JP4803976B2 - Molecular sensor for intracellular IP3 measurement - Google Patents
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Description
この発明は、細胞内カルシウム・シグナルを誘導する最も重要な細胞内メッセンジャーの１つである、イノシトール１，４，５三リン酸（以下「IP3」ともいう。）の濃度を高精度で測定する分子センサー及びこの分子センサーを用いたIP3の測定法に関する。 The present invention measures the concentration of inositol 1,4,5 triphosphate (hereinafter also referred to as “IP 3 ”), which is one of the most important intracellular messengers that induce intracellular calcium signals, with high accuracy. The present invention relates to a molecular sensor that performs measurement of IP 3 using the molecular sensor.
IP3は細胞が神経伝達物質、ホルモン、増殖因子などの刺激を受けることによって細胞内で産生され、Ca2+シグナルを誘導する細胞内メッセンジャーである。IP3が特異的に作用するターゲットであるIP3受容体は、小胞体などの細胞内Ca2+貯蔵部位（Ca2+ストア）に分布するCa2+チャネルである。IP3受容体が活性化すると、ストアから細胞質にCa2+が放出される。
IP3-Ca2+系は血圧、学習、免疫機能、内分泌及び外分泌機能、炎症などの調節において重要な働きをしており、IP3-Ca2+系の障害が記憶・学習機能、運動機能、発生に深刻な障害を与えることなどが明らかにされている（非特許文献１等）。従って、IP3濃度の定量はこのような病態の解明、治療や診断法の確立、薬剤の開発において極めて重要である。
特に近年、fura-2などのCa2+感受性蛍光色素を用いて、生きた細胞のCa2+反応をリアルタイムで可視化する技術が確立された（非特許文献２）。このような研究によって、IP3が時間・空間的なパターンの異なる多彩なCa2+シグナルを発生させることが明らかにされてきた。しかし、従来の技術では細胞内のIP3を測定することができない。
IP 3 is an intracellular messenger that is produced intracellularly and induces a Ca 2+ signal when the cell is stimulated by neurotransmitters, hormones, growth factors, and the like. The IP 3 receptor, which is a target to which IP 3 specifically acts, is a Ca 2+ channel distributed in intracellular Ca 2+ storage sites (Ca 2+ stores) such as the endoplasmic reticulum. When the IP 3 receptor is activated, Ca 2+ is released from the store into the cytoplasm.
The IP 3 -Ca 2+ system plays an important role in the regulation of blood pressure, learning, immune function, endocrine and exocrine functions, inflammation, etc., and the disorder of the IP 3 -Ca 2+ system is memory / learning function, motor function It has been clarified that serious damage is caused to the occurrence (Non-patent Document 1, etc.). Therefore, quantification of IP 3 concentration is extremely important in elucidating such pathological conditions, establishing treatments and diagnostic methods, and developing drugs.
In particular, in recent years, a technique for visualizing the Ca 2+ reaction of living cells in real time using a Ca 2+ sensitive fluorescent dye such as fura-2 has been established (Non-patent Document 2). These studies have revealed that IP 3 generates a variety of Ca 2+ signals with different temporal and spatial patterns. However, in the prior art can not measure the IP 3 in the cell.
現在一般的に行われているIP3の定量法は、IP3結合タンパク質を用いた競合アッセイ、あるいはイオン交換樹脂を用いたIP3の分離定量である（非特許文献３等）。これらは、検出トレーサーとして放射性同位元素を用いるため操作が煩雑である。これらの方法は、細胞集団から抽出したサンプルを用いてIP3濃度を測定するため、細胞内のIP3濃度やその動態を知ることはできなかった。
近年、蛍光ラベルしたIP3結合タンパク質の蛍光強度の変化によってIP3濃度を定量する方法が開発されている（非特許文献４）。この方法は、放射性同位元素を用いる方法より簡便であるが細胞集団から抽出したサンプルを用いる点は同じである。
従来法の中で最も注目されているのは、IP3結合タンパク質（PLCdのPHドメイン）とGFPの融合遺伝子を細胞に導入し、その遺伝子でコードされる融合タンパク質（GFP-PHD）の局在によって細胞内のIP3濃度の変化を解析する方法である（非特許文献５及び６、特許文献１）。この方法によって、生きた細胞でIP3の動態を知ることが初めて可能になった。しかし、GFP-PHDが細胞膜から遊離する微少な分布の変化を検出する必要があり定量的な測定は極めて難しい。また、この解析には共焦点レーザー顕微鏡が不可欠であり、汎用性が低い。
なお、IP3受容体においてIP3と高親和性を示す領域があることが知られている（非特許文献７、特許文献２）。
また最近、２種類の蛍光物質（例えば、フルオロセイントとローダミン、ECFPとEYFP）の間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用した分子プローブの開発が注目されており（非特許文献８〜１０）、各種標的物質や阻害剤などの検出に用いられている（特許文献３，４）
The IP 3 quantification method currently generally used is a competitive assay using an IP 3 binding protein, or a separation quantification of IP 3 using an ion exchange resin (Non-patent Document 3, etc.). Since these use a radioisotope as a detection tracer, the operation is complicated. Since these methods measure the IP 3 concentration using a sample extracted from a cell population, it was impossible to know the intracellular IP 3 concentration and its kinetics.
In recent years, a method for quantifying the IP 3 concentration based on a change in fluorescence intensity of a fluorescently labeled IP 3 binding protein has been developed (Non-patent Document 4). This method is simpler than the method using a radioisotope, but is the same in that a sample extracted from a cell population is used.
Is what is most remarkable in the conventional method, localization of IP 3 binding protein fusion gene with GFP (PH domain of PLCD) introduced into the cell, the fusion protein encoded by the gene (GFP-PHD) This is a method for analyzing changes in intracellular IP 3 concentration (Non-patent Documents 5 and 6, Patent Document 1). This method makes it possible for the first time to know the dynamics of IP 3 in living cells. However, quantitative measurement is extremely difficult because it is necessary to detect minute changes in the distribution of GFP-PHD released from the cell membrane. Moreover, a confocal laser microscope is indispensable for this analysis, and its versatility is low.
Incidentally, it is known that there is a region showing IP 3 and high affinity in IP 3 receptor (Non-Patent Document 7, Patent Document 2).
Recently, the development of molecular probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET) between two types of fluorescent substances (for example, fluorosaint and rhodamine, ECFP and EYFP) has attracted attention (Non-Patent Documents 8 to 10). And used for detection of various target substances and inhibitors (Patent Documents 3 and 4)
本発明は、細胞内カルシウム・シグナルを誘導する重要な細胞内メッセンジャーの１つであるIP3の濃度を高精度で測定する手段を提供することを目的とする。
本発明の方法は、以下の特徴を有し、従来のIP3の測定における問題点を解消することができる。
(1) 蛍光強度の比の変化によって測定が可能であるため、正確な細胞内のIP3濃度の変化をリアルタイムで可視化することができる。
(2) 蛍光光度計を用いて、簡便にIP3の定量を行うことができる。
(3) IP3がCa2+放出反応を起こす時のターゲットであるIP3受容体のリガンド結合部位を用いるため特異性が高い。
(4) IP3受容体の新規リガンドや新規阻害剤の検索が可能になり、このような機能を有する新薬のスクリーニングができる。
An object of the present invention is to provide a means for measuring the concentration of IP 3 , which is one of important intracellular messengers that induce intracellular calcium signals, with high accuracy.
The method of the present invention has the following features and can solve the problems in conventional IP 3 measurement.
(1) Since the measurement can be performed by changing the ratio of fluorescence intensities, an accurate change in intracellular IP 3 concentration can be visualized in real time.
(2) IP 3 can be easily quantified using a fluorometer.
(3) IP 3 has a higher specificity for using the ligand binding site of the target at which IP 3 receptors when causing Ca 2+ release reaction.
(4) It becomes possible to search for new ligands and new inhibitors of the IP 3 receptor, and screen for new drugs having such functions.
本発明者らは、このような課題を解決するために、ラットIP3受容体のリガンド結合部位を含むペプチドフラグメント及び２種類の蛍光物質（ECFPとEYFP）から構成される分子センサーを設計した。この分子センサーをコードする遺伝子を細胞(SH-SY5Y細胞)に導入し、この細胞で発現した分子センサーにIP3を結合させると、ECFPとEYFPの間の蛍光共鳴エネルギー転移の効率が変化し、蛍光強度の比が変化することを見いだした。特に、この分子センサーに更に細胞膜移行シグナル等の局在化シグナルを装着すると、発現した分子センサーは細胞膜などの特定部位に局在するため、観察が容易になる。
また、分子センサーを発現したSH-SY5Y細胞をムスカリン受容体アゴニスト（例えば、アセチルコリンやカルバーコル）で刺激すると、細胞内のIP3濃度の上昇に伴なって蛍光強度の比が変化することが確認された。
In order to solve such a problem, the present inventors designed a molecular sensor composed of a peptide fragment containing a ligand binding site of rat IP 3 receptor and two kinds of fluorescent substances (ECFP and EYFP). When a gene encoding this molecular sensor is introduced into a cell (SH-SY5Y cell) and IP 3 is bound to the molecular sensor expressed in this cell, the efficiency of fluorescence resonance energy transfer between ECFP and EYFP changes, We found that the ratio of fluorescence intensities changed. In particular, when a localization signal such as a cell membrane translocation signal is further attached to this molecular sensor, the expressed molecular sensor is localized at a specific site such as the cell membrane, so that observation becomes easy.
