JP4765402B2 - Method for producing poly (A) RNA by applying electric field - Google Patents
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Description
本発明は、ポリ（Ａ）ＲＮＡ作製に係る技術に関する。より詳しくは、ポリアデニン分子に電気力学的作用を与えることによって、ポリ（Ａ）ＲＮＡを作製する技術に関する。 The present invention relates to a technique relating to the poly (A) RN A work made. More specifically, the present invention relates to a technique for producing poly (A) RNA by giving an electrodynamic action to a polyadenine molecule.
近年、遺伝子工学の発展により種々の生物の遺伝子配列が解明されつつある。例えば、ヒトに存在する遺伝子数は１０万を越えるであろうといわれている。しかしながら、ゲノムＤＮＡ全てが生命現象を担っているわけではなく、生命現象の主たる担い手タンパク質のアミノ酸配列情報を含む領域である。言い換えればタンパク質の合成の前にまずＲＮＡに転写されるが、この際その間に挟まれたアミノ酸配列情報を含まない領域（イントロン）も合わせて転写され、スプライシングと呼ばれる過程でこの領域が切除され、アミノ酸配列情報を含む領域が残ったメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成する。 In recent years, gene sequences of various organisms are being elucidated by the development of genetic engineering. For example, it is said that the number of genes present in humans will exceed 100,000. However, not all genomic DNAs carry a life phenomenon, but a region containing amino acid sequence information of the protein responsible for the life phenomenon. In other words, it is first transcribed into RNA before protein synthesis. At this time, a region (intron) sandwiched between them is also transcribed, and this region is excised in a process called splicing, Messenger RNA (mRNA) is generated in which a region containing amino acid sequence information remains.
また、真核生物などのｍＲＮＡにおいては、転写に続いてポリ（Ａ）ポリメラーゼにより、その３’末端に１００〜２００ｂｐ程度のポリ（Ａ）鎖（poly(A)tail）と呼ばれるＡＭＰ残基の連続体が付加されるポリアデニル化（polyadenylation）が行われ、ポリ（Ａ）ＲＮＡが生成する。ポリ（Ａ）鎖の機能は未だわかっていないが、ｍＲＮＡを分解するような酵素群から保護し、ｍＲＮＡの安定性を高めていると考えられている。 Moreover, in mRNAs such as eukaryotes, an AMP residue called poly (A) tail of about 100 to 200 bp is formed at the 3 ′ end by poly (A) polymerase following transcription. Polyadenylation to which a continuum is added is performed to produce poly (A) RNA. Although the function of the poly (A) chain is not yet known, it is thought that it protects from a group of enzymes that degrade mRNA and enhances the stability of mRNA.
遺伝子の機能解析においては、生物の各組織内でいかなる遺伝子が発現されているかを知ることは極めて重要である。ポリ（Ａ）ＲＮＡの解析において、しばしばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ（ポリＡ+ＲＮＡ）等の混合物であるTotal ＲＮＡを用いて行われる。しかし、このTotal ＲＮＡに占めるポリ（Ａ）ＲＮＡは５％以下であり、特にコピー数の少ないポリ（Ａ）ＲＮＡの解析は困難である。そのため、生体材料から効率的にポリ（Ａ）ＲＮＡを単離することは、これらの解析において非常に有意義である。 In gene function analysis, it is extremely important to know what gene is expressed in each tissue of an organism. In the analysis of poly (A) RNA, it is often performed using Total RNA which is a mixture of tRNA, rRNA, mRNA (poly A + RNA) and the like. However, poly (A) RNA occupies 5% or less of the total RNA, and analysis of poly (A) RNA having a small copy number is particularly difficult. Therefore, isolating poly (A) RNA efficiently from biomaterials is very significant in these analyses.
