JP4694867B2 - 多孔性膜上に現れる輪を測定する試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キット - Google Patents

Description

本発明は、試料中に微量に含まれる測定対象物質を、ごく簡便且つ正確に測定することができる測定方法及び測定キットに関するものである。
本発明は、分析化学、生命科学、医療、薬品製造、食品衛生、及び環境科学等において有用であり、特に臨床検査分野において有用なものである。

抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオチド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレセプター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用した試料中に含まれる微量の測定対象物質の測定方法及び測定キットは種々のものが知られている。

中でも、抗原と抗体の間の抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法及び免疫学的測定キットは広く実施され、利用されている。
この免疫学的測定方法のうち間接凝集反応測定法は簡易かつ安価な方法であることから汎用されている。

この間接凝集反応測定法は、測定対象物質に特異的に結合する抗体（測定対象物質が抗体の場合は抗原を使用することも可能）を固定化した担体（ラテックス粒子若しくはゼラチン粒子等の高分子粒子又は赤血球等）と、測定対象物質を含むと推定される試料を、プラスチックやガラスなどよりなる板（プレート）又はＵ字状若しくはＶ字状の容器底面を有するマイクロタイタープレートなどに添加し、混合して、前記担体と試料とを接触させ、試料中に測定対象物質が存在する場合には、抗原抗体反応により生じた測定対象物質を介した担体間の凝集像を観察することにより、試料中に測定対象物質が測定下限値以上の濃度で存在する（陽性）か、又は存在しないか若しくは測定下限値未満の濃度で存在する（陰性）かを判定する方法である（非特許文献１参照。）。

しかしながら、この間接凝集反応測定法で、前記担体と前記試料とを、プラスチックやガラスなどよりなる板（プレート）の上で接触させ、担体間の凝集像を観察する方法は、特別な器具や装置を必要とせず、安価に、かつ短時間の内に測定結果を得ることができる方法であるが、正確な測定結果を得るには測定の手技に熟練を要し、そして凝集像の判定（陽性か陰性かの判定）もまた難しく熟練を要するものであった。
また、前記担体と前記試料とを、マイクロタイタープレートの容器内で接触させ、担体間の凝集像を観察する方法は、特別な器具や装置を必要とせず、かつ安価に測定結果を得ることができる方法であるが、凝集像を得るのに要する時間は通常１時間以上であり、迅速に測定結果を得ることはできないものであった。

「臨床検査法提要」（改訂第３０版）、金原出版、第８４３頁〜第８４７頁、及び第９３１頁〜第９３６頁、１９９３年

本発明の課題は、特別な器具や装置を必要とせず、簡便かつ安価に実施することができ、測定を行うに熟練を要さず、測定結果が明確に示されるため判定が容易であり、そして極めて迅速、高感度かつ正確に測定結果を得ることができる、試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットを提供することである。

本発明は、以下の発明を包含するものである。
（１） 下記の各工程よりなる、試料中の測定対象物質の測定方法。
（ａ） 試料、エチルバイオレット、ローダミンＢ、エリスロシンＢ、エオシン又はクーマシーブリリアントブルーからなる群より選ばれる色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つタンパク質を固定化した担体、及び遊離状態にあるタンパク質を接触させる工程、
（ｂ） 前記接触後、その一定量を多孔性膜上に添加する工程、及び
（ｃ） 前記多孔性膜上に現れる輪を測定する工程
（２） 測定対象物質に対する特異的結合物質が、測定対象物質が抗原である場合には当該抗原に特異的に結合する抗体であり、測定対象物質が抗体である場合には当該抗体に特異的に結合する抗体又は当該抗体にとっての抗原である、前記（１）記載の試料中の測定対象物質の測定方法。
（３） 担体が粒子である、前記（１）又は（２）記載の試料中の測定対象物質の測定方法。
（４） 工程（ｃ）の多孔性膜上に現れる輪の測定において、多孔性膜上に輪が観察できた場合には試料中に測定対象物質が測定下限値以上の濃度で存在すると判定し、多孔性膜上に輪が観察できなかった場合には試料中に測定対象物質が存在しないか又は測定下限値未満の濃度で存在すると判定する、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の試料中の測定対象物質の測定方法。
（５） エチルバイオレット、ローダミンＢ、エリスロシンＢ、エオシン又はクーマシーブリリアントブルーからなる群より選ばれる色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つタンパク質を固定化した担体、及び遊離状態にあるタンパク質を含有する試薬、並びに多孔性膜を含む、試料中の測定対象物質の測定キット。
（６） 測定対象物質に対する特異的結合物質が、測定対象物質が抗原である場合には当該抗原に特異的に結合する抗体であり、測定対象物質が抗体である場合には当該抗体に特異的に結合する抗体又は当該抗体にとっての抗原である、前記（５）記載の試料中の測定対象物質の測定キット。
（７） 担体が粒子である、前記（５）又は（６）記載の試料中の測定対象物質の測定キット。
（８） 多孔性膜上に輪が観察できた場合には試料中に測定対象物質が測定下限値以上の濃度で存在すると判定し、多孔性膜上に輪が観察できなかった場合には試料中に測定対象物質が存在しないか又は測定下限値未満の濃度で存在すると判定するものである、前記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の試料中の測定対象物質の測定キット。

本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットは、特別な器具や装置を必要とせず、簡便かつ安価に実施することができ、測定を行うに熟練を要さず、測定結果が明確に示されるため判定が容易であり、そして極めて迅速、高感度かつ正確に測定結果を得ることができる、試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットである。

Ｉ．試料中の測定対象物質の測定方法
１．試料
本発明において、試料とは、測定対象物質が存在する可能性があり、かつその測定対象物質の存在の有無、又は含有量（濃度）の測定を行おうとするものをいう。
本発明における試料は、このようなものであれば特に限定されないが、例えば、ヒト若しくは動物に由来する試料、植物に由来する試料、微生物に由来する試料、食物、飲料、飲料水、薬剤、試薬、又は環境試料等を挙げることができる。

ヒト若しくは動物に由来する試料は、特に限定されず、例えば、ヒト或いは動物の、血液、血清、血漿、尿、大便、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、咽頭拭い液、羊水、若しくはその他の体液；脳、心臓、腎臓、若しくは肝臓などの臓器；毛髪、皮膚、爪、筋肉、若しくは神経などの組織；又は細胞等を挙げることができる。

食物は、特に限定されず、例えば、食肉、野菜、穀物、果物、卵、水産物、又は加工食品等を挙げることができる。

飲料は、特に限定されず、例えば、ジュース、牛乳、茶、コーヒー、又は酒類等を挙げることができる。

薬剤は、特に限定されず、例えば、輸液、注射液、散剤、又は錠剤等を挙げることができる。

環境試料は、特に限定されず、例えば、河川水、湖沼水、海水、土壌又は産業廃棄物などの懸濁液等を挙げることができる。

なお、測定に用いる試料の形態は、液体である必要があるので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料とすればよい。

また、必要に応じて、試料は濃縮処理を行ってもよい。

また、試料は、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質と接触させる前に、希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
この希釈液として、各種水系溶媒を用いることができる。
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ４．０〜ｐＨ１２．０の範囲にあることが好ましい。

また、試料が血液（全血）である場合、この全血試料を、精製水又は界面活性剤を含有する水系溶媒等の低張液と混合し、赤血球を破裂させる処理を行うことが、その後の測定を支障なく行う上で、好ましい。

２．測定対象物質
本発明において、測定対象物質とは、試料中におけるその存在の有無、又は含有量（濃度）を測定しようとする物質である。

この測定対象物質としては、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬、並びに多孔性膜を使用して測定を行うことができるものであれば如何なるものでもよい。