In addition, when SH-SY5Y cells expressing a molecular sensor were stimulated with a muscarinic receptor agonist (eg, acetylcholine or carborcol), it was confirmed that the ratio of fluorescence intensity changes with increasing intracellular IP 3 concentration. It was.
本発明の分子センサーは、IP3受容体全体（約2.7Kアミノ酸）ではなく、そのリガンド結合部（約600アミノ酸）を用いることによりFRETに変化を起こす点に特徴がある。本願の構成のセンサーは、IP3受容体のリガンド結合部にIP3が結合していない場合には、ECFPとEYFPとが近接しFRETが起きているのに対し、IP3受容体のリガンド結合部にIP3が結合すると、このリガンド結合部の構造が変化し、恐らくECFPとEYFPとが離れて、FRETが起きなくなるものと考えられる。本願は、このようにIP3受容体のリガンド結合部がIP3が結合すると構造が変化するということに基づいており、これは単にIP3受容体全体を用いただけではこの様な構造変化（FRETに影響を及ぼすような構造変化）は起きなかったと思われる。このように分子センサーを構成した結果、従来不可能であったIP3の濃度を定量することが可能になった。
The molecular sensor of the present invention is characterized in that FRET is changed by using the ligand binding part (about 600 amino acids) rather than the entire IP 3 receptor (about 2.7 K amino acids). Sensors of the present configuration, when the IP 3 does not bind to the ligand binding portion of the IP 3 receptor, whereas the ECFP and EYFP is happening close to FRET, ligand binding of IP 3 receptors When IP 3 binds to the moiety, the structure of this ligand binding moiety changes, presumably because ECFP and EYFP are separated and FRET does not occur. This application is based on the fact that in this way the ligand binding portion of the IP 3 receptor IP 3 structural changes upon binding, this simply alone is such a structure change with the entire IP 3 receptor (FRET It seems that no structural changes that affect As a result of configuring the molecular sensor in this way, it became possible to quantify the concentration of IP 3 that was not possible before.
即ち、本発明は、ＩＰ３受容体のリガンド結合部及び蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を起こす２種の蛍光物質から成る分子センサーであって、前記ＩＰ３受容体のリガンド結合部が、以下の（１）又は（２）のいずれかのポリペプチドから成る分子センサー。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列の265〜489番目のいずれかから842〜868番目のいずれかまでのアミノ酸配列を含むポリペプチド
（２）（１）のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、イノシトール１，４，５三リン酸との親和性を有するポリペプチド
この蛍光物質としては、蛍光タンパク質が好ましい。
２種の蛍光タンパク質として、ＥＣＦＰ又はその改変体及びＥＹＦＰ又はその改変体が好ましい。この分子センサーは、更に、局在化シグナルを有してもよい。
この分子センサーにおいて、蛍光タンパク質ＥＣＦＰが、（３）又は（４）のいずれかのポリペプチドから成り、蛍光タンパク質ＥＹＦＰが、（５）又は（６）のいずれかのポリペプチドから成ることがより好ましい。
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列の21〜259番目のアミノ酸配列から成るポリペプチド
（４）（３）のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、465〜495nmにピークを有する光を発光するポリペプチド
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列の899〜1137番目のアミノ酸配列から成るポリペプチド
（６）（５）のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、522〜548nmにピークを有する光を発光するポリペプチド
That is, the present invention provides a molecular sensor comprising a ligand binding part of an IP 3 receptor and two kinds of fluorescent substances that cause fluorescence resonance energy transfer (FRET), wherein the ligand binding part of the IP 3 receptor has the following structure: A molecular sensor comprising the polypeptide of either (1) or (2).
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence from any of the amino acid sequence 265 to 489 to any one of the 842 to 868 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) In the polypeptide of (1), 1 or a number A polypeptide having an amino acid sequence in which a single amino acid is substituted and having affinity for inositol 1,4,5 triphosphate. As the fluorescent substance, a fluorescent protein is preferable.
As the two types of fluorescent proteins, ECFP or a variant thereof and EYFP or a variant thereof are preferable. The molecular sensor may further have a localization signal.
In this molecular sensor, it is more preferable that the fluorescent protein ECFP is composed of the polypeptide (3) or (4), and the fluorescent protein EYFP is composed of the polypeptide (5) or (6). .
(3) Polypeptide (4) consisting of amino acid sequences 21 to 259 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (4) In the polypeptide of (3), one or several amino acids have been deleted, substituted or added A polypeptide comprising an amino acid sequence and emitting light having a peak at 465 to 495 nm (5) Polypeptide of a polypeptide (6) (5) comprising an amino acid sequence from 899 to 1137 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and emitting light having a peak at 522 to 548 nm.
本発明は、上記いずれかの分子センサーをコードするＤＮＡである。
更に、本発明は、このＤＮＡを含む組換えベクターである。
更に、本発明は、この組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
更に、本発明は、上記いずれかの分子センサーを細胞内に有する細胞である。
更に、本発明は、上記いずれかの分子センサーを体内に有する動物又は植物である。
更に、本発明は、上記形質転換体、上記細胞又は上記動物若しくは植物に350〜500nmの光を照射して、400〜515nm及び515〜600nmにおける蛍光を測定し、これらの蛍光強度を指標として、該形質転換体又は該細胞におけるイノシトール１，４，５三リン酸の濃度（又は量）を見積もる方法である。
更に、本発明は、、上記形質転換体、上記細胞又は上記動物若しくは植物に未知の薬剤を導入し、これに350〜500nmの光を照射して、400〜515nm及び515〜600nmにおける蛍光を測定し、これらの蛍光強度を指標として、IP3受容体のリガンド又は阻害剤をスクリーニングする方法である。
The present invention is a DNA encoding any of the above molecular sensors.
Furthermore, the present invention is a recombinant vector containing this DNA.
Furthermore, the present invention is a transformant transformed with this recombinant vector.
Furthermore, the present invention is a cell having any one of the above molecular sensors in the cell.
Furthermore, the present invention is an animal or plant having any one of the above molecular sensors in the body.
Furthermore, the present invention irradiates the transformant, the cell or the animal or plant with light of 350 to 500 nm, measures fluorescence at 400 to 515 nm and 515 to 600 nm, and uses these fluorescence intensities as indices. This is a method for estimating the concentration (or amount) of inositol 1,4,5 triphosphate in the transformant or the cell.
Furthermore, the present invention introduces an unknown drug into the transformant, the cell, or the animal or plant, and irradiates the light with 350 to 500 nm to measure fluorescence at 400 to 515 nm and 515 to 600 nm. In this method, the ligand or inhibitor of the IP 3 receptor is screened using the fluorescence intensity as an index.
本発明は上記いずれかの分子センサーから成るIP3検知装置である。この装置において、この分子センサーを、溶液中に入れたり、ビーズ、ファイバー、ディッシュ等の基体に固定してもよい。
また本発明は、この装置と被検物とを接触させ、350〜500nmの光を照射して、400〜515nm及び515〜600nmにおける蛍光を測定し、これらの蛍光強度を指標として、被検物中のイノシトール１，４，５三リン酸の濃度を見積もる方法である。
装置と被検物とを接触させる方法は装置の構成による。例えば、装置にセンサーを組み込んで、この装置に被検物を入れる方法をとってもよいし、センサーを小型にして被検物（例えば、組織や細胞など）にこのセンサーを入れる方法をとってもよい。
The present invention is an IP 3 detector comprising any one of the molecular sensors described above. In this apparatus, the molecular sensor may be placed in a solution or fixed to a substrate such as a bead, fiber, or dish.
Further, the present invention makes this apparatus and a test object contact, irradiates light of 350 to 500 nm, measures fluorescence at 400 to 515 nm and 515 to 600 nm, and uses these fluorescence intensities as an index. In this method, the concentration of inositol 1,4,5 triphosphate is estimated.
The method for bringing the device into contact with the test object depends on the configuration of the device. For example, a method may be employed in which a sensor is incorporated in the apparatus and a test object is put into the apparatus, or a method in which the sensor is made small and the sensor is inserted into a test object (for example, a tissue or a cell).
本発明の分子センサーは、IP3受容体のリガンド結合部と２種類の蛍光物質（例えば、ECFP及びEYFP）とからなる。その構造の例（配列番号１）を図１に示す。この配列番号１で表されるアミノ酸配列において、ECFPは21〜259番目、EYFPは899〜1137番目、IP3受容体のリガンド結合部は265〜868番目に位置する。
IP3受容体はIP3が結合することによって開口するCa2+チャンネルで、IP3はそのN末端部分に特異的に結合する（特許文献２）。IP3受容体としては、ニワトリ、アフリカツメガエル、ショウジョウバエ、ヒトデ、線虫等の広範な生物種のものを用いてもよいが、本発明においては、ヒト、マウス、ラット等の哺乳動物のものを用いることが好ましい。また、哺乳類のIP3受容体にはタイプ１からタイプ３の３つのサブタイプが知られており、そのいずれを用いてもよい。
このIP3が特異的に結合するIP3受容体の領域は、例えば、ラットタイプ３IP3受容体（Blondel et al., J. Biol. Chem., 268:11356-11363 (1993)、L06096）のアミノ酸配列のうち少なくとも226〜578番目(配列番号１の490〜842番目、非特許文献６及び特許文献１)、好ましくは1〜578番目(配列番号１の265〜842番目)である。後述の実施例において1〜604番目のもの(配列番号１の265〜868番目)が機能することが確かめられているが、より短いものでも機能すると考えられる。即ち、この配列の1〜225番目(配列番号１の265〜489番目)のいずれかから578〜604番目(配列番号１の842〜868番目)のいずれかまでのものが好ましいと考えられる。
The molecular sensor of the present invention comprises a ligand binding part of IP 3 receptor and two kinds of fluorescent substances (for example, ECFP and EYFP). An example of the structure (SEQ ID NO: 1) is shown in FIG. In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, ECFP is located at positions 21 to 259, EYFP is located at positions 899 to 1137, and the ligand binding site of the IP 3 receptor is located at positions 265 to 868.
