JP4742191B2 - 糖蛋白質およびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトなど哺乳類細胞でリソソームへ糖蛋白質が輸送されるための標識マーカーとして機能しうるマンノース-6-リン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
天然界に存在する蛋白質などについては、その糖鎖を除くと本来の生物活性を示さなくなることが明らかにされてきた（木幡陽、蛋白質核酸酵素、36, 775-788 (1991)）。このことから糖鎖が生物活性の発現に重要な役割を担っていることが予想されるが、糖鎖の構造と生物活性との相関が必ずしも明確でないため、蛋白質部分に付加する糖鎖の構造（糖の種類、結合位置、鎖長など）を自由自在に改変制御できる技術の開発が必要となる。
【０００３】
糖蛋白質の糖鎖には、大別して、Asn結合型、ムチン型、O-GlcNAc型、GPIアンカー型、プロテオグリカン型などがあり（竹内誠、グリコバイオロジーシリーズ5、グリコテクノロジー、木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編、講談社サイエンティフィック、 191-208 (1994)）、それぞれ固有の生合成経路をもち、個別の生理機能を担っている。このうち、Asn結合型糖鎖の生合成経路については多くの知見があり、詳しく解析されている。
【０００４】
Asn結合型糖鎖の生合成は、N-アセチルグルコサミン、マンノース、およびグルコースからなる前駆体が脂質キャリアー中間体の上に合成され、まず小胞体（ER）で糖蛋白質の特定の配列（Asn-X-SerまたはThr）に転移される。次にプロセシング（グルコース残基と特定のマンノース残基の切断）を受け、マンノース８残基とN-アセチルグルコサミン２残基からなるM8ハイマンノース型糖鎖（Man8GlcNAc2）が合成される。このハイマンノース型糖鎖を含有する蛋白質はゴルジ体に輸送されて、種々の修飾を受けるが、このゴルジ体での修飾は酵母と哺乳類で大きく異なっている（Kukuruzinska et al., Annu. Rev. Biochem., 56, 915-944 (1987)）。
【０００５】
哺乳類細胞では、糖鎖修飾を受ける蛋白質の種類によって異なる以下の３種の経路をたどる。1)上記のコア糖鎖が何等変化を受けない場合、2)UDP-N-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）のN-アセチルグルコサミン-１-リン酸部分（GlcNAc-1-P）がコア糖鎖のManの６位に付加してMan-6-P-1-GlcNAcとなったのち、このGlcNAc部分だけが除去されて、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質に変換される場合、3)コア糖鎖から５分子のManが順次除去されてMan3GlcNAc2 となり、これと相前後してGlcNAc、ガラクトース（Gal）、Ｎ-アセチルノイラミン酸、別名シアル酸（NeuNAc）などが順次付加して、多様な混成型および複合型糖鎖が混合物として生成する場合の３通りである[R. Kornfeld and S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem., Vol. 54, p.631-664 (1985)]（図１）。従って、哺乳類型糖鎖と言っても構造は多岐にわたりそれらの構造が糖蛋白質の機能に大きく関わっていることが解っている。
【０００６】
一方、酵母では、上記のコア糖鎖(Man8GlcNAc2)にマンノースが数残基から100残基以上付加した、マンナン型糖鎖、いわゆる糖外鎖(outer chain)を生成する他、コア糖鎖部分および糖外鎖部分にマンノース-１-リン酸が付加した酸性糖鎖も生成することがわかっている（図２参照）。この修飾は、動物細胞と異なり、酵母では液胞（動物細胞のリソソームに相当するオルガネラ）局在性糖蛋白質のsorting signalとしては機能しないことが報告されている。従って、酵母におけるこのリン酸化糖鎖の生理機能は不明のままである[Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Biochem., Vol.56, p915-944 (1987)]。
【０００７】
酵母のマンノースリン酸含有糖鎖のリン酸化部位は、図２に示すように、小胞体で合成されるMan8GlcNAc2のコア糖鎖のα-1,3-分岐側とα-1,6-分岐側に付加する場合のほか、ゴルジ体で合成されるマンノース外鎖に多数存在するα-1,2-分岐に付加する場合とマンノース外鎖の非還元末端に付加する場合がある[A. Herscovics and P. Orlean, FASEB J., Vol. 7, p540-550 (1993)]。Saccharomyces属酵母における糖外鎖の生合成は図２に示した経路で進行すると考えられている[Ballou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, p3368 (1990)] 。
【０００８】
すなわち、M8ハイマンノース型糖鎖にまずα-1,6 結合でマンノースが付加する延長開始反応が起こる（図２, 反応I, B）。この反応を行なう酵素はOCH1遺伝子にコードされる蛋白質であることが明らかになっている（Nakayama et al., EMBO J. , 11, 2511-2519 (1992)）。さらにα-1,6結合でマンノースを逐次延長する反応（図２, II）が起こることにより、外糖鎖の骨格となるポリα-1,6結合マンノース結合が形成される（図２, E）。このα-1,6結合のマンノースには、α-1,2結合したマンノースの分岐が存在し（図２：C, F, H)、この枝分かれしたα-1,2結合のマンノースの先には、さらにα-1,3結合したマンノースが付加することがある（図２：D, G, H, I) 。このα-1,3結合のマンノースの付加は、MNN1遺伝子産物によるものである（Nakanishi-Shindo et al., J. Biol. Chem., 268, 26338-26345 (1993)）。またハイマンノース型糖鎖部分（図２, ＊)および外糖鎖部分にマンノース-1-リン酸が付加した酸性糖鎖も生成することがわかっている。この反応はMNN6遺伝子がコードする遺伝子によることがわかり（Wang et al., J. Biol. Chem., 272, 18117-18124 (1997)）、さらにこの転位反応を正に制御する蛋白質をコードする遺伝子（MNN4）も明らかとなった（Odani et al., Glycobiology, 6, 805-810 (1996) ; Odani et al., FEBS letters, 420, 186-190 (1997))。
【０００９】
多くの場合に、外糖鎖は不均質な蛋白質産物を生成し、蛋白質の精製を困難にしたり、比活性を低下させたりする（Bekkers et al., Biochim. Biophys. Acta, 1089, 345-351 (1991)）。さらに糖鎖の構造が大きく異なるため、酵母で生産された糖蛋白質は、哺乳類由来のものと同一の生物活性が検出されなかったり、哺乳類動物などに対して強い免疫原性を有する。例えば、酵母（S. cerevisiae）の場合、MNN1遺伝子により生成するα１，３マンノシド結合は強い免疫原性を有することが知られており（Ballou, C. E., Methods Enzymol., 185, 440-470(1990)）、また酵母は本来マンノース-6-リン酸（Man-6-P）をマンノース-6-リン酸-α-1-マンノース（Man-6-P-1-Man）の形で有しており、そのためMan-6-Pレセプターに結合しないことが報告されている（Kukuruzinska et al., Annu. Rev. Biochem., 56, 915-944 (1987); Faust and Kornfeld, J. Biol. Chem., 264, 479-488 (1989); Tong et al., J. Biol. Chem., 264, 7962-7969 (1989)）。このように、哺乳類由来の有用糖蛋白質を生産させる際の宿主としては、酵母は不適当とされている。哺乳類由来のものと同等の生物活性を持った糖蛋白質、すなわち哺乳類型の糖鎖を含有する糖蛋白質を生産できる酵母の開発が、学会や産業界から望まれている。本発明者らは既にこの外糖鎖を欠損した変異株、及び哺乳類型の糖鎖を含有する酵母の作成に成功している(特願平11-233215)。
【００１０】
また前述のように酵母では、上記のコア糖鎖部分および糖外鎖部分にMNN4遺伝子、及びMNN6遺伝子の作用によるマンノース-１-リン酸が付加した酸性糖鎖も生成する。そのうちコア糖鎖を産生する外糖鎖生合成酵素遺伝子の欠損変異株が生産した糖蛋白質糖鎖には、中性糖鎖（図３、構造式I）のほかに、酸性糖鎖（図３、構造式II〜IV）が含まれることが解っている（第１２回バイオテクノロジーシンポジウム予稿集、p.153-157、平成６年１０月１４日発行、バイオテクノロジー開発技術研究組合）。
【００１１】
この酸性糖鎖はヒトなど哺乳類由来の糖鎖には存在しない構造である。すなわち、哺乳類細胞では、マンノース-１-リン酸ではなく、Ｎ-アセチルグルコサミン-1-リン酸が付加したのち、Ｎ-アセチルグルコサミン部分だけがさらに除去されて、最終的に図１中、＊で示した記載の酸性糖鎖になる。下記のようにこの糖鎖は哺乳動物細胞ではリソソーム輸送シグナルとして機能することがMethods in Enzymology, 〔Vol.185, p.440-470 (1990)〕に記載されている。
【００１２】
ところで細胞内小器官のひとつであるリソソームには、数多くの酸性加水分解酵素が存在し、細胞内外からリソソームに取り込まれた物質の分解を担っている。 ヒトリソソームに局在する酵素群の多くは、生合成されゴルジ体に輸送されると、そのハイマンノース型糖鎖の非還元末端のマンノース残基の6位にリン酸基が付加、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質に変換され、これがリソソーム酵素特異的な認識マーカーとなる。そしてその高親和性受容体であるマンノース-6-リン酸受容体（MPR）との結合を介して、他の蛋白質から選別され、プレリソソームへ運ばれ、酸性条件下でMPRから解離した後、さらにリソソームへと輸送される（von Figura and Hasilik, Annu. Rev. Biochem., 54, 167-193 (1984) ）。マンノース-6-リン酸受容体（MPR）との結合にはマンノース-6-リン酸を１本の糖鎖内に１分子以上含むことが必要である。このリソソーム酵素特異的なリン酸基の付加反応は、2種の酵素反応により行なわれている。W. Canfieldらはマンノース-６-リン酸合成に関与する２種の酵素（GlcNAc-phosphotransferase、GlcNAc-phosphodiester-GlcNAc'ase）の遺伝子クローニングに成功している（Abstract of the XV International Symposium on Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal Vol. 16 No. 4/5 S41 (1999)）。
【００１３】
これらのリソソーム酵素、前述のリン酸基の付加反応に関与する酵素、または酵素の活性化および安定化に関与する因子の遺伝的欠陥により、酵素反応が進行せず、細胞内に基質が蓄積して起こる一連の疾患群が「リソソーム病」と呼ばれている（Leroy and DeMars, Science, 157, 804-806 (1967)）。リソソーム病に関しては、ヒトでは30種類以上のものが知られており、小児科や内科領域で重要な疾患群のひとつとなっている。これらの疾患に対する根本的治療法の開発については、骨髄移植、遺伝子治療等が試みられてきた。またリソソーム酵素を用いた酵素補填療法が以前より試されているが、その際に標的臓器への取り込みが大きな障害になっており、今のところ、ゴーシェ（Gaucher）病に対する酵素補充療法以外良好な成績は収めていない。
【００１４】
ゴーシェ病はリソソーム酵素の１つであるグルコシルセラミドの分解酵素グルコセレブロシダーゼの遺伝子変異により、主に骨髄のマクロファージ由来の細胞にその基質であるグルコシルセラミドが蓄積して、著明な肝脾腫のほかに貧血、出血等の造血障害を伴う疾患である。前述のように本疾患の治療法として酵素補填療法が行われており、高い治療成績を収めているが、一方で本療法は一生涯継続しなければならず、酵素製剤が非常に高価であるなどの問題点もある。このグルコセレブロシダーゼ製剤はCHO細胞で生産されたヒト組換えグルコセレブロシダーゼの糖鎖の末端を、マンノースを露出させた形に修飾したものである。本疾患は主な罹患細胞がマクロファージであるため、グルコセレブロシダーゼはマクロファージ上のマンノース受容体を介して細胞内に取り込まれた後にリソソームへ運搬されるようである。グルコセレブロシダーゼは、その糖鎖にマンノース-6-リン酸を持たないにも関わらずリソソームへ輸送されることが知られている。よって本酵素はマンノース-6-リン酸受容体（MPR）非依存性輸送機構によりリソソームへ輸送されていると考えられる。
【００１５】
しかしながら、他のリソソーム疾患の多くは、その欠損酵素のリソソームへの輸送がマンノース-6-リン酸受容体を介した系であるので、酵素補填療法に用いるリソソーム酵素はマンノース-6-リン酸受容体（MPR）との結合に必要なリソソーム移行シグナルであるマンノース-6-リン酸を含む糖鎖をもっていることが必要である。よってこれらのリソソーム酵素の糖鎖へのマンノース-6-リン酸の付加がキーとなる。
【００１６】
現在、リソソーム酵素は、胎盤から精製する方法、繊維芽細胞、メラノーマ細胞等の培養細胞を利用した生産法、昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞等の培養細胞を用いた組換え法、トランスジェニックウサギの乳から得る方法が報告されているが、１）リン酸が付加した糖鎖を有するリソソーム酵素の含有量が低いためリソソームへの取り込み効率が悪い、２）生産性が低く、培養コストが高い。このため１）大量投与が必要で、２）治療コストがかかるなどの問題点がある。また酵母細胞を用いた組換え法による生産例はない。よってマンノース-6-リン酸を糖鎖に含むリソソームへの取り込み活性の高い酵素が求められている。
【００１７】
一方、リソソーム病の一種であるファブリー（Fabry）病は、α-ガラクトシダーゼの活性が低下し、生体内基質であるグロボトリオシルセラミドが体内に蓄積するX染色体の遺伝病である。典型的な経過をとる「古典型」ファブリー病患者は、少年期から青年期に、四肢疼痛、被角血管腫や低汗症が出現し、年齢が進むと腎障害や心および脳血管障害を起こす。近年、比較的軽症で、壮年期以後に心筋障害を主微とする「亜型」ファブリー病の存在が知られるようになり、これらの患者が「心筋症」を擬診される患者群の中に隠れていることが報告されて、注目されている。
【００１８】
α-ガラクトシダーゼは前述のグルコセレブロシダーゼと異なり、マンノース-6-リン酸受容体を介した系でリソソームに輸送される。よって標的細胞に効率的に取り込ませるためにはマンノース-6-リン酸を含有する糖鎖を有することが必要である。しかしながらマンノース-6-リン酸を含有する糖鎖を持つα-ガラクトシダーゼを治療用途として用いる程の高純度の標品を大量に生産する技術は存在しなかった。例えば、ヒトに投与し、１０人中９人で酵素補填療法としての優位性が確認された、線維芽細胞由来の糖蛋白質（α-ガラクトシダーゼ）の糖鎖は、マンノース-6-リン酸型糖鎖の割合が２０％程度であるとされている（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 97:365-370 (2000)）。
【００１９】
以上のように、酵母と哺乳類細胞では蛋白質に付加する糖鎖の構造が大きく異なるため、遺伝子工学的手法により酵母でヒトなど哺乳類由来の有用糖蛋白質を生産させても、哺乳類由来のものと同一の生物活性が検出されなかったり、糖鎖の違いによる抗原性の相違などが指摘されている。このため、哺乳類由来の糖蛋白質を酵母で生産させることは従来困難であった。またヒトおよび他の哺乳類細胞において付加されるのと同一の糖鎖構造をもつ、有用なリン酸含有酸性糖鎖はヒトなど哺乳類細胞でリソソームへ糖蛋白質が輸送されるための標識マーカーとして機能しており有益であるが、これらの酸性糖鎖を含有する糖蛋白質を均一かつ多量に供給することは現状では困難である。したがって、このような技術の開発が望まれるところである。
【００２０】
本発明者らは糖鎖合成変異株（Δ OCH1 mnn1）を用いて糖蛋白質を生産させ、これにMNN6遺伝子産物を生体内または生体外で働かせることにより、マンノース-１-リン酸が付加した酸性糖鎖を得て、これを酸処理することによりリソソーム輸送シグナルとして有効な哺乳類と同様な糖鎖を得る方法を提案している（特開平9-135689）。しかしこの方法では極度の変性条件下（0.01Ｎ塩酸中、100℃、30分間）におくため殆どの糖蛋白質は変性してしまう。よって生理活性を有する糖蛋白質を得る方法としては十分なものではなかった。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、酵母での糖蛋白質の生産における上記の問題を克服し、ヒトおよび他の哺乳類細胞において付加されるのと同一の糖鎖構造をもつ、有用なリン酸含有酸性糖鎖、および該糖鎖を含有する糖蛋白質を、酵母を用いて製造する方法を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、糖鎖生合成酵母変異株を用いてリン酸含有糖鎖を多く有する糖蛋白質を得、これにα-マンノシダーゼを作用させることにより、抗原性を持たず、ヒトをはじめとする哺乳類細胞のリソソームへ輸送されるための標識マーカーとして機能しうるマンノース-6-リン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質を多量に、純度よく、かつ生理活性を保持した状態で製造できることを見いだした。またこのリン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質がヒトのリソソーム酵素の欠損症の治療などに有効な薬剤として利用できることを見いだし、発明を完成するに至った。
【００２３】
すなわち、本発明は、高リン酸化コア糖鎖を産生する糖鎖生合成変異酵母株を用いて、これに目的の糖蛋白質をコードする遺伝子を導入発現させ、得られたマンノース-１-リン酸付加酸性糖鎖含有糖蛋白質をα-マンノシダーゼ処理によってマンノース部分を切除することを特徴とするマンノース-６-リン酸含有糖鎖含有糖蛋白質の製造方法である。
【００２４】
また本発明の酵母を用いた生産法により製造されるリン酸含有酸性糖鎖を有するヒトのリソソーム酵素をはじめとする糖蛋白質である。
更に本発明により生産されたヒトのリソソーム酵素を用いたリソソーム病治療組成物である。
【００２５】
より具体的には、本発明は以下の（１）〜（２７）を提供する。
（１） 酵母を用いて、マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有する酸性糖鎖を有する活性型糖蛋白質を製造する方法。
（２） マンノース-6-リン酸含有酸性糖鎖がマンノース-6-リン酸レセプターと結合し得る糖鎖である上記（１）に記載の方法。
（３） 酵母を用いて、下記構造式I〜VIIIに示す、マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有するハイマンノース型糖鎖を有する活性型糖蛋白質を製造する方法。
【００２６】
【化３】
【００２７】
（４） 酵母が酸性糖鎖を含み、かつ少なくともα-1,6マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊した酵母株を用いることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 酵母が酸性糖鎖を含み、かつ少なくともα-1,6マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びα-1,3マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊した酵母
【００２８】
