[go: up one dir, main page]

JP4786451B2 - Ｎａｄ／ｎａｄｈの安定化 - Google Patents

Ｎａｄ／ｎａｄｈの安定化 Download PDF

Info

Publication number
JP4786451B2
JP4786451B2 JP2006205087A JP2006205087A JP4786451B2 JP 4786451 B2 JP4786451 B2 JP 4786451B2 JP 2006205087 A JP2006205087 A JP 2006205087A JP 2006205087 A JP2006205087 A JP 2006205087A JP 4786451 B2 JP4786451 B2 JP 4786451B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
enzyme
coenzyme
independently
case
present
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2006205087A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2007054052A5 (ja
JP2007054052A (ja
Inventor
ハインドル ディーター
ヘーネス ヨアヒム
ホルン カリナ
ヘルデヴェイン ピート
Original Assignee
エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト filed Critical エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト
Publication of JP2007054052A publication Critical patent/JP2007054052A/ja
Publication of JP2007054052A5 publication Critical patent/JP2007054052A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4786451B2 publication Critical patent/JP4786451B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/167—Purine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90209—Oxidoreductases (1.) acting on NADH or NADPH (1.6), e.g. those with a heme protein as acceptor (1.6.2) (general), Cytochrome-b5 reductase (1.6.2.2) or NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、安定なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ／ＮＡＤＨ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド リン酸塩（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ）誘導体、それら誘導体の酵素複合体および生化学的検出方法におけるその使用および試薬キットに関する。
生化学的分析用測定システムは、臨床関連分析法の重要な構成要素である。これは、主として、検体たとえば、直接的または間接的に酵素を用いて測定される代謝産物または基質の測定に関する。検体は、酵素−補酵素複合体を用いて変換されかつ続いて測定される。このプロセスにおいて、測定される検体は、適当な酵素および補酵素と接触され、そこでは、酵素は、通常触媒量で使用される。補酵素は、酵素反応により酸化されるまたは還元されるなどの変化を受ける。このプロセスは、直接的にまたは媒介物によってのいずれかにより、電気化学的に、または測光的に検出できる。補正により、測定値と測定される検体の濃度とのあいだの直接相関関係が得られる。
補酵素は、酵素に共有結合で、または非共有結合で結合される有機分子であり、検体の変換により変化する。補酵素の著名な例は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩（ＮＡＤＰ）であり、それからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨがそれぞれ還元により生成される。
先行技術より公知の測定システムは、制限された保管寿命により、またこの貯蔵安定性を達成するための冷却または乾燥貯蔵などの環境のための特別な必要条件により特徴づけられる。このため、不正確な、不注意の、不完全な貯蔵に起因する誤った結果が、特定の利用形態たとえば、血液グルコース自動モニタリング等、最終ユーザーにより行われるテストの場合などに生じ得る。特に、過剰な期間一次包装品を開けることにより、乾燥剤が消耗し、あるシステムの場合には、消費者によりほとんど認識されない程度の測定誤差を生じることになる。
生化学的測定システムの安定性を増加させるために使用され得る公知の手段は、安定な酵素の使用、たとえば好熱性生物由来の酵素の使用である。化学修飾、たとえば架橋または突然変異誘発などにより酵素を安定化することも可能である。さらに、トレハロース、ポリビニルピロリドンおよび血清アルブミンなどの酵素安定化剤も添加でき、または酵素を光重合などにより高分子ネットワークに包接することもできる。
安定な媒介物を用いることにより、生化学的測定システムの保管寿命を改良することが、従来からも行われてきた。これにより、テストの特異性が増大し、かつ最小の酸化還元電位を有する媒介物を用いることにより、反応のあいだの干渉が除去される。しかし、酵素／補酵素複合体の酸化還元電位は、酸化還元電位に対する下限値を構成している。これらの酸化還元電位がこの下限値以下になると、媒介物との反応が、減速されまたは邪魔されることもある。
あるいは、媒介物を用いずに、たとえば補酵素ＮＡＤＨなどの補酵素が、直接的に検出される生化学的測定システムを使用することもできる。しかし、そのような測定システムの不利な点は、ＮＡＤおよびＮＡＤＰなどの補酵素が、不安定であるということである。
ＮＡＤおよびＮＡＤＰは、塩基に不安定な分子であり、その分解経路は、文献に記載されている（Ｎ．Ｊ．オッペンハイマー、ピリジンヌクレオチド補酵素、アカデミー出版、ニューヨーク、ロンドン１９８２年、Ｊ．エヴァース、Ｂ．アンダーソン、Ｋ．ヨウ、編集者、第三章５６〜６５頁）。本質的には、ＡＤＰ−リボースは、リボースとピリジン単位間のグリコシル結合の開裂によるＮＡＤおよびＮＡＤＰの分解のあいだに形成される。しかし、還元型のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、酸に不安定であり；たとえば、エピマー化が、公知の分解経路である。両ケースにおいて、ＮＡＤ／ＮＡＤＰおよびＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの不安定性は、リボースとピリジン単位間のグリコシル結合の不安定さに起因している。しかし、水溶液中などのより強烈ではない条件下においても、補酵素ＮＡＤまたはＮＡＤＰは、周囲湿度により、既に単独で加水分解される。この不安定性のために、検体を測定する際に、不正確さが生じ得る。
多数のＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体が、たとえばＢ．Ｍ．アンダーソン、ピリジンヌクレオチド補酵素、アカデミー出版、ニューヨーク、ロンドン１９８２年、Ｊ．エヴァース、Ｂ．アンダーソン、Ｋ．ヨウ、編集者ら、第四章中に記載されている。しかし、これら誘導体の大抵のものは、酵素によりうまく受容されない。したがって、以前診断テストに使用された唯一の誘導体は、３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）であり、それは１９５６年に初めて述べられている（Ｎ．Ｏ．カプラン、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５６年）２２１巻、８２３頁）。この補酵素も酵素によりうまく受容されず、酸化還元電位において変化を示す。
修飾されたピリジン基を有する他のＮＡＤ誘導体の使用は、国際公開第０１／９４３７０号パンフレット中に記載されている。しかし、ニコチンアミド基の修飾は、通常触媒反応に直接的な影響を与える。大抵の場合には、この効果はネガテイブである。
他の安定化コンセプトにおいては、リボース単位がグリコシル結合の安定性に影響を与えるよう修飾された。このプロセスは、ニコチンアミド基の触媒反応に、直接には干渉しない。しかし、酵素が、リボース単位に強固にまた特異的に結合するやいなや、間接的効果となり得る。この関連において、カウフマンらは、国際公開第９８／３３９３６号パンフレット、米国特許５,８０１,００６号明細書および国際公開第０１／４９２４７号中に多数のチオリボース−ＮＡＤ誘導体を開示している。しかし、ニコチンアミドリボース単位の修飾と酵素反応における誘導体の活性とのあいだの相関関係は、以前から示されてこなかった。
グリコシル結合のない誘導体であるカルバＮＡＤは、１９８８年に初めて示された（Ｊ．Ｔ．スラマ、バイオケミストリー １９８９年、２７巻、１８３頁およびバイオケミストリー １９８９年、２８巻、７６８８頁）。この誘導体においては、リボースは、炭素環式糖単位により置換されている。カルバＮＡＤはデヒドロゲナーゼに対する基質として記載されたが、その活性は、臨床的生化学的検出法においては未だ証明されてない。