The IP 3 receptor is a Ca 2+ channel that opens when IP 3 binds, and IP 3 specifically binds to the N-terminal portion thereof (Patent Document 2). As the IP 3 receptor, a wide range of biological species such as chickens, Xenopus, Drosophila, starfish, nematodes and the like may be used, but in the present invention, mammals such as humans, mice and rats are used. It is preferable to use it. In addition, three subtypes of type 1 to type 3 are known for mammalian IP 3 receptors, any of which may be used.
Region of IP 3 receptors The IP 3 binds specifically, for example, rat type 3IP 3 receptors: the (Blondel et al, J. Biol Chem , 268... 11356-11363 (1993), L06096) The amino acid sequence is at least 226 to 578 (490 to 842 of SEQ ID NO: 1, Non-Patent Document 6 and Patent Document 1), preferably 1 to 578 (265 to 842 of SEQ ID NO: 1). In Examples described later, it has been confirmed that the 1st to 604th ones (265th to 868th of SEQ ID NO: 1) function, but it is thought that even shorter ones will function. That is, it is considered that one from the 1st to 225th positions (265th to 489th positions of SEQ ID NO: 1) to the 578th to 604th positions (842th to 868th positions of SEQ ID NO: 1) of this sequence is preferable.
ECFP(enhanced cyan fluorescent protein)とEYFP(enhanced yellow fluorescent protein)はどちらもクラゲ由来のグリーンフルオレセントタンパク質（GFP）の変異体である。ECFPは425nmの励起光を照射すると480nm付近の波長を最大とする青色の蛍光を発し、EYFPは514nmの励起光を照射すると528nm付近の波長を最大とする黄色の蛍光を発する。通常、EYFPは425nmの励起光では蛍光を発しないが、ECFPが近くにあると、425nmで励起されたECFPからのエネエルギー移動によって蛍光を発する。この現象を蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）という。本発明の分子センサーは、IP3の結合によってIP3受容体のN末端部分の三次元構造が変化し、その結果２つの蛍光タンパク質の間のFRET効率が低下し、蛍光比が変化することを利用している。
このECFPとEYFPは、改変することによりFRETの効率やｐＨ安定性を向上させたり、またEYFPを改変して蛍光波長を長波長側にシフトさせることにより適当な光源（例えば、457nmのアルゴンイオンレーザー）を利用するように改変することができる。特にアクセプターであるEYFP部分の改変は、FRET効率の向上に有効である。また、ＥＣＦＰとＥＹＦＰ以外の蛍光ペアを用いることによって様々な光源を利用したりＦＲＥＴ効率を高めることが可能である。本発明においては、これら２つの蛍光タンパク質が蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を起こしている限りにおいて、これら２つの蛍光タンパク質を改変したものを用いることも本発明の範囲内であると考えるものである。
Both ECFP (enhanced cyan fluorescent protein) and EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) are mutants of jellyfish-derived green fluorescent protein (GFP). ECFP emits blue fluorescence with a maximum wavelength near 480 nm when irradiated with 425 nm excitation light, and EYFP emits yellow fluorescence with a maximum wavelength near 528 nm when irradiated with excitation light at 514 nm. Normally, EYFP does not emit fluorescence with excitation light of 425 nm, but when ECFP is nearby, it emits fluorescence by energy transfer from ECFP excited at 425 nm. This phenomenon is called fluorescence resonance energy transfer (FRET). Molecular sensors of the present invention, IP 3 three-dimensional structure of the N-terminal portion of the receptor is changed by the binding of IP 3, that the result is FRET efficiency between the two fluorescent proteins decreases the fluorescence ratio changes We are using.
The ECFP and EYFP can be modified to improve the efficiency and pH stability of FRET, or the EYFP can be modified to shift the fluorescence wavelength to the longer wavelength side (for example, a 457 nm argon ion laser). ) Can be modified. In particular, modification of the acceptor EYFP moiety is effective in improving FRET efficiency. Further, by using a fluorescent pair other than ECFP and EYFP, various light sources can be used and FRET efficiency can be increased. In the present invention, as long as these two fluorescent proteins cause fluorescence resonance energy transfer (FRET), it is considered that it is also within the scope of the present invention to use a modified version of these two fluorescent proteins. .
さらに、本発明では、lP3受容体リガンド結合部位のＮ末端のＣ末端に連結されたリンカーを介して蛍光タンパク質が連結されているが、それぞれの機能を妨害しないものであればリンカーは必要なく、lP3受容体リガンド結合部位Ｎ末端あるいはＣ末端以外のいずれの場所に蛍光物質をつけてもよい。また、特定のアミノ酸あるいはアミノ酸配列に結合する蛍光物質（アミン反応性色素、カルボキシル反応性色素、チオール反応性色素、F1AsH, ReAsH, Pro-Qなど）をlP3受容体リガンド結合部位のアミノ酸あるいはその特定部位に挿入したアミノ酸あるいはアミノ酸配列（テトラシステイン・モチーフ、オリゴヒスチジンなど）に結合させたものも本発明の範囲内であると考える。 Furthermore, in the present invention, the fluorescent protein is linked through a linker linked to the N-terminal C-terminus of the lP 3 receptor ligand binding site, but the linker is not necessary as long as it does not interfere with each function. The fluorescent substance may be attached at any place other than the N-terminal or C-terminal of the lP 3 receptor ligand binding site. The fluorescent substance that binds to a particular amino acid or amino acid sequence (amine-reactive dyes, carboxyl-reactive dyes, thiol-reactive dyes, F1AsH, ReAsH, Pro-Q, etc.) amino acid or its lP 3 receptor ligand binding site An amino acid or amino acid sequence inserted at a specific site (tetracysteine motif, oligohistidine, etc.) is considered to be within the scope of the present invention.
EYFPの改変体として、Q69K（ｐＨ安定性の向上を目的とする。）、Q69M (Citrine、ｐＨ、塩素、蛍光退色に対する安定性の向上を目的とする。）、F64L/M153T/V163A/S175G (super-YFP、ｐＨ、塩素に対する安定性の向上とFRET効率の向上を目的とする。）、F46L（FRET効率の向上を目的とする。）、F46L/F64L/M153T/V163A/S175G (Venus、ｐＨ、塩素に対する安定性の向上とFRET効率の向上を目的とする。）等が挙げられる（Nagai et al. Nature Biotech., 20:87-90 (2002); O.Griesbeck et al. J. Biol. Chem., 276:29188-29194 (2001)）。
EYFPの改変体として、更にPhi-Yellow (Evrogen JSC社製、ｐＨ安定性の向上とFRETの検出効率の向上を目的とする。）等を用いることもできる。
更に、以下のような組み合わせも可能である。各励起波長（Ex）と蛍光波長（Em）を挙げる。
EBFP/EGFP Ex 350-390nm：Em 420-480nm/515-555nm
ECFP/DsRed Ex 400-460nm： Em 465-495nm/565-595nm
EGFP/DsRed Ex 450-480nm： Em 485-510nm/565-595nm
Sapphire/DsRed Ex 380-430nm： Em 485-510nm/565-595nm
EYFP/HcRed-tandem Ex 460-490nm: Em 510-545nm/640-680nm
Midoriishi-Cyan/Kusabira-Orange Ex 400-460nm: Em 465-510nm/540-600nm
EBFP、ECFP、EGFP、EYFP（クローンテック社製）及びSapphire（オーロラ社製）はオワンクラゲ由来のGFPの変異体であり、DsRed（クローンテック社製）、HcRed-tandem（Evrogen JSC社製）、Midoriishi-Cyan及びKusabira-Orange（（株）医学生物学研究所製）はサンゴ由来の蛍光タンパク質である。
As variants of EYFP, Q69K (for the purpose of improving pH stability), Q69M (for the purpose of improving stability against Citrine, pH, chlorine, and fluorescence fading), F64L / M153T / V163A / S175G ( super-YFP, aiming to improve stability against pH and chlorine and improving FRET efficiency.), F46L (to improve FRET efficiency), F46L / F64L / M153T / V163A / S175G (Venus, pH For the purpose of improving stability against chlorine and FRET efficiency) (Nagai et al. Nature Biotech., 20: 87-90 (2002); O. Griesbeck et al. J. Biol. Chem., 276: 29188-29194 (2001)).
As a modified EYFP, Phi-Yellow (manufactured by Evrogen JSC, Inc. for the purpose of improving pH stability and FRET detection efficiency) can also be used.
Further, the following combinations are possible. List each excitation wavelength (Ex) and fluorescence wavelength (Em).
EBFP / EGFP Ex 350-390nm: Em 420-480nm / 515-555nm
ECFP / DsRed Ex 400-460nm: Em 465-495nm / 565-595nm
EGFP / DsRed Ex 450-480nm: Em 485-510nm / 565-595nm
Sapphire / DsRed Ex 380-430nm: Em 485-510nm / 565-595nm
EYFP / HcRed-tandem Ex 460-490nm: Em 510-545nm / 640-680nm
Midoriishi-Cyan / Kusabira-Orange Ex 400-460nm: Em 465-510nm / 540-600nm
EBFP, ECFP, EGFP, EYFP (manufactured by Clontech) and Sapphire (manufactured by Aurora) are GFP mutants derived from Aequorea jellyfish, DsRed (manufactured by Clontech), HcRed-tandem (manufactured by Evrogen JSC), Midoriishi -Cyan and Kusabira-Orange (manufactured by the Institute of Medical Biology) are coral-derived fluorescent proteins.
