JP4802216B2

JP4802216B2 - ビフィドバクテリウム属菌含有組成物及びビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法

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Publication number: JP4802216B2
Application number: JP2008152950A
Authority: JP
Inventors: 金忠清水; 寿美子米澤
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2008-06-11
Filing date: 2008-06-11
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2028-06-11
Also published as: JP2009296910A

Description

本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分と、乳タンパク質と、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌とを有するビフィドバクテリウム属菌含有組成物、及び該ビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法に関する。

ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、すなわちビフィズス菌は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つであり、腸内細菌のバランスを回復する整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌発酵乳等の生きているビフィズス菌を含む食品への需要が高まっている。

ビフィズス菌は、乳性培地における増殖性が悪い。このため、発酵乳中に一定量の、例えば１×１０^７ＣＦＵ／ｍＬのビフィズス菌を含有させるために、通常、酵母エキス等の様々な増殖促進物質を添加することが行われている。しかし、該増殖促進物質は一般的に高価であり、かつ、風味が損なわれるおそれもある。

ビフィズス菌以外の乳酸菌と混合発酵をさせることにより、該生育促進物質等を添加することなく、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されている。発酵乳製造におけるビフィズス菌の生育性を改善させる方法については、例えば、（１）ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）及びビフィズス菌属を含有することを特徴とするヨーグルト及びその製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。

その他、発酵乳のビフィズス菌の保存生残性を改善させる方法については、例えば、（２）乳を主成分とする培地で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒｅｖｅ）、並びにダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスを混合培養することを特徴とするビフィズス菌発酵乳の製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
特許第３３６４４９１号公報特許第３０６８４８４号公報

しかしながら、上記（１）の方法では、必ずしも充分なビフィズス菌の生育促進及び発酵時間短縮の効果があるとは言えない。また、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの２種類の菌が存在する条件下でビフィズス菌の生育が促進されるとされているが、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス又はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスをそれぞれ単独で用いた場合の効果については、一切記載がない。
一方、上記（２）の方法では、特定のビフィズス菌と特定の乳酸菌とからなる混合菌を用いることにより、増殖促進効果と生残性改善効果の両方が認められるものの、ビフィドバクテリウム・ブレーベ以外のビフィズス菌、例えば食品に汎用されているビフィドバクテリウム・ロンガムについては、一切記載がない。

また、上記（１）及び（２）の方法のいずれも、ビフィズス菌とラクトコッカス乳酸菌の生菌を共培養しており、このため、ラクトコッカス属菌の生育管理が必要であり、ラクトコッカス乳酸菌の生育状況によりビフィズス菌増殖促進効果に変動をきたす可能性があり、常に品質が安定した製品を供給するためには問題があった。また、生菌を利用した場合、発酵中にラクトコッカス乳酸菌自身が増殖することにより、発酵産物にラクトコッカス乳酸菌発酵による独特な風味が伴うことがあり、好まれないことが多いという問題もあった。

本発明は、ビフィズス菌の増殖性が非常に良好であり、かつ、品質が安定した、風味的にも良好なビフィズス菌含有組成物、及び該ビフィズス菌含有組成物の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、細胞壁局在性タンパク質分解酵素ＰｒｔＰを有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分と、乳タンパク質とを併用することにより、ビフィズス菌の増殖が促進されることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分と、乳タンパク質と、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌とを有することを特徴とするビフィドバクテリウム属菌含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）であることを特徴とする、前記記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクチスが、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする、前記記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記乳タンパク質がカゼインであることを特徴とする前記いずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）であることを特徴とする前記いずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガムタイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株であることを特徴とする前記記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、食品、サプリメント、医薬品、及び飼料からなる群より選択される１であることを特徴とする前記いずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、発酵乳又は乳酸菌飲料である前記記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分を添加した、乳タンパク質を含有する培地に、ビフィドバクテリウム属菌を接種することを特徴とするビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分を添加した、乳タンパク質を含有する培地に、ビフィドバクテリウム属菌を接種した後、発酵させることを特徴とするビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）であることを特徴とする、前記記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクチスが、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする、前記記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記乳タンパク質がカゼインであることを特徴とする前記いずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）であることを特徴とする前記いずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガムタイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株であることを特徴とする前記記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌含有組成物が、食品、サプリメント、医薬品、及び飼料からなる群より選択される１であることを特徴とする前記いずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌含有組成物が、発酵乳又は乳酸菌飲料であることを特徴とする前記記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法を提供するものである。

本発明のビフィズス菌含有組成物は、そのまま、あるいはビフィズス菌を培養することにより、従来に無くビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムを多く含有する組成物であり、より整腸効果が高く、健康管理上も有用である。また、本発明のビフィズス菌含有組成物においてビフィズス菌の増殖促進活性を担っているのは、乳酸菌の菌体破砕物又は画分であるため、乳酸菌の生菌を使用する組成物とは異なり、品質が安定した組成物を効率よく製造することができる。

