JP4819240B2 - Process for producing purified N-acetyllactosamine - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ-アセチルグルコサミンとＤ-ガラクトースがβ-1,4結合しているＮ-アセチルラクトサミンと、Ｎ-アセチルグルコサミンとＤ-ガラクトースがβ-1,6結合しているＮ-アセチルアロラクトサミンを含有する混合物からＮ-アセチルラクトサミンを精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｎ-アセチルラクトサミンは、Ｄ-ガラクトースとＮ-アセチルグルコサミンがβ-1,4グリコシド結合している二糖であり、人乳オリゴ糖やリポ多糖、各種糖タンパク質および糖脂質の糖鎖中に存在し、生化学的に非常に重要なオリゴ糖である。また、腸内細菌の一種であるビフィズス菌の増殖活性を有しており、優れた整腸作用を示すことから、育児用調製粉乳のような高度栄養食品への利用が注目されている。さらに近年、Ｎ-アセチルラクトサミンを含む複合糖質糖鎖の生理活性にも注目が集まっており、例えば細胞接着阻害活性を有するシアリルＬｅx糖鎖などの合成における原料としても重要になりつつある。
【０００３】
Ｎ-アセチルラクトサミンの合成法としては、化学合成法と酵素合成法が知られているが、一段階の反応で目的物質が得られることから、工業規模での合成法としては、専ら酵素合成法の研究が広くなされている。現在までに行われている酵素反応を利用したＮ-アセチルラクトサミンの合成法としては、ガラクトシルトランスフェラーゼを利用した方法とβ-ガラクトシダーゼを利用した方法が報告されている。
【０００４】
ガラクトシルトランスフェラーゼを利用した方法としては、例えば、Brewらが報告したウリジンジリン酸ガラクトースとＮ-アセチルグルコサミンからＮ-アセチルラクトサミンを合成する方法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 59, 491, 1968）があるが、基質として用いるウリジンジリン酸ガラクトースが高価なため、工業規模での合成法としては実現性に乏しいものであった。この問題を解決する方法として、出家らは反応系内でウリジンジリン酸ガラクトースを合成させるためにガラクトシルトランスフェラーゼとともにトルロプシス属酵母の乾燥菌体などを共存させる方法、即ち、ウリジン-5'-モノリン酸、ガラクトースとＮ-アセチルグルコサミンからＮ-アセチルラクトサミンを合成する方法を発明している（特開昭６２−１３４０９６号公報）。具体的には、ガラクトース１モル当たり０.２モルのＮ-アセチルラクトサミンが生成し、１０mlの反応液を除核酸と活性炭クロマトグラフィーに供することによって純度９２％のＮ-アセチルラクトサミンを１３０ｍｇ得ることに成功している。しかしながら、本法では、最初に反応系内でウリジンジリン酸ガラクトースが合成されなければならないために、反応が終了するまでに５日もかかり、工業規模での合成法としてはさらに工夫することが必要である。
【０００５】
一方、もう一つのアプローチとしてβ-ガラクトシダーゼなどのガラクトース転移反応を利用した方法が報告されている。
例えば、碓氷らは、Bacillus circulans由来のβ-ガラクトシダーゼをラクトースとＮ-アセチルグルコサミンに作用させてＮ-アセチルラクトサミンを製造する方法を報告しており、ガラクトース供与体であるラクトース１モル当たり０.４２モルのＮ-アセチルラクトサミンが反応液中に合成されることを示している（特開平３−４９６９２号公報）。しかしながら、本反応終了後の反応液中には原料のラクトースやＮ-アセチルグルコサミンのほか、副反応生成物であるＮ-アセチルアロラクトサミンやガラクトシル-Ｎ-アセチルラクトサミンも存在しており、目的物質であるＮ-アセチルラクトサミンのみを分取するには、活性炭クロマトグラフィー、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー等の手段を組み合わせる必要がある。特にＮ-アセチルアロラクトサミンとの分別精製には高度なクロマトグラフィー技術が必要である。
【０００６】
また、鰺坂らはβ-1,4結合選択性の高いβ-ガラクトシダーゼであるDiplococcus pneumoniae（現Streptpcoccus pneumoniae）由来のβ-ガラクトシダーゼとガラクトース供与体としてフェニルガラクトピラノシド誘導体とを用いたＮ-アセチルラクトサミンの製造法を報告している（特開平６−３３５３９５号公報）。この方法は、前記方法において生成する副生成物Ｎ-アセチルアロラクトサミンを生成させずに、Ｎ-アセチルラクトサミンを合成する方法である。しかしながら、Ｎ-アセチルラクトサミンの生産性は６０〜８０ｍＭで、碓氷らの方法に比べて低く、高価な基質を用いるわりには、基質１モル当たりの反応収率が低いものであり、工業規模で用いるにはあまり適さない。
【０００７】
これらのＮ-アセチルラクトサミンの製造方法では、合成法に主眼がおかれているために、その精製方法については実験室で一般に用いられている方法、例えば、活性炭クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィーなどが応用されているに過ぎなかった。例えば、活性炭-セライトカラムを用いて、高純度なＮ-アセチルラクトサミンを得るには、繰り返しカラムにかけて精製を行う必要があり、Ｎ-アセチルラクトサミンの回収率も４０〜４５％程度に下がるという問題点がある。
【０００８】
従って、高純度のＮ-アセチルラクトサミンを高収率且つ、より安価に得ようとするためには、活性炭クロマトグラフィーのみを使用する方法は適当ではなく、何らかの工夫を行う必要があると考えた。
【０００９】
一方、三次元架橋結合を形成させたデキストラン、セルロース、ポリアクリルアミドなどを基材とするゲル濾過剤を用いて分子サイズによる分離を行うゲル濾過法もＮ-アセチルラクトサミンの精製方法として有望であるが、これらゲル濾過剤の寿命は短く、単位樹脂当たりの適性負荷量が小さく過負荷状態では分離能が極端に悪くなり、しかもこれらゲル濾過剤は高価であることから、実質的には実験室規模の使用にしか応用することができないことが判った。
【００１０】
アミノ糖製造法において、これらクロマトグラフィーの組み合わせによる精製方法以外の精製方法を用いた例としては、ラクト-Ｎ-ビオースを製造する際にラクトースとＮ-アセチルグルコサミンとを含有する基質にブタ睾丸由来のβ-ガラクトシダーゼを作用させてガラクトース転移反応を行わせた後、副生産物である異性体や未反応のラクトースを、Bacillus circulansの生産するβ-ガラクトシダーゼで加水分解し除去する方法が報告されている（特開平６−２５３８７８号公報）。ここでの目的物質は、ラクト-Ｎ-ビオースＩであるため、Ｎ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンは共に副生成物として除去されるべき物質であり、Bacillus circulansの生産するβ-ガラクトシダーゼが、β-1,4結合もβ-1,6結合も分解するため、これにより両物質とも加水分解されることが記載されている。従って、本方法はＮ-アセチルラクトサミンとＮ-アセチルアロラクトサミンとの分取には用いることができない。
【００１１】
またオリゴ糖の分離方法としては、イオン交換基を持たない多孔性ポリマーからなる合成吸着剤を用いる方法（特開昭６１−１３０２９７号公報）や、強酸性陽イオン交換樹脂を用いる方法（特公平６−１４８７０号公報）が知られている。前者の方法は、合成吸着剤を充填したカラムに被処理液を供給し、吸着された糖類を水または水とアルコールの濃度勾配により溶出するもので、糖と吸着剤との親和性の差により糖が分子量の小さい順に溶出される。このカラムに吸着した二糖類以上のオリゴ糖は水で溶出することが実質的に不可能で、溶出にはアルコール溶液が必要である。一方、後者の方法は、強酸性陽イオン交換樹脂を用いて行うクロマトグラフィーを使用するものであり、反応液中のオリゴ糖成分は、分子サイズ排除効果（架橋樹脂内へ浸透し得ない大きな分子サイズの糖から先に溶出させる効果）によって分離されるものである。
【００１２】
これらの方法に用いられている吸着剤や樹脂は比較的安価で耐久性にも優れているので、ある種のオリゴ糖の大量精製に既に応用されているが、アミノ糖への応用は高速液体クロマトグラフィーによるＮ-アセチルグルコサミンの分析例があるのみで、アミノ糖含有オリゴ糖の精製に応用された報告例はほとんどない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
上記のようにＮ-アセチルラクトサミンの工業的製造には酵素法、特にラクトース及びＮ-アセチルグルコサミンを基質としたβ-ガラクトシダーゼによるガラクトース転移反応に基づいた製造が有望である。しかし、当該反応により得られる反応生成物中にはＮ-アセチルラクトサミンの他、Ｎ-アセチルアロラクトサミン等が存在する。
【００１４】
上記したように、Ｎ-アセチルラクトサミンとＮ-アセチルアロラクトサミンとは異性体であるため、混合物からＮ-アセチルラクトサミンのみを得るには、通常用いられているようなカラムクロマトグラフィー等を用いた方法では、その操作を繰り返し行うか、あるいは高度な技術を要した。従って本発明は、Ｎ-アセチルラクトサミンとＮ-アセチルアロラクトサミンを含有する溶液等の混合物から簡便で安価にＮ-アセチルラクトサミンを精製できる方法であって、工業的規模での使用も可能な方法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、Ｎ-アセチルラクトサミンと、Ｎ-アセチルアロラクトサミンを含有する溶液等の混合物にβ-1,6グリコシド結合を分解する作用に優れたβ-ガラクトシダーゼを作用させることにより、Ｎ-アセチルアロラクトサミンは容易に単糖に分解され、Ｎ-アセチルラクトサミンはほとんど分解されないことを見出し、本発明を完成した。
【００１６】
即ち本発明は、Ｎ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンを含有する混合物から精製されたＮ-アセチルラクトサミンを製造する方法であって、前記混合物をβ-1,6-グリコシド結合を切断し得るβ-ガラクトシダーゼで処理し、Ｎ-アセチルアロラクトサミンを分解して除去することを特徴とする方法を提供する。
【００１７】
上記本発明方法においては、前記混合物がさらにラクトースを含有していてもよい。
上記本発明方法の好ましい態様においては、前記混合物として、ラクトース及びＮ-アセチルグルコサミンを基質として用いるＮ-アセチルラクトサミンの酵素合成反応による製造において得られた反応混合物を使用でき、該反応混合物について活性炭を用いた分離方法を行うことにより分取したＮ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンを含む画分をより好ましく使用できる。
【００１８】