また、EYFPの改変体としてテトラシステイン・モチーフ（-Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys-(配列番号２)；Xaaは任意のアミノ酸）と呼ばれる配列のポリペプチドとFluorescein Arsenical Hairpin binder(FlAsH、Panvera社製)の複合体を用いることができる(B.A.Griffin et al. Science 281:269-271 (1998))。FlAsHは緑色の蛍光色素であるフルオロセインの誘導体で、テトラシステイン・モチーフと特異的に結合する性質を持っている。このテトラシステイン・モチーフとFlAsHの複合体を用いる場合には、まずEYFPをテトラシステイン・モチーフを含むポリペプチドと入れ替えた融合タンパク質を発現させる。これにFlAsH-EDT2（Panvera社製）を作用させると、化学反応によってテトラシステイン・モチーフを含むポリペプチドとFlAsHの複合体が形成される。
同様に、オリゴヒスチジンやアミノ酸のアミノ基、カルボキシル基、チオール基などの官能基に結合する蛍光色素を化学的に結合させることができる。
In addition, as a variant of EYFP, a polypeptide having a sequence called tetracysteine motif (-Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys- (SEQ ID NO: 2); Xaa is an arbitrary amino acid) and a Fluorescein Arsenical Hairpin binder (FlAsH , Manufactured by Panvera) (BAGriffin et al. Science 281: 269-271 (1998)). FlAsH is a derivative of fluorescein, a green fluorescent dye, and has the property of binding specifically to the tetracysteine motif. When using this tetracysteine motif and FlAsH complex, first, a fusion protein in which EYFP is replaced with a polypeptide containing the tetracysteine motif is expressed. When FlAsH-EDT2 (Panvera) is allowed to act on this, a complex of the polypeptide containing the tetracysteine motif and FlAsH is formed by a chemical reaction.
Similarly, fluorescent dyes that bind to functional groups such as oligohistidine and amino groups, carboxyl groups, and thiol groups of amino acids can be chemically bonded.
また、EGFPの代替としてAce-GreenやCop-Green（Evrogen JSC社）、DsRedの代替としてHcRED-tandem（Evrogen JSC社）等が挙げられる。
本発明の分子センサーは図１に示すようにIP3受容体のリガンド結合部と２種類の蛍光物質（ECFP及びEYFP等）とからなる。これらの２種類の蛍光物質はそれぞれ入れ替えてもよく、またこれらの構成部分の間に１残基以上、好ましくは４〜３０残基程度のアミノ酸からなるリンカーを挿入してもよい。
また、この分子センサーは局在化シグナルを有してもよく、特定部位に不動化することにより、蛍光変化を起こりやすくし、IP3濃度の定量測定も容易になると考えられる。分子センサーにおける局在化シグナルの結合位置は、Ｎ末端、Ｃ末端のどちらでもよいが、Ｎ末端が好ましい。
局在化部位としては、細胞膜、ミトコンドリア、細胞骨格、核、小胞体などが挙げられるが、実施例に示すようにIP3センサーを細胞膜に局在させるために、ニューロモジュリンのバルミトイル化ドメインを含む20コのアミノ酸をN末端に付加してもよい。
さらに、この分子センサーには、FLAG、His-tag, strep-tag, GST, HA-tag, c-myc等のタンパク質精製用のアミノ酸配列やプロテアーゼ等の基質となるアミノ酸配列等を含んでもよい。
また、分子センサー遺伝子の開始コドンの上流に、コザック配列（Kozak 配列;CGCCACCATGC）を有することが好ましい。
In addition, Ace-Green and Cop-Green (Evrogen JSC) can be used as alternatives to EGFP, and HcRED-tandem (Evrogen JSC) can be used as alternatives to DsRed.
As shown in FIG. 1, the molecular sensor of the present invention comprises a ligand binding part of IP 3 receptor and two kinds of fluorescent substances (ECFP, EYFP, etc.). These two types of fluorescent substances may be exchanged, and a linker composed of amino acids of 1 residue or more, preferably about 4 to 30 residues, may be inserted between these constituent parts.
In addition, this molecular sensor may have a localization signal, and by immobilizing to a specific site, it is considered that fluorescence change is likely to occur, and quantitative measurement of IP 3 concentration is facilitated. The binding position of the localization signal in the molecular sensor may be either N-terminal or C-terminal, but the N-terminal is preferable.
Examples of localization sites include cell membrane, mitochondria, cytoskeleton, nucleus, endoplasmic reticulum, etc.In order to localize the IP 3 sensor to the cell membrane as shown in the examples, the neuromodulin balmitoylation domain is used. Twenty amino acids may be added to the N-terminus.
Furthermore, the molecular sensor may include an amino acid sequence for protein purification such as FLAG, His-tag, strep-tag, GST, HA-tag, and c-myc, an amino acid sequence serving as a substrate for protease, and the like.
Further, it preferably has a Kozak sequence (Kozak sequence; CGCCACCATGC) upstream of the start codon of the molecular sensor gene.
本発明の分子センサーを利用すると、細胞や動物や植物の組織内のIP3の濃度変化を知ることができる。細胞内にこの分子センサーを導入する方法については、公知のいかなる方法を用いてもよく、分子センサー（タンパク質）を直接細胞に導入してもよいし、このタンパク質をコードするＤＮＡを細胞に導入して発現させてもよい。特に確実な方法として、上記のように構成された分子センサーをコードするDNAを適当なベクターに組み込むことにより、各種細胞や動物や植物を形質転換することができる。このベクターとして、プラスミドベクター、ウイルスベクター、アグロバクテリウム等を用いることができる。組替えベクターを細胞に導入するには、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロプラスト融合法、エレクトロポレーション法、DEAEデキストラン法、Gene Gunによる遺伝子導入など公知の方法を用いることができる。あるいは、融合タンパク質の細胞内発現の方法としては、融合タンパク質遺伝子が染色体DNAに組込まれた遺伝子導入動物や植物（トランスジェニック動物やトランスジェニック植物）を作出することもできる。トランスジェニック動物やトランスジェニック植物の作出は公知の方法により行うこともできる。また、その作出において、融合遺伝子は染色体DNAの任意の部位に挿入されてもよく、あるいは内在性lP3遺伝子と相同組み替えするようにしてもよい。このようなトランスジェニック動物（マウス、ゼブラフィッシュ等）やトランスジェニック植物（タバコ、シロイヌナズナ、イネ等）は、in vivoの系でlP3濃度の定量が可能であり、IP3受容体の機能の解明、IP3-Ca2+系の障害による病態の解明、治療や診断法の確立、薬剤のスクリーニング等に利用価値が高い。
また、これらのトランジェニック動物やトランスジェニック植物から得られた細胞は薬剤のスクリーニング等にも利用することができる。さらに、分子センサーを用いることによって、従来の方法に比べて容易に溶液中のlP3濃度を容易に測定することも可能であり、そのための測定キットや測定機器を作成することも可能である。
By utilizing the molecular sensor of the present invention, it is possible to know changes in the concentration of IP 3 in cells, animals and plant tissues. As a method for introducing the molecular sensor into the cell, any known method may be used. The molecular sensor (protein) may be directly introduced into the cell, or DNA encoding the protein may be introduced into the cell. May be expressed. As a particularly reliable method, various cells, animals and plants can be transformed by incorporating DNA encoding the molecular sensor constructed as described above into an appropriate vector. As this vector, a plasmid vector, a viral vector, Agrobacterium or the like can be used. In order to introduce the recombinant vector into cells, known methods such as lipofection method, calcium phosphate method, microinjection method, proplast fusion method, electroporation method, DEAE dextran method, gene introduction by Gene Gun can be used. Alternatively, as a method for intracellular expression of the fusion protein, a transgenic animal or plant (transgenic animal or transgenic plant) in which the fusion protein gene is incorporated into chromosomal DNA can also be produced. Production of transgenic animals and transgenic plants can also be performed by known methods. Further, in the production, the fusion gene may be any may be inserted into the site, or endogenous lP 3 gene homologous recombination of the chromosomal DNA. Such transgenic animals (mouse, zebrafish, etc.) and transgenic plants (tobacco, Arabidopsis, rice, etc.) can quantitate lP 3 concentrations in an in vivo system, and elucidate the function of IP 3 receptors. It is highly useful for elucidating the pathophysiology caused by disorders of the IP 3 -Ca 2+ system, establishing treatments and diagnostic methods, and screening for drugs.
In addition, cells obtained from these transgenic animals and transgenic plants can be used for drug screening and the like. Furthermore, by using a molecular sensor, it is possible to easily measure the concentration of 1P 3 in a solution as compared with the conventional method, and it is also possible to create a measurement kit and a measurement device for that purpose.
また、本発明の分子センサーはそのまま溶液中で使用したり、適当な基体に固定化して用いることもできる。 Further, the molecular sensor of the present invention can be used in a solution as it is, or can be used by being immobilized on a suitable substrate.