本発明のビフィズス菌含有組成物は、ＰｒｔＰ酵素を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分と、乳タンパク質と、ビフィズス菌とを有することを特徴とする。ＰｒｔＰ酵素を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分と、乳タンパク質とを併用することにより、ビフィズス菌を従来になく良好に増殖させることができるため、本発明のビフィズス菌含有組成物は、ビフィズス菌含量の高い組成物又はその原料組成物である。ＰｒｔＰ酵素を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分と、乳タンパク質との併用により、ビフィズス菌増殖促進活性が得られる理由は明らかではないが、乳タンパク質を、ＰｒｔＰを用いて加水分解することにより、ビフィズス菌増殖促進作用を有するオリゴペプチドが得られるためではないかと推察される。

本発明において、ＰｒｔＰ酵素とは、細胞膜に存在し、細胞表面に活性部位が剥き出しになっている酵素である。ＰｒｔＰ酵素を有している乳酸菌としては、例えば、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）やラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス属菌において、ＰｒｔＰを有する菌株が幾つか報告されている。

これまでに、ラクトコッカス・ラクチス由来のＰｒｔＰ酵素には、Ｐ_Ｉ型（α―カゼインを余り分解せず、β―カゼインをＣ末端の近辺からよく分解する）、Ｐ_ＩＩＩ型（α―カゼイン及びβ―カゼインをＣ末端及びＮ末端の両方からよく分解する）及びその中間型（Ｐ_Ｉ／Ｐ_ＩＩＩ型）が知られている（例えば、Ｒｅｉｄ，ＪＲ．ｅｔａｌ．、ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年、第６０巻第３号、第８０１〜８０６ページ参照。）。
具体的には、ラクトコッカス・ラクチス由来のＰｒｔＰ酵素として、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）にアクセッション番号ＡＹ５４２６９０、ＡＹ５４２６９１等として遺伝子配列が登録されているＰｒｔＰ酵素等が挙げられる。

ある乳酸菌が、ＰｒｔＰ酵素を有する乳酸菌であるか否かは、例えば、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）等の遺伝子解析技術を用いて、ＰｒｔＰ酵素をコードするＰｒｔＰ遺伝子を有しているか否かを調べることにより確認することができる。

ＰｒｔＰ酵素は、細胞外に酵素活性部位を有するため、培地中のタンパク質を分解することができる。例えば、乳酸菌が乳性培地で増殖するときに、ＰｒｔＰ酵素が、乳性培地中の乳タンパク質を分解し、乳酸菌の生育に必要となるオリゴペプチドやアミノ酸が提供される。このため、ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスは、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができるほど増殖が早く、強い発酵性を有する、という特徴がある。このような増殖性や発酵性が高いという特徴を利用して、ＰｒｔＰ酵素を有する乳酸菌を検出することもできる。その他、ＰｒｔＰ酵素活性を検出することによっても、ＰｒｔＰ酵素を有する乳酸菌を検出することができる。

本発明に用いられる乳酸菌は、ＰｒｔＰ酵素を有するものであれば特に限定されるものではないが、ラクトコッカス属菌であることが好ましく、ラクトコッカス・ラクチスであることがより好ましく、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスやラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス等であることがさらに好ましい。発酵乳等のビフィズス菌を原料とする乳製品において、従来から原料として使用されていることから、安全性が高いと考えられるためである。ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスとしては、例えば、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６^Ｔ株や、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株等がある。

本発明において用いられるＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌（ＰｒｔＰ酵素を有する乳酸菌）の菌体破砕物は、該乳酸菌をＰｒｔＰ酵素の酵素活性を損なうことなく破砕することにより得られたものであれば、特に限定されるものではない。このような破砕方法として、例えば、超音波を利用した破砕処理、ガラスビーズ破砕処理、浸透圧ショックを利用した破砕処理等が挙げられる。なお、これらの破砕処理は、５０℃以下、好ましくは室温以下、より好ましくは１０℃以下の低温下において行うことが好ましい。加熱により、ＰｒｔＰ酵素が失活してしまうためである。

なお、菌体破砕物を調製するために用いられるＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌は、生菌体であってもよく、死菌体であってもよいが、生菌体であることが好ましい。ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の生菌体は、常法により培養した乳酸菌をそのまま用いてもよく、凍結乾燥等の常法により調整した乾燥菌末であってもよい。培養した乳酸菌としては、培養に用いた培地ごと用いてもよく、遠心分離処理等により培地から菌体のみを回収した後、適当なバッファー等に懸濁させたものであってもよい。余分な培地等を除去し得ること、また濃縮や希釈により濃度を調整することも可能であることから、培地から回収した菌体をバッファーに懸濁させたものを用いることが好ましい。

