JP4669962B2 - クラスＣ型β−ラクタマーゼ産生菌の簡易検出法 - Google Patents
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Description
本発明は、β-ラクタマーゼの中でも、クラスC型β-ラクタマーゼに特異性の高い阻害剤を用いたクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌の簡易検出法に関する。
β-ラクタマーゼ産生は、腸内細菌をはじめとするグラム陰性菌のβ-ラクタム剤に対する主要な耐性機序である。即ち、β-ラクタマーゼはβラクタム系抗菌薬のβラクタム環を加水分解し抗菌力を失わせる細菌産生酵素の一つである。
［β-ラクタマーゼの種類とその産生菌検出法についてのこれまでの研究］
β-ラクタマーゼには、その構造上の特徴からクラス A、 B、 C、 Dの４つのグループがある。本発明者らは、これまでに臨床上大きな問題となっているクラス A の基質拡張型β-ラクタマーゼ(ESBL)の検出法としてTwin testを、クラス Bのメタロ-β-ラクタマーゼの検出法としてSMA法（特開２０００−２２４９９８号公報）を開発し、広く普及されるに至っている。
β-ラクタマーゼには、その構造上の特徴からクラス A、 B、 C、 Dの４つのグループがある。本発明者らは、これまでに臨床上大きな問題となっているクラス A の基質拡張型β-ラクタマーゼ(ESBL)の検出法としてTwin testを、クラス Bのメタロ-β-ラクタマーゼの検出法としてSMA法（特開２０００−２２４９９８号公報）を開発し、広く普及されるに至っている。
クラスC型β-ラクタマーゼは、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、エンテロバクター属（Enterobacter spp.）、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、大腸菌（Escherichia coli）など院内感染の原因菌となることの多い菌種の染色体上にあるものや、未だ報告例は少ないが我が国でも見出されているプラスミド上に存在するものがある。クラスC型β-ラクタマーゼは、ペニシリン系やセファロスポリン系の薬剤に対する耐性を付与するため臨床上問題となっていて、その産生菌の簡易な検出法の開発が待たれる。
クラスC型β-ラクタマーゼの検出法としては、セフォキシチンによるクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌の誘導性をみる方法や、粗酵素液を用いた３次元法などの報告はある。しかし、いずれも、判定法や方法の簡便さや平明さにおいて難があり普及するに至っていない。
そこで本発明の目的は、クラスC型β-ラクタマーゼの簡易な検出法を提供することにある。より具体的には、本発明は、クラスC型β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法であって、病院の検査室においても実施することが可能な程簡便な方法を提供することにある。
さらに本発明は、上記方法を利用して、より簡便にクラスC型β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を実施できるキット及びこのキットを用いたクラスC型β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を提供することにある。
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
［１］
検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、ボロン酸化合物及びβ-ラクタム薬を、距離を置いて点在させ、かつボロン酸化合物とβ-ラクタム薬との間の距離が、培養期間中にボロン酸化合物が拡散する範囲とβ-ラクタム薬が拡散する範囲とが重複するように設定し、上記固体培地を培養し、培養後、上記β-ラクタム薬の周囲に形成される阻止円が、上記ボロン酸化合物側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。
［２］
ボロン酸化合物を含有するディスク及びβ-ラクタム薬を含有するディスクを用いて、ボロン酸化合物及びβ-ラクタム薬をそれぞれ点在させる［１］に記載の方法。
［３］
ボロン酸化合物が３-アミノフェニルボロン酸である［１］または［２］に記載の方法。
［４］
β-ラクタム薬が第３世代セフェム薬である［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］
第３世代セフェム薬がセフタジジムまたはセフォタキシムである［４］に記載の方法。
［６］
ボロン酸化合物を含有するディスク及びβ-ラクタム薬を含有するディスクを、１つずつストリップ状の基体に配置し、かつボロン酸化合物を含有するディスクとβ-ラクタム薬を含有するディスクとの間の距離が、培養期間中に固体培地の表面でボロン酸化合物が拡散する範囲とβ-ラクタム薬が拡散する範囲とが重複するように設定されていることを特徴とするキットであって、
前記キットを検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に置き、培養を行い、培養後、上記β-ラクタム薬を含有するディスクの周囲に形成される阻止円が、上記ボロン酸化合物を含有するディスク側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法に用いるためのクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌判別用キット。
［７］
ボロン酸化合物が３-アミノフェニルボロン酸である［６］に記載のキット。
［８］
β-ラクタム薬が第３世代セフェム薬である［６］〜［７］のいずれか１項に記載のキット。
［９］
第３世代セフェム薬がセフタジジムまたはセフォタキシムである［８］に記載のキット。
［１０］