以上のような分子センサーに、ドナーである蛍光タンパク(例えば、ECFP又はその改変体)の吸収波長に相当する光を照射する。この照射光の波長は改変の程度によっても変化するが350〜500nm、好ましくは400〜460nmである。非改変のECFPを用いる場合には420〜430nmの励起光を用いるのが好ましい。光源としては、ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用いて所望の波長範囲とした光源を用いてもよいし、レーザー等の単色光を用いてもよい。レーザー光源を使う場合は、ヘリウムカドミウムレーザー(442nm)が一般的であるが、ブルーダイオードレーザー(405nm)、アルゴンイオンレーザー(457nm)、LD励起固体レーザー(diode-pumped solid-state laser)（430nm）等を用いてもよい。二光子励起法であれば800nm付近のパルスレーザーを用いてもよい。 The molecular sensor as described above is irradiated with light corresponding to the absorption wavelength of a fluorescent protein that is a donor (for example, ECFP or a variant thereof). The wavelength of the irradiation light varies depending on the degree of modification, but is 350 to 500 nm, preferably 400 to 460 nm. When non-modified ECFP is used, it is preferable to use excitation light of 420 to 430 nm. As the light source, a light source having broad ultraviolet light or visible light in a desired wavelength range using a filter or a spectroscope may be used, or monochromatic light such as a laser may be used. When using a laser light source, helium cadmium laser (442nm) is common, but blue diode laser (405nm), argon ion laser (457nm), LD pumped solid-state laser (430nm) Etc. may be used. In the case of the two-photon excitation method, a pulse laser of around 800 nm may be used.
本発明においては、ドナーである蛍光タンパク質(例えば、ＥＣＦＰ又はその改変体)及び他方の蛍光タンパク質(例えば、ＥＹＦＰ又はその改変体)からの各蛍光を測定する。即ち、400〜515nm、好ましくは465〜495nm及び515〜600nm、好ましくは522〜548nmにおける蛍光の、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）によるその蛍光強度の変化を測定する。即ち、IP3の影響によりFRET効率が低下すれば、ＥＣＦＰ又はその改変体の蛍光強度が増加し、ＥＹＦＰ又はその改変体の蛍光強度が減少するため、これらの増加と減少の程度を測定すればよい。これらの変化はIP3の濃度に依存しているため、これらの変化からIP3の濃度を見積もることができる。これら２種の蛍光強度の処理はいかなる方法を用いてもよい。最も簡便な方法として、ＥＣＦＰ又はその改変体及びＥＹＦＰ又はその改変体からの各蛍光強度の比を測定し、これらを予めIP3濃度が０の場合といくつかの既知のIP3濃度における比の差を算出しておき、これらの間の検量線を作成しておけば、蛍光強度比のデータからIP3濃度を知ることができる。
また、細胞中のIP3生成系や代謝系に影響を与え、その結果IP3濃度に影響をあたえるシグナル分子や薬物の検索を行うこともできる。更に、この分子センサーを用いて、IP3受容体を活性化あるいは抑制する薬物を検出し、その濃度を測定することも可能である。
In the present invention, each fluorescence from a fluorescent protein (for example, ECFP or a variant thereof) as a donor and the other fluorescent protein (for example, EYFP or a variant thereof) is measured. That is, changes in fluorescence intensity due to fluorescence resonance energy transfer (FRET) of fluorescence at 400 to 515 nm, preferably 465 to 495 nm and 515 to 600 nm, preferably 522 to 548 nm are measured. That is, if the FRET efficiency decreases due to the influence of IP 3 , the fluorescence intensity of ECFP or a variant thereof increases, and the fluorescence intensity of EYFP or a variant thereof decreases. Therefore, if the extent of these increases and decreases is measured Good. These changes because it depends on the concentration of IP 3, it is possible to estimate the concentration of IP 3 from these changes. Any method may be used for the treatment of these two kinds of fluorescence intensities. The simplest method is to measure the ratio of each fluorescence intensity from ECFP or a variant thereof and EYFP or a variant thereof, and calculate the ratio of the ratio at a case where the IP 3 concentration is 0 and several known IP 3 concentrations. By calculating the difference and creating a calibration curve between them, the IP 3 concentration can be determined from the fluorescence intensity ratio data.
It is also possible to search for signal molecules and drugs that affect the IP 3 production system and metabolic system in the cell, and consequently affect the IP 3 concentration. Furthermore, using this molecular sensor, it is possible to detect a drug that activates or suppresses the IP 3 receptor and to measure its concentration.
IP3は様々な細胞のCa2+シグナルの発生に関与しているので、この融合タンパク質は幅広い生物医学領域の研究でその利用が見込まれる。特に、今回作成されたIP3センサーはDNAによって暗号化されているので、様々な細胞に導入可能である。また、この遺伝子を受精卵に導入することによって、全身の臓器あるいは任意の臓器にIP3センサーを発現するトランスジェニック動物を作成することが可能である。このような動物を用いると、生きた組織や生きた動物での細胞内IP3濃度の変化を測定することも期待でき、さまざまな生理機能、病体の解明に大きな進歩をもたらすと考えられる。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
Since IP 3 is involved in the generation of Ca 2+ signals in various cells, this fusion protein is expected to be used in a wide range of biomedical research. In particular, the IP 3 sensor created this time is encrypted with DNA, so it can be introduced into various cells. In addition, by introducing this gene into a fertilized egg, it is possible to create a transgenic animal that expresses the IP 3 sensor in a whole body organ or an arbitrary organ. If such an animal is used, it can be expected to measure changes in intracellular IP 3 concentration in living tissues and animals, and it is thought that it will bring about a great progress in elucidating various physiological functions and pathologies.
The following examples illustrate the invention, but are not intended to limit the invention.
pEYFP-N1（クローンテック社、図２）をBamH1とXba1で切断し、EYFP遺伝子を含むDNA断片を作成した。
また、pECFP-C1（クローンテック社、図３）をBamH1とXba1で切断し、そこにEYFP遺伝子を含むDNA断片を連結させた。
次に、ECFPとEYFPの融合遺伝子ベクターをBspE1とBamH1で切断し、ベクター（図３）の1331-1390番目までの60コの塩基を除去し、そこにBspE1、Xho I、Bgl II、Sal I、Bam H1の制限酵素サイトを含む合成DNA断片（配列番号３，リンカー部分）を挿入した（pCY-N、図４）。
pCY-NをBsrG Iで切断して、そこにECFPの一部、MCS及びEYFPの遺伝子が連結したDNA断片を切り出した。
同様にpECFP-mem（クローンテック社、図５）をBsrGIで切断し、そこにpCY-Nから切り出したDNA断片を挿入した（mCY-N、図６）。
さらに、mCY-NをEco47 III/Sma Iで切断して、バルネシル化ドメイン（膜局在シグナル）上流の62塩基を分離除去し、そのまま融合させた。これにより、非翻訳部位の不要な制限酵素切断部位を除去し、5'末端にバルネシル化ドメインを付加したECFPとEYFPの融合タンパク質遺伝子ベクター（mCY、図７）を作成した。
pEYFP-N1 (Clontech, FIG. 2) was digested with BamH1 and Xba1 to prepare a DNA fragment containing the EYFP gene.
Moreover, pECFP-C1 (Clontech, FIG. 3) was cut with BamH1 and Xba1, and a DNA fragment containing the EYFP gene was ligated thereto.
Next, the fusion gene vector of ECFP and EYFP is cleaved with BspE1 and BamH1 to remove 60 bases up to the 1331-1390th position of the vector (Fig. 3), and there are BspE1, Xho I, Bgl II, Sal I A synthetic DNA fragment (SEQ ID NO: 3, linker part) containing the restriction enzyme site of Bam H1 was inserted (pCY-N, FIG. 4).
pCY-N was cleaved with BsrGI, and a DNA fragment in which a part of ECFP, MCS and EYFP genes were linked was excised.
Similarly, pECFP-mem (Clontech, FIG. 5) was digested with BsrGI, and a DNA fragment excised from pCY-N was inserted therein (mCY-N, FIG. 6).
Furthermore, mCY-N was cleaved with Eco47 III / Sma I to separate and remove 62 bases upstream of the balnesylation domain (membrane localization signal) and fused as they were. As a result, an unnecessary restriction enzyme cleavage site of the untranslated site was removed, and an ECFP-EYFP fusion protein gene vector (mCY, FIG. 7) in which a valnesylated domain was added to the 5 ′ end was prepared.
次に、ラットIP3受容体（タイプ３）の遺伝子配列からプライマー（センスプライマー(配列番号４)、アンチセンスプライマー(配列番号５)）を設計し、ラット耳下腺cDNAライブラリーを鋳型としたPCR反応により、IP3受容体のリガンド結合部位を含むポリペプチドをコードする1.8kbのDNA(IP3R-N1.8、配列番号６の793-2604)の5'末端及び3'末端にXho I切断部位を付加したDNA断片を作成した。このIP3R-N1.8は、すでに知られているマウスIP3受容体（タイプ１）のリガンド結合部位と71.7%相同であった（Receptor and Channels, 2:2-22 (1994)）。
このPCR産物をTAクローニングベクターに挿入して増幅した後、XhoIで切り出した。この切り出されたDNA断片をXhoIで切断したmCYに挿入して、IP3センサー発現ベクター（mCY-IP3R-N1.8）を作成した。
図８ａはmCY-IP3R-N1.8ベクター(配列番号７)の制限酵素地図と分子センサー(配列番号６)の位置を示す。また、図８ｂは分子センサーの部品の遺伝子の位置及び制限酵素部位を示す。このmCY-IP3R-N1.8ベクター(配列番号７)の617〜4027番目は分子センサー(配列番号６)であり、この配列番号６の塩基配列において、1〜60番目は膜局在ドメイン、61〜777番目はECFP、778〜792番目はリンカー１、793〜2604番目はIP3受容体リガンド結合部位、2605〜2694番目はリンカー２、2695〜3411番目はEYFPをコードする。
Next, primers (sense primer (SEQ ID NO: 4) and antisense primer (SEQ ID NO: 5)) were designed from the gene sequence of rat IP 3 receptor (type 3), and a rat parotid gland cDNA library was used as a template. By PCR reaction, Xho at the 5 ′ end and 3 ′ end of 1.8 kb DNA (IP 3 R-N1.8, 793-2604 of SEQ ID NO: 6) encoding a polypeptide containing the ligand binding site of IP 3 receptor. A DNA fragment to which an I cleavage site was added was prepared. This IP 3 R-N1.8 was 71.7% homologous to the known ligand binding site of the mouse IP 3 receptor (type 1) (Receptor and Channels, 2: 2-22 (1994)).