培地から回収した菌体を懸濁させるバッファー等としては、乳酸菌を生菌の状態で懸濁させることができる溶媒であれば、特に限定されるものではなく、乳酸菌等の懸濁に通常用いられるバッファー等を用いることができるが、カルシウムイオンを含むバッファー等であることが好ましい。懸濁に用いられるバッファーのｐＨとしては、４．５〜８．０であることが好ましい。該バッファーとして、例えば、ＭＥＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、リン酸バッファー等が挙げられる。その他、生理食塩水であってもよい。

本発明において用いられるＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分は、該乳酸菌から、ＰｒｔＰ酵素の酵素活性を損なうことなく、ＰｒｔＰ酵素を分画することにより得られたものであれば、特に限定されるものではない。例えば、培養後に培地から回収された乳酸菌を、バッファー中に懸濁して保持した後、遠心分離処理等によって菌体を除去することにより、乳酸菌の細胞表面から遊離したＰｒｔＰ酵素を含む上清を、ＰｒｔＰ酵素画分として得ることができる。該バッファーに、ＥＤＴＡ等のキレート剤を添加することにより、乳酸菌の細胞表面からＰｒｔＰ酵素が遊離されやすくなるため、ＥＤＴＡ等のキレート剤を添加したバッファーを用いることが好ましい。このような上清を得るためのバッファーとしては、例えば、上記生菌体の懸濁に用いることができるバッファーとして挙げられたものに、ＥＤＴＡ等のキレート剤を添加したものを用いることができる。また、バッファー中に乳酸菌を保持する温度は、５０℃未満であれば特に限定されるものではないが、４〜３７℃程度であることが好ましく、３０℃程度であることがより好ましい。また、保持時間は、保持温度やバッファーの種類等を考慮して適宜決定することができるが、１時間以内であることが好ましく、５〜３０分間であることがより好ましく、５〜１５分間であることがさらに好ましい。

なお、このようにして得られた上清を、透析処理することにより、ＰｒｔＰ酵素画分からキレート剤を除去することができる。さらに、分画されたＰｒｔＰ酵素画分は、凍結濃縮等の公知の手法により、ＰｒｔＰ酵素活性を損なうことなく濃縮することもできる。その他、乳酸菌の菌体破砕物を、硫酸アンモニウム沈殿法やクロマトグラフィー法等の公知の分画手段を用いて分画することにより得られたＰｒｔＰ酵素画分であってもよい。

また、これらのＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスは、ダイアセチル及びアセトインを生成しないため、これらの乳酸菌の菌体破砕物やＰｒｔＰ酵素画分を用いることにより、風味の良い組成物を製造し得ることも期待できる。

なお、このようにして調製されたＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物やＰｒｔＰ酵素画分は、適宜に凍結濃縮又は凍結乾燥した後に、ビフィズス菌含有組成物へ添加してもよい。

本発明のビフィズス菌含有組成物中のＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物やＰｒｔＰ酵素画分の量は、ビフィズス菌の培養（発酵）時間、ビフィズス菌の接種量、ビフィズス菌の種類等を考慮して、適宜決定することができる。ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物やＰｒｔＰ酵素画分の量が多いほど、高いビフィズス菌増殖促進効果を得ることができる。たとえば、本発明のビフィズス菌含有組成物中のＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物やＰｒｔＰ酵素画分の濃度は、０．０１重量％以上であることが好ましく、０．１重量％以上であることが好ましく、１重量％以上であることがさらに好ましい。

本発明において用いられる乳タンパク質は、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の動物（但しヒトを除く）から採取された乳由来のタンパク質であれば、特に限定されるものではなく、食用に通常用いられる乳由来のタンパク質を適宜選択して用いることができる。本発明においては、産業上の利用価値の高い牛乳に含まれている乳タンパク質であることが好ましい。
また、牛乳タンパク質としては、カゼインであってもよく、ホエータンパク質（ホエー中に含まれるタンパク質）であってもよく、トータルミルクプロテインであってもよい。本発明において用いられる乳タンパク質としては、牛乳由来のカゼイン又はトータルミルクプロテインであることが好ましく、牛乳由来のカゼインであることがより好ましい。よりビフィズス菌増殖促進効果が高い乳タンパク質分解物を得ることができるためである。
なお、カゼイン、トータルミルクプロテイン、ホエータンパク質等の乳タンパク質は、常法により調製したものを用いることができる。また、市販されているものを用いてもよい。