後に、Ｇ．Ｍ．ブラックバーン、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９９６年、２７６５頁により天然ピロリン酸塩の代わりに、メチレンビスホスホン酸塩を用いてカルバＮＡＤを合成するための同様のアプローチが記載された。メチレンビスホスホン酸塩は、ホスホターゼに対してより安定であり、ＡＤＰリボシルシクラーゼに対する阻害剤として使用された。この目的は、それの加水分解に対する抵抗性を強めるためではなかった（Ｊ．Ｔ．スラマ、Ｇ．Ｍ．ブラックバーン）。
本発明の目的は、ＮＡＤ／ＮＡＤＰの加水分解に対する感受性を無効にし、かつ同時に酵素反応における補酵素として活性な、特にグルコース測定用の安定した生物分析測定システムを提供することである。
本目的は、（ｉ）補酵素依存性酵素またはそのような酵素に対する基質および（ｉｉ）補酵素として次の一般式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは任意の還元型を含むことを特徴とする検体測定用テストエレメントにより達成される。
Figure 0004786451
 式中、
Ａは、アデニンまたはその類似体であり、
Ｔは、それぞれの場合において、独立してＯ、Ｓを示し、
Ｕは、それぞれの場合において、独立してＯＨ、ＳＨ、ＢＨ3 -、ＢＣＮＨ2 -を示し、
Ｖは、ＯＨまたはリン酸塩基であり、
Ｗは、ＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）2、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）2であり、式中Ｒは、それぞれの場合において、独立してＨまたはＣ1−Ｃ2アルキルを示し、
Ｘ1、Ｘ2は、それぞれの場合において、独立してＯ、ＣＨ2、ＣＨＣＨ3、Ｃ（ＣＨ3）2、ＮＨ、ＮＣＨ3を示し、
Ｙは、ＮＨ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2であり、
Ｚは、（ｉ）４〜６個の炭素原子、好ましくは４個の炭素原子を含む直鎖基であり、そこでは、１個または２個の炭素原子が、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１個以上のヘテロ原子により置換されていてもよく、または（ｉｉ）任意には、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１個以上のヘテロ原子ならびに任意には１つ以上の置換基を含む６個の炭素原子を含む環状化合物、および該環状化合物およびＸ2に結合されたＣＲ４2残基（式中Ｒ４は、それぞれの場合において、独立してＨ、Ｆ、ＣＨ3を示す）を含む基であり、
ただし、Ｚおよびピリジン残基はグリコシド結合により連結されていない。
好ましい実施態様においては、ＷがＣＯＮＨ2またはＣＯＣＨ3である。
Ｚ上の好ましい置換基は、ＯＨ、Ｆ、ＣｌおよびＣ1−Ｃ2アルキルから選択され、Ｃ1−Ｃ2アルキルは任意にはフッ素化されている、または塩素化されている、または／およびＯＨ置換、Ｏ−Ｃ1−Ｃ2アルキルである。
好ましい実施態様においては、Ｚは−ＣＲ４2−Ｃｙｃ−で表され、式中、−Ｃｙｃ−は、任意には、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１個以上のヘテロ原子ならびに任意には１つ以上の置換基を含む６個の炭素原子を含む環状化合物を含む基であり、ＣＲ４2は前記に定義される。
好ましい実施態様においては、テストエレメントはグルコースを測定するために使用され、グルコースデヒドロゲナーゼおよび前記一般式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む。
驚くべきことに、本発明による化合物は加水分解に対して安定であり、酵素的検出方法において良好な基質であり、また生化学的診断薬としても使用できる。この知見は、従来の既知のＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体のほとんどと、それら誘導体は通常酵素的検出方法において非常に短い期間のみ安定的であるので、対照的である。
先行技術と比較した場合の本発明による化合物の利点は、
― 高い安定性、
― 高い酵素活性、
― 簡単でかつ経済的な合成、
― それらは、既知のすべての生化学的検出方法に使用できる
ということである。
既知の生化学的検出方法の欠点は、本発明を、好ましくはたとえば高分子ネットワーク中に酵素を包接することなどの安定化処方と組み合わせて用い、安定なＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体を提供することにより、ほとんど回避することができる。さらに、安定化剤を使用する必要はない。関係する反応性物質の数が少ないほど、検体測定のための安定な処方を得る機会が大きくなるため、このことは特に有利である。
本発明は、テストエレメント上で補酵素として使用するための充分な酵素活性を有する多数の安定なＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体を含むテストエレメントを提供する。
安定なＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体は、一般的に既知の合成プロセスにより製造することができる。このためには、環状アミノアルコールのアミノ基を、ジンケ化学によりピリジニウム誘導体に変換する。続いて、一級ＯＨ基をリン酸化し、活性化ＡＭＰ誘導体と結合させ、ＮＡＤ誘導体を形成する。あるいは、一級ＯＨ基をまずまたリン酸化し、その後アミノ基を、ジンケ反応によりピリジンに変換することができる。
他の合成ルートは、一級アルコールを活性化して、トシル酸塩またはヨウ化物を形成させ、続いてＡＤＰをアルキル化することである。
本発明によるテストエレメントの好ましい実施態様は、たとえば、補酵素として、次の一般式（Ｉ’）を有する化合物またはその塩もしくは任意の還元型を含む。
Figure 0004786451
 式中、
Ａは、アデニンまたはその類似体であり、
Ｔは、それぞれの場合において、独立してＯ、Ｓを示し、
Ｕは、それぞれの場合において、独立してＯＨ、ＳＨ、ＢＨ3 -、ＢＣＮＨ2 -を示し、
Ｖは、ＯＨまたはリン酸塩基であり、
Ｗは、ＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）2、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）2であり、式中Ｒは、それぞれの場合において、独立してＨまたはＣ1−Ｃ2アルキルを示し、
Ｘ１、Ｘ２は、それぞれの場合において、独立してＯ、ＣＨ2、ＣＨＣＨ3、Ｃ（ＣＨ3）2、ＮＨ、ＮＣＨ3を示し、
Ｙは、ＮＨ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2であり、
Ｚは、飽和または不飽和炭素環式または複素環式６員環、特に一般式（ＩＩ）の化合物であり、
Figure 0004786451
 式中、単結合または二重結合が、それぞれの場合において、独立してＲ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだに存在し得、
もし単結合が、Ｒ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだにそれぞれ存在する場合には、
Ｒ１、Ｒ１’は、それぞれの場合において、独立してＯ、Ｓ、ＮＣＨ3、ＮＨ、ＣＲ４2、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ3を示し、式中、Ｒ１またはＲ１’は同時にヘテロ原子になることはできず、
Ｒ２、Ｒ２’は、それぞれの場合において、独立してＣＲ４2、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ3を示し、
もし二重結合が、Ｒ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだにそれぞれ存在する場合には、
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’は、それぞれの場合において、独立してＣＲ４を示し、
Ｒ４は、それぞれの場合において、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ3を示し、
Ｒ６、Ｒ６’は、それぞれの場合において、独立して、ＣＨ、ＣＣＨ3を示す。
次の式（Ｉ’’）の化合物またはその塩もしくは任意の還元型が、本発明の他の内容である：
Figure 0004786451
 式中、
Ａは、アデニンまたはその類似体であり、
Ｔは、それぞれの場合において、独立してＯ、Ｓを示し、
Ｕは、それぞれの場合において、独立してＯＨ、ＳＨ、ＢＨ3 -、ＢＣＮＨ2 -を示し、
Ｖは、ＯＨまたはリン酸塩基であり、
Ｗは、ＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）2、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）2であり、式中、Ｒは、それぞれの場合において、独立してＨまたはＣ1−Ｃ2アルキルを示し、
Ｘ1、Ｘ2は、それぞれの場合において、独立してＯ、ＣＨ2、ＮＨ、ＮＣＨ3を示し、
Ｙは、ＮＨ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2であり、
（ｉ）Ｚは、一般式
−（ＣＲ４2）n−
の直鎖基であり、式中、ｎは、４〜６、好ましくは４であり、かつ