This PCR product was inserted into a TA cloning vector, amplified, and then excised with XhoI. The excised DNA fragment was inserted into mCY cut with XhoI to prepare an IP 3 sensor expression vector (mCY-IP 3 R-N1.8).
FIG. 8a shows the restriction enzyme map of the mCY-IP 3 R-N1.8 vector (SEQ ID NO: 7) and the position of the molecular sensor (SEQ ID NO: 6). FIG. 8b shows the location of genes and restriction enzyme sites in the molecular sensor. In this mCY-IP 3 R-N1.8 vector (SEQ ID NO: 7), positions 617 to 4027 are molecular sensors (SEQ ID NO: 6). In the base sequence of SEQ ID NO: 6, positions 1 to 60 are membrane localization domains. , is 61 to 777 th ECFP, seven hundred and seventy-eight to seven hundred and ninety-two th 1,793～2604 th linker IP 3 receptor ligand binding site, from 2605 to 2694 th 2,2695～3411 th linker encoding EYFP.
容量が約100μLの実験チャンバー中でSH-SY5Y細胞(DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)から入手)を培養し、リポフェクトアミン2000(インビトロジェン社製)を用いて、細胞に分子センサー遺伝子を導入し、分子センサーを発現させた。このチャンバーを蛍光顕微鏡にセットして観察すると、細胞膜への分子センサーの局在が認められた。その様子を図９に示す。この細胞を430nmの光で励起するとECFPの蛍光である480nmとEYFPの蛍光である535nmの蛍光が観察された。
この分子センサーにIP3を直接作用させるために、チャンバー内の細胞をサポニンで穿孔した。細胞の穿孔は、100μg/mlのサポニンを含む細胞内液様メディウム（ICM；125mM KCl, 25mM NaCl, 1mM EGTA, 330μM CaCl2, pH 7.3）に、細胞を約１分間曝露した（穿孔後はチャンバー内の液をサポニンを含まないICMに置換した）。分子センサーは、細胞を穿孔した後でも細胞膜への局在していた。
SH-SY5Y cells (obtained from DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)) are cultured in an experimental chamber with a volume of approximately 100 μL, and molecular sensor genes are introduced into the cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). The molecular sensor was expressed. When this chamber was set on a fluorescence microscope and observed, the localization of the molecular sensor to the cell membrane was observed. This is shown in FIG. When the cells were excited with 430 nm light, ECFP fluorescence of 480 nm and EYFP fluorescence of 535 nm were observed.
In order to make IP 3 act directly on this molecular sensor, the cells in the chamber were perforated with saponin. For cell perforation, cells were exposed to an intracellular fluid-like medium (ICM; 125 mM KCl, 25 mM NaCl, 1 mM EGTA, 330 μM CaCl 2 , pH 7.3) containing 100 μg / ml saponin (chamber after the perforation). The liquid inside was replaced with ICM without saponin). Molecular sensors were localized to the cell membrane even after perforating the cells.
実施例１で作成した分子センサーを導入したSH-SY5Y細胞を、430nmの光で励起し、ECFPの蛍光である480nmとEYFPの蛍光である535nmにおける蛍光を観察した。
実験装置として、ニコン製倒立顕微鏡、浜松ホトニクス社製画像解析装置、W-viwe光学系、画像解析装置ソフトウェア（AQUACOSMOS）を用いた。
蛍光顕微鏡に試料（分子センサーを発現したSH-SY5Y細胞）をセットし、425nmの光を照射した。試料からの蛍光を485nmのダイクロイックミラーで２光路に分離し、それぞれの光路に取り付けた蛍光フィルターで480±15nm と535±12.5nmの蛍光だけを抽出した。それぞれの蛍光像をcooled CCDカメラで同時に記録し、画像解析装置ソフトウェアで480nmの蛍光（ECFP）を535nmの蛍光（EYFP）で割った蛍光比を算出した。
The SH-SY5Y cells into which the molecular sensor prepared in Example 1 was introduced were excited with light of 430 nm, and the fluorescence at 480 nm which is the fluorescence of ECFP and the fluorescence at 535 nm which is the fluorescence of EYFP was observed.
Nikon inverted microscopes, Hamamatsu Photonics image analyzers, W-viwe optical system, and image analyzer software (AQUACOSMOS) were used as experimental devices.
A sample (SH-SY5Y cells expressing a molecular sensor) was set on a fluorescence microscope and irradiated with light of 425 nm. The fluorescence from the sample was separated into two optical paths by a 485 nm dichroic mirror, and only the fluorescence at 480 ± 15 nm and 535 ± 12.5 nm was extracted by a fluorescent filter attached to each optical path. Each fluorescence image was recorded simultaneously with a cooled CCD camera, and a fluorescence ratio obtained by dividing fluorescence at 480 nm (ECFP) by fluorescence at 535 nm (EYFP) was calculated using image analysis software.
サポニンで穿孔した穿孔細胞を様々な濃度（0.03〜10μM）のIP3を含む細胞内液様溶液（ICM）と置換すると、IP3濃度に依存して分子センサーの蛍光比(480nm/535nm)の増加が認められた（図１０）。10μMのIP3で起こる蛍光比の変化を最大とし、その50%の蛍光比の変化を起こすIP3の濃度（EC50）は約200nMであった。
より親和性の高いIP3受容体のアゴニストであるアデノフォスチンAは、その約1/10の濃度でIP3と同等の蛍光比の増加を起こした。それに対し、イノシトール1,3,4三リン酸やイノシトール4,5二リン酸では、蛍光比の変化はほとんど認められなかった。高濃度のイノシトール1,3,4,5四リン酸は蛍光比をわずかに上昇させた（図１１）。これらの性質は、これまでに報告されているnativeなIP3受容体の性質とよく一致していた。
コントロール実験としてmCYを発現した細胞で同様の実験を行ったが、蛍光比の変化全く認められなかった。
これらの結果から、この融合タンパク質がIP3特異性の高い、高感度な分子センサーとして利用できることが確認された。
Replacing perforated cells perforated with saponin with an intracellular liquid-like solution (ICM) containing IP 3 at various concentrations (0.03-10 μM), the fluorescence ratio (480 nm / 535 nm) of the molecular sensor depends on the IP 3 concentration. An increase was observed (FIG. 10). The change in fluorescence ratio that occurred with 10 μM IP 3 was maximized, and the concentration of IP 3 that caused a 50% change in fluorescence ratio (EC50) was about 200 nM.
Adenophostin A, a higher affinity agonist of IP 3 receptor, caused an increase in fluorescence ratio equivalent to IP 3 at about 1/10 of its concentration. In contrast, inositol 1,3,4 triphosphate and inositol 4,5 diphosphate showed almost no change in fluorescence ratio. High concentrations of inositol 1,3,4,5 tetraphosphate slightly increased the fluorescence ratio (FIG. 11). These properties were in good agreement with the properties of the native IP 3 receptor reported so far.
As a control experiment, a similar experiment was performed on cells expressing mCY, but no change in the fluorescence ratio was observed.
From these results, it was confirmed that this fusion protein can be used as a highly sensitive molecular sensor with high IP 3 specificity.
次に、この分子センサーを発現させたSH-SY5Y細胞を含むチャンバー内の液を10μM及び100μMのアセチルコリンを含むハンクスーヘペス液で置換することによって、細胞をアセチルコリンで刺激すると蛍光比(480nm/535nm)の上昇が認められ、アセチルコリンを含まないハンクスーヘペス液で置換すると蛍光比は元に戻った（図１２）。この蛍光比の変化（差）を穿孔細胞に既知の濃度のIP3を作用させて作成した検量腺（図１３）と比較すると、SH-SY5Y細胞をアセチルコリン刺激時の細胞内IP3濃度は約0.3μMと算定された。
この結果から、この発明の分子センサーの蛍光強度の比の変化を測定することによって、細胞内のIP3濃度を正確に定量することができることが確認された。
Next, by replacing the solution in the chamber containing SH-SY5Y cells expressing this molecular sensor with Hanks-Hepes solution containing 10 μM and 100 μM acetylcholine, the cells were stimulated with acetylcholine to obtain a fluorescence ratio (480 nm / 535 nm). An increase was observed, and the fluorescence ratio returned to its original value when replaced with Hanks-Hepes solution containing no acetylcholine (FIG. 12). When this change (difference) in the fluorescence ratio is compared with a calibration gland (FIG. 13) prepared by applying a known concentration of IP 3 to perforated cells, the intracellular IP 3 concentration of SH-SY5Y cells upon stimulation with acetylcholine is about Calculated as 0.3 μM.
From this result, it was confirmed that the intracellular IP 3 concentration can be accurately quantified by measuring the change in the fluorescence intensity ratio of the molecular sensor of the present invention.