［６］〜［９］のいずれかに記載のキットを検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に置き、培養を行い、培養後、上記β-ラクタム薬を含有するディスクの周囲に形成される阻止円が、上記ボロン酸化合物を含有するディスク側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。
［１］
検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、ボロン酸化合物及びβ-ラクタム薬を、距離を置いて点在させ、かつボロン酸化合物とβ-ラクタム薬との間の距離が、培養期間中にボロン酸化合物が拡散する範囲とβ-ラクタム薬が拡散する範囲とが重複するように設定し、上記固体培地を培養し、培養後、上記β-ラクタム薬の周囲に形成される阻止円が、上記ボロン酸化合物側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。
［２］
ボロン酸化合物を含有するディスク及びβ-ラクタム薬を含有するディスクを用いて、ボロン酸化合物及びβ-ラクタム薬をそれぞれ点在させる［１］に記載の方法。
［３］
ボロン酸化合物が３-アミノフェニルボロン酸である［１］または［２］に記載の方法。
［４］
β-ラクタム薬が第３世代セフェム薬である［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］
第３世代セフェム薬がセフタジジムまたはセフォタキシムである［４］に記載の方法。
［６］
ボロン酸化合物を含有するディスク及びβ-ラクタム薬を含有するディスクを、１つずつストリップ状の基体に配置し、かつボロン酸化合物を含有するディスクとβ-ラクタム薬を含有するディスクとの間の距離が、培養期間中に固体培地の表面でボロン酸化合物が拡散する範囲とβ-ラクタム薬が拡散する範囲とが重複するように設定されていることを特徴とするキットであって、
前記キットを検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に置き、培養を行い、培養後、上記β-ラクタム薬を含有するディスクの周囲に形成される阻止円が、上記ボロン酸化合物を含有するディスク側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法に用いるためのクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌判別用キット。
［７］
ボロン酸化合物が３-アミノフェニルボロン酸である［６］に記載のキット。
［８］
β-ラクタム薬が第３世代セフェム薬である［６］〜［７］のいずれか１項に記載のキット。
［９］
第３世代セフェム薬がセフタジジムまたはセフォタキシムである［８］に記載のキット。
［１０］
［６］〜［９］のいずれかに記載のキットを検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に置き、培養を行い、培養後、上記β-ラクタム薬を含有するディスクの周囲に形成される阻止円が、上記ボロン酸化合物を含有するディスク側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。
本発明によれば、クラスC型β−ラクタマーゼ産生菌を、病院の検査室においても実施することが可能な程簡便な方法で判別することができる。
さらに本発明によれば、より簡便にクラスC型β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を実施できるキット及びこのキットを用いたクラスC型β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を提供することがある。
さらに本発明によれば、より簡便にクラスC型β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を実施できるキット及びこのキットを用いたクラスC型β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を提供することがある。
後述するが、ボロン酸化合物やモノバクタム誘導体Syn2190などは、クラスC型β-ラクタマーゼを阻害する物質として報告されている。しかし、これらの阻害剤を用いてクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌を判別する方法は、知られていない。
［本発明の方法の第１の態様］
本発明の方法の第１の態様は、検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬を、距離を置いて点在させ、上記固体培地を培養し、培養後、上記β−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円が、上記クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法である。
本発明の方法の第１の態様は、検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬を、距離を置いて点在させ、上記固体培地を培養し、培養後、上記β−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円が、上記クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法である。
本発明に用いられる固体培地は、通常の薬剤感受性試験等に汎用されている固体培地でよい。固体培地は、例えば、炭素源、窒素源等の栄養分を含む寒天培地であることができる。そのような固体培地としては、例えばミュラーヒントン寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社）等を挙げることができる。
上記固体培地の表面に検出対象である菌を塗布する。固体培地表面への菌の塗布方法や条件等は、薬剤感受性試験等で採用されているものをそのまま使用できる。例えば、日本化学療法学会標準法またはＮＣＣＬＳ（National Committee for Clinical Laboratory Standards）で定められたディスク拡散法で指定されている方法を用い、ミュラーヒントン寒天培地に菌を塗布することができる。
