JP4819789B2

JP4819789B2 - 多層分析要素

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Publication number: JP4819789B2
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Authority: JP
Inventors: 中村　　健太郎
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
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Filing date: 2006-01-25
Publication date: 2011-11-24
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Description

本発明は、臨床検査、食品検査、環境分析等に用いられる多層分析要素に関する。

臨床検査、食品検査及び環境分析の分野では、迅速・簡便に検体を処理する要求が年々高くなっており、そのニース゛に応えた乾式分析素子が汎用されている。乾式分析要素の中で、血液の受容、展開、拡散を行わせる展開層には、特開昭５５−１６４３５６号公報、特開昭５７−６６３５９号公報、特開昭６０−２２２７６９号公報等に代表されるように、繊維質多孔性材料が用いられてきた。

この繊維質多孔性材料は、液体試料点着時の展開が速く、製造時の取り扱い性にも優れている。また、全血のような粘性のある試料に対しても適用性があり、広く使用されている。

しかし、この分野では、より高い精度（再現性）での測定が要求されるようになってきており、繊維質多孔性材料（布展開層）では、いくつか不具合がでてきている。その一つが、布自身のロット変動の問題である。通常、布展開層には、織物と編物があるが、その織り方、編み方にロット間差及びロット内差が見つかっている。具体的には、単位面積当たりの編目数、単位面積当たりの重量、厚みなどである。また、中間工程で、材料の洗浄工程があるが、その洗浄の程度により、布の親水性にロット間差、ロット内差がある。さらに、布展開層は、平滑ではないため、積層方式で、十分な接着力を確保して製造しようとすると、下層に展開層を食い込ませざるをえない。これにより下層は乱れており、より高い精度での測定に対しては、好ましくない。さらに、布展開層は布自身及び下層のくい込み等の影響によって液体試料の下層への移行量を増加させることが難しく、高感度化できにくいという問題もある。また布は下層に布を接着する際に、その構造上伸びやすく、空隙体積の変化を起こしやすい。そのために液体試料点着時の展開面積が変化しやすく、ロット内差及び高精度測定が達成できない原因となっている。また近年、より少ない試料で測定することが望まれているが、布展開層では、試料液量を少なくしていくと、編目の影響による反射光量のバラツキが顕著になり、高精度の測定ができなくなる。

上述したような布展開層の欠点を解決する手段として、特公昭５３−２１６７７号公報、特公平１−３３７８２号公報等に示されるような非繊維質多孔性膜を展開層に用いた乾式分析素子が検討されている。ここで言う非繊維質多孔性膜は、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロースなどの有機高分子の製膜原液を作製し、これを支持体上に、塗布、流延し、乾燥を行うことで製膜して作製したものである。ここでは、写真フイルムで培われた塗布技術が応用されており、その製膜精度は、５〜１０％程度であり、ロット間差、ロット内差なども十分に小さい。また、これら非繊維質多孔性膜は、布展開層に比べ、平滑で、かつ、比表面積が大きいことから、下層への食い込みは少ない状態で、下層と所望の強さでの接着が可能である。さらに、布展開層に代表される編目はなく、白色度も高いため、分析素子の面積を小さくしても、反射光量のバラツキは安定しており、高精度の測光が可能である。

このような非繊維質多孔性膜を展開層に用いた分析素子において、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩を含む系（例えば、ＬＤＨ、ＣＰＫ、又はＣＫＭＢを分析する系）では展開層に用いる非繊維質多孔性膜の素材により、特開昭６２−２０５７９８号公報、特開昭６３−３２４９９号公報、特開平１１−１９６号公報等に示された従来の布展開層に比べ検出感度が大きく変化すること、また検出感度の変化に伴い測定精度にも影響を及ぼすこと場合があることが分かってきた。

本発明は、ロット間差及びロット内差が小さく、測定精度が高く、小型化が可能な多層分析要素を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩を含む系において測定精度の向上を達成できる多層分析要素を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩を含む液体試料分析用多層分析要素において、多孔性液体試料展開層を構成する非繊維性多孔膜としてセルロースアシレートを使用することによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに到った。