Ｒ４は、それぞれの場合において、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨを示し、ただし少なくとも１つの残基Ｕは、ＢＨ3 -またはＢＣＮＨ2 -であり、または、
（ｉｉ）Ｚは、飽和または不飽和炭素環式または複素環式６員環、特に一般式（ＩＩ）の化合物であり、
Figure 0004786451
 式中、単結合または二重結合が、それぞれの場合において、独立して、Ｒ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだに存在しても良く、
もし単結合が、Ｒ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだにそれぞれ存在する場合には、
Ｒ１、Ｒ１’は、それぞれの場合において、独立してＯ、Ｓ、ＮＣＨ3、ＮＨ、ＣＲ４2、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ3を示し、そこではＲ１またはＲ１’は同時にヘテロ原子になることはできず、
Ｒ２、Ｒ２’は、それぞれの場合において、独立してＣＲ４2、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ3を示し、
もし二重結合が、Ｒ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだにそれぞれ存在する場合には、
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’は、それぞれの場合において、独立してＣＲ４を示し、
Ｒ４は、それぞれの場合において、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ3を示し、
Ｒ６、Ｒ６’は、それぞれの場合において、独立してＣＨ、ＣＣＨ3を示し、
ただし、Ｚおよびピリジン残基はグリコシド結合により連結されていない。
好ましい実施態様においては、本発明による化合物は、Ｃ8置換およびＮ6置換アデニン、７−デアザなどのデアザ変異体、８−アザなどのアザ変異体、または、７−デアザまたは８−アザなどの組み合わせ、フォルマイシンなどの炭素環式類似体（そこでは、７−デアザ変異体が、７位において、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルケニルまたはＣ1−Ｃ6アルキルで置換され得る）などのアデニン類似体を包含している。
さらに好ましい実施態様においては、この化合物は、たとえば２−メトキシデオキシリボース、２’−フルオロデオキシリボース、ヘキシトール、アルトリトールなどのアデノシン類似体、またはリボースの代わりの二環式、ＬＮＡおよび三環式糖類などの多環式類似体を包含する。
特に、（ジ）ホスフェートの酸素を、たとえばＯ-をＳ-またはＢＨ3 -などにより、または、ＯをＮＨ、ＮＣＨ3またはＣＨ2により、そして＝Ｏを＝Ｓなどで等電子的に置換したりすることもできる。
他の好ましい実施態様は、一般式（ＩＩＩ）を有する化合物またはその塩もしくは任意の還元型およびそれを含むテストエレメントである。
Figure 0004786451
 式中、
Ｕは、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ3 -、ＢＣＮＨ2 -であり、
Ｖは、ＯＨまたはリン酸塩基であり、
Ｗは、ＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）2、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）2であり、式中Ｒは、それぞれの場合において、独立して、ＨまたはＣ1−Ｃ2アルキルを示し、
Ｘは、Ｏ、ＣＨ2、ＮＨであり、
Ｒ１は、ＣＲ４2、Ｏ、Ｓ、ＮＣＨ3、ＮＨ、ＣＨ、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＨ3であり、
Ｒ４’は、Ｈ、ＯＨである。
検体、たとえば、血液、血清、血漿または尿などの体液中のパラメータまたは、排水または食物のサンプル中のパラメータに対する生化学的テストは、診断には大いに重要である。これらのテストにおいて、測定される検体は、適当な酵素および補酵素と接触される。
したがって、本発明のもう１つの対象は、適当な酵素と組み合わせて本発明の化合物で構成される酵素−補酵素複合体である。
酸化還元反応により検出することができる任意の生化学的または化学的物質は、検体、たとえば補酵素依存性酵素の基質または補酵素依存性酵素自身である物質として、測定され得る。好ましい検体の例は、グルコース、乳酸、マレイン酸、グリセロール、アルコール、コレステロール、トリグリセリド、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、ペプチド、尿素、アンモニア、サリチル酸塩、ピルビン酸塩、５’−ヌクレオチダーゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）および炭酸ガスなどである。
酵素の基質を検出するために、テストエレメントは、補酵素に加えて基質を検出するのに適当な酵素を含むことが好ましい。適当な酵素とは、たとえば、グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸塩デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、１．１．１．２８）、マレイン酸塩デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）、α−ヒドロキシ酪酸塩デヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、またはＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）から選択されるアミノ酸デヒドロゲナーゼから選択されるデヒドロゲナーゼである。さらに、適当な酵素とは、グルコースオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．４）、コレステロールオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．６）などのオキシダーゼ、またはアスパルギン酸塩またはアラニンアミノトランスフェラーゼなどのアミノトランスフェラーゼ、５’−ヌクレオチダーゼまたはクレアチンキナーゼなどである。
酵素を検出するために、テストエレメントは、補酵素に加えて酵素を検出するのに適当な酵素の基質を含むことが好ましい。
本発明のもう１つの対象は、サンプル中の検体を酵素反応により検出するための、本発明による化合物、または本発明による酵素−補酵素複合体の使用である。これに関連して、グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの検出が特に好ましい。
検体との反応（検体が酵素基質である場合）による、または検体触媒反応（検体が酵素の場合）による補酵素、すなわち本発明の化合物における変化は、原則的には、任意の所望の方法で検出できる。基本的には、先行技術で公知の酵素反応検出方法の全てが使用できる。しかし、光学的方法により、補酵素中の変化を検出することが好ましい。たとえば、光学的検出方法は、吸光度、蛍光発光、円二色性（ＣＤ）、旋光分散（ＯＲＤ）、屈折計法などの測定を包含する。補酵素における変化は、蛍光発光を測定することにより検出することが特に好ましい。蛍光発光測定は高感度であって、小型化システム中の低濃度の検体の検出でさえも可能である。
たとえば、試薬が溶液または分散体の形状で水溶液または非水溶液中に存在している検体、または粉体、凍結乾燥体で存在している検体を検出するためには、液体テストが使用できる。しかし、試薬が担体に適用される場合にはドライテストも可能である。たとえば、担体は、吸収剤または／および検査するサンプル液で濡らすことにより膨潤する材料を含むテストストリップであっても良い。
しかし、酵素−補酵素複合体が組み入れられるゲルマトリックスは、検出試薬としても使用できる（ＤＥ１０２２１８４５Ａ１参照）。
この場合、酵素は、本発明による化合物とともにマトリックスに重合するか、または重合後、マトリックスを、対応する酵素−補酵素複合体を形成させるために、酵素存在下に、補酵素溶液と接触させることもできる。
本発明の他の対象は、検体を検出するための試薬キットとその使用に関する。試薬キットは、本発明による化合物、適当な酵素および適当な反応緩衝液を含むことができる。適当な酵素については既に記述されている。本発明による試薬キットは、多種多様な方法で使用することができ、グルコース、乳酸、マレイン酸、グリセロール、アルコール、コレステロール、トリグリセリド、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、ペプチド、尿素、アンモニア、サリチル酸塩、ピルビン酸塩、５’−ヌクレオチダーゼ、ＣＫ、ＬＤＨ、炭酸ガスなどの検体を測定するために使用できる。血液中のグルコースを検出するために、本発明による化合物およびグルコースデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）を含む試薬キットが好ましい。
本発明による試薬キットは、ドライテストまたは液体テストにおいて検体を検出するために使用できる。
本発明の他の対象は、フッ素測定法または測光法による検体の検出用のテストストリップに関する。そのようなテストストリップは、補酵素として前述した化合物、および任意には吸収剤または／および膨潤性材料上に固定化した適当な酵素または酵素基質を含む。適当な材料は、たとえばセルロース、プラスチックスなどから選択できる。
本発明の他の対象は、
（ａ）テストエレメントまたは補酵素を含む本発明による試薬キットとサンプルを接触させる工程、および
（ｂ）たとえば、補酵素における変化に基づいて、検体を検出する工程