次いで、検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬を、距離を置いて点在させる。各薬剤の点在には、具体的には、β−ラクタム薬を含有するディスクとクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスクを用いることが適当である。β−ラクタム薬を含有するディスクは、市販品があり、これを用いることができる。また、β−ラクタム薬は、治療薬として市販されているものから適宜選択することが出来、例えば、第３世代セフェム薬、セファマイシン薬等であることができる。また、第３世代セフェム薬、セファマイシン薬としては、例えば、セフタジジム、ラタモキセフ、セフメノキシム、セフォタキシム等を挙げることができる。但し、これらの薬剤に限定される意図ではない。尚、ディスクとして市販品がない場合でも、適当な寸法及び形状の濾紙にβ−ラクタム薬を、必要により、溶媒を用いて含浸させることで作成することができる。
クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスクは、適当な寸法及び形状の濾紙にクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含浸させることで作成することができる。クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤は、クラスC型β-ラクタマーゼに対して阻害効果を有する薬剤から適宜選択することができる。クラスC型β-ラクタマーゼに対して阻害効果を有する薬剤としては、例えば、ボロン酸化合物、ホウ酸、モノバクタム誘導体、フェニルアセチルグリシル異項環誘導体等を挙げることができる。
さらに、ボロン酸化合物としては、例えば、３-アミノフェニルボロン酸、３-ニトロフェニルボロン酸、２-チオフェンボロン酸、ベンゾ[b]チオフェン-２-ボロン酸等を挙げることができる。
さらに、ボロン酸化合物としては、例えば、３-アミノフェニルボロン酸、３-ニトロフェニルボロン酸、２-チオフェンボロン酸、ベンゾ[b]チオフェン-２-ボロン酸等を挙げることができる。
β−ラクタム薬及びクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤の点在量は、各薬剤の固体培地表面での拡散性や培養時間(拡散時間)、さらにはクラスC型β-ラクタマーゼに対する阻害効果の強度等を考慮して適宜決定できる。例えば、β−ラクタム薬の場合、セフタジジムでは点在量を30μgとすることが適当であり、またクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤の場合、３-アミノフェニルボロン酸では、300〜500μgの範囲とすることが適当である。
但し、これらはあくまでも目安であり、検査対象とする菌の種類に応じて、β−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円の形状や大きさ等を考慮して適宜変化させることができる。
但し、これらはあくまでも目安であり、検査対象とする菌の種類に応じて、β−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円の形状や大きさ等を考慮して適宜変化させることができる。
クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤とβ−ラクタム薬との間の距離は、両者の相互作用を利用してクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌を検出するという観点から、培養期間中にクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤が拡散する範囲とβ−ラクタム薬が拡散する範囲とが重複するように設定することが適当である。
β−ラクタム薬及びクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤の拡散範囲は、各薬剤の種類と点在量、及び培養条件(主に時間)により変化するので、両者が拡散する範囲が重複するようにクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤とβ−ラクタム薬との距離は、ディスクの中心間距離にして、例えば、1〜2cm程度であることが適当である。
クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬を表面に置いた固体培地は、培養される。培養条件は、例えば、35〜37℃、１２〜３６時間の範囲とすることができる。但し、培養条件、特に時間は、上記薬剤の拡散範囲との兼ね合いを考慮して適宜決定する。
上記培養により、固体培地表面に置かれたβ−ラクタム薬及びクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤は、固体培地表面及び内部を拡散する。対象とする菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌である場合、この菌は、クラスC型β-ラクタマーゼを産生することによりβ−ラクタム薬に対する感受性が低下する。従って、固体培地表面にβ−ラクタム薬だけを置いたのでは、阻止円は観察されないか、観察されても、ディスクに近接した小さな阻止円が形成されるだけである。
ところが、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤をβラクタム薬にある程度の距離で配置すると、β−ラクタム薬とクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤との拡散範囲が重複する位置にあるβ−ラクタム薬の周囲には、対象とする菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌であっても阻止帯が観察される。