即ち、本発明によれば、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩を該機能層、該多孔性液体試料展開層またはその両方に含み、かつ該非繊維性多孔膜がセルロースアシレートであることを特徴とする液体試料分析用多層分析要素が提供される。

好ましくは、酸化型補酵素はＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋である。
好ましくは、ホルマザン色素形成テトラゾリウム塩はニトロテトラゾリウムブルーである。
好ましくは、セルロースアシレートはセルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートブチレートの鹸化物、またはこれらの混合物である。
さらに好ましくは、セルロースアシレートはセルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物、またはこれらの混合物である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の液体試料分析用多層分析要素は、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩を該機能層、該多孔性液体試料展開層またはその両方に含み、かつ該非繊維性多孔膜がセルロースアシレートであることを特徴とする。

本発明によれば、セルロースアシレートの非繊維性多孔膜を展開層として用いることで、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩を含む液体試料分析用多層分析要素において、ロット間差及びロット内差が小さく、測定精度が高く、小型化可能となる。

本発明の液体試料分析用多層分析要素の構成例としては、（１）支持体上に、1または複数の機能層が設けられ、さらに該機能層の上に非繊維性多孔膜が設けられている液体試料分析用多層分析要素、並びに、（２）支持体上に、1または複数の機能層が設けられ、さらに該機能層の上に、試料分析用の試薬を含有する非繊維性多孔膜が設けられている液体試料分析用多層分析要素、が挙げられる。即ち、本発明における非繊維性多孔膜は、試料分析用の試薬を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。

多孔性液体試料展開層は、１層だけに限定する必要はなく、２層以上の非繊維性多孔膜を部分的に配置された接着剤により接着された積層物を用いることができる。また、少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層は特開昭５７−６６３５９に開示の物理的活性化処理、好ましくはグロー放電処理またはコロナ放電処理を非繊維性多孔膜の少なくとも片面に施すか、あるいは特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５９等に開示の界面活性剤含浸処理、好ましくはノニオン性界面活性剤含浸処理、または親水性ポリマー含浸処理などの親水化処理、またはこれらの処理工程の二つ以上の組合わせを逐次実施することにより非繊維性多孔膜を親水化し、下側（支持体に近い側）の機能層との接着力の強化、または展開面積のコントロールをすることができる。更に、目的とする検出反応を行うための試薬、該検出反応を促進するための試薬、あるいは干渉・妨害反応を低減又は阻止するための各種試薬、もしくはこれらの試薬の一部を含ませることができる。

本発明においては、上記非繊維性多孔膜として、セルロースアシレートを用いる。好ましくはセルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートブチレートの鹸化物またはこれらの混合物を用いることができ、更に好ましくはセルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物またはこれらの混合物を用いることができる。

例えば、セルロースアセテートの多孔膜としては、ミクロフィルターＦＭ５００（富士写真フイルム（株）製）がある。

セルロースアシレートから成る非繊維性多孔膜の平均孔径は特に限定されないが、一般的には０．３μｍ〜５０μｍであり、好ましくは０．５μｍ〜２０μｍであり、より好ましくは１μｍ〜１０μｍであり、特に好ましくは１μｍ〜７μｍである。
セルロースアシレートからなる非繊維性多孔膜の厚さ、空隙率、透水速度などは特に限定されないが、厚さについては５０〜５００μｍ、好ましくは５０〜３５０μｍ、更に好ましくは８０〜２００μｍであることが望ましい。空隙率については好ましくは５０〜９５％、更に好ましくは６０〜９０％が望ましい。また透水速度については２５℃で１Ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を透過させたときの透水量が好ましくは非繊維性多孔膜１ｃｍ²当たり1分間に１〜５０００ｍｌ、更に好ましくは５〜２０００ｍｌであることが望ましい。