を含む検体の検出方法を含む。
本発明の他の利点は、補酵素の蛍光発光が深色シフトを示し、その結果、テストエレメントの他の材料または／およびサンプルの蛍光発光との干渉がより少なくなる。
本発明の対象の全ての好ましい実施態様は、たとえば、本発明による化合物の好ましい実施態様などの本発明の他の対象にも適用できることを意図している。
本発明を、以下の図および実施例により詳細に説明する。
安定なＮＡＤ／ＮＡＤＨ誘導体の製造を、例として合成スキーム１、２および３（図１、２および３）に基づいて示す。
全ての溶媒は、使用前に蒸留して、標準法により精製した。1ＨＮＭＲ用の内部標準としてＴＭＳ、および13ＣＮＭＲ用の内部標準としてＤＭＳＯｄ6（３９．６ｐｐｍ）を用いて、２００ＭＨｚまたは５００ＭＨｚバリアン装置で1ＨＮＭＲを測定した。31ＰＮＭＲスペクトルは、外部標準として８５％Ｈ3ＰＯ4を用いて測定した。質量スペクトル：ＥＳＩインターフェースを用いたマイクロスケールＱ−Ｔｏｆ２。ＴＬＣ：コートされたアルミニウムストリップ（フルカ シリカゲル／ＴＬＣカード、２５４ｎｍ）。検出：ＵＶおよびアニスアルデヒド硫酸噴霧；カラムクロマトグラフィー：シリカゲル（０．０６０〜０．２００ｎｍ）。
１，５−アンヒドロ−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−デオキシ−２−Ｏ−メタンスルフォニル−Ｄ−リボヘキシトール（２）
４０ｍｌ無水ピリジン中のスパチュラ一杯の４−ジメチルアミノピリジン、メタンスルフォニルクロライド（３ｍｌ、３８ｍｍｏｌ）を、氷上で冷却、攪拌しながら、１，５−アンヒドロ−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−デオキシ−ｄ−グルシトール（Ｍ．Ｗ．アンダーセンら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９６、Ｖｏｌ．３７、８１４７〜８１５０）（１、５．０００ｇ、２１．１６ｍｍｏｌ）溶液に添加する。この混合物を室温で１４時間攪拌する。ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させた後、トルエン中に攪拌して、再度蒸発させる。残渣を温クロロホルムで３回抽出する。合わせた抽出物を、短いシリカゲルカラム上で濾過する。真空下、溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。残渣をエーテルで洗浄し、メタノールから沈殿させる。
収率：（５．１０３ｇ、７７％）。Ｒf０．８（ヘキサン／酢酸エチル １／２）、０．５（ヘキサン／酢酸エチル ２／１）。
Figure 0004786451
１，５−アンヒドロ−２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘキシトール（３）
ナトリウムアジド（２．１ｇ、３２ｍｍｏｌ）を、１２０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２（５．０００ｇ、１５．９１ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。この混合物を、窒素雰囲気下８０℃で３１時間加熱攪拌する。室温まで冷却後、ロータリーエバポレーターで、真空下蒸留により溶媒を除去する。残渣を温クロロホルムで３回抽出する。合わせた抽出物を、短いシリカゲルカラム上で濾過する。真空下、溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。残渣をエーテルで洗浄し、ヘキサンから沈殿させる。
収率：３（４．０７３ｇ、９８％）無色粉末。Ｒf０．９（ヘキサン／酢酸エチル ２／１）。
Figure 0004786451
１，５−アンヒドロ−２−アジド−２，３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘキシトール（４）
３（４．０００ｇ、１５．３１ｍｍｏｌ）の１８０ｍｌ８０％氷酢酸溶液を、９５℃で１時間攪拌する。ロータリーエバポレーターでの蒸発後、それを水に攪拌し、再度蒸発する。その後、それをトルエンで攪拌して再び蒸発させる。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜１０％酢酸エチル）で精製する。溶媒を真空下ロータリーエバポレーターでの蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。残渣を、Ｐ2Ｏ5上真空で乾燥する。
収率：４（２．１７４ｇ、８２％）油。Ｒf０．２５（ヘキサン／酢酸エチル １／２）。
Figure 0004786451
１，５−アンヒドロ−２−アジド−２，３−ジデオキシ−６−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−アラビノ−ヘキシトール アンモニウム塩（５）
アジド４（１．００４ｇ、５．８０ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下６ｍｌのトリメチルホスフェート（ＢａＯ上で真空蒸留したてのもの）中に、攪拌により溶解する。ホスホリルクロライド（蒸留したてのもの）およびトリメチルホスフェートの１／１（ｖ／ｖ）混合物１．７ｍｌを、全部一度に０℃で添加する。０℃で３時間攪拌後、氷水６ｍｌと冷トリエチルアミン９ｍｌを添加する。混合物を、真空下ロータリーエバポレーターで蒸発乾固する。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、カラムクロマトグラフィー（イソプロピルアルコール中０〜３５％水酸化アンモニウム（２０％水溶液））により精製する。溶媒をロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。
収率：５（０．６７７ｇ、４３％）浅黄色油。Ｒf０．３５（イソプロパノール／２５％水酸化アンモニウム水／水＝６／３／１）。
Figure 0004786451
２−アミノ−１，５−アンヒドロ−２，３−ジデオキシ−６−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−アラビノ−ヘキシトール ナトリウム塩（６）
２５ｍｌのメタノールとアダム触媒（ＰｔＯ2・Ｈ2Ｏ、０．０６８ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を、７５ｍｌの水に溶解させたアジド５（０．６７７ｇ、２．５１ｍｍｏｌ）の溶液中に添加する。混合物を、パー水素添加装置（３０ｐｓｉ）中で、２時間振とうする。触媒を濾過して除去し、溶媒を、真空下ロータリーエバポレーターでの蒸留により濾液から除去する。残渣を水に溶解させ、Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ４−４００（Ｎａ+）イオン交換カラムにかけ、水で溶出する。真空下で、溶媒をロータリーエバポレーターでの蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。残渣を、Ｐ2Ｏ5上真空で乾燥する。
収率：６（０．６６６ｇ、９８％）浅黄色固化油。Ｒf０．２（イソプロパノール／２５％水酸化アンモニウム水／水 ６／３／１）。
Figure 0004786451
１−（２，４−ジニトロフェニル）−３−カルバモイルピリジニウム テトラフルオロボレート
５８．６ｇのジニトロクロロベンゼンを窒素雰囲気下溶融し、その後２９．３２ｇのニコチンアミドをその融液に添加する。それを１１０℃で２．５時間加熱する。３：２（ｖ／ｖ）エタノール／水混合物５００ｍｌを、還流冷却器を経由して添加し、溶液が形成されるまで還流する。室温で一晩攪拌したのち、５０％エタノール／水１５０ｍｌと水１００ｍｌを添加し、分液ロートに移し、各回に５００ｍｌのクロロホルムで３回洗浄する。３００ｍｌと５０ｇの活性炭を分離した水層に添加し、それを室温で１時間攪拌し、その後、ＳｅｉｔｚＫ７００深ベッドフィルターで濾過する。濾液を、真空下ロータリーエバポレーターで約１００ｍｌまで濃縮し、その間浴温は２０℃を越えてはならない。それを３００ｍｌの水で希釈して、室温で攪拌しながら７０ｇの四フッ化ホウ酸ナトリウムを添加する。沈殿物をメタノール／水から再結晶する。この結晶を少量のアセトンで濾過して、その後ジエチルエーテルで洗浄し、高真空下４０℃で２４時間乾燥する。
収量：２１．１ｇ（２３％）。ＴＬＣ（メルク、シリカゲル６０Ｆ−２５４：ブタノール／氷酢酸／水 ５：２：３）、Ｒf＝０．５６。
１，５−アンヒドロ−２−（３−カルバモイルピリジニウム）−２，３−ジデオキシ−６−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−グルシトール（７）
１−（２，４−ジニトロフェニル）−３−カルバモイルピリジニウム テトラフルオロボレート（０．１４８ｇ、０．４６ｍｏｌ）の１．５ｍｌ水溶液を、水６ｍｌおよびメタノール４ｍｌ中の６（０．１００ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液に、攪拌しながら５時間かけて滴下する。それを４０℃で４日間攪拌する。この間、０．５Ｍのトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ＴＥＡＢ）水溶液０．３ｍｌを添加する。反応の経過は、ＴＬＣを用いてモニターする。出発時のアミンが、もはや見られなくなると、すぐにＴＥＡＢを添加し、それを０℃に冷却する。沈殿を遠心分離する。溶媒をロータリーエバポレーターでの蒸留により、上澄み液から除去する。溶離液として０．０１Ｍ ＴＥＡＢを用いて、ＤＥＡＥワットマンＤＥ−５２セルロース（２１ｍｍ×１４ｃｍ）上でのカラムクロマトグラフィーにより精製する。主精製を、０．０１Ｍ ＴＥＡＢで平衡化させたＤＥＡＥセファデックスＡ−２５セルロース（１８ｍｍ×２４ｃｍ）でのＨＰＬＣより行い、濃度を増加させるＴＥＡＢ溶液（０．０１→０．５Ｍ）を用いて溶離する。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせられた生成物留分から除去する。残渣を１００ｍｌの水に溶解し、凍結乾燥する。この手法を３回繰り返す。