株を用いることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６） α-1,6マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子がS. cerevisiae におけるOCH1遺伝子であり、α-1,3マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子がS. cerevisiae におけるMNN1遺伝子である上記（４）または（５）に記載の方法。
（７） 酵母が高リン酸化糖鎖含有変異株である上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【００２９】
（８） 酵母がS. cerevisiae HPY21株である上記（７）に記載の方法。
（９） マンノース-6-リン酸含有酸性糖鎖を有する活性型糖蛋白質がリソソーム酵素である上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０） リソソーム酵素がα-ガラクトシダーゼである上記（９）に記載の方法。
【００３０】
（１１） α-ガラクトシダーゼの構造遺伝子がヒト由来遺伝子である上記（１０）に記載の方法。
（１２） α-ガラクトシダーゼの構造遺伝子が配列番号５に示される塩基配列を有するものである、上記（１１）に記載の方法。
（１３） α-ガラクトシダーゼを生産する酵母がHPY21G株である上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
【００３１】
（１４） 上記（４）〜（８）のいずれかに記載の酵母にて産生された糖蛋白質にα-マンノシダーゼを作用させ、糖鎖中のマンノース-1-リン酸結合のマンノース残基を除去することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（１５） α-マンノシダーゼがマンノース-1-リン酸結合のマンノース残基を除去する活性を有するものである上記（１４）に記載の方法。
【００３２】
（１６） α-マンノシダーゼがα-1,2マンノシド結合、α-1,3マンノシド結合、α-1,6マンノシド結合を非特異的に分解する活性を有するものである上記（１４）または（１５）に記載の方法。
（１７） α-マンノシダーゼ活性がエキソ型活性であり、エンド型活性はないものである、上記（１６）に記載の方法。
（１８） Cellulomonas属細菌由来のα-マンノシダーゼである上記（１７）に記載の方法。
【００３３】
（１９） Cellulomonas属細菌がCellulomonas SO-5である、上記（１８）記載の方法。
（２０） 酵母により作られるマンノース-6-リン酸を非還元末端に含有する酸性糖鎖を有する糖蛋白質。
（２１） リソソーム酵素である、上記（２０）に記載の糖蛋白質。
（２２） 上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の方法によって生産される上記（２０）または（２１）に記載の糖蛋白質。
【００３４】
（２３） α-ガラクトシダーゼである上記（２１）または（２２）に記載の糖蛋白質。
（２４） ヒト由来遺伝子によってコードされたα-ガラクトシダーゼである上記（２３）に記載の糖蛋白質。
（２５） 下記構造式I〜VIIIに示す、マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有するハイマンノース型糖鎖構造を持つ糖鎖を含有する上記（２０）に記載の糖蛋白質。
【００３５】
【化４】
【００３６】
（２６） 上記（２０）〜（２５）のいずれかに記載の糖蛋白質を含有することを特徴とする、リソソーム病の治療および／または予防のための医薬組成物。
（２７） 糖蛋白質がヒトα−ガラクトシダーゼである、ファブリー病治療のための上記（２６）に記載の医薬組成物。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３７】
【発明を実施するための形態】
本発明におけるリソソームへ輸送されるための標識マーカーとして機能しうるリン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質の製造法は基本的には下記の工程よりなる。
１）リン酸化コア糖鎖を産生する糖鎖生合成変異酵母株を用いて、これに目的の糖蛋白質をコードする遺伝子を導入しマンノース-１-リン酸付加酸性糖鎖含有糖蛋白質を発現させる工程。
２）得られたマンノース-１-リン酸付加酸性糖鎖含有糖蛋白質をα-マンノシダーゼ処理によってマンノース部分を切除し、マンノース-６-リン酸含有糖鎖含有糖蛋白質を生成させる工程。
【００３８】
本発明における、酵母特有の外糖鎖生合成系遺伝子が破壊された酵母変異株は以下のようにして作製することができる。まず、標的遺伝子の破壊に必要なDNA遺伝子断片の単離は、Saccharomyces cerevisiaeのゲノムプロジェクトにより、いずれもその染色体上の配座が既知である（Goffeau et al., Nature, 387 (suppl.), 1-105 (1997)) ことから、米国ATCC（American Type Culture Collection）など公的な機関から標的遺伝子の近傍を含む遺伝子断片の分与を受けることが可能である（ATCC Recombinant DNA materials, 3rd edition, 1993）。また、一般的手法にしたがってS. cerevisiaeからゲノムDNAを抽出し、目的遺伝子を選別することにより得ることも可能である。上記において、S. cerevisiaeからのゲノムDNAの抽出は、例えば、Cryer らの方法（Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975) ）およびP. Philippsenらの方法（Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991) ）に従って行なうことができる。
【００３９】
標的遺伝子は、ＰＣＲ法により増幅させてから遺伝子破壊を行なう。PCR法は、インビトロ（in vitro）でDNAの特定断片をその領域の両端のセンス・アンチセンスプライマー、耐熱性DNAポリメラーゼ、DNA増幅システム等の組み合わせを用いて約２-３時間で数十万倍以上に増幅できる技術であるが、標的遺伝子の増幅には、プライマーとして25-30merの合成1本鎖DNAを、鋳型としてゲノムDNAを用いる。
【００４０】
本発明において標的遺伝子の破壊は、Rothstein, Methods Enzymol., 101, 202-211 (1983)に開示される方法に基本的に従って行いうる。本方法は、まず、プラスミド上の標的遺伝子DNAを分断あるいは部分欠失させ、そこに適当な選択マーカー遺伝子DNAを挿入して標的遺伝子の上流部と下流部の間に選択マーカーがサンドイッチされた構造体を作製し、次に、この構造体を酵母細胞に導入する。以上の操作により、導入断片（選択マーカーを挟み込んだDNA構造体）の両端と染色体上の標的遺伝子との相同部分の間で２回の組み換えを起こし、染色体上の標的遺伝子が導入断片で置換される。
【００４１】
具体的に、OCH1遺伝子破壊株の作製を例にとり説明する。Alaniらによって構築された、サルモネラ菌のhisG遺伝子DNA断片がURA3遺伝子の両端に結合されているプラスミド（Alani et al., Genetics, 116, 541-545 (1987))からhisG-URA3-hisGのカセットを制限酵素で切りだし、プラスミド上の標的遺伝子に挿入し、破壊された対立遺伝子を構築する。このプラスミドを用いて染色体の標的遺伝子と置換して遺伝子破壊株を得る。染色体に挿入されたURA ３遺伝子はhisGではさまれており、hisG配列間での相同的組み換えにより１コピーのhisGとともに染色体から脱落する。染色体上の標的遺伝子にはなおも１コピーのhisG断片が残り破壊されたままであるが、宿主細胞はUra-表現形となる。このhisG間での相同的組み換えは5-フルオロオロト酸（5-FOA）により行なうことができる。ura3変異株は5-FOAに耐性であり（Boeke et al., Mol. Gen. Genet., 197, 345-346 (1984); Boeke et al., Methods Enzymol., 154, 165-174 (1987)）、Ura3+表現形を持つ細胞株は5-FOA培地に生育できなくなる。よって、5-FOAを加えた培地で耐性形質をもつ株を分離すれば、再びURA3マーカーを用いての操作が可能である。
【００４２】
以下、このOCH1遺伝子破壊株に、同様な手法にてMNN1遺伝子を遺伝子破壊を行うことにより、目的とする二重変異株（Δ och1 Δ mnn1) を得ることができる。
酵母の△ och1変異株は糖蛋白質のコア糖鎖にマンノース外鎖付加に必要な最初のα-1,6結合したマンノースを付加する反応が、またΔ mnn1変異株はコア糖鎖および外糖鎖分枝の非還元末端にα-1,3結合したマンノースを付加する反応が、各々欠損している。これらの変異を両方もつ二重変異株（△ och1 Δ mnn1 ）は、既に発明者らが提案（特許3091851）したように、Man8GlcNAc2の中性コア糖鎖を生産すると共に、この中性糖鎖以外に、マンノース-1-リン酸を含む酸性糖鎖も副生する（第１２回バイオテクノロジーシンポジウム予稿集、p.153-157、平成６年１０月１４日発行、バイオテクノロジー開発技術研究組合発行）。
【００４３】
また本発明に利用される酵母株として、マンノース-6-リン酸を含有する糖鎖を有することが必要である。この糖鎖は酵母においてもかなり普遍的に存在することが知られている。この糖鎖の生成に関与する遺伝子としてはSaccharomyces cerevisiaeにおいて図２に示される糖鎖構造式の*印の付されたマンノースの6位にマンノース-1-リン酸の付加反応を触媒する遺伝子（MNN6）と、このマンノース-1-リン酸の付加を制御する遺伝子（MNN4）が該当する。
【００４４】
リン酸含有糖鎖は対数増殖期より培養後期（定常期）に多く検出される。これはマンノース-1-リン酸の付加を制御する遺伝子（MNN4）の発現パターンと一致している。MNN4、MNN6遺伝子の発現を増強することにより、マンノース-6-リン酸を含有する糖鎖を多く含む酵母を育種することができると考えられる。
【００４５】
Saccharomyces cerevisiae KK4株はMNN4遺伝子のプロモーター部分に変異がかかっており、MNN4遺伝子が構成的に発現している株である。よってリン酸付加糖鎖を多く含有する。マンノース-6-リン酸を含有する糖蛋白質を生産するにはふさわしいと考えられる。
【００４６】
上記操作における、DNAの細胞への導入およびこれによる形質転換の方法としては、一般的な方法、例えば、ベクターとしてファージを用いる場合は、大腸菌宿主にこれを感染させる方法等により、効率よく宿主にDNAを取り込ませることができる。またプラスミドを用いて酵母を形質転換する方法としては、リチウム塩で処理して自然にDNAを取込みやすい状態にしてプラスミドを取り込ませる方法や、あるいは電気的にDNAを細胞内に導入する方法を採用できる（Becker and Guarente, Methods Enzymol., 194, 182-187 (1991)）。
【００４７】
また、上記操作における、DNAの単離・精製等は何れも常法、例えば大腸菌の場合、アルカリ/SDS法とエタノール沈殿によるDNA抽出、さらにRNase処理、PEG沈殿法などによりDNAを精製できる。また、遺伝子のDNA配列の決定等も通常の方法、例えばジデオキシ法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)）等により行なうことができる。さらに、上記DNA塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによっても容易に行ない得る。
【００４８】
さらに、上記の糖鎖を持つ異種生物由来の糖蛋白質を生産させるためには、上記酵母変異株を宿主として、目的の糖蛋白質をコードする遺伝子（cDNAなど）を酵母で発現出来るプロモーターの下流に接続した遺伝子を作製し、相同組換えによって上記酵母宿主に組み込むか、或いは、プラスミドに挿入して上記宿主を形質転換することにより、上記宿主の形質転換体を作製し、これを公知の方法により培養することにより、酵母細胞内または細胞外に生産された目的の糖蛋白質を回収できる。
【００４９】
その際の目的の糖蛋白質をコードする遺伝子は翻訳されるアミノ酸配列が同一であればよい。ヒトは酵母と比較しコドンユーセージが異なるため、ヒト由来遺伝子は酵母内での発現が低いことが多い。よって遺伝子を酵母型のコドンユーセージに変換した遺伝子を合成し用いることにより、高発現が期待される。用いる遺伝子は基本的にヒト由来酵素と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子である必要がある。つまり他種の酵素である場合、抗原性を有することが懸念されるためである。
【００５０】
上記の酵母変異株の培養は、酵母の培養に慣用される常法に従って行なうことができる。例えば、Difco社から供給される各種の培地成分を添加し、かつプラスミドの複製・保持に必要なマーカーによって供給可能となるアミノ酸を除いた合成培地（炭素源、窒素源、無機塩類、アミノ酸、ビタミン等を含む）等を利用できる（Sherman, Methods Enzymol., 194, 3-57 (1991)）。外来遺伝子をプラスミド上ではなく染色体に組み込んだ場合には、遺伝子が脱落することはないので、通常の栄養源が豊富な培地によって培養することができる。
【００５１】
上記の培養物（培養液、培養菌体）から糖蛋白質を単離精製するためには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。例えば、菌体内に存在する糖蛋白質については培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得、これを遠心分離することにより上清を得る。一方培養上清に存在する糖蛋白質については培養終了後、細胞を遠心分離により分離し、限外ろ過、塩析法等により濃縮する。以降の操作は通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）セファロース等を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、スルホプロピル（SP）セファロース（ファルマシア社製）等を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、フェニルセファロース等を用いた疎水性クロマトグラフィー法、セファクリル等を用いた分子篩を用いたゲルろ過法、群特異性担体、レクチンリガンド、金属キレートなどを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００５２】
本発明においてはアフィニティー・クロマトグラフィーを用いることによりリン酸化糖鎖を有するα-ガラクトシダーゼとリン酸化糖鎖を持たないα-ガラクトシダーゼとを分離することにも成功した。つまりブルーセファロース・クロマトグラフィーを用いることにより目的の糖蛋白質の分離に成功した。ブルーセファロースに用いられるアフィニティーリガンドはクロロトリアジン色素の一種であるシバクロンブルーF3GAであり、このようなリン酸化糖鎖を分離できるような色素をリガンドとしたアフィニティー・クロマトグラフィーにてマンノース-6-リン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質を精製する方法も応用できるであろう。
【００５３】
またリン酸による糖鎖の荷電の差を利用し、イオン交換、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動本発明を用いることにより、マンノース-6-リン酸含有糖鎖を有する糖蛋白質、より詳しくは下記の酵母特有のマンノース-1-リン酸中のマンノースが除去された糖蛋白質を精製、濃縮することができる。
【００５４】
さらにマンノース認識レクチンとして知られるConcanavalin A（ConA）の結合特異性の差を利用することにより、すなわち、リン酸を含まない糖鎖を有する酵母由来の糖蛋白質はα-マンノシダーゼによって糖鎖が切断され、ConAへの結合性が低下、あるいは欠損する。一方、リン酸を含有する糖鎖の場合、マンノース-6-リン酸を基質として認識しないため、糖鎖の削り込みがそれ以上行なわれず、ConAへの結合性が低下しない。これを利用することによりより生物的に高活性、すなわち細胞への取り込み活性が高い、より詳しくはマンノース-6-リン酸受容体への結合活性の高い、リソソーム酵素標品のみを得ることができ、高機能医薬品としての応用が期待できる。
【００５５】
本発明における酵母特有のマンノース除去に使用されるα-マンノシダーゼはマンノース-1-リン酸結合を分解し、エキソ型に作用し、糖蛋白質に作用し、かつ処理する糖蛋白質が安定なｐＨ域で作用するものであれば特に限定しない。これらのα-マンノシダーゼはα-1,2、α-1,3、α-1,6結合等のマンノシド結合に作用する他、p-ニトロフェニル-α-マンノピラノシドや4-メチルウンベリフェニル-α-マンノシピラノシド等の合成基質にも作用する等、幅広い基質特異性を有するものである。そのようなα-マンノシダーゼとしては、タチナタマメ（Jack Bean）α-マンノシダーゼ、酵母液泡由来マンノシダーゼ等が利用できると考えられる。しかし、タチナタマメ由来のα-マンノシダーゼは糖蛋白質の糖鎖そのものに対しては比較的酵素活性が弱く、長時間の反応が必要であり、また弱酸性側に至適ｐＨを有する（ｐＨ＝４．５）ため、弱酸性側で不安定な蛋白質は失活する恐れがあるため、糖蛋白質の糖鎖部分を除去した構造安定的な蛋白質の回収には不適と思われる。そこで更に酵素活性が強く、精製も容易であり、かつ糖蛋白質が安定な中性のｐＨで作用できる新規のα-マンノシダーゼが必要となってくる。本発明者等により取得されたCellulomonas SO-5株の生産するα-マンノシダーゼは上記の条件を満たし、本発明に有効な酵素と言えるであろう。尚、上記Cellulomonas SO-5株は、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１ 中央第６ 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに2001年６月１２日付けでFERM BP-7628という受託番号で国際寄託されている。
【００５６】
また本発明における酵素生産酵母は、最終的にα-マンノシダーゼ処理によって、マンノース-6-リン酸が生成し、かつ抗原性のない糖鎖を生産できるものであれば特に限定しない。例えば、Pichia pastorisはマンノース-1-リン酸含有糖鎖を有する糖蛋白質を生産するメタノール酵母であり、α-マンノシダーゼ処理によって出芽酵母由来のものと同等の糖鎖となることが期待できる。
【００５７】
さらに本発明で生産されるリソソーム酵素は、α-ガラクトシダーゼに限定されるものではない。例えば、Tay-Sachs病の治療薬となるb-ヘキソサミニダーゼ A、Sandhoff病の治療薬となるb-ヘキソサミニダーゼA及びB、Krabbe病の治療薬となるガラクトセレブロシダーゼ、Hurler病の治療薬となるa-イズロニダーゼ、Sly病の治療薬であるb-グルクロニダーゼ、フコシドーシスの治療薬であるa-フコシダーゼ、Schindler病・神崎病の治療薬であるa-N-アセチルガラクトサミニダーゼなどの遺伝子を同様に発現、精製することで各種リソソーム病の治療及び／または予防のための医薬として応用できる。
【００５８】
α-ガラクトシダーゼの場合、治療用途としての使用法は、治療に必要な量のα-ガラクトシダーゼを与えることによってファブリー病の治療に用いられる。この場合治療に必要な量とはファブリー病の症状を顕著に緩和させるα-ガラクトシダーゼの量である。α-ガラクトシダーゼは本発明の様に、マンノース-6-リン酸含有糖鎖を少なくとも１つ以上有し、ヒトマンノース-6-リン酸受容体に結合する活性を持つものである。α-ガラクトシダーゼは標準的な医療上許容しうる安定化剤、等張液等を含有した医薬組成物として投与され、たとえば静脈内注射により常法で投与される。本発明により生産されるα-ガラクトシダーゼはヒト組織から得られる精製酵素標品、動物培養細胞、トランスジェニック動物などによって生産される組換え酵素標品と比較して、マンノース-6-リン酸含有糖鎖を同等以上含有するので、より少ない投与量で効果を発揮することができ、かつヒト、動物組織を用いた医薬品で問題となるウイルス等の混入もないので安全かつ高機能の医薬組成物を提供できる。
【００５９】