また、試薬含有非繊維性多孔膜は、試薬を含有している膜を指すが、予め多孔膜を試薬溶液に浸漬後、乾燥させることにより試薬含有膜を作製できる。また、別法として多孔膜上に試薬溶液を塗布後乾燥させることにより試薬含有非繊維性多孔膜を作製できるが、特に手段は、限定しない。

さらに、本発明の液体試料分析用多層分析要素は、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、上記の非繊維性多孔膜またはこれと液体接触関係にある少なくとも１つの機能層またはその両方に、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩などの試薬を含む。

本発明の多層分析要素が対象とする被検物質は特に限定されず、任意の液体試料（例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、髄液、膣液などの体液中の特定成分を分析することができる。例えば、クレアチンフォスフォキナーゼ（ＣＰＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）などを分析することができる。

（１）クレアチンフォスフォキナーゼ（ＣＰＫ）の分析
血中のクレアチンフォスフォキナーゼ（ＣＰＫ）活性値は、心筋梗塞、進行性筋ジストロフィーやその他の筋肉疾患、並びに内分泌疾患などの臨床診断上の重要な指標として近年利用されている。ＣＰＫは、ＡＴＰ＋クレアチン→ＡＤＰ＋クレアチン酸の可逆反応を触媒する。本発明の液体試料分析用多層分析要素においては、上記反応の逆反応を用い、さらに呈色色素を生成させる酵素系を導入したＮＡＤＨ比色法を使用している。ＣＰＫ測定用の分析要素で使用する試薬の具体例としては、特開昭６３−３２４９９号公報に記載されているものを使用することができる。

即ち、本発明の液体試料分析用多層分析要素を用いてＣＰＫの分析を行う場合には、分析要素中には、クレアチンリン酸２ナトリウム、ニトロテトラゾリウムブルー、ＡＤＰ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコース、ＮＡＤ⁺、ヘキソキナーゼ、及びジアホラーゼが含まれる。上記した成分を含む多層分析要素に検体を点着すると、以下の反応により、ホルマザン色素が生成する。即ち、検体中のＣＰＫは、分析要素中のクレアチンリン酸とＡＤＰとの反応を触媒する。反応の開始と共にＡＴＰは、共存するヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ジアホラーゼなどの酵素の働きでニトロテトラゾリウムブルーを還元し、ホルマザン色素が生成する。生成した色素による吸光度の増加を測定することにより生成速度が算出され、ＣＰＫ活性値を求めることができる。

（２）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の分析
血清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性の上昇は、心・腎・肝などの各種疾患、白血病、悪性貧血などに見られる。本発明の液体試料分析用多層分析要素においては、乳酸を基質として用い、テトラゾリウム塩を発色試薬としたＮＡＤＨ比色法を使用している。ＬＤＨ測定用の分析要素で使用する試薬の具体例としては、特開昭６２−２０５７９８号公報に記載されているものを使用することができる。

即ち、本発明の液体試料分析用多層分析要素を用いてＬＤＨの分析を行う場合には、分析要素中には、乳酸リチウム、ニトロテトラゾリウムブルー、ＮＡＤ⁺、ジアホラーゼ、及びアスコルビン酸オキシダーゼが含まれる。上記した成分を含む多層分析要素に検体を点着すると、以下の反応により、ホルマザン色素が生成する。即ち、検体中のＬＤＨは、基質である乳酸塩と補酵素酸化型ニコチン酸アミドジヌクレオチド（ＮＡＤ⁺）との反応を触媒する。生成した還元型補酵素（ＮＡＤＨ）は、ジアホラーゼの触媒作用によりニトロテトラゾリウムブルーを還元し、ホルマザン色素が生成する。生成した色素による吸光度の増加を測定することにより生成速度が算出され、ＬＤＨ活性値を求めることができる。