収率：ヌクレオチド７（０．０８３ｇ、５９％）黄色固形油。Ｒf０．１５（イソプロパノール／２５％水酸化アンモニウム水／水 ６／４／１）。＋ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ３３３．１［Ｍ+］；−ＥＳＩ ＭＳ： ３３１．４［Ｍ+ −２Ｈ］-。
Figure 0004786451
アデノシン−５’−（ホスホラス−ジ−ｎ−ブチルホスフィノチオ無水物）は、関連文献（スラマ、Ｊ．Ｔ．、ラツイジェウスキー、Ｃ．、オルガンテイ、Ｓ．，カイザー，Ｅ．Ｔ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８４）１０６、６７７８〜６７８５）にしたがって合成した：Ｒf０．９（イソプロパノール／２５％水酸化アンモニウム水／水 ６／３／１）。
Figure 0004786451
ジ−ｎ−ブチルホスフィノチオニルブロマイドおよびテトラ−ｎ−ブチルジホスフィン ジサルファイドは、関連文献（フルサワ、Ｋ．、セキネ、Ｍ．、ハタ、Ｔ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ（１９７６）、１７１１〜１７１６；ブックウオールド、Ｈ．，ストローレンベルク，Ｋ．，メッチェン，Ｊ．，Ａｎｎ（１９６２），６５２，２８〜３５）にしたがって合成した。
ヘキシトールニコチンアミドアデニンジヌクレオチド リチウム塩（８）
ヌクレオチド７（０．０６７ｇ、０．２ｍｏｌ）およびアデノシン−５’−（ホスホラス−ジ−ｎ−ブチルホスフィノチオ無水物）（０．２１１ｇ、０．４ｍｏｌ）を、１ｍｌの無水無アミンＤＭＦおよび３ｍｌのピリジン（ＢａＯ上で蒸留したてのもの）の混合物中で、アルゴン雰囲気下攪拌する。溶媒を真空蒸留により除去する。溶解および蒸留手順を３回繰り返す。その後、残渣を無水ＤＭＦ２．４ｍｌおよび無水ピリジン３ｍｌの混合物中に溶解する。硝酸銀（０．２７４ｇ、１．６１ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気の遮光下で、全部を１度に添加する。室温で４０時間攪拌後１５ｍｌの水を添加し、硫化水素をさっと通す。硫化銀の沈殿を、セライト上で濾過して除去する。濾液を、各回５ｍｌのクロロホルムで３回洗浄する。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、水層抽出物から除去する。生成物は、３つのクロマトグラフィーにより精製する。
１）０．０１Ｍ ＴＥＡＢで平衡化されたＤＥＡＥセファデックスＡ−２５セルロース（１８ｍｍ×２４ｃｍ）、ＴＥＡＢ溶液を用いた溶離（０．０１→０．５Ｍ）。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。残渣を１００ｍｌの水に溶解し、凍結乾燥する。この手順を３回繰り返す。
２）水で事前に平衡化されたＤＥＡＥワットマンＤＥ−５２セルロース（１８ｍｍ×２５ｃｍ）、ギ酸水溶液を用いた溶離（０→０．３Ｍ）。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。残渣を１００ｍｌの水に溶解し、凍結乾燥する。この手順を２回繰り返す。溶液は、０．１Ｍ ＬｉＯＨでｐＨ６に調整する。
３）溶離液として水を用いたセファデックスＬＨ−２０セルロース（１８ｍｍ×３１ｃｍ）。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。残渣を１００ｍｌの水に溶解し、凍結乾燥する。この手順を２回繰り返す。
収率：８（０．０２６ｇ、１９％）無色粉末。Ｒf０．５（イソプロパノール／２５％水酸化アンモニウム水／水 ６／４／１）。Ｃ22Ｈ28Ｎ7Ｏ13Ｐ2［Ｍ+−２Ｈ］に対する正確な理論質量６６０．１２２０；実測値６６０．１２２９ ＵＶ（Ｈ2Ｏ）：λmax２５９ｎｍ。
Figure 0004786451
Figure 0004786451
１，５−アンヒドロ−２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−Ｄ−アルツリトール（altritol）（１０）
ナトリウムアジド（１．５００ｇ、２３．０７ｍｍｏｌ）と塩化アンモニウム（１．５００ｇ、２８．０４ｍｍｏｌ）とを、２−メトキシエタノールおよび水５：１の混合物（２４０ｍｌ）中の１，５：２，３−アンヒドロ−４，６−Ｏ−ベンジリデン−Ｄ−アリトール（アラートＢ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９９，５５，６５２７〜６５４６）９（１．０００ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。この混合物を、窒素雰囲気下１００℃で１８時間攪拌する。室温まで冷却後、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、溶媒を除去する。残渣を、温クロロホルム１００ｍｌで、ついで塩化メチレン（１００ｍｌ）で３回抽出する。合わせた抽出物を、短いシリカゲルカラムで濾過する。溶媒をロータリーエバポレーターでの真空蒸留により除去する。
収率：１０（１．１２６ｇ、９５％）浅黄色油。Ｒf０．７（塩化メチレン／メタノール ９８／２）。＋ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ２７８．０［Ｍ＋Ｈ］+、ｍ／ｚ ３００．０［Ｍ＋Ｎａ］+。
Figure 0004786451
１，５−アンヒドロ−２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−アルツリトール（１１）
１８０ｍｌの８０％氷酢酸中の１０（１．１１６ｇ、４．０２ｍｍｏｌ）の溶液を、９５℃で２時間攪拌する。ロータリーエバポレーターでの蒸発後、それを水中で攪拌し、再度蒸発する。その後、それをトルエンに攪拌し、再び蒸発させる。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中３０−９０％酢酸エチル）で精製する。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。残渣を、クロロホルムで洗浄し、Ｐ2Ｏ5上で真空乾燥する。
収率：１１；０．５０５ｇ（６６％）、Ｒf０．１（ヘキサン／酢酸エチル １：２）
Figure 0004786451
１，５−アンヒドロ−２−アジド−２−デオキシ−６−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−アルツリトール ジアンモニウム塩（１２）
ホスフェート１２は、アジド１１（０．５０３ｇ、２．６６ｍｍｏｌ）から出発してホスフェート５と同様にして製造する。カラムクロマトグラフィーおよびシリカゲル（０．３５％アンモニア（イソプロピルアルコール中２０％水溶液））により粗精製、浅黄色油１２（０．３５３ｇ、４６％）。Ｒf０．４（イソプロパノール／２５％水酸化アンモニウム水／水 ６／４／１）。この生成物は、さらに精製することなく使用する。
１，５−アンヒドロ−２−アミノ−２−デオキシ−６−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−アルツリトール ジナトリウム塩（１３）
２５ｍｌのメタノールとアダム触媒（ＰｔＯ2・Ｈ2Ｏ、０．０６８ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を、１５ｍｌの水に溶解させたアジド１２（０．３５３ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）の溶液中に添加する。混合物を、パー水素添加装置（３０ｐｓｉ）中で８５時間振とうする。触媒を濾過して除去し、溶媒を、ロータリーエバポレーターで真空下蒸留により濾液から除去する。残渣を、水中に溶解させ、Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ４−４００（Ｎａ+）イオン交換カラムにかけ、水で溶出する。真空下で、ロータリーエバポレーターでの蒸留により、合わせた生成物留分から溶媒を除去する。残渣をＰ2Ｏ5上で真空乾燥する。
収率：１３（０．３４２ｇ、９１％）浅黄色アモルファス粉末。Ｒf０．２５（イソプロパノール／２５％水酸化アンモニウム水／水 ６／４／１）。
Figure 0004786451
１，５−アンヒドロ−２−（３−カルバモイルピリジニウム）−２−デオキシ−６−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−アルツリトール（１４）
これは、アミン１３（０．１００ｇ、０．３５ｍｍｏｌ、メタノール４ｍｌおよび水５ｍｌ中の溶液）、ジンケ塩Ｃｌ（０．２０１ｇ、０．６２ｍｍｏｌ、水中２．１の溶液）および０．５Ｍ ＴＥＡＢ水溶液０．６ｍｌから出発して、７と同様にして、収率４２％で製造する。
Ｒf０．１５（イソプロパノール／２５％水酸化アンモニウム水／水＝６／４／１）。
Figure 0004786451
アルツリトールニコチンアミン アデニン ジヌクレオチド リチウム塩（１５）