本発明において、医薬組成物は、本発明の糖蛋白質の他、製薬上許容し得る安定化剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、嬌味剤、着色剤、香料等を適宜添加して、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の剤形にすることができる。また、本発明における医薬組成物の投与形態は、経口投与、あるいは静脈内注射、筋肉内注射等の非経口投与の何れでも良い。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路等により異なるが、通常成人一人あたり、有効成分の量として、経口投与の場合には1回に１〜１０mgの範囲で、非経口投与の場合には１回に１０〜５０mgの範囲で投与することが望ましい。
【００６０】
また本発明はリソソーム病治療薬に限らず、リソソームへ糖蛋白質を輸送させるための技術として利用可能である。これを利用して、リソソーム酵素の輸送機構や、リソソーム内での老廃物分解のメカニズムの解明が可能になり、この分野の研究の発展が期待される。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。
〔実施例１〕高リン酸化糖鎖含有糖鎖生合成二重変異酵母株（Saccharomyces cerevisiae Δ och1 Δ mnn1 株) の作製
すでに報告のあるpNK51(Alani et al., Genetics, 116, 541-545 (1987))より、URA3遺伝子の両端にサルモネラ菌hisG遺伝子がダイレクトリピートで結合しているカセット（HUH）をBglIIとBamHIで切断し、大腸菌プラスミドpSP73のBamHI部位に挿入した。このプラスミドをpSP73-HUHと命名した。
【００６２】
OCH1遺伝子は、酵母第７番染色体に位置し、OCH1遺伝子のDNA塩基配列は、GenBankデータベースにD11095で登録されている（Nakayama et al., EMBO J., 11, 2511-2519 (1992)）。すでに構築されているOCH1遺伝子破壊用ベクターpoch1::LEU2-1（Nakayama et al., EMBO J., 11, 2511-2519 (1992)）をSalIおよびHindIIIで切断することによりΔ och1::LEU2 を含む領域を切り出し、これを用いて高リン酸化糖鎖産生酵母であるSaccharomyces cerevisiae KK4株（MATa ura3 his1 or his3 trp1 leu2 gal80 ; Nogi et al., Mol. Gen. Genet., 195, 29-34 (1984)）を酢酸リチウム法（Ito et al., J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)）で形質転換した。Δ och1破壊を含む株は低浸透圧感受性を示すため、0.3 M KClを含むSD-Ura（2％グルコース、0.67 % Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco社製）、ウラシルを除く核酸塩基、およびアミノ酸混合物（20-400 mg/L））培地のプレートにまいて、30℃で2日間培養し、形質転換体を得た。
形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法によりウラシルマーカーがΔ och1領域の染色体に組込まれていることを確認し、HPY11株とした。
【００６３】
一方MNN1遺伝子は、酵母第５番染色体動原体近傍に位置し、MNN1遺伝子のDNA塩基配列は、GenBankデータベースにL23753で登録されている(Yip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9, 2723-2727 (1994))。MNN1遺伝子の３’領域をプライマーA(GGATCCGAAGAAAACCTAATACATTGAAGT：配列番号１)とプライマーB(GCATGCCCTTTGGTTTAATATAAATCTCCGGAGTGC：配列番号２)を用いて、また、５’領域をプライマーC(GCATGCTACATAACTCCAATCAGCAGCAAATATGTC：配列番号３)とプライマーD(GCGGCCGCGTGTTCTGTTCGGGTAACGTTTAAACCAAT：配列番号４)を用いて、それぞれPCRで増幅した。これらのDNA断片をHIS3マーカーを持つプラスミドpHYHのSphI部位に組込み、pHYHΔmnn1を作製した。MNN1遺伝子をHUHカセットを用いて破壊するために、1.8ｋｂのSph I断片をpHYHΔmnn1より取得しpSP73-HUHのSph I部位に挿入したpSP73-Δmnn1::HUHを構築した。本プラスミドをNot I部位で切断することにより直鎖化し、HPY11株を酢酸リチウム法を用いて形質転換した。形質転換後、0.3 M KClを含むSD-Ura培地のプレートにまいて、30℃で2日間培養し、形質転換体を得た。
【００６４】
形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法によりウラシルマーカーがMNN1領域の染色体に組込まれていることを確認し、HPY22株とした。本株を、0.3 M KClと5-FOAを含有したYSD 培地（1%酵母抽出液、2%グルコース、アデニン (40 mg/L)、ウラシル(20mg/L)） にて選抜を行ない、URA3遺伝子脱落株を得た。上記の方法と同様にPCR法を用いてURA3遺伝子を脱落させたmnn1破壊株を確認した。Δ och1::LEU2 Δ mnn1::hisGを含む本株を、高リン酸化糖鎖含有二重変異酵母株Saccharomyces cerevisiae HPY21株とした。
【００６５】
〔実施例2〕 Δ och1 Δ mnn1二重破壊株へのα-ガラクトシダーゼ
遺伝子の導入
ヒトα-ガラクトシダーゼ 遺伝子配列は、 GenBankデータベースにNM000169で登録されている（Nucleic Acids Res. 17 (8), 3301-3302 (1989)）。 すでに報告されているpCXN2（Ishii et al., Hum. Genet. 89, 29-32 (1992)）よりEcoRIで切断し、ヒトα-ガラクトシダーゼのcDNA領域（-16〜+1290；配列番号５）を切り出した。次に酵母での発現を行うため、酵母発現ベクターであるプラスミドYEp352-GAPのEcoRI部位に挿入した。このプラスミドをYEp352-GAP-GLNと命名した。次にこのプラスミドからBamHIでプロモーター、ターミネーター領域を含むヒトα-ガラクトシダーゼのcDNA領域を切り出し、インテグレーションベクターであるpRS404のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpRS-GLN-4をBst1107Iで切断後、実施例1で作成したS. cerevisiae HPY21株を形質転換した。形質転換は酢酸リチウム法を用いて行なった。形質転換後、0.3 M KClを含むSD-Trp（2％ グルコース、0.67 % Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco社製)、トリプトファンを除く核酸塩基およびアミノ酸混合物（20-400 mg/L））培地のプレートにまいて、30℃で2日間培養し、形質転換体S. cerevisiae HPY21G 株 を得た。
【００６６】
次にS. cerevisiae HPY21G株を5 mlの0.3MのKClを含むYPAD培地（2% ポリペプトン、1% 酵母抽出液、2% グルコース、アデニン (40 mg/L)）で30℃で３日間培養後、遠心分離により培養上清を得た。限外ろ過膜（ウルトラフリーC3LGC (分子量10000カット)、ミリポア社）にて約5倍に濃縮したものを粗酵素液とした。粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法にてウエスタンブロット解析を行なった。ウエスタンブロット解析は一次抗体としてウサギ抗α-ガラクトシダーゼ抗体を、二次抗体として抗ウサギIg抗体アルカリフォスファターゼ複合体を用い、検出はCDP-Starシステム（Pierce社）を用いてX線フィルムに露光することで行なった。
その結果、コントロール株であるHPY21株ではシグナルが全く見られないのに対し、HPY21G株で形質転換したものの培養上清には、分子量約50 kDaの位置にシグナルが確認された（図５）。
【００６７】
次に粗酵素液中のα-ガラクトシダーゼ の酵素活性を測定した。5mMの4-メチルウンベリフェリル-D-ガラクトピラノシドが入った0.15M酢酸緩衝液（pH4.6）60μlに酵素液10μlを加え、３７℃にて３０分間反応させた。これに0.2Mグリシン/水酸化ナトリウム緩衝液（pH10.7）700μlを加え、反応を停止した。これを蛍光光度計（Ex:365nm, Em:450nm）にて測定した。その結果、HPY21G株の粗酵素液を酵素源とした場合、コントロールであるHPY21株の粗酵素液と比較し蛍光が明らかに増加していた（表1）。
【００６８】
【表１】
【００６９】
〔実施例３〕 α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した株の培養上清からのα-ガラクトシダーゼの精製、及び精製酵素の糖鎖構造解析
α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したHPY21G株の培養、粗酵素液の調製は実施例２に準じて行った。粗酵素液をpH 4.5に調整し、ブルー・セファロースCL-6B（ファルマシア社）カラムクロマトグラフィーに供した。酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）にて洗浄後、4 M NaClを含むMES緩衝液（pH 6.0）にて溶出した。各画分の酵素活性を測定した結果、α-ガラクトシダーゼ活性はカラム素通り画分にも、溶出画分にも存在した。それぞれの画分をCon Aセファロースに供した。0.15 M塩化ナトリウム、0.5 mM塩化カルシウム、0.5 mM塩化マンガンを含むMES緩衝液（pH 6.0）にて洗浄後、0.15 M塩化ナトリウム、0.5 mM塩化カルシウム、0.5 mM塩化マンガン及び0.2 Mのα-メチルマンノシドを含むMES緩衝液（pH 6.0）にてα-ガラクトシダーゼを溶出した。溶出画分をさらにMonoQに供した。MES緩衝液（pH 6.0）にて洗浄後、1 M NaClを含むMES緩衝液でグラジエント溶出を行なった。酵素活性の強い画分を透析後、濃縮し精製α-ガラクトシダーゼ標品を得た。
【００７０】
得られたα-ガラクトシダーゼに対し、酵素処理を施しアスパラギン結合型糖鎖を切り出した。凍結乾燥品を100μlのN-グリコシダーゼF用緩衝液（0.5% SDS, 0.35% 2-メルカプトエタノールを含む0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)）に溶解し、5分間煮沸処理をした。室温まで戻した後、50μlの7.5% Nonidet P-40、138μlのH2O、12μlのN-glycosidase F（ベーリンガー社製）を加え、37℃ 、16時間処理した。BioRad AG50W-X8カラムで脱塩し、糖鎖調製品とした。
【００７１】
得られた糖鎖を蛍光標識（ピリジルアミノ化、PA化という）するため、以下の操作を行なった。糖鎖調製品を濃縮乾固後、40μlのカップリング試薬（552 mgの2-アミノピリジンを200μl の酢酸に溶解した）を加え、密封し、90℃、60分処理した。室温まで戻した後、140μl の還元試薬（200 mgのボラン・ジメチルアミン複合体を50μl のH2Oと80μlの酢酸に溶解した）を加え、密封し、80℃、80分処理した。反応後、TOYOPEARL HW-40F（東ソー）でゲル濾過を行ない、未反応の2-アミノピリジンを除去した。糖鎖画分について0.22μm のフィルターで濾過し、PA化オリゴ糖調製品とした。
【００７２】
糖鎖構造解析は本発明者らが提案した方法（特開平9-135689）に準じて行った。アミノカラムを用いたHPLCでは、PA化オリゴ糖をその鎖長によって分離することが可能である。更にリン酸化糖鎖と非リン酸化糖鎖をも分離することができる。これはリン酸がアミノカラムに強く吸着するため溶出時間が遅れることに起因している。カラムはアミノカラムAsahipak NH2P-50 (4.6 x 250 mm) を用い、溶媒はA液として200 mM 酢酸-トリエチルアミン (pH 7.2)を、B液としてアセトニトリルを用いた。予め溶媒Aを30％、溶媒Bを70％で流速1.0 ml/minで流すことによりカラムを平衡化し、溶出は1.0 ml/minの流速で、B液70%から始まり、50分でB液20%となるリニアグラジエントをかけることでPA化オリゴ糖を溶出した。その結果を図６に示す。ブルー・セファロース溶出画分のα-ガラクトシダーゼから調製された糖鎖は20分付近（ピークA）に溶出され、一方ブルー・セファロース素通り画分のα-ガラクトシダーゼから調製された糖鎖は30分付近（ピークＢ）と38分付近（ピークＣ）の２ケ所に溶出された。
【００７３】
ピークAはMan8GlcNAc2-PAと同じ位置に溶出されてくることから、リン酸が付加していないMan8GlcNAc2構造を持つ糖鎖であることが解った。ピークＢ及びピークＣは溶出位置から、ピークＢはマンノース-1-リン酸が１つ結合している糖鎖、ピークＣはマンノース-1-リン酸が２つ結合している糖鎖であることが示唆された。ピークＢ及びピークＣについては更に下記の方法に従いアルカリフォスファターゼ処理により構造を確認した。
【００７４】
以上のことからα-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した高リン酸化糖鎖含有糖鎖生合成二重変異酵母株HPY21G株にて生産されたα-ガラクトシダーゼの糖鎖は(Man-P)2-Man8GlcNAc2、(Man-P)-Man8GlcNAc2のリン酸付加ハイマンノース型糖鎖、及びMan8GlcNAc2のハイマンノース型糖鎖であることが明らかとなった。その量比は約1：1：1であった。
またブルー・セファロース・クロマトグラフィーを用いることによりリン酸化糖鎖を有するα-ガラクトシダーゼとリン酸化糖鎖を持たないα-ガラクトシダーゼとを分離することが可能であることが解った。
【００７５】
反応産物（ピークＢおよびＣ）（図６）が、マンノース-1-リン酸が付加した産物であるかどうかを解析した。まず、すでにNMRでその構造が確認できている化合物（図３、構造式II, IIIおよびIV）について、HPLCにより分析したところ、構造式II, IIIのものは、30分付近に溶出された。従って、活性測定で現れたピークＢはマンノース-1-リン酸が１つ結合している糖鎖と同じものを含んでいると考えられた。またマンノース-1-リン酸が２つ結合している構造式IVの溶出位置は、ピークよりもかなり遅れて溶出することから、ピークＣはマンノース-1-リン酸が２つ結合している糖鎖と推定された。
【００７６】
さらに、ピークＢがマンノース-1-リン酸が１つ結合した糖鎖であることを直接確認するため、ピークＢを分取し、マンノース-1-リン酸残基のマンノース部分を切り出すためJack Beanα-マンノシダーゼによる消化を行なった。分取したピークの溶媒を凍結乾燥で除き、Jack Beanα-マンノシダーゼ（生化学工業社製）60 mUを含む酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）を加え、３７℃で一晩反応させた。その結果図7bに示すように、もとの糖鎖より遅い位置に溶出された。更にアルカリフォスファターゼ処理を行ったところ、Man4GlcNAc2-PAと同じ位置に溶出されたことから、Jack Beanα-マンノシダーゼで処理された糖鎖はPO4-Man4GlcNAc2-PAの構造を持つことが解った。同様にしてピークＣについてもJack Beanα-マンノシダーゼ処理、アルカリフォスファターゼ処理を行なった結果、ピークＢと同様に遅い位置に溶出してきた。またアルカリフォスファターゼ処理では、Man6GlcNAc2-PAと同じ位置に溶出してきた（図7d）ことから、ピークＣは図3の構造式IVに示される酸性糖鎖であることが明らかとなった。
以上の結果から、本株は有効なマンノース-６-リン酸付加酸性糖鎖含有糖蛋白質の前駆体としてのマンノース-１-リン酸付加酸性糖鎖含有糖蛋白質の生産に適していることが示された。
【００７７】
[参考例1] Cellulomonas SO-5由来酵素のα-マンノシダーゼおよび夾雑酵素の活性測定法
本発明者等は、土壌中細菌から新規α-マンノシダーゼを生成する細菌をスクリーニングする際のマンナン分解活性の測定を、α-マンナンを基質として反応を行い、遊離した糖の還元力を測定することによって行なった。すなわち、α-マンナン（終濃度0.1％）と酵素液を含む反応液（0.4 M リン酸緩衝液、pH 7.0）中、３７℃で１０分間、反応を行い、反応後マンノースを標準として還元糖をネルソン・ソモジ（Nelson？Somogi）法によって測定した（福井作蔵、生物化学実験法シリーズ１，還元糖の定量法（学会出版センター）、p. 10(1979)）。
【００７８】
精製の各段階の粗酵素および部分精製酵素のα-マンノシダーゼ活性の測定は、4-メチルウンベリフェリル（MU）-α-マンノピラノシドを基質として反応を行い、遊離する4-MUを測定することによって行なった。すなわち、0.5 mM 4-MU-α-マンノピラノシドと酵素液を含む反応液70 μl（0.15 M NaClを含む20 mＭリン酸緩衝液、 pH 7.5）中、37℃で30分間反応後、0.2 M グリシン緩衝液（pH 10.7）を700μl加えて反応を停止した。うち100 μlをとり、遊離した4-MUの蛍光量をマイクロプレートリーダー（Ex:385 nm, Em:450 nm）で測定した。酵素活性の単位は、上記反応において1分間に1 μmoleの4-MUを遊離する酵素量を１ユニット（以下「U」と略す）とした。
【００７９】
共存する夾雑酵素の測定法は以下のように行なった。
エンド-α-マンノシダーゼ活性の測定は、α-1,6-マンナンを基質として反応を行い、遊離した糖の還元力を測定することによって行なった。すなわち、α-1,6-マンナン（終濃度0.1％）と酵素液を含む反応液（0.4 M リン酸緩衝液、pH 7.0）中、３７℃で１０分間、反応を行い、反応後マンノースを標準として還元糖をネルソン・ソモジ（Nelson Somogi）法によって測定した（福井作蔵、生物化学実験法シリーズ１，還元糖の定量法（学会出版センター）、p. 10(1979)）。
【００８０】
β-マンノシダーゼ活性の測定は、p-ニトロフェニル（pNP）-β-D-マンノピラノシドを基質として反応を行い、遊離するpNPを測定することによって行なった。すなわち、5 mM pNP-β-D-マンノピラノシドと酵素液を含む反応液70 μl（0.15 M NaClを含む20 mＭリン酸緩衝液、 pH 7.5）中、37℃で24時間反応後、0.2 M グリシン緩衝液（pH 10.7）を700μl加えて反応を停止した。うち100 μlをとり、遊離した4-MUの蛍光量をマイクロプレートリーダー（Ex:385 nm, Em:450 nm）で測定した。酵素活性の単位は、上記反応において1分間に1 μmoleの4-MUを遊離する酵素量を１ユニット（以下「U」と略す）とした。
【００８１】
[参考例2] α-マンノシダーゼ生産菌のスクリーニング
マンノシダーゼを誘導生産するための培地（マンナン液体培地）は以下の通りに作成した。パン酵母マンナン2 g、硫酸アンモニウム［（NH4）2SO4］500 mg、硫酸第二鉄［Fe2SO4］ 20 mg、硫酸マグネシウム［MgSO4・7H2O］ 400 mg、塩化カルシウム［CaCl2・2H2O］ 60 mg、酵母エキス 1 g、第二リン酸カリウム［K2HPO4］ 7.54 g、第一リン酸カリウム［KH2PO4］ 2.32 gに水を加えて１Ｌとした。またマンノシダーゼ生産菌を単離するための平板培地は、上記マンナン液体培地に寒天末を1.5%になるように加えたものを用いた。
【００８２】
試験管に入った2 mlのマンナン液体培地に、土壌懸濁水から植菌耳で植菌し、30℃、2晩振盪培養した。この培養液を植菌耳で新しい2 mlのマンナン液体培地に植え継ぎし、再び30℃、2晩振盪培養した。2晩の振盪培養を計3回行なった後、1晩の振盪培養を2回行なった。培養液を遠心し、培養上清を10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に対して透析した粗酵素液を、マンナン分解酵素活性の測定に用いた。活性のあった土壌サンプルについて、さらにα-マンノシダーゼ生産菌のスクリーニングを進めた。
【００８３】