また、上記本発明方法の好ましい態様においては、エシェリシア（Eschericia）属細菌に由来するβ-1,6-グリコシド結合を切断しうるβ-ガラクトシダーゼを使用する。
酵素合成反応によるＮ-アセチルラクトサミンの製造において得られた反応混合物を用いる上記本発明方法の好ましい態様においては、酵素合成反応に用いる酵素が、β-1,4-結合選択性の高いβ-ガラクトシダーゼを使用する。
【００１９】
上記本発明方法の好ましい態様においては、β-1,4結合選択性の高いβ-ガラクトシダーゼとして、ロドトルラ属、バチルス属、またはストレプトコッカス属の微生物に由来するβ-ガラクトシダーゼを使用する。本発明方法を用いることにより、純度９５％以上のＮ-アセチルラクトサミンを得ることが出来る。
【００２０】
本発明方法を用いる一連の工程としては、例えば、ラクトース及びＮ-アセチルグルコサミンを含有する基質を用いるＮ-アセチルラクトサミンの酵素合成方法において、Rhodotorura minutaの洗浄菌体又はBacillus circulans由来β-ガラクトシダーゼを前記基質に作用させてＮ-アセチルラクトサミンの合成反応を行い、該反応混合物から活性炭を使用して得たＮ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンを含む画分をEschericia coli由来β-ガラクトシダーゼ処理して当該処理液から純度９５％以上のＮ-アセチルラクトサミンを得ることができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
Ｎ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンは異性体同士であり、両者ともＤ-ガラクトースとＮ-アセチルグルコサミンとを構成糖とする二糖類である。前者は、両構成糖が、β-1,4グリコシド結合している二糖で、後者は、β-1,6グリコシド結合している二糖である。
【００２２】
本発明方法に用いられるＮ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンを含有する混合物は、両者を含有する溶液等の混合物であればよく、混合物の生成方法や由来には特に限定されない。本発明方法は、例えば、ラクトースとＮ-アセチルグルコサミンを含有する基質を用いた酵素反応によるＮ-アセチルラクトサミンの合成における反応混合物に好ましく適用することができる。
【００２３】
上記混合物中におけるＮ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンの含有比率は特に限定されないが、本発明方法による精製後のＮ-アセチルラクトサミンの収率を高めるためにはＮ-アセチルラクトサミンの含有比率が高いことが好ましい。上記のラクトースとＮ-アセチルグルコサミンを含有する基質を用いたＮ-アセチルラクトサミンの酵素による合成により得られた反応混合物は通常Ｎ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンを１０：１〜１０：２程度のモル比で含有しており、本発明方法はこのような混合物に好ましく適用することができる。
【００２４】
また上記混合物は、例えば上記酵素反応の基質であるラクトース等を含んでいてもよい。このような物質は後述のように通常の分離操作により容易に分離することができる。ただしＮ-アセチルグルコサミンについては後述のように除去する必要がある。
【００２５】
上記のラクトースとＮ-アセチルグルコサミンを含有する基質を用いたＮ-アセチルラクトサミンの酵素的合成は、具体的には、ラクトースとＮ-アセチルグルコサミンを含有する基質に、ガラクトース転移作用を有する酵素、またはこの酵素を含有する酵素含有物（静止菌体、乾燥菌体、菌体破砕物など、以下これらを単に「酵素」ということもある。）を作用させ、ガラクトース転移反応を起こすことによって行う。
【００２６】
この酵素合成に用いる上記酵素は、本発明方法におけるＮ-アセチルラクトサミンの収率の点から、β-1,4グリコシド結合に対する特異性の高いβ-ガラクトシダーゼが好ましい。そのようなβ-ガラクトシダーゼとしては、Bacillus circulans等のBacillus属由来のものや、Rhodotorula minutaやRhodotorula lactosa等のRhodotorula属由来のもの、Streptcoccus sp 6646k株、Streptpcoccus pneumoniae等のStreptcoccus属由来のもの、Sterigmatomycse elviae等のSterigmatomyces属由来のものが挙げられるが、特に、Bacillus circulans由来のβ-ガラクトシダーゼが好ましい。なお、この酵素は、上記各属の非組換え細菌を培養して得た天然の酵素であってもよく、また上記β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の全部または一部を導入した微生物その他の細胞を生育させることによって遺伝子工学的手法により製造したものであってもよい。ガラクトース転移作用を有する酵素の活性部位を含むポリペプチドでもよく、このようなポリペプチドは、遺伝子工学的手法により製造できる。
【００２７】
この酵素合成反応の条件は特に限定されることはなく、用いる合成酵素の反応条件として公知の条件に従って行うことができ、当業者が適宜選択することができるが、用いる酵素の至適pH及び至適温度条件下で反応を行うことが好ましい。基質混合物に関しても用いる酵素による反応に影響を与えない限り限定されないが、混合物の緩衝液溶液であることが好ましく、用いる酵素の至適pH及び至適温度条件下であるように調整されていることが好ましい。
【００２８】
反応形態としては、酵素反応の常套的手段が採用でき、酵素反応が進行する状態で基質と酵素を作用させればよい。例えば、基質溶液に酵素を接触させてもよく、またその逆でもよく、用いるこのような酵素を適当な担体に固定化して、基質溶液を接触させる方法も採用し得る。より具体的には、例えば、用いる酵素をビーズ状の担体に固定化してカラムに充填し、ラクトースとＮ-アセチルグルコサミンの混合物を通しながら連続して合成を行うことも可能である。
【００２９】
β-1,6-グリコシド結合を分解しうるβ-ガラクトシダーゼ（以下、β-1,6分解型ガラクトシダーゼという）とは、β-1,6-グリコシド結合分解能が、β-1,4-グリコシド結合分解能と同等以上、より好ましくは、β-1,6-グリコシド結合をより選択的に分解する性質を有するβ-ガラクトシダーゼであればよく、特に限定されない。具体的には、各基質に対するミカエリ定数の比（Ｎ-アセチルラクトサミン／Ｎ-アセチルアロラクトサミン）が２以上、好ましくは２．５以上、例えば２．５〜３．５程度であるβ-1,6分解型ガラクトシダーゼが挙げられる。例えば、Eschericia属由来のβ-ガラクトシダーゼや、β-ガラクトシダーゼの一種であるPenicillium属由来のラクターゼが挙げられるが、特に好ましくは、Eschericia coliが産生するβ-ガラクトシダーゼが挙げられる。
【００３０】
Ｎ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンを含有する混合物にβ-1,6分解型ガラクトシダーゼを作用させる場合の条件は、反応が生起する範囲、すなわち、Ｎ-アセチルアロラクトサミンが分解され、Ｎ-アセチルラクトサミンが出来るだけ分解しない条件において当業者が適宜選択することができるが、用いる酵素の至適pH、至適温度条件下で反応させることが好ましい。酵素の至適pH、至適温度等は用いるβ-1,6分解型ガラクトシダーゼの種類により変化し得るが、通常はpH５〜８、温度３０〜４０℃程度であり、例えば、Eschericia Coli由来β-ガラクトシダーゼを用いた場合は、pH 7〜7.5、30℃付近の反応条件が好ましい。
【００３１】
反応形態は、Ｎ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンを含有する溶液等の混合物にβ-1,6分解型ガラクトシダーゼが作用し得る限り特に限定されない。具体的には例えば、両物質を含有する溶液にβ-1,6分解型ガラクトシダーゼを添加して、該酵素の至適反応条件下、Ｎ-アセチルアロラクトサミンが分解するまで保持する方法、両物質を含有する溶液とβ-1,6分解型ガラクトシダーゼを含有する静止菌体等を接触させる方法、β-1,6分解型ガラクトシダーゼを適当な担体に固定して両物質を含有する混合物を接触させる方法等を使用できる。
【００３２】
前述のようにラクトース及びＮ-アセチルグルコサミンを基質として用いたＮ-アセチルラクトサミンの酵素合成反応により得られた反応液等の混合物を用いる場合は、β-1,6分解型ガラクトシダーゼを作用させる前に、β-1,6分解型ガラクトシダーゼのガラクトース転移作用によるＮ-アセチルアロラクトサミンの合成を防ぐため、合成反応終了溶液より未反応で残留しているＮ-アセチルグルコサミンを予め除去する必要がある。
【００３３】
この未反応のＮ-アセチルグルコサミンを予め除去する方法は、反応終了後の反応液等の混合物に存在する他の混在成分に大きな影響を与えることなくＮ-アセチルグルコサミンを除去できる方法であれば特に限定されない。例えば、必要に応じて粉炭やイオン交換樹脂による脱色・脱塩処理などの予備精製を混合物に施し、濃度が低い場合には、さらに減圧下で濃縮する等の処理をしてから、強酸性陽イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィーによる分離法や、活性炭・セライト（商品名）カラム等の吸着剤に吸着させ、メタノールと水による直線的又は段階的増加グラディエント法などによって容易にＮ-アセチルグルコサミンを除去することができる。
【００３４】
より具体的には、例えば、活性炭・セライトカラムによりＮ-アセチルグルコサミンを除去する場合、カラム容量の２〜６％（W/V）の合成反応終了液をカラムに供給し、流速６０〜２００ ml／hrで溶出液を流し、糖類を溶出させる。目安としては、Ｎ-アセチルグルコサミンやグルコース等単糖類は水で溶出され、ラクトースは、１０〜１５％のメタノール濃度で、Ｎ-アセチルラクトサミンは１４〜２０％のメタノール濃度で、Ｎ-アセチルアロラクトサミンは１８〜２２％濃度で、ガラクトシル-Ｎ-アセチルラクトサミンは２３％以上のメタノール濃度で溶出される。UV210nmの吸収（Ｎ-アセチル基の吸収）をモニターしながら分取し、第２ピークをＮ-アセチルラクトサミン画分として得る。この方法を利用することにより混合物も粗精製されたものとなるため、Ｎ-アセチルラクトサミン酵素合成法により得られた溶液等の混合物について本発明を利用する際の前処理として特に好ましい。ただし、カラムに供給する合成反応終了液の糖濃度は、２０〜６５％（w/w）程度が適当で、これよりも濃度が高いと分離パターンに乱れを生じる。
【００３５】