（３）クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の分析
クレアチンフォスフォキナーゼ（ＣＰＫ）のアイソザイムの一つであるＣＫＭＢは、その含有比率と含有量が心筋に著しく高いことが知られている。心筋に傷害が起こると血中ＣＫＭＢ活性が上昇するため、ＣＫＭＢの測定が心筋梗塞に特異性の高い検出法として重要視されている。本発明の液体試料分析用多層分析要素においては、ＣＫ−Ｍ活性を阻害する抗体を用いた免疫阻害法を用い、さらに呈色色素を生成させる酵素系を導入したＮＡＤＨ比色法を使用している。ＣＫＭＢ測定用の分析要素で使用する試薬の具体例としては、特開平１１−１９６号公報に記載されているものを使用することができる。

即ち、本発明の液体試料分析用多層分析要素を用いてＣＫＭＢの分析を行う場合には、分析要素中には、抗ヒトＣＫ−Ｍヒツジ抗体、クレアチンリン酸２ナトリウム、ニトロテトラゾリウムブルー、１，５−ジ（アデノシン−５’）５リン酸、ＮＡＣ、ＡＭＰ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＡＤＰ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコース、ＮＡＤ⁺、ヘキソキナーゼ、及びジアホラーゼが含まれる。上記した成分を含む多層分析要素に検体を点着すると、以下の反応により、ホルマザン色素が生成する。即ち、検体中のＣＫ−Ｍ活性は、抗ＣＫ−Ｍ抗体により阻害され、阻害作用を受けないＣＫ−ＢサブユニットはＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）により活性化され、クレアチンリン酸とＡＤＰからクレアチンとＡＴＰを生成する反応を触媒する。この反応で生成したＡＴＰはヘキソキナーゼ（ＨＫ）の触媒作用でグルコースと反応し、グルコース−６−リン酸とＡＤＰに変化する。さらに、グルコース−６−リン酸は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）の作用で酸化され、同時にニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が生成する。最終的には、ＮＡＤＨはジアホラーゼ（ＤＩ）の作用でニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を還元し、ホルマザン色素が生成する。生成した色素による吸光度の増加を測定することにより生成速度が算出され、ＣＫＭＢ活性値を求めることができる。

機能層の具体例としては、展開層と機能層を接着する接着層、液状試薬を吸水する吸水層、化学反応により生成した色素の拡散を防止する媒染層、ガスを選択的に透過させるガス透過層、層間での物質移動を抑制・促進させる中間層、内因性物質を除去する除去層、反射測光を安定に行うための光遮蔽層、内因性色素の影響を抑制する色遮蔽層、血球と血漿を分離する分離層、分析対象物と反応する試薬を含む試薬層、発色剤を含む発色層などが挙げられる。

本発明の一例としては、例えば、支持体の上には、場合によっては下塗層等の他の層を介して、機能層として親水性ポリマー層を設けることができる。親水性ポリマー層としては、例えば、無孔性、吸水性かつ水浸透性の層であり、基本的に親水性ポリマーのみなる吸水層、親水性ポリマーをバインダーとし発色反応に直接関与する発色試薬の一部又は全部を含む試薬層、及び親水性ポリマー中に発色色素を固定し不動にする成分（例：媒染剤）を含有する検出層などを設けることができる。

試薬層は水性液体中の被検成分と反応して光学的に検出可能な変化を生じる試薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されている吸水性で水浸透性の層である。この試薬層には指示薬層、発色層なども含まれる。

試薬層のバインダーとして用いることができる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が３０℃で約１５０％から約２０００％、好ましくは約２５０％から約１５００％の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例としては、特開昭６０−１０８７５３号公報等に開示されているゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあげることができる。

試薬層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化された層とすることができる。架橋剤の例として、ゼラチンに対する１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン、ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル等の公知のビニルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メタリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、２個のグリシジル基含有エポキシ化合物等がある。

試薬層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは約３μｍから約５０μｍの範囲である。また試薬層は実質的に透明であることが好ましい。