これは、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤により、クラスC型β-ラクタマーゼの活性が阻害され、その結果、β−ラクタム薬が菌の生育を妨げることができるようになったためである。ここで観察される阻止帯の形状は、β−ラクタム薬の拡散範囲とクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤の拡散範囲との重複の程度により変化するが、一般的には、歪んだ形になる。即ち、β−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円は、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤側に拡張する。この形状が変化した阻止円は、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤の拡散範囲と重複しない位置にあるβ−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円とは、大きさの違いから明確に区別できる。
これは、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤により、クラスC型β-ラクタマーゼの活性が阻害され、その結果、β−ラクタム薬が菌の生育を妨げることができるようになったためである。ここで観察される阻止帯の形状は、β−ラクタム薬の拡散範囲とクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤の拡散範囲との重複の程度により変化するが、一般的には、歪んだ形になる。即ち、β−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円は、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤側に拡張する。この形状が変化した阻止円は、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤の拡散範囲と重複しない位置にあるβ−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円とは、大きさの違いから明確に区別できる。
一方、検査対象がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌でない場合には、2つの場合がある。β−ラクタム薬が菌の生育を妨げ、大きめの阻止円を形成する感受性菌である場合とクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌ではないが、β−ラクタム薬によっては菌の生育が妨げられず阻止円が形成されない場合(例えば、クラスAまたはBβ−ラクタマーゼ産生菌等の菌の場合)である。前者は、クラスC型β-ラクタマーゼ産生菌でないので、β−ラクタム薬のみの薬剤感受性試験で判別できる。即ち、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を併用しない場合でもβ−ラクタム薬の周囲にゆがみのない大きな阻止円が形成され、判別できる。後者は、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を併用せずにβ−ラクタム薬のみを使用した薬剤感受性試験ではクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌であるのか否かは判別できない。それに対して本発明の方法では、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を近接して配置した場合でも、βラクタム薬の周囲には阻止円が形成されないか、あるいは形成されたとしてもクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤により変形、ゆがみを形成しない。従って、本発明の方法では、クラスC型β-ラクタマーゼとクラスAまたはBβ−ラクタマーゼ産生菌とを判別することが可能である。
［本発明の方法の第２の態様］
本発明の方法の第２の態様は、検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬の混合物、並びにβ−ラクタム薬を、距離を置いて点在させ、上記固体培地を培養し、培養後、上記混合物の周囲に形成される阻止円と、上記β−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円の違いにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法である。
本発明の方法の第２の態様は、検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬の混合物、並びにβ−ラクタム薬を、距離を置いて点在させ、上記固体培地を培養し、培養後、上記混合物の周囲に形成される阻止円と、上記β−ラクタム薬の周囲に形成される阻止円の違いにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法である。
本発明の第２の態様で用いる固体培地、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬は、本発明の方法の第１の態様で用いるものと同様である。また、固体培地の培養条件も、本発明の方法の第１の態様で用いるものと同様である。
本発明の方法の第２の態様では、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬の混合物、並びにβ−ラクタム薬をそれぞれ点在させる際、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤とβ−ラクタム薬を含有するディスク及びβ−ラクタム薬を含有するディスクを用いることが好ましい。β−ラクタム薬を含有するディスクは、本発明の方法の第１の態様で用いるものと同様である。クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬を含有するディスクは、例えば、β−ラクタム薬を含有するディスクに、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤をさらに含浸させることで作成することができる。