この測定対象物質を例示すると、例えば、タンパク質、糖質、脂質、核酸などのような有機物質、又は金属などの無機物質等を挙げることができる。

より具体的には、例えば、ＨＢｓ抗原、抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗原、抗ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗原、抗ＨＩＶ抗体、抗ＡＴＬＶ抗体等のウイルス関連の抗原又は抗体；
大腸菌Ｏ１５７抗原、抗トレポネーマ・パリダム抗体、抗マイコプラズマ抗体、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）、赤痢菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、キャンピロバクター、ヘリコバクターピロリ、ＭＲＳＡ、若しくはレジオネラ菌等の細菌関連の抗原、抗体又は細菌自体；免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、若しくは免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）等の免疫グロブリン；Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、α１−酸性糖タンパク質、ハプトグロビン、補体Ｃ３、補体Ｃ４、リウマトイド因子等の炎症マーカー；α−フェトプロテイン、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９等の腫瘍マーカー；ヒト胎盤絨毛性ゴナドトロピン等のホルモン；アレルゲン、アレルゲン特異ＩｇＥ抗体等のアレルギー関連の抗原又は抗体；アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）等の血液凝固系関連物質；フィブリン体分解物（ＦＤＰ）、Ｄダイマー等の線溶系関連物質；ＡＢＯ式血液型抗体、不規則抗体等の血液型関連の抗原又は抗体；ウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡ；細菌のＤＮＡ又はＲＮＡ；ヒト等の動物若しくは植物のＤＮＡ又はＲＮＡ；リポタンパク質（ａ）、フェリチン等の他の疾病に関連した物質；薬物；環境ホルモン、ＰＣＢ若しくはダイオキシンなどの環境汚染物質；金属；毒物又は劇物等を例示することができる。

３．色素
本発明における色素は、特に限定なく用いることができる。

この色素としては、例えば、ローダミンＢ、エリスロシンＢ若しくはエオシンなどのキサンテン系色素；エチルバイオレット、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）、ブロモクロロフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、若しくはブロモクレゾールパープルなどのトリフェニルメタン系色素；又はバッファローブラック、アシドオレンジ１２、メチルオレンジ、オレンジＧ、若しくはアゾスルファチアゾールなどのアゾ色素等を挙げることができる。
なお、本発明における色素としては、例えば、エチルバイオレット又はローダミンＢ等が好適であり、特にエチルバイオレット等が好適である。

ところで、本発明における色素は、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体と接触したときに、その担体に固定化された「色素に結合することができる物質」に結合するものである。
また、本発明における色素は、遊離状態にある色素に結合可能な物質と接触したときに、その遊離状態にある「色素に結合可能な物質」に結合するものである。

この色素の濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中の測定対象物質を測定することができないので、試料、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させるときの濃度で、０．０１μＭ以上であることが好ましく、０．１μＭ以上であることがより好ましく、１μＭ以上であることが特に好ましい。

また、この色素の濃度は、高すぎると試料中に測定対象物質が存在しなくとも多孔性膜上に輪が現れたり又は着色域が生じてしまうことがあり、その場合試料中に測定対象物質が存在するときとの判別が難しくなるので、試料、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させるときの濃度で、１，０００μＭ以下であることが好ましく、１００μＭ以下であることがより好ましく、１０μＭ以下であることが特に好ましい。

なお、この色素を溶解させる溶媒は、各種水系溶媒を用いることができる。
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ４．０〜ｐＨ１２．０の範囲にあることが好ましい。

４．測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体
〔１〕測定対象物質に対する特異的結合物質
本発明において、測定対象物質に対する特異的結合物質とは、前記の測定対象物質に特異的な親和性を有し結合することができる物質のことである。

この測定対象物質に対する特異的結合物質としては、例えば、測定対象物質が抗原である場合にはこの抗原に対する抗体、測定対象物質が抗体である場合にはこの抗体にとっての抗原若しくはこの抗体に対する抗体、測定対象物質がタンパク質などよりなる物質である場合にはそのリガンド、測定対象物質が糖である場合にはこの糖と結合するレクチン、測定対象物質がレクチンである場合にはこのレクチンと結合する糖、測定対象物質がヌクレオチド鎖である場合にはこのヌクレオチド鎖と相補的なヌクレオチド鎖、又は測定対象物質がレセプターである場合にはこのレセプターに結合する物質（リガンド）等を挙げることができる。

すなわち、測定対象物質に特異的な親和性を有し結合することができる物質であれば、特に制限なく、測定対象物質に対する特異的結合物質として、本発明において用いることができる。

なお、本発明においては、測定対象物質が抗原であり、測定対象物質に対する特異的結合物質が前記抗原に対する抗体である場合が好適である。

ここで、抗体としては、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、そしてこれらの断片〔Ｆ（ａｂ）’２又はＦａｂ’など〕等でもよい。

また、本発明においては、測定対象物質が抗体であり、測定対象物質に対する特異的結合物質が前記抗体にとっての抗原、又は前記抗体に対する抗体である場合が好適である。

この測定対象物質が抗体であり、測定対象物質に対する特異的結合物質が前記抗体にとっての抗原である場合、この「前記抗体にとっての抗原」は、細菌若しくはウイルスなど由来の天然のものであってもよく、又は遺伝子組み換え法などにより人為的に調製したものであってもよいが、特に遺伝子組み換え法などにより人為的に調製したものである場合が好適である。

そして、この遺伝子組み換え法などにより人為的に調製したものである場合、「前記抗体にとっての抗原」は、他のタンパク質と融合しているものであってもよい。

また、この遺伝子組み換え法などにより人為的に調製したものである場合、「前記抗体にとっての抗原」は、複数種類の抗原が融合しているものであってもよい。

〔２〕色素に結合することができる物質
本発明において、色素に結合することができる物質とは、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させたときに、前記の色素に親和性を有し、結合することができる物質のことである。

この色素に結合することができる物質としては、例えば、タンパク質、糖類、又は脂質等を挙げることができる。

このタンパク質としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、又はカゼイン等を挙げることができる。

このアルブミンとしては、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、又は卵白アルブミン等を挙げることができる。

本発明におけるこの色素に結合することができる物質としては、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、又は卵白アルブミン等のアルブミンが好適である。

なお、本発明における「色素に結合することができる物質」と「色素」との組み合わせであるが、「色素に結合することができる物質」がアルブミン、グロブリン、ゼラチン、又はカゼイン等のタンパク質であって、そして「色素」がローダミンＢ、エリスロシンＢ若しくはエオシンなどのキサンテン系色素；エチルバイオレット、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）、ブロモクロロフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、若しくはブロモクレゾールパープルなどのトリフェニルメタン系色素；又はバッファローブラック、アシドオレンジ１２、メチルオレンジ、オレンジＧ、若しくはアゾスルファチアゾールなどのアゾ色素等である組み合わせが好ましい。
そして、前記色素としては、例えば、エチルバイオレット又はローダミンＢ等が特に好ましい。

この色素に結合することができる物質は、遺伝子組み換え法などにより人為的に調製したものであってもよく、又は変性処理若しくは分解処理などが施されたものであってもよい。

なお、この色素に結合することができる物質は、１種類のものを用いてもよいし、又は複数種類のものを用いてもよい。

〔３〕担体
（１） 本発明において、担体は、「測定対象物質に対する特異的結合物質」及び「色素に結合することができる物質」をそれぞれ固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。

すなわち、「測定対象物質に対する特異的結合物質」と「測定対象物質」との特異的な結合反応を利用して試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び測定キット（測定試薬）に使用されている担体、又は使用することが可能な担体であればよい。

（２） 本発明における担体としては、例えば、間接凝集反応測定法であるラテックス凝集反応法に使用されているラテックス粒子、若しくはラテックス凝集反応法に使用することが可能なラテックス粒子、又は、ラテックス比濁法に使用されているラテックス粒子、若しくはラテックス比濁法に使用することが可能なラテックス粒子等を挙げることができる。

このようなラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレン・ラテックス粒子、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体・ラテックス粒子、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体・ラテックス粒子、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体・ラテックス粒子、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体・ラテックス粒子、ポリアクロレイン・ラテックス粒子、スチレン−メタクリル酸共重合体・ラテックス粒子、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体・ラテックス粒子、メタクリル酸重合体・ラテックス粒子、又はアクリル酸重合体・ラテックス粒子などの合成高分子粒子を均一に懸濁させたラテックス粒子等を挙げることができる。

このラテックス粒子としては、ポリスチレン・ラテックス粒子又はスチレン−メタクリル酸共重合体・ラテックス粒子が好適であり、ポリスチレン・ラテックス粒子が特に好適である。

（３） 本発明における担体としては、更に、例えば、ゼラチン粒子などを用いる粒子凝集反応測定法などの他の間接凝集反応測定法に使用されている粒子、若しくはこの他の間接凝集反応測定法に使用することが可能な粒子、又は、ラテックス粒子以外の担体を用いる比濁法に使用されている粒子、又はラテックス粒子以外の担体を用いる比濁法に使用することが可能な粒子等を挙げることができる。