Ｎ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンを含有する溶液等の混合物にβ-1,6分解型ガラクトシダーゼを作用させることにより、Ｎ-アセチルラクトサミンの異性体であるＮ-アセチルアロラクトサミンは、効率的に単糖に分解され、Ｎ-アセチルラクトサミンはあまり分解されないので、異性体同士であるＮ-アセチルラクトサミンとＮ-アセチルアロラクトサミンは、二糖類であるＮ-アセチルラクトサミンと、Ｎ-アセチルアロラクトサミンが分解された単糖類という単純な組成となり、従来用いられている方法により容易に分離可能となる。
【００３６】
その分離方法としては、二糖類であるＮ-アセチルラクトサミンと単糖を容易に分離でき、かつＮ-アセチルラクトサミンを採取可能な方法である限り、特に限定されないが、活性炭・セライトクロマトグラフィーや強酸性陽イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー、分子ふるい等が挙げられる。例えば、活性炭カラムを用いると、水性溶液としてカラムにかけることにより単糖は素通りし、次いで吸着しているＮ-アセチルラクトサミンをメタノール等のアルコール類により溶出することができる。本発明の方法により、純度９５％以上のＮ-アセチルラクトサミンが得られる。
【００３７】
【実施例】
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
参考例１
β-ガラクトシダーゼ活性の測定方法
【００３８】
p-ニトロフェニル-β-ガラクトピラノシドを5 mM濃度になるように100 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）に溶解し、基質溶液とした。100μlの基質溶液に同緩衝液で様々な濃度に希釈した酵素溶液を20μl加え、３０℃で１０分間反応を行った。880μlの１% K2BO4・7H20水溶液を添加して反応を停止させた後、遊離したp-ニトロフェノール濃度をその特異的吸収である400 nmの吸光度を測定することで求めた。１Uの酵素活性は、１分間に１μmoleのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量と定義した。
【００３９】
参考例２
Ｎ-アセチルラクトサミン等のオリゴ糖の測定方法
後述の実施例中、各種オリゴ糖類の純度測定は、高速液体クロマトグラフィー（以下、HPLCという）を用い、下記条件にて行った。
尚、本HPLC分析法によるＮ-アセチルラクトサミンのリテンションタイムは、10.0分であった。
【００４１】
参考例３
酵素源のスクリーニング
ラクトース資化性を有する酵母であるLipomyces lipofer(IFO 0673)、Rhodotorula minuta(IFO 0928)、Rhodotorula lactosa(IFO 1423)、Sterigmatomyces elviae(IFO 1843)、（以上、理化学研究所微生物系統保存施設より購入）をマルツエキス寒天スラント培地で２８℃において６日間培養し、保存カルチャーを作製した。
【００４２】
ラクトースを唯一の炭素源とする培地（ラクトース；2%、ペプトン；1%、酵母エキス；1%、(NH4)2SO4；0.5%、K2HPO4；0.3%、KH2PO4；0.1%、MgSO4・7H2O；0.05%、pH 7.0）を５００ mlの坂口フラスコに５０ ml入れ、121℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。これに上記各保存カルチャーを１白金耳接種し、２８℃で４日間培養した。培養終了後、遠心分離法により菌体を集め、培養液と同量の生理食塩水で２回洗浄した後菌体を集め、−２０℃で凍結保存した。
【００４３】
上記方法にて調製した洗浄菌体を、終濃度が500 mg/mlになるように、100 mM酢酸ナトリウム緩衝溶液（pH 6.0）にラクトースとＮ-アセチルグルコサミンをそれぞれ０.５Ｍと１Ｍになるように溶解した基質溶液に懸濁し、６０℃で１７時間反応させた。その後遠心分離法によって得られた反応上澄液を煮沸浴中（５分間）で加熱して酵素を失活させた後、蒸留水で1/10に希釈し、HPLCで反応生成物の分析を行った。結果を表１に示す。碓氷らの方法（Bacillus ciruculans由来のβ-ガラクトシダーゼを用いるＮ-アセチルラクトサミンの製造方法）で合成した結果も併せて記載した。
【００４４】
【表１】
Rhodotorula属や、Sterigmatomyces属の酵母を用いた洗浄菌体もＮ-アセチルラクトサミンを生産し、特にRhodotorula属の酵母を用いた場合、Bacillus circulans由来β-ガラクトシダーゼを用いた酵素合成と同等のＮ-アセチルラクトサミン生産性が得られた。よって以下の実験にはRhodotorula minutaの洗浄菌体を使用した。
【００４６】
参考例４
酵素反応条件の決定
Bacillus circulans由来β-ガラクトシダーゼ（大和化成(株)製）の終濃度を0.15 U/mlとし、基質のラクトース（和光純薬工業（株）製）とＮ-アセチルグルコサミン（ナカライテスク製）を表２に示した濃度となるように100 mM酢酸ナトリウム緩衝溶液（pH 6.0）に添加して基質溶液を調製し、30℃、37℃または60℃で１７時間反応させた。煮沸浴中で５分間加熱し、酵素を失活させた後、蒸留水で1/10に希釈し、HPLCで分析した。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
表２に示した結果より、Ｎ-アセチルラクトサミンの生産量は、基質濃度に依存して増加するが、ガラクトース供与体であるラクトース濃度0.5Ｍ以上で、生産量はほぼ横ばいとなり、また、ラクトース濃度が低い程、及び、反応温度が高い程、異性体であるＮ-アセチルアロラクトサミンが生産される割合が増えることが分かった。この結果から、以後の実施例における酵素反応条件は、特に断らない限り、酵素濃度は0.15 U/mlとし、反応温度は３０℃とし、ラクトースとＮ-アセチルグルコサミンの基質濃度は、それぞれ０.５Ｍと１Ｍとし、反応時間は１７時間とした。
【００４９】
参考例５
（１）酵素溶液
由来の異なるβ-ガラクトシダーゼによる、Ｎ-アセチルラクトサミン（生化学工業（株）製、以下「LacNAc」という）とＮ-アセチルアロラクトサミン（生化学工業（株）製、以下「allo-LacNAc」という）に対する基質特異性を調べるため、Eschericia coli由来β-ガラクトシダーゼ（フナコシ（株）製）、Bacillus circulans由来β-ガラクトシダーゼ（大和化成（株）製ビオラクタＮ５）の各酵素を１０mg/ml濃度になるように１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー(ｐＨ 6.0）に溶解した。
【００５０】
（２）β-ガラクトシダーゼ活性測定法
本試験に用いる上記各酵素の活性を測定するための基質溶液として、１ｍＭ ｐ-ニトロフェニル-β-ガラクトピラノシド溶液を上記バッファーで調製し、試験管に基質溶液を１００μｌ分注し、続いて上記（１）の各酵素溶液２０μｌを各々添加し、ミキサーで撹拌後、３７℃、１０分間インキュベーションした。反応を終了させるために、１％硼酸カリウム（K2B4O7・4H2O）溶液を８８０μｌ加え、当該反応終了液中に存在する遊離したｐ-ニトロフェノール量を４００ｎｍの吸光度（Ｅ400）の測定により測定し、各酵素の活性を求めた（表３）。酵素濃度は下記の計算式より決定した。本条件下で、遊離ｐ-ニトロフェノールのモル吸光係数は１７．７×１０3である。
【００５１】
（計算式）
酵素濃度（Unit／ml）＝ (Eactivate − Eblank)／（17.7×0.02×10）×（希釈率）
式中、Eactivateは酵素反応終了後の反応液の４００ｎｍにおける吸光度を表し、 Eblankは熱により酵素を失活させた酵素溶液を用いて同様に処理した後の反応液の４００ｎｍにおける吸光度を表す。希釈率は、上記酵素溶液を実際の反応に使用した際の希釈率である。活性測定に際して使用する酵素溶液は、反応終了液のＥ400が０．５〜１．０になるように上記バッファーで希釈したものを使用した。１Uの酵素活性は、１分間に１μmoleのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量と定義した。
【００５２】
【表３】
（３）LacNAcおよびallo-LacNAcに対する各種由来のβ-ガラクトシダーゼのＫｍ値の比較
５００ｍＭとなるようにLacNAc（生化学工業（株）製）及びallo-LacNAc（生化学工業（株）製）を上記バッファーに溶解し、更に、それを同じバッファーで２倍ずつ希釈し、各８種の基質溶液を調製した（7.813〜500ｍＭ）。
上記（２）の測定結果より、（１）の各酵素溶液を０．２Ｕ／ｍｌ濃度になる様に上記バッファーで希釈した。
【００５４】
試験管に基質溶液を２５μｌずつ分注し、続いて酵素希釈液を５μｌ分注し、ミキサーで撹拌後、３７℃で１０分間インキュベーションした。反応終了後、反応液をあらかじめ冷やしておいた脱イオン水で１０倍に希釈し、酵素を失活させるため、沸騰水中に５分間放置した。室温以下に冷却させた後、反応終了液２０μｌを下記条件の高速液体クロマトグラフィーに注入し、反応終了液中のＮ-アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃという）量を定量した。（結果を図８、図９に示す。）
尚、E. Coli由来のβ-ガラクトシダーゼは、０．２Ｕ／ｍｌ濃度での測定ではLacNAc溶液に対する分解作用が測定されなかったため、２Ｕ／ｍｌ濃度にて再度実験を行った（図１０）。
【００５５】
（４）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析法
反応終了後の溶液中のＮ-アセチルグルコサミン量の測定は、島津製作所（株）製ＨＰＬＣ ＬＣ-１０Ａシステムを持ち、下記条件にて行った。
分析カラム：パックドカラム ＮＨ２Ｐ-５０ ４Ｅ（ガードカラム ＮＨ２Ｐ ５０Ｇ使用、昭和電工（株）製）
移動相：７０％アセトニトリル水溶液
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
温度：３７℃
検出：紫外検出装置（ＳＰＤ-１０ＡＶ）にてＵＶ２１０ｎｍの吸収を測定
本条件下で、GlcNAc、LacNAc、allo-LacNAcのリテンションタイムはそれぞれ、８．２分、１０．７分、１２．３分であった。
【００５６】
以上の結果より、β-ガラクトシダーゼの由来の違いにより基質への選択性は異なり、Bacillus circulans由来のβ-ガラクトシダーゼはD-ガラクトースとGlcNAcがβ-１,４グリコシド結合しているLacNAcに対し強い基質特異性を示し、E. Coli由来β-ガラクトシダーゼはD-ガラクトースとGlcNAcがβ-1,6グリコシド結合しているＮ-アセチルアロラクトサミンに対し顕著な基質特異性を示すことが判明した。従って、本発明においてβ-1,6グリコシド結合を切断し得る酵素としてE. Coli由来β-ガラクトシダーゼを用いることにより目的物質を殆ど分解することなく副生成物であるallo-GlcNAcを除去でき、最も好ましい。
また、それぞれの酵素の各基質についてのＫｍ値（ミカエリ定数）を算出した（表４）。