ヌクレオチド１４（０．０５１ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、無水ホルムアミド（ｐＡグレード）２．５ｍｌおよびピリジン（ＢａＯ上で蒸留したてのもの）１ｍｌの混合物中で、アルゴン雰囲気下攪拌する。溶媒を真空蒸留により除去する。溶解および蒸留の手順を３回繰り返す。アデノシン−５’−（ホスホラス−ジ−ｎ−ブチルホスフィノチオ無水物）（０．１５５ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を、無水ピリジンで３回共蒸発させる。その後、残渣を、２．０ｍｌの無水ピリジン中に溶解する。硝酸銀（０．２００ｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１２０℃で２時間乾燥したもの）を、アルゴン雰囲気遮光下で全部を１度に添加する。室温で６５時間攪拌後、１５ｍｌの水を添加し、その後の手順は、８に対して記述した通りである。
収率：リチウム塩１５（０．０３９ｇ、３９％）無色粉末。Ｒf０．４（イソプロパノール／２５％水酸化アンモニウム水／水 ６／４／１）。Ｃ22Ｈ28Ｎ7Ｏ14Ｐ2［Ｍ+−２Ｈ］に対する理論質量６７６．１１６９；実測値６７６．１１４７。−ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ６７６［Ｍ+−２Ｈ］-、ｍ／ｚ ６９８［Ｍ+−３Ｈ＋Ｎａ］-；＋ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ６７８［Ｍ+］、ｍ／ｚ ７００［Ｍ+−Ｈ＋Ｎａ］。ＵＶ（Ｈ2Ｏ）：λmax２５９ｎｍ。
Figure 0004786451
（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−Ｎ−（５−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−５，７−Ｏ−ベンジリデン−２−シクロヘキセン−１−イル）フタルイミド（１７）
無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）中のＤＩＡＤ（５．３ｍｌ、２５．５２ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で攪拌しながら、窒素雰囲気下、無水ＴＨＦ（１７０ｍｌ）中のトリフェニルホスフィン（７ｇ、２６．６８ｍｍｏｌ）、ワン，Ｊ．らに記載された化合物１６（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１、６６、８４７８〜８４８２；グ、Ｐ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００４，６０，２１１１〜２１２３）（４．２ｇ，１８．０８ｍｍｏｌ）およびフタルイミド（４ｇ、２７．１８ｍｍｏｌ）の懸濁液にゆっくりと添加する。１時間攪拌後、それを、ロータリーエバポレーターで留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン ２／８）で精製する。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。
収量：１７；５．２３ｇ（８０％）無色固体。
Figure 0004786451
（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−Ｎ−（５−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロヘキセン−１−イル）フタルイミド（１８）
８０ｍｌの８０％氷酢酸中の１７（１．１１６ｇ、４．０２ｍｍｏｌ）の懸濁液を、透明な溶液が形成されるまで、９５℃で攪拌する。ロータリーエバポレーターで蒸発後、水中に攪拌して、再度蒸発させる。その後トルエンと攪拌し、再度蒸発させる。残渣を、カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン １／１から７／３まで）で精製する。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。
収量：１８；３．４ｇ（９０％）。
Figure 0004786451
（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−１−アミノ−４−Ｏ−ホスホノメチル−５−ヒドロキシ−２−シクロヘキセン アンモニウム塩（２０）
オキシ塩化リン（４３６μｌ）を、アルゴン雰囲気下０℃で攪拌しながら、トリメチルホスフェート（５．５ｍｌ）に添加する。０℃で１５分攪拌後、１８（６００ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を全部１度に添加する。３時間攪拌後、５０ｍｌの冷水を添加し、トリエチルアミンを滴下して中和する。混合物を、ロータリーエバポレーターで真空下、蒸発乾燥する。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、イソプロパノール／水酸化アンモニウム／水（６／３／１）を溶離液として用いて、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製する。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。
収量：１９；無色固体として（４７５ｍｇ、５６％）。
１９（３００ｍｇ、０．７７５ｍｍｏｌ）を、１５ｍｌのエタノール／水（１／１）中に溶解し、ヒドラジン１水和物（７５μｌ、１．５５ｍｍｏｌ）と混合する。９０℃で一晩攪拌後、溶媒をロータリーエバポレーターでの真空蒸留により除去する。残渣を水に溶解させ、酢酸エチルで洗浄する。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により水層から除去する。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、イソプロパノール／水酸化アンモニウム／水（６／３／１）を溶離液として用いて、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製する。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。
収量：２０（１１１ｍｇ、５６％）。
Figure 0004786451
（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−１−（カルバモイルピリジン）−４−ホスホノメチル−５−ヒドロキシ−２−シクロヘキセン トリエチルアンモニウム塩（２１）
２０（０．０７ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を、メタノール（４．５ｍｌ）と無水のヒューニッヒ塩基ｉＰｒ2ＥｔＮ（０．０９ｍｌ、０．５２ｍｍｏｌ）との混合物中で、窒素雰囲気下室温で３０分間攪拌する。ジンケＢＦ4塩（０．１ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を、全部１度に添加する。深赤色混合物を５５℃で５時間攪拌し、さらに０．０３ｇのジンケ四フッ化ホウ酸塩を添加し、さらに２０時間加熱する。５０ｍｌのＴＥＡＢ（１Ｍ）溶液を添加して、真空下ロータリーエバポレーターで蒸発乾固する。粗生成物を、ＤＥＡＥセルロースでＭＰＬＣにより精製する。最初に、望ましくない副生物を水で溶離する。その後、流速１ｍｌ／分で、０．０１ＭのＴＥＡＢから０．５ＭのＴＥＡＢの勾配溶離を続ける。溶媒を、ロータリーエバポレーター上の真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。
収量；２１＝０．０９ｇ（９２％）、無色アモルファス粉末。
Figure 0004786451
シクロヘキセニルニコチンアミドアデニンジヌクレオチド トリエチルアンモニウム塩（２２）
９ｍｌのＤＭＦ／ピリジンの１：１混合物を、モノヌクレオチド２１（０．０９５ｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）およびアデノシン−５’−（ホスホラス−ジ−ｎ−ブチルホスフィノチオ無水物）（０．１８６ｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）に添加する。溶媒を真空蒸留により除去し、それを再び９ｍｌのＤＭＦ／ピリジンの１：１混合物中に取り込む。この手順をもう一度繰り返す。その後、残渣を高真空で完全に乾燥させ、その後再び９ｍｌのＤＭＦ／ピリジンの１：１混合物中に取り込む。硝酸銀（０．２４２ｇ、１．４２４ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気遮光下で、全部を１度に添加する。室温で１５時間攪拌後、３０ｍｌの水を添加し、硫化水素をさっと通す。硫化銀沈殿をセライト上で濾過して除去する。濾液を、各回５ｍｌのクロロホルムで３回洗浄する。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、水層から除去する。粗生成物を、ＤＥＡＥセルロースでＭＰＬＣにより精製する。最初に、望ましくない副生成物を水で溶出する。その後、流速１ｍｌ／分で、０．０１ＭのＴＥＡＢから０．２５ＭのＴＥＡＢへの勾配で溶離を続ける。溶媒を、ロータリーエバポレーターでの真空蒸留により、合わせた生成物留分から除去する。
収量；２２＝０．０１８ｇ（１２％）、無色粉末。
Figure 0004786451
ヘキシトールニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造用のスキームである。 アルツリトールニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリチウム塩の製造用のスキームである。 シクロヘキセンニコチンアミドアデニンヌクレオチドの製造用のスキームである。

