JP4683819B2 - 同種輸血により誘導されたタンパク質及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Description

技 術 分 野
本発明は、免疫抑制活性を有するタンパク質、そのタンパク質をコードする遺伝子、その遺伝子を含有するベクター、そのベクターによる形質転換体、その形質転換体を培養して免疫活性を有するタンパク質を製造する方法、そのタンパク質を含有する医薬組成物等に関する。
背 景 技 術
臓器移植は末期臓器不全の最終的治療法として、すでに確立された治療手段である。臓器移植の医学的側面においての最大の問題は、急性・慢性の拒絶反応である。現在使用されている、副腎皮質ホルモン、サイクロスポリン、タクロリムス、アザチオプリン、抗胸腺細胞抗体などは、強力な免疫抑制活性をもち、臨床的には有用な薬剤である。しかしながら、これらの薬剤は、宿主の免疫機能を全般的に低下させてしまう。そのために、臓器移植後の死因の多くは、拒絶、感染、悪性腫瘍の発生など、これらの免疫抑制に関係したものがほとんどである。従って、より安全で確実な移植を行うために望まれるのは、抗原に特異的な免疫抑制、さらには、初期治療のみで臓器を永久生着可能に陥れるような、免疫寛容を人為的に導入することであろうと考えられる。
また、上述した免疫抑制剤は、リウマチ、乾癬等の自己免疫疾患やアレルギー性喘息（気管支喘息等）、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎（アトピー性皮膚炎等）、花粉症等のアレルギー性疾患の予防剤又は治療剤として、或いは拒絶反応抑制剤としても期待されている。
一方、古くから腎移植においては、術前輸血を繰り返した腎不全患者の腎移植の生着率が高いことが知られている［Ｏｐｅｌｚ Ｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１，６９６−６９８（１９７４）］。特に ドナー特異的な計画的な同種輸血（ｄｏｎｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）により有利な免疫反応が起きることが認められ［Ｏｐｅｌｚ Ｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ，１７，２３５７−２３６１（１９８５）］、多くの実験でその事実が確かめられてきた。齧歯類を用いた実験で１回の同種輸血のみで完全な免疫寛容が誘導される系が数多く知られている［Ｍａｒｉｎｏ Ｈ ｅｔ．ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ，９５，２６７−２７３（１９５８）；Ｍａｒｑｕｅｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ＩＩＩ，７０８−７１０（１９７１）；Ｆａｂｒｅ ＪＷ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１４，６０８−６１６（１９７２）］。
これまで、同種輸血による免疫寛容状態のメカニズムは種々の報告がなされてきた。大別してそれらを細胞性因子と液性因子に分けて考えることができる［小林英司，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３４，７９６−８０４（１９９７）］。Ｃｌｏｎａｌ ｄｅｌａｔｉｏｎ［Ｃｒａｎｓｔｏｎ Ｄ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，４２，３０２−３０６（１９８６）］またはａｎｅｒｇｙ［Ｄｏｌｌｍａｎ ＭＪ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１７３，７９−８７（１９９１）］は前者のメカニズムとして、同種輸血後に誘導される生体内生理活性物質が後者の候補である。液性因子の一つとして抗イディオタイプ抗体が、同種輸血後すみやかに産生されることが動物［ＮａｇａｒｋａｔｔＩ ＰＳ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，３６，６９５−６９９（１９８３）；Ｄｏｗｎｅｙ ＷＥＩＩＩ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，４９，１６０−１６６（１９９０）；Ｂａｌｄｗｏｎ ＷＭＩＩＩ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５１，４８１−４８５（１９９１）］またヒト［Ｈｏｒｕｚｘｋｏ Ａ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６，１２７−１３０（１９９０）］において報告されているが、その他のものについての全貌は未だ明らかにはなっていない。
そして、同種輸血後に誘導される免疫抑制力を示す生理活性物質は、内因性物質であることから、既存の免疫抑制薬と比較して、副作用がないことが期待される。
発 明 の 開 示
本発明者らは、上記課題を解決するため、同種輸血モデルを使用し、本モデルにおいて血液中に生産される免疫抑制活性を有する新規なタンパク質を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のタンパク質等を提供するものである。
項１．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質。
項２．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質。
項３．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質。
項４．項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
項５．以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
項６．以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
項７．以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
項８．項４〜７のいずれかに記載の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質。
項９．項４〜７のいずれかに記載の遺伝子を含有するベクター。
項１０．項９に記載のベクターを含有する形質転換体。
項１１．以下の工程を含むタンパク質の製造方法：
工程１；項１０に記載の形質転換体を培養する工程、及び
工程２；前記工程により得られた培養物から免疫抑制活性を有するタンパク質を回収する工程。
項１２．項１〜３又は８のいずれかに記載のタンパク質を有効成分として薬学的に許容される担体とともに含有する医薬組成物。
項１３．医薬組成物が免疫抑制剤である項１２に記載の医薬組成物。
項１４．免疫抑制剤が自己免疫疾患若しくはアレルギー性疾患の予防剤又は治療剤或いは拒絶反応抑制剤である項１３に記載の医薬組成物。
項１５．自己免疫疾患が、リウマチ、乾癬のいずれかである項１４に記載の医薬組成物。
項１６．アレルギー性疾患が、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、花扮症のいずれかである項１４に記載の医薬組成物。
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示はＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