このような粒子としては、例えば、リポソーム、ゼラチン、ポリアクリルアミド、マイクロカプセル若しくはエマルジョン等の有機高分子物質よりなる粒子、ガラス、シリカゲル、カーボン若しくはベントナイト等の無機高分子物質よりなる粒子、又はその他の人工担体等を挙げることができる。

（４） 本発明における担体としては、また、前記の各担体を強磁性体で被覆又は担体成型時に強磁性体を分散させて調製した磁性粒子等を挙げることができる。

（５） 本発明における担体の径（粒径）については、特に制限はない。
なお、その平均径（平均粒子径）が０．００１〜１０μｍの範囲内にあることが好ましく、０．０１〜５μｍの範囲内にあることがより好ましく、０．０５〜１μｍの範囲内にあることが特に好ましい。

なお、本発明における担体の径（粒径）は、本発明における多孔性膜の孔径との関係においては、本発明における担体の平均径（平均粒子径）を本発明における多孔性膜の平均孔径で除した比が、０．０１〜１の範囲内にあることが好ましく、０．０５〜０．２の範囲内にあることがより好ましい。

なお、本発明における担体の径（粒径）は、その径（粒径）が大きくなる程測定の感度が高くなるので、測定の感度を高めたい場合には、径（粒径）が大きい担体を用いればよい。その場合、例えば、担体の平均径（平均粒子径）が０．０５μｍ以上の担体を用いることが好ましく、０．１以上の担体を用いることがより好ましい。その場合、多孔性膜も、上記した通り、対応する範囲内の孔径のものを用いることが好ましい。

また、本発明における担体の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。

〔４〕測定対象物質に対する特異的結合物質の担体への固定化及び色素に結合することができる物質の担体への固定化
本発明において、測定対象物質に対する特異的結合物質を担体へ固定化する方法、及び色素に結合することができる物質を担体へ固定化する方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。

物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、「測定対象物質に対する特異的結合物質」及び／又は「色素に結合することができる物質」と「担体」とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した「測定対象物質に対する特異的結合物質」及び／又は「色素に結合することができる物質」と「担体」とを、前記溶液中で接触させること等により行うことができる。

例えば、緩衝液等に懸濁した担体に測定対象物質に対する特異的結合物質を添加し、この緩衝液等の溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間保持することにより、測定対象物質に対する特異的結合物質の担体への固定化処理を行う。
次に、この測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化した担体を懸濁する溶液に、色素に結合することができる物質を添加し、この溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間保持することにより、色素に結合することができる物質の前記担体への固定化処理を行う。
これらの処理により、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体を得ることができる。

また、例えば、測定対象物質に対する特異的結合物質、及び色素に結合することができる物質をそれぞれ含む緩衝液等の溶液に、緩衝液等に懸濁した担体を添加し、混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間保持することにより、測定対象物質に対する特異的結合物質、及び色素に結合することができる物質の担体への固定化処理を行う。
この処理により、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体を得ることができる。

また、化学的結合法により行う場合は、『日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行』及び『日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行』等に記載の公知の方法に従い、「測定対象物質に対する特異的結合物質」及び／又は「色素に結合することができる物質」と「担体」とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、「測定対象物質に対する特異的結合物質」及び／又は「色素に結合することができる物質」と「担体」とのそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。

なお、本発明においては、色素に結合することができる物質を担体へ固定化していることにより、副次的に、非特異的反応や担体の自然凝集等が抑制されると考えられるが、もし必要であれば、更にタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を担体に接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。

〔５〕測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体
試料、色素、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質と接触させる際の、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体の濃度であるが、これは、測定対象物質の種類とその試料中における濃度、測定対象物質に対する特異的結合物質の種類とその担体表面上での分布密度、色素の濃度、色素に結合することができる物質の種類とその担体表面上での分布密度、担体の径（粒径）、並びに、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質の存在比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。

しかしながら、この測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体の濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中の測定対象物質を測定することができないので、試料及び色素と接触させるときの濃度で、０．００５％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることがより好ましい。

また、この測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体の濃度は、高すぎても測定の感度が下がってしまうので、５％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましく、１％（ｗ／ｖ）以下であることがより好ましい。

〔６〕測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体を懸濁させる分散媒
測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体を懸濁させる分散媒は、各種水系溶媒を用いることができる。
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ４．０〜ｐＨ１２．０の範囲にあることが好ましい。

５．遊離状態にある色素に結合可能な物質
本発明において、遊離状態にある色素に結合可能な物質とは、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させたときに、前記の色素に親和性を有し結合することが可能であり、且つ遊離状態にある物質のことである。

この遊離状態にある色素に結合可能な物質としては、例えば、タンパク質、糖類、又は脂質等を挙げることができる。

このタンパク質としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、又はカゼイン等を挙げることができる。

このアルブミンとしては、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、又は卵白アルブミン等を挙げることができる。

本発明におけるこの遊離状態にある色素に結合可能な物質としては、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、又は卵白アルブミン等のアルブミンが好適である。

なお、本発明における「遊離状態にある色素に結合可能な物質」と「色素」との組み合わせであるが、「遊離状態にある色素に結合可能な物質」がアルブミン、グロブリン、ゼラチン、又はカゼイン等のタンパク質であって、そして「色素」がローダミンＢ、エリスロシンＢ若しくはエオシンなどのキサンテン系色素；エチルバイオレット、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）、ブロモクロロフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、若しくはブロモクレゾールパープルなどのトリフェニルメタン系色素；又はバッファローブラック、アシドオレンジ１２、メチルオレンジ、オレンジＧ、若しくはアゾスルファチアゾールなどのアゾ色素等である組み合わせが好ましい。
そして、前記色素としては、例えば、エチルバイオレット又はローダミンＢ等が特に好ましい。

この遊離状態にある色素に結合可能な物質は、遺伝子組み換え法などにより人為的に調製したものであってもよく、又は変性処理若しくは分解処理などが施されたものであってもよい。

なお、この遊離状態にある色素に結合可能な物質は、１種類のものを用いてもよいし、又は複数種類のものを用いてもよい。

また、この遊離状態にある色素に結合可能な物質は、前記の測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体における色素に結合することができる物質と、同一のものを用いてもよいし、又は異なるものを用いてもよいが、同一のものを用いることが好ましい。

ところで、試料、色素、及び測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体と接触させる際の、遊離状態にある色素に結合可能な物質の濃度であるが、これは、色素の濃度、色素に結合することができる物質の種類とその担体表面上での分布密度、担体の径（粒径）、並びに、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質の存在比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。

しかしながら、この遊離状態にある色素に結合可能な物質の濃度が低すぎると、前記の担体に固定化した色素に結合することができる物質に結合せずに存在する色素を、この遊離状態にある色素に結合可能な物質と結合させることが充分に行えず、これにより試料中に測定対象物質が存在しなくとも多孔性膜上に輪が現れたり又は着色域が生じてしまうことがあり、その場合試料中に測定対象物質が存在するときとの判別が難しくなるので、試料、色素、及び測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体と接触させるときの濃度で、０．０１ｍＭ以上であることが好ましく、０．１ｍＭ以上であることがより好ましい。

また、この遊離状態にある色素に結合可能な物質の濃度が高すぎると、前記の担体に固定化した色素に結合することができる物質と競合して、多くの色素と結合してしまう結果、前記の測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体に結合する色素の量が少なくなり、測定の感度が下がってしまうので、１０ｍＭ以下であることが好ましく、１ｍＭ以下であることがより好ましい。

６．ｐＨ
本発明において、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させる際のｐＨは、特に限定はなく適宜適当なｐＨを選択して用いることができる。

前記の接触時のｐＨとしては、ｐＨ４．０〜ｐＨ１２．０の範囲にあることが好ましく、ｐＨ５．０〜ｐＨ１１．０の範囲にあることがより好ましく、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の範囲にあることが特に好ましい。

なお、前記の接触時のｐＨが、余り低いものであると、試料中に測定対象物質が存在しなくとも、多孔性膜上に輪が現れてしまうことがあるので適当ではなく、また、余りｐＨが高すぎても、タンパク質が変性したり不溶化してしまうので適当でない。

本発明において、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させるときに、ｐＨが上記のｐＨとなるような緩衝剤（これらのｐＨ域に緩衝能がある緩衝剤）を共存させることが好ましい。この緩衝剤としては、既知の緩衝剤を用いることができる。