活性のあった培養液を、線引き法、希釈法にて平板プレートに植菌して、30℃で培養した。数日後、現れたコロニーを拾い、マンナン液体培地に植菌して30℃、2晩振盪培養した。培養液を遠心し、培養上清を10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に対して透析した粗酵素液について、α-マンナンと合成基質を用いて酵素活性を測定した。
【００８４】
この操作を数回繰り返し、確実なシングルコロニーを拾って完全なα-マンノシダーゼ生産菌の単離を行なった。この生産菌をSO-5と命名した。なお、このSO-5株は、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１ 中央第６ 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに2001年６月１２日付けでFERM BP-7628という受託番号で国際寄託されている。
【００８５】
[参考例3] 新規なα−マンノシダーゼ生産菌SO-5の同定
リボゾームRNA遺伝子の塩基配列の相同性は分子系統、分類上重要であり、遺伝子のコピー数、構成は種によって異なっている。したがってリボゾームRNAの塩基配列により細菌の同定が可能である。
【００８６】
SO-5株よりWizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ社製）を用いてゲノムDNAを単離した。これをテンプレートDNAとし、リボゾームRNA領域をコードする部分の塩基配列をPCRにて増幅した。プライマーはSPF1（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG:配列番号５）とSPR1（GGTTACCTTGTTACGACTT：配列番号６）を用い、得られた約1.5 kbの断片をPGEM-T vector（プロメガ社製）にクローニングした後、ジデオキシ法により部分塩基配列を決定した。その結果を配列番号７に示した。
【００８７】
この配列を日本DNAデータバンクのweb siteから利用できるBLASTシステムを用いて相同性検索を行なったところ、Oerskovia xanthineolyticaならびにCellulomonas属と高い相同性がみられた。Oerskovia属は樹枝状に成長するが、SO-5株は普通の丸いコロニーを形成する。これらの結果から、SO-5株はCellulomonas sp.であることが推定された。
【００８８】
[参考例4] α-マンノシダーゼの生産と部分精製
α-マンノシダーゼを誘導生産するため、実施例２で得られたSO-5をマンナン液体培地で30℃、一晩培養を行なった。培養後、4℃、15,000 x gで10分遠心し、菌体を除去した。上清を2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行ない、粗酵素液とした。
【００８９】
次にこの粗酵素液に終濃度1.2 Mとなるように硫酸アンモニウムを添加したあと、4℃で一晩混合した。これを遠心し、沈殿を除いた上清に対し、さらに終濃度1.7 Mとなるように硫酸アンモニウムを添加したあと、4℃で一晩混合した。次に4℃、15,000 x gで10分遠心し、沈殿する蛋白質を回収した。得られた沈殿物をH2Oに溶解し、2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行なった。これを2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で平衡化したHiTrap Qカラムに供した。NaClの濃度を1 Mまで増加させるグラジエント溶出を行ない、活性画分を得た。これを2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行ない、部分精製標品とした。
部分精製標品は[参考例1]に従い、α-マンノシダーゼ活性、エンド-α-マンノシダーゼ活性、β-マンノシダーゼ活性を測定した。比活性は31.9 mU/mgで、エンド-α-マンノシダーゼ活性、β-マンノシダーゼ活性は検出されなかった。
【００９０】
[参考例5] Cellulomonas属由来のα-マンノシダーゼの酵素学的性質
測定は参考例4で得られた精製酵素を用いて行なった。
（ａ）至適ｐＨ：本酵素について酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0〜6.5）、リン酸緩衝液（pH 6.0〜8.0）、トリス緩衝液（pH7.5〜10.0）を用いて37℃、30分間の酵素反応を行い、至適ｐＨを調べたところ、ｐＨ７〜８、特に7.5付近であった。
（ｂ）至適温度：本酵素について20〜80℃の各温度でリン酸緩衝液（ｐＨ 7.5）中、30分間反応させて至適温度を調べたところ、35〜45℃、特に40℃付近であった。
【００９１】
（ｃ）安定温度：本酵素について0.1 Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）中、0〜80℃の範囲で30分間処理した後、37℃、30分間の酵素反応によって残存活性（相対活性）を調べたところ、４０℃まで安定であった。
（ｄ）金属イオンの影響：本酵素について無機イオンおよび阻害剤による影響を、反応系に添加して37℃、30分間の酵素反応によって調べた。Ca2+によって僅かに（１０％）活性化された。またHg2+、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって活性が100％阻害されるが、Ca2+の添加によって活性が回復した。
【００９２】
（ｅ）ミハエリス定数：本酵素の4-MU-α-マンノピラノシドに対するミハエリス定数（Km）を、基質濃度の逆数と反応速度の逆数をプロットとして求めたところ、Km=0.32 mM-1であった。なお、高濃度の基質（1 mM以上）では、基質阻害が見られた。
（ｆ）高マンノース糖鎖に対する作用：アミノカラムを用いたHPLCでは、蛍光標識された（PA化）オリゴ糖をその鎖長によって分離することが可能である。カラムはSHODEX AsahiPak NH2P-50（4.6 x 250 mm、昭和電工製）を使用し、溶媒は、200 mM酢酸-トリエチルアミン緩衝液（pH 7.0）とアセトニトリルとの30：70の混合液（A液）、200 mM酢酸-トリエチルアミン緩衝液（pH 7.0）とアセトニトリルとの50：50の混合液（B液）を調製した。予め溶媒Aを流速1.0 ml/minで流すことによりカラムを平衡化し、試料注入直後から溶媒Bの割合を50分かけて100％まで直線的に上昇させ、PA化オリゴ糖を溶出した。PA化糖鎖は蛍光検出器（励起波長:320nm, 蛍光波長:400nm）にて検出した。反応は糖鎖100 pmolに対し、本発明酵素画分20 μUを加え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）中、37℃で10分から2時間反応した。下記構造式のMan8GlcNAc2-PA（Ｍ８）
【００９３】
【化５】
を基質とした場合、Man5GlcNAc2-PA（Ｍ５）まで比較的早く分解されたあと、さらにMan4GlcNAc2-PA（Ｍ４）が徐々に生成し、Man2GlcNAc2-PA（Ｍ２）もわずかながら生成している。２時間反応後では、Man4GlcNAc2-PAの他に、Man3GlcNAc2-PA（Ｍ３）、Man2GlcNAc2-PA（Ｍ２）、Man1GlcNAc2-PA（Ｍ１）の３本のピークが見られた。このことから、本酵素は、α-１，２-マンノシド結合、α-１，３-マンノシド結合、α-１，６-マンノシド結合に関わらず、非還元末端から非特異的にα-マンノシド結合に作用することがわかった。またこの結果からエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性は共存しないことが予想された。
【００９４】
（ｇ）β-マンノシド結合を有する糖鎖に対する作用：ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-マンノシドを基質とした際には活性が見られなかったことから、β-マンノシドには作用しないことが明らかとなった。
（ｈ）酵母リン酸含有酸性糖鎖に対する作用：酵母の生産する糖鎖中にはマンノースリン酸を含有する糖鎖が知られている（Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Biochem., 56, 915-944 (1987)）。下記構造式
【００９５】
【化６】
に示したような構造を有する糖鎖に対する作用を調べた。なお、分析にはSuperQ 5PW（東ソー製）を使用し、溶媒は、2 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）（A液）、0．25 M酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）（B液）を調製した。予め溶媒Aを流速1.0 ml/minで流すことによりカラムを平衡化し、試料注入直後から溶媒Bの割合を30分かけて100％まで直線的に上昇させ、PA化オリゴ糖を溶出した。反応は糖鎖100 pmolに対し、本酵素画分20μUを加え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）中、37℃で一晩反応した。リン酸に結合したマンノースが切断された糖鎖はリン酸の負電荷が増えるため、遅い保持時間で溶出されるようになる。コントロール（酵素なし）の糖鎖が10分付近に溶出されるのに対し、本酵素を作用させたものは12分過ぎに新たなピークが見られた。この溶出位置は（構造式６）の糖鎖を化学的に処理し、リン酸に結合したマンノースを除去した糖鎖の溶出位置と一致したことから、本酵素はフォスフォジエステル結合のα-マンノースも切断することが可能であることが明らかとなった。
【００９６】
[参考例6] 糖蛋白質に対する作用
リボヌクレアーゼB（RNase B）は高マンノース型糖鎖を有する糖蛋白質として知られている。リボヌクレアーゼB 20 μgに対し、[参考例2]で得られたα-マンノシダーゼ画分を100 μU加え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）存在下で、37℃、14時間反応させた。なお、コントロールとしてα-マンノシダーゼ画分の代わりに緩衝液のみを等量加えた。それぞれをSDS-PAGEで分析したところ、コントロールに対し、α-マンノシダーゼ画分を加えたものでは見かけの分子量が減少していた。この分子量はペプチド部分の配列が同じで、糖鎖のみを欠損したリボヌクレアーゼ A（RNase A）のものと近似していた。これらのリボヌクレアーゼ活性を測定したところ、反応前と比べ活性の減少はほとんど見られなかった。従ってこれらのことから、本酵素画分を加えたものでは、高マンノース型糖鎖のα-マンノシド結合部分のみが切断され、糖鎖の根元部分に当たるManβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcが残ったものの、蛋白質部分には影響がないことが示唆された。
【００９７】
〔実施例４〕 各種α-マンノシダーゼによる消化実験
実施例３で得られたα-ガラクトシダーゼを、各種α-マンノシダーゼで処理し、糖蛋白質にα-マンノシダーゼが作用し、糖鎖中のマンノース-1-リン酸結合が分解できるかどうか検討した。
【００９８】
実施例３で精製したα-ガラクトシダーゼ1 mgに対し、Jack Bean α-マンノシダーゼ（生化学工業社製）2 mUを含む酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）を加え、３７℃で一晩反応させた。このα-ガラクトシダーゼのウエスタンブロット解析を行なったところ、α-マンノシダーゼ未処理のものと移動度が変わらなかった。また糖鎖構造解析の結果でも、糖鎖中のマンノース-1-リン酸結合は切断されていなかった。従ってこの条件では糖鎖中のマンノース-1-リン酸結合は切断されないと考えられた。
このことから新たなマンノシダーゼのスクリーニングが必要であると考えられた。そこで、上記Cellulomonas SO-5株由来のα-マンノシダーゼを用いて、マンノース-1-リン酸結合の切断を試みた。
【００９９】
実施例３で精製したα-ガラクトシダーゼ1 mgに対し、上記Cellulomonas SO-5株由来α-マンノシダーゼ 90μUを含む生理食塩水緩衝液（PBS ; pH 7.5）を加え、３７℃で一晩反応させた。このα-ガラクトシダーゼのウエスタンブロット解析を行なったところ、α-マンノシダーゼ未処理のものに比べ 移動度が大きくなっていた（図8）。このα-ガラクトシダーゼの糖鎖構造解析を実施例3に従って行なったところ、糖鎖中のマンノース-1-リン酸結合は切断されており、リン酸が露出した時と同じ溶出位置に見られた（図9）。
更にアルカリフォスファターゼ処理を行ったところ、Man6GlcNAc2-PAと同じ位置に溶出されたことから、α-マンノシダーゼで処理された糖鎖は(PO4)2Man6GlcNAc2-PAとPO4-Man4GlcNAc2-PAの構造を持つことが解った。
【０１００】
〔実施例５〕 高リン酸化糖鎖含有α-ガラクトシダーゼの大量調製
高リン酸化糖鎖含有α-ガラクトシダーゼの大量調製を行なった。実施例３で精製したα-ガラクトシダーゼ300μgに対し、上記Cellulomonas SO-5株由来α-マンノシダーゼ 30 mUを含むリン酸緩衝液（pH 7.5）を加え、３７℃で6時間反応後、さらに30 mUのα-マンノシダーゼを加え、12時間反応させた。反応後に、MonoQカラムを用いて精製を行なった。α-ガラクトシダーゼ活性は15-18本目の画分に、α-マンノシダーゼ活性は26-29本目の画分に回収された。
【０１０１】
〔実施例６〕 ファブリー病患者から得られた培養皮膚繊維芽細胞を用いた精製α-ガラクトシダーゼへの取り込み実験
ファブリー病患者由来の培養皮膚線維芽細胞（F377、F87）を、10%となるようにFCSを加えた Ham's F10培地で、直径3.5 cmシャーレ中、5% CO2の下３７°Cで培養した。次に、実施例５においてマンノシダーゼ処理した、または未処理のα-ガラクトシダーゼを終濃度0.1μg/mlまたは1μg/mlで培養液中に添加し、18時間後に細胞を採取し、細胞抽出液中のα-ガラクトシダーゼ活性を測定した。なお、コントロールとして正常人由来の培養皮膚線維芽細胞（F592）の細胞内活性も測定した。またマンノース-6-リン酸レセプター依存的な取り込みであることを確認するために、上記の系にさらに終濃度5 mMとなるようにマンノース-6-リン酸を培養液中に添加し、阻害実験を行なった。その結果を図10に示す。
【０１０２】
終濃度1μg/mlでα-ガラクトシダーゼを添加した場合、マンノシダーゼ未処理の酵素に対し、処理後の酵素の投与によりファブリー病患者由来細胞内のα-ガラクトシダーゼ活性は約3倍の増加を示した。またこの酵素活性の増加はマンノース-6-リン酸によって阻害を受けることから、マンノシダーゼ処理後のα-ガラクトシダーゼはマンノース-6-リン酸レセプター依存的に細胞に取り込まれていることがわかった。すなわち、マンノシダーゼ処理後のα-ガラクトシダーゼは、ヒトと同様のマンノース-6-リン酸含有糖鎖構造を有していることを示唆するものである。
【０１０３】
次に、ヌンク社の８穴チャンバースライドを用いて1チャンバー当たり5 x 103 cellsのファブリー病患者由来の培養皮膚線維芽細胞（F377）を播き、24時間培養後、α-ガラクトシダーゼを1μg/mlとなるように加えた。なお、コントロールとして正常人由来の培養皮膚線維芽細胞（F592）についても同様に行なった。18時間、または５日間培養後、蓄積物であるグロボトリアオシルセラミド（CTH）に対する抗体を一次抗体として、免疫蛍光染色を行なった（図11）。
【０１０４】
ファブリー病患者由来の培養皮膚線維芽細胞の培養液中にα-ガラクトシダーゼを加え、細胞内に蓄積しているCTHに対する効果を免疫染色法で解析した（図１１の右側−酵素(+)）。CTHの検出については、一次抗体として抗CTH抗体で処理し、次にFITC-抗マウスIgG抗体を二次抗体として用いて染色し、緑色で可視化した。細胞内のα-ガラクトシダーゼに関しては、一次抗体として抗α-ガラクトシダーゼ抗体で処理した後に、二次抗体としてCy3-抗ウサギIgG抗体で染色して赤色で可視化した。両者が混在する領域は黄色で表現される。比較のため、正常者由来の培養皮膚線維芽細胞をα-ガラクトシダーゼ未処理のファブリー病患者由来の培養皮膚線維芽細胞の染色性を図の左側に示した（酵素(-)）。
【０１０５】
その結果、マンノシダーゼ処理後のα-ガラクトシダーゼを加えた場合、5日後で抗CTH抗体による染色性が明らかに減少していた。また、α-ガラクトシダーゼは投与後18時間で細胞内に取り込まれており、5日後でも依然染色されたことから非常に安定であると考えられる。蓄積していたCTHが分解されたことから、本発明で作製したα-ガラクトシダーゼがリソソーム病治療薬として有効であることが示唆された。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明による酵母を用いる遺伝子工学的手法により、ヒトなど哺乳類細胞のリソソームへ輸送されるための標識マーカーとして機能しうるリン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質を多量かつ純度よく製造することができる。本発明におけるリン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質はヒトのリソソーム酵素の欠損症の治療などに有効な薬剤として利用することができる。
【０１０７】
【配列表】
【０１０８】
【配列表フリーテキスト】
【図面の簡単な説明】
【図１】哺乳類動物での一般的なN-結合型糖鎖の生合成経路を示す（konfeldら）。
【図２】酵母（S. cerevisiae）におけるN-結合型糖鎖の生合成経路を示す。
【図３】酵母HPY21株（Δ och1 Δ mnn1）で生成されるコア糖鎖ならびに酸性糖鎖の構造を示す。
【図４】本発明におけるストラテジー図を示す。
【図５】α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したHPY21G株の培養上清液を用いたウエスタンブロット解析を示す。１）ベクターのみを導入した株（HPY21株）２）α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した株（HPY21G株）
【図６】α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したHPY21G株の培養上清濃縮液よりブルーセファロースで分離したα-ガラクトシダーゼ糖鎖の糖鎖構造解析の結果を示す。
【図７】α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したHPY21G株の培養上清濃縮液より精製したα-ガラクトシダーゼ糖鎖のAsahi-Pak NH2-Pカラムでの糖鎖構造解析の結果を示す。
１）培養上清精製α-ガラクトシダーゼの糖鎖（リン酸を糖鎖内に1分子含むもの）
２）１）のα-マンノシダーゼ処理後の糖鎖
３）２）のアルカリホスファターゼ処理後の糖鎖
４）培養上清精製α-ガラクトシダーゼの糖鎖部分（リン酸を糖鎖内に２分子含むもの）をα-マンノシダーゼ、アルカリホスファターゼ処理した糖鎖
【図８】精製α-ガラクトシダーゼをCellulomonas SO-5株の生産するα-マンノシダーゼで処理した後のウエスタンブロット解析を示す。
１）α-マンノシダーゼ未処理のもの
２）α-マンノシダーゼ処理したもの
【図９】Cellulomonas SO-5株の生産するα-マンノシダーゼで処理したα-ガラクトシダーゼから得られた糖鎖のAsahi-Pak NH2-Pカラムでの構造解析を示す。
【図１０】ファブリー病患者から得られた培養皮膚繊維芽細胞を用いた本発明で得られた精製α-ガラクトシダーゼへの取り込み実験（酵素活性測定）の結果である。
【図１１】ファブリー病患者から得られた培養繊維芽細胞に本発明で得られた精製α-ガラクトシダーゼを投与した際の蓄積した基質に対する効果を示す図である（蛍光抗体法による顕微鏡図）。
【符号の説明】
GlcNAc, GN： N- アセチルグルコサミン
Man, M ：マンノース
PA ： 2-アミノピリジル化
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトなど哺乳類細胞でリソソームへ糖蛋白質が輸送されるための標識マーカーとして機能しうるマンノース-6-リン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