また、本発明において遺伝子（ＤＮＡ）とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さについては何ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及びｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
本発明の免疫抑制活性を有するタンパク質は、例えば以下の方法により入手可能である。８〜１０週齢のＤＡラットのヘパリン添加全血を１ｍｌ、８〜１０週齢のＬｅｗｉｓラットの静脈あるいは門脈、好ましくは門脈に輸血（同種輸血）し、４〜２８日好ましくは１週間後にＬｅｗｉｓラットの組織や細胞あるいは血液から単離・精製する場合、動物の組織または細胞の場合はホモジナイズした後、酸などで抽出を行い該抽出液を、好ましくは腹部大動脈から全血を採取し、０〜２０℃、好ましくは４℃で遠心分離し、本発明のタンパク質を含む血清分画を採集する。
上記の方法により得られた本発明のタンパク質を含む抽出液好ましくは血清から本発明のタンパク質を精製する方法としては、例えば、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することが可能である。
本発明のタンパク質の免疫抑制活性測定法としては、マウス、ラットあるいはヒトのリンパ球を用いた種々の免疫反応を用いることができるが、例えば免疫抑制活性は、マウス、ラット、ヒトの同種リンパ球混合反応（同種ＭＬＲ（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ））に免疫抑制物質を添加することで感度良く測定できる。同種ＭＬＲにより免疫抑制反応を示す物質は、免疫抑制剤への応用が期待され、特にリウマチ、乾癬等の自己免疫疾患やアレルギー性喘息（気管支喘息等）、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎（アトピー性皮膚炎等）、花粉症等のアレルギー性疾患に対する薬剤として、或いは拒絶反応抑制剤として有用である。
本発明者らにより新たに単離・同定された免疫抑制活性を有する２６ｋＤａのタンパク質（以下、ＭＡＹ−Ｉと称する）を適当な断片に切断し、その断片のアミノ酸配列を決定し、公知のアミノ酸配列と比較した。その結果、ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｈ４Ｐ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ−ｒａｔ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ Ｎｏ．Ｙ１１２８３：以下、ラットＩαＩＨ４Ｐと称する）のアミノ酸配列（配列番号６）の６９９〜７２５、７８５〜７８９及び８９７〜９００番目のアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を有する断片の存在が確認された。ラットＩαＩＨ４Ｐの６９９〜７２５、７８５〜７８９及び８９７〜９００番目のアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３、４及び５に示す。
ラットＩαＩＨ４Ｐの６９９番目のアミノ酸からＣ末端のアミノ酸までのタンパク質の予想分子量は、ＭＡＹ−Ｉと同じく２６ｋＤａであった。そこで、本発明者らは、ラットＩαＩＨ４ＰのｃＤＮＡ配列からポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲと称する）にて、ＭＡＹ−ＩのｃＤＮＡ配列（配列番号２）をクローニングした。当該ＭＡＹ−ＩのｃＤＮＡ配列をタンパク質発現ベクターに組み込み、組換えＭＡＹ−Ｉを調製した。この組換えＭＡＹ−Ｉを同種ＭＬＲに供した結果、免疫抑制活性を有していた。従って、ＭＡＹ−ＩとラットＩαＩＨ４Ｐの６９９番目からＣ末端のアミノ酸配列を持つタンパク質は、その構造において同一のタンパク質であることが明らかになった。
さらに、本発明者らは、ラットＩαＩＨ４Ｐの全ｃＤＮＡ配列（配列番号９）をクローニングし、配列番号８のアミノ酸を有する組換えタンパク質を調製し、これを同種ＭＬＲに供した結果、免疫抑制活性を有していることを確認した。加えて、本発明者らは配列番号９のｃＤＮＡ配列からＭＡＹ−Ｉに相当する配列（配列番号２）を除去し、ＭＡＹ−Ｉに相当するアミノ酸配列を含まないアミノ酸配列を有する組換えタンパク質を調製し、これを同種ＭＬＲに供した結果、免疫抑制活性を示さないことを確認し、ＭＡＹ−Ｉが免疫抑制作用を支配していることを明らかにした。
一方、ラットＩαＩＨ４Ｐと類似のタンパク質がヒトにおいても存在し、ヒトＰＫ−１２０やヒトＩＨＲＰなどが知られ、これらのタンパク質は、統一してその名前をＩαＩＨ４Ｐと呼ばれている（ＰＫ−１２０［Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｎ ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３５７，２０７−２１１（１９９５）］、ｓｇｐ１２０［Ｃａｒｌ Ｈ．Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ：５４５９０６３（１９８９）］、ＩＨＲＰ［Ｋｅｎ Ｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，５７７−５８４（１９９６）］）。ヒトＰＫ−１２０のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１２及び１３として示し、ヒトＩＨＲＰのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１０及び１１として示す。ヒトＰＫ−１２０とヒトＩＨＲＰの間には、一部異なるアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が存在するが非常に高い相同性を有している（ＧｅｎｅＢａｎｋ配列データベースａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ Ｎｏ．Ｄ３８５９５（ヒトＩＨＲＰ）とＧｅｎｅＢａｎｋ配列データベースａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ Ｎｏ．Ｄ３８５３５（ヒトＰＫ−１２０）の相同性解析）。さらに、ヒトＩＨＲＰのアミノ酸配列（配列番号１０）とラットＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列（配列番号６）とは、非常に高い相同性を有していることが明らかになっている［Ｓｏｕｅｙ Ｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２４３，５２２−５３０（１９９８）］。また、両者はｃＤＮＡ配列においても７３％の相同性を有しており［ラットＩαＩＨ４Ｐの塩基配列（配列番号７）：ＧｅｎｅＢａｎｋ塩基配列データベースａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ Ｎｏ．Ｙ１１２８３と、ヒトＩＨＲＰの塩基配列（配列番号１１）：ＧｅｎｅＢａｎｋ塩基配列データベースａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ Ｎｏ．Ｄ３８５９５の相同性解折］、種を越えて保存されているタンパク質であることが容易に推測される。そこで、ヒトＩＨＲＰのアミノ酸配列（配列番号１０）のうちＭＡＹ−Ｉに相当するアミノ酸配列（配列番号１４）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１５）をクローニングし、タンパク質発現ベクターに組み込み、組換えヒトＭＡＹ−Ｉを調製した。この組換えヒトＭＡＹ−Ｉをヒト同種ＭＬＲに供した結果、免疫抑制活性を有していた。このことから、配列番号１４のアミノ酸配列を含有するヒトＩＨＲＰのアミノ酸配列（配列番号１０）や、ヒトＩＨＲＰのアミノ酸配列と高い相同性を有するヒトＰＫ−１２０のアミノ酸配列（配列番号１２）もまた、ヒトＭＡＹ−Ｉと同様にヒトに対し免疫抑制活性を有すると考えられる。さらに、その他のヒトＩαＩＨ４Ｐもまた、ＭＡＹ−Ｉと同一のアミノ酸配列、又はＭＡＹ−Ｉの示す免疫抑制活性を損なわない程度に修飾されたアミノ酸配列を含有する限りは、ヒトに対し免疫抑制活性を有すると考えられる。