現在、ポリ（Ａ）ＲＮＡの精製やｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）の作製にポリ（Ａ）構造が利用されている。例えば、ポリ（Ａ）と相補的に結合するｄＴ鎖を担体に結合したカラムに細胞から抽出したTotal ＲＮＡを流すと、ポリ（Ａ）構造を持たないｔＲＮＡ、ｒＲＮＡは通り抜け、タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡだけが捕捉され、次いで、低塩濃度溶液でｍＲＮＡを溶出させて精製する（例えば、特許文献１参照）。また、ｍＲＮＡを鋳型に逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する際にも、ｄＴ鎖のプライマーをｍＲＮＡに付着し部分的に二重鎖にして、逆転写酵素によるＤＮＡ合成反応を開始することが行われている。
従来のポリ（Ａ）ＲＮＡの精製技術においては、ｄＴ鎖に対するポリ（Ａ）ＲＮＡの捕捉効率や精度に改良の余地があった。より具体的には、担体に固定等されたｄＴ鎖に対して、回収目的とするポリ（Ａ）ＲＮＡ以外にも他の不要分子が非特異的に吸着するという問題が発生するため、ポリ（Ａ）ＲＮＡの回収効率や純度が悪かった。 Conventional poly (A) RNA purification techniques have room for improvement in the capture efficiency and accuracy of poly (A) RNA for dT strands. More specifically, since a problem arises in that other unwanted molecules adsorb non-specifically to the dT chain immobilized on the carrier in addition to the poly (A) RNA to be recovered. A) RNA recovery efficiency and purity were poor.
そこで、本発明は、ポリアデニン分子に対する電界印加の効果に基づき、細胞等の核酸を含有する試料から、効率的に高純度のポリ（Ａ）ＲＮＡを作製する方法を提供することを主な目的とする。 The present invention is based on the effect of the electric field application to the polyadenine molecules, primary purpose of the sample containing nucleic acids, such as cells, to provide a method of making an efficient high purity Po Li (A) RNA of And
核酸分子は、骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷によって分極ベクトル（双極子：dipole）が生じる。この分極ベクトルは電界によりその方向が変化し、また、分子配向も変化する。 Nucleic acid molecules are thought to be ion clouded by phosphate ions (negative charges) that form the skeleton and hydrogen atoms (positive charges) formed by ionizing water around them, and are polarized by these negative and positive charges. A vector (dipole) is generated. The direction of the polarization vector is changed by an electric field, and the molecular orientation is also changed.
本願発明者らは、鋭意研究を行った結果、電界印加によって、他の核酸分子に比べて、アデニン分子が急激に双極子モーメント（dipole moment）と配向（transformation）が変化することを突き止め、この電界印加による電気力学的作用によって、ｄＴ鎖に対してＲＮＡのポリ（Ａ）鎖部分が高効率で相補結合し、また、ポリ（Ａ）ＲＮＡが効率良く生成することを明らかにした。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that the dipole moment and transformation of adenine molecules change abruptly by applying an electric field compared to other nucleic acid molecules. It has been clarified that the poly (A) chain portion of RNA is efficiently complementary-bonded to the dT chain by electrodynamic action by applying an electric field, and that poly (A) RNA is efficiently generated.
本発明では、反応場に電界を印加してポリアデニン分子の双極子モーメントの配向を変化させることによって、ＲＮＡの３'末端部位に対するポリＡ鎖の付加及び／又は伸長を促進させてポリ（Ａ）ＲＮＡを作製する方法を提供する。 In the present invention, an electric field is applied to the reaction field to change the orientation of the dipole moment of the polyadenine molecule, thereby facilitating the addition and / or extension of the poly A strand to the 3 ′ end site of RNA to thereby poly (A). Methods for making RNA are provided.
本発明によれば、ポリアデニン分子を標的として電界印加を行って、ポリアデニン分子の双極子モーメントとその配向を急激に変化させることができる。この電気力学的効果によって、ｄＴ鎖とポリ（Ａ）ＲＮＡのポリ（Ａ）鎖との間の相補鎖結合効率を向上させたり、あるいは、ｄＴ鎖とポリ（Ａ）鎖の相補結合の解離を促進させたりすることができる。 According to the present invention, an electric field can be applied to a polyadenine molecule as a target to rapidly change the dipole moment and the orientation of the polyadenine molecule. This electrodynamic effect improves the complementary strand binding efficiency between the dT strand and the poly (A) strand of the poly (A) RNA, or dissociates the complementary bond between the dT strand and the poly (A) strand. It can be promoted.
また、電界印加によって、ｄＴ鎖に対するミスマッチ結合の解離をＡ−Ｔフルマッチの解離よりも相対的に増やすことによって、相補結合中のＡ−Ｔフルマッチの割合を増加させることができる。このため、ｄＴ鎖に対してポリ（Ａ）ＲＮＡのポリ（Ａ）鎖部位を相補結合させるアッセイの精度を高めることができ、ひいては、回収されたポリ（Ａ）ＲＮＡの純度を向上させることができる。 Moreover, the ratio of the AT full match in the complementary bond can be increased by increasing the dissociation of the mismatch bond to the dT chain relative to the dissociation of the AT full match by applying an electric field. For this reason, it is possible to increase the accuracy of the assay in which the poly (A) chain portion of the poly (A) RNA is complementarily bound to the dT chain, and thus improve the purity of the recovered poly (A) RNA. it can.