本発明のビフィズス菌含有組成物中の乳タンパク質濃度は、所望のビフィズス菌含有組成物の種類や、添加するＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分の量、ビフィズス菌の種類、ビフィズス菌の接種量、ビフィズス菌の培養（発酵）時間等を考慮して適宜決定することができる。本発明においては、本発明のビフィズス菌含有組成物中の乳タンパク質濃度は、０．５重量％以上であることが好ましく、１重量％以上であることがより好ましい。菌体破砕物等との併用によるビフィズス菌増殖促進効果をより十分に得ることができるためである。

本発明で用いられるビフィズス菌は、特に限定されるものではないが、ビフィドバクテリウム・ロンガムであることが好ましい。ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスによる増殖促進効果が、より顕著に得られるためである。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株や、ビフィドバクテリウム・ロンガムタイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株であることが好ましい。

本発明において、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌やビフィズス菌の前培養に用いられる培地は、通常用いられる培地であれば、特に限定されるものではなく、Ｄｉｆｃｏ（登録商標）Ｍ１７Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）等の市販の半合成培地であってもよく、還元脱脂粉乳培地等の乳性培地であってもよい。取り扱いが簡便であるため、還元脱脂粉乳培地が特に好ましい。該還元脱脂粉乳培地の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。その他、前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加することができる。特にビフィズス菌は乳性培地での増殖性が低いため、生育促進物質を添加した培地を用いることが好ましい。例えば、０．１〜１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有した培地を用いることができる。また、前培養に用いられる培地は、殺菌処理をしたものを用いる。該殺菌処理は、通常用いられる方法で行うことができ、例えば、８０〜１２２℃で５〜４０分間、好ましくは８５〜９５℃で５〜３５分間の加熱処理により行うことができる。

以下、本発明のビフィズス菌含有組成物及びビフィズス菌増殖促進作用について、さらに詳細に説明する。
１．ラクトコッカス・ラクチスの菌株のＰｒｔＰ酵素保有性の検出
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６^Ｔ（ＡＴＣＣ１９２５７^Ｔ）株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７（ＮＣＤＯ４９７）株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株、及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株が、ＰｒｔＰ酵素を保有しているか否かを確認した。
具体的には、ラクトース及びグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）Ｍ１７Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、各菌株を３％接種し、３０℃で１６時間培養した。遠心分離により菌体を得、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄａｎｄＴｉｓｓｕｅｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりＰｒｔＰ遺伝子の保有性を確認した。ＰＣＲは参考文献（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｉｅｉｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６年、第１００巻、第１３０７〜１３１７ページ。）に記載の手法に準じて行った。プライマーは、フォワードプライマーＧＢｆ（ＧＣＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡ）及びリバースプライマーＧＢ２ｒ（ＴＧＡＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＣＴＴＣＴＴＣＣ）のプライマーセット、もしくはフォワードプライマーＧＨｆ（ＣＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＡＡ）及びリバースプライマーＧＨ２ｒ（ＴＡＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＣＴＴＣＧＴＣＡ）のプライマーセットを用いた。

図１はＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、染色により検出したバンドパターンを示した図である。図１中、「１」は分子量マーカーを流したレーンであり、「２」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６^Ｔ株のＰＣＲ産物、「３」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のＰＣＲ産物、「４」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株のＰＣＲ産物、「５」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株のＰＣＲ産物、「６」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株のＰＣＲ産物を、それぞれ流したレーンである。この結果、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６^Ｔ株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株にはＰｒｔＰ遺伝子の保有が確認された。一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株では、のそれぞれの菌株には保有していないことが判明した。

２．ＰｒｔＰ酵素含有菌体破砕物によるビフィズス菌増殖促進作用
まず、ラクトース及びグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）Ｍ１７Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にてＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株をそれぞれ３％接種し、３０℃で１６時間培養した。その後、遠心分離により集菌し、洗浄後、滅菌水を用いて元培養液の１０分の１容量に懸濁した。次に、超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮＳＯＮＦＩＥＲ４５０）を用いて１０分間以上の超音波破砕処理を行い、菌体を破砕した後、遠心分離（５０００×ｇ、１０分）により未破砕菌体を除き、菌体破砕物を得た。なお、菌体破砕物に生きている細胞が存在しないことは、顕微鏡観察及びコロニー培養で確認した。また、菌体破砕物の一部を９０℃で１０分煮沸処理し、加熱処理を行った。
次に、後記実施例１に記載の方法で、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャーを調製した。
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む乳性培地を、９０℃で１０分間殺菌し、前記のように調製したラクトコッカス・ラクチスの各菌株の菌体破砕物又は加熱処理した菌体破砕物を１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャー１％を接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷しビフィズス菌数を測定した。測定結果を表１に示す。なお、ビフィズス菌数の測定は、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）平板で行った。