天然界に存在する蛋白質などについては、その糖鎖を除くと本来の生物活性を示さなくなることが明らかにされてきた（木幡陽、蛋白質核酸酵素、36, 775-788 (1991)）。このことから糖鎖が生物活性の発現に重要な役割を担っていることが予想されるが、糖鎖の構造と生物活性との相関が必ずしも明確でないため、蛋白質部分に付加する糖鎖の構造（糖の種類、結合位置、鎖長など）を自由自在に改変制御できる技術の開発が必要となる。
【０００３】
糖蛋白質の糖鎖には、大別して、Asn結合型、ムチン型、O-GlcNAc型、GPIアンカー型、プロテオグリカン型などがあり（竹内誠、グリコバイオロジーシリーズ5、グリコテクノロジー、木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編、講談社サイエンティフィック、 191-208 (1994)）、それぞれ固有の生合成経路をもち、個別の生理機能を担っている。このうち、Asn結合型糖鎖の生合成経路については多くの知見があり、詳しく解析されている。
【０００４】
Asn結合型糖鎖の生合成は、N-アセチルグルコサミン、マンノース、およびグルコースからなる前駆体が脂質キャリアー中間体の上に合成され、まず小胞体（ER）で糖蛋白質の特定の配列（Asn-X-SerまたはThr）に転移される。次にプロセシング（グルコース残基と特定のマンノース残基の切断）を受け、マンノース８残基とN-アセチルグルコサミン２残基からなるM8ハイマンノース型糖鎖（Man8GlcNAc2）が合成される。このハイマンノース型糖鎖を含有する蛋白質はゴルジ体に輸送されて、種々の修飾を受けるが、このゴルジ体での修飾は酵母と哺乳類で大きく異なっている（Kukuruzinska et al., Annu. Rev. Biochem., 56, 915-944 (1987)）。
【０００５】
哺乳類細胞では、糖鎖修飾を受ける蛋白質の種類によって異なる以下の３種の経路をたどる。1)上記のコア糖鎖が何等変化を受けない場合、2)UDP-N-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）のN-アセチルグルコサミン-１-リン酸部分（GlcNAc-1-P）がコア糖鎖のManの６位に付加してMan-6-P-1-GlcNAcとなったのち、このGlcNAc部分だけが除去されて、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質に変換される場合、3)コア糖鎖から５分子のManが順次除去されてMan3GlcNAc2 となり、これと相前後してGlcNAc、ガラクトース（Gal）、Ｎ-アセチルノイラミン酸、別名シアル酸（NeuNAc）などが順次付加して、多様な混成型および複合型糖鎖が混合物として生成する場合の３通りである[R. Kornfeld and S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem., Vol. 54, p.631-664 (1985)]（図１）。従って、哺乳類型糖鎖と言っても構造は多岐にわたりそれらの構造が糖蛋白質の機能に大きく関わっていることが解っている。
【０００６】
一方、酵母では、上記のコア糖鎖(Man8GlcNAc2)にマンノースが数残基から100残基以上付加した、マンナン型糖鎖、いわゆる糖外鎖(outer chain)を生成する他、コア糖鎖部分および糖外鎖部分にマンノース-１-リン酸が付加した酸性糖鎖も生成することがわかっている（図２参照）。この修飾は、動物細胞と異なり、酵母では液胞（動物細胞のリソソームに相当するオルガネラ）局在性糖蛋白質のsorting signalとしては機能しないことが報告されている。従って、酵母におけるこのリン酸化糖鎖の生理機能は不明のままである[Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Biochem., Vol.56, p915-944 (1987)]。
【０００７】
酵母のマンノースリン酸含有糖鎖のリン酸化部位は、図２に示すように、小胞体で合成されるMan8GlcNAc2のコア糖鎖のα-1,3-分岐側とα-1,6-分岐側に付加する場合のほか、ゴルジ体で合成されるマンノース外鎖に多数存在するα-1,2-分岐に付加する場合とマンノース外鎖の非還元末端に付加する場合がある[A. Herscovics and P. Orlean, FASEB J., Vol. 7, p540-550 (1993)]。Saccharomyces属酵母における糖外鎖の生合成は図２に示した経路で進行すると考えられている[Ballou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, p3368 (1990)] 。
【０００８】
すなわち、M8ハイマンノース型糖鎖にまずα-1,6 結合でマンノースが付加する延長開始反応が起こる（図２, 反応I, B）。この反応を行なう酵素はOCH1遺伝子にコードされる蛋白質であることが明らかになっている（Nakayama et al., EMBO J. , 11, 2511-2519 (1992)）。さらにα-1,6結合でマンノースを逐次延長する反応（図２, II）が起こることにより、外糖鎖の骨格となるポリα-1,6結合マンノース結合が形成される（図２, E）。このα-1,6結合のマンノースには、α-1,2結合したマンノースの分岐が存在し（図２：C, F, H)、この枝分かれしたα-1,2結合のマンノースの先には、さらにα-1,3結合したマンノースが付加することがある（図２：D, G, H, I) 。このα-1,3結合のマンノースの付加は、MNN1遺伝子産物によるものである（Nakanishi-Shindo et al., J. Biol. Chem., 268, 26338-26345 (1993)）。またハイマンノース型糖鎖部分（図２, ＊)および外糖鎖部分にマンノース-1-リン酸が付加した酸性糖鎖も生成することがわかっている。この反応はMNN6遺伝子がコードする遺伝子によることがわかり（Wang et al., J. Biol. Chem., 272, 18117-18124 (1997)）、さらにこの転位反応を正に制御する蛋白質をコードする遺伝子（MNN4）も明らかとなった（Odani et al., Glycobiology, 6, 805-810 (1996) ; Odani et al., FEBS letters, 420, 186-190 (1997))。
【０００９】
多くの場合に、外糖鎖は不均質な蛋白質産物を生成し、蛋白質の精製を困難にしたり、比活性を低下させたりする（Bekkers et al., Biochim. Biophys. Acta, 1089, 345-351 (1991)）。さらに糖鎖の構造が大きく異なるため、酵母で生産された糖蛋白質は、哺乳類由来のものと同一の生物活性が検出されなかったり、哺乳類動物などに対して強い免疫原性を有する。例えば、酵母（S. cerevisiae）の場合、MNN1遺伝子により生成するα１，３マンノシド結合は強い免疫原性を有することが知られており（Ballou, C. E., Methods Enzymol., 185, 440-470(1990)）、また酵母は本来マンノース-6-リン酸（Man-6-P）をマンノース-6-リン酸-α-1-マンノース（Man-6-P-1-Man）の形で有しており、そのためMan-6-Pレセプターに結合しないことが報告されている（Kukuruzinska et al., Annu. Rev. Biochem., 56, 915-944 (1987); Faust and Kornfeld, J. Biol. Chem., 264, 479-488 (1989); Tong et al., J. Biol. Chem., 264, 7962-7969 (1989)）。このように、哺乳類由来の有用糖蛋白質を生産させる際の宿主としては、酵母は不適当とされている。哺乳類由来のものと同等の生物活性を持った糖蛋白質、すなわち哺乳類型の糖鎖を含有する糖蛋白質を生産できる酵母の開発が、学会や産業界から望まれている。本発明者らは既にこの外糖鎖を欠損した変異株、及び哺乳類型の糖鎖を含有する酵母の作成に成功している(特願平11-233215)。
【００１０】
また前述のように酵母では、上記のコア糖鎖部分および糖外鎖部分にMNN4遺伝子、及びMNN6遺伝子の作用によるマンノース-１-リン酸が付加した酸性糖鎖も生成する。そのうちコア糖鎖を産生する外糖鎖生合成酵素遺伝子の欠損変異株が生産した糖蛋白質糖鎖には、中性糖鎖（図３、構造式I）のほかに、酸性糖鎖（図３、構造式II〜IV）が含まれることが解っている（第１２回バイオテクノロジーシンポジウム予稿集、p.153-157、平成６年１０月１４日発行、バイオテクノロジー開発技術研究組合）。
【００１１】
この酸性糖鎖はヒトなど哺乳類由来の糖鎖には存在しない構造である。すなわち、哺乳類細胞では、マンノース-１-リン酸ではなく、Ｎ-アセチルグルコサミン-1-リン酸が付加したのち、Ｎ-アセチルグルコサミン部分だけがさらに除去されて、最終的に図１中、＊で示した記載の酸性糖鎖になる。下記のようにこの糖鎖は哺乳動物細胞ではリソソーム輸送シグナルとして機能することがMethods in Enzymology, 〔Vol.185, p.440-470 (1990)〕に記載されている。
【００１２】
ところで細胞内小器官のひとつであるリソソームには、数多くの酸性加水分解酵素が存在し、細胞内外からリソソームに取り込まれた物質の分解を担っている。 ヒトリソソームに局在する酵素群の多くは、生合成されゴルジ体に輸送されると、そのハイマンノース型糖鎖の非還元末端のマンノース残基の6位にリン酸基が付加、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質に変換され、これがリソソーム酵素特異的な認識マーカーとなる。そしてその高親和性受容体であるマンノース-6-リン酸受容体（MPR）との結合を介して、他の蛋白質から選別され、プレリソソームへ運ばれ、酸性条件下でMPRから解離した後、さらにリソソームへと輸送される（von Figura and Hasilik, Annu. Rev. Biochem., 54, 167-193 (1984) ）。マンノース-6-リン酸受容体（MPR）との結合にはマンノース-6-リン酸を１本の糖鎖内に１分子以上含むことが必要である。このリソソーム酵素特異的なリン酸基の付加反応は、2種の酵素反応により行なわれている。W. Canfieldらはマンノース-６-リン酸合成に関与する２種の酵素（GlcNAc-phosphotransferase、GlcNAc-phosphodiester-GlcNAc'ase）の遺伝子クローニングに成功している（Abstract of the XV International Symposium on Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal Vol. 16 No. 4/5 S41 (1999)）。
【００１３】
これらのリソソーム酵素、前述のリン酸基の付加反応に関与する酵素、または酵素の活性化および安定化に関与する因子の遺伝的欠陥により、酵素反応が進行せず、細胞内に基質が蓄積して起こる一連の疾患群が「リソソーム病」と呼ばれている（Leroy and DeMars, Science, 157, 804-806 (1967)）。リソソーム病に関しては、ヒトでは30種類以上のものが知られており、小児科や内科領域で重要な疾患群のひとつとなっている。これらの疾患に対する根本的治療法の開発については、骨髄移植、遺伝子治療等が試みられてきた。またリソソーム酵素を用いた酵素補填療法が以前より試されているが、その際に標的臓器への取り込みが大きな障害になっており、今のところ、ゴーシェ（Gaucher）病に対する酵素補充療法以外良好な成績は収めていない。
【００１４】
ゴーシェ病はリソソーム酵素の１つであるグルコシルセラミドの分解酵素グルコセレブロシダーゼの遺伝子変異により、主に骨髄のマクロファージ由来の細胞にその基質であるグルコシルセラミドが蓄積して、著明な肝脾腫のほかに貧血、出血等の造血障害を伴う疾患である。前述のように本疾患の治療法として酵素補填療法が行われており、高い治療成績を収めているが、一方で本療法は一生涯継続しなければならず、酵素製剤が非常に高価であるなどの問題点もある。このグルコセレブロシダーゼ製剤はCHO細胞で生産されたヒト組換えグルコセレブロシダーゼの糖鎖の末端を、マンノースを露出させた形に修飾したものである。本疾患は主な罹患細胞がマクロファージであるため、グルコセレブロシダーゼはマクロファージ上のマンノース受容体を介して細胞内に取り込まれた後にリソソームへ運搬されるようである。グルコセレブロシダーゼは、その糖鎖にマンノース-6-リン酸を持たないにも関わらずリソソームへ輸送されることが知られている。よって本酵素はマンノース-6-リン酸受容体（MPR）非依存性輸送機構によりリソソームへ輸送されていると考えられる。
【００１５】
しかしながら、他のリソソーム疾患の多くは、その欠損酵素のリソソームへの輸送がマンノース-6-リン酸受容体を介した系であるので、酵素補填療法に用いるリソソーム酵素はマンノース-6-リン酸受容体（MPR）との結合に必要なリソソーム移行シグナルであるマンノース-6-リン酸を含む糖鎖をもっていることが必要である。よってこれらのリソソーム酵素の糖鎖へのマンノース-6-リン酸の付加がキーとなる。
【００１６】
現在、リソソーム酵素は、胎盤から精製する方法、繊維芽細胞、メラノーマ細胞等の培養細胞を利用した生産法、昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞等の培養細胞を用いた組換え法、トランスジェニックウサギの乳から得る方法が報告されているが、１）リン酸が付加した糖鎖を有するリソソーム酵素の含有量が低いためリソソームへの取り込み効率が悪い、２）生産性が低く、培養コストが高い。このため１）大量投与が必要で、２）治療コストがかかるなどの問題点がある。また酵母細胞を用いた組換え法による生産例はない。よってマンノース-6-リン酸を糖鎖に含むリソソームへの取り込み活性の高い酵素が求められている。
【００１７】
一方、リソソーム病の一種であるファブリー（Fabry）病は、α-ガラクトシダーゼの活性が低下し、生体内基質であるグロボトリオシルセラミドが体内に蓄積するX染色体の遺伝病である。典型的な経過をとる「古典型」ファブリー病患者は、少年期から青年期に、四肢疼痛、被角血管腫や低汗症が出現し、年齢が進むと腎障害や心および脳血管障害を起こす。近年、比較的軽症で、壮年期以後に心筋障害を主微とする「亜型」ファブリー病の存在が知られるようになり、これらの患者が「心筋症」を擬診される患者群の中に隠れていることが報告されて、注目されている。
【００１８】
α-ガラクトシダーゼは前述のグルコセレブロシダーゼと異なり、マンノース-6-リン酸受容体を介した系でリソソームに輸送される。よって標的細胞に効率的に取り込ませるためにはマンノース-6-リン酸を含有する糖鎖を有することが必要である。しかしながらマンノース-6-リン酸を含有する糖鎖を持つα-ガラクトシダーゼを治療用途として用いる程の高純度の標品を大量に生産する技術は存在しなかった。例えば、ヒトに投与し、１０人中９人で酵素補填療法としての優位性が確認された、線維芽細胞由来の糖蛋白質（α-ガラクトシダーゼ）の糖鎖は、マンノース-6-リン酸型糖鎖の割合が２０％程度であるとされている（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 97:365-370 (2000)）。
【００１９】
以上のように、酵母と哺乳類細胞では蛋白質に付加する糖鎖の構造が大きく異なるため、遺伝子工学的手法により酵母でヒトなど哺乳類由来の有用糖蛋白質を生産させても、哺乳類由来のものと同一の生物活性が検出されなかったり、糖鎖の違いによる抗原性の相違などが指摘されている。このため、哺乳類由来の糖蛋白質を酵母で生産させることは従来困難であった。またヒトおよび他の哺乳類細胞において付加されるのと同一の糖鎖構造をもつ、有用なリン酸含有酸性糖鎖はヒトなど哺乳類細胞でリソソームへ糖蛋白質が輸送されるための標識マーカーとして機能しており有益であるが、これらの酸性糖鎖を含有する糖蛋白質を均一かつ多量に供給することは現状では困難である。したがって、このような技術の開発が望まれるところである。
【００２０】
本発明者らは糖鎖合成変異株（Δ OCH1 mnn1）を用いて糖蛋白質を生産させ、これにMNN6遺伝子産物を生体内または生体外で働かせることにより、マンノース-１-リン酸が付加した酸性糖鎖を得て、これを酸処理することによりリソソーム輸送シグナルとして有効な哺乳類と同様な糖鎖を得る方法を提案している（特開平9-135689）。しかしこの方法では極度の変性条件下（0.01Ｎ塩酸中、100℃、30分間）におくため殆どの糖蛋白質は変性してしまう。よって生理活性を有する糖蛋白質を得る方法としては十分なものではなかった。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、酵母での糖蛋白質の生産における上記の問題を克服し、ヒトおよび他の哺乳類細胞において付加されるのと同一の糖鎖構造をもつ、有用なリン酸含有酸性糖鎖、および該糖鎖を含有する糖蛋白質を、酵母を用いて製造する方法を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、糖鎖生合成酵母変異株を用いてリン酸含有糖鎖を多く有する糖蛋白質を得、これにα-マンノシダーゼを作用させることにより、抗原性を持たず、ヒトをはじめとする哺乳類細胞のリソソームへ輸送されるための標識マーカーとして機能しうるマンノース-6-リン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質を多量に、純度よく、かつ生理活性を保持した状態で製造できることを見いだした。またこのリン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質がヒトのリソソーム酵素の欠損症の治療などに有効な薬剤として利用できることを見いだし、発明を完成するに至った。
【００２３】
すなわち、本発明は、高リン酸化コア糖鎖を産生する糖鎖生合成変異酵母株を用いて、これに目的の糖蛋白質をコードする遺伝子を導入発現させ、得られたマンノース-１-リン酸付加酸性糖鎖含有糖蛋白質をα-マンノシダーゼ処理によってマンノース部分を切除することを特徴とするマンノース-６-リン酸含有糖鎖含有糖蛋白質の製造方法である。
【００２４】
また本発明の酵母を用いた生産法により製造されるリン酸含有酸性糖鎖を有するヒトのリソソーム酵素をはじめとする糖蛋白質である。
更に本発明により生産されたヒトのリソソーム酵素を用いたリソソーム病治療組成物である。
【００２５】
より具体的には、本発明は以下の（１）〜（２７）を提供する。
（１） 酵母を用いて、マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有する酸性糖鎖を有する活性型糖蛋白質を製造する方法。
（２） マンノース-6-リン酸含有酸性糖鎖がマンノース-6-リン酸レセプターと結合し得る糖鎖である上記（１）に記載の方法。
（３） 酵母を用いて、下記構造式I〜VIIIに示す、マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有するハイマンノース型糖鎖を有する活性型糖蛋白質を製造する方法。
【００２６】
【化３】
（４） 酵母が酸性糖鎖を含み、かつ少なくともα-1,6マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊した酵母株を用いることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 酵母が酸性糖鎖を含み、かつ少なくともα-1,6マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びα-1,3マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊した酵母
【００２８】
株を用いることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６） α-1,6マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子がS. cerevisiae におけるOCH1遺伝子であり、α-1,3マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子がS. cerevisiae におけるMNN1遺伝子である上記（４）または（５）に記載の方法。
（７） 酵母が高リン酸化糖鎖含有変異株である上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【００２９】
（８） 酵母がS. cerevisiae HPY21株である上記（７）に記載の方法。