本発明の方法の第２の態様では、本発明の方法の第１の態様と異なり、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬の混合物とβ−ラクタム薬との間の距離は、培養期間中に前記混合物中のクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤が拡散する範囲とβ−ラクタム薬（混合物ではない）が拡散する範囲とが重複するように設定する必要はない。むしろ、各点在点（好ましくは各ディスク）からの薬剤の拡散する範囲は重複しない様に設定する。例えば、ディスクの中心距離にして３ｃｍ以上離して点在させる。
β−ラクタム薬だけの場合、クラスC型β-ラクタマーゼ産生菌が産生するクラスC型β-ラクタマーゼの作用により、菌の生育はほとんど、または全く妨げられない。従って、阻止円は観察されないか、または観察されても小さい。
それに対して、β−ラクタム薬とクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤との混合物の場合では、対象とする菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌であっても大きな阻止円が観察される。これは、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤により、クラスC型β-ラクタマーゼの活性が阻害され、その結果、β−ラクタム薬が菌の生育を妨げることができるようになったためである。従って、β−ラクタム薬のみの周囲に形成される阻止円（形成されない場合もあるが）とは大きさの違いから明確に区別できる。すなわち、阻止円径５ｍｍ以上の拡大が認められれば、クラスC型β-ラクタマーゼ産生菌と判定できる。
一方、検査対象がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌でない場合には、2つの場合がある。β−ラクタム薬が菌の生育を妨げ、大きめの阻止円を形成する感受性菌である場合とクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌ではないが、β−ラクタム薬によっては菌の生育が妨げられず阻止円が形成されない場合(例えば、クラスAまたはBβ−ラクタマーゼ産生菌等の菌の場合)である。前者は、クラスC型β-ラクタマーゼ産生菌でないので、β−ラクタム薬のみの薬剤感受性試験で判別できる。即ち、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含む、含まないにかかわらず２つのディスクの周囲に同程度の大きな阻止円が形成され、判別できる。後者は、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を併用せずにβ−ラクタム薬のみを使用した薬剤感受性試験ではクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌であるのか否かは判別できない。それに対して本発明の方法では、クラスC型β−ラクマターゼ阻害剤を含む場合も含まない場合も阻止円は形成されないか、形成されても小さく、両者の阻止円の大きさはほとんど変化しない。従って、本発明の方法では、クラスC型β-ラクタマーゼとクラスAまたはBβ−ラクタマーゼ産生菌とを判別することが可能である。
[本発明のキット]
本発明のクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌判別用キットは、
(1)クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク及びβ−ラクタム薬を含有するディスクを、１つずつストリップ状の基体に配置したことを特徴とするものと、(2)クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬を含有するディスク及びβ−ラクタム薬を含有するディスクを、１つずつストリップ状の基体に配置したことを特徴とするものとが有る。
(1)のクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌判別用キットは、上記本発明の方法の第1の態様に用いられ、(2)のクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌判別用キットは、上記本発明の方法の第2の態様に用いられる。
本発明のクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌判別用キットは、
(1)クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含有するディスク及びβ−ラクタム薬を含有するディスクを、１つずつストリップ状の基体に配置したことを特徴とするものと、(2)クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬を含有するディスク及びβ−ラクタム薬を含有するディスクを、１つずつストリップ状の基体に配置したことを特徴とするものとが有る。
(1)のクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌判別用キットは、上記本発明の方法の第1の態様に用いられ、(2)のクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌判別用キットは、上記本発明の方法の第2の態様に用いられる。