さらに、前記電気力学的効果によって、ＲＮＡの３'末端部位に対するポリＡ鎖の付加や伸長を促進させて、ポリ（Ａ）ＲＮＡの人為的な作製を効率よく行うことができる。 Furthermore, artificial addition of poly (A) RNA can be efficiently carried out by promoting the addition and extension of poly A chain to the 3 ′ terminal site of RNA by the electrodynamic effect.
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。 DESCRIPTION OF EXEMPLARY EMBODIMENTS Hereinafter, preferred embodiments for carrying out the invention will be described with reference to the accompanying drawings. Each embodiment shown in the attached drawings shows an example of a typical embodiment of the thing and method concerning the present invention, and, thereby, the scope of the present invention is not interpreted narrowly.
まず、図１は、本発明に係るポリ（Ａ）ＲＮＡ精製方法の工程手順の一例を示す図である。 First, FIG. 1 is a figure which shows an example of the process sequence of the poly (A) RNA purification method which concerns on this invention.
符号Ｒで示す反応場としては、例えば、カラム内に形成された反応場や基板上に形成された反応場を利用できる。このような反応場Ｒにおいて、担体（例えば、ビーズ）や基板の表面ＳにｄＴ鎖（符号１）の一端を、例えば、カップリング反応やビオチン‐アビジン結合等を用いて固定しておく。 As the reaction field indicated by the symbol R, for example, a reaction field formed in a column or a reaction field formed on a substrate can be used. In such a reaction field R, one end of the dT chain (symbol 1) is fixed to the surface (S) of the carrier (for example, beads) or the substrate, for example, using a coupling reaction or a biotin-avidin bond.
このようなｄＴ鎖（符号１）が固定されている環境の反応場Ｒに対して、細胞等から抽出されたＴｏｔａｌＲＮＡを含有する試料を添加又は送液等して送り込む。図１中の（Ｉ）には、ポリ（Ａ）鎖を有するＲＮＡ、即ちポリ（Ａ）ＲＮＡ（符号２）とポリ（Ａ）鎖を持たないＲＮＡ（符号３）が反応場Ｒに混在している様子が模式的に示されている。 A sample containing Total RNA extracted from a cell or the like is added or sent to the reaction field R in the environment where the dT chain (symbol 1) is fixed. In (I) in FIG. 1, RNA having a poly (A) chain, that is, poly (A) RNA (symbol 2) and RNA having no poly (A) chain (symbol 3) are mixed in the reaction field R. This is shown schematically.
なお、ポリ（Ａ）ＲＮＡ含有する試料は、特に限定されないが、例えば、血清、血液、髄液、組織、尿、糞便、唾液、精液等の生体材料から分離した細胞及び培養細胞などの生体試料を挙げることができる。 The sample containing poly (A) RNA is not particularly limited. For example, biological samples such as cells and cultured cells separated from biological materials such as serum, blood, spinal fluid, tissue, urine, feces, saliva, semen, etc. Can be mentioned.
続いて、このような物質環境の反応場Ｒに対して、電界Ｅを印加することによって、ポリ（Ａ）ＲＮＡ２において、特にそのポリ（Ａ）鎖部位２１の双極子モーメントに対して、選択的に影響を与える。
Subsequently, by applying an electric field E to the reaction field R in such a material environment, the poly (A)
図２は、電界Ｅを印加することによって、ポリ（Ａ）ＲＮＡ２のポリ（Ａ）鎖部位２１の双極子モーメントの向きが急激に変化して配向が変化することによって、ランダムコイル形状などを形成して絡み合っているポリＡ鎖部位が反応場Ｒに露出し、表面Ｓに固定されているｄＴ鎖（符号１）に引き寄せられている様子が模式的に示されている。
FIG. 2 shows that a random coil shape or the like is formed by applying an electric field E to abruptly change the orientation of the dipole moment of the poly (A)
図３は、さらに、図２の段階から進行し、ポリ（Ａ）ＲＮＡ２のポリ（Ａ）鎖部位２１と表面Ｓに固定されているｄＴ鎖（符号１）とが相補結合することにより、相補鎖を形成している様子が模式的に示されている。
FIG. 3 further proceeds from the stage of FIG. 2, and complementation is achieved by the complementary binding between the poly (A)
このような電界印加による相補鎖形成工程に続いて、洗浄工程へ移行する。図１中の（III）は、この洗浄工程の概念を模式的に簡潔に示している。この洗浄工程では、反応場Ｒに対して所定の洗浄用のバッファー溶液（相補鎖に影響を与えないもの）を送り込み、反応場Ｒに遊離状態で存在しているポリ（Ａ）鎖を持たないＲＮＡ３を、該反応場Ｒから除去する。 Subsequent to the complementary strand forming step by applying an electric field, the process proceeds to a cleaning step. (III) in FIG. 1 schematically shows the concept of this cleaning step in a concise manner. In this washing step, a predetermined washing buffer solution (that does not affect the complementary strand) is sent to the reaction field R, and the reaction field R does not have a poly (A) chain present in a free state. RNA3 is removed from the reaction field R.