測定結果を表１に示す。無添加の発酵乳（組成物）と比べて、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株の菌体破砕物を添加した発酵乳では、ビフィズス菌数が５×１０^８ＣＦＵ／ｇ以上に達し、無添加の発酵乳の２０倍近くまで増えた。一方、加熱処理してＰｒｔＰ酵素を失活させた菌体破砕物を添加した発酵乳では、無添加と比べて、ビフィズス菌数はあまり変化しなかった。
すなわち、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスの菌株は、生きている完全な菌体細胞を有しなくても、ＰｒｔＰ酵素活性を有する菌体破砕物を添加することにより、ビフィズス菌に対する増殖促進性が優れていることが明らかである。

３．ＰｒｔＰ酵素画分によるビフィズス菌増殖促進作用
まず、７０ｍＭのβ―グリセロリン酸２ナトリウムを含む１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む乳性培地を、９５℃で３０分間殺菌し、前記各菌株のシードカルチャーを３％接種し、３０℃で１６時間培養した。その後、１％のクエン酸３ナトリウムと水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．８に調整した後、遠心分離により菌体を得た。続いて、この洗浄菌体を、１０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａを含む３０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、３０℃で１０分間保持した。その後急冷し、４℃の遠心分離（８５００×ｇ、１０分）により遊離したＰｒｔＰ酵素を含む上清液を得た。このＰｒｔＰ酵素画分を、１０ｍＭ塩化カルシウムを含む３０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）で一晩透析した後、凍結濃縮により５０分の１容量まで濃縮し、これをＰｒｔＰ酵素画分とした。また、ＰｒｔＰ酵素画分の一部を９０℃で１０分煮沸処理し、加熱処理を行った。
次に、後記実施例１に記載の方法で、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャーを調製した。
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む乳性培地を９０℃で１０分間殺菌し、前記のように調製したラクトコッカス・ラクチスの各菌株のＰｒｔＰ酵素画分又は加熱処理したＰｒｔＰ酵素画分を１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャー１％とを接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、上記２と同様にしてビフィズス菌数を測定した。

測定結果を表２に示す。無添加の発酵乳（組成物）と比べて、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株のＰｒｔＰ酵素画分を添加した発酵乳では、ビフィズス菌数が３×１０８ＣＦＵ／ｇ前後に達し、無添加の組成物の２０倍以上まで増えた。一方、加熱処理してＰｒｔＰ酵素を失活させたＰｒｔＰ酵素画分を添加した発酵乳では、無添加の発酵乳と比べて、ビフィズス菌数はあまり変化しなかった。
すなわち、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスの菌株の菌体破砕物が有するビフィズス菌増殖促進活性は、ＰｒｔＰ酵素活性に依存していることが明らかである。

４．特許文献１、２記載の乳酸菌と本発明のラクトコッカス・ラクチスとの比較
まず、上記２及び３記載の方法で、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株の菌体破砕物及びＰｒｔＰ酵素画分をそれぞれ調製した。
次に、後記実施例１に記載の方法で、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャーを調製した。
さらに、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）入り１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、文献２記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャーを３０ｍＬ接種し、３０℃で１６時間培養して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャーを調製した。
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む乳性培地を９０℃で１０分間殺菌し、前記のように調製したラクトコッカス・ラクチスの各菌株の菌体破砕物又はＰｒｔＰ酵素画分を１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャー１％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、ビフィズス菌数を測定した。
一方、対照として、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャー１％を接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、ｐＨ及び含有されるビフィズス菌数を測定した。
また、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャー１％と、特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物「ＥＺＡＬＭＡ１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）２％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。なお、「ＥＺＡＬＭＡ１４」は、特許文献１に記載の「ＥＺＡＬＭＲ０１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）に相当する混合物である。
なお、得られた発酵乳のビフィズス菌数は、上記２と同様にして測定した。

測定結果を表３に示す。ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株の菌体破砕物又はＰｒｔＰ酵素画分を添加した発酵乳では、ビフィズス菌数が３×１０^８ＣＦＵ／ｇ前後に達した。これに対し、「ＥＺＡＬＭＡ１４」を用いた発酵乳を１０^６倍に希釈した希釈溶液からは、ビフィズス菌が全く検出されず、該発酵乳に含有されるビフィズス菌数は１×１０^６ＣＦＵ／ｇ以下であることが判明した。
すなわち、特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスを、ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、混合培養した場合には、ビフィズス菌の生育促進及び発酵時間の短縮という効果を十分に得ることができないことが明らかである。
また、特許文献２記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた発酵乳では、１６時間発酵を行ってもｐＨが５．０以上で凝固せず、発酵乳にならなかった。発酵終了後のビフィズス菌数は１×１０^８ＣＦＵ／ｇ以下であり、本発明のＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス菌株と比較して、ビフィズス菌の増殖促進作用は顕著に弱かった。
これらの結果から、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスであるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株は、ビフィズス菌に対して増殖促進作用に優れることが明らかになった。

本発明のビフィズス菌含有組成物は、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分と、乳タンパク質と、ビフィズス菌とを有する組成物であればよく、ビフィズス菌を生菌として維持し得る適当なバッファーや、ビフィズス菌の培養培地に、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分と、乳タンパク質とを添加した組成物であってもよい。また、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分と、乳タンパク質と、ビフィズス菌とを混合した後、ビフィズス菌を培養したものであってもよい。高いビフィズス菌数を確保するために、ビフィズス菌スターターを、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物やＰｒｔＰ酵素画分を添加して発酵した組成物であることが好ましい。

本発明においては、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分を添加した、乳タンパク質を含有する培地に、ビフィズス菌を接種した組成物や、該組成物を培養した組成物であることが好ましい。ここで、乳タンパク質を含有する培地としては、特に限定されるものではなく、所望のビフィズス菌含有組成物の種類等を考慮して適宜選択することができる。例えば、ビフィズス菌の培養に通常用いられる培地に乳タンパク質を添加した培地であってもよく、乳性培地であってもよい。本発明においては、乳性培地であることが好ましい。すなわち、本発明のビフィズス菌含有組成物としては、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分を添加した乳性培地に、ビフィズス菌を接種した組成物や、該組成物を培養し発酵させた発酵乳や乳酸菌飲料であることがより好ましい。

本発明において乳性培地としては、例えば、発酵乳を製造するために通常用いられる発酵用ベースを用いることができる。このような発酵用ベースは、例えば、牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、脱脂粉乳等に、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合し、常法に従って殺菌、均質化、冷却等することにより調製することができる。

発酵用ベースへのビフィズス菌の添加量は、特に限定されるものではないが、ビフィズス菌の添加量が、発酵用ベースに対して０．０１〜１０（Ｖ／Ｖ）％が好ましく、０．１〜５（Ｖ／Ｖ）％が特に好ましい。ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物やＰｒｔＰ酵素画分の添加量は、濃縮や凍結乾燥倍率に応じて適宜に調整すればよい。

本発明のビフィズス菌含有組成物が、乳性培地中でビフィズス菌を培養した発酵乳である場合には、この培養温度は、３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８℃が特に好ましい。ビフィズス菌が充分に生育可能な温度範囲であるためである。また、培養時間は、製造する発酵乳の種類によって適宜決定されるが、５〜１８時間が好ましい。

培養後得られた発酵乳は、そのまま食品としてもよく、例えば、均質化して液状発酵乳や乳酸菌飲料に加工してもよい。その他、例えば、果汁、果実等を適宜添加してもよい。また、容器への充填等は、特に限定されるものではなく、通常用いられる方法で行うことができる。

本発明のビフィズス菌含有組成物には、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物やＰｒｔＰ酵素画分のビフィズス菌に対する増殖促進効果を阻害しない範囲において、ビフィズス菌の他に、他の乳酸菌を含有してもよい。該他の乳酸菌は、通常発酵乳の製造に用いられるものであれば、特に限定されないが、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスが好ましい。ビフィズス菌の摂取量と、その他の乳酸菌を合わせた摂取量の、スターターとしての発酵用ベースへの接種比率は、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物やＰｒｔＰ酵素画分のビフィズス菌に対する効果を阻害しない限り、特に限定されるものではないが、１０００：１〜１０：１が好ましい。

本発明のビフィズス菌含有組成物は、そのままで、又は培養（発酵）させることにより、従来に無くビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガム多く含有する組成物であり、より整腸効果が高く、健康管理上も有用である。また、本発明のビフィズス菌含有組成物においてビフィズス菌の増殖促進活性を担っているのは、乳酸菌の菌体破砕物又は画分であるため、乳酸菌の生菌を使用する組成物とは異なり、品質が安定した組成物を効率よく製造することができる。

このため、本発明のビフィズス菌含有組成物は、発酵乳や乳酸菌飲料を含む食品、サプリメント、飼料、医薬品として広く利用することが可能である。例えば、ビフィズス菌と、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物やＰｒｔＰ酵素画分、乳タンパク質、乳糖などの原料を用いてビフィズス菌を培養し、遠心集菌した後、さらに凍結乾燥しビフィズス菌体を得る。この乾燥菌体をさらに澱粉や乳糖などの原料と均一に混合し、サプリメント、飼料、医薬品などの整腸剤を作ることが可能である。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］菌体破砕物を有するビフィズス菌含有組成物の調製１
まず、ラクトース及びグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）Ｍ１７Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）１００Ｌを、１２１℃で１５分間殺菌し、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株を３Ｌ接種し、３０℃で１６時間培養した。遠心分離により集菌し、洗浄後、１０Ｌの滅菌水に懸濁し、３０分間の超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮＳＯＮＦＩＥＲ４５０、１０分間破砕処理）後、遠心分離により未破砕菌体を除き、菌体破砕物を得た。その後、菌体破砕物を凍結濃縮し、１Ｌの菌体破砕物を得た。
一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で６時間培養した。また、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１５００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ハンゼン社製）とラクトバチルス・ブルガリクス（ハンゼン社製）の混合カルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃で５時間培養した。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳及び蔗糖等の原料を混合溶解し、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖８．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り調製したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株の菌体破砕物５００ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャー５００ｍＬを接種し、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー１５０ｍＬを接種し、１２０ｍＬ容の紙容器に充填し、密封し、３７℃で７時間培養した後、直ちに冷却した。得られた発酵乳は乳酸酸度０．７％、ｐＨ４．６であり、４．５×１０^８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。この該発酵乳を１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は２．５×１０^８ＣＦＵ／ｇであった。