【００５７】
【表４】
実施例１
固定化酵母菌体法を用いたＮ-アセチルラクトサミンの連続生産法におけるＮ-アセチルラクトサミンの精製方法
（１）酵素合成（固定化菌体法）
参考例３で調製したRhodotorura minutaの洗浄菌体を常法（日本生物工学会編、生物化学工学実験書、初版第２刷、316（1993）、培風館）に従ってアルギン酸カルシウムで固定化した。具体的には、あらかじめ冷却した2.8%アルギン酸ナトリウム水溶液に菌体濃度が500 mg/mlになるように懸濁し、これを冷却0.5%塩化カルシウム水溶液中にパスツールピペットを用いて滴下し、冷暗所に一昼夜保管した。
【００５９】
予備実験として、固定化菌体（固定化菌体濃度0.44ml/ml）を用いたバッチ法（基質：ラクトース0.5Ｍ,Ｎ-アセチルグルコサミン1.0Ｍ,反応条件：pH6.0,60℃）によるＮ-アセチルラクトサミンの合成反応を行ったところ、60 mMのＮ-アセチルラクトサミンが反応液中に得られることが確認された。
【００６０】
固定化菌体をガラスカラム（1,6 x 10 cm）に充填し、固定化菌体カラムとした。100 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）にラクトースとＮ-アセチルグルコサミンをそれぞれ0.5Mと1Mになるように溶解した基質溶液を60℃に加温し、該カラムに流速2 ml/hrで供給し、連続的にＮ-アセチルラクトサミン合成反応を行った。
【００６１】
また、該固定化菌体カラムから溶出した反応液を、10 mlずつ分取し、この画分についてＮ-アセチルラクトサミンの生成量を1本置きにHPLCにて分析した。図１に本連続生産法によるＮ-アセチルラクトサミンの生産量の推移について示す。これにより少なくとも２週間は連続的にＮ-アセチルラクトサミンを生産できることが明らかとなった。
【００６２】
上記合成反応により得られた反応液（40 ml）を活性炭-セライト（1:1、和光純薬）カラム（8 x 13 cm）にかけ、カラムの３倍量の水でカラムを洗浄し、水（3000 ml）と40%メタノール（3000 ml）を用いたメタノール濃度の直線的増加グラディエント法により、流速；0.82 ml/min、分画液量；20 mlで溶出した。
【００６３】
溶出画分は、210 nm（アセチル基の吸収）におけるＵＶ吸収を測定することにより決定した。結果を図２に示す。
ピーク１を単糖画分（Ｎ-アセチルグルコサミン、グルコース）、ピーク２を二糖画分（Ｎ-アセチルラクトサミン、ラクトース、Ｎ-アセチルアロラクトサミン）、ピーク３（図示しない）を三糖画分（ガラクトシル-Ｎ-アセチルラクトサミン）とした。ピーク２に関して、UV210 nmの吸光度が0.8以上あるフラクションをプールし、粗Ｎ-アセチルラクトサミン画分とし、2.6 gの凍結乾燥品を得た。また、HPLCによる純度検定の結果、Ｎ-アセチルラクトサミンの純度は84％であり、その回収率は98.7%であった（HPLCによる分析結果を図３に示す）。
【００６４】
（２）E. coli由来のβ-ガラクトシダーゼによる精製
（１）で得た粗Ｎ-アセチルラクトサミン100 mgを1 mlの100 mMトリス-塩酸緩衝液（pH 7.2）に溶解し、Escherichia coli由来β-ガラクトシダーゼ（フナコシ製）を終濃度2 U/mlになるように添加し、３０℃で４時間反応させた。反応前後におけるオリゴ糖の消長を参考例２で示したＨＰＬＣ分析法により測定した。反応後３時間で、溶液中のＮ-アセチルアロラクトサミンとラクトースは、ほぼ完全に消失し、一方、Ｎ-アセチルラクトサミンは、その70%以上が残存していた。該反応液を活性炭クロマトグラフィー（1.5 x 1,4 cm）に吸着させ、Ｎ-アセチルグルコサミンなどの単糖類を水洗除去後、30%メタノールでＮ-アセチルラクトサミンを溶出した。UV210 nm吸収を示したフラクションをプールし、減圧下で濃縮した後、凍結乾燥することにより、60 mgのＮ-アセチルラクトサミンを得た。図４に得られたＮ-アセチルラクトサミンの10 mg/ml水溶液のHPLCパターンを示す。得られたＮ-アセチルラクトサミンの純度は99%以上であった。
【００６５】
実施例２
Bacillus circulans由来β-ガラクトシダーゼを用いたＮ-アセチルラクトサミン酵素合成法におけるE. coli由来β-ガラクトシダーゼを用いたＮ-アセチルラクトサミン精製方法
【００６６】
（１）酵素合成（β-ガラクトシダーゼを使用）
Bacillus circulans由来β-ガラクトシダーゼ（大和化成（株）製）の酵素終濃度が0.15 U/mlになるように、ラクトース0.5 MとＮ-アセチルグルコサミン1 Mを調製した100 mM酢酸ナトリウム緩衝水溶液（pH 6.0）に添加して基質溶液を調製し、30℃で、17時間反応させた。その後、煮沸浴中で５分間加熱し、酵素を失活させた。得られた反応液（5 ml）を活性炭-セライト（1:1、和光純薬）カラム（1.5 x 45 cm）で精製した。具体的には、得られた反応液をカラムに供給後、カラムをカラムの２倍量の水で洗浄し、水（500 ml）と30%メタノール（500 ml）を用いたメタノール濃度の直線的増加グラディエント法で、流速；0.82 ml/min、分画液量；10 mlで、溶出した。溶出画分を210 nm（アセチル基吸収）におけるＵＶ吸収とE690 nm（パーク-ジョンソン法による還元糖の吸収）で測定することによって溶出される各種糖類を決定した。結果を図５に示す。
【００６７】
E690 nmの吸収が検出された最初のピークをＮ-アセチルグルコサミン画分、２番目のピークをグルコース画分、３番目のピークをラクトース画分、４番目のピークをＮ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミン画分とし、UV210 nmの吸光度の検出における２番目のピークについて、UV210 nmの吸光度が0.8以上あるフラクションを集め、Ｎ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンを含む画分とし、その画分を凍結乾燥し、240 mgの純白パウダーを得た。また、その純度は90%であった（HPLC分析による結果を図６に示す）。
【００６８】
（２）精製
上記でＮ-アセチルラクトサミン及びＮ-アセチルアロラクトサミンを含む画分から得られた純白パウダーの100 mg/ml溶液にEschericia coli由来β-ガラクトシダーゼを終濃度2 U/mlになるように添加し、30℃で３時間処理した。100℃,15分間の煮沸処理により反応を停止させた後、この溶液を活性炭カラム（1.5 x 1,4 cm）に吸着させ、カラムをカラムの５倍量の水で洗浄した。その後、20%メタノール水溶液でＮ-アセチルラクトサミンを溶出させ、濃縮後、凍結乾燥した。その結果、70 mgの純白パウダーを得た。得られたＮ-アセチルラクトサミンの凍結乾燥品10 mg/ml溶液を用いたHPLC分析結果より、Ｎ-アセチルラクトサミンの純度は、97.3%であった（HPLC分析による結果を図７に示す）。
【００６９】
【発明の効果】
本発明の精製されたＮ-アセチルラクトサミンの製造方法によれば、カラムによる精製回数が少ないため、従来の方法よりも高い回収率が得られ、メタノール等の溶出液の使用量も少ない。さらに非常に高純度のＮ-アセチルラクトサミンを得ることができる。
本発明の方法を用いると極めて純度の高いＮ-アセチルラクトサミンを得ることができるので、ビヒダス菌増殖促進因子としての活性の高いＮ-アセチルラクトサミンを容易に製造することができる。また、単糖類、Ｎ-アセチルアロラクトサミン、ラクトースの含有率が極めて低いＮ-アセチルラクトサミンが得られるので、これらの夾雑糖類に起因する甘味やカロリーが使用上の障害になったり、乳糖（ラクトース）不耐症体質者が下痢をおこしたりするといった問題がない。また、本発明の精製方法により得られるＮ-アセチルラクトサミンは高純度であるため、Ｎ-アセチルラクトサミンを含有する生理活性複合糖脂質のような物質の合成原料をして有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 固定化菌体法によるＮ-アセチルラクトサミンの連続的製造において得られるＮ-アセチルラクトサミン濃度を示すグラフである。
【図２】 固定化菌体法によるＮ-アセチルラクトサミンの連続的製造において得られる混合物についての活性炭・セライトクロマトグラフィーにおける糖の溶出パターンを示す図である。
【図３】 固定化菌体法によるＮ-アセチルラクトサミンの連続的製造において得られた混合物を活性炭・セライトカラムにかけ分取した粗Ｎ-アセチルラクトサミン画分のHPLCによる分析結果を示す図である。
【図４】 E. coli由来β-ガラクトシダーゼを用いた本発明の方法によりＮ-アセチルラクトサミンを製造した際に得られたＮ-アセチルラクトサミンのHPLC分析による結果を示す図である。
【図５】 Bacillus circulans由来β-ガラクトシダーゼを用いたＮ-アセチルラクトサミンの製造において得られる混合物についての活性炭・セライトクロマトグラフィーにおける糖の溶出パターンを示す図である。
【図６】 Bacillus circulans由来β-ガラクトシダーゼを使用したＮ-アセチルラクトサミンの製造において得られた混合物を活性炭・セライトカラムにかけ分取した粗Ｎ-アセチルラクトサミン画分のHPLCによる分析結果を示す図である。
【図７】 E. coli由来β-ガラクトシダーゼを用いた本発明の方法によりＮ-アセチルラクトサミンを製造した際に得られたＮ-アセチルラクトサミンのHPLC分析による結果を示す図である。
【図８】 Ｎ-アセチルラクトサミンまたはＮ-アセチルアロラクトサミンを基質として、Bacillus circulans由来β-ガラクトシダーゼを用いて行った酵素反応におけるＮ-アセチルグルコサミンの生成量を示す図である。
【図９】 Ｎ-アセチルラクトサミンまたはＮ-アセチルアロラクトサミンを基質として、E. coli由来β-ガラクトシダーゼを用いて行った酵素反応におけるＮ-アセチルグルコサミンの生成量を示す図である。
【図１０】 Ｎ-アセチルラクトサミンまたはＮ-アセチルアロラクトサミンを基質として、E. coli由来β-ガラクトシダーゼを用いて行った酵素反応におけるＮ-アセチルグルコサミンの生成量を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to N-acetyllactosamine in which N-acetylglucosamine and D-galactose are linked by β-1,4, and N-acetyl in which N-acetylglucosamine and D-galactose are linked by β-1,6 The present invention relates to a method for purifying N-acetyllactosamine from a mixture containing allolactosamine.