この洗浄工程が完了したら、続いて解離工程に移行する。図１中の（VI）にはこの解離工程の概念が模式的に示されている。 When this washing process is completed, the process proceeds to the dissociation process. (VI) in FIG. 1 schematically shows the concept of this dissociation process.
この解離工程では、表面Ｓ近傍の反応場Ｒに形成されている相補鎖、即ち、ポリ（Ａ）ＲＮＡ２のポリ（Ａ）鎖部位２１と表面Ｓに固定されているｄＴ鎖（符号１）との相補結合部位を、反応場Ｒの温度条件、塩濃度、ｐＨ条件などを操作することによって解離し、一本鎖のポリ（Ａ）ＲＮＡ２を反応場Ｒへ遊離させるようにする。なお、解離のための反応場の条件は、適宜選択すればよい。
In this dissociation step, the complementary strand formed in the reaction field R in the vicinity of the surface S, that is, the poly (A)
なお、この解離工程において、再び電界を印加することによって、ポリ（Ａ）ＲＮＡ２のポリ（Ａ）鎖部位２１の双極子モーメントやその配向を急激に変化させ、その効果により解離を促進させるようにしてもよい。
In this dissociation step, by applying an electric field again, the dipole moment of the poly (A)
即ち、電界印加による電気力学的効果によって、ｄＴ鎖に対するミスマッチ結合の解離をＡ−Ｔフルマッチの解離よりも相対的に増やすことによって、全相補結合中のＡ−Ｔフルマッチの割合を増加させることができる、これにより、ｄＴ鎖に対するポリ（Ａ）ＲＮＡのポリ（Ａ）鎖部位を相補結合させるアッセイの精度を高めることができ、ひいては、回収されたポリ（Ａ）ＲＮＡの純度を向上させることができる。 That is, it is possible to increase the ratio of AT full match in all complementary bonds by increasing the dissociation of mismatch bond with respect to dT chain relative to the dissociation of AT full match by electrodynamic effect by applying electric field. This can increase the accuracy of the assay for complementary binding of the poly (A) chain site of the poly (A) RNA to the dT chain, and thus improve the purity of the recovered poly (A) RNA. it can.
最後に、反応場Ｒに存在する溶液を回収することによって、該溶液中に含まれているポリ（Ａ）ＲＮＡ２を回収することができる。図１の（Ｖ）には、この回収工程の概念が模式的に示されている。
Finally, by recovering the solution present in the reaction field R, the poly (A)
次に、図４は、本発明に係るポリ（Ａ）ＲＮＡ作製方法に係る工程手順の概念を示す図である。 Next, FIG. 4 is a figure which shows the concept of the process procedure which concerns on the poly (A) RNA preparation method based on this invention.