７．他の成分
本発明において、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させるときに、その他の成分を適宜共存させることができる。
例えば、ポリエチレングルコールやポリプロピレングルコール等の水溶性高分子化合物を共存させてもよく、このポリエチレングルコールやポリプロピレングルコール等の水溶性高分子化合物を共存させることにより、測定の感度を増加させることが出来るので好ましい。

また、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウム若しくは抗生剤などの各種防腐剤、又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜共存させてもよい。

そして、これらの成分を共存させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）がより好ましく、０．１〜１％（Ｗ／Ｖ）が特に好ましい。

なお、この各種界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。

８．多孔性膜
本発明における多孔性膜は、多数の微細な孔を有する膜であって、その膜上に微量の溶液を添加したときにその溶液を吸収することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。

この多孔性膜の材質としては、例えば、紙〔ろ紙〕、ニトロセルロース、セルロースアセテート、セルロース混合エステル〔ニトロセルロース及びセルロースアセテートの混合物〕、ポリカーボネート、ポリビニリデンフロライド、四フッ化エチレン樹脂（ＰＴＦＥ）、又は親水性四フッ化エチレン樹脂（親水性ＰＴＦＥ）等を挙げることができる。

この多孔性膜の孔径としては、０．１〜１０μｍが好ましく、０．４５〜５μｍがより好ましく、０．８〜１．２μｍが特に好ましい。

例えば、この多孔性膜として、「メンブランフィルター（タイプＪＶ；親水性四フッ化エチレン樹脂；孔径０．１μｍ）〔ミリポア社〕」、「メンブランフィルター（タイプＪＨ；親水性四フッ化エチレン樹脂；孔径０．４５μｍ）〔ミリポア社〕」、「メンブランフィルター（タイプＪＡ；親水性四フッ化エチレン樹脂；孔径１μｍ）〔ミリポア社〕」、「メンブランフィルター（タイプＪＭ；親水性四フッ化エチレン樹脂；孔径５．０μｍ）〔ミリポア社〕」、「メンブランフィルター（タイプＪＣ；親水性四フッ化エチレン樹脂；孔径１０．０μｍ）〔ミリポア社〕」、「ＭＦ−メンブランフィルター（タイプＨＡ；セルロース混合エステル；孔径０．４５μｍ）〔ミリポア社〕」、「ＭＦ−メンブランフィルター（タイプＡＡ；セルロース混合エステル；孔径０．８μｍ）〔ミリポア社〕」、「ＭＦ−メンブランフィルター（タイプＲＡ；セルロース混合エステル；孔径１．２μｍ）〔ミリポア社〕」、又は「ＳＥＬＥＣＡ−Ｖ（セルロースアセテート膜）〔東洋濾紙社〕」等を挙げることができる。

なお、本発明における多孔性膜は、本発明において用いる色素を吸着若しくは結合しないか、又は色素を吸着若しくは結合しにくいものであることが好ましい。
また、本発明における多孔性膜は、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化した担体が測定対象物質を介して凝集した凝集物を捕捉する能力が高いものが好ましい。

これらの条件を満たす多孔性膜としては、例えば、親水性四フッ化エチレン樹脂（親水性ＰＴＦＥ）を材質とするもの等を挙げることができる。
この親水性四フッ化エチレン樹脂（親水性ＰＴＦＥ）を材質とする多孔質膜は、色素が吸着若しくは結合しにくいものであり、試薬（水溶液）の拡散が速く、そして前記凝集物の捕捉能力が高いものであり、感度良く測定を行うことができるので好ましい。

９．試料中の測定対象物質の測定
本発明における試料中の測定対象物質の測定について、以下説明を行う。

（１）接触工程〔工程（ａ）〕
まず、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させる工程であるが、前記の試料、前記の色素、前記の測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び前記の遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させることができれば、どのような方法でもよい。

試料と、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体との接触により、試料中に含まれる測定対象物質と、担体に固定化された測定対象物質に対する特異的結合物質とが反応し、『…−「測定対象物質に対する特異的結合物質−担体−測定対象物質に対する特異的結合物質」−「測定対象物質」−「測定対象物質に対する特異的結合物質−担体−測定対象物質に対する特異的結合物質」−…』の凝集物が形成される。このときの濃度については、前記の通りである。

また、色素と、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体との接触により、担体に固定化された色素に結合することができる物質に、色素が結合する。

そして、色素と、遊離状態にある色素に結合可能な物質との接触により、前記担体に結合していない色素は、この遊離状態にある色素に結合可能な物質と結合する。

なお、この、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させる時間であるが、３分間以上であることが好ましく、５分間以上であることがより好ましく、１０分間以上であることが特に好ましい。

この、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させる温度であるが、特に限定はない。
但し、６０℃以上であると、タンパク質が変性する可能性があるので、０〜５０℃が好ましく、５〜４５℃がより好ましく、１５〜４０℃が特に好ましい。

この、試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質の接触は、１段階で行ってもよいが、２段階以上の複数段階で行ってもよい。

例えば、１段階で行う場合は、試料を、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質と混合して接触させる。

２段階で行う場合は、例えば、試料を、色素、及び測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体と混合し接触させ、その後、この混合液（混合物）に、遊離状態にある色素に結合可能な物質を混合して、接触させる等により行う。

３段階で行う場合は、例えば、試料を、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体と混合し接触させ、その後、この混合液（混合物）に色素を混合し接触させ、更にその後、この混合液（混合物）に、遊離状態にある色素に結合可能な物質を混合して、接触させる等により行う。

（２）添加工程〔工程（ｂ）〕
次に、前記接触後その一定量を多孔性膜上に添加する工程であるが、これも、前記の試料、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質の接触の後、得られた混合液（混合物）の一定量を前記の多孔性膜の上に添加するのであれば、特に限定なく行うことができる。

なお、前記の多孔性膜上に添加する一定量であるが、これは微量である程、測定に要する試料や試薬を節約できるので好ましいが、余り微量過ぎると多孔性膜上に現れる輪の測定が難しくなるので、１〜１００μＬであることが好ましく、３〜５０μＬであることがより好ましく、５〜２０μＬであることが特に好ましい。

（３）輪測定工程〔工程（ｃ）〕
そして、前記多孔性膜上に現れる輪を測定する工程であるが、これも、前記の混合液（混合物）の多孔性膜上への添加の後、この多孔性膜上に現れた輪を測定するのであれば、特に限定なく行うことができる。

なお、この前記混合液（混合物）の一定量を前記の多孔性膜の上に添加してからこの多孔性膜上に現れる輪を測定するまでの時間であるが、１分間以上であることが好ましく、３分間以上であることがより好ましく、５分間以上であることが特に好ましい。

また、この前記混合液（混合物）の一定量を前記の多孔性膜の上に添加してからこの多孔性膜上に現れる輪を測定するまでの間の温度であるが、特に限定はない。
但し、６０℃以上であると、タンパク質が変性する可能性があるので、０〜５０℃が好ましく、５〜４５℃がより好ましく、１５〜４０℃が特に好ましい。

この多孔性膜上に現れる輪の測定において、多孔性膜上に輪が観察できた場合には試料中に測定対象物質が測定下限値以上の濃度で存在すると判定し、多孔性膜上に輪が観察できなかった場合には試料中に測定対象物質が存在しないか又は測定下限値未満の濃度で存在すると判定する。

なお、前記の多孔性膜上に現れる輪の測定であるが、これは目視により行ってもよく、又は、デンシトメーター、スポットメーター、若しくはＣＣＤ装置等の装置を用いて測定を行ってもよい。

また、測定対象物質を含まない試料（陰性対照試料又は試薬盲検試料）及び／又は測定対象物質を含む試料（陽性対照試料）を測定して得られた多孔性膜上に現れる輪の色の濃淡等と、試料を測定して得られた多孔性膜上に現れる輪の色の濃淡等とを対比して、試料中の測定対象物質の存在の判定を行ってもよい。

１０．試料中の測定対象物質の定量測定
試料の測定結果を、濃度既知の試料を多段階に希釈したときの各測定結果と比較することにより、試料中に含まれていた測定対象物質の濃度を定量することができる。

また、試料を多段階に希釈したときの各測定結果を、濃度既知の試料を多段階に希釈したときの各測定結果と比較することによっても、試料中に含まれていた測定対象物質の濃度を定量することができる。