（９） マンノース-6-リン酸含有酸性糖鎖を有する活性型糖蛋白質がリソソーム酵素である上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０） リソソーム酵素がα-ガラクトシダーゼである上記（９）に記載の方法。
【００３０】
（１１） α-ガラクトシダーゼの構造遺伝子がヒト由来遺伝子である上記（１０）に記載の方法。
（１２） α-ガラクトシダーゼの構造遺伝子が配列番号５に示される塩基配列を有するものである、上記（１１）に記載の方法。
（１３） α-ガラクトシダーゼを生産する酵母がHPY21G株である上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
【００３１】
（１４） 上記（４）〜（８）のいずれかに記載の酵母にて産生された糖蛋白質にα-マンノシダーゼを作用させ、糖鎖中のマンノース-1-リン酸結合のマンノース残基を除去することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（１５） α-マンノシダーゼがマンノース-1-リン酸結合のマンノース残基を除去する活性を有するものである上記（１４）に記載の方法。
【００３２】
（１６） α-マンノシダーゼがα-1,2マンノシド結合、α-1,3マンノシド結合、α-1,6マンノシド結合を非特異的に分解する活性を有するものである上記（１４）または（１５）に記載の方法。
（１７） α-マンノシダーゼ活性がエキソ型活性であり、エンド型活性はないものである、上記（１６）に記載の方法。
（１８） Cellulomonas属細菌由来のα-マンノシダーゼである上記（１７）に記載の方法。
【００３３】
（１９） Cellulomonas属細菌がCellulomonas SO-5である、上記（１８）記載の方法。
（２０） 酵母により作られるマンノース-6-リン酸を非還元末端に含有する酸性糖鎖を有する糖蛋白質。
（２１） リソソーム酵素である、上記（２０）に記載の糖蛋白質。
（２２） 上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の方法によって生産される上記（２０）または（２１）に記載の糖蛋白質。
【００３４】
（２３） α-ガラクトシダーゼである上記（２１）または（２２）に記載の糖蛋白質。
（２４） ヒト由来遺伝子によってコードされたα-ガラクトシダーゼである上記（２３）に記載の糖蛋白質。
（２５） 下記構造式I〜VIIIに示す、マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有するハイマンノース型糖鎖構造を持つ糖鎖を含有する上記（２０）に記載の糖蛋白質。
【００３５】
【化４】
（２６） 上記（２０）〜（２５）のいずれかに記載の糖蛋白質を含有することを特徴とする、リソソーム病の治療および／または予防のための医薬組成物。
（２７） 糖蛋白質がヒトα−ガラクトシダーゼである、ファブリー病治療のための上記（２６）に記載の医薬組成物。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３７】
【発明を実施するための形態】
本発明におけるリソソームへ輸送されるための標識マーカーとして機能しうるリン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質の製造法は基本的には下記の工程よりなる。
１）リン酸化コア糖鎖を産生する糖鎖生合成変異酵母株を用いて、これに目的の糖蛋白質をコードする遺伝子を導入しマンノース-１-リン酸付加酸性糖鎖含有糖蛋白質を発現させる工程。
２）得られたマンノース-１-リン酸付加酸性糖鎖含有糖蛋白質をα-マンノシダーゼ処理によってマンノース部分を切除し、マンノース-６-リン酸含有糖鎖含有糖蛋白質を生成させる工程。
【００３８】
本発明における、酵母特有の外糖鎖生合成系遺伝子が破壊された酵母変異株は以下のようにして作製することができる。まず、標的遺伝子の破壊に必要なDNA遺伝子断片の単離は、Saccharomyces cerevisiaeのゲノムプロジェクトにより、いずれもその染色体上の配座が既知である（Goffeau et al., Nature, 387 (suppl.), 1-105 (1997)) ことから、米国ATCC（American Type Culture Collection）など公的な機関から標的遺伝子の近傍を含む遺伝子断片の分与を受けることが可能である（ATCC Recombinant DNA materials, 3rd edition, 1993）。また、一般的手法にしたがってS. cerevisiaeからゲノムDNAを抽出し、目的遺伝子を選別することにより得ることも可能である。上記において、S. cerevisiaeからのゲノムDNAの抽出は、例えば、Cryer らの方法（Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975) ）およびP. Philippsenらの方法（Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991) ）に従って行なうことができる。
【００３９】
標的遺伝子は、ＰＣＲ法により増幅させてから遺伝子破壊を行なう。PCR法は、インビトロ（in vitro）でDNAの特定断片をその領域の両端のセンス・アンチセンスプライマー、耐熱性DNAポリメラーゼ、DNA増幅システム等の組み合わせを用いて約２-３時間で数十万倍以上に増幅できる技術であるが、標的遺伝子の増幅には、プライマーとして25-30merの合成1本鎖DNAを、鋳型としてゲノムDNAを用いる。
【００４０】
本発明において標的遺伝子の破壊は、Rothstein, Methods Enzymol., 101, 202-211 (1983)に開示される方法に基本的に従って行いうる。本方法は、まず、プラスミド上の標的遺伝子DNAを分断あるいは部分欠失させ、そこに適当な選択マーカー遺伝子DNAを挿入して標的遺伝子の上流部と下流部の間に選択マーカーがサンドイッチされた構造体を作製し、次に、この構造体を酵母細胞に導入する。以上の操作により、導入断片（選択マーカーを挟み込んだDNA構造体）の両端と染色体上の標的遺伝子との相同部分の間で２回の組み換えを起こし、染色体上の標的遺伝子が導入断片で置換される。
【００４１】
具体的に、OCH1遺伝子破壊株の作製を例にとり説明する。Alaniらによって構築された、サルモネラ菌のhisG遺伝子DNA断片がURA3遺伝子の両端に結合されているプラスミド（Alani et al., Genetics, 116, 541-545 (1987))からhisG-URA3-hisGのカセットを制限酵素で切りだし、プラスミド上の標的遺伝子に挿入し、破壊された対立遺伝子を構築する。このプラスミドを用いて染色体の標的遺伝子と置換して遺伝子破壊株を得る。染色体に挿入されたURA ３遺伝子はhisGではさまれており、hisG配列間での相同的組み換えにより１コピーのhisGとともに染色体から脱落する。染色体上の標的遺伝子にはなおも１コピーのhisG断片が残り破壊されたままであるが、宿主細胞はUra-表現形となる。このhisG間での相同的組み換えは5-フルオロオロト酸（5-FOA）により行なうことができる。ura3変異株は5-FOAに耐性であり（Boeke et al., Mol. Gen. Genet., 197, 345-346 (1984); Boeke et al., Methods Enzymol., 154, 165-174 (1987)）、Ura3+表現形を持つ細胞株は5-FOA培地に生育できなくなる。よって、5-FOAを加えた培地で耐性形質をもつ株を分離すれば、再びURA3マーカーを用いての操作が可能である。
【００４２】
以下、このOCH1遺伝子破壊株に、同様な手法にてMNN1遺伝子を遺伝子破壊を行うことにより、目的とする二重変異株（Δ och1 Δ mnn1) を得ることができる。
酵母の△ och1変異株は糖蛋白質のコア糖鎖にマンノース外鎖付加に必要な最初のα-1,6結合したマンノースを付加する反応が、またΔ mnn1変異株はコア糖鎖および外糖鎖分枝の非還元末端にα-1,3結合したマンノースを付加する反応が、各々欠損している。これらの変異を両方もつ二重変異株（△ och1 Δ mnn1 ）は、既に発明者らが提案（特許3091851）したように、Man8GlcNAc2の中性コア糖鎖を生産すると共に、この中性糖鎖以外に、マンノース-1-リン酸を含む酸性糖鎖も副生する（第１２回バイオテクノロジーシンポジウム予稿集、p.153-157、平成６年１０月１４日発行、バイオテクノロジー開発技術研究組合発行）。
【００４３】
また本発明に利用される酵母株として、マンノース-6-リン酸を含有する糖鎖を有することが必要である。この糖鎖は酵母においてもかなり普遍的に存在することが知られている。この糖鎖の生成に関与する遺伝子としてはSaccharomyces cerevisiaeにおいて図２に示される糖鎖構造式の*印の付されたマンノースの6位にマンノース-1-リン酸の付加反応を触媒する遺伝子（MNN6）と、このマンノース-1-リン酸の付加を制御する遺伝子（MNN4）が該当する。
【００４４】
リン酸含有糖鎖は対数増殖期より培養後期（定常期）に多く検出される。これはマンノース-1-リン酸の付加を制御する遺伝子（MNN4）の発現パターンと一致している。MNN4、MNN6遺伝子の発現を増強することにより、マンノース-6-リン酸を含有する糖鎖を多く含む酵母を育種することができると考えられる。
【００４５】
Saccharomyces cerevisiae KK4株はMNN4遺伝子のプロモーター部分に変異がかかっており、MNN4遺伝子が構成的に発現している株である。よってリン酸付加糖鎖を多く含有する。マンノース-6-リン酸を含有する糖蛋白質を生産するにはふさわしいと考えられる。
【００４６】
上記操作における、DNAの細胞への導入およびこれによる形質転換の方法としては、一般的な方法、例えば、ベクターとしてファージを用いる場合は、大腸菌宿主にこれを感染させる方法等により、効率よく宿主にDNAを取り込ませることができる。またプラスミドを用いて酵母を形質転換する方法としては、リチウム塩で処理して自然にDNAを取込みやすい状態にしてプラスミドを取り込ませる方法や、あるいは電気的にDNAを細胞内に導入する方法を採用できる（Becker and Guarente, Methods Enzymol., 194, 182-187 (1991)）。
【００４７】
また、上記操作における、DNAの単離・精製等は何れも常法、例えば大腸菌の場合、アルカリ/SDS法とエタノール沈殿によるDNA抽出、さらにRNase処理、PEG沈殿法などによりDNAを精製できる。また、遺伝子のDNA配列の決定等も通常の方法、例えばジデオキシ法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)）等により行なうことができる。さらに、上記DNA塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによっても容易に行ない得る。
【００４８】
さらに、上記の糖鎖を持つ異種生物由来の糖蛋白質を生産させるためには、上記酵母変異株を宿主として、目的の糖蛋白質をコードする遺伝子（cDNAなど）を酵母で発現出来るプロモーターの下流に接続した遺伝子を作製し、相同組換えによって上記酵母宿主に組み込むか、或いは、プラスミドに挿入して上記宿主を形質転換することにより、上記宿主の形質転換体を作製し、これを公知の方法により培養することにより、酵母細胞内または細胞外に生産された目的の糖蛋白質を回収できる。
【００４９】
その際の目的の糖蛋白質をコードする遺伝子は翻訳されるアミノ酸配列が同一であればよい。ヒトは酵母と比較しコドンユーセージが異なるため、ヒト由来遺伝子は酵母内での発現が低いことが多い。よって遺伝子を酵母型のコドンユーセージに変換した遺伝子を合成し用いることにより、高発現が期待される。用いる遺伝子は基本的にヒト由来酵素と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子である必要がある。つまり他種の酵素である場合、抗原性を有することが懸念されるためである。
【００５０】
上記の酵母変異株の培養は、酵母の培養に慣用される常法に従って行なうことができる。例えば、Difco社から供給される各種の培地成分を添加し、かつプラスミドの複製・保持に必要なマーカーによって供給可能となるアミノ酸を除いた合成培地（炭素源、窒素源、無機塩類、アミノ酸、ビタミン等を含む）等を利用できる（Sherman, Methods Enzymol., 194, 3-57 (1991)）。外来遺伝子をプラスミド上ではなく染色体に組み込んだ場合には、遺伝子が脱落することはないので、通常の栄養源が豊富な培地によって培養することができる。
【００５１】
上記の培養物（培養液、培養菌体）から糖蛋白質を単離精製するためには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。例えば、菌体内に存在する糖蛋白質については培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得、これを遠心分離することにより上清を得る。一方培養上清に存在する糖蛋白質については培養終了後、細胞を遠心分離により分離し、限外ろ過、塩析法等により濃縮する。以降の操作は通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）セファロース等を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、スルホプロピル（SP）セファロース（ファルマシア社製）等を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、フェニルセファロース等を用いた疎水性クロマトグラフィー法、セファクリル等を用いた分子篩を用いたゲルろ過法、群特異性担体、レクチンリガンド、金属キレートなどを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００５２】
本発明においてはアフィニティー・クロマトグラフィーを用いることによりリン酸化糖鎖を有するα-ガラクトシダーゼとリン酸化糖鎖を持たないα-ガラクトシダーゼとを分離することにも成功した。つまりブルーセファロース・クロマトグラフィーを用いることにより目的の糖蛋白質の分離に成功した。ブルーセファロースに用いられるアフィニティーリガンドはクロロトリアジン色素の一種であるシバクロンブルーF3GAであり、このようなリン酸化糖鎖を分離できるような色素をリガンドとしたアフィニティー・クロマトグラフィーにてマンノース-6-リン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質を精製する方法も応用できるであろう。
【００５３】
またリン酸による糖鎖の荷電の差を利用し、イオン交換、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動本発明を用いることにより、マンノース-6-リン酸含有糖鎖を有する糖蛋白質、より詳しくは下記の酵母特有のマンノース-1-リン酸中のマンノースが除去された糖蛋白質を精製、濃縮することができる。
【００５４】
さらにマンノース認識レクチンとして知られるConcanavalin A（ConA）の結合特異性の差を利用することにより、すなわち、リン酸を含まない糖鎖を有する酵母由来の糖蛋白質はα-マンノシダーゼによって糖鎖が切断され、ConAへの結合性が低下、あるいは欠損する。一方、リン酸を含有する糖鎖の場合、マンノース-6-リン酸を基質として認識しないため、糖鎖の削り込みがそれ以上行なわれず、ConAへの結合性が低下しない。これを利用することによりより生物的に高活性、すなわち細胞への取り込み活性が高い、より詳しくはマンノース-6-リン酸受容体への結合活性の高い、リソソーム酵素標品のみを得ることができ、高機能医薬品としての応用が期待できる。
【００５５】
本発明における酵母特有のマンノース除去に使用されるα-マンノシダーゼはマンノース-1-リン酸結合を分解し、エキソ型に作用し、糖蛋白質に作用し、かつ処理する糖蛋白質が安定なｐＨ域で作用するものであれば特に限定しない。これらのα-マンノシダーゼはα-1,2、α-1,3、α-1,6結合等のマンノシド結合に作用する他、p-ニトロフェニル-α-マンノピラノシドや4-メチルウンベリフェニル-α-マンノシピラノシド等の合成基質にも作用する等、幅広い基質特異性を有するものである。そのようなα-マンノシダーゼとしては、タチナタマメ（Jack Bean）α-マンノシダーゼ、酵母液泡由来マンノシダーゼ等が利用できると考えられる。しかし、タチナタマメ由来のα-マンノシダーゼは糖蛋白質の糖鎖そのものに対しては比較的酵素活性が弱く、長時間の反応が必要であり、また弱酸性側に至適ｐＨを有する（ｐＨ＝４．５）ため、弱酸性側で不安定な蛋白質は失活する恐れがあるため、糖蛋白質の糖鎖部分を除去した構造安定的な蛋白質の回収には不適と思われる。そこで更に酵素活性が強く、精製も容易であり、かつ糖蛋白質が安定な中性のｐＨで作用できる新規のα-マンノシダーゼが必要となってくる。本発明者等により取得されたCellulomonas SO-5株の生産するα-マンノシダーゼは上記の条件を満たし、本発明に有効な酵素と言えるであろう。尚、上記Cellulomonas SO-5株は、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１ 中央第６ 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに2001年６月１２日付けでFERM BP-7628という受託番号で国際寄託されている。
【００５６】
また本発明における酵素生産酵母は、最終的にα-マンノシダーゼ処理によって、マンノース-6-リン酸が生成し、かつ抗原性のない糖鎖を生産できるものであれば特に限定しない。例えば、Pichia pastorisはマンノース-1-リン酸含有糖鎖を有する糖蛋白質を生産するメタノール酵母であり、α-マンノシダーゼ処理によって出芽酵母由来のものと同等の糖鎖となることが期待できる。
【００５７】
さらに本発明で生産されるリソソーム酵素は、α-ガラクトシダーゼに限定されるものではない。例えば、Tay-Sachs病の治療薬となるb-ヘキソサミニダーゼ A、Sandhoff病の治療薬となるb-ヘキソサミニダーゼA及びB、Krabbe病の治療薬となるガラクトセレブロシダーゼ、Hurler病の治療薬となるa-イズロニダーゼ、Sly病の治療薬であるb-グルクロニダーゼ、フコシドーシスの治療薬であるa-フコシダーゼ、Schindler病・神崎病の治療薬であるa-N-アセチルガラクトサミニダーゼなどの遺伝子を同様に発現、精製することで各種リソソーム病の治療及び／または予防のための医薬として応用できる。
【００５８】
α-ガラクトシダーゼの場合、治療用途としての使用法は、治療に必要な量のα-ガラクトシダーゼを与えることによってファブリー病の治療に用いられる。この場合治療に必要な量とはファブリー病の症状を顕著に緩和させるα-ガラクトシダーゼの量である。α-ガラクトシダーゼは本発明の様に、マンノース-6-リン酸含有糖鎖を少なくとも１つ以上有し、ヒトマンノース-6-リン酸受容体に結合する活性を持つものである。α-ガラクトシダーゼは標準的な医療上許容しうる安定化剤、等張液等を含有した医薬組成物として投与され、たとえば静脈内注射により常法で投与される。本発明により生産されるα-ガラクトシダーゼはヒト組織から得られる精製酵素標品、動物培養細胞、トランスジェニック動物などによって生産される組換え酵素標品と比較して、マンノース-6-リン酸含有糖鎖を同等以上含有するので、より少ない投与量で効果を発揮することができ、かつヒト、動物組織を用いた医薬品で問題となるウイルス等の混入もないので安全かつ高機能の医薬組成物を提供できる。
【００５９】
本発明において、医薬組成物は、本発明の糖蛋白質の他、製薬上許容し得る安定化剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、嬌味剤、着色剤、香料等を適宜添加して、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の剤形にすることができる。また、本発明における医薬組成物の投与形態は、経口投与、あるいは静脈内注射、筋肉内注射等の非経口投与の何れでも良い。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路等により異なるが、通常成人一人あたり、有効成分の量として、経口投与の場合には1回に１〜１０mgの範囲で、非経口投与の場合には１回に１０〜５０mgの範囲で投与することが望ましい。
【００６０】