Claims (7)

  1. （ｉ）補酵素依存性酵素またはそのような酵素に対する基質および（ii）補酵素として、次の一般式（Ｉ’）を有する化合物またはその塩もしくは還元型を含むことを特徴とする検体測定用テストエレメント。
    Figure 0004786451
     式中、
    Ａは、アデニンであり、
    Ｔは、Ｏであり、
    Ｕは、ＯＨであり、
    Ｖは、ＯＨまたはリン酸塩基であり、
    Ｗは、ＣＯＮＨ 2 であり、
    Ｘ１、Ｘ２は、Ｏであり、
    Ｙは、Ｏであり、
    Ｚは、一般式（II）の飽和または不飽和炭素環式または複素環式６員環であり、
    Figure 0004786451
     式中、単結合または二重結合が、それぞれの場合において、独立してＲ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだに存在し得、
    もし単結合が、Ｒ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだにそれぞれ存在する場合には、
    Ｒ１、Ｒ１’は、それぞれの場合において、独立してＯ、ＣＨＯＨを示し、式中、Ｒ１またはＲ１’は同時にＯになることはできず、
    Ｒ２、Ｒ２’は、それぞれの場合において、独立してＣＨ 2、ＣＨＯＨを示し、
    もし二重結合が、Ｒ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだに存在する場合には、
    Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’は、それぞれの場合において、独立してＣＨを示し、
    Ｒ４は、Ｈであり、
    Ｒ６、Ｒ６’は、ＣＨである。
  2. 酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼであることを特徴とするグルコース検出用の請求項１記載のテストエレメント。
  3. 一般式（Ｉ’’）の化合物またはその塩もしくは還元型：
    Figure 0004786451
     式中、
    Ａは、アデニンであり、
    Ｔは、Ｏであり、
    Ｕは、ＯＨであり、
    Ｖは、ＯＨまたはリン酸塩基であり、
    Ｗは、ＣＯＮＨ 2 であり、
    Ｘ1、Ｘ2は、Ｏであり、
    Ｙは、Ｏであり、
    Ｚは、一般式（II）の飽和または不飽和炭素環式または複素環式６員環であり、
    Figure 0004786451
     式中、単結合または二重結合が、それぞれの場合において、独立して、Ｒ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだに存在しても良く、
    もし単結合が、Ｒ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだにそれぞれ存在する場合には、
    Ｒ１、Ｒ１’は、それぞれの場合において、独立してＯ、ＣＨＯＨを示し、そこではＲ１またはＲ１’は同時にＯになることはできず、
    Ｒ２、Ｒ２’は、それぞれの場合において、独立してＣＨ 2、ＣＨＯＨを示し、
    もし二重結合が、Ｒ１およびＲ２のあいだに、またはＲ１’およびＲ２’のあいだに存在する場合には、
    Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’は、それぞれの場合において、独立してＣＨを示し、
    Ｒ４は、Ｈであり、
    Ｒ６、Ｒ６’は、ＣＨである。
  4. 酵素との組み合わせで、請求項３記載の化合物からなる酵素−補酵素複合体。
  5. 酵素反応によりサンプル中の検体を検出するための、請求項３記載の化合物または、請求項４記載の複合体の使用。
  6. 請求項３記載の化合物および酵素、または請求項４記載の酵素−補酵素複合体、ならびに緩衝液を含む試薬キット。
  7. （ａ）補酵素を含む請求項１または２記載のテストエレメントとサンプルを接触させる工程、および
    （ｂ）検体を検出する工程
    を含む検体検出方法。
JP2006205087A 2005-07-28 2006-07-27 Ｎａｄ／ｎａｄｈの安定化 Expired - Fee Related JP4786451B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005035469.6 2005-07-28
DE102005035469 2005-07-28