更に、異なる材質の複数の多孔性膜を用いて測定を行った測定結果を比較することにより、試料中の測定対象物質の定量測定を行うことができる。

例えば、材質がセルロース混合エステル〔ニトロセルロース及びセルロースアセテートの混合物〕の多孔性膜を用いた場合の測定の感度は、材質がセルロースアセテートの多孔性膜を用いた場合の測定の感度に比べて約１０倍高い。
従って、このように材質の違いにより測定の感度が異なる複数の多孔性膜を用いた場合の試料の測定結果、及び同様にして得た濃度既知の試料の測定結果を比較することにより、試料中に含まれていた測定対象物質の濃度を定量することができる。

また、異なる孔径の複数の多孔性膜を用いて測定を行った測定結果を比較することにより、試料中の測定対象物質の定量測定を行うことができる。
孔径の違いにより測定の感度が異なる複数の多孔性膜を用いた場合の試料の測定結果、及び同様にして得た濃度既知の試料の測定結果を比較することにより、試料中に含まれていた測定対象物質の濃度を定量することができる。

ＩＩ．試料中の測定対象物質の測定キット
本発明の試料中の測定対象物質の測定キットは、少なくとも、「色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬」、並びに「多孔性膜」を含むものである。

１．試薬
本発明の試料中の測定対象物質の測定キットは、「色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬」を含む。

（１）測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体

本発明の試料中の測定対象物質の測定キットにおける、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬において、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体については、前記「Ｉ．試料中の測定対象物質の測定方法」の「４．測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体」において詳述した通りである。

この測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体を前記試薬に含有させる濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中の測定対象物質を測定することができないので、試料と接触させるときの濃度が、０．００５％（ｗ／ｖ）以上となるように試薬に含有させることが好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）以上となるように試薬に含有させることがより好ましい。

また、この測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体を前記試薬に含有させる濃度は、高すぎても測定の感度が下がってしまうので、試料と接触させるときの濃度が、５％（ｗ／ｖ）以下となるように試薬に含有させることが好ましく、１％（ｗ／ｖ）以下となるように試薬に含有させることがより好ましい。

（２）色素
本発明の試料中の測定対象物質の測定キットにおける、「色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬」において、色素については、前記「Ｉ．試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．色素」において詳述した通りである。

この色素を前記試薬に含有させる濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中の測定対象物質を測定することができないので、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体と接触させるときの濃度が、０．０１μＭ以上となるように試薬に含有させることが好ましく、０．１μＭ以上となるように試薬に含有させることがより好ましく、１μＭ以上となるように試薬に含有させることが特に好ましい。

また、この色素を前記試薬に含有させる濃度は、高すぎると試料中に測定対象物質が存在しなくとも多孔性膜上に輪が現れたり又は着色域が生じてしまうことがあり、その場合試料中に測定対象物質が存在するときとの判別が難しくなるので、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体と接触させるときの濃度が、１，０００μＭ以下となるように試薬に含有させることが好ましく、１００μＭ以下となるように試薬に含有させることがより好ましく、１０μＭ以下となるように試薬に含有させることが特に好ましい。

（３）遊離状態にある色素に結合可能な物質
本発明の試料中の測定対象物質の測定キットにおける、「色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬」において、遊離状態にある色素に結合可能な物質については、前記「Ｉ．試料中の測定対象物質の測定方法」の「５．遊離状態にある色素に結合可能な物質」において詳述した通りである。

この遊離状態にある色素に結合可能な物質を前記試薬に含有させる濃度は、低すぎると、前記の担体に固定化した「色素に結合することができる物質」に結合せずに存在する色素を、この「遊離状態にある色素に結合可能な物質」と結合させることが充分に行えず、これにより試料中に測定対象物質が存在しなくとも多孔性膜上に輪が現れたり又は着色域が生じてしまうことがあり、その場合試料中に測定対象物質が存在するときとの判別が難しくなるので、色素、及び測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体と接触させるときの濃度が、０．０１ｍＭ以上となるように試薬に含有させることが好ましく、０．１ｍＭ以上となるように試薬に含有させることがより好ましい。

また、この遊離状態にある色素に結合可能な物質の濃度は、高すぎると、前記の担体に固定化した「色素に結合することができる物質」と競合して、多くの色素と結合してしまう結果、前記の測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体に結合する色素の量が少なくなり、測定の感度が下がってしまうので、色素、及び測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体と接触させるときの濃度が、１０ｍＭ以下となるように試薬に含有させることが好ましく、１ｍＭ以下となるように試薬に含有させることがより好ましい。

（４）ｐＨ
本発明において、「色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬」のｐＨとしては、特に限定はなく適宜適当なｐＨを選択して用いることができる。

前記試薬のｐＨとしては、ｐＨ４．０〜ｐＨ１２．０の範囲にあることが好ましく、ｐＨ５．０〜ｐＨ１１．０の範囲にあることがより好ましく、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の範囲にあることが特に好ましい。

なお、前記試薬のｐＨが、余り低いものであると、試料中に測定対象物質が存在しなくとも、多孔性膜上に輪が現れてしまうことがあるので適当ではなく、また、余りｐＨが高すぎると、タンパク質が変性したり不溶化してしまう。

そして、前記試薬には、前記試薬のｐＨが上記のｐＨとなるような緩衝剤（これらのｐＨ域に緩衝能がある緩衝剤）を含有させることが好ましい。この緩衝剤としては、既知の緩衝剤を用いることができる。

（５）他の成分
本発明の試料中の測定対象物質の測定キットにおける、「色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬」には、その他の成分を適宜含有させることができる。

例えば、ポリエチレングルコールやポリプロピレングルコール等の水溶性高分子化合物を含有させてもよく、このポリエチレングルコールやポリプロピレングルコール等の水溶性高分子化合物を含有させることにより、測定の感度を増加させることが出来るので好ましい。

また、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウム若しくは抗生剤などの各種防腐剤、又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜含有させてもよい。

そして、これらの成分を含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）がより好ましく、０．１〜１％（Ｗ／Ｖ）が特に好ましい。

なお、この各種界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。

（６）試薬の構成
本発明の試料中の測定対象物質の測定キットにおける、「色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬」は、１試薬よりなるものであってもよいし、又は２試薬以上の複数の試薬より構成されるものであってもよい。

前記試薬が、１試薬よりなる場合、その試薬は少なくとも、色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有するものである。

また、前記試薬が２試薬より構成される場合、例えば、前記試薬として、色素、及び測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体を含有する試薬と、遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬より構成されるもの等を挙げることができる。

そして、前記試薬が３試薬より構成される場合、例えば、前記試薬として、色素を含有する試薬、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体を含有する試薬、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬より構成されるもの等を挙げることができる。

２．多孔性膜
本発明の試料中の測定対象物質の測定キットにおける多孔性膜は、前記「Ｉ．試料中の測定対象物質の測定方法」の「８．多孔性膜」において詳述した通りである。

３．他の物
本発明の試料中の測定対象物質の測定キットには、必要に応じて、「色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を含有する試薬」、並びに「多孔性膜」以外の物を含めることができる。

この物としては、例えば、陰性対照試料（試薬盲検試料）、陽性対照試料、標準試料、対照表、希釈液、及び緩衝液等を挙げることができる。

４．試料中の測定対象物質の測定
本発明の試料中の測定対象物質の測定キットを用いて、試料中の測定対象物質の測定を行うことについては、前記「Ｉ．試料中の測定対象物質の測定方法」の「９．試料中の測定対象物質の測定」及び「１０．試料中の測定対象物質の定量測定」に記載した通りである。

ＩＩＩ．本発明の作用機序についての推察
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットにおいて、試料中に測定対象物質が存在する場合に多孔性膜上に輪が現れる作用機序については明確には分かっていない。

しかしながら、担体（測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化していないが色素に結合することができる物質を固定化しているもの）と色素を接触、混合し、この懸濁液を限外ろ過処理したときに、前記担体が着色しており、且つ、ろ液の着色度は低かったことから、色素が前記担体に結合しているものと考えられた。

また、別に、担体に固定化された測定対象物質に対する特異的結合物質と、試料中の測定対象物質との特異的な結合反応に、色素が関与していないことも確かめられた。

以上の結果から、試料中に測定対象物質が存在する場合に多孔性膜上に輪が現れる作用機序については、以下のように推察された。

（１） 測定対象物質を含む試料、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体、色素、及び遊離状態にある色素に結合可能な物質を接触させることにより、前記担体に固定化された測定対象物質に対する特異的結合物質と、試料中の測定対象物質との特異的な結合反応が進行するとともに、前記担体に固定化された色素に結合することができる物質に、色素が結合する反応が進む。
一方、前記の遊離状態にある色素に結合可能な物質は、前記の担体に固定化された色素に結合することができる物質に結合せずに存在する色素と結合する。