また本発明はリソソーム病治療薬に限らず、リソソームへ糖蛋白質を輸送させるための技術として利用可能である。これを利用して、リソソーム酵素の輸送機構や、リソソーム内での老廃物分解のメカニズムの解明が可能になり、この分野の研究の発展が期待される。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。
〔実施例１〕高リン酸化糖鎖含有糖鎖生合成二重変異酵母株（Saccharomyces cerevisiae Δ och1 Δ mnn1 株) の作製
すでに報告のあるpNK51(Alani et al., Genetics, 116, 541-545 (1987))より、URA3遺伝子の両端にサルモネラ菌hisG遺伝子がダイレクトリピートで結合しているカセット（HUH）をBglIIとBamHIで切断し、大腸菌プラスミドpSP73のBamHI部位に挿入した。このプラスミドをpSP73-HUHと命名した。
【００６２】
OCH1遺伝子は、酵母第７番染色体に位置し、OCH1遺伝子のDNA塩基配列は、GenBankデータベースにD11095で登録されている（Nakayama et al., EMBO J., 11, 2511-2519 (1992)）。すでに構築されているOCH1遺伝子破壊用ベクターpoch1::LEU2-1（Nakayama et al., EMBO J., 11, 2511-2519 (1992)）をSalIおよびHindIIIで切断することによりΔ och1::LEU2 を含む領域を切り出し、これを用いて高リン酸化糖鎖産生酵母であるSaccharomyces cerevisiae KK4株（MATa ura3 his1 or his3 trp1 leu2 gal80 ; Nogi et al., Mol. Gen. Genet., 195, 29-34 (1984)）を酢酸リチウム法（Ito et al., J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)）で形質転換した。Δ och1破壊を含む株は低浸透圧感受性を示すため、0.3 M KClを含むSD-Ura（2％グルコース、0.67 % Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco社製）、ウラシルを除く核酸塩基、およびアミノ酸混合物（20-400 mg/L））培地のプレートにまいて、30℃で2日間培養し、形質転換体を得た。
形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法によりウラシルマーカーがΔ och1領域の染色体に組込まれていることを確認し、HPY11株とした。
【００６３】
一方MNN1遺伝子は、酵母第５番染色体動原体近傍に位置し、MNN1遺伝子のDNA塩基配列は、GenBankデータベースにL23753で登録されている(Yip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9, 2723-2727 (1994))。MNN1遺伝子の３’領域をプライマーA(GGATCCGAAGAAAACCTAATACATTGAAGT：配列番号１)とプライマーB(GCATGCCCTTTGGTTTAATATAAATCTCCGGAGTGC：配列番号２)を用いて、また、５’領域をプライマーC(GCATGCTACATAACTCCAATCAGCAGCAAATATGTC：配列番号３)とプライマーD(GCGGCCGCGTGTTCTGTTCGGGTAACGTTTAAACCAAT：配列番号４)を用いて、それぞれPCRで増幅した。これらのDNA断片をHIS3マーカーを持つプラスミドpHYHのSphI部位に組込み、pHYHΔmnn1を作製した。MNN1遺伝子をHUHカセットを用いて破壊するために、1.8ｋｂのSph I断片をpHYHΔmnn1より取得しpSP73-HUHのSph I部位に挿入したpSP73-Δmnn1::HUHを構築した。本プラスミドをNot I部位で切断することにより直鎖化し、HPY11株を酢酸リチウム法を用いて形質転換した。形質転換後、0.3 M KClを含むSD-Ura培地のプレートにまいて、30℃で2日間培養し、形質転換体を得た。
【００６４】
形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法によりウラシルマーカーがMNN1領域の染色体に組込まれていることを確認し、HPY22株とした。本株を、0.3 M KClと5-FOAを含有したYSD 培地（1%酵母抽出液、2%グルコース、アデニン (40 mg/L)、ウラシル(20mg/L)） にて選抜を行ない、URA3遺伝子脱落株を得た。上記の方法と同様にPCR法を用いてURA3遺伝子を脱落させたmnn1破壊株を確認した。Δ och1::LEU2 Δ mnn1::hisGを含む本株を、高リン酸化糖鎖含有二重変異酵母株Saccharomyces cerevisiae HPY21株とした。
【００６５】
〔実施例2〕 Δ och1 Δ mnn1二重破壊株へのα-ガラクトシダーゼ
遺伝子の導入
ヒトα-ガラクトシダーゼ 遺伝子配列は、 GenBankデータベースにNM000169で登録されている（Nucleic Acids Res. 17 (8), 3301-3302 (1989)）。 すでに報告されているpCXN2（Ishii et al., Hum. Genet. 89, 29-32 (1992)）よりEcoRIで切断し、ヒトα-ガラクトシダーゼのcDNA領域（-16〜+1290；配列番号５）を切り出した。次に酵母での発現を行うため、酵母発現ベクターであるプラスミドYEp352-GAPのEcoRI部位に挿入した。このプラスミドをYEp352-GAP-GLNと命名した。次にこのプラスミドからBamHIでプロモーター、ターミネーター領域を含むヒトα-ガラクトシダーゼのcDNA領域を切り出し、インテグレーションベクターであるpRS404のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpRS-GLN-4をBst1107Iで切断後、実施例1で作成したS. cerevisiae HPY21株を形質転換した。形質転換は酢酸リチウム法を用いて行なった。形質転換後、0.3 M KClを含むSD-Trp（2％ グルコース、0.67 % Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco社製)、トリプトファンを除く核酸塩基およびアミノ酸混合物（20-400 mg/L））培地のプレートにまいて、30℃で2日間培養し、形質転換体S. cerevisiae HPY21G 株 を得た。
【００６６】
次にS. cerevisiae HPY21G株を5 mlの0.3MのKClを含むYPAD培地（2% ポリペプトン、1% 酵母抽出液、2% グルコース、アデニン (40 mg/L)）で30℃で３日間培養後、遠心分離により培養上清を得た。限外ろ過膜（ウルトラフリーC3LGC (分子量10000カット)、ミリポア社）にて約5倍に濃縮したものを粗酵素液とした。粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法にてウエスタンブロット解析を行なった。ウエスタンブロット解析は一次抗体としてウサギ抗α-ガラクトシダーゼ抗体を、二次抗体として抗ウサギIg抗体アルカリフォスファターゼ複合体を用い、検出はCDP-Starシステム（Pierce社）を用いてX線フィルムに露光することで行なった。
その結果、コントロール株であるHPY21株ではシグナルが全く見られないのに対し、HPY21G株で形質転換したものの培養上清には、分子量約50 kDaの位置にシグナルが確認された（図５）。
【００６７】
次に粗酵素液中のα-ガラクトシダーゼ の酵素活性を測定した。5mMの4-メチルウンベリフェリル-D-ガラクトピラノシドが入った0.15M酢酸緩衝液（pH4.6）60μlに酵素液10μlを加え、３７℃にて３０分間反応させた。これに0.2Mグリシン/水酸化ナトリウム緩衝液（pH10.7）700μlを加え、反応を停止した。これを蛍光光度計（Ex:365nm, Em:450nm）にて測定した。その結果、HPY21G株の粗酵素液を酵素源とした場合、コントロールであるHPY21株の粗酵素液と比較し蛍光が明らかに増加していた（表1）。
【００６８】
【表１】
〔実施例３〕 α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した株の培養上清からのα-ガラクトシダーゼの精製、及び精製酵素の糖鎖構造解析
α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したHPY21G株の培養、粗酵素液の調製は実施例２に準じて行った。粗酵素液をpH 4.5に調整し、ブルー・セファロースCL-6B（ファルマシア社）カラムクロマトグラフィーに供した。酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）にて洗浄後、4 M NaClを含むMES緩衝液（pH 6.0）にて溶出した。各画分の酵素活性を測定した結果、α-ガラクトシダーゼ活性はカラム素通り画分にも、溶出画分にも存在した。それぞれの画分をCon Aセファロースに供した。0.15 M塩化ナトリウム、0.5 mM塩化カルシウム、0.5 mM塩化マンガンを含むMES緩衝液（pH 6.0）にて洗浄後、0.15 M塩化ナトリウム、0.5 mM塩化カルシウム、0.5 mM塩化マンガン及び0.2 Mのα-メチルマンノシドを含むMES緩衝液（pH 6.0）にてα-ガラクトシダーゼを溶出した。溶出画分をさらにMonoQに供した。MES緩衝液（pH 6.0）にて洗浄後、1 M NaClを含むMES緩衝液でグラジエント溶出を行なった。酵素活性の強い画分を透析後、濃縮し精製α-ガラクトシダーゼ標品を得た。
【００７０】
得られたα-ガラクトシダーゼに対し、酵素処理を施しアスパラギン結合型糖鎖を切り出した。凍結乾燥品を100μlのN-グリコシダーゼF用緩衝液（0.5% SDS, 0.35% 2-メルカプトエタノールを含む0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)）に溶解し、5分間煮沸処理をした。室温まで戻した後、50μlの7.5% Nonidet P-40、138μlのH2O、12μlのN-glycosidase F（ベーリンガー社製）を加え、37℃ 、16時間処理した。BioRad AG50W-X8カラムで脱塩し、糖鎖調製品とした。
【００７１】
得られた糖鎖を蛍光標識（ピリジルアミノ化、PA化という）するため、以下の操作を行なった。糖鎖調製品を濃縮乾固後、40μlのカップリング試薬（552 mgの2-アミノピリジンを200μl の酢酸に溶解した）を加え、密封し、90℃、60分処理した。室温まで戻した後、140μl の還元試薬（200 mgのボラン・ジメチルアミン複合体を50μl のH2Oと80μlの酢酸に溶解した）を加え、密封し、80℃、80分処理した。反応後、TOYOPEARL HW-40F（東ソー）でゲル濾過を行ない、未反応の2-アミノピリジンを除去した。糖鎖画分について0.22μm のフィルターで濾過し、PA化オリゴ糖調製品とした。
【００７２】
糖鎖構造解析は本発明者らが提案した方法（特開平9-135689）に準じて行った。アミノカラムを用いたHPLCでは、PA化オリゴ糖をその鎖長によって分離することが可能である。更にリン酸化糖鎖と非リン酸化糖鎖をも分離することができる。これはリン酸がアミノカラムに強く吸着するため溶出時間が遅れることに起因している。カラムはアミノカラムAsahipak NH2P-50 (4.6 x 250 mm) を用い、溶媒はA液として200 mM 酢酸-トリエチルアミン (pH 7.2)を、B液としてアセトニトリルを用いた。予め溶媒Aを30％、溶媒Bを70％で流速1.0 ml/minで流すことによりカラムを平衡化し、溶出は1.0 ml/minの流速で、B液70%から始まり、50分でB液20%となるリニアグラジエントをかけることでPA化オリゴ糖を溶出した。その結果を図６に示す。ブルー・セファロース溶出画分のα-ガラクトシダーゼから調製された糖鎖は20分付近（ピークA）に溶出され、一方ブルー・セファロース素通り画分のα-ガラクトシダーゼから調製された糖鎖は30分付近（ピークＢ）と38分付近（ピークＣ）の２ケ所に溶出された。
【００７３】
ピークAはMan8GlcNAc2-PAと同じ位置に溶出されてくることから、リン酸が付加していないMan8GlcNAc2構造を持つ糖鎖であることが解った。ピークＢ及びピークＣは溶出位置から、ピークＢはマンノース-1-リン酸が１つ結合している糖鎖、ピークＣはマンノース-1-リン酸が２つ結合している糖鎖であることが示唆された。ピークＢ及びピークＣについては更に下記の方法に従いアルカリフォスファターゼ処理により構造を確認した。
【００７４】
以上のことからα-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した高リン酸化糖鎖含有糖鎖生合成二重変異酵母株HPY21G株にて生産されたα-ガラクトシダーゼの糖鎖は(Man-P)2-Man8GlcNAc2、(Man-P)-Man8GlcNAc2のリン酸付加ハイマンノース型糖鎖、及びMan8GlcNAc2のハイマンノース型糖鎖であることが明らかとなった。その量比は約1：1：1であった。
またブルー・セファロース・クロマトグラフィーを用いることによりリン酸化糖鎖を有するα-ガラクトシダーゼとリン酸化糖鎖を持たないα-ガラクトシダーゼとを分離することが可能であることが解った。
【００７５】
反応産物（ピークＢおよびＣ）（図６）が、マンノース-1-リン酸が付加した産物であるかどうかを解析した。まず、すでにNMRでその構造が確認できている化合物（図３、構造式II, IIIおよびIV）について、HPLCにより分析したところ、構造式II, IIIのものは、30分付近に溶出された。従って、活性測定で現れたピークＢはマンノース-1-リン酸が１つ結合している糖鎖と同じものを含んでいると考えられた。またマンノース-1-リン酸が２つ結合している構造式IVの溶出位置は、ピークよりもかなり遅れて溶出することから、ピークＣはマンノース-1-リン酸が２つ結合している糖鎖と推定された。
【００７６】
さらに、ピークＢがマンノース-1-リン酸が１つ結合した糖鎖であることを直接確認するため、ピークＢを分取し、マンノース-1-リン酸残基のマンノース部分を切り出すためJack Beanα-マンノシダーゼによる消化を行なった。分取したピークの溶媒を凍結乾燥で除き、Jack Beanα-マンノシダーゼ（生化学工業社製）60 mUを含む酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）を加え、３７℃で一晩反応させた。その結果図7bに示すように、もとの糖鎖より遅い位置に溶出された。更にアルカリフォスファターゼ処理を行ったところ、Man4GlcNAc2-PAと同じ位置に溶出されたことから、Jack Beanα-マンノシダーゼで処理された糖鎖はPO4-Man4GlcNAc2-PAの構造を持つことが解った。同様にしてピークＣについてもJack Beanα-マンノシダーゼ処理、アルカリフォスファターゼ処理を行なった結果、ピークＢと同様に遅い位置に溶出してきた。またアルカリフォスファターゼ処理では、Man6GlcNAc2-PAと同じ位置に溶出してきた（図7d）ことから、ピークＣは図3の構造式IVに示される酸性糖鎖であることが明らかとなった。
以上の結果から、本株は有効なマンノース-６-リン酸付加酸性糖鎖含有糖蛋白質の前駆体としてのマンノース-１-リン酸付加酸性糖鎖含有糖蛋白質の生産に適していることが示された。
【００７７】
[参考例1] Cellulomonas SO-5由来酵素のα-マンノシダーゼおよび夾雑酵素の活性測定法
本発明者等は、土壌中細菌から新規α-マンノシダーゼを生成する細菌をスクリーニングする際のマンナン分解活性の測定を、α-マンナンを基質として反応を行い、遊離した糖の還元力を測定することによって行なった。すなわち、α-マンナン（終濃度0.1％）と酵素液を含む反応液（0.4 M リン酸緩衝液、pH 7.0）中、３７℃で１０分間、反応を行い、反応後マンノースを標準として還元糖をネルソン・ソモジ（Nelson？Somogi）法によって測定した（福井作蔵、生物化学実験法シリーズ１，還元糖の定量法（学会出版センター）、p. 10(1979)）。
【００７８】
精製の各段階の粗酵素および部分精製酵素のα-マンノシダーゼ活性の測定は、4-メチルウンベリフェリル（MU）-α-マンノピラノシドを基質として反応を行い、遊離する4-MUを測定することによって行なった。すなわち、0.5 mM 4-MU-α-マンノピラノシドと酵素液を含む反応液70 μl（0.15 M NaClを含む20 mＭリン酸緩衝液、 pH 7.5）中、37℃で30分間反応後、0.2 M グリシン緩衝液（pH 10.7）を700μl加えて反応を停止した。うち100 μlをとり、遊離した4-MUの蛍光量をマイクロプレートリーダー（Ex:385 nm, Em:450 nm）で測定した。酵素活性の単位は、上記反応において1分間に1 μmoleの4-MUを遊離する酵素量を１ユニット（以下「U」と略す）とした。
【００７９】
共存する夾雑酵素の測定法は以下のように行なった。
エンド-α-マンノシダーゼ活性の測定は、α-1,6-マンナンを基質として反応を行い、遊離した糖の還元力を測定することによって行なった。すなわち、α-1,6-マンナン（終濃度0.1％）と酵素液を含む反応液（0.4 M リン酸緩衝液、pH 7.0）中、３７℃で１０分間、反応を行い、反応後マンノースを標準として還元糖をネルソン・ソモジ（Nelson Somogi）法によって測定した（福井作蔵、生物化学実験法シリーズ１，還元糖の定量法（学会出版センター）、p. 10(1979)）。
【００８０】
β-マンノシダーゼ活性の測定は、p-ニトロフェニル（pNP）-β-D-マンノピラノシドを基質として反応を行い、遊離するpNPを測定することによって行なった。すなわち、5 mM pNP-β-D-マンノピラノシドと酵素液を含む反応液70 μl（0.15 M NaClを含む20 mＭリン酸緩衝液、 pH 7.5）中、37℃で24時間反応後、0.2 M グリシン緩衝液（pH 10.7）を700μl加えて反応を停止した。うち100 μlをとり、遊離した4-MUの蛍光量をマイクロプレートリーダー（Ex:385 nm, Em:450 nm）で測定した。酵素活性の単位は、上記反応において1分間に1 μmoleの4-MUを遊離する酵素量を１ユニット（以下「U」と略す）とした。
【００８１】
[参考例2] α-マンノシダーゼ生産菌のスクリーニング
マンノシダーゼを誘導生産するための培地（マンナン液体培地）は以下の通りに作成した。パン酵母マンナン2 g、硫酸アンモニウム［（NH4）2SO4］500 mg、硫酸第二鉄［Fe2SO4］ 20 mg、硫酸マグネシウム［MgSO4・7H2O］ 400 mg、塩化カルシウム［CaCl2・2H2O］ 60 mg、酵母エキス 1 g、第二リン酸カリウム［K2HPO4］ 7.54 g、第一リン酸カリウム［KH2PO4］ 2.32 gに水を加えて１Ｌとした。またマンノシダーゼ生産菌を単離するための平板培地は、上記マンナン液体培地に寒天末を1.5%になるように加えたものを用いた。
【００８２】
試験管に入った2 mlのマンナン液体培地に、土壌懸濁水から植菌耳で植菌し、30℃、2晩振盪培養した。この培養液を植菌耳で新しい2 mlのマンナン液体培地に植え継ぎし、再び30℃、2晩振盪培養した。2晩の振盪培養を計3回行なった後、1晩の振盪培養を2回行なった。培養液を遠心し、培養上清を10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に対して透析した粗酵素液を、マンナン分解酵素活性の測定に用いた。活性のあった土壌サンプルについて、さらにα-マンノシダーゼ生産菌のスクリーニングを進めた。
【００８３】
活性のあった培養液を、線引き法、希釈法にて平板プレートに植菌して、30℃で培養した。数日後、現れたコロニーを拾い、マンナン液体培地に植菌して30℃、2晩振盪培養した。培養液を遠心し、培養上清を10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に対して透析した粗酵素液について、α-マンナンと合成基質を用いて酵素活性を測定した。
【００８４】
この操作を数回繰り返し、確実なシングルコロニーを拾って完全なα-マンノシダーゼ生産菌の単離を行なった。この生産菌をSO-5と命名した。なお、このSO-5株は、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１ 中央第６ 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに2001年６月１２日付けでFERM BP-7628という受託番号で国際寄託されている。