[0002]
[Prior art]
N-acetyllactosamine is a disaccharide in which D-galactose and N-acetylglucosamine are linked by β-1,4 glycoside, and is contained in the sugar chains of human milk oligosaccharides, lipopolysaccharides, various glycoproteins and glycolipids. It is an oligosaccharide that exists and is biochemically very important. Moreover, since it has the growth activity of bifidobacteria which is a kind of enteric bacteria, and exhibits an excellent intestinal regulating action, it is attracting attention for use in highly nutritive foods such as infant formula. Furthermore, in recent years, attention has also been focused on the physiological activity of glycoconjugates containing N-acetyllactosamine. For example, sialyl Le having cell adhesion inhibitory activityxIt is also becoming important as a raw material in the synthesis of sugar chains and the like.
[0003]
As synthetic methods for N-acetyllactosamine, chemical synthesis and enzyme synthesis are known, but the target substance can be obtained in a single-step reaction. There has been extensive research in law. As methods for synthesizing N-acetyllactosamine using an enzyme reaction performed so far, a method using galactosyltransferase and a method using β-galactosidase have been reported.
[0004]
As a method using galactosyltransferase, for example, a method of synthesizing N-acetyllactosamine from uridine diphosphate galactose and N-acetylglucosamine reported by Brew et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 59, 491, 1968 However, since uridine diphosphate galactose used as a substrate is expensive, it is not feasible as a synthesis method on an industrial scale. As a method for solving this problem, Ideya et al., In order to synthesize uridine diphosphate galactose in the reaction system, coexisting galactosyltransferase together with dried cells of the genus Toluropsis, such as uridine-5′-monophosphate, galactose. And N-acetylglucosamine have been invented (Japanese Patent Laid-Open No. 62-134096). Specifically, 0.2 mol of N-acetyllactosamine is produced per mol of galactose, and 130 mg of N-acetyllactosamine having a purity of 92% is obtained by subjecting 10 ml of the reaction solution to denucleic acid and activated carbon chromatography. Has been successful. However, in this method, since uridine diphosphate galactose must first be synthesized in the reaction system, it takes 5 days to complete the reaction, and it is necessary to further devise the synthesis method on an industrial scale. is there.
[0005]
On the other hand, as another approach, a method using a galactose transfer reaction such as β-galactosidase has been reported.
For example, Usui et al. Have reported a method of producing N-acetyllactosamine by reacting β-galactosidase derived from Bacillus circulans with lactose and N-acetylglucosamine, and the amount of galactose donor is 0. It shows that 42 mol of N-acetyllactosamine is synthesized in the reaction solution (Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-49792). However, in the reaction solution after the completion of this reaction, in addition to the raw material lactose and N-acetylglucosamine, side reaction products N-acetylallactosamine and galactosyl-N-acetyllactosamine are also present. In order to fractionate only the substance N-acetyllactosamine, it is necessary to combine means such as activated carbon chromatography, gel filtration, and high performance liquid chromatography. In particular, fractional purification with N-acetylallactosamine requires advanced chromatographic techniques.
[0006]
In addition, Osaka and others use β-galactosidase derived from Diplococcus pneumoniae (currently Streptpcoccus pneumoniae), a β-galactosidase with high β-1,4 bond selectivity, and N-acetyl using phenylgalactopyranoside derivatives as galactose donors. A method for producing lactosamine has been reported (JP-A-6-335395). This method is a method of synthesizing N-acetyllactosamine without producing the by-product N-acetylallactosamine produced in the above method. However, the productivity of N-acetyllactosamine is 60 to 80 mM, which is lower than the method of Usui and others. Instead of using an expensive substrate, the reaction yield per mol of the substrate is low, and on an industrial scale. Not very suitable for use.
[0007]
In these methods for producing N-acetyllactosamine, since the focus is on the synthesis method, the purification method is generally used in the laboratory, such as activated carbon chromatography or gel filtration chromatography. Was only applied. For example, in order to obtain high-purity N-acetyllactosamine using an activated carbon-celite column, it is necessary to repeatedly purify the column, and the recovery rate of N-acetyllactosamine is reduced to about 40 to 45%. There is a problem.
[0008]
Therefore, in order to obtain high-purity N-acetyllactosamine in a high yield and at a lower cost, the method using only activated carbon chromatography is not appropriate, and it was thought that some device should be devised. .
[0009]
On the other hand, a gel filtration method in which separation by molecular size is performed using a gel filtration agent based on dextran, cellulose, polyacrylamide or the like formed with three-dimensional crosslinks is also promising as a method for purifying N-acetyllactosamine. However, since these gel filter media have a short life span, the appropriate load per unit resin is small and the separation performance becomes extremely poor in an overload state, and these gel filter media are expensive, it is practically a laboratory. It has been found that it can only be applied to scale use.
[0010]
As an example of using a purification method other than the purification method by a combination of these chromatography in the amino sugar production method, a porcine testis derived from a substrate containing lactose and N-acetylglucosamine when producing lacto-N-biose Of β-galactosidase of galactosidase to cause galactose transfer reaction and then hydrolyze and remove by-product isomers and unreacted lactose with β-galactosidase produced by Bacillus circulans. (JP-A-6-253878). Since the target substance here is lacto-N-biose I, both N-acetyllactosamine and N-acetylallolactosamine are substances to be removed as by-products, and β- produced by Bacillus circulans It is described that galactosidase degrades both β-1,4 bonds and β-1,6 bonds, and thus both substances are hydrolyzed. Therefore, this method cannot be used for fractionation of N-acetyllactosamine and N-acetylallolactosamine.
[0011]
As oligosaccharide separation methods, a method using a synthetic adsorbent composed of a porous polymer having no ion exchange group (Japanese Patent Laid-Open No. Sho 61-130297), a method using a strongly acidic cation exchange resin (Japanese Patent Publication No. 6-125). 6-14870) is known. In the former method, the liquid to be treated is supplied to a column packed with a synthetic adsorbent, and the adsorbed saccharide is eluted with a concentration gradient of water or water and alcohol. Depending on the difference in affinity between the saccharide and the adsorbent, Sugars are eluted in order of increasing molecular weight. Oligosaccharides of disaccharide or higher adsorbed on this column are practically impossible to elute with water, and an alcohol solution is required for elution. On the other hand, the latter method uses chromatography performed using a strongly acidic cation exchange resin, and the oligosaccharide component in the reaction solution has a molecular size exclusion effect (a large molecule that cannot penetrate into the crosslinked resin). Which is separated by the effect of first elution from the sugar of the size).
[0012]
Since the adsorbents and resins used in these methods are relatively inexpensive and have excellent durability, they have already been applied to mass purification of certain oligosaccharides. There are only analysis examples of N-acetylglucosamine by chromatography, and there are few reports applied to the purification of amino sugar-containing oligosaccharides.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, industrial production of N-acetyllactosamine is promising based on enzymatic methods, in particular, production based on galactose transfer reaction with β-galactosidase using lactose and N-acetylglucosamine as substrates. However, the reaction product obtained by the reaction contains N-acetyllactosamine and the like in addition to N-acetyllactosamine.
[0014]
As described above, since N-acetyllactosamine and N-acetylallolactosamine are isomers, in order to obtain only N-acetyllactosamine from the mixture, column chromatography or the like as usual is used. In the method used, the operation was repeated or advanced techniques were required. Therefore, the present invention is a simple and inexpensive method for purifying N-acetyllactosamine from a mixture such as a solution containing N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine, and can be used on an industrial scale. It aims to provide a simple method.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have decomposed the β-1,6 glycosidic bond into a mixture such as a solution containing N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine. As a result of acting β-galactosidase, which is excellent in action, N-acetylallactosamine was easily decomposed into monosaccharides and N-acetyllactosamine was hardly decomposed, and the present invention was completed.