反応場Ｒに、符号４で示されたポリアデニン分子と、ポリ（Ａ）鎖を持たないＲＮＡ５、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（poly A polymerase）、酵素反応に必要な成分（例えば、Ｍｇ２＋又はＭｎ２＋）などが存在している系を形成する。
In the reaction field R, the polyadenine molecule indicated by
このような反応場Ｒに電界Ｅを印加すると、ポリアデニン分子４の双極子モーメントやその配向が急激に変化することにより、ポリアデニン分子４がＲＮＡ５の３'末端に付加され易く、あるいは伸長され易い状態となるため、目的のポリ（Ａ）ＲＮＡ６の生成を効率よく進めることができる。
When an electric field E is applied to such a reaction field R, the dipole moment of the
より具体的には、前記電界Ｅの電気力学的効果によって、ポリアデニン分子４と同反応場Ｒに存在するポリ（Ａ）ポリメラーゼ（図示ぜす）の複合体（中間体）の形成が促進され、これにより、ＲＮＡ５の３'末端部位に対するポリＡ鎖の付加や伸長が促進されると考えられる。
More specifically, the electrodynamic effect of the electric field E promotes the formation of a poly (A) polymerase (shown) complex (intermediate) present in the reaction field R with the
以下、本発明に係るポリ（Ａ）ＲＮＡ精製方法やポリ（Ａ）ＲＮＡ精製方法の有用性の根拠となる電界Ｅの電気力学的効果によるポリアデニン分子の双極子モーメントと配向（トランスフォーメーション）の変化に係る検証結果を、図５〜図８に基づいて説明する。なお、各図の左縦軸はベクトル（Debye）、右縦軸は配向の変化角度（Angle）、横軸は電圧（Ｖ／ｎｍ）をそれぞれ示している。 Hereinafter, poly (A) RNA purification method and poly (A) RNA purification method according to the present invention change in dipole moment and orientation (transformation) of polyadenine molecule due to electrodynamic effect of electric field E, which is the basis of usefulness of poly (A) RNA purification method The verification result which concerns on is demonstrated based on FIGS. In each figure, the left vertical axis represents a vector (Debye), the right vertical axis represents an orientation change angle (Angle), and the horizontal axis represents a voltage (V / nm).
図５は、ポリアデニン分子の双極子モーメントと配向が、電界強度（電圧）１．６〜２．１Ｖ／ｎｍのときに急激に変化することが示されている。一方、図６はポリチアミン分子、図７はポリシトシン分子、図８はポリグアニン分子のついての双極子モーメントとトランスフォーメーションの変化をそれぞれ示している。 FIG. 5 shows that the dipole moment and orientation of the polyadenine molecule change rapidly when the electric field strength (voltage) is 1.6 to 2.1 V / nm. On the other hand, FIG. 6 shows polythiamine molecules, FIG. 7 shows polycytosine molecules, and FIG. 8 shows changes in dipole moment and transformation of polyguanine molecules.
図６から８の結果と図５の結果を比較すればわかるように、ポリチアミン分子、ポリシトシン分子、ポリグアニン分子では、ポリアデニン分子のような電界強度（電圧）１．６〜２．１Ｖ／ｎｍにおける双極子モーメントと配向の急激な変化が見られないことが明らかである。 As can be seen by comparing the results of FIGS. 6 to 8 with the results of FIG. It is clear that there is no sudden change in the repulsive moment and orientation.
核酸分子は、骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷によって分極ベクトル（双極子）が生じ、この分極ベクトルが電界の印加によりその方向が変化し、また、配向も変化する。 Nucleic acid molecules are thought to be ion clouded by phosphate ions (negative charges) that form the skeleton and hydrogen atoms (positive charges) formed by ionizing water around them, and are polarized by these negative and positive charges. A vector (dipole) is generated, and this polarization vector changes its direction by applying an electric field, and its orientation also changes.
本実施例１に係る実験で使用したElution Bufferの組成は、10mM Tris-HCL pH7.5, 1mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）,0.1%SDS（ポリアクリルアミド）であり、洗浄用のバッファー溶液（Washing Buffer）の組成は、10mMTris-HCL pH7.5, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5MNaClである。 The composition of the Elution Buffer used in the experiment according to Example 1 is 10 mM Tris-HCL pH 7.5, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetate disodium), 0.1% SDS (polyacrylamide). The composition of Washing Buffer is 10 mM Tris-HCL pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5 M NaCl.
エタノール沈殿後のtotal RNA400mgに、前記Elution Buffer400mlを加え、更にoligotex-dT30 <super> 400mlを加えて、65度、５分インキュベートした。その後、３分間急冷し、電界（条件：１ＭＨｚ，２Ｖ）を10分かけた。 400 ml of the above Elution Buffer was added to 400 mg of total RNA after ethanol precipitation, and 400 ml of oligotex-dT30 <super> was further added and incubated at 65 ° C. for 5 minutes. Thereafter, it was rapidly cooled for 3 minutes, and an electric field (conditions: 1 MHz, 2 V) was applied for 10 minutes.