【００８５】
[参考例3] 新規なα−マンノシダーゼ生産菌SO-5の同定
リボゾームRNA遺伝子の塩基配列の相同性は分子系統、分類上重要であり、遺伝子のコピー数、構成は種によって異なっている。したがってリボゾームRNAの塩基配列により細菌の同定が可能である。
【００８６】
SO-5株よりWizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ社製）を用いてゲノムDNAを単離した。これをテンプレートDNAとし、リボゾームRNA領域をコードする部分の塩基配列をPCRにて増幅した。プライマーはSPF1（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG:配列番号５）とSPR1（GGTTACCTTGTTACGACTT：配列番号６）を用い、得られた約1.5 kbの断片をPGEM-T vector（プロメガ社製）にクローニングした後、ジデオキシ法により部分塩基配列を決定した。その結果を配列番号７に示した。
【００８７】
この配列を日本DNAデータバンクのweb siteから利用できるBLASTシステムを用いて相同性検索を行なったところ、Oerskovia xanthineolyticaならびにCellulomonas属と高い相同性がみられた。Oerskovia属は樹枝状に成長するが、SO-5株は普通の丸いコロニーを形成する。これらの結果から、SO-5株はCellulomonas sp.であることが推定された。
【００８８】
[参考例4] α-マンノシダーゼの生産と部分精製
α-マンノシダーゼを誘導生産するため、実施例２で得られたSO-5をマンナン液体培地で30℃、一晩培養を行なった。培養後、4℃、15,000 x gで10分遠心し、菌体を除去した。上清を2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行ない、粗酵素液とした。
【００８９】
次にこの粗酵素液に終濃度1.2 Mとなるように硫酸アンモニウムを添加したあと、4℃で一晩混合した。これを遠心し、沈殿を除いた上清に対し、さらに終濃度1.7 Mとなるように硫酸アンモニウムを添加したあと、4℃で一晩混合した。次に4℃、15,000 x gで10分遠心し、沈殿する蛋白質を回収した。得られた沈殿物をH2Oに溶解し、2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行なった。これを2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で平衡化したHiTrap Qカラムに供した。NaClの濃度を1 Mまで増加させるグラジエント溶出を行ない、活性画分を得た。これを2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行ない、部分精製標品とした。
部分精製標品は[参考例1]に従い、α-マンノシダーゼ活性、エンド-α-マンノシダーゼ活性、β-マンノシダーゼ活性を測定した。比活性は31.9 mU/mgで、エンド-α-マンノシダーゼ活性、β-マンノシダーゼ活性は検出されなかった。
【００９０】
[参考例5] Cellulomonas属由来のα-マンノシダーゼの酵素学的性質
測定は参考例4で得られた精製酵素を用いて行なった。
（ａ）至適ｐＨ：本酵素について酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0〜6.5）、リン酸緩衝液（pH 6.0〜8.0）、トリス緩衝液（pH7.5〜10.0）を用いて37℃、30分間の酵素反応を行い、至適ｐＨを調べたところ、ｐＨ７〜８、特に7.5付近であった。
（ｂ）至適温度：本酵素について20〜80℃の各温度でリン酸緩衝液（ｐＨ 7.5）中、30分間反応させて至適温度を調べたところ、35〜45℃、特に40℃付近であった。
【００９１】
（ｃ）安定温度：本酵素について0.1 Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）中、0〜80℃の範囲で30分間処理した後、37℃、30分間の酵素反応によって残存活性（相対活性）を調べたところ、４０℃まで安定であった。
（ｄ）金属イオンの影響：本酵素について無機イオンおよび阻害剤による影響を、反応系に添加して37℃、30分間の酵素反応によって調べた。Ca2+によって僅かに（１０％）活性化された。またHg2+、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって活性が100％阻害されるが、Ca2+の添加によって活性が回復した。
【００９２】
（ｅ）ミハエリス定数：本酵素の4-MU-α-マンノピラノシドに対するミハエリス定数（Km）を、基質濃度の逆数と反応速度の逆数をプロットとして求めたところ、Km=0.32 mM-1であった。なお、高濃度の基質（1 mM以上）では、基質阻害が見られた。
（ｆ）高マンノース糖鎖に対する作用：アミノカラムを用いたHPLCでは、蛍光標識された（PA化）オリゴ糖をその鎖長によって分離することが可能である。カラムはSHODEX AsahiPak NH2P-50（4.6 x 250 mm、昭和電工製）を使用し、溶媒は、200 mM酢酸-トリエチルアミン緩衝液（pH 7.0）とアセトニトリルとの30：70の混合液（A液）、200 mM酢酸-トリエチルアミン緩衝液（pH 7.0）とアセトニトリルとの50：50の混合液（B液）を調製した。予め溶媒Aを流速1.0 ml/minで流すことによりカラムを平衡化し、試料注入直後から溶媒Bの割合を50分かけて100％まで直線的に上昇させ、PA化オリゴ糖を溶出した。PA化糖鎖は蛍光検出器（励起波長:320nm, 蛍光波長:400nm）にて検出した。反応は糖鎖100 pmolに対し、本発明酵素画分20 μUを加え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）中、37℃で10分から2時間反応した。下記構造式のMan8GlcNAc2-PA（Ｍ８）
【００９３】
【化５】
【００９４】
（ｇ）β-マンノシド結合を有する糖鎖に対する作用：ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-マンノシドを基質とした際には活性が見られなかったことから、β-マンノシドには作用しないことが明らかとなった。
（ｈ）酵母リン酸含有酸性糖鎖に対する作用：酵母の生産する糖鎖中にはマンノースリン酸を含有する糖鎖が知られている（Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Biochem., 56, 915-944 (1987)）。下記構造式
【００９５】
【化６】
【００９６】
[参考例6] 糖蛋白質に対する作用
リボヌクレアーゼB（RNase B）は高マンノース型糖鎖を有する糖蛋白質として知られている。リボヌクレアーゼB 20 μgに対し、[参考例2]で得られたα-マンノシダーゼ画分を100 μU加え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）存在下で、37℃、14時間反応させた。なお、コントロールとしてα-マンノシダーゼ画分の代わりに緩衝液のみを等量加えた。それぞれをSDS-PAGEで分析したところ、コントロールに対し、α-マンノシダーゼ画分を加えたものでは見かけの分子量が減少していた。この分子量はペプチド部分の配列が同じで、糖鎖のみを欠損したリボヌクレアーゼ A（RNase A）のものと近似していた。これらのリボヌクレアーゼ活性を測定したところ、反応前と比べ活性の減少はほとんど見られなかった。従ってこれらのことから、本酵素画分を加えたものでは、高マンノース型糖鎖のα-マンノシド結合部分のみが切断され、糖鎖の根元部分に当たるManβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcが残ったものの、蛋白質部分には影響がないことが示唆された。
【００９７】
〔実施例４〕 各種α-マンノシダーゼによる消化実験
実施例３で得られたα-ガラクトシダーゼを、各種α-マンノシダーゼで処理し、糖蛋白質にα-マンノシダーゼが作用し、糖鎖中のマンノース-1-リン酸結合が分解できるかどうか検討した。
【００９８】
実施例３で精製したα-ガラクトシダーゼ1 mgに対し、Jack Bean α-マンノシダーゼ（生化学工業社製）2 mUを含む酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）を加え、３７℃で一晩反応させた。このα-ガラクトシダーゼのウエスタンブロット解析を行なったところ、α-マンノシダーゼ未処理のものと移動度が変わらなかった。また糖鎖構造解析の結果でも、糖鎖中のマンノース-1-リン酸結合は切断されていなかった。従ってこの条件では糖鎖中のマンノース-1-リン酸結合は切断されないと考えられた。
このことから新たなマンノシダーゼのスクリーニングが必要であると考えられた。そこで、上記Cellulomonas SO-5株由来のα-マンノシダーゼを用いて、マンノース-1-リン酸結合の切断を試みた。
【００９９】
実施例３で精製したα-ガラクトシダーゼ1 mgに対し、上記Cellulomonas SO-5株由来α-マンノシダーゼ 90μUを含む生理食塩水緩衝液（PBS ; pH 7.5）を加え、３７℃で一晩反応させた。このα-ガラクトシダーゼのウエスタンブロット解析を行なったところ、α-マンノシダーゼ未処理のものに比べ 移動度が大きくなっていた（図8）。このα-ガラクトシダーゼの糖鎖構造解析を実施例3に従って行なったところ、糖鎖中のマンノース-1-リン酸結合は切断されており、リン酸が露出した時と同じ溶出位置に見られた（図9）。
更にアルカリフォスファターゼ処理を行ったところ、Man6GlcNAc2-PAと同じ位置に溶出されたことから、α-マンノシダーゼで処理された糖鎖は(PO4)2Man6GlcNAc2-PAとPO4-Man4GlcNAc2-PAの構造を持つことが解った。
【０１００】
〔実施例５〕 高リン酸化糖鎖含有α-ガラクトシダーゼの大量調製
高リン酸化糖鎖含有α-ガラクトシダーゼの大量調製を行なった。実施例３で精製したα-ガラクトシダーゼ300μgに対し、上記Cellulomonas SO-5株由来α-マンノシダーゼ 30 mUを含むリン酸緩衝液（pH 7.5）を加え、３７℃で6時間反応後、さらに30 mUのα-マンノシダーゼを加え、12時間反応させた。反応後に、MonoQカラムを用いて精製を行なった。α-ガラクトシダーゼ活性は15-18本目の画分に、α-マンノシダーゼ活性は26-29本目の画分に回収された。
【０１０１】
〔実施例６〕 ファブリー病患者から得られた培養皮膚繊維芽細胞を用いた精製α-ガラクトシダーゼへの取り込み実験
ファブリー病患者由来の培養皮膚線維芽細胞（F377、F87）を、10%となるようにFCSを加えた Ham's F10培地で、直径3.5 cmシャーレ中、5% CO2の下３７°Cで培養した。次に、実施例５においてマンノシダーゼ処理した、または未処理のα-ガラクトシダーゼを終濃度0.1μg/mlまたは1μg/mlで培養液中に添加し、18時間後に細胞を採取し、細胞抽出液中のα-ガラクトシダーゼ活性を測定した。なお、コントロールとして正常人由来の培養皮膚線維芽細胞（F592）の細胞内活性も測定した。またマンノース-6-リン酸レセプター依存的な取り込みであることを確認するために、上記の系にさらに終濃度5 mMとなるようにマンノース-6-リン酸を培養液中に添加し、阻害実験を行なった。その結果を図10に示す。
【０１０２】
終濃度1μg/mlでα-ガラクトシダーゼを添加した場合、マンノシダーゼ未処理の酵素に対し、処理後の酵素の投与によりファブリー病患者由来細胞内のα-ガラクトシダーゼ活性は約3倍の増加を示した。またこの酵素活性の増加はマンノース-6-リン酸によって阻害を受けることから、マンノシダーゼ処理後のα-ガラクトシダーゼはマンノース-6-リン酸レセプター依存的に細胞に取り込まれていることがわかった。すなわち、マンノシダーゼ処理後のα-ガラクトシダーゼは、ヒトと同様のマンノース-6-リン酸含有糖鎖構造を有していることを示唆するものである。
【０１０３】
次に、ヌンク社の８穴チャンバースライドを用いて1チャンバー当たり5 x 103 cellsのファブリー病患者由来の培養皮膚線維芽細胞（F377）を播き、24時間培養後、α-ガラクトシダーゼを1μg/mlとなるように加えた。なお、コントロールとして正常人由来の培養皮膚線維芽細胞（F592）についても同様に行なった。18時間、または５日間培養後、蓄積物であるグロボトリアオシルセラミド（CTH）に対する抗体を一次抗体として、免疫蛍光染色を行なった（図11）。
【０１０４】
ファブリー病患者由来の培養皮膚線維芽細胞の培養液中にα-ガラクトシダーゼを加え、細胞内に蓄積しているCTHに対する効果を免疫染色法で解析した（図１１の右側−酵素(+)）。CTHの検出については、一次抗体として抗CTH抗体で処理し、次にFITC-抗マウスIgG抗体を二次抗体として用いて染色し、緑色で可視化した。細胞内のα-ガラクトシダーゼに関しては、一次抗体として抗α-ガラクトシダーゼ抗体で処理した後に、二次抗体としてCy3-抗ウサギIgG抗体で染色して赤色で可視化した。両者が混在する領域は黄色で表現される。比較のため、正常者由来の培養皮膚線維芽細胞をα-ガラクトシダーゼ未処理のファブリー病患者由来の培養皮膚線維芽細胞の染色性を図の左側に示した（酵素(-)）。
【０１０５】
その結果、マンノシダーゼ処理後のα-ガラクトシダーゼを加えた場合、5日後で抗CTH抗体による染色性が明らかに減少していた。また、α-ガラクトシダーゼは投与後18時間で細胞内に取り込まれており、5日後でも依然染色されたことから非常に安定であると考えられる。蓄積していたCTHが分解されたことから、本発明で作製したα-ガラクトシダーゼがリソソーム病治療薬として有効であることが示唆された。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明による酵母を用いる遺伝子工学的手法により、ヒトなど哺乳類細胞のリソソームへ輸送されるための標識マーカーとして機能しうるリン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質を多量かつ純度よく製造することができる。本発明におけるリン酸含有酸性糖鎖を有する糖蛋白質はヒトのリソソーム酵素の欠損症の治療などに有効な薬剤として利用することができる。
【０１０７】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
【図面の簡単な説明】
【図１】哺乳類動物での一般的なN-結合型糖鎖の生合成経路を示す（konfeldら）。
【図２】酵母（S. cerevisiae）におけるN-結合型糖鎖の生合成経路を示す。
【図３】酵母HPY21株（Δ och1 Δ mnn1）で生成されるコア糖鎖ならびに酸性糖鎖の構造を示す。
【図４】本発明におけるストラテジー図を示す。
【図５】α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したHPY21G株の培養上清液を用いたウエスタンブロット解析を示す。１）ベクターのみを導入した株（HPY21株）２）α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した株（HPY21G株）
【図６】α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したHPY21G株の培養上清濃縮液よりブルーセファロースで分離したα-ガラクトシダーゼ糖鎖の糖鎖構造解析の結果を示す。
【図７】α-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したHPY21G株の培養上清濃縮液より精製したα-ガラクトシダーゼ糖鎖のAsahi-Pak NH2-Pカラムでの糖鎖構造解析の結果を示す。
１）培養上清精製α-ガラクトシダーゼの糖鎖（リン酸を糖鎖内に1分子含むもの）
２）１）のα-マンノシダーゼ処理後の糖鎖
３）２）のアルカリホスファターゼ処理後の糖鎖
４）培養上清精製α-ガラクトシダーゼの糖鎖部分（リン酸を糖鎖内に２分子含むもの）をα-マンノシダーゼ、アルカリホスファターゼ処理した糖鎖
【図８】精製α-ガラクトシダーゼをCellulomonas SO-5株の生産するα-マンノシダーゼで処理した後のウエスタンブロット解析を示す。
１）α-マンノシダーゼ未処理のもの
２）α-マンノシダーゼ処理したもの
【図９】Cellulomonas SO-5株の生産するα-マンノシダーゼで処理したα-ガラクトシダーゼから得られた糖鎖のAsahi-Pak NH2-Pカラムでの構造解析を示す。
【図１０】ファブリー病患者から得られた培養皮膚繊維芽細胞を用いた本発明で得られた精製α-ガラクトシダーゼへの取り込み実験（酵素活性測定）の結果である。
【図１１】ファブリー病患者から得られた培養繊維芽細胞に本発明で得られた精製α-ガラクトシダーゼを投与した際の蓄積した基質に対する効果を示す図である（蛍光抗体法による顕微鏡図）。
【符号の説明】
GlcNAc, GN： N- アセチルグルコサミン
Man, M ：マンノース
PA ： 2-アミノピリジル化
Claims (14)
- α-1,6マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子及びα-1,3マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊した酵母に糖蛋白質をコードする遺伝子を導入し、該遺伝子を発現させて産生されたマンノース-1-リン酸付加酸性糖鎖を有する糖蛋白質を、Cellulomonas SO-5株（FERM BP-7628）由来のα-マンノシダーゼで処理して該糖鎖のマンノース-1-リン酸からマンノース残基を切除することにより、マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有する酸性糖鎖を有する活性型糖蛋白質を製造する方法。
- マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有する酸性糖鎖がマンノース-6-リン酸レセプターと結合し得る糖鎖である請求項１に記載の方法。
- マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有する前記糖鎖が、下記構造式I〜VIIのいずれかに示すハイマンノース型糖鎖である、請求項１または２に記載の方法。
- α-1,6マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子がS. cerevisiae におけるOCH1遺伝子であり、α-1,3マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子がS. cerevisiae におけるMNN1遺伝子である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 酵母が高リン酸化糖鎖含有変異株である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記酵母においてMNN4遺伝子の発現が増強されている、請求項５に記載の方法。
- 糖蛋白質がリソソーム酵素である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- リソソーム酵素がα-ガラクトシダーゼである請求項７に記載の方法。
- α-ガラクトシダーゼの構造遺伝子がヒト由来遺伝子である請求項８に記載の方法。
- α-ガラクトシダーゼの構造遺伝子が配列番号５に示される塩基配列を有するものである、請求項９に記載の方法。
- α-マンノシダーゼがα-1,2マンノシド結合、α-1,3マンノシド結合、α-1,6マンノシド結合を非特異的に分解する活性を有するものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- α-マンノシダーゼ活性がエキソ型活性であり、エンド型活性はないものである、請求項１１に記載の方法。
- 請求項７に記載の方法により、マンノース-6-リン酸を非還元末端に含有する酸性糖鎖を有する活性型リソソーム酵素を製造し、それを用いて医薬組成物を製造することを特徴とする、リソソーム病の治療および／または予防のための医薬組成物の製造方法。
- リソソーム酵素がヒトα−ガラクトシダーゼであり、医薬組成物がファブリー病治療のための医薬組成物である、請求項１３に記載の方法。
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