［実施例２］菌体破砕物を有するビフィズス菌含有組成物の調製２
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株の代わりにラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株を用いた以外は、実施例１と同様にして菌体破砕物を調製し、ビフィズス菌含有発酵乳を得た。得られた発酵乳は乳酸酸度０．７％、ｐＨ４．６であり、４．８×１０^８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。この該発酵乳を１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は２．８×１０^８ＣＦＵ／ｇであった。

［実施例３］ＰｒｔＰ酵素画分を有するビフィズス菌含有組成物の調製１
まず、７０ｍＭのβ―グリセロリン酸２ナトリウムを含む１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む乳性培地１００Ｌを、９５℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のシードカルチャーを３Ｌ接種し、３０℃で１６時間培養した。１％のクエン酸３ナトリウムと水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．８に調整した後、遠心分離により菌体を得た。得られた菌体を、５Ｌの１０ｍＭ塩化カルシウムを含む３０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）で２回洗浄後、５Ｌの１０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａを含む３０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、３０℃で１０分間保持した。その後急冷し、遠心分離（８５００×ｇ、１０分間、４℃）によりＰｒｔＰ酵素を含む上清液を得た。この上清液を、１０ｍＭ塩化カルシウムを含む３０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）で一晩透析し、凍結濃縮により２Ｌ容量まで濃縮し、ＰｒｔＰ酵素画分を得た。
一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で６時間培養した。また、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１５００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ハンゼン社製）とラクトバチルス・ブルガリクス（ハンゼン社製）の混合カルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃で５時間培養した。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳及び蔗糖等の原料を混合溶解し、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖８．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り調製したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のＰｒｔＰ酵素画分５００ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャー５００ｍＬを接種し、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー１５０ｍＬを接種し、３７℃で７時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度０．７％、ｐＨ４．６、６．０×１０^８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。この該ドリンクヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は３．６×１０^８ＣＦＵ／ｇであり、生残率は６０％であった。

［実施例４］ＰｒｔＰ酵素画分を有するビフィズス菌含有組成物の調製２
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株の代わりにラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株を用いた以外は、実施例３と同様にしてＰｒｔＰ酵素画分を調製し、ビフィズス菌含有発酵乳を得た。得られた発酵乳は乳酸酸度０．７％、ｐＨ４．６であり、５．８×１０^８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。この該発酵乳を１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は２．９×１０^８ＣＦＵ／ｇであった。

［実施例５］菌体破砕物を有するビフィズス菌含有整腸剤の調製１
まず、ラクトース及びグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）Ｍ１７Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）９７Ｌを、１２１℃で１５分間殺菌し、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株を３Ｌ接種し、３０℃で１６時間培養した。遠心分離により集菌し、洗浄後、１０Ｌの滅菌水に懸濁し、３０分間の超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮＳＯＮＦＩＥＲ４５０、１０分間破砕処理）後、遠心分離により未破砕菌体を除き、菌体破砕物を得た。その後、菌体破砕物を脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）からなる溶液（９０℃３０分間殺菌済）２０Ｌに懸濁し、常法に従って凍結乾燥し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株の菌体破砕物１．５ｋｇを得た。
一方、９０℃で３０分間殺菌したカゼイン１０００ｇ、肉エキス５００ｇ、酵母エキス５００ｇ、ペプトン５００ｇ、乳糖２０００ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ５００ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １００ｇ、シスチン４０ｇ及び水９５Ｌの組成からなる培地に、実施例１の通り記載のビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株のカルチャー５Ｌを接種し、３７℃で１６時間培養した。次いで、シャープレス型遠心分離機を用いて、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）により菌体を集め、培地と同量の生理食塩水（９０℃３０分間殺菌済）に再懸濁し、前記と同様遠心分離して再度集菌した。集めた菌体を、脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖１％（Ｗ／Ｗ）、グルタミン酸ソーダ１％（Ｗ／Ｗ）からなる溶液（９０℃３０分間殺菌済）２０Ｌに懸濁し、常法に従って凍結乾燥し、１．０×１０¹¹ＣＦＵ／ｇのビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株の菌体破砕物を含む粉末約１．２ｋｇを得た。
さらに、乾燥殺菌した澱粉１００ｋｇ、脱脂粉乳４０ｋｇ及び砂糖５８ｋｇに、上記で得られたラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株の菌体破砕物粉末１ｋｇ及びビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株を含む粉末１ｋｇを加えて均一に混合し、乳タンパク、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６の菌体破砕物及びビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株の菌末を含有する整腸剤の組成物約２００ｋｇを得た。