（２） 前記接触後、上記（１）の混合液の一定量を多孔性膜上に添加することにより、多孔性膜が有する若干の撥水性によって、添加された混合液は多孔性膜上で短時間の間、半球状の液滴を形成する。

このとき、半球状の液滴の中に分散していた『…−「測定対象物質に対する特異的結合物質−担体−測定対象物質に対する特異的結合物質」−「測定対象物質」−「測定対象物質に対する特異的結合物質−担体−測定対象物質に対する特異的結合物質」−…』の凝集物は、固相・液相・気相の三相の界面、すなわち前記の半球状の液滴の多孔性膜上の外縁部に移動し濃縮され、かつ多孔性膜の孔径よりも大きいので多孔性膜上に留まる。

（３） 前記の半球状の液滴中に存在する、遊離状態にある色素に結合可能な物質と色素との結合体、及び過剰量の前記担体は、多孔性膜の孔径よりも小さいので、多孔性膜上に固定されることなく拡散する。

（４） その結果として、前記の凝集物が多孔性膜上において輪の形状で残り、前記担体に色素に結合することができる物質を介して結合した色素により、その輪を明瞭に認めることができる。

なお、以上の作用機序の推察を模式的に表した図を図１に示した。

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例の記載により限定されるものではない。

〔実施例１〕（本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットによる試料中のＣＲＰの測定）
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットにより、試料中のＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）を測定対象物質として、このＣＲＰの測定を行った。

１．試薬

（１）遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液
遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液として、０．１ｍＭのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１．５３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕を調製した。
なお、ここで、ＢＳＡは、本発明における遊離状態にある色素に結合可能な物質である。

（２）測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体
測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体として、抗ＣＲＰ抗体を固定化し且つウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を固定化したラテックス粒子を用いた。
なお、ここで、抗ＣＲＰ抗体は、本発明における、測定対象物質（ＣＲＰ）に対する特異的結合物質である。
また、ＢＳＡは、本発明における、色素に結合することができる物質である。

この抗ＣＲＰ抗体を固定化し且つＢＳＡを固定化したラテックス粒子は、以下の手順により調製を行った。

平均粒径０．１μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液１０．４ｍＬに、抗ＣＲＰヤギポリクローナル抗体を１．４ｇ／ｄＬの濃度で４．５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）に混和した液の７．３６ｍＬを加え、５℃にて一晩撹拌し、ラテックス粒子に抗ＣＲＰ抗体を固定化した。

次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に０．１ｍＭのＢＳＡ及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加え懸濁し、３７℃で２時間静置し、前記の抗ＣＲＰ抗体を固定化したラテックス粒子に更にＢＳＡを固定化した。

これを遠心分離により沈殿部を回収した後、０．１ｍＭのＢＳＡ及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕で波長５８５ｎｍにおける吸光度が５Ａｂｓとなるように懸濁し、抗ＣＲＰ抗体を固定化し且つＢＳＡを固定化したラテックス粒子の分散液を調製した。
なお、前記分散液には、本発明における遊離状態にある色素に結合可能な物質であるＢＳＡが含まれている。

（３）色素を含む緩衝液
色素を含む緩衝液として、１３５μＭのエチルバイオレット（和光純薬工業社；特級）及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕を調製した。
なお、ここで、エチルバイオレットは、色素である。

２．多孔性膜
多孔性膜として、親水性四フッ化エチレン樹脂を材質とする多孔性膜（商品名「メンブランフィルター（タイプＪＡ；孔径１μｍ）〔ミリポア社〕）を用いた。

３．試料
（イ）ＣＲＰ不含試料
ＣＲＰを含まない試料として、生理食塩水を用意した。

（ロ）ＣＲＰ含有試料
ＣＲＰを含む試料として、２．０ｍｇ／ｄＬのＣＲＰを含む試料を用意した。

４．ＣＲＰ不含試料及びＣＲＰ含有試料の測定
（１） 前記３の（イ）の「ＣＲＰ不含試料」の１０μＬに、前記１の（１）の「遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液」の３３０μＬ、前記１の（２）の「測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体」の１５０μＬ、及び前記１の（３）の「色素を含む緩衝液」の１０μＬを、順次添加し、撹拌して混合した。

（２） その後、この混合液を、室温にて１０分間静置した。

（３） 次に、前記（２）の混合液の１０μＬを、前記２の「多孔性膜」の上に添加した。

（４） 前記の多孔性膜上への添加後、室温で５分間静置した後、この多孔性膜上に現れる輪の測定を行った。

なお、この多孔性膜上に輪が観察できた場合には、試料中に測定対象物質であるＣＲＰが測定下限値以上の濃度で存在する、すなわち陽性と判定した。
また、この多孔性膜上に輪が観察できなかった場合には、試料中にＣＲＰが存在しないか又は測定下限値未満の濃度で存在する、すなわち陰性と判定した。

（５） 次に、試料を、前記３の（イ）の「ＣＲＰ不含試料」から（ロ）の「ＣＲＰ含有試料」に変えて、前記（１）〜（４）の操作の通りに測定を行った。

５．測定結果
前記測定において、多孔性膜上の輪を測定した結果を図２に示した。

試料が（イ）のＣＲＰ不含試料の場合、多孔性膜上に輪は観察できず、試料中にＣＲＰが存在しないか又は測定下限値未満の濃度で存在する、すなわち陰性と判定することができた。

また、試料が（ロ）のＣＲＰ含有試料の場合、多孔性膜上に明瞭な輪（青色）を観察することができ、試料中にＣＲＰが測定下限値以上の濃度で存在する、すなわち陽性と判定することができた。

以上のことより、本発明の測定対象物質の測定方法及び測定キットは、試料中の測定対象物質であるＣＲＰを正確に測定することができることが確かめられた。

〔実施例２〕（本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットによる血清試料中のＣＲＰの測定−１）

本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットにより血清試料中のＣＲＰの測定を行い、ラテックス免疫比濁法による測定値と比較した。

Ｉ．本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットによる血清試料中のＣＲＰの測定

１．試薬
（１）遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液
前記実施例１の１の（１）で調製した０．１ｍＭのＢＳＡ、１．５３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕を、本実施例の「遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液」として用いた。

（２）測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体
前記実施例１の１の（２）で調製した抗ＣＲＰ抗体を固定化し且つＢＳＡを固定化したラテックス粒子の分散液を、本実施例の「測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体」として用いた。

（３）色素を含む緩衝液
前記実施例１の１の（３）で調製した１３５μＭのエチルバイオレット及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕を、本実施例の「色素を含む緩衝液」として用いた。

２．多孔性膜
前記実施例１の２における親水性四フッ化エチレン樹脂を材質とする多孔性膜（商品名「メンブランフィルター（タイプＪＡ；孔径１μｍ）〔ミリポア化）を、本実施例の「多孔性膜」として用いた。

３．試料
血清試料として、１２種類のヒトの血清試料を用意した。

４．ヒト血清試料の測定
前記３の１２種類のヒトの血清試料のそれぞれについて、前記実施例１の４の（１）〜（４）の操作の通りに測定を行った。

５．測定結果
前記の１２種類のヒト血清試料中のＣＲＰの測定結果を表１に示した。
なお、この表において、測定結果が、多孔性膜上に輪が観察できなかったもの（陰性）は「−」と表し、多孔性膜上に輪が観察できたもの（陽性）は「＋」と表し、輪の色調がより濃いものは「＋＋」と表し、そして薄い色調の輪が観察できたもの（弱陽性）は「±」と表した。

ＩＩ．ラテックス免疫比濁法及びその測定試薬による血清試料中のＣＲＰの測定

１．試薬
ラテックス免疫比濁法を測定原理とする市販の試料中のＣＲＰの測定試薬「アキュラスオート ＣＲＰＩＩ」（シノテス社）を用いた。

２．試料
血清試料として、前記Ｉの３の１２種類のヒト血清試料を用いた。

３．ヒト血清試料の測定
前記２の１２種類のヒトの血清試料のそれぞれについて、日立７１７０Ｓ形自動分析装置（日立製作所社）を用いて、試料量３．６μＬ、第１試薬量１８０μＬ、第２試薬量６０μＬ、測光の主波長５７０ｎｍ及び副波長８００ｎｍ、並びに１８ポイント及び３４ポイントの２ポイントエンド法の測定条件において、試料中のＣＲＰの定量測定を行った。