続いて、5M NaCl 80mlを加え、37度10minインキュベートした後、15000rpm 3min 4度で遠心した。ペレットを上記Washing Buffer 1mlに懸濁し、15000rpm 3min 4℃で遠心し、上清を除去した。再び電界を10分かけてから、TE 400mlを加え、ピペッティングで懸濁し、65℃ 5分インキュベートし、その後、３分間急冷した後、15000rpm 3min 4℃で遠心し、その上清を新しいチューブに移し、15000rpm 3min 4℃遠心した。その上清を新しいチューブに移してエタノール沈殿(2M NaoAc1/10,100% Etoh 2.5倍）させた。その後、ペレットを少し乾かし、DEPC（diethylpyrocarbonete）処理したdH2OまたはTEに溶かして、ポリ（Ａ）ＲＮＡの濃度を測定した。 Subsequently, 80 ml of 5M NaCl was added, incubated at 37 degrees for 10 minutes, and then centrifuged at 15000 rpm for 3 minutes at 4 degrees. The pellet was suspended in 1 ml of the above Washing Buffer, centrifuged at 15000 rpm for 3 min at 4 ° C., and the supernatant was removed. Apply electric field again for 10 minutes, add 400 ml of TE, suspend by pipetting, incubate at 65 ° C for 5 minutes, then rapidly cool for 3 minutes, and then centrifuge at 15000 rpm for 3 minutes at 4 ° C. Transfer the supernatant to a new tube. The sample was transferred and centrifuged at 15000 rpm for 3 minutes at 4 ° C. The supernatant was transferred to a new tube and ethanol precipitated (2M NaoAc1 / 10, 100% Etoh 2.5 times). Thereafter, the pellet was slightly dried, dissolved in dH2O or TE treated with DEPC (diethylpyrocarbonete), and the concentration of poly (A) RNA was measured.
この実験結果、電界を印加した場合は、電界をかけない場合に比べて、２０％以上のポリ（Ａ）ＲＮＡを生成できることを確認できた。 As a result of this experiment, it was confirmed that 20% or more of poly (A) RNA could be generated when an electric field was applied, compared to when no electric field was applied.
ストレス条件下で３h培養した枯草菌から抽出したtotal RNAを用いて、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（poly A polymerase）によってpoly Aを付加させる実験を行った。 Using total RNA extracted from Bacillus subtilis cultured for 3 hours under stress conditions, an experiment was conducted in which poly A was added by poly (A) polymerase (poly A polymerase).
ＲＮＡは8.4μg使用し、poly A polymerase活性測定用反応液として、Takara社のプロトコルに沿って調製した。電界をかけない時に、酵素反応時間を37℃で60分、10mMのATP(アデノシン三リン酸)濃度がpoly A付加反応を、電界を印加した条件と、電界を印加しない条件でそれぞれ行った。 8.4 μg of RNA was used and prepared as a reaction solution for measuring poly A polymerase activity according to Takara's protocol. When no electric field was applied, the enzyme reaction time was 37 minutes at 60 ° C., and a 10 mM ATP (adenosine triphosphate) concentration poly A addition reaction was carried out under conditions where an electric field was applied and conditions where an electric field was not applied.
電界印加条件では、電界を印加しない条件よりも、短時間でpoly A付加反応が終わった。また、付加されたポリ（Ａ）鎖（poly A tail）の長さを調べたところ、電場印加条件でポリ（Ａ）鎖は、電界印加がない時より長いことが分かった。このような電界印加の効果は、ポリ（Ａ）鎖の付加に加え、当該ポリ（Ａ）鎖の伸長も促進させると考えられる。 Under the electric field application condition, the poly A addition reaction was completed in a shorter time than when no electric field was applied. Further, when the length of the added poly (A) chain (poly A tail) was examined, it was found that the poly (A) chain was longer under the electric field application condition than when no electric field was applied. Such an electric field application effect is considered to promote the extension of the poly (A) chain in addition to the addition of the poly (A) chain.
本発明は、様々な生体材料から効率的にポリ（Ａ）ＲＮＡを精製したり、作製したりする技術として利用できる。本発明に係る方法により得られたポリ（Ａ）ＲＮＡは、ノザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解析、ｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮＡクローニングなどの鋳型として利用できる。 The present invention can be used as a technique for efficiently purifying or producing poly (A) RNA from various biomaterials. The poly (A) RNA obtained by the method according to the present invention can be used as a template for Northern blot analysis, RT-PCR analysis, cDNA library preparation, cDNA cloning and the like.
１ ｄＴ鎖
２ ポリ（Ａ）ＲＮＡ
３ ポリ（Ａ）鎖を持たないＲＮＡ
Ｅ 電界
Ｒ 反応場
Ｓ 表面
1
3 RNA without poly (A) chain
E Electric field R Reaction field S Surface
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