本発明の多層分析要素の試薬層やその他の層に含める試薬としては、被験物質に応じてその検出に適した試薬を選択することができる。

本発明の液体試料分析用多層分析要素における水不透過性平面支持体としては、従来公知の分析要素に用いられている水不透過性の支持体を用いることができる。水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲のフィルムもしくはシート状の支持体を挙げることができる。

支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持体の上に設けられる機能層と支持体との接着を強固なものにすることができる。また、下塗層の代りに、支持体の表面を物理的あるいは化学的な活性化処理を施して接着力の向上を図ってもよい。
非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を試薬層、吸水層または接着層等の機能層にラミネートするには特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５９等に開示の方法に従うことができる。すなわち試薬層、吸水層または接着層等の機能層が塗布後未乾燥のうちに、または乾燥後の機能層に水、界面活性剤を含む水溶液、界面活性剤と親水性ポリマーを含む水溶液、有機溶媒または有機溶媒を含有する水溶液等をワイヤーバー塗布装置及びダイを用いた塗布装置等で実質的に均一に供給し、機能層を膨潤または溶解させ、ついで非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を膨潤または溶解している機能層の上に実質的に均一に軽く圧力をかけながらラミネートし、一体化する。機能層の膨潤または溶解に際しては、赤外線ヒーター等の輻射熱の照射による加温、支持体にヒーターを接触させ加温する方法等を用いることができる。

本発明の多層分析要素は、公知の方法により調製することができる。溶血試薬は塗布または含浸される試薬水溶液に予め加えておけばよい。他の方法としては、単独又は界面活性剤・展開面積制御のための親水性ポリマーなどを含む水溶液、有機溶媒（エタノール、メタノールなど）溶液又は水−有機溶媒混合液溶液を展開層の上から塗布して含浸させることもできる。これを用いた被験物質の分析も公知の方法に従って行なうことができる。

例えば、本発明の多層分析要素は、一辺約５ｍｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３３１号公報（対応米国特許４，１６９，７５１）、実開昭５６−１４２４５４号公報（対応米国特許４，３８７，９９０）、特開昭５７−６３４５２号公報、実開昭５８−３２３５０号公報、特表昭５８−５０１１４４号公報（対応国際公:ＷＯ０８３／００３９１）等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることができ、これは製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口のある容器内に収めて用いたり、又は小片を開口カードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。

本発明の多層分析要素は、例えば約２μＬ〜約３０μＬ、好ましくは４μＬ〜１５μＬの範囲の水性液体試料液を、粒状構造物展開層に点着する。点着した多層分析要素を約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーションする。多層分析要素内の発色又は変色を支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中の被験物質の量を求めることができる。

測定操作は特開昭６０−１２５５４３号公報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報（対応米国特許４，４２４，１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。

本発明の多層分析要素は、分析を行うまでは乾燥状態で貯蔵・保管されるため、試薬を用時調製する必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる検査方法としても優れている。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：各種展開層素材を用いたＬＤＨ分析用多層分析要素の感度及び精度比較
（１）平均孔径５μｍのセルロースアセテート膜を展開層に用いたＬＤＨ分析用多層分析要素の作製方法
ゼラチン下塗りされている１８０μｍのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フィルムに下記組成の水溶液（ｐＨ＝６．４）を、下記の被覆量になるように塗布、乾燥し発色層とした。

ゼラチン 19.9ｇ／ｍ²
ニトロテトラゾリウムブルー 0.8ｇ／ｍ²
ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル 0.4ｇ／ｍ²
１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン 0.2ｇ／ｍ²

次に上記試薬層上に約３０ｇ／ｍ²の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、平均孔径５μｍのセルロースアセテート膜（ＦＭ-５００：富士写真フイルム社製）を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させて、接着させた。

上記ＦＭ-５００膜上に、下記組成の水溶液（ｐＨ＝８．０）を下記の被覆量になるように塗布、乾燥させ、平均孔径５μｍのセルロースアセテート膜を展開層に用いたＬＤＨ分析用多層分析要素を作製した。