［実施例６］菌体破砕物を有するビフィズス菌含有整腸剤の調製２
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株の代わりにラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株を用いた以外は、実施例５と同様にして菌体破砕物を調製し、整腸剤の組成物を得た。

［実施例７］ＰｒｔＰ酵素画分を有するビフィズス菌含有整腸剤の調製１
まず、７０ｍＭのβ―グリセロリン酸２ナトリウムを含む１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む乳性培地９７Ｌを、９５℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のシードカルチャーを３Ｌ接種し、３０℃で１６時間培養した。１％のクエン酸３ナトリウムと水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．８に調整した後、遠心分離により菌体を得た。得られた菌体を、５Ｌの１０ｍＭ塩化カルシウムを含む３０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）で２回洗浄後、５Ｌの１０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａを含む３０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、３０℃で１０分間保持した。その後急冷し、遠心分離（８５００×ｇ、１０分間、４℃）によりＰｒｔＰを含む上清液を得た。この上清液を、１０ｍＭ塩化カルシウムを含む３０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）で一晩透析し、凍結濃縮により２Ｌ容量まで濃縮した。さらに、脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）からなる溶液（９０℃３０分間殺菌済）２０Ｌに懸濁し、常法に従って凍結乾燥し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のＰｒｔＰ酵素画分の粉末１．１ｋｇを得た。
さらに、乾燥殺菌した澱粉１００ｋｇ、脱脂粉乳４０ｋｇ及び砂糖５８ｋｇに、上記で得られたラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のＰｒｔＰ酵素画分粉末１ｋｇ及び実施例５記載の方法で調製したビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株を含む粉末１ｋｇを加えて均一に混合し、乳タンパク、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のＰｒｔＰ酵素画分及びビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株の菌末を含有する整腸剤の組成物約２００ｋｇを得た。

［実施例８］ＰｒｔＰ酵素画分を有するビフィズス菌含有整腸剤の調製２
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株の代わりにラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株を用いた以外は、実施例７と同様にしてＰｒｔＰ酵素画分を調製し、乳タンパク、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０株のＰｒｔＰ酵素画分及びビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株の菌末を含有する整腸剤の組成物約２００ｋｇを得た。

本発明のビフィズス菌含有組成物及びその製造方法により、生きているビフィズス菌を従来に無く多く含有する発酵乳を製造することができるため、発酵乳等の製造分野で利用が可能である。

ラクトコッカス・ラクチスの各菌株由来のＤＮＡを鋳型として、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を検出するプライマーを用いてＰＣＲを行った結果得られたＰＣＲ産物を、電気泳動法により分離し、染色により検出したバンドパターンを示した図である。

Claims

細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分と、乳タンパク質と、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌とを有することを特徴とするビフィドバクテリウム属菌含有組成物。
前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）であることを特徴とする、請求項１記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物。
前記ラクトコッカス・ラクチスが、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする、請求項２記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物。
前記乳タンパク質がカゼインであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物。
前記ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物。
前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガムタイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株であることを特徴とする請求項５記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物。
食品、サプリメント、医薬品、及び飼料からなる群より選択される１であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物。
発酵乳又は乳酸菌飲料である請求項７記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物。
細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分を添加した、乳タンパク質を含有する培地に、ビフィドバクテリウム属菌を接種することを特徴とするビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法。
細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分を添加した、乳タンパク質を含有する培地に、ビフィドバクテリウム属菌を接種した後、発酵させることを特徴とするビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法。
前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）であることを特徴とする、請求項９又は１０記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法。
前記ラクトコッカス・ラクチスが、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする、請求項１１記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法。
前記乳タンパク質がカゼインであることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法。
前記ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）であることを特徴とする請求項９〜１３のいずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法。
前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ-９９９株及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガムタイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株であることを特徴とする請求項１４記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法。
前記ビフィドバクテリウム属菌含有組成物が、食品、サプリメント、医薬品、及び飼料からなる群より選択される１であることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法。
前記ビフィドバクテリウム属菌含有組成物が、発酵乳又は乳酸菌飲料であることを特徴とする請求項１０〜１５のいずれか記載のビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法。