[0016]
That is, the present invention relates to a method for producing purified N-acetyllactosamine from a mixture containing N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine, wherein the mixture has a β-1,6-glycosidic bond. Provided is a method characterized by treating with cleavable β-galactosidase to degrade and remove N-acetylallactosamine.
[0017]
In the method of the present invention, the mixture may further contain lactose.
In a preferred embodiment of the above-described method of the present invention, as the mixture, a reaction mixture obtained by enzymatic synthesis of N-acetyllactosamine using lactose and N-acetylglucosamine as a substrate can be used. A fraction containing N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine collected by performing a separation method using can be more preferably used.
[0018]
In a preferred embodiment of the method of the present invention, β-galactosidase capable of cleaving a β-1,6-glycoside bond derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia is used.
In a preferred embodiment of the method of the present invention using the reaction mixture obtained in the production of N-acetyllactosamine by an enzyme synthesis reaction, the enzyme used for the enzyme synthesis reaction is a β--1,4-bond-selective β- Use galactosidase.
[0019]
In a preferred embodiment of the method of the present invention, β-galactosidase derived from a microorganism of the genus Rhodotorula, Bacillus, or Streptococcus is used as β-galactosidase having high β-1,4 binding selectivity. By using the method of the present invention, N-acetyllactosamine having a purity of 95% or more can be obtained.
[0020]
As a series of steps using the method of the present invention, for example, in an enzyme synthesis method of N-acetyllactosamine using a substrate containing lactose and N-acetylglucosamine, a washed bacterial cell of Rhodotorura minuta or β-galactosidase derived from Bacillus circulans is used. A fraction containing N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine obtained from the reaction mixture by using activated carbon was reacted with the substrate to effect N-acetyllactosamine synthesis reaction. N-acetyllactosamine with a purity of 95% or more can be obtained from the treatment solution by galactosidase treatment.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in further detail below.
N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine are isomers, both of which are disaccharides having D-galactose and N-acetylglucosamine as constituent sugars. The former is a disaccharide in which both constituent sugars are linked by β-1,4 glycoside, and the latter is a disaccharide in which β-1,6 glycoside is bonded.
[0022]
The mixture containing N-acetyllactosamine and N-acetylallolactosamine used in the method of the present invention may be a mixture such as a solution containing both, and is not particularly limited by the method for producing the mixture or the origin. The method of the present invention can be preferably applied to, for example, a reaction mixture in the synthesis of N-acetyllactosamine by an enzymatic reaction using a substrate containing lactose and N-acetylglucosamine.
[0023]
Although the content ratio of N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine in the mixture is not particularly limited, N-acetyllactosamine can be used to increase the yield of N-acetyllactosamine after purification by the method of the present invention. It is preferable that the content ratio of is high. The reaction mixture obtained by enzymatic synthesis of N-acetyllactosamine using the above-mentioned substrate containing lactose and N-acetylglucosamine is usually 10: 1 to 10 with N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine. The molar ratio is about 2 and the method of the present invention can be preferably applied to such a mixture.
[0024]
Moreover, the said mixture may contain the lactose etc. which are the substrates of the said enzyme reaction, for example. Such a substance can be easily separated by a normal separation operation as described later. However, N-acetylglucosamine must be removed as described later.
[0025]
The enzymatic synthesis of N-acetyllactosamine using the above-mentioned substrate containing lactose and N-acetylglucosamine is specifically an enzyme having a galactose transfer action on a substrate containing lactose and N-acetylglucosamine, Alternatively, it is carried out by causing a galactose transfer reaction by causing an enzyme-containing material containing this enzyme (stationary cells, dried cells, crushed cells, etc., hereinafter, these may be simply referred to as “enzymes”) to act.
[0026]
The enzyme used for the enzyme synthesis is preferably β-galactosidase having high specificity for β-1,4 glycosidic bond from the viewpoint of the yield of N-acetyllactosamine in the method of the present invention. Examples of such β-galactosidase include those derived from the genus Bacillus such as Bacillus circulans, those derived from the genus Rhodotorula such as Rhodotorula minuta and Rhodotorula lactosa, those derived from the genus Streptcoccus such as Streptcoccus sp 6646k strain, Streptpcoccus pneumoniae, and Sterigmatomycse elviae. And those derived from the genus Sterigmatomyces, such as β-galactosidase derived from Bacillus circulans. The enzyme may be a natural enzyme obtained by culturing the non-recombinant bacteria of each genus, or a microorganism or other cell into which all or part of the gene encoding β-galactosidase has been introduced. It may be produced by genetic engineering techniques by growing. A polypeptide containing an active site of an enzyme having a galactose transfer action may be used, and such a polypeptide can be produced by a genetic engineering technique.
[0027]
The conditions for the enzyme synthesis reaction are not particularly limited, and can be performed according to known conditions as the reaction conditions for the synthetic enzyme to be used, and can be appropriately selected by those skilled in the art. It is preferable to carry out the reaction under suitable temperature conditions. The substrate mixture is not limited as long as it does not affect the reaction by the enzyme to be used, but it is preferably a buffer solution of the mixture, and adjusted to be at the optimum pH and temperature conditions of the enzyme to be used. Is preferred.
[0028]
As a reaction form, a conventional means of an enzyme reaction can be adopted, and a substrate and an enzyme may be allowed to act while the enzyme reaction proceeds. For example, an enzyme may be brought into contact with the substrate solution, or vice versa, and a method in which such an enzyme to be used is immobilized on a suitable carrier and the substrate solution is brought into contact may be employed. More specifically, for example, the enzyme to be used can be immobilized on a bead-shaped carrier, packed in a column, and continuously synthesized while passing through a mixture of lactose and N-acetylglucosamine.
[0029]
β-galactosidase (hereinafter referred to as β-1,6-degradable galactosidase) that can degrade β-1,6-glycosidic bond is defined as β-1,6-glycosidic bond resolution It is equal to or higher than the resolution, and more preferably β-galactosidase having a property of more selectively decomposing β-1,6-glycoside bond, and is not particularly limited. Specifically, the ratio of Michaelis constant to each substrate (N-acetyllactosamine / N-acetylallolactosamine) is 2 or more, preferably 2.5 or more, for example, about 2.5 to 3.5. Examples include 1,6-degraded galactosidase. Examples include β-galactosidase derived from the genus Eschericia and lactase derived from the genus Penicillium which is a kind of β-galactosidase, and particularly preferred is β-galactosidase produced by Escherichia coli.
[0030]
The condition for allowing β-1,6-degradable galactosidase to act on a mixture containing N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine is the range in which the reaction occurs, that is, N-acetylallactosamine is degraded. Although those skilled in the art can appropriately select N-acetyllactosamine under conditions that do not decompose as much as possible, it is preferable to carry out the reaction under the optimum pH and optimum temperature conditions of the enzyme used. The optimum pH, optimum temperature, etc. of the enzyme can vary depending on the type of β-1,6-degradable galactosidase used, but it is usually pH 5-8 and temperature 30-40 ° C., for example, Escherichia Coli-derived β- When galactosidase is used, reaction conditions of
[0031]
The reaction form is not particularly limited as long as β-1,6-degradable galactosidase can act on a mixture such as a solution containing N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine. Specifically, for example, a method in which β-1,6-degradable galactosidase is added to a solution containing both substances and kept under the optimal reaction conditions of the enzyme until N-acetylallactosamine is decomposed, both A method of contacting a solution containing a substance with a stationary cell containing β-1,6-degradable galactosidase, etc., and fixing a β-1,6-degradable galactosidase on an appropriate carrier and contacting a mixture containing both substances Can be used.
[0032]
As described above, when using a mixture such as a reaction solution obtained by enzymatic synthesis of N-acetyllactosamine using lactose and N-acetylglucosamine as a substrate, before the action of β-1,6-degradable galactosidase, In addition, in order to prevent the synthesis of N-acetylallactosamine due to the galactose transfer action of β-1,6-degraded galactosidase, it is necessary to previously remove unreacted N-acetylglucosamine from the synthesis reaction completion solution. .
[0033]
The method for removing the unreacted N-acetylglucosamine in advance is particularly a method that can remove N-acetylglucosamine without greatly affecting other mixed components present in the mixture such as the reaction solution after the reaction is completed. It is not limited. For example, if necessary, the mixture is subjected to preliminary purification such as decolorization and desalting treatment with pulverized coal or ion exchange resin. If the concentration is low, the mixture is further concentrated under reduced pressure, and then subjected to strong acid cation. N-acetylglucosamine can be easily removed by adsorption using an ion-exchange resin chromatographic separation method or an adsorbent such as activated carbon / Celite (trade name) column and linear or stepwise gradient using methanol and water. can do.
[0034]
More specifically, for example, when removing N-acetylglucosamine with an activated carbon / celite column, 2 to 6% (W / V) of the synthesis reaction completion solution is supplied to the column, and the flow rate is 60 to 200 ml. The eluate is run at / hr to elute the saccharide. As a guide, N-acetylglucosamine and monosaccharides such as glucose are eluted with water, lactose is 10-15% methanol concentration, N-acetyllactosamine is 14-20% methanol concentration, Lactosamine is eluted at a concentration of 18-22% and galactosyl-N-acetyllactosamine is eluted at a methanol concentration of 23% or more. Fractionating while monitoring absorption at 210 nm (absorption of N-acetyl group), a second peak is obtained as an N-acetyllactosamine fraction. Since the mixture is also roughly purified by using this method, it is particularly preferred as a pretreatment when using the present invention for a mixture such as a solution obtained by the N-acetyllactosamine enzyme synthesis method. However, the sugar concentration of the synthesis reaction end solution supplied to the column is appropriately about 20 to 65% (w / w), and if the concentration is higher than this, the separation pattern is disturbed.