また、ブタＩαＩＨ４Ｐの塩基配列（配列番号１８）［Ｋｅｎ Ｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，，１１９，５７７−５８４（１９９６）］もラットＩαＩＨ４ＰのＤＮＡ配列と高い相同性を有することから、ヒトＩαＩＨ４Ｐの場合と同様に、ブタＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列（配列番号１７）又はこのアミノ酸配列のうちＭＡＹ−Ｉに相当するアミノ酸配列（配列番号１９）からなるタンパク質もヒトに対し免疫抑制活性を有すると考えられる。ブタＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列のうちＭＡＹ−Ｉに相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２０に示す。
さらには、他の哺乳動物のＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列のうちＭＡＹ−Ｉに相当するアミノ酸配列も、ブタＩαＩＨ４Ｐの場合と同様に免疫抑制活性を有すると考えられる。本発明は、（ａ）ラット、ヒト及びブタ以外の哺乳動物のＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列のうちＭＡＹ−Ｉに相当するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質を包含する。さらに、本発明は、前記アミノ酸配列（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を包含する。
本発明のタンパク質は、免疫抑制作用を有している。配列番号１４で表されるアミノ酸配列は、本明細書の実施例でクローニングされた遺伝子の塩基配列に基づいて誘導されたアミノ酸配列である。本発明のタンパク質は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、そのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質も本発明に包含される。なお、本明細書において、複数個とは、２〜５０個、より好ましくは２〜３０個、より一層好ましくは２〜２０個、最も好ましくは２〜数個をいう。
また、本発明のタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、そのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質も本発明に包含される。
さらに、本発明のタンパク質は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、そのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質も本発明に包含される。
一方、配列番号１４、１又は８のアミノ酸配列のいずれかと、相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上であるアミノ酸からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質も本発明に包含される。さらに、該タンパク質をコードする遺伝子も本発明に包含される。
一般に、天然に存在するタンパク質の中には、それをコードする遺伝子の多形性や変異のために、あるいはタンパク質生成後の修飾反応などによって、アミノ酸配列中でアミノ酸残基の欠失、付加、置換などの変異が生じる場合があるが、それにも関わらずそのような変異が生じないタンパク質と同じ生理学的活性を有するものがある。あるいはまた、遺伝子組み換え工学の技術を使用して人工的に遺伝子に変異を施すことも可能であり、この場合にも該タンパク質の生理学的活性に実質的に変化を生じさせることなく変異させることが可能である。配列番号１、８又は１４のアミノ酸配列をこれらの天然又は人工的な変異で変異させたアミノ酸配列を有するタンパク質も免疫抑制という機能を有する限り、本発明のタンパク質の範囲に含まれるし、天然又は人工的に変異を生じた遺伝子も、該遺伝子によってコードされたアミノ酸配列を有するタンパク質が免疫抑制作用示す限り、本発明の遺伝子に含まれる。これには対立遺伝子（アレル体）も含まれる。
上述の人工的な変異を生じさせる手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，３６７−３８２（１９８７）；同１００，４６８（１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」，日本生化学会編，ｐ１０５（１９８６）〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）；同９１，３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０，１７８（１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２２，１８５９（１９８１）；同２４，２４５（１９８３）〕及びそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法又はトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
また、本発明のタンパク質は、天然のタンパク質でも組み換えタンパク質でも、あるいは化学合成タンパク質でもよく、その起源は特に限定されない。天然のタンパク質を得たい場合には、目的タンパク質を発現している組織または培養細胞の培養物を出発原料として、塩析、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過などのタンパク質の精製のための公知の方法を適宜組合わせて精製することが可能である。例えば、アフィニティークロマトグラフィーを利用する場合には、本発明のタンパク質に対する抗体を結合させた担体を用いることにより目的タンパク質を精製することができる。
また、組換えタンパク質を得たい場合には、上記のように目的タンパク質をコードする本発明の遺伝子を好適な発現ベクター中にクローニングして得られた組換え発現ベクターを宿主（大腸菌、酵母など）に形質転換し、形質転換体を好適な条件下で培養することにより目的とするタンパク質を産生させることができる。目的タンパク質の単離のためには、目的タンパク質を培養上清中に分泌させることが一般には好ましく、これは、組換えベクター／宿主の組み合わせや培養条件などを適宜選択することによって行うことができる。また、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質を化学合成的に製造することも当業者ならば適宜行うことができる。