実施例１で作成したIP3分子センサーのpH安定性とFRET効率を向上させるために、蛍光アクセプターであるEYFPをYFP変異体に置換したpH安定型IP3分子センサーを作成した（図１４）。このYFP変異体とは、EYFPの46番目と64番目フェニルアラニンをロイシンに（F46L、F64L）、153番目のメチオニンをスレオニン（M153T）に、163番目のバリンをアラニン（V163A）に、175番目のセリンをグリシン（S175G）に置換したもので、ｐＨや塩素濃度に対する安定性の向上と蛍光強度の増加を起こすことが知られている（Nagai et al. Nature Biotech., 20:87-90 (2002)）。
まず最初にプライマー（配列番号８）とアンチセンスプライマー（配列番号９）を設計し、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit（Strategene社製）を用いてpEYFP-N1のアミノ酸置換（F46L）を行った。次にプライマー（配列番号１０）とアンチセンスプライマー（配列番号１１）を用い、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kitで（F64L）のアミノ酸置換を行った。さらに、プライマー（配列番号１２）とアンチセンスプライマー（配列番号１３）を用いて（M153T/V163A/S175G）のアミノ酸置換を行ってYFP変異体を作成した。
In order to improve the pH stability and FRET efficiency of IP 3 molecular sensors prepared in Example 1 to prepare a pH-stable IP 3 molecules sensors replacing the EYFP a fluorescent acceptor YFP mutants (Figure 14). These YFP mutants are EYFP 46th and 64th phenylalanine to leucine (F46L, F64L), 153rd methionine to threonine (M153T), 163rd valine to alanine (V163A), 175th serine Is replaced with glycine (S175G), which is known to increase stability against pH and chlorine concentration and increase fluorescence intensity (Nagai et al. Nature Biotech., 20: 87-90 (2002) ).
First, a primer (SEQ ID NO: 8) and an antisense primer (SEQ ID NO: 9) were designed, and pEYFP-N1 amino acid substitution (F46L) was performed using QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Strategene). . Next, using the primer (SEQ ID NO: 10) and the antisense primer (SEQ ID NO: 11), amino acid substitution of (F64L) was performed with QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit. Furthermore, amino acid substitution of (M153T / V163A / S175G) was performed using a primer (SEQ ID NO: 12) and an antisense primer (SEQ ID NO: 13) to prepare a YFP mutant.
次にプライマー（配列番号１４）とアンチセンスプライマー（配列番号１５）を設計し、mCY-IP3R-N1.8を鋳型としたPCR反応により、膜局在シグナル、ECFP、IP3受容体リガンド結合部位及びリンカーのポリペプチドをコードするDNA断片を作成した。このPCR産物をTAクローニングベクターに挿入して増幅した後、NheIとEcoRIで切り出した。YFP変位体の遺伝子を含むベクターをNheIとEcoRIで切断し、TAクローニングベクターから切り出されたDNA断片を挿入してpH安定型IP3分子センサー（mCYv-IP3R-N1.8）を作成した。
図１５は実施例１で作成した変位導入を行っていないIP3分子センサー（mCY-IP3R-N1.8）と変位導入を行ったpH安定型IP3分子センサー（mCYv-IP3R-N1.8）の蛍光比の変化をサポニン穿孔細胞を用いて比較したものである。mCY-IP3R-N1.8に使われているEYFPはpHの低下によって蛍光強度が減弱するために蛍光比（480nm/535nm）の大きな増加が見られるが（ａ）、EYFP変異体を用いたmCYv-IP3R-N1.8ではpHによる蛍光比の変化が約1/3に押さえられる事が確認された（ｂ）。
さらにサポニン穿孔細胞を用いてIP3に対する反応性を比較すると（図１６）、変異導入前の分子センサー（ａ）と比較して、変異導入後の分子センサー（ｂ）では、IP3によって変化する蛍光比の割合が約1.5倍に増強する事が確認された。
Next, a primer (SEQ ID NO: 14) and an antisense primer (SEQ ID NO: 15) are designed and subjected to a PCR reaction using mCY-IP 3 R-N1.8 as a template, membrane localization signal, ECFP, IP 3 receptor ligand A DNA fragment encoding the binding site and linker polypeptide was generated. This PCR product was inserted into a TA cloning vector, amplified, and then excised with NheI and EcoRI. A vector containing the YFP displacement gene was cleaved with NheI and EcoRI, and a DNA fragment excised from the TA cloning vector was inserted to create a pH stable IP 3 molecular sensor (mCYv-IP 3 R-N1.8). .
FIG. 15 shows the IP 3 molecular sensor (mCY-IP 3 R-N1.8) not introduced with displacement and the pH-stable IP 3 molecular sensor (mCYv-IP 3 R-) with displacement introduced in Example 1. N1.8) changes in fluorescence ratio using saponin perforated cells. EYFP used in mCY-IP 3 R-N1.8 has a large increase in fluorescence ratio (480nm / 535nm) due to the decrease in fluorescence intensity due to the decrease in pH (a). In mCYv-IP 3 R-N1.8, it was confirmed that the change in fluorescence ratio due to pH was suppressed to about 1/3 (b).
Furthermore, when the reactivity to IP 3 is compared using saponin perforated cells (FIG. 16), the molecular sensor after mutation introduction (b) changes depending on IP 3 compared to the molecular sensor (a) before mutation introduction. It was confirmed that the ratio of the fluorescence ratio was enhanced about 1.5 times.
哺乳類のIP3受容体にはタイプ１からタイプ３の３つのサブタイプがあり、タイプ１とタイプ２はタイプ３よりもIP3に対する親和性が高い事が知られている（Miyakawa et al. EMBO J., 18: 1303-1308 (1999)）。そこで、実施例４で作成したpH安定型IP3分子センサー（mCYv-IP3R-N1.8）のIP3感受性をさらに高めるために、タイプ３IP3受容体の1-604番目のアミノ酸に相当する配列番号１の265-868番目までのアミノ酸をタイプ１IP3受容体及びタイプ２IP3受容体のリガンド結合部（1-604番目のアミノ酸）に置換した分子センサーを作成した。
ラットIP3受容体（タイプ１）の遺伝子配列からプライマー（センスプライマー（配列番号１６）、アンチセンスプライマー（配列番号１７））を設計し、ラット耳下腺cDNAライブラリーを鋳型とした PCR反応により、タイプ１IP3受容体のリガンド結合部位（1-604番目まで）を含むポリペプチドをコードする1.8kbのDNAの5'末端及び3'末端にXhoI切断部位を付加したDNA断片を作成した。このPCR産物をTAクローニングベクターに挿入して増幅した後、XhoIで切り出した。実施例４で作成したpH安定型IP3分子センサー（mCYv-IP3R-N1.8）をXho Iで切断し、TAクローニングベクターから切り出されたDNA断片を挿入して、高感受性IP3分子センサー・タイプ１（mCYv-IP3R1）を作成した。
同様にプライマー（センスプライマー（配列番号１６）、アンチセンスプライマー（配列番号１８））を設計し、ラット耳下腺cDNAライブラリーを鋳型とした PCR反応により、タイプ２IP3受容体のリガンド結合部位を含むポリペプチドをコードする1.8kbのDNAの5'末端及び3'末端にXhoI切断部位を付加したDNA断片を作成した。このPCR産物をTAクローニングベクターに挿入して増幅した後、XhoIで切り出した。この切り出されたDNA断片をXho Iで切断したpH安定型IP3分子センサーに挿入して、高感受性IP3分子センサー・タイプ２（mCYv-IP3R2）を作成した。
There are three types of mammalian IP 3 receptors, type 1 to type 3, and types 1 and 2 are known to have higher affinity for IP 3 than type 3 (Miyakawa et al. EMBO J., 18: 1303-1308 (1999)). Therefore, in order to further enhance the IP 3 sensitivity of the pH stable IP 3 molecular sensor (mCYv-IP 3 R-N1.8) prepared in Example 4, it corresponds to the 1-604th amino acid of the type 3 IP 3 receptor. It created a molecular sensors that substituting amino acids up to 265-868 in SEQ ID NO: 1 in the ligand binding portions of the type 1IP 3 receptor and type 2IP 3 receptor (1-604 amino acid) that.
Primers (sense primer (SEQ ID NO: 16) and antisense primer (SEQ ID NO: 17)) were designed from the gene sequence of rat IP 3 receptor (type 1), and PCR reaction was performed using rat parotid gland cDNA library as a template. A DNA fragment was prepared by adding a XhoI cleavage site to the 5 ′ end and 3 ′ end of a 1.8 kb DNA encoding a polypeptide containing a ligand binding site (up to 1-604th) of the type 1 IP 3 receptor. This PCR product was inserted into a TA cloning vector, amplified, and then excised with XhoI. The pH-stable IP 3 molecule sensor (mCYv-IP 3 R-N1.8) prepared in Example 4 was cleaved with Xho I, and a DNA fragment excised from the TA cloning vector was inserted to obtain a highly sensitive IP 3 molecule. Sensor type 1 (mCYv-IP 3 R1) was created.
Similarly, primers (sense primer (SEQ ID NO: 16), antisense primer (SEQ ID NO: 18)) were designed, and the ligand binding site of type 2 IP 3 receptor was determined by PCR reaction using rat parotid gland cDNA library as a template. A DNA fragment was prepared by adding XhoI cleavage sites to the 5 ′ end and 3 ′ end of 1.8 kb DNA encoding the polypeptide to be contained. This PCR product was inserted into a TA cloning vector, amplified, and then excised with XhoI. The excised DNA fragment was inserted into a pH-stable IP 3 molecule sensor cleaved with Xho I to prepare a highly sensitive IP 3 molecule sensor type 2 (mCYv-IP 3 R2).