[0035]
N-acetylallactosamine which is an isomer of N-acetyllactosamine by allowing β-1,6-degradable galactosidase to act on a mixture such as a solution containing N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine Is efficiently decomposed into monosaccharides and N-acetyllactosamine is not degraded so much, so the isomers N-acetyllactosamine and N-acetylallolactosamine are disaccharides N-acetyllactosamine And a simple composition of monosaccharides obtained by decomposing N-acetylallactosamine, which can be easily separated by a conventionally used method.
[0036]
The separation method is not particularly limited as long as N-acetyllactosamine, which is a disaccharide, can be easily separated from monosaccharide, and N-acetyllactosamine can be collected. Examples thereof include chromatography using a strongly acidic cation exchange resin, molecular sieving and the like. For example, when an activated carbon column is used, the monosaccharide passes through the column as an aqueous solution, and then the adsorbed N-acetyllactosamine can be eluted with alcohols such as methanol. By the method of the present invention, N-acetyllactosamine having a purity of 95% or more is obtained.
[0037]
【Example】
Examples The present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
Reference example 1
Method for measuring β-galactosidase activity
[0038]
p-Nitrophenyl-β-galactopyranoside was dissolved in 100 mM sodium acetate buffer (pH 6.0) to a concentration of 5 mM to obtain a substrate solution. 20 μl of enzyme solution diluted to various concentrations with the same buffer was added to 100 μl of the substrate solution, and the reaction was carried out at 30 ° C. for 10 minutes. 880μl of 1% K2BOFour・ 7H2After stopping the reaction by adding 0 aqueous solution, the liberated p-nitrophenol concentration was determined by measuring its specific absorption at 400 nm. 1 U of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that liberates 1 μmole of p-nitrophenol per minute.
[0039]
Reference example 2
Method for measuring oligosaccharides such as N-acetyllactosamine
In Examples described later, the purity of various oligosaccharides was measured using high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HPLC) under the following conditions.
The retention time of N-acetyllactosamine according to this HPLC analysis method was 10.0 minutes.
[0041]
Reference example 3
Enzyme source screening
Lipomyces lipofer (IFO 0673), Rhodotorula minuta (IFO 0928), Rhodotorula lactosa (IFO 1423), Sterigmatomyces elviae (IFO 1843), which are lactose-utilizing yeasts Was cultured in malt extract agar slant medium at 28 ° C. for 6 days to prepare a preservation culture.
[0042]
Medium containing lactose as the sole carbon source (lactose; 2%, peptone; 1%, yeast extract; 1%, (NHFour)2SOFour; 0.5%, K2HPOFour; 0.3%, KH2POFour0.1% MgSOFour・ 7H2O; 0.05%, pH 7.0) was placed in a 500 ml Sakaguchi flask and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. One platinum loop of each of the above preservation cultures was inoculated and cultured at 28 ° C. for 4 days. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, washed twice with the same amount of physiological saline as the culture solution, and then collected and stored frozen at -20 ° C.
[0043]
The washed cells prepared by the above method are adjusted to 0.5 M and 1 M, respectively, with lactose and N-acetylglucosamine in a 100 mM sodium acetate buffer solution (pH 6.0) so that the final concentration is 500 mg / ml. The resultant was suspended in the substrate solution dissolved in the solution and reacted at 60 ° C. for 17 hours. Then, the reaction supernatant obtained by centrifugation is heated in a boiling bath (5 minutes) to inactivate the enzyme, then diluted to 1/10 with distilled water, and the reaction product is analyzed by HPLC. went. The results are shown in Table 1. The result of synthesis by the method of Usui et al. (Method for producing N-acetyllactosamine using β-galactosidase derived from Bacillus ciruculans) is also described.
[0044]
[Table 1]
Washed cells using yeasts of the genus Rhodotorula and Sterigmatomyces also produce N-acetyllactosamine, and in particular when using yeasts of the genus Rhodotorula, N-equivalent to enzymatic synthesis using β-galactosidase derived from Bacillus circulans. Acetyl lactosamine productivity was obtained. Therefore, Rhodotorula minuta washed cells were used for the following experiments.
[0046]
Reference example 4
Determination of enzyme reaction conditions
The final concentration of Bacillus circulans-derived β-galactosidase (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.) is 0.15 U / ml, and the substrates lactose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and N-acetylglucosamine (manufactured by Nacalai Tesque) are listed in Table 2. A substrate solution was prepared by adding to 100 mM sodium acetate buffer solution (pH 6.0) so as to have the concentration shown in FIG. 1, and reacted at 30 ° C., 37 ° C. or 60 ° C. for 17 hours. After heating for 5 minutes in a boiling bath to inactivate the enzyme, it was diluted 1/10 with distilled water and analyzed by HPLC. The results are shown in Table 2.
[0047]
[Table 2]
From the results shown in Table 2, the production amount of N-acetyllactosamine increases depending on the substrate concentration, but at a lactose concentration of 0.5 M or more which is a galactose donor, the production amount is almost flat, and lactose It was found that the lower the concentration and the higher the reaction temperature, the higher the rate of production of the isomer N-acetylallactosamine. From these results, the enzyme reaction conditions in the following examples are as follows. Unless otherwise specified, the enzyme concentration is 0.15 U / ml, the reaction temperature is 30 ° C., and the substrate concentrations of lactose and N-acetylglucosamine are 0.5 M, respectively. And the reaction time was 17 hours.
[0049]
Reference Example 5
(1) Enzyme solution
N-acetyllactosamine (manufactured by Seikagaku Corporation, hereinafter referred to as “LacNAc”) and N-acetylallactosamine (manufactured by Seikagaku Corporation, hereinafter referred to as “allo-LacNAc”) by β-galactosidase of different origin In order to examine the substrate specificity for the enzyme, β-galactosidase derived from Escherichia coli (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) and β-galactosidase derived from Bacillus circulans (Biolacta N5 manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.) have a concentration of 10 mg / ml. So as to dissolve in 100 mM sodium acetate buffer (pH 6.0).
[0050]
(2) β-galactosidase activity measurement method
As a substrate solution for measuring the activity of each enzyme used in this test, a 1 mM p-nitrophenyl-β-galactopyranoside solution is prepared with the above buffer, and 100 μl of the substrate solution is dispensed into a test tube. Then, 20 μl of each enzyme solution of (1) above was added, stirred with a mixer, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. To complete the reaction, 1% potassium borate (K2BFourO7・ 4H2O) 880 μl of the solution was added, and the amount of released p-nitrophenol present in the reaction-terminated solution was determined by measuring the absorbance (E400) To determine the activity of each enzyme (Table 3). The enzyme concentration was determined from the following calculation formula. Under this condition, the molar extinction coefficient of free p-nitrophenol is 17.7 × 10ThreeIt is.
[0051]
(a formula)
Enzyme concentration (Unit / ml) = (Eactivate − Eblank) / (17.7 × 0.02 × 10) × (dilution rate)
Where EactivateRepresents the absorbance at 400 nm of the reaction solution after completion of the enzyme reaction, EblankRepresents the absorbance at 400 nm of the reaction solution after the same treatment using an enzyme solution in which the enzyme was deactivated by heat. The dilution rate is a dilution rate when the enzyme solution is used in an actual reaction. The enzyme solution used for the activity measurement is E of the reaction end solution.400Diluted with the above buffer so as to be 0.5 to 1.0 was used. 1 U of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that liberates 1 μmole of p-nitrophenol per minute.
[0052]
[Table 3]
(3) Comparison of Km values of β-galactosidase of various origins for LacNAc and allo-LacNAc
LacNAc (manufactured by Seikagaku Corporation) and allo-LacNAc (manufactured by Seikagaku Corporation) were dissolved in the above buffer so that the concentration was 500 mM, and further diluted two-fold with the same buffer. A seed substrate solution was prepared (7.813-500 mM).
From the measurement result of (2) above, each enzyme solution of (1) was diluted with the above buffer so as to have a concentration of 0.2 U / ml.
[0054]
25 μl of the substrate solution was dispensed into each test tube, followed by 5 μl of the enzyme dilution, stirred with a mixer, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was diluted 10 times with pre-cooled deionized water and left in boiling water for 5 minutes to deactivate the enzyme. After cooling to room temperature or lower, 20 μl of the reaction end solution was injected into high performance liquid chromatography under the following conditions, and the amount of N-acetylglucosamine (hereinafter referred to as GlcNAc) in the reaction end solution was quantified. (The results are shown in FIGS. 8 and 9.)
In addition, E. Coli-derived β-galactosidase was measured again at a concentration of 0.2 U / ml. Therefore, the experiment was conducted again at a concentration of 2 U / ml because the degradation action on the LacNAc solution was not measured (FIG. 10).
[0055]
(4) High performance liquid chromatography (HPLC) analysis method
The amount of N-acetylglucosamine in the solution after completion of the reaction was measured using the HPLC LC-10A system manufactured by Shimadzu Corporation under the following conditions.
Analytical column: packed column NH2P-50 4E (guard column NH2P 50G used, manufactured by Showa Denko KK)
Mobile phase: 70% acetonitrile aqueous solution
Flow rate: 0.7 ml / min
Temperature: 37 ° C
Detection: UV absorption at 210nm is measured with an ultraviolet detector (SPD-10AV)
Under these conditions, the retention times of GlcNAc, LacNAc, and allo-LacNAc were 8.2 minutes, 10.7 minutes, and 12.3 minutes, respectively.
[0056]
Based on the above results, the selectivity to the substrate varies depending on the origin of β-galactosidase, and β-galactosidase derived from Bacillus circulans is a strong substrate for LacNAc in which D-galactose and GlcNAc are β-1,4 glycosidic bonds. E. Coli-derived β-galactosidase was found to show remarkable substrate specificity for N-acetylallactosamine in which D-galactose and GlcNAc are linked by β-1,6 glycoside. Therefore, by using E. Coli-derived β-galactosidase as an enzyme capable of cleaving the β-1,6 glycosidic bond in the present invention, allo-GlcNAc, which is a byproduct, can be removed with almost no degradation of the target substance. preferable.