ポリアクリルアミド 2.9ｇ／ｍ²
ポリエチレングリコール（１０）オクチルフェニルエーテル 0.9ｇ／ｍ²
ポリエチレングリコール（４０）オクチルフェニルエーテル 0.4ｇ／ｍ²
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 2.5ｇ／ｍ²
Ｌ−グルタミン酸 1.4ｇ／ｍ²
乳酸リチウム 1.1ｇ／ｍ²
ジアホラーゼ 0.75 KU／ｍ²
グルタミン酸ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ(GPT) 1.83 KU／ｍ²
アスコルビン酸オキシダーゼ 16.2 KU／ｍ²
ニコチンアミドアデニンヌクレオチド酸化型(ＮＡＤ⁺) 0.24ｇ／ｍ²

上記の多層分析要素を１２ｍｍ×１３ｍｍ四方のチップに裁断し、スライド枠（特開昭５７−６３４５２号公報に記載）に収めて、ＬＤＨ分析用スライド１を作製した。

（２）平均孔径１．２μｍのセルロースアセテート膜を展開層に用いたＬＤＨ分析用多層分析要素の作製方法
展開層に平均孔径１．２μｍのセルロースアセテート膜（ＦＭ-１２０）を用いる以外は、（１）平均孔径５μｍのセルロースアセテート膜を展開層に用いたＬＤＨ分析用多層分析要素の作製方法と同様に作製し、ＬＤＨ分析用スライド２を作製した。

（３）編物布地を展開層に用いたＬＤＨ分析用多層分析要素の作製方法
展開層に５０デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編物布地（以下編物布地とする）を用いる以外は、（１）平均孔径５μｍのセルロースアセテート膜を展開層に用いたＬＤＨ分析用多層分析要素の作製方法と同様に作製し、ＬＤＨ分析用スライド３を作製した。

（４）感度及び測定精度比較
上記ＬＤＨ分析用スライド１、２、３に水及びＬＤＨ活性が９４６Ｕ／Ｌである管理血清を各々１０μＬ点着した。この後、各スライドを３７℃でインキュベーションし、支持体側から５４０ｎｍの反射光学濃度を測定し、点着後１から２分後の反射光学濃度の変化量を求め、感度（９４６Ｕ／Ｌである管理血清を点着した時の反射光学濃度の変化量と水を点着した時の反射光学濃度の変化量の差（ｄｄＯＤｒ（９４６Ｕ／Ｌ−０Ｕ／Ｌ）））を比較した。また、ＬＤＨ活性が４７０Ｕ／Ｌの管理血清を１０μＬで１００回点着した時の精度（変動係数％＜ＣＶ＞）を比較した。表１に感度比較結果、表２に精度比較結果を示す。

セルロースアセテート膜を展開層に用いたＬＤＨ分析用多層分析要素１、２は編物布地を展開層に用いたＬＤＨ分析用多層分析要素３に対し、感度が向上する。さらに測定精度の向上も達成された。

実施例２：各種展開層素材を用いたＣＰＫ分析用多層分析要素の感度及び精度比較
（１）平均孔径５μｍのセルロースアセテート膜を展開層に用いたＣＰＫ分析用多層分析要素の作製方法
ゼラチン下塗りされている１８０μｍのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フィルムに下記組成の水溶液（ｐＨ＝６．４）を、下記の被覆量になるように塗布、乾燥し発色層とした。

ゼラチン 19.9ｇ／ｍ²
ニトロテトラゾリウムブルー 0.8ｇ／ｍ²
ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル0.4ｇ／ｍ²
１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン 0.2ｇ／ｍ²

上記ＦＭ-５００膜上に、下記組成の水溶液（ｐＨ＝６．５）を下記の被覆量になるように塗布、乾燥させ、平均孔径５μｍのセルロースアセテート膜を展開層に用いたＣＰＫ分析用多層分析要素を作製した。