本発明のキットに使用するβ−ラクタム薬を含有するディスクは上記本発明の方法で説明したものと同様のディスクを使用できる。また、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含有させるためのディスクは、濾紙等のクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含有させることができるものであれば良い。また、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤及びβ−ラクタム薬を含有するディスクは、β−ラクタム薬を含有するディスクにクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含浸させたものであることができる。これらのディスクをストリップ状の基体に一列に配置する。
ストリップ状の基体の形状や寸法には特に制限はない。このキットを使用する固体培地の大きさ等を考慮して適宜決定できる。尚、ストリップ状の基体は、阻止円の判読を容易にするため、透明性の高い素材で形成することもできる。各ディスクの間隔やβ−ラクタム薬のディスク中の含有量等は、上記本発明の方法において説明したと同様の点を考慮して適宜決定できる。
上記本発明のキットを用いるクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌の判別方法は、上記のキットを検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に置き、培養を行い、培養後、2つのディスクの周囲に形成される阻止円の違いにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する。この方法は、上記キットを用いること以外は、上記本発明の方法をそのまま用いることができる。
[本発明の方法の第３の態様]
本発明の方法の第３の態様は、微量液体希釈法に基づく方法である。この方法では、まず、β−ラクタム薬を段階的に希釈して含有し、かつ等濃度のクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含有する複数の液体培地を用意する。
液体培地としては、例えば、ミューラー・ヒントン液体培地（Ditco社）等を用いることができる。
β−ラクタム薬及びクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤は、本発明の方法の第１の態様で説明したものと同様である。
液体培地中でのβ−ラクタム薬の段階的な希釈の程度は、例えば、0.5〜256μg/mlの範囲とすることができる。
また、各液体培地中のクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤の濃度は等しくし、例えば、３-アミノフェニルボロン酸であれば、例えば、200μg/mlとすることができる。
本発明の方法の第３の態様は、微量液体希釈法に基づく方法である。この方法では、まず、β−ラクタム薬を段階的に希釈して含有し、かつ等濃度のクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤を含有する複数の液体培地を用意する。
液体培地としては、例えば、ミューラー・ヒントン液体培地（Ditco社）等を用いることができる。
β−ラクタム薬及びクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤は、本発明の方法の第１の態様で説明したものと同様である。
液体培地中でのβ−ラクタム薬の段階的な希釈の程度は、例えば、0.5〜256μg/mlの範囲とすることができる。
また、各液体培地中のクラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤の濃度は等しくし、例えば、３-アミノフェニルボロン酸であれば、例えば、200μg/mlとすることができる。
このように準備された各液体培地に、検出対象である菌を接種し、培養を行う。培養条件は、固体培地を用いる場合と同様にすることができる。
培養後、ＭＩＣの低下から、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別することができく。具体的には、ＭＩＣの低下が８倍以上である場合、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌であると判定することができる。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１(本発明の方法の第１の態様)
被検菌をNCCLSの推奨するディスク拡散法に基づく方法でミューラー・ヒントン寒天培地に接種した。被検菌としては以下の表1に示すものを用いた。
実施例１(本発明の方法の第１の態様)
被検菌をNCCLSの推奨するディスク拡散法に基づく方法でミューラー・ヒントン寒天培地に接種した。被検菌としては以下の表1に示すものを用いた。
その上にAPBを300μgしみ込ませたディスク(栄研化学製、直径6mm)を置き、その左右にセフタジジム（CAZ）とセフォタキシム（CTX）のKBディスク
(直径6mm)を中心距離にして約18mm離して配置した。図1及び2に写ったシャーレの上段の3つのディスクが左から、CAZ 、APB、CTXのディスクである。
発育阻止帯の状況及び形状を下記表2に記載する。
(直径6mm)を中心距離にして約18mm離して配置した。図1及び2に写ったシャーレの上段の3つのディスクが左から、CAZ 、APB、CTXのディスクである。
発育阻止帯の状況及び形状を下記表2に記載する。
クラスC型β-ラクタマーゼ産生菌では、図1及び2に示すように、一晩培養後CAZまたはCTXの周囲の発育阻止帯がAPBのディスクに引っ張られるようにゆがんで観察された。即ち、β−ラクタム薬(CAZまたはCTX)の周囲に形成される阻止円が、クラスC型β-ラクタマーゼ阻害剤(APB)側に拡張しており、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌であることが判定できる。それに対して、クラスC以外のクラス Aやクラス Bβ-ラクタマーゼ産生菌では発育阻止円のゆがみは認められなかった。