４．測定結果
前記の１２種類のヒト血清試料中のＣＲＰの定量測定の結果を、これも表１に示した。
なお、この表に示した数値は、各ヒト血清試料中のＣＲＰの定量値（ｍｇ／ｄＬ）である。

ＩＩＩ．測定結果のまとめ
この表より、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットによるヒト血清試料中のＣＲＰの測定結果は、ラテックス免疫比濁法を測定原理とする市販のＣＲＰ測定試薬による定量値と、非常に良い相関を示していること、すなわち正確な測定結果が得られていることが分かる。

また、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットによるヒト血清試料中のＣＲＰの測定の測定下限値が約０．１８ｍｇ／ｄＬであり、微量のＣＲＰまで正確に測定可能なことが分かる。

以上のことより、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットは、特別な器具や装置を必要とせず、簡便かつ安価に、そして迅速に、更に高感度に、試料中の測定対象物質を正確に測定することができることが確かめられた。

〔実施例３〕（本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットによる血清試料中のＣＲＰの測定−２）

本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットにおいて、水溶性高分子化合物であるポリエチレングリコールを共存（含有）させて、血清試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確かめた。

Ｉ．本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットによる血清試料中のＣＲＰの測定

１．試薬
（１）遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液
遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液として、１．２２％のポリエチレングリコール（分子量１０，０００）、０．１ｍＭのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１．５３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕を調製した。
なお、ここで、ＢＳＡは、本発明における遊離状態にある色素に結合可能な物質である。

（２）測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体
前記実施例１の１の（２）で調製した抗ＣＲＰ抗体を固定化し且つＢＳＡを固定化したラテックス粒子の分散液を、本実施例の「測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体」として用いた。

（３）色素を含む緩衝液
前記実施例１の１の（３）で調製した１３５μＭのエチルバイオレット及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕を、本実施例の「色素を含む緩衝液」として用いた。

２．多孔性膜
前記実施例１の２における親水性四フッ化エチレン樹脂を材質とする多孔性膜（商品名「メンブランフィルター（タイプＪＡ；孔径１μｍ）〔ミリポア化）を、本実施例の「多孔性膜」として用いた。

３．試料
血清試料として、ＣＲＰ濃度が分かっている１４種類のヒトの血清試料を用意した。

４．ヒト血清試料の測定
前記３の１４種類のヒトの血清試料のそれぞれについて、前記実施例１の４の（１）〜（４）の操作の通りに測定を行った。

５．測定結果
前記の１４種類のヒト血清試料中のＣＲＰの測定結果を表２に示した。
なお、この表において、測定結果が、多孔性膜上に輪が観察できなかったもの（陰性）は「−」と表し、多孔性膜上に輪が観察できたもの（陽性）は「＋」と表し、輪の色調が濃くなるに従い、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」及び「＋＋＋＋」と表し、そして薄い色調の輪が観察できたもの（弱陽性）は「±」と表した。

ＩＩ．ラテックス免疫比濁法及びその測定試薬による血清試料中のＣＲＰの測定

１．試薬
ラテックス免疫比濁法を測定原理とする市販の試料中のＣＲＰの測定試薬「アキュラスオート ＣＲＰＩＩ」（シノテスト社）を用いた。

２．試料
血清試料として、前記１の３の１４種類のヒト血清試料を用いた。

３．ヒト血清試料の測定
前記２の１４種類のヒトの血清試料のそれぞれについて、日立７１７０Ｓ形自動分析装置（日立製作所社）を用いて、試料量３．６μＬ、第１試薬量１８０μＬ、第２試薬量６０μＬ、測光の主波長５７０ｎｍ及び副波長８００ｎｍ、並びに１８ポイント及び３４ポイントの２ポイントエンド法の測定条件において、試料中のＣＲＰの定量測定を行った。

４．測定結果
前記の１４種類のヒト血清試料中のＣＲＰの定量測定の結果を、これも表２に示した。
なお、この表に示した数値は、各ヒト血清試料中のＣＲＰの定量値（ｍｇ／ｄＬ）である。

ＩＩＩ．測定結果のまとめ
この測定結果の表からも、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットによるヒト血清試料中のＣＲＰの測定結果は、ラテックス免疫比濁法を測定原理とする市販のＣＲＰ測定試薬による定量値と、非常に良い相関を示していること、すなわち正確な測定結果が得られていることが分かる。

そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットにおいて、ポリエチレングリコールを共存（含有）させた本測定においては、ＣＲＰ濃度が約０．０４ｍｇ／ｄＬの血清試料まで、陽性と判定することができた。
すなわち、ヒト血清試料中のＣＲＰの測定の測定下限値は、約０．０４ｍｇ／ｄＬであった。

従って、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子化合物を共存（含有）させない場合の測定下限値が約０．１８ｍｇ／ｄＬであったので、この水溶性高分子化合物であるポリエチレングリコールを共存（含有）させることにより、測定の感度を４．５倍高めることができ、更に高感度に試料中の測定対象物質の測定を行えることが分かる。

以上の実施例の結果より、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットは、特別な器具や装置を必要とせず、簡便かつ安価に実施することができ、測定を行うに熟練を要さず、測定結果（多孔性膜上に現れる輪）が明確に示されるため判定が容易であり、そして極めて迅速に正確な測定結果を得ることができるものであることが確かめられた。

〔参考例１〕（本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットにおける色素の結合の確認）

本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットにおける色素の結合について、以下の検討により確認を行った。

１．試薬
◎ 色素水溶液
エチルバイオレット（和光純薬工業社；特級）を純水に溶解し、２７０μＭのエチルバイオレットを含む「色素水溶液」を調製した。

２．遠心式限外ろ過器具
遠心力を利用し限外ろ過膜により分子量が３０，０００以上の物質とそれ未満の物質を分離する「遠心式限外ろ過器具」として、商品名「アミコン・ウルトラ−１５（分画分子量：３０，０００）」〔ミリポア社〕を用いた。

３．検討対象
次のものを色素との結合を確かめる対象とした。

（イ）ラテックス粒子
前記実施例１の１の（２）における平均粒径０．１μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液に純水を加え、これを遠心した後上清を除き、その後純水を加え再度遠心した後上清を除く処理を２回繰り返した後、純水に懸濁し、ラテックス粒子の０．１％懸濁液を調製した。

これを検討対象の一つである「ラテックス粒子」とした。（なお、この「ラテックス粒子」には、抗体等の「測定対象物質に対する特異的結合物質」も、ＢＳＡ等の「色素に結合することができる物質」も固定化されていない。）

（ロ）ＢＳＡを固定化したラテックス粒子
前記の実施例１の１の（２）における平均粒径０．１μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液に、０．１ｍＭのＢＳＡを含む１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加え懸濁し、３７℃で２時間静置し、ラテックス粒子にＢＳＡを固定化した。
これを遠心分離により沈殿部を回収した後、純水を加え、これを遠心した後上清を除き、その後純水を加え再度遠心した後上清を除く処理を２回繰り返した後、純水に懸濁し、ＢＳＡを固定化したラテックス粒子の０．１％懸濁液を調製した。

これを検討対象の一つである「ＢＳＡを固定化したラテックス粒子」とした。（なお、この「ＢＳＡを固定化したラテックス粒子」には、抗体等の「測定対象物質に対する特異的結合物質」は固定化されていない。）

（ハ）ＢＳＡ水溶液
前記の実施例１の１の（１）で用いたＢＳＡを純水に溶解し、０．１ｍＭのＢＳＡ水溶液を調製した。
これを検討対象の一つである「ＢＳＡ水溶液」とした。

４．色素結合の確認
検討対象である前記３の（イ）の「ラテックス粒子」の４５０μＬと、前記１の「色素水溶液」の５０μＬを混合した後、この混合液を前記２の「遠心式限外ろ過器具」に添加し、１分間静置した。