タイプ１IP3受容体のリガンド結合部の４４１番目のアルギニンをグルタミンに置換するとIP3に対する親和性が高まることが知られている（Yoshikawa et al., J. Biol. Chem., 271: 18277-18284 (1996)）。同様な親和性の向上はタイプ２IP3受容体やタイプ３IP3受容体でも起こることが予想されることから、pH安定型IP3分子センサー（mCYv-IP3R-N1.8）及び高感受性IP3分子センサー・タイプ２（mCYv-IP3R2）のIP3感受性をさらに高めるために、分子センサーのリガンド結合部位のアミノ酸置換を行った。
プライマー（配列番号１９）とアンチセンスプライマー（配列番号２０）を設計し、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kitを用いてmCYv-IP3R-N1.8の配列番号１の704番目のアルギニンをグルタミンに置換して高感度型IP3分子センサー・タイプ３（mCYv-IP3R3S）を作成した。
同様にプライマー（配列番号２１）とアンチセンスプライマー（配列番号２２）を設計し、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kitを用いてmCYv-IP3R2の705番目のアルギニンをグルタミンに置換して高感度型IP3分子センサー・タイプ２Ｓ（mCYv-IP3R2S）を作成した。
Substituting glutamine for the 441st arginine of the ligand binding site of type 1 IP 3 receptor is known to increase the affinity for IP 3 (Yoshikawa et al., J. Biol. Chem., 271: 18277-18284). (1996)). Similar affinity improvement of the fact that is expected to occur in type 2IP 3 receptor and type 3IP 3 receptor, pH stabilized IP 3 molecular sensors (mCYv-IP 3 R-N1.8 ) and highly sensitive IP In order to further enhance the IP 3 sensitivity of the trimolecular sensor type 2 (mCYv-IP 3 R2), amino acid substitution at the ligand binding site of the molecular sensor was performed.
A primer (SEQ ID NO: 19) and an antisense primer (SEQ ID NO: 20) are designed, and the 704th arginine of SEQ ID NO: 1 of mCYv-IP 3 R-N1.8 is glutamine using the QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit. The high-sensitivity IP 3 molecule sensor type 3 (mCYv-IP 3 R3S) was created.
Similarly, a primer (SEQ ID NO: 21) and an antisense primer (SEQ ID NO: 22) are designed, and the 705th arginine of mCYv-IP 3 R2 is replaced with glutamine using QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit. Type IP 3 molecule sensor type 2S (mCYv-IP 3 R2S) was prepared.
実施例４で作成したpH安定型IP3分子センサー（mCYv-IP3R-N1.8）、実施例５で作成した高感度型IP3分子センサー・タイプ１（mCYv-IP3R1）と高感受性IP3分子センサー・タイプ２（mCYv-IP3R2）及び実施例６で作成した高感度型IP3分子センサー・タイプ３（mCYv-IP3R3S）と高感度型IP3分子センサー・タイプ２Ｓ（mCYv-IP3R2S）の反応性を実施例１で作成した変異導入を行う前の分子センサー（mCY-IP3R-N1.8）と比較した。すなわち、これらの分子センサーをコードする遺伝子を導入したSH-SY5Y細胞をサポニンで穿孔し、10nM〜10μMのIP3による蛍光比の変化を解析した。
変異導入前の分子センサーの蛍光比の変化を起こす最小のIP3濃度は100nMであったのに対し、高感度型タイプ１，高感度型タイプ２、高感度型タイプ２Ｓでは10nMのIP3で明らかな蛍光比の上昇が認められた。また、高感度型タイプ２、高感度型タイプ２Ｓ、高感度型タイプ３では、100nMのIP3による蛍光比の変化は４〜６倍に増大した（図１７）。これらの結果から、高感度型IP3分子センサー・タイプ１、タイプ２、タイプ２Ｓ、タイプ３は、いずれも低濃度のIP3に対する反応性が増大していることが確認された。
PH stable IP 3 molecule sensor (mCYv-IP 3 R-N1.8) prepared in Example 4, high sensitivity IP 3 molecule sensor type 1 (mCYv-IP 3 R1) prepared in Example 5 and high Sensitive IP 3 molecule sensor type 2 (mCYv-IP 3 R2) and high sensitivity type IP 3 molecule sensor type 3 (mCYv-IP 3 R3S) and high sensitivity type IP 3 molecule sensor type 2S created in Example 6 The reactivity of (mCYv-IP 3 R2S) was compared with that of the molecular sensor (mCY-IP 3 R-N1.8) before the mutagenesis prepared in Example 1. That is, SH-SY5Y cells into which genes encoding these molecular sensors were introduced were perforated with saponin, and the change in fluorescence ratio due to 10 nM to 10 μM IP 3 was analyzed.
The minimum IP 3 concentration that causes a change in the fluorescence ratio of the molecular sensor before mutagenesis was 100 nM, whereas the high sensitivity type 1, high sensitivity type 2 and high sensitivity type 2S had an IP 3 of 10 nM. A clear increase in the fluorescence ratio was observed. In the high-sensitivity type 2, high-sensitivity type 2S, and high-sensitivity type 3, the change in fluorescence ratio due to 100 nM IP 3 increased 4 to 6 times (FIG. 17). From these results, it was confirmed that the high-sensitivity IP 3 molecular sensor type 1, type 2, type 2S, and type 3 all have increased reactivity to low concentrations of IP 3 .
本発明の分子センサーは、IP3受容体に作用する薬物やIP3生成系あるいはIP3分解系に作用する薬物の検索に用いることができる。その場合、それらの薬物の作用が特異的なものであるか否かを確かめる手段として、分子センサーとほぼ同じ構造を持ちながらIP3に対する親和性を持たないコントロール分子が有用である。
タイプ１IP3受容体のリガンド結合部の５０８番目のリジンをアラニンに置換するとIP3に対する親和性が消失することが知られている（Yoshikawa et al., J. Biol. Chem., 271: 18277-18284 (1996)）。同様な親和性の消失はタイプ３IP3受容体でも起こることが予想されることから、pH安定型IP3分子センサ（mCYv-IP3R-N1.8）のリガンド結合部位のアミノ酸置換を行った。プライマー（配列番号２３）とアンチセンスプライマー（配列番号２４）を設計し、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kitを用いてmCYv-IP3R-N1.8の771番目のリジンをアラニンに置換してコントロール分子（mCYv-IP3R3C）を作成した。
この分子をコードする遺伝子を導入したSH-SY5Y細胞をサポニンで穿孔し、IP3による蛍光比の変化を解析したところ、最大濃度(10μM)のIP3を添加しても、蛍光比の変化は全く認められなかった（図１８）。この結果から、この分子はIP3に対する親和性を持たないコントロール分子として利用できることが確認された。
The molecular sensor of the present invention can be used to search for drugs that act on IP 3 receptors, drugs that act on IP 3 production systems, or IP 3 degradation systems. In that case, a control molecule that has almost the same structure as a molecular sensor but does not have an affinity for IP 3 is useful as a means for ascertaining whether or not the action of these drugs is specific.
It is known that the affinity for IP 3 disappears when lysine at position 508 in the ligand binding site of type 1 IP 3 receptor is substituted with alanine (Yoshikawa et al., J. Biol. Chem., 271: 18277- 18284 (1996)). Since the similar loss of affinity is expected to occur in the type 3 IP 3 receptor, amino acid substitution was performed at the ligand binding site of the pH stable IP 3 molecular sensor (mCYv-IP 3 R-N1.8). . Design a primer (SEQ ID NO: 23) and antisense primer (SEQ ID NO: 24), and replace 771st lysine of mCYv-IP 3 R-N1.8 with alanine using QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit. A control molecule (mCYv-IP 3 R3C) was created.
When SH-SY5Y cells into which the gene encoding this molecule was introduced were perforated with saponin and the change in fluorescence ratio due to IP 3 was analyzed, the change in fluorescence ratio did not change even when the maximum concentration (10 μM) of IP 3 was added. It was not recognized at all (FIG. 18). From the results, the molecule can be used as a control molecule having no affinity for IP 3 was confirmed.
Claims (13)
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列の265〜489番目のいずれかから842〜868番目のいずれかまでのアミノ酸配列を含むポリペプチド
（２）（１）のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、イノシトール１，４，５三リン酸との親和性を有するポリペプチド A molecular sensor comprising a ligand binding part of an IP 3 receptor and two fluorescent substances that cause fluorescence resonance energy transfer (FRET), wherein the ligand binding part of the IP 3 receptor has the following (1) or (2 ) A molecular sensor comprising any of the polypeptides.
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence from any of the amino acid sequence 265 to 489 to any one of the 842 to 868 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) In the polypeptide of (1), 1 or a number A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one amino acid is substituted and having affinity for inositol 1,4,5 triphosphate
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列の21〜259番目のアミノ酸配列から成るポリペプチド
（４）（３）のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、465〜495nmにピークを有する光を発光するポリペプチド
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列の899〜1137番目のアミノ酸配列から成るポリペプチド
（６）（５）のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、522〜548nmにピークを有する光を発光するポリペプチド The fluorescent protein ECFP is composed of the polypeptide of (3) or (4), and the fluorescent protein EYFP is composed of the polypeptide of (5) or (6). The molecular sensor according to one item.
(3) Polypeptide (4) consisting of amino acid sequences 21 to 259 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (4) In the polypeptide of (3), one or several amino acids have been deleted, substituted or added A polypeptide comprising an amino acid sequence and emitting light having a peak at 465 to 495 nm (5) Polypeptide of a polypeptide (6) (5) comprising an amino acid sequence from 899 to 1137 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and emitting light having a peak at 522 to 548 nm.
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