ポリアクリルアミド 3.2ｇ／ｍ²
ポリエチレングリコール（１０）オクチルフェニルエーテル 0.6ｇ／ｍ²
ポリエチレングリコール（４０）オクチルフェニルエーテル 0.3ｇ／ｍ²
イミダゾール 1.8ｇ／ｍ²
グルコース 0.6ｇ／ｍ²
N-アセチル-L-システイン 0.2ｇ／ｍ²
エチレンジアミン４酢酸・２ナトリウム塩 0.5ｇ／ｍ²
P¹,P⁵-ジ（アデノシン-5'-）ペンタホスフェート 0.02ｇ／ｍ²
ニコチンアミドアデニンヌクレオチド酸化型(ＮＡＤ⁺) 0.6ｇ／ｍ²
クレアチンリン酸・２ナトリウム塩 1.8ｇ／ｍ²
アデノシン-5'-モノホスフェート・１ナトリウム塩 1.2ｇ／ｍ²
アデノシン-5'-ジホスフェート・１カリウム塩 0.7ｇ／ｍ²
スクロース 6.8ｇ／ｍ²
塩化マグネシウム 1.2ｇ／ｍ²
ジアホラーゼ 1.1 KU／ｍ²
グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ 4.0 KU／ｍ²
ヘキソキナーゼ 2.8 KU／ｍ²
アスコルビン酸オキシダーゼ 4.8 KU／ｍ²

上記の多層分析要素を１２ｍｍ×１３ｍｍ四方のチップに裁断し、スライド枠（特開昭５７−６３４５２号公報に記載）に収めて、ＣＰＫ分析用スライド１を作製した。

（２）編物布地を展開層に用いたＣＰＫ分析用多層分析要素の作製方法
展開層に５０デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編物布地（以下編物布地とする）を用いる以外は、（１）平均孔径５μｍのセルロースアセテート膜を展開層に用いたＣＰＫ分析用多層分析要素の作製方法と同様に作製し、ＣＰＫ分析用スライド２を作製した。

（３）感度及び測定精度比較
上記ＣＰＫ分析用スライド１、２に水及びＣＰＫ活性が１０９５Ｕ／Ｌである管理血清を各々１０μＬ点着した。この後、各スライドを３７℃でインキュベーションし、支持体側から５４０ｎｍの反射光学濃度を測定し、点着後２．５から４分後の反射光学濃度の変化量を求め、感度（１０９５Ｕ／Ｌである管理血清を点着した時の反射光学濃度の変化量と水を点着した時の反射光学濃度の変化量の差（ｄｄＯＤｒ（１０９５Ｕ／Ｌ−０Ｕ／Ｌ）））を比較した。また、ＬＤＨ活性が１０９５Ｕ／Ｌの管理血清を１０μＬで２０回点着した時の精度（変動係数％＜ＣＶ＞）を比較した。表３に感度比較結果、表４に精度比較結果を示す。

セルロースアセテート膜を展開層に用いたＣＰＫ分析用多層分析要素１は編物布地を展開層に用いたＣＰＫ分析用多層分析要素２に対し、感度が向上する。さらに測定精度の向上も達成された。

本発明によれば、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩を含む系において、ロット間差及びロット内差が小さく、測定精度が高く、小型化が可能な多層分析要素のための展開層を提供することができる。

Claims

水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩を該機能層、該多孔性液体試料展開層またはその両方に含み、かつ該非繊維性多孔膜がセルロースアシレートであり、酸化型補酵素がＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋であることを特徴とする液体試料分析用多層分析要素。
ホルマザン色素形成テトラゾリウム塩がニトロテトラゾリウムブルーである、請求項１に記載の液体試料分析用多層分析要素。
セルロースアシレートがセルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートブチレートの鹸化物、またはこれらの混合物である請求項１又は２に記載の液体試料分析用多層分析要素。
セルロースアシレートがセルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物、またはこれらの混合物である、請求項１又は２に記載の液体試料分析用多層分析要素。