次に、１４，０００ｒ．ｐ．ｍで１０分間、遠心分離を行った。

この遠心分離により、分子量が３０，０００以上である「ラテックス粒子」は、限外ろ過膜上に残り、分子量がそれ未満である遊離状態の「色素」は限外ろ過膜を通過して、ろ液中に存在することになる。

この遠心分離操作後のろ液の色調を観察した。

なお、検討対象を、更に、（イ）「ラテックス粒子」から、（ロ）「ＢＳＡを固定化したラテックス粒子」、そして、（ハ）「ＢＳＡ水溶液」にそれぞれ変えて、前記の通りに検討を行った。

４．検討結果
ろ液の色調は、検討対象が（イ）「ラテックス粒子」の場合には、濃い青色であったが、検討対象が（ロ）「ＢＳＡを固定化したラテックス粒子」の場合及び（ハ）「ＢＳＡ水溶液」の場合においては、僅かに薄い青色が認められるにとどまった。

これらの検討結果より、色素は、ラテックス粒子には結合していないが、ＢＳＡを固定化したラテックス粒子、及び水溶液中のＢＳＡには結合していることが分かる。

すなわち、色素は、ラテックス粒子の表面には結合しないが、ラテックス粒子に固定化されたＢＳＡ、及び溶液中で遊離状態で存在しているＢＳＡには結合していることが確かめられた。

〔参考例２〕（遊離状態にある色素に結合可能な物質の効果の確認）
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キットにおいて、遊離状態にある色素に結合可能な物質の効果の確認を行った。

１．試薬

（１）遊離状態にある色素に結合可能な物質を含まない緩衝液
遊離状態にある色素に結合可能な物質を含まない緩衝液として、１．５３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕を調製した。

（２）遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液
遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液として、０．１ｍＭのＢＳＡ、１．５３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕を調製した。
なお、ここで、ＢＳＡは、本発明における遊離状態にある色素に結合可能な物質である。

（３）測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体
測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体として、抗ＣＲＰ抗体を固定化し且つＢＳＡを固定化したラテックス粒子を用いた。

なお、ここで、抗ＣＲＰ抗体は、本発明における、測定対象物質（ＣＲＰ）に対する特異的結合物質である。
また、ＢＳＡは、本発明における、色素に結合することができる物質である。

この抗ＣＲＰ抗体を固定化し且つＢＳＡを固定化したラテックス粒子は、以下の手順により調製を行った。

平均粒径０．１μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液の１０．４ｍＬに、抗ＣＲＰヤギポリクローナル抗体を１．４ｇ／ｄＬの濃度で４．５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）に混和した液の７．３６ｍＬを加え、５℃にて一晩攪拌し、ラテックス粒子に抗ＣＲＰ抗体を固定化した。

次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に０．１ｍＭのＢＳＡ及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加え懸濁し、３７℃で２時間静置し、前記の抗ＣＲＰ抗体を固定化したラテックス粒子に更にＢＳＡを固定化した。

これを遠心分離により沈殿部を回収した後、０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕に懸濁し、次に遠心した後上清を除き、その後前記緩衝液を加え再度遠心した後上清を除く処理を２回繰り返した後、波長５８５ｎｍにおける吸光度が５Ａｂｓとなるように前記緩衝液に懸濁し、抗ＣＲＰ抗体を固定化し且つＢＳＡを固定化したラテックス粒子の分散液を調製した。

（４）色素を含む緩衝液
色素を含む緩衝液として、１３５μＭのエチルバイオレット（和光純薬工業社；特級）及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕を調製した。
なお、ここで、エチルバイオレットは、色素である。

２．多孔性膜
多孔性膜として、親水性四フッ化エチレン樹脂を材質とする多孔性膜（商品名「メンブランフィルター（タイプＪＡ；孔径１μｍ）〔ミリポア化）を用いた。

３．試料
◎ ＣＲＰ不含試料
ＣＲＰを含まない試料として、生理食塩水を用意した。

４．ＣＲＰ不含試料の測定
（１） 前記３の「ＣＲＰ不含試料」の１０μＬに、前記１の（１）の「遊離状態にある色素に結合可能な物質を含まない緩衝液」の３３０μＬ、前記１の（２）の「測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つ色素に結合することができる物質を固定化した担体」の１５０μＬ、及び前記１の（３）の「色素を含む緩衝液」の１０μＬを、順次添加し、撹拌して混合した。

（２） その後、この混合液を、室温にて１０分間静置した。

（３） 次に、前記（２）の混合液の１０μＬを、前記２の「多孔性膜」の上に添加した。

（４） 前記の多孔性膜上への添加後、室温で５分間静置した後、この多孔性膜上に現れる輪の測定を行った。

（５） 次に、前記（１）における「遊離状態にある色素に結合可能な物質を含まない緩衝液」を、前記１の（２）の「遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液」に変えて、前記（１）〜（４）の操作の通りに測定を行った。

５．測定結果
前記測定において、多孔性膜上の輪を測定した結果を図３に示した。

この図より、「遊離状態にある色素に結合可能な物質を含まない緩衝液」の場合は、測定対象物質であるＣＲＰを含まない試料においても、多孔性膜上に輪が現れてしまうことが分かる。すなわち、測定対象物質が存在しない試料を測定したとき、測定対象物質が存在するという誤った測定結果が得られてしまうことが分かる。

これに対して、「遊離状態にある色素に結合可能な物質を含む緩衝液」の場合は、測定対象物質であるＣＲＰを含まない試料においては、多孔性膜上に輪は現れず、試料中の測定対象物質を誤りなく正確に測定できることが分かる。

以上のことより、測定時に遊離状態にある色素に結合可能な物質を存在させることは、試料中の測定対象物質の正確な測定のために、必須であることが確かめられた。

本発明の測定方法の作用機序の推察を模式的に表した図である。 本発明の測定方法及び測定キットにより、ＣＲＰ不含試料及びＣＲＰ含有試料それぞれについて、多孔性膜上の輪を測定した結果を示した図である。 本発明の測定方法及び測定キットにおける、遊離状態にある色素に結合可能な物質の効果を示した図である。

Claims (8)

1. 下記の各工程よりなる、試料中の測定対象物質の測定方法。
   （ａ） 試料、エチルバイオレット、ローダミンＢ、エリスロシンＢ、エオシン又はクーマシーブリリアントブルーからなる群より選ばれる色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つタンパク質を固定化した担体、及び遊離状態にあるタンパク質を接触させる工程、
   （ｂ） 前記接触後、その一定量を多孔性膜上に添加する工程、及び
   （ｃ） 前記多孔性膜上に現れる輪を測定する工程
2. 測定対象物質に対する特異的結合物質が、測定対象物質が抗原である場合には当該抗原に特異的に結合する抗体であり、測定対象物質が抗体である場合には当該抗体に特異的に結合する抗体又は当該抗体にとっての抗原である、請求項１記載の試料中の測定対象物質の測定方法。
3. 担体が粒子である、請求項１又は請求項２記載の試料中の測定対象物質の測定方法。
4. 工程（ｃ）の多孔性膜上に現れる輪の測定において、多孔性膜上に輪が観察できた場合には試料中に測定対象物質が測定下限値以上の濃度で存在すると判定し、多孔性膜上に輪が観察できなかった場合には試料中に測定対象物質が存在しないか又は測定下限値未満の濃度で存在すると判定する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の試料中の測定対象物質の測定方法。
5. エチルバイオレット、ローダミンＢ、エリスロシンＢ、エオシン又はクーマシーブリリアントブルーからなる群より選ばれる色素、測定対象物質に対する特異的結合物質を固定化し且つタンパク質を固定化した担体、及び遊離状態にあるタンパク質を含有する試薬、並びに多孔性膜を含む、試料中の測定対象物質の測定キット。
6. 測定対象物質に対する特異的結合物質が、測定対象物質が抗原である場合には当該抗原に特異的に結合する抗体であり、測定対象物質が抗体である場合には当該抗体に特異的に結合する抗体又は当該抗体にとっての抗原である、請求項５記載の試料中の測定対象物質の測定キット。
7. 担体が粒子である、請求項５又は請求項６記載の試料中の測定対象物質の測定キット。
8. 多孔性膜上に輪が観察できた場合には試料中に測定対象物質が測定下限値以上の濃度で存在すると判定し、多孔性膜上に輪が観察できなかった場合には試料中に測定対象物質が存在しないか又は測定下限値未満の濃度で存在すると判定するものである、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の試料中の測定対象物質の測定キット。