さらに、免疫抑制活性を保持する限り、本発明のタンパク質に薬学的に許容しうる適当な修飾をすることが可能である。すなわち、配列番号１４、１又は８で表されるアミノ酸配列のタンパク質および部分配列などを含有するタンパク質はＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキルなどのＣ_７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが挙げられる。本発明のタンパク質の塩としては、薬学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、とりわけ薬学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク質、その前駆体、そのアミド、そのエステル又はその塩は、免疫抑制活性を有し、医薬として、特に、自己免疫疾患（リウマチ、乾癬等）若しくはアレルギー性疾患（アレルギー性喘息（気管支喘息等）、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎（アトピー性皮膚炎等）、花粉症等）等の予防剤又は治療剤として、或いは拒絶反応抑制剤として有用である。
本発明の遺伝子は、免疫抑制作用を有するタンパク質をコードする。本発明の遺伝子は、具体的には、配列番号１４、１又は８のいずれかで表されるアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、本発明の遺伝子は、配列番号１５、２又は９のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ、或いはその塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも包含する。また、本発明の遺伝子は、遺伝子治療に使用され得る。
ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は特に制限されないが、プローブＤＮＡ配列と検出されるＤＮＡ配列との間の相同性が比較的高くなるような条件を選択するのが一般的である。ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション溶液中の溶媒濃度および／または塩濃度、ハイブリダイゼーション温度またはハイブリダイゼーション時間などによって調節することができる。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件（洗浄液の塩濃度等）によって調節することもできる。これらの条件は、プローブの長さおよび／または塩基組成、並びに検出すべき塩基配列とプローブの塩基配列との相同性の設定に応じて、当業者ならば適宜選択することができる。
本発明の遺伝子は以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。本発明の遺伝子のクローニングの手段としては、本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のＰＣＲ法によってゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、またヒトや温血動物のあらゆる組織・細胞、好ましくは肝臓から目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを例えば本発明のタンパク質の一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。クローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明によれば、本発明の遺伝子を含有するベクターが提供される。ベクターの種類は特に限定されず、その後の操作の目的に応じて適当なベクターを選択できる。一般的にはプラスミドベクター、ファージベクターなどが使用でき、これらは多くの業者から市販されている。また、本発明のＤＮＡがコードする組み換えタンパク質を産生させたい場合には、発現ベクターが使用される。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
本発明によれば、上記組み換えベクターを宿主に形質転換することによって作製される形質転換体が提供される。宿主としては任意の好適な生物体を選択でき、例えば微生物であり、真核微生物（動物細胞、植物細胞、酵母など）でも原核微生物（大腸菌など）でもよい。形質転換の方法は当業者に公知の方法を使用することができ、具体的には、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション法などを適宜使用できる。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、タンパク質またはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｐｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα（ＭＦα）・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築されたタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィトロ（ｉｎ Ｖｉｔｒｏ），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７）〕などが用いられる。動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ−７細胞，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞，マウスＬ細胞，マウス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なわれる。バチルス属菌を形質転換するには、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行われる。酵母を形質転換するには、たとえばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６巻，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、たとえばＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なわれる。発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ），８４倦，７４１３（１９８７）〕、リン酸カルシウム法〔Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７（１９７３）〕、電気穿孔法〔Ｎｕｅｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，８４１−８４５（１９８２）〕等が挙げられる。このようにして、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。なお、動物細胞を用いて、本発明のタンパク質等を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のタンパク質等の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のタンパク質またはその部分ペプチド等をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。上記の形質転換体を本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質等を生成、蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質等を製造することができる。
本発明の医薬組成物は、本発明のタンパク質を含有するものであれば特に限定されない。また、本発明の医薬組成物は、本発明のタンパク質の他、その使用形態に応じて、生物学的に許容される担体、賦形剤等を含有できる。
また、本発明の免疫抑制剤は、自己免疫疾患（リウマチ、乾癬等）若しくはアレルギー性疾患（アレルギー性喘息（気管支喘息等）、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎（アトピー性皮膚炎等）、花粉症等）等に対する予防剤又は治療剤として、或いは拒絶反応抑制剤として有用である。
本発明のタンパク質またはそれをコードするＤＮＡを上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは軟膏、硬膏等の外用剤、噴霧剤、吸入剤などとして経鼻的に、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。本発明のタンパク質の投与方法としては、移植の際の拒絶反応を治療をする場合、経口、注射、関節内投与、直腸内投与、移植臓器の潅流、移植臓器への投与、バルーンカテーテルを利用した投与方法が挙げられる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。好ましい投与方法は、注射剤、吸入剤、点鼻剤、外用剤等の局所投与である。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、マントヒヒ、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のタンパク質またはそれをコードする遺伝子の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人の移植患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０００１ｇから１０ｇ、好ましくは約０．１ｍｇから１００ｍｇ、より好ましくは約１．０ｍｇから５０ｍｇ、さらに好ましくは約１．０ｍｇから２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の移植患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．００００１ｇから１ｇ、好ましくは約０．０１ｍｇから３０ｍｇ、より好ましくは約０．１ｍｇから２０ｍｇ程度、さらに好ましくは約０．１ｍｇから１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。この投与量は他の動物の場合も同様である。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：同種輸血により誘導される免疫抑制活性
８〜１０週齢のＤＡラットのヘパリン添加全血を１ｍｌ、８〜１０週齢のＬｅｗｉｓラットの門脈に輸血（同種輸血）し、１週間後にＬｅｗｉｓラットの腹部大動脈から全血を採取した。また、対象としてＬｅｗｉｓラットのヘパリン添加全血を１ｍｌ、Ｌｅｗｉｓラットの門脈に輸血（以下ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ：ＢＴと称する）し、１週間後にＬｅｗｉｓラットの腹部大動脈から全血を採取した。これらの血液を４℃で遠心分離し、血清分画を採集した（以下、それぞれ同種輸血血清およびＢＴ血清と称する）。同種輸血およびＢＴ血清中のタンパク質濃度を測定し、１、０．４および０．１μｇの濃度でラット同種ＭＬＲに添加し、免疫抑制活性を比較した。血清中のタンパク質濃度は、市販されているＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、添付されている方法に従って測定した。また、同種ＭＬＲは、反応細胞としてＬｅｗｉｓラットの脾細胞を、刺激細胞としてＤＡラットの脾細胞をマイトマイシンＣ処理（または照射）したものを用い、両者を等比で混合培養した。
反応細胞の調製法としては、以下の方法で行った。８〜１０週齢のＬｅｗｉｓラットより脾臓を摘出し、リンホライト−ラット（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を用いた比重遠心法にてリンパ球を調製した。リンパ球は、熱不活性化牛胎仔血清（以下、ＦＢＳと称する）を１０％含むＲＰＭＩ−１６４０培地（日研生物医学研究所、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホネート１０ｍＭ、２−メルカプトエタノール５５μＭ含有）を用いて、１０^６個／ｍｌに調製し、反応細胞浮遊液として用いた。刺激細胞は以下の方法で調製した。８〜１０週齢のＤＡラットより脾細胞を摘出し、リンホライト−ラットを用いた比重遠心法にてリンパ球を調製した。リンパ球は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊させ、２５μｇ／ｍｌマイトマイシンＣで３７℃、１５分間の処理を行った。３回洗浄後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、１０^６個／ｍｌに調製し、刺激細胞浮遊液として用いた。上述した方法により調製した反応細胞浮遊液１００μｌと刺激細胞浮遊液用１００μｌおよび被検体２μｌとを、９６穴Ｕ底マイクロテストプレートに加え、３７℃で５％炭酸ガス９５％空気の条件化で３日間培養を行った。ラット同種ＭＬＲにおけるリンパ球の幼若化反応の測定法としては、^３Ｈ−チミジンの取り込みを指標とする方法を用いた。即ち、培養終了１８時間前に^３Ｈ−チミジン１μＣｉ／ウエルを添加し、培養終了後、セルハーベスターにて細胞を収集し、細胞内に取り込まれた放射活性をマイクロプレートシンチレーションカウンターにて測定し、同種ＭＬＲのリンパ球幼若化の指標とした。ラット同種ＭＬＲの抑制活性は、以下の数式により抑制率を算出し評価した。
抑制率（％）＝｛１−（被検体を添加したＭＬＲのｃｐｍ−反応細胞のみのｃｐｍ）／（被検体未添加のＭＬＲのｃｐｍ−反応細胞のみのｃｐｍ）｝×１００
その結果、同種輸血血清はタンパク質量０．４μｇで、明瞭な免疫抑制活性を示した（図１）。
実施例２：ラット同種ＭＬＲを抑制する生理活性物質（タンパク質）の分離・精製
実施例１において得られた同種輸血血清を、以下に示す方法にて分離・精製した。
１．塩析
同種輸血血清は、４０％硫酸アンモニウムにより塩析し、沈殿物を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解し、同溶液にて透析した。この溶液を４℃で遠心分離し、上清を回収した。
２．プロテインＧアフィニティーカラムクロマトグラフィー
塩析したサンプルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ファルマシア）を用いて、中圧クロマトグラフィーにて分離・精製した（図２）。分離は、結合溶液；５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、溶出液；１００ｍＭグリシンー塩酸溶液（ｐＨ２．７）、流速；２００μｌ／分で行った。その結果、カラムに結合しないタンパク質が含まれる画分Ｎｏ．２〜７（以下ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ：ＰＧＦＴと称する）は、ラット同種ＭＬＲにより免疫抑制活性を調べると、著明な免疫抑制活性をした（図３）。
３．ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
ＰＧＦＴは、ＣＨＴ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムを用いて、中圧クロマトグラフィーにて分離・精製した（図４）。分離は、結合溶液；５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、溶出液；５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、グラジエント容量；３００ｍｌ、流速；２ｍｌ／分で行った。その結果、分離した画分をラット同種ＭＬＲにより免疫抑制活性を調べると、画分Ｎｏ．３９〜４２が免疫抑制活性を示した（以下ＣＨＴ３９〜４２と称する、図５）。４．ゲル濾過クロマトグラフィー
ＣＨＴ３９〜４２は、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ファルマシア）を用いて、中圧クロマトグラフィーにて分離・精製した（図６）。分離は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液／１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、流速；０．８ｍｌ／分で行った。その結果、分離した画分を、ラット同種ＭＬＲにより免疫抑制活性を調べると、画分Ｎｏ．２８および２９（以下ＳＤ２８および２９と称する）が免疫抑制活性を示した（図７）。
実施例３：ラット同種ＭＬＲを抑制する生理活性物質（タンパク質）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製度の確認
精製過程でのタンパク質の純度の検定は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、「タンパク質実験ノート（下）一次構造の決定まで（羊土社）１４〜１９頁」に記載される方法に従って行い、泳動後、ゲルは、同２２頁に記載される銀染色法にて染色した。その結果、ＳＤ２８および２９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて一種類のタンパク質であることが判明した（以下ＳＤ２８に含まれるタンパク質をＭＡＹ−Ｉと称する、図８）。
上述の精製・分離方法により免疫抑制活陸を有するＭＡＹ−Ｉの精製度は、約１．５×１０^８倍である（表１）。

実施例４：ラット同種ＭＬＲを抑制するタンパク質（ＭＡＹ−Ｉ）のＮ末端および内部部分アミノ酸配列の解析
実施例２で精製された免疫抑制活性を有するＳＤ２８および２９に含まれるタンパク質（ＭＡＹ−Ｉ）のアミノ酸配列を決定した。タンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、フェニルイソチオシアナート法によるプロテインシークエンサー（Ｇ１００５Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ社製）により分析した。また、タンパク質内部の部分アミノ酸配列は、タンパク質のジスルフィド結合をカルボキシメチル化法により切断後、リジルエンドペプチダーゼにより断片化し、逆相ＨＰＬＣによりペプチドを分離し、これを上述したプロテインシークエンサーにて分析した。その結果、どちらの画分からも同じアミノ酸配列（Ｎ末端から２７配列（配列番号３））が得られた。また、タンパク質内部には配列番号４および５のアミノ酸配列が得られた。
実施例５：ラット同種ＭＬＲを抑制する生理活性物質（ＭＡＹ−Ｉ）の分子量の解析
ＭＡＹ−Ｉの分子量は、イオンスプレー質量分析法により、質量分析装置（ＡＰＩ３０００、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ社製）により分析した。その結果、分子量２６０８９．８４Ｄａのタンパク質であった。
実施例６：ラットＩαＩＨ４Ｐをコードする遺伝子断片の同定
実施例４において解析されたＮ末端側の２７アミノ酸（配列番号３）を、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ ＦＡＳＴＡ Ｓｅｒｖｅｒ（Ｋｙｏｔｏ Ｃｅｎｔｅｒ）に登録されているタンパク質データベースにてホモロジーサーチに供した。その結果、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒがＪＣ５９５３として登録されていたラットＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列の６９９〜７２５番目のアミノ酸配列と完全な相同性を示した。配列番号４および５で表されるアミノ酸配列は、ラットＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列のそれぞれ７８５〜７８９および８９７〜９００番目のアミノ酸と完全な相同性を示した。
さらに、配列番号３で表される２７アミノ酸が相同性を示す、ラットＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列６９９番目のアミノ酸からＣ末端のアミノ酸までのタンパク質の予想される分子量を計算すると２６０８０．０７Ｄａであり、実施例５に示したタンパク質（ＭＡＹ−Ｉ）の分子量と実質的に同一であった。従って、当該タンパク質は、ラットＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列６９９番目のアミノ酸から下流の配列をコードしている。
実施例７：実施例６で得られたラットＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列６９９番目のアミノ酸から下流の配列（ＭＡＹ−Ｉ）をコードする遺伝子のクローニング
遺伝子配列のデータベース、ＧｅｎｅＢａｎｋにａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ｎｕｍｂｅｒがＹ１１２８３として登録されているラットＩαＩＨ４Ｐの全長ｃＤＮＡ塩基配列から、６９９番目のアミノ酸からＣ末端のアミノ酸までに相当する部分をＰＣＲにてクローニングした。すなわち、９週齢のＤＡラットのヘパリン添加全血を１ｍｌ、９週齢のＬｅｗｉｓラットの門脈に輸血（同種輸血）し、１週間後に採取したＬｅｗｉｓラットの肝臓から、Ｉｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ）を用いてマニュアルに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。調製した１０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡから６塩基のランダムプライマー（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）にてｃＤＮＡの合成を行った。合成した１μｇのｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーとして配列番号２１および２２で示される塩基配列を、それぞれ合成した。ＰＣＲ反応は、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、プライマー各２μｌおよびＡｄｖａｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １μｌ、酵素に添付の反応バッファーおよびｄＮＴＰｓと１μｌのｃＤＮＡを用いて全容量４０μｌで行った。最初に９４℃で１分間熱処理を行って鋳型ＤＮＡの変性を十分に行った後に、９４℃で１分、６２℃で１分、６８℃で１分のサイクルを２５回行い、最後に６８℃で３分伸長反応を行った。反応終了後に１０μｌの反応液を用いて１．２％アガロースゲル電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色で増幅産物を検出し、約７００ｂｐのバンドを剃刀で切り出し、フィルター（ＵｌｔｒａＦｒｅｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心濾過後、フェノール抽出、エタノール沈澱をしてＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片は、制限酵素ＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉで消化し、タンパク質発現ベクターｐＳｅｃ Ｔａｇ２ Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉサイトへサブクローニングし、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αへ導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ＭＡＹＩ−ｐＳｅｃ Ｔａｇ２ Ｂを得た。得られた形質転換体に挿入されたｃＤＮＡ断片の塩基配列を、Ｔ７プライマーとｐｃＤＮＡ３．１／ＢＧＨリバースプライマーを用いてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社）によるシーケンス反応を行なった。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いてこのｃＤＮＡの配列を解析したところ、ラットＩαＩＨ４Ｐの６９９番目のアミノ酸からＣ末端のアミノ酸までに相当する部分のタンパク質（ＭＡＹ−Ｉ）をコードするｃＤＮＡの配列（配列番号２）が得られた。
実施例８：ラットＩαＩＨ４Ｐの全長ｃＤＮＡ塩基配列のクローニング
実施例７で合成したラット肝臓ｃＤＮＡの１μｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーとして配列番号２３，２４，２５，２６，２７および２８で示される塩基配列を、それぞれ合成した。ＰＣＲ反応は、実施例７と同様の方法で行った。配列番号２３および２４で増幅したＤＮＡ断片（Ｈ４Ｐ−１）、配列番号２５および２６で増幅したＤＮＡ断片（Ｈ４Ｐ−２）及び配列番号２７および２８で増幅したＤＮＡ断片（Ｈ４Ｐ−３）は、アガロースゲル電気泳動後、ゲルから回収し、制限酵素ＢａｍＨ ＩとＥｃｏＲ Ｉで消化し、それぞれタンパク質発現ベクターｐＥＦ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨ ＩとＥｃｏＲ Ｉサイトへサブクローニングし、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＳＣＳ１１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へ導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＣＳ１１０／Ｈ４Ｐ−１，２，３を得た。挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を確認した後、Ｈ４Ｐ−１及び２の断片を含むプラスミドベクターを、制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ及びＢｇｌ ＩＩで消化し、再びｐＥＦ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃにサブクローニングし、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＳＣＳ１１０へ導入し、ＭＡＹ−Ｉタンパク質をコードするｃＤＮＡを含まないＥ．ｃｏｌｉ ＳＣＳ１１０／ｐａｒｔｉａｌ−Ｈ４Ｐを得た。得られたｐａｒｔｉａｌ−Ｈ４ＰのｃＤＮＡの塩基配列を確認した後、Ｈ４Ｐ−３と共に制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、再びｐＥＦ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃにサブクローニングし、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αへ導入し、ラットＩαＩＨ４Ｐの全長ｃＤＮＡ塩基配列を含むＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／Ｈ４Ｐを得た。
実施例９：実施例７で得られたラットＩαＩＨ４Ｐのアミノ酸配列６９９番目のアミノ酸からＣ末端のアミノ酸までに相当する部分のタンパク質（ＭＡＹ−Ｉ）の調製、並びに実施例８で得られたラットＩαＩＨ４Ｐ全長のタンパク質（Ｈ４Ｐ）及びＭＡＹ−Ｉのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含まない部分のタンパク質（ｐａｒｔｉａｌ−Ｈ４Ｐ）の調製
実施例７で作製したＭＡＹ Ｉ−ｐＳｅｃ Ｔａｇ２ Ｂ、実施例８で調製しＨ４Ｐ及びｐａｒｔｉａｌ−Ｈ４ＰをＣＯＳ ７細胞にＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの翌日、ＦＢＳを含まない培地に交換し、培養２４時間後の培養上清を回収し、その中に含まれる組換えＭＡＹ−Ｉ、Ｈ４Ｐおよびｐａｒｔｉａｌ−Ｈ４Ｐを以下の方法で分離・精製した。すなわち、培養上清は、Ｈｉｓ Ｔｒａｐカラム（アマシャムファルマシア）を用いて、中圧クロマトグラフィーにて分離・精製した。分離は、結合溶液；２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液−１０ｍＭイミダゾール溶液（ｐＨ７．４）、溶出液；２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液−５００ｍＭイミダゾール溶液（ｐＨ７．４）、流速；１．５ｍｌ／分で行った。このクロマトグラフィーのピークをＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを用いて、中圧クロマトグラフィーにて緩衝液の交換を行った。条件は、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液−１２０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、流速；１ｍｌ／分で行った。
実施例１０：実施例９で調製した組換えＭＡＹ−Ｉ、Ｈ４Ｐ及びｐａｒｔｉａｌ−Ｈ４Ｐの免疫抑制活性
実施例９で調製した組換えＭＡＹ−Ｉ（配列番号１）の、ラット同種ＭＬＲによる免疫抑制活性を、実施例１と同様にして調べると、濃度依存的な免疫抑制活性を示した（図９）。さらに、組換えＨ４Ｐ（配列番号８）及びｐａｒｔｉａｌ−Ｈ４Ｐについても同様に免疫抑制活性を測定すると、前者には免疫抑制活性が認められ、後者にはそれが認められなかった（図１０）。この結果、ＭＡＹ−Ｉは免疫抑制活性を支配していることが確認された。
実施例１１：ヒトＭＡＹ−Ｉをコードする遺伝子のクローニング（１）
Ｈｅｐ Ｇ２細胞から、Ｉｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ）を用い、マニュアルに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。調製した１０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡから６塩基のランダムプライマー（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）にてｃＤＮＡの合成を行った。合成した１μｇのｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーとして配列番号２９および３０で示される塩基配列を、それぞれ合成した。ＰＣＲ反応は、最初に９５℃で１分間熱処理を行って鋳型ＤＮＡの変性を十分に行った後に、９５℃で３０秒、６８℃で１分のサイクルを２５回行い、最後に６８℃で１０分伸長反応を行った。増幅したＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動後、ゲルから回収し、制限酵素ＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉで消化し、タンパク質発現ベクターｐＳｅｃ Ｔａｇ２ Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉサイトへサブクローニングし、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αへ導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／Ｈｕｍａｎ ＭＡＹ Ｉ−ｐＳｅｃ Ｔａｇ２ Ｂを得た。挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を実施例７と同様の方法で確認した後、ヒトＩＨＲＰの６６１番目のアミノ酸からＣ末端のアミノ酸までに相当する部分のタンパク質（ヒトＭＡＹ−Ｉ）をコードするｃＤＮＡの配列（配列番号１５）が得られた。
実施例１２：ヒトＭＡＹ−Ｉをコードする遺伝子のクローニング（２）
ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から，ラットＭＡＹ−Ｉをコードする遺伝子をプローブとして，ライブラリーに添付されているマニュアルに従いラットＭＡＹ−Ｉをコードする遺伝子と相同性を有するｃＤＮＡを含む形質転換体を得た．このｃＤＮＡ断片の塩基配列を解析した結果，このｃＤＮＡ断片はヒトＩＨＲＰ ｃＤＮＡ配列の１４２４番目の塩基からＣ末端側のコード領域を含むことが確認された（配列番号１６）。
実施例１３：実施例１１で得られたヒトＩＨＲＰの６６１番目のアミノ酸からＣ末端のアミノ酸までに相当する部分のタンパク質（ヒトＭＡＹ−Ｉ）の調製及び調製した組換えヒトＭＡＹ−Ｉの免疫抑制活性
実施例１１で作製したＨｕｍａｎ ＭＡＹ Ｉ−ｐＳｅｃ Ｔａｇ２ ＢをＣＯＳ ７細胞にＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの翌日、ＦＢＳを含まない培地に交換し、培養２４時間後の培養上清を回収し、その中に含まれる組換えヒトＭＡＹ−Ｉを実施例９に示す方法で分離・精製した。このヒトＭＡＹ−ＩのヒトＭＬＲによる免疫抑制活性を調べると、濃度依存的な免疫抑制活性を示した（図１１）。
産業上の利用の可能性
本発明のタンパク質は、免疫抑制活性を有していることから、自己免疫疾患（リウマチ、乾癬等）若しくはアレルギー性疾患（アレルギー性喘息（気管支喘息等）、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎（アトピー性皮膚炎等）、花扮症等）等の予防剤又は治療剤として、或いは拒絶反応抑制剤として有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、同種輸血血清のラット同種ＭＬＲにおける免疫抑制活性を示す。
図２は、同種輸血血清のプロテインＧアフィニティーカラムによるクロマトグラムを示す。
図３は、プロテインＧアフィニティーカラムに結合しない画分の、ラット同種ＭＬＲにおける免疫抑制活性を示す。
図４は、プロテインＧアフィニティーカラムに結合しない画分の、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるクロマトグラムを示す。
図５は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーで分離した画分の、ラット同種ＭＬＲにおける免疫抑制活性を示す。
図６は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーで免疫抑制活性が認められた画分の、ゲル濾過クロマトグラフィーによるクロマトグラムを示す。
図７は、ゲル濾過クロマトグラフィーで分離した画分の、ラット同種ＭＬＲにおける免疫抑制活性を示す。
図８は、ゲル濾過クロマトグラフィーで分離した画分Ｆｒ．２８のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真であり、単一のタンパク質であることを示す。
図９は、組換えラットＭＡＹ−１の、ラット同種ＭＬＲにおける免疫抑制活性を示す。
図１０は、組換えラットＭＡＹ−Ｉ、ＩαＩＨ４Ｐ及びｐａｒｔｉａｌ−Ｈ４Ｐの、ラット同種ＭＬＲにおける免疫抑制活性を示す。
図１１は、組換えヒトＭＡＹ−Ｉの、ヒト同種ＭＬＲにおける免疫抑制活性を示す。

Claims (16)

1. 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：（ａ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質。
2. 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質。
3. 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
5. 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：（ａ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
6. 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
7. 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：（ａ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ免疫抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
8. 請求項４〜７のいずれかに記載の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質。
9. 請求項４〜７のいずれかに記載の遺伝子を含有するベクター。
10. 請求項９に記載のベクターを含有する形質転換体。
11. 以下の工程を含むタンパク質の製造方法：工程１；請求項１０に記載の形質転換体を培養する工程、及び工程２；前記工程により得られた培養物から免疫抑制活性を有するタンパク質を回収する工程。
12. 請求項１〜３又は８のいずれかに記載のタンパク質を有効成分として薬学的に許容される担体とともに含有する医薬組成物。
13. 医薬組成物が免疫抑制剤である請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 免疫抑制剤が自己免疫疾患若しくはアレルギー性疾患の予防剤又は治療剤或いは拒絶反応抑制剤である請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 自己免疫疾患が、リウマチ、乾癬のいずれかである請求項１４に記載の医薬組成物。
16. アレルギー性疾患が、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、花粉症のいずれかである請求項１４に記載の医薬組成物。

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