Moreover, Km value (Michaeli constant) about each substrate of each enzyme was calculated (Table 4).
[0057]
[Table 4]
Example 1
Purification method of N-acetyllactosamine in continuous production method of N-acetyllactosamine using immobilized yeast cell method
(1) Enzymatic synthesis (immobilized cell method)
The washed microbial cells of Rhodotorura minuta prepared in Reference Example 3 were immobilized with calcium alginate according to a conventional method (edited by the Japanese Society for Biotechnology, Biochemical Engineering Experiment, First Edition, Second Printing, 316 (1993), Baifukan). Specifically, it is suspended in a pre-cooled 2.8% aqueous sodium alginate solution so that the cell concentration is 500 mg / ml, and this is dropped into a cooled 0.5% aqueous calcium chloride solution using a Pasteur pipette, and placed in a cool dark place. Stored all day and night.
[0059]
As a preliminary experiment, N by a batch method (substrate: lactose 0.5 M, N-acetylglucosamine 1.0 M, reaction conditions: pH 6.0, 60 ° C.) using immobilized cells (concentration of immobilized cells 0.44 ml / ml) As a result of the synthesis reaction of -acetyllactosamine, it was confirmed that 60 mM N-acetyllactosamine was obtained in the reaction solution.
[0060]
The immobilized cells were packed into a glass column (1,6 × 10 cm) to obtain an immobilized cell column. A substrate solution in which lactose and N-acetylglucosamine are dissolved in 100 mM sodium acetate buffer (pH 6.0) to a concentration of 0.5 M and 1 M, respectively, is heated to 60 ° C. and supplied to the column at a flow rate of 2 ml / hr. The N-acetyllactosamine synthesis reaction was continuously performed.
[0061]
Further, 10 ml of the reaction solution eluted from the immobilized bacterial cell column was fractionated, and the production amount of N-acetyllactosamine was analyzed by HPLC for every other fraction. FIG. 1 shows the transition of the production amount of N-acetyllactosamine by this continuous production method. This revealed that N-acetyllactosamine can be produced continuously for at least 2 weeks.
[0062]
The reaction solution (40 ml) obtained by the above synthesis reaction is applied to an activated carbon-Celite (1: 1, Wako Pure Chemicals) column (8 x 13 cm), and the column is washed with three times the amount of water. Elution was performed at a flow rate of 0.82 ml / min and a fraction volume of 20 ml by a linear increase gradient method of methanol concentration using 3000 ml) and 40% methanol (3000 ml).
[0063]
The elution fraction was determined by measuring the UV absorption at 210 nm (absorption of acetyl groups). The results are shown in FIG.
[0064]
(2) Purification by β-galactosidase from E. coli
100 mg of the crude N-acetyllactosamine obtained in (1) is dissolved in 1 ml of 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2), and Escherichia coli-derived β-galactosidase (Funakoshi) is added to a final concentration of 2 U / ml. And reacted at 30 ° C. for 4 hours. The fluctuation of the oligosaccharide before and after the reaction was measured by the HPLC analysis method shown in Reference Example 2. In 3 hours after the reaction, N-acetylallactosamine and lactose in the solution almost completely disappeared, while 70% or more of N-acetyllactosamine remained. The reaction solution was adsorbed on activated carbon chromatography (1.5 × 1, 4 cm), and monosaccharides such as N-acetylglucosamine were washed away with water, and then N-acetyllactosamine was eluted with 30% methanol. Fractions showing UV210 nm absorption were pooled, concentrated under reduced pressure, and then lyophilized to obtain 60 mg of N-acetyllactosamine. FIG. 4 shows the HPLC pattern of the obtained 10 mg / ml aqueous solution of N-acetyllactosamine. The purity of the obtained N-acetyllactosamine was 99% or more.
[0065]
Example 2
N-acetyllactosamine purification method using β-galactosidase derived from E. coli in N-acetyllactosamine enzyme synthesis method using β-galactosidase derived from Bacillus circulans
[0066]
(1) Enzymatic synthesis (using β-galactosidase)
100 mM sodium acetate buffer solution (pH 6.0) prepared with 0.5 M lactose and 1 M N-acetylglucosamine so that the final enzyme concentration of β-galactosidase derived from Bacillus circulans (manufactured by Daiwa Kasei) is 0.15 U / ml. ) To prepare a substrate solution and reacted at 30 ° C. for 17 hours. Thereafter, the enzyme was inactivated by heating in a boiling bath for 5 minutes. The resulting reaction liquid (5 ml) was purified with an activated carbon-Celite (1: 1, Wako Pure Chemical Industries) column (1.5 x 45 cm). Specifically, after supplying the obtained reaction solution to the column, the column was washed with twice the amount of water as the column, and the methanol concentration linearly using water (500 ml) and 30% methanol (500 ml). Elution was carried out by an incremental gradient method at a flow rate of 0.82 ml / min and a fraction volume of 10 ml. Various saccharides to be eluted were determined by measuring the eluted fraction with UV absorption at 210 nm (acetyl group absorption) and E690 nm (absorption of reducing sugar by Park-Johnson method). The results are shown in FIG.
[0067]
The first peak at which absorption at E690 nm was detected was the N-acetylglucosamine fraction, the second peak was the glucose fraction, the third peak was the lactose fraction, the fourth peak was N-acetyllactosamine and N- For the second peak in the detection of UV210 nm absorbance, collect the fractions with UV210 nm absorbance of 0.8 or more as a fraction containing N-acetyllactosamine and N-acetylallolactosamine. The fraction was freeze-dried to obtain 240 mg of pure white powder. The purity was 90% (results obtained by HPLC analysis are shown in FIG. 6).
[0068]
(2) Purification
Β-galactosidase derived from Escherichia coli was added to a 100 mg / ml solution of pure white powder obtained from the fraction containing N-acetyllactosamine and N-acetylallolactosamine to a final concentration of 2 U / ml, Treated at 30 ° C. for 3 hours. After stopping the reaction by boiling at 100 ° C. for 15 minutes, this solution was adsorbed onto an activated carbon column (1.5 × 1, 4 cm), and the column was washed with 5 times the amount of water in the column. Thereafter, N-acetyllactosamine was eluted with a 20% aqueous methanol solution, concentrated and freeze-dried. As a result, 70 mg of pure white powder was obtained. From the result of HPLC analysis using the obtained freeze-dried 10 mg / ml solution of N-acetyllactosamine, the purity of N-acetyllactosamine was 97.3% (result of HPLC analysis is shown in FIG. 7). .
[0069]
【The invention's effect】
According to the method for producing purified N-acetyllactosamine of the present invention, since the number of purifications by the column is small, a higher recovery rate can be obtained than in the conventional method, and the amount of eluent such as methanol used is also small. Furthermore, very high purity N-acetyllactosamine can be obtained.
When the method of the present invention is used, N-acetyllactosamine with extremely high purity can be obtained, so that N-acetyllactosamine having high activity as a growth promoting factor for B. subtilis can be easily produced. In addition, since N-acetyllactosamine with a very low content of monosaccharides, N-acetylallactosamine, and lactose can be obtained, the sweetness and calories resulting from these contaminating saccharides can be an obstacle to use, and lactose ( There is no problem that lactose) intolerant constitution causes diarrhea. In addition, since N-acetyllactosamine obtained by the purification method of the present invention has high purity, it is useful as a raw material for synthesizing substances such as physiologically active complex glycolipids containing N-acetyllactosamine.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the concentration of N-acetyllactosamine obtained in continuous production of N-acetyllactosamine by an immobilized cell method.
FIG. 2 is a diagram showing an elution pattern of sugar in activated carbon / celite chromatography for a mixture obtained in the continuous production of N-acetyllactosamine by the immobilized cell method.
FIG. 3 is a diagram showing an analysis result by HPLC of a crude N-acetyllactosamine fraction obtained by separating a mixture obtained in continuous production of N-acetyllactosamine by an immobilized cell method through activated carbon / celite column. is there.
FIG. 4 shows the results of HPLC analysis of N-acetyllactosamine obtained when N-acetyllactosamine is produced by the method of the present invention using E. coli-derived β-galactosidase.
FIG. 5 is a diagram showing a sugar elution pattern in activated carbon / celite chromatography for a mixture obtained in the production of N-acetyllactosamine using Bacillus circulans-derived β-galactosidase.
FIG. 6 is a diagram showing the results of HPLC analysis of a crude N-acetyllactosamine fraction obtained by fractionating a mixture obtained in the production of N-acetyllactosamine using β-galactosidase derived from Bacillus circulans through an activated carbon / celite column. It is.
FIG. 7 shows the results of HPLC analysis of N-acetyllactosamine obtained when N-acetyllactosamine was produced by the method of the present invention using E. coli-derived β-galactosidase.
FIG. 8 is a diagram showing the amount of N-acetylglucosamine produced in an enzymatic reaction performed using β-galactosidase derived from Bacillus circulans using N-acetyllactosamine or N-acetylallactosamine as a substrate.
FIG. 9 is a graph showing the amount of N-acetylglucosamine produced in an enzymatic reaction performed using β-galactosidase derived from E. coli using N-acetyllactosamine or N-acetylallactosamine as a substrate.
FIG. 10 is a graph showing the amount of N-acetylglucosamine produced in an enzymatic reaction performed using β-galactosidase derived from E. coli using N-acetyllactosamine or N-acetylallactosamine as a substrate.
Claims (9)
前記混合物をEschericia coli由来のβ-ガラクトシダーゼで処理し、Ｎ-アセチルアロラクトサミンを分解して除去することを特徴とする方法。A method for producing purified N-acetyllactosamine from a mixture containing N-acetyllactosamine and N-acetylallactosamine, comprising:
A method comprising treating the mixture with β-galactosidase derived from Escherichia coli to decompose and remove N-acetylallactosamine.
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