実施例２(本発明の方法の第２の態様)
被検菌を上記実施例1と同様にミューラー・ヒントン寒天培地に接種し、CAZのKBディスク(直径6mm)を中心距離にして3cm以上離して配置した。一方のCAZディスクにAPBを300μgしみ込ませ、一晩培養後２つのCAZディスクの周囲の発育阻止円の径を測定した。図1及び2に写ったシャーレの下段の2つのディスクが左から、CAZ 、CAZ+APBのディスクである。結果を下記表3にコメントともに示す。
被検菌を上記実施例1と同様にミューラー・ヒントン寒天培地に接種し、CAZのKBディスク(直径6mm)を中心距離にして3cm以上離して配置した。一方のCAZディスクにAPBを300μgしみ込ませ、一晩培養後２つのCAZディスクの周囲の発育阻止円の径を測定した。図1及び2に写ったシャーレの下段の2つのディスクが左から、CAZ 、CAZ+APBのディスクである。結果を下記表3にコメントともに示す。
クラスC型β-ラクタマーゼ産生菌では、図1及び2に示すように、5mm以上の径の拡大(APBを含まないディスクに対して)が見られ、クラスC型β-ラクタマーゼ産生菌と判定できる。それに対して、クラスC以外のクラス Aやクラス Bβ-ラクタマーゼ産生菌では発育阻止円の拡大は認められなかった。
実施例３（本発明の方法の第３の態様）
CAZを段階希釈したミューラー・ヒントン液体培地と、CAZの段階希釈に200μgの APBを加えたミューラー・ヒントン液体培地を作製し、被検菌をNCCLSの推奨する微量液体希釈法に基づいた方法で接種した。一晩培養後MICを測定した。結果を以下の表4に示す。
CAZを段階希釈したミューラー・ヒントン液体培地と、CAZの段階希釈に200μgの APBを加えたミューラー・ヒントン液体培地を作製し、被検菌をNCCLSの推奨する微量液体希釈法に基づいた方法で接種した。一晩培養後MICを測定した。結果を以下の表4に示す。
APB：３-アミノフェニルボロン酸
CAは4μg/ml、SMAは500μg/nl、APBは200μg/ml、の濃度で使用した。
CAZのみのMICに比べて、CAZ+APBのMICが8倍以上低下した場合、クラスC型β-ラクタマーゼ産生菌と判定した。実施例1及び2でクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌と判定された菌は、いずれも8倍以上のMICの低下が認められた。それに対して、クラスC以外のクラス Aやクラス Bβ-ラクタマーゼ産生菌ではMICの低下は認められなかった。
尚、ＣＡＺ＋ＣＡ及びＣＡＺ＋ＳＭＡの場合、前者はクラスＡ型βーラクタマーゼ産生菌においてのみＣＡＺの場合に比べて8倍以上のＭＩＣの低下がみられ、後者の場合はクラスＢ型βーラクタマーゼ産生菌においてのみＣＡＺの場合に比べて8倍以上のＭＩＣの低下を認める。
尚、ＣＡＺ＋ＣＡ及びＣＡＺ＋ＳＭＡの場合、前者はクラスＡ型βーラクタマーゼ産生菌においてのみＣＡＺの場合に比べて8倍以上のＭＩＣの低下がみられ、後者の場合はクラスＢ型βーラクタマーゼ産生菌においてのみＣＡＺの場合に比べて8倍以上のＭＩＣの低下を認める。
本発明は、病院の検査室においても実施することが可能な程簡便なクラスC型β-ラクタマーゼの簡易な検出法を提供することができる。
Claims (10)
- 検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に、ボロン酸化合物及びβ-ラクタム薬を、距離を置いて点在させ、かつボロン酸化合物とβ-ラクタム薬との間の距離が、培養期間中にボロン酸化合物が拡散する範囲とβ-ラクタム薬が拡散する範囲とが重複するように設定し、上記固体培地を培養し、培養後、上記β-ラクタム薬の周囲に形成される阻止円が、上記ボロン酸化合物側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。
- ボロン酸化合物を含有するディスク及びβ-ラクタム薬を含有するディスクを用いて、ボロン酸化合物及びβ-ラクタム薬をそれぞれ点在させる請求項１に記載の方法。
- ボロン酸化合物が３-アミノフェニルボロン酸である請求項１または２に記載の方法。
- β-ラクタム薬が第３世代セフェム薬である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 第３世代セフェム薬がセフタジジムまたはセフォタキシムである請求項４に記載の方法。
- ボロン酸化合物を含有するディスク及びβ-ラクタム薬を含有するディスクを、１つずつストリップ状の基体に配置し、かつボロン酸化合物を含有するディスクとβ-ラクタム薬を含有するディスクとの間の距離が、培養期間中に固体培地の表面でボロン酸化合物が拡散する範囲とβ-ラクタム薬が拡散する範囲とが重複するように設定されていることを特徴とするキットであって、
前記キットを検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に置き、培養を行い、培養後、上記β-ラクタム薬を含有するディスクの周囲に形成される阻止円が、上記ボロン酸化合物を含有するディスク側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法に用いるためのクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌判別用キット。 - ボロン酸化合物が３-アミノフェニルボロン酸である請求項６に記載のキット。
- β-ラクタム薬が第３世代セフェム薬である請求項６〜７のいずれか１項に記載のキット。
- 第３世代セフェム薬がセフタジジムまたはセフォタキシムである請求項８に記載のキット。
- 請求項６〜９のいずれかに記載のキットを検出対象である菌が塗布された固体培地の表面に置き、培養を行い、培養後、上記β-ラクタム薬を含有するディスクの周囲に形成される阻止円が、上記ボロン酸化合物を含有するディスク側に拡張したか否かにより、検出対象である菌がクラスC型β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法。
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