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2007054052A JP2007054052A (ja) 2007-03-08
JP2007054052A5 JP2007054052A5 (ja) 2008-04-17
JP4786451B2 true JP4786451B2 (ja) 2011-10-05

Family

ID=37694833

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006205087A Expired - Fee Related JP4786451B2 (ja) 2005-07-28 2006-07-27 Ｎａｄ／ｎａｄｈの安定化

Country Status (2)

Country Link
US (2) US7553615B2 (ja)
JP (1) JP4786451B2 (ja)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1504113T3 (da) * 2002-05-16 2007-03-05 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til fremstilling af polymerlag
US7553615B2 (en) * 2005-07-28 2009-06-30 Roche Diagnostics Operations, Inc. Compounds, methods, complexes, apparatuses and uses relating to stabile forms of NAD/NADH
EP2022859A1 (de) * 2007-08-01 2009-02-11 Roche Diagnostics GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten mittels Fluoreszenzmessung
EP2093284A1 (de) * 2008-02-19 2009-08-26 F.Hoffmann-La Roche Ag Stabilisierung von Dehydrogenasen mit stabilen Coenzymen
EP2226007A1 (de) 2009-02-19 2010-09-08 Roche Diagnostics GmbH Testelementmagazin mit abgedeckten Testfeldern
EP2226008A1 (de) 2009-02-19 2010-09-08 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur Herstellung eines analytischen Magazins
CN102325496B (zh) 2009-02-19 2015-10-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 分析辅助工具的节省空间的储存
EP2398909B1 (de) 2009-02-19 2015-07-22 F. Hoffmann-La Roche AG Schnelle reaktionskinetik von enzymen mit niedriger aktivität in trockenen chemieschichten
EP2459537B1 (en) * 2009-07-27 2014-12-17 Roche Diagnostics GmbH Method and substances for preparation of n-substituted pyridinium compounds
EP2287605A1 (de) 2009-08-20 2011-02-23 Roche Diagnostics GmbH Vereinfachte Magazinierung integrierter Systeme
EP2292751A1 (de) 2009-08-20 2011-03-09 Roche Diagnostics GmbH Stabilisierung von Enzymen mit stabilen Coenzymen
EP2333544A1 (de) 2009-12-11 2011-06-15 F. Hoffmann-La Roche AG Sterilisierbare Chemie für Testelemente
WO2011073258A1 (de) * 2009-12-16 2011-06-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Detektion der zersetzung von enzymen in einem testelement durch kontrollierte freisetzung von geschütztem analyt
US9045421B2 (en) * 2010-05-27 2015-06-02 University Of Washington Reagent and method for detection of carboxylic acids by mass spectrometry
KR101530804B1 (ko) 2011-04-12 2015-06-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 분석 보조기구
US9752990B2 (en) 2013-09-30 2017-09-05 Honeywell International Inc. Low-powered system for driving a fuel control mechanism
EP2620507A1 (en) 2012-01-25 2013-07-31 Roche Diagnostics GmbH Method for the evaluation of the quality of a test element
EP2839267B1 (de) 2012-04-19 2019-12-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Verfahren und vorrichtung zur bestimmung einer analytkonzentration in blut
US8920628B2 (en) 2012-11-02 2014-12-30 Roche Diagnostics Operations, Inc. Systems and methods for multiple analyte analysis
US8921061B2 (en) 2012-11-02 2014-12-30 Roche Diagnostics Operations, Inc. Reagent materials and associated test elements
WO2015063025A1 (en) 2013-10-29 2015-05-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Nano-enzyme containers for test elements
PL3523639T3 (pl) 2016-10-05 2025-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Odczynniki wykrywające i układy elektrod do elementów diagnostycznych testów wieloanalitowych oraz sposoby ich zastosowania

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1033196A (ja) * 1996-07-23 1998-02-10 Unitika Ltd 試験片
US5801006A (en) 1997-02-04 1998-09-01 Specialty Assays, Inc. Use of NADPH and NADH analogs in the measurement of enzyme activities and metabolites
US6380380B1 (en) * 1999-01-04 2002-04-30 Specialty Assays, Inc. Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates
WO2001094370A1 (fr) 2000-06-07 2001-12-13 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Derives de coenzymes et enzymes appropries
DE10221845A1 (de) 2002-05-16 2003-11-27 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren und Reagenzsystem mit nicht-regenerierbarem Enzym-Coenzym-Komplex
DE102005035461A1 (de) * 2005-07-28 2007-02-15 Roche Diagnostics Gmbh Stabile NAD/NADH-Derivate
US7553615B2 (en) * 2005-07-28 2009-06-30 Roche Diagnostics Operations, Inc. Compounds, methods, complexes, apparatuses and uses relating to stabile forms of NAD/NADH
EP2093284A1 (de) * 2008-02-19 2009-08-26 F.Hoffmann-La Roche Ag Stabilisierung von Dehydrogenasen mit stabilen Coenzymen

Also Published As

Publication number Publication date
US20070026476A1 (en) 2007-02-01
US7553615B2 (en) 2009-06-30
US20090246818A1 (en) 2009-10-01
JP2007054052A (ja) 2007-03-08
US9139572B2 (en) 2015-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4786451B2 (ja) Ｎａｄ／ｎａｄｈの安定化
JP5129133B2 (ja) 安定なｎａｄ／ｎａｄｈ誘導体
JP5758128B2 (ja) 安定な補酵素による脱水素酵素の安定化
AU742386B2 (en) The use of nadph and nadh analogs in the measurement of enzyme activities and metabolites
ES2350507T3 (es) Método colorimétrico y reactivo que se utiliza para el mismo.
KR20160132970A (ko) 페나지늄 매개체
AU2012201023B2 (en) Stable NAD/NADH derivatives
JP3470099B2 (ja) デヒドロゲナーゼまたはその基質を測定するための安定化補酵素溶液およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080303

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080303

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20100525

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101109

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110208

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110214

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110502

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20110705

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20110713

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140722

Year of fee payment: 3

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees