JP4622836B2 - Analysis equipment - Google Patents
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Description
本発明は、高速かつ高精度に血糖値と糖化ヘモグロビン量を測定する分析装置に関し、健康管理、臨床診断等に資するものである。 The present invention relates to an analyzer for measuring a blood glucose level and a glycated hemoglobin amount at high speed and with high accuracy, and contributes to health management, clinical diagnosis, and the like.
糖尿病の診断ならびに治療を目的とした診断項目として血糖値と糖化ヘモグロビン比率が広く用いられている。糖尿病の発症により、血糖値が上昇する。ただし血糖値は食事等の摂取により上昇し、変動の激しい測定項目である。したがって空腹時血糖値は糖尿病の一次スクリーニング、日常の治療成果の確認には適しているが、血糖値のみで糖尿病の正確な病態を把握することは困難である。そのため数多くの診断指標が提案されている。中でもヘモグロビンの糖化率は有力な指標である。糖化ヘモグロビンとはヘモグロビンに糖が非酵素的に結合した糖化タンパク質の一種である。糖化ヘモグロビンの中でも特に、ＨｂＡ１ｃと呼ばれる画分はヘモグロビンＡのβ鎖Ｎ末端のバリン残基にグルコースがシッフ塩基を形成してアルジミン（不安定型）となり、さらにアマドリ転位を受けてケトアミン化合物を生成したものである。なおアルジミン構造をとるものを不安定糖化ヘモグロビン、ケトアミン構造をとる場合を安定糖化ヘモグロビンと呼ぶ。なお、アマドリ転位後の前記β鎖のＮ末端はフルクトシルバリン残基となる。 As diagnostic items for the purpose of diagnosis and treatment of diabetes, blood glucose level and glycated hemoglobin ratio are widely used. Due to the onset of diabetes, blood sugar levels rise. However, blood sugar level is a measurement item that rises due to ingestion of meals, etc., and fluctuates greatly. Therefore, fasting blood glucose level is suitable for primary screening of diabetes and confirmation of daily treatment results, but it is difficult to grasp the exact pathology of diabetes only by blood glucose level. Therefore, many diagnostic indicators have been proposed. Among them, the glycation rate of hemoglobin is a powerful index. Glycated hemoglobin is a kind of glycated protein in which sugar is non-enzymatically bound to hemoglobin. Among the glycated hemoglobins, in particular, a fraction called HbA1c formed a Schiff base at the valine residue at the N-terminus of hemoglobin A to form an aldimine (unstable form), and further undergoes Amadori rearrangement to produce a ketoamine compound. Is. Those having an aldimine structure are called unstable glycated hemoglobin, and those having a ketoamine structure are called stable glycated hemoglobin. The N-terminal of the β chain after Amadori rearrangement is a fructosyl valine residue.
この反応過程に酵素の関与はなく、血漿中のグルコース濃度に応じてその量が増加し、いわゆる血漿中の血糖値が平均的に長期間高い値を示すとＨｂＡ１ｃは高値となる。安定型糖化ヘモグロビンはその赤血球の寿命が尽きるまで消滅しない。一般にヘモグロビン分子の生体内での寿命は２ヶ月程度とされており、その結果、ＨｂＡ１ｃの値は過去１〜２ヶ月間の平均血糖値を反映するとされている。そのためＨｂＡ１ｃは長期間の血糖値の平均値の指標として用いられる。ＨｂＡ１ｃは長期間の平均値であるため、糖尿病の確定診断、治療のための判断材料として用いるのに適しているとされている。 Enzyme is not involved in this reaction process, and its amount increases according to the glucose concentration in the plasma. When the blood glucose level in the plasma shows a high value on average for a long period of time, HbA1c becomes high. Stable glycated hemoglobin does not disappear until the life of the red blood cells is exhausted. In general, the lifetime of hemoglobin molecules in vivo is about 2 months, and as a result, the value of HbA1c is considered to reflect the average blood glucose level over the past 1 to 2 months. Therefore, HbA1c is used as an index of the average value of blood glucose level over a long period. Since HbA1c is an average value over a long period of time, it is said that HbA1c is suitable for use as a decision material for definite diagnosis and treatment of diabetes.
そのため、すでに糖化ヘモグロビンについて多種多様の測定方法が提案されている。その代表的なものとして、高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）、免疫法、酵素法が挙げられる。 Therefore, various measurement methods have already been proposed for glycated hemoglobin. Typical examples include high performance liquid chromatography (HPLC), immunization, and enzymatic methods.
ＨＰＬＣ法は、現在最も多用される方法である。分離カラムによりヘモグロビンを分画し、ＨｂＡ１ｃに相当する保持容量に溶出したピークと、全ピーク面積の比率からＨｂＡ１ｃの存在比率を算出する。いわば相対面積法をとるため、注入容量の精度をある程度無視できるなどの利点がある。しかし装置が大型かつ複雑であり、メンテナンス負荷が大きい等の問題がある。また、不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃが区別できないため、あらかじめ不安定型ＨｂＡ１ｃを除去後に分離分析を行わなければならないという欠点を有する（特許文献１）。同時に先天的なヘモグロビンの変異がある場合は、分離パターンが変化して異常値を示す場合がある。また他の生体成分が偶然ＨｂＡ１ｃのピークと重複することによる誤差を含む可能性がある。 The HPLC method is the most frequently used method at present. The hemoglobin is fractionated by a separation column, and the abundance ratio of HbA1c is calculated from the ratio of the peak eluted in the retention volume corresponding to HbA1c and the total peak area. In other words, since the relative area method is used, there is an advantage that the accuracy of the injection capacity can be ignored to some extent. However, there are problems such as a large and complicated apparatus and a heavy maintenance load. Moreover, since unstable type HbA1c and stable type HbA1c cannot be distinguished, it has the fault that a separation analysis must be performed after removing unstable type HbA1c beforehand (patent document 1). At the same time, when there is a congenital hemoglobin mutation, the separation pattern may change and show an abnormal value. In addition, there is a possibility that other biological components may include an error due to an overlap with the peak of HbA1c.
免疫法はＨｂＡ１ｃのβ鎖のＮ末端付近の構造に対応した抗体を利用することにより、より高精度な分析を、より簡単な機構で達成できる可能性を有する。しかし一般的な免疫分析のように血清を対象とするのではなく、全血を溶血させた検体を対象とするため、非特異反応や、反応を検知するために用いる比色計を汚染し、必ずしも満足できる精度が得られないことが指摘されている。 The immunization method has a possibility that more accurate analysis can be achieved with a simpler mechanism by using an antibody corresponding to the structure near the N-terminus of the β chain of HbA1c. However, it is not intended for serum as in general immunoassay, but is intended for specimens in which whole blood has been hemolyzed, so it contaminates colorimetry used to detect non-specific reactions and reactions, It has been pointed out that satisfactory accuracy cannot always be obtained.
一方で酵素法は、糖化タンパク質から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを何らかの手法で切り出した後、生じた糖化アミノ酸量または糖化ペプチド量をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等の酵素を用いて検出するものである。酵素の選択性を利用することにより、より高精度の分析を実施できる可能性があり、種々の検討がなされている。 On the other hand, in the enzymatic method, after glycated amino acid or glycated peptide is cut out from glycated protein by some technique, the amount of glycated amino acid or glycated peptide produced is detected using an enzyme such as fructosyl amino acid oxidase. By utilizing the selectivity of the enzyme, there is a possibility that more accurate analysis can be performed, and various studies have been made.
糖化アミノ酸を酵素により測定する方法は特許文献２に、また糖化ペプチドを酵素により測定する方法は特許文献３に記載されている。さらに糖化タンパク質から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す方法として、タンパク質分解酵素を利用する方法があり、糖化タンパク質に作用しうるタンパク質分解酵素の検討もされている（特許文献４、５、６、７）。
A method for measuring a glycated amino acid with an enzyme is described in
さらに、糖尿病の臨床診断に使用される指標値であるＨｂＡ１ｃは糖化ヘモグロビンとヘモグロビンとの比率で表されるため、試料中の糖化ヘモグロビン量を測定するとともにヘモグロビンを定量する必要がある。公知の方法でヘモグロビンを定量し、酵素法で測定した糖化ヘモグロビンとの比率を算出した例がある（特許文献８）。 Furthermore, since HbA1c, which is an index value used for clinical diagnosis of diabetes, is represented by a ratio between glycated hemoglobin and hemoglobin, it is necessary to measure the amount of glycated hemoglobin in the sample and quantify hemoglobin. There is an example in which hemoglobin is quantified by a known method and the ratio to glycated hemoglobin measured by an enzymatic method is calculated (Patent Document 8).
このように糖化ヘモグロビンの測定に際して主にＨＰＬＣ法、免疫法、酵素法の３つが提案されているが、いずれも糖化ヘモグロビン比率のみを測定するものであった。臨床診断の立場からは血糖値と糖化ヘモグロビン比率が、実質的に同時に求められることが望ましい。 As described above, three main methods, HPLC method, immunization method, and enzyme method, have been proposed for measuring glycated hemoglobin, and all of them measure only the glycated hemoglobin ratio. From the standpoint of clinical diagnosis, it is desirable that the blood glucose level and the glycated hemoglobin ratio are determined substantially simultaneously.
従来この２つの指標値を同時に算出する場合、まず適当な血糖計で血糖値を測定した後、血液試料をＨｂＡ１ｃ分析装置に搬送して別途ＨｂＡ１ｃ分析装置でＨｂＡ１ｃを測定するものであった。このような構成の元では、２種類の専用分析装置が必要であり、各装置に試料の注入機構や送液機構が存在するため、広い設置スペースを必要とする上、各分析装置で使用する溶液組成が全く異なるため、それぞれに応じた溶離液や緩衝液が必要であった。また、正確には２つの指標値を同時に算出しているとは言えない。 Conventionally, when calculating these two index values at the same time, the blood glucose level is first measured with an appropriate blood glucose meter, and then the blood sample is transported to the HbA1c analyzer and HbA1c is separately measured with the HbA1c analyzer. Under such a configuration, two types of dedicated analyzers are required, and each device has a sample injection mechanism and a liquid feed mechanism, which requires a large installation space and is used in each analyzer. Since the solution compositions are completely different, an eluent and a buffer solution corresponding to each were required. In addition, it cannot be said that two index values are calculated simultaneously.
このように従来２つの指標値を同時に正確に算出する有効な方法は提案されていない。 Thus, an effective method for accurately calculating two index values simultaneously has not been proposed.
また、糖化ヘモグロビンを酵素法で定量する際、血中成分またはタンパク質分解酵素処理後の生成物に由来する糖化アミノ酸オキシダーゼ等の酵素への妨害を除く有効な方法は提案されていない。
本発明は、検体中に含まれる血糖値と糖化ヘモグロビン比率を簡便かつ高精度で算出する装置を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the apparatus which calculates the blood glucose level and glycated hemoglobin ratio contained in a sample simply and with high precision.
本発明は、グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、フルクトシルＬ−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体とフルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、全ヘモグロビンを検知する機構を備え、フルクトシルＬ−バリンとヘモグロビンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの前記測定値とヘモグロビンの検知結果に基づきＨｂＡ１ｃを得るための第一演算機構と、全血／血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血／血球グルコースを血漿グルコースに補正する第二演算機構を備えたことを特徴とするグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置を開示する。 The present invention immobilizes an immobilized body in which an enzyme that catalyzes the oxidation reaction of glucose is immobilized, an electrochemically active substance that increases or decreases by the glucose oxidation reaction, and a fructosyl amino acid oxidase that acts on fructosyl L-valine. A mechanism for detecting an electrochemically active substance that is increased or decreased by an oxidation reaction of a fructosyl amino acid or fructosyl peptide, and an immobilized form in which fructosyl peptide oxidase acting on fructosylvalylhistidine is immobilized; A first operation mechanism for obtaining HbA1c based on the measurement value of fructosyl L-valine and hemoglobin or fructosylvalylhistidine and the detection result of hemoglobin, and a whole blood / blood cell glucose and hemoglobin Whole blood based on detection results Discloses an analyzer of glucose and glycosylated hemoglobin, characterized in that it comprises a second operation mechanism for correcting a blood glucose plasma glucose.
さらに好適な構成として、前記の機構を備えた分析装置に、検体中グルコースとフルクトシルＬ−バリンまたは検体中グルコースとフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果に基づき検体中グルコースの影響を排除したフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定値を得る第三演算機構を備えた糖化ヘモグロビンの分析装置を開示する。 As a more preferable configuration, the fructosyl L- in which the influence of the glucose in the sample is eliminated based on the detection result of the glucose in the sample and fructosyl L-valine or the glucose in the sample and fructosylvalylhistidine is added to the analyzer having the above-described mechanism. Disclosed is an apparatus for analyzing glycated hemoglobin having a third calculation mechanism for obtaining a measurement value of valine or fructosyl valyl histidine.
また本発明では、緩衝液を連続して送液する機構と、その下流の緩衝液に検体を注入する機構（４、５、７）を備え、検体を注入する機構（４、５、７）の下流にグルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構（１７、１８）と、フルクトシルＬ−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体とフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構（１９、２０）を配置するとともに、検体を注入する機構（４、５、７）の上流または下流に全ヘモグロビン濃度を検知する機構（１６）を配置したことを特徴とするグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置を開示する。 In the present invention, a mechanism for continuously feeding a buffer solution and a mechanism (4, 5, 7) for injecting a sample into a buffer solution downstream thereof, and a mechanism for injecting a sample (4, 5, 7). Downstream of the enzyme, an immobilized body in which an enzyme that catalyzes the oxidation reaction of glucose, a mechanism (17, 18) for detecting an electrochemically active substance that increases or decreases by the glucose oxidation reaction, and fructosyl that acts on fructosyl L-valine Electrochemical activity increased or decreased by the oxidation of fructosyl valine or fructosyl valyl histidine and immobilized form immobilized on amino acid oxidase or fructosyl peptide oxidase immobilized on fructosyl valyl histidine A mechanism (19, 20) for detecting a substance is disposed, and all hemogs are located upstream or downstream of the mechanism (4, 5, 7) for injecting the specimen. To the arrangement of the mechanism (16) for detecting a bin concentrations discloses a spectrometer of glucose and glycosylated hemoglobin characterized by.
さらに本発明では、以下の工程を含む、検体中のグルコースと糖化ヘモグロビンの分析方法を開示する:
グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体と、グルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のグルコース濃度を電気化学的に検知する工程；
フルクトシルＬ−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体と、フルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを電気化学的に検知する工程；
全ヘモグロビンを検知する機構を用いて、検体中の全ヘモグロビンを検知する工程；
フルクトシルＬ−バリンとヘモグロビンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果とヘモグロビンの検知結果に基づき第一演算機構によりＨｂＡ１ｃを得る工程；および
全血／血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき第二演算機構により全血／血球グルコースを血漿グルコースに補正する工程。
Furthermore, the present invention discloses a method for analyzing glucose and glycated hemoglobin in a sample, comprising the following steps:
A step of electrochemically detecting a glucose concentration in a specimen using an immobilized body in which an enzyme that catalyzes an oxidation reaction of glucose is immobilized, and a mechanism for detecting an electrochemically active substance that is increased or decreased by the glucose oxidation reaction;
Immobilization of immobilized fructosyl amino acid oxidase acting on fructosyl L-valine or immobilized fructosyl peptide oxidase acting on fructosylvalylhistidine, and oxidation reaction of fructosyl amino acid or fructosyl peptide Electrochemically detecting fructosyl L-valine or fructosylvalylhistidine in a specimen using a mechanism for detecting an electrochemically active substance that increases or decreases by
Detecting all hemoglobin in the sample using a mechanism for detecting all hemoglobin;
Obtaining HbA1c by the first calculation mechanism based on the detection result of fructosyl L-valine and hemoglobin or fructosylvalylhistidine and the detection result of hemoglobin; and by the second calculation mechanism based on the detection result of whole blood / blood glucose and hemoglobin. Correcting whole blood / blood cell glucose to plasma glucose.
さらに好適な構成として、前記の分析方法において、検体中グルコースとフルクトシルＬ−バリンまたは検体中グルコースとフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果に基づき第三演算機構により検体中グルコースの影響を排除したフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定値を得る工程をさらに含み、得られた測定値とヘモグロビンの検知結果に基づき第一演算機構によりＨｂＡ１ｃを得る。 Further preferably, in the above analysis method, fructosyl L in which the influence of glucose in the sample is eliminated by the third calculation mechanism based on the detection results of glucose in the sample and fructosyl L-valine or glucose in the sample and fructosylvalylhistidine. -A step of obtaining a measurement value of valine or fructosyl valyl histidine is further included, and HbA1c is obtained by the first arithmetic mechanism based on the obtained measurement value and the detection result of hemoglobin.
本発明によれば、血液検体中の血漿グルコース濃度と糖化ヘモグロビン比率（すなわちＨｂＡ１ｃ）を簡便且つ高精度で定量することができる。 According to the present invention, the plasma glucose concentration and the glycated hemoglobin ratio (that is, HbA1c) in a blood sample can be quantified simply and with high accuracy.
本発明の装置によれば、第一および第二の演算機構を用いてグルコースとＨｂＡ１ｃ を同時に算出できる。さらに検体中グルコース濃度は、ＨｂＡ１ｃの算出に必須のヘモグロビン濃度に基づき第二演算機構により血漿中グルコース濃度に変換され、検体中フルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの濃度はグルコースの影響を第三演算機構により排除された後、第二演算機構によりＨｂＡ１ｃに変換されるため、全体として血漿中グルコースとＨｂＡ１ｃを効率および精度よく測定することができる。 According to the apparatus of the present invention, glucose and HbA1c can be calculated simultaneously using the first and second calculation mechanisms. Further, the glucose concentration in the sample is converted into the plasma glucose concentration by the second calculation mechanism based on the hemoglobin concentration essential for the calculation of HbA1c. Since it is converted into HbA1c by the second calculation mechanism after being eliminated by the three calculation mechanisms, the plasma glucose and HbA1c can be measured efficiently and accurately as a whole.
以下、本発明の構成及び好ましい形態についてさらに詳しく説明する。 Hereinafter, the configuration and preferred embodiments of the present invention will be described in more detail.
本発明におけるグルコースの測定は、グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化して用いる。該当する酵素としては、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４）、ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１０）、グルコース脱水素酵素（ＥＣ１．１．９９．１０）などがある。中でもグルコースオキシダーゼは耐久性が高く、基質選択性に優れるため望ましい。 In the measurement of glucose in the present invention, an enzyme that catalyzes an oxidation reaction of glucose is immobilized and used. Applicable enzymes include glucose oxidase (EC 1.1.3.4), pyranose oxidase (EC 1.1.3.10), glucose dehydrogenase (EC 1.1.9.10.10) and the like. Among these, glucose oxidase is desirable because of its high durability and excellent substrate selectivity.
また、臨床検査の分野におけるグルコース値は、通常血漿中のグルコースで評価されている。全血中にはヘモグロビン等の溶媒となりえない成分を含んでいるため、全血グルコース濃度値は血漿グルコース濃度値とは異なる。糖化ヘモグロビン比率の測定では、ヘモグロビンを含む検体が対象となり、使用する検体は全血もしくは血球である。全血を対象とし、糖化ヘモグロビン比率とグルコースを同時測定した際に検出されるグルコース値は、全血グルコース値である。 Moreover, the glucose level in the field of clinical examination is usually evaluated by glucose in plasma. Since whole blood contains a component that cannot be a solvent such as hemoglobin, the whole blood glucose concentration value is different from the plasma glucose concentration value. In the measurement of the glycated hemoglobin ratio, a specimen containing hemoglobin is targeted, and the specimen to be used is whole blood or blood cells. The glucose value detected when measuring the glycated hemoglobin ratio and glucose simultaneously for whole blood is the whole blood glucose value.
なお、全血グルコースと血球(赤血球)グルコースは、新鮮血ではほぼ等価であるので、本明細書では、全血グルコースと血球(赤血球)グルコースを「全血グルコース」と表現する場合がある。 Note that since whole blood glucose and blood cell (erythrocyte) glucose are almost equivalent in fresh blood, in this specification, whole blood glucose and blood cell (erythrocyte) glucose may be expressed as “whole blood glucose”.
全血グルコース値から血漿グルコース値を算出する方法としては、ヘマトクリット値を何らかの方法で測定して全血グルコース値を補正する方法（ヘマトクリット補正）があるが、別途ヘマトクリット値を測定する装置が必要であるため、分析装置が大型で複雑になり、望ましくない。本発明においては、糖化ヘモグロビン比率を測定する際に、必ずヘモグロビン濃度を測定するので、ヘモグロビン濃度から血球分の補正係数を算出して全血グルコース値を補正する第二演算機構を備えることで、装置を大型化することなく血漿グルコース値を算出できる。 As a method of calculating the plasma glucose value from the whole blood glucose value, there is a method of correcting the whole blood glucose value by measuring the hematocrit value by any method (hematocrit correction), but a separate device for measuring the hematocrit value is required. This is undesirable because the analyzer is large and complex. In the present invention, when measuring the glycated hemoglobin ratio, the hemoglobin concentration is always measured. Plasma glucose levels can be calculated without upsizing the device.
糖化アミノ酸の測定は、糖化アミノ酸を酸化して過酸化水素を生成するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化して使用する。糖化ヘモグロビンＮ末端の糖化アミノ酸であるフルクトシルバリンの検出の際にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼに要求される特性は、ε-アミノ基が糖化されたフルクトシルリジンには実質的に作用せず、フルクトシルバリンに特異的に作用することが好ましい。これは、血清中に含まれるアルブミンが糖化されたものからε-アミノ基が糖化されたリジンが遊離してくる場合や、ヘモグロビンに含まれるリジン糖化物が測定結果に正の誤差を生じる可能性があるためである。このような特性を有するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが例示できる。 The measurement of glycated amino acid is performed by immobilizing fructosyl amino acid oxidase that oxidizes glycated amino acid to produce hydrogen peroxide. The characteristics required of fructosyl amino acid oxidase when detecting fructosyl valine, a glycated amino acid at the N-terminal of glycated hemoglobin, does not substantially affect fructosyl lysine in which the ε-amino group is glycated. It is preferable to act specifically on kutosylvaline. This is because lysine in which ε-amino group is glycated is released from glycated albumin contained in serum, or lysine glycated product in hemoglobin may cause a positive error in measurement results. Because there is. Examples of the fructosyl amino acid oxidase having such properties include fructosyl amino acid oxidase derived from Corynebacterium.
しかしながら、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、糖化アミノ酸だけでなく、わずかではあるがグルコースにも作用する場合があることを本発明者らは発見した。血中には、糖化ヘモグロビンの約１００倍濃度のグルコースが存在するので、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼがグルコースにも作用する場合、検出されたフルクトシルバリン値は血中のグルコースによる正の誤差を含んでおり、正確なフルクトシルバリン濃度が得られない。従って、検体中のグルコースのフルクトシルバリン検出値への妨害を除くため、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化体とともにグルコースオキシダーゼ固定化体を配置し、グルコースと同時にフルクトシルバリンを測定し、フルクトシルバリン検出値から検体中のグルコースによる妨害を第三演算装置により差演算する。 However, the present inventors have discovered that fructosyl amino acid oxidase may act not only on glycated amino acids but also on glucose to a small extent. Since blood has approximately 100 times the glucose concentration of glycated hemoglobin, when fructosyl amino acid oxidase also acts on glucose, the detected fructosyl valine value includes a positive error due to glucose in the blood. Therefore, an accurate fructosyl valine concentration cannot be obtained. Therefore, in order to eliminate the interference of glucose in the sample with the detected value of fructosyl valine, a glucose oxidase immobilized body is arranged together with the fructosyl amino acid oxidase immobilized body, and fructosyl valine is measured simultaneously with glucose. The third arithmetic unit calculates a difference between the interference detected by the glucose in the specimen from the detected value of the silver valine.
糖化ペプチドの測定は、糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化して使用する。糖化ヘモグロビンＮ末端の糖化ジペプチドであるフルクトシルバリルヒスチジンの検出の際に、フルクトシルペプチドオキシダーゼに要求される特性は、糖化ヘモグロビンα鎖Ｎ末端の糖化ジペプチドであるフルクトシルバリルロイシンやε-アミノ基が糖化されたε−フルクトシルリジンには実質的に作用せず、糖化ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化ジペプチドであるフルクトシルバリルヒスチジンに特異的に作用する酵素が好ましい。 The measurement of the glycated peptide is performed by immobilizing fructosyl peptide oxidase that oxidizes the glycated peptide to generate hydrogen peroxide. When detecting fructosyl valyl histidine, which is a glycated dipeptide at the N-terminal of glycated hemoglobin, the characteristics required for fructosyl peptide oxidase are fructosyl valyl leucine and ε- An enzyme that does not substantially act on ε-fructosyl lysine in which the amino group is glycated and acts specifically on fructosyl valyl histidine, which is a glycated dipeptide at the N-terminal of glycated hemoglobin β chain, is preferred.
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと同様に、フルクトシルペプチドオキシダーゼがグルコースにも作用する場合には、グルコースオキシダーゼ固定化体と同時に使用して糖化ペプチドとグルコースを同時に測定し、糖化ペプチドの検出値から検体中のグルコースによる妨害を第三演算機構により差演算する。 As with fructosyl amino acid oxidase, when fructosyl peptide oxidase also acts on glucose, it is used simultaneously with the glucose oxidase immobilized product to measure glycated peptide and glucose at the same time. Interference by glucose is calculated by a third calculation mechanism.
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼまたはフルクトシルペプチドオキシダーゼを用いた糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出系で、検体中のグルコースが糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出値に妨害を与える場合、これらの妨害を除くための、演算方法について説明する。具体的には、グルコース検出系で糖化アミノ酸または糖化ペプチドが応答し、糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出系でグルコースが応答する場合、まず各検出系でグルコースと糖化アミノ酸または糖化ペプチドの検量線を作成する。その後各検出系で得られた試料に対する応答値を、各検量線を用いて差演算するものである。 Calculation method for removing glycated amino acid or glycated peptide detection system in the glycated amino acid or glycated peptide detection system using fructosyl amino acid oxidase or fructosyl peptide oxidase, if glucose in the sample interferes with the detected value of glycated amino acid or glycated peptide explain. Specifically, when a glycated amino acid or glycated peptide responds in the glucose detection system and glucose responds in the glycated amino acid or glycated peptide detection system, first, a calibration curve of glucose and glycated amino acid or glycated peptide is created in each detection system. . Thereafter, the difference between the response values for the sample obtained in each detection system is calculated using each calibration curve.
グルコースオキシダーゼ固定化体と第1の過酸化水素電極を組み合わせたグルコース検出系で得られたグルコースの検量線を
ｙ＝ａ１１×ｘ＋ｂ１１
フルクトシルバリンの検量線を
ｙ＝ａ１２×ｘ＋ｂ１２
とし、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼまたはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体と過酸化水素電極を組み合わせた糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出系で得られたグルコースの検量線を
ｙ＝ａ２１×ｘ＋ｂ２１
フルクトシルバリンの検量線を
ｙ＝ａ２２×ｘ＋ｂ２２
とすると、ｘ１の濃度のグルコースとｘ２の濃度のフルクトシルバリンによる応答値は、第１の過酸化水素電極では、
ｙ１＝ａ１１×ｘ１＋ｂ１１＋ａ１２×ｘ２＋ｂ１２
第2の過酸化水素電極では、
ｙ２＝ａ２１×ｘ１＋ｂ２１＋ａ２２×ｘ２＋ｂ２２
となる。
A glucose calibration curve obtained by a glucose detection system in which a glucose oxidase immobilized body and a first hydrogen peroxide electrode are combined is represented by y = a 11 × x + b 11
The calibration curve for fructosyl valine is y = a 12 × x + b 12
And a calibration curve of glucose obtained by a glycated amino acid or glycated peptide detection system in which a fructosyl amino acid oxidase or fructosyl peptide oxidase immobilized body and a hydrogen peroxide electrode are combined is represented by y = a 21 × x + b 21
A standard curve for fructosyl valine is represented by y = a 22 × x + b 22
Then, the response value by the glucose with x 1 concentration and fructosyl valine with x 2 concentration is as follows:
y 1 = a 11 × x 1 + b 11 + a 12 × x 2 + b 12
In the second hydrogen peroxide electrode,
y 2 = a 21 × x 1 + b 21 + a 22 × x 2 + b 22
It becomes.
これらの値を元にグルコース、フルクトシルバリンの濃度をそれぞれ求めると、グルコースの濃度ｘ１は
ｘ１＝（ａ１２×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２２×（ｙ１−ｂ１１−ｂ１２））／（ａ１２×ａ２１−ａ１１×ａ２２）
フルクトシルバリンの濃度ｘ２は
ｘ２＝（ａ１１×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２１×（ｙ１−ｂ１１−ｂ１２））／（ａ１１×ａ２２−ａ１２×ａ２１）
となる。
When the concentrations of glucose and fructosyl valine are determined based on these values, the glucose concentration x 1 is
x 1 = (a 12 × ( y 2 -b 21 -b 22) -a 22 × (y 1 -b 11 -b 12)) / (a 12 × a 21 -a 11 × a 22)
The concentration x 2 of fructosyl valine is x 2 = (a 11 × ( y 2 -b 21 -b 22) -a 21 × (y 1 -b 11 -b 12)) / (a 11 × a 22 -a 12 xa 21 )
It becomes.
グルコース検出系でフルクトシルバリンが、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼまたはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体でグルコースが応答する場合でも、グルコースとフルクトシルバリンの濃度が算出でき、分別定量が可能である。 Even when fructosyl valine responds with fructosyl valine in the glucose detection system and with fructosyl amino acid oxidase or fructosyl peptide oxidase immobilized form, the concentrations of glucose and fructosyl valine can be calculated and fractional quantification is possible.
グルコース検出系でフルクトシルバリンが応答しない場合、上式の ａ１２、ｂ１２ は ０ となり、グルコースの濃度ｘ１は
ｘ１＝（ｙ１−ｂ１１）／ ａ１１
フルクトシルバリンの濃度ｘ２は
ｘ２＝（ａ１１×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２１×（ｙ１−ｂ１１））／（ａ１１×ａ２２）
となり、グルコース検出系と糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出系でグルコースとフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの検量線を作製し、試料のフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジン検出値から、上式により試料中のグルコース濃度とフルクトシルバリン濃度が正確に算出できる。
When fructosyl valine does not respond in the glucose detection system, a 12 and b 12 in the above formula are 0, and the glucose concentration x 1 is x 1 = (y 1 -b 11 ) / a 11
The concentration x 2 is x 2 = the fructosyl valine (a 11 × (y 2 -b 21 -b 22) -a 21 × (y 1 -b 11)) / (a 11 × a 22)
A calibration curve for glucose and fructosyl valine or fructosyl valyl histidine was prepared using the glucose detection system and the glycated amino acid or glycated peptide detection system. The glucose concentration and fructosyl valine concentration in the sample can be accurately calculated by the formula.
さらに、糖化ヘモグロビン比率であるＨｂＡ１ｃの算出は、検体中のグルコースに由来する妨害を差演算して求められたフルクトシルバリン濃度またはフルクトシルバリルヒスチジン濃度と、検体中のヘモグロビン濃度との比率を第一演算機構により算出することで求められる。 Furthermore, the calculation of HbA1c, which is the ratio of glycated hemoglobin, is the ratio of the fructosyl valine concentration or fructosyl valyl histidine concentration obtained by subtracting the interference derived from glucose in the sample and the hemoglobin concentration in the sample. Is calculated by the first calculation mechanism.
グルコースオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ等の酵素固定化方法としては、物理吸着法、イオン結合法、包括法、共有結合法などタンパク質の固定化方法として公知の方法を利用できるが、中でも共有結合法が長期安定性に優れ望ましい。タンパク質を共有結合させる方法としては、ホルムアルデヒド、グリオキザール、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基を有する化合物を用いるか、多官能基性アシル化剤を利用する方法、スルフヒドリル基を架橋させる方法など各種の方法を利用できる。酵素固定化体の形状としては、膜状に固定化し白金、金、カーボンなどからなる電極上にのせることもできるし、不溶性担体に固定化し担体をカラムリアクターに充填して用いることもできる。 As enzyme immobilization methods such as glucose oxidase, fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, etc., methods known as protein immobilization methods such as physical adsorption method, ionic bond method, inclusion method, and covalent bond method can be used. Of these, the covalent bond method is desirable because of its long-term stability. As a method for covalently binding a protein, various methods such as a method using a compound having an aldehyde group such as formaldehyde, glyoxal, and glutaraldehyde, a method using a polyfunctional acylating agent, a method of crosslinking a sulfhydryl group, and the like are used. it can. As the shape of the enzyme-immobilized body, it can be immobilized in a film shape and placed on an electrode made of platinum, gold, carbon or the like, or it can be immobilized on an insoluble carrier and packed in a column reactor for use.
さらに固定化の際に他種の酵素あるいはゼラチンや血清アルブミンなどのタンパク質、ポリアリルアミンやポリリジンなどの合成高分子を共存させ、酵素固定化体の特性、すなわち膜強度、基質透過特性などを変更することもできる。酵素を不溶性担体に固定化する場合の担体としては、粘土鉱物、ケイソウ土、活性炭、アルミナセラミックス、酸化チタン、架橋処理デンプン粒子、セルロール系高分子、キチンおよびキトサン誘導体などの公知の担体を利用できる。 Furthermore, during immobilization, other types of enzymes, proteins such as gelatin and serum albumin, and synthetic polymers such as polyallylamine and polylysine are allowed to coexist to change the properties of the enzyme-immobilized product, that is, membrane strength, substrate permeability, etc. You can also. Known carriers such as clay minerals, diatomaceous earth, activated carbon, alumina ceramics, titanium oxide, cross-linked starch particles, cellulose-based polymers, chitin and chitosan derivatives can be used as the carrier when the enzyme is immobilized on an insoluble carrier. .
検体中のグルコース、タンパク質分解酵素の作用によって糖化ヘモグロビンから生成した糖化ペプチド及び糖化アミノ酸は、順次グルコースオキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（順序は問わない）で過酸化水素に変換し、各々のオキシダーゼにより生成した過酸化水素を電気化学的に検出することで、各物質濃度が測定できる。しかしながら、天然に存在するヘモグロビン糖化物の糖化率は約５％と低く、タンパク質分解酵素の処理によって生じたフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジン由来の過酸化水素量が通常よりも少ないことが十分に予想されるため、糖化ペプチド及び糖化アミノ酸を測定する場合には、過酸化水素を高感度で検出する。過酸化水素は公知の方法により直接、間接的に測定することができるが、ヘモグロビン自身が４００〜６００ｎｍ付近に吸収帯を有しているため、公知の方法の中でもこれらの波長領域での過酸化水素の吸光度検出はヘモグロビンの吸収による妨害が大きく、実際の糖化ヘモグロビン測定には適用できない可能性が高い。これらのことから過酸化水素の高感度計測には、アンペロメトリー等の電気化学的な手法を用いるのがより好ましい。 Glucose peptide and glycated amino acid generated from glycated hemoglobin by the action of glucose and proteolytic enzyme in the sample are sequentially converted to hydrogen peroxide with glucose oxidase, fructosyl peptide oxidase and fructosyl amino acid oxidase (regardless of order), The concentration of each substance can be measured by electrochemically detecting hydrogen peroxide generated by each oxidase. However, the saccharification rate of naturally occurring hemoglobin saccharified products is as low as about 5%, and the amount of hydrogen peroxide derived from fructosyl valine or fructosyl valyl histidine generated by the treatment with proteolytic enzyme is less than usual. Since it is sufficiently expected, hydrogen peroxide is detected with high sensitivity when measuring glycated peptides and glycated amino acids. Hydrogen peroxide can be measured directly or indirectly by a known method, but since hemoglobin itself has an absorption band in the vicinity of 400 to 600 nm, it is a peroxidation in these wavelength regions among the known methods. The hydrogen absorbance detection is largely disturbed by the absorption of hemoglobin, and is likely not applicable to actual glycated hemoglobin measurement. For these reasons, it is more preferable to use an electrochemical method such as amperometry for highly sensitive measurement of hydrogen peroxide.
糖化ヘモグロビンをタンパク質分解酵素で処理する方法は、まず糖化ヘモグロビンを含む検体を界面活性剤含有緩衝液と混合し、次にタンパク質分解酵素を添加して所定時間反応させる、または糖化ヘモグロビンを含む検体を界面活性剤含有緩衝液と混合した試料をタンパク質分解酵素が固定化された担体と所定時間接触させる等の方法が挙げられ、何れの方法を用いてもよい。 The method of treating glycated hemoglobin with a proteolytic enzyme is as follows. First, a sample containing glycated hemoglobin is mixed with a surfactant-containing buffer, and then a proteolytic enzyme is added and reacted for a predetermined time, or a sample containing glycated hemoglobin is prepared. Examples include a method in which a sample mixed with a surfactant-containing buffer is brought into contact with a carrier on which a proteolytic enzyme is immobilized for a predetermined time, and any method may be used.
糖化ヘモグロビンを含む検体を処理する際に使用する界面活性剤には、溶血作用とヘモグロビンの分子構造を変化させる２つの作用が必要である。ヘモグロビンは赤血球内に大部分が存在し、適切な濃度の界面活性剤存在下ではヘモグロビンが赤血球外に放出される。また、ヘモグロビンは通常折りたたまれた状態で存在するが、適切な濃度の界面活性剤中では緩んだ状態で存在し、この作用によりタンパク質分解酵素による分解が容易になると推測される。界面活性剤としては、非イオン系のポリオキシエチレンアルキルエーテル類[例えばポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル(トリトンＸ−１００)、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル等]やポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類[例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ツイーン４０）等]、陰イオン系のポリオキシエチレンアルキルエーテル類やアルキル硫酸塩［ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等）］、陽イオン系、両性イオン系があるが、陰イオン系界面活性剤が先に述べた２つの効果が高く、望ましい。その濃度は０．０５〜１０％、好ましくは０．０５〜１％で、界面活性剤との反応時間は数秒〜１０分程度である。 A surfactant used for processing a specimen containing glycated hemoglobin needs two actions to change the molecular structure of hemolysis and hemoglobin. Most of hemoglobin is present in erythrocytes, and hemoglobin is released out of erythrocytes in the presence of an appropriate concentration of surfactant. In addition, hemoglobin is usually present in a folded state, but is present in a relaxed state in an appropriate concentration of surfactant, and this action is presumed to facilitate degradation by proteolytic enzymes. Surfactants include nonionic polyoxyethylene alkyl ethers [for example, polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (Triton X-100), polyoxyethylene (23) lauryl ether, etc.] and polyoxyethylene sorbitan fatty acids. Esters [eg, polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20), polyoxyethylene sorbitan monopalmitate (Tween 40), etc.], anionic polyoxyethylene alkyl ethers and alkyl sulfates [sodium dodecyl sulfate (SDS ) Etc.]], cationic and zwitterionic, but anionic surfactants are desirable because they have the two effects described above. The concentration is 0.05 to 10%, preferably 0.05 to 1%, and the reaction time with the surfactant is about several seconds to 10 minutes.
糖化ヘモグロビンを含む検体を処理する際に使用する緩衝液は、ヘモグロビンが溶解できるｐＨ範囲の緩衝液であれば特に限定されず、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の公知の緩衝液及びその塩を使用すればよい。緩衝液には塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩を適宜添加してもよい。 The buffer solution used when processing the specimen containing glycated hemoglobin is not particularly limited as long as it is a buffer solution in a pH range in which hemoglobin can be dissolved, and known buffers such as phosphate buffer and Tris buffer and salts thereof. Can be used. A salt such as sodium chloride or potassium chloride may be appropriately added to the buffer solution.
使用しうるタンパク質分解酵素は、糖化ヘモグロビンのＮ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを生じる作用が大きく、ヘモグロビンが十分に溶解できるｐＨ範囲に至適を有するタンパク質分解酵素が好ましく使用できる。具体的にはｐＨ６．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０に至適を有し、糖化ヘモグロビンのＮ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを生じる作用の大きいタンパク質分解酵素であればよい。このような作用を有するタンパク質分解酵素として、糖化アミノ酸を生成する作用が大きい中性域またはアルカリ域に至適ｐＨを有するアスペルギルス属由来のタンパク質分解酵素と、糖化ペプチドを生成する作用が大きい中性域または酸性域に至適ｐＨを有するバチルス属由来のタンパク質分解酵素が例示できる。 As the proteolytic enzyme that can be used, a proteolytic enzyme that has a large effect of generating a glycated amino acid or a glycated peptide from the N-terminus of glycated hemoglobin and is optimal in a pH range in which hemoglobin can be sufficiently dissolved can be preferably used. Specifically, it may be a proteolytic enzyme that has an optimum effect at pH 6.0 to 10.0, more preferably pH 6.0 to 8.0, and has a large action to generate a glycated amino acid or glycated peptide from the N-terminus of glycated hemoglobin. That's fine. As a proteolytic enzyme having such an action, a proteolytic enzyme derived from the genus Aspergillus having an optimum pH in a neutral range or an alkaline range, which has a large action to produce a glycated amino acid, and a neutral having a large action to produce a glycated peptide Examples thereof include proteolytic enzymes derived from the genus Bacillus having an optimum pH in a region or an acidic region.
本明細書において、「アスペルギルス属タンパク質分解酵素」あるいは「アスペルギルス属微生物由来のプロテアーゼ」または「バチルス属タンパク質分解酵素」あるいは「バチルス属微生物由来のプロテアーゼ」とは、アスペルギルス属またはバチルス属の微生物が産生するプロテアーゼ自体であってもよく、該プロテアーゼのアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸を置換、付加、欠失、挿入させることで得られる改変体であって、アスペルギルス属タンパク質分解酵素またはバチルス属タンパク質分解酵素のように、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジン濃度を高めることができる改変体は広く包含される。 As used herein, “Aspergillus genus proteolytic enzyme” or “Protease derived from Aspergillus genus microorganism” or “Bacillus proteolytic enzyme” or “Protease derived from Bacillus genus microorganism” is produced by microorganisms belonging to the genus Aspergillus or Bacillus A protease obtained by substitution, addition, deletion, or insertion of one or more amino acids in the amino acid sequence of the protease, wherein the protease is Aspergillus proteolytic enzyme or Bacillus Variants that can increase fructosyl valine or fructosyl valyl histidine concentrations, such as proteolytic enzymes, are widely encompassed.
ヘモグロビン濃度を測定する方法としては、シアンメトヘモグロビン法、メトヘモグロビン法、アザイドヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法等の公知の方法を用いればよいが、中でも種々の酵素に阻害や失活等の影響が少なく、試薬廃棄時に環境に対する負荷が小さいＳＬＳ−ヘモグロビン法が好ましい。ＳＬＳ−ヘモグロビン法は、血液試料を陰イオン系界面活性剤であるアルキル硫酸塩溶液（以後ヘモグロビン測定試薬と表記する）で処理した後、５４０ｎｍでの試料の吸光度変化から算出するものである。アルキル硫酸塩はラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）やポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等を適宜選択して使用し、ヘモグロビン測定試薬中には緩衝液や各種塩類を含んでいてもよい。アルキル硫酸塩の濃度は、反応溶液中の血球濃度０．２５〜２０体積％に対して０．０５〜１０％、好ましくは０．０５〜１％である。血液試料とヘモグロビン測定試薬の反応は数秒〜数分程度で完了する。 As a method for measuring the hemoglobin concentration, a known method such as cyan methemoglobin method, methemoglobin method, azide hemoglobin method, SLS-hemoglobin method may be used, and among them, the influence of various enzymes such as inhibition or inactivation The SLS-hemoglobin method is preferable because it has a low environmental impact when the reagent is discarded. In the SLS-hemoglobin method, a blood sample is treated with an alkyl sulfate solution (hereinafter referred to as a hemoglobin measuring reagent) that is an anionic surfactant, and then calculated from the change in absorbance of the sample at 540 nm. As the alkyl sulfate, sodium lauryl sulfate (SLS), polyoxyethylene sodium lauryl sulfate, or the like is appropriately selected and used, and the hemoglobin measuring reagent may contain a buffer or various salts. The concentration of the alkyl sulfate is 0.05 to 10%, preferably 0.05 to 1% with respect to the blood cell concentration of 0.25 to 20% by volume in the reaction solution. The reaction between the blood sample and the hemoglobin measuring reagent is completed in about several seconds to several minutes.
また、アルキル硫酸塩を含むヘモグロビン測定試薬中に、タンパク質分解酵素を作用させる際に使用する界面活性剤含有緩衝液を同時に共存させて、溶血、ヘモグロビンの変性、ＳＬＳ−ヘモグロビンの形成反応を同時に行ってもよく、検体のヘモグロビン測定試薬との反応後にタンパク質分解酵素処理用の界面活性剤含有緩衝液を加えてもよく、逆の順序でもよい。 In addition, a surfactant-containing buffer used for the action of proteolytic enzymes is simultaneously coexisted in a hemoglobin measurement reagent containing alkyl sulfate, and hemolysis, hemoglobin denaturation, and SLS-hemoglobin formation reaction are simultaneously performed. Alternatively, a surfactant-containing buffer for proteolytic enzyme treatment may be added after the reaction of the specimen with the hemoglobin measurement reagent, or the reverse order may be used.
ヘモグロビン測定試薬中の界面活性剤とタンパク質分解酵素処理用の界面活性剤は、上記の条件を満たすものであれば、異なっていてもよく、同一であってもよい。 The surfactant in the hemoglobin measuring reagent and the surfactant for proteolytic enzyme treatment may be different or the same as long as they satisfy the above conditions.
ヘモグロビン濃度の測定は、検体とヘモグロビン濃度測定試薬の反応終了後で反応液の吸光度が安定である時間の範囲内であれば如何なる時間に測定してもよく、検体のタンパク質分解酵素の処理前後、グルコース及びフルクトシルバリン及びフルクトシルバリルヒスチジンの検出の前後のいずれでもよい。 The hemoglobin concentration may be measured at any time within the time range in which the absorbance of the reaction solution is stable after completion of the reaction between the sample and the hemoglobin concentration measuring reagent. Either before or after the detection of glucose, fructosyl valine and fructosyl valyl histidine.
ヘモグロビン測定試薬で処理した検体の吸光度を測定する方法としては、キュベットに該試料を分注して特定の波長の吸光度を測定するバッチ法、もしくはテフロン（登録商標）管をセルとして試料がテフロン（登録商標）管を通過する際の特定の波長の吸光度変化を測定するフロー法を用いればよく、操作が簡単であることからフロー法がより望ましい。
固定化された酵素に試料を一定時間接触させて反応を進行させるには、試料液を一定時間撹拌しながら反応を起こさせるバッチ方式でも可能であるが、より高精度の測定を実施するためにフロー方式の測定を用いることが望ましい。本発明ではより高精度の測定を行えるフロー方式の装置を開示する。
As a method for measuring the absorbance of a specimen treated with a hemoglobin measuring reagent, a batch method in which the sample is dispensed into a cuvette and the absorbance at a specific wavelength is measured, or a sample is used as a Teflon (registered trademark) tube as a cell. A flow method for measuring a change in absorbance at a specific wavelength when passing through a (registered trademark) tube may be used, and the flow method is more preferable because the operation is simple.
In order to advance the reaction by contacting the sample with the immobilized enzyme for a certain period of time, a batch method in which the reaction is caused while stirring the sample liquid for a certain period of time is possible, but in order to carry out a more accurate measurement. It is desirable to use flow based measurements. In the present invention, a flow type apparatus capable of performing measurement with higher accuracy is disclosed.
本発明の1つの好ましい実施形態を図１に示す。緩衝液の流れを形成する機構（１、２）と検体を注入する機構（４、５、７）、該試料注入機構の下流にタンパク質分解酵素固定化体（１４）、ヘモグロビン濃度検出用フロー型比色計（１６）と電気化学的活性物質濃度を検知できる電極（１８、２０）を配置し、ヘモグロビン濃度検出系（１６）、グルコース検出用電極系（１７、１８）と糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出用電極系（１９、２０）で構成される。 One preferred embodiment of the present invention is shown in FIG. A mechanism (1, 2) for forming a flow of buffer solution, a mechanism (4, 5, 7) for injecting a specimen, a proteolytic enzyme immobilized body (14) downstream of the sample injection mechanism, and a flow type for detecting hemoglobin concentration A colorimeter (16) and electrodes (18, 20) capable of detecting the electrochemically active substance concentration are arranged, a hemoglobin concentration detection system (16), a glucose detection electrode system (17, 18) and a glycated amino acid or glycated peptide It consists of a detection electrode system (19, 20).
具体的には、緩衝液槽（１）より緩衝液Ａをポンプ（２）により送液する。試料（６）にニードル（７）を挿入し、バルブ（１０）を閉じ、バルブ（１１）を開けて、シリンジポンプ（１２）を引くことにより検体を計量バルブ（４）の計量ループ（５）に引き込む。次に計量バルブ（４）を切り替え、緩衝液Ａによりループ（５）内に溜まった検体を押し出す。過剰の検体は一旦バルブ（１０）を開けてバルブ（１１）を閉じ、洗浄液（９）をシリンジポンプ（１２）に引き込んだ後、バルブ（１０）を閉じバルブ（１１）を開けて洗浄液を押し出すことにより、廃棄ポット（８）に押し出され、廃液ボトル（２２）に貯留される。注入された試料は緩衝液Ａの流れにのって恒温槽（１３）内に配置されたタンパク質分解酵素固定化体（１４）を通り、試料中の糖化タンパク質から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを生成する。タンパク質分解酵素の作用した試料は、緩衝液Ａの流れに従ってさらに下流のフロー型比色計（１６）を通り、試料が通過する際の一定波長の吸光度変化から試料中のヘモグロビン濃度が検知される。次に試料は、グルコースオキシダーゼ固定化体（１７）を通り、そこで生成した過酸化水素が過酸化水素電極（１８）で検知される。続いてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化体またはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体（１９）を通り、そこで生成した過酸化水素が下流の過酸化水素電極（２０）で検知される。廃液は背圧コイル（２１）を通り、廃液ボトル（２２）に溜まる。 Specifically, the buffer A is sent from the buffer tank (1) by the pump (2). Insert the needle (7) into the sample (6), close the valve (10), open the valve (11), and pull the syringe pump (12) to pull the sample into the metering loop (5) of the metering valve (4) Pull in. Next, the metering valve (4) is switched, and the sample accumulated in the loop (5) is pushed out by the buffer A. Excess specimen once opens the valve (10) and closes the valve (11), draws the cleaning liquid (9) into the syringe pump (12), then closes the valve (10) and opens the valve (11) to push out the cleaning liquid. As a result, it is pushed out to the waste pot (8) and stored in the waste liquid bottle (22). The injected sample passes along the flow of the buffer A, passes through the proteolytic enzyme immobilized body (14) arranged in the thermostatic bath (13), and generates a glycated amino acid or a glycated peptide from the glycated protein in the sample. . The sample on which the proteolytic enzyme acts passes through the flow colorimeter (16) further downstream according to the flow of the buffer A, and the hemoglobin concentration in the sample is detected from the change in absorbance at a certain wavelength when the sample passes. . Next, the sample passes through the glucose oxidase immobilized body (17), and the hydrogen peroxide generated therein is detected by the hydrogen peroxide electrode (18). Subsequently, the hydrogen peroxide generated through the immobilized fructosyl amino acid oxidase or the immobilized fructosyl peptide oxidase (19) is detected by the downstream hydrogen peroxide electrode (20). The waste liquid passes through the back pressure coil (21) and accumulates in the waste liquid bottle (22).
図２は、血液試料による測定系の汚染を連続的に除去可能な透析モジュールを組み込んだ、フロー型のグルコースと糖化アミノ酸または糖化ペプチド同時測定装置の例である。緩衝液槽（２４）より緩衝液Ｂをポンプ（２５）により送液し、試料注入機構（４、５、７）により試料（６）を緩衝液Ｂの流れに注入する。注入された試料は、緩衝液Ｂの流れにのって恒温槽（１３）内に設置されたフロー型比色計（１６）を通り、一定波長の吸光度変化からヘモグロビン濃度が検知された後、さらに下流に配置されたタンパク質分解酵素固定化カラム（１４）を通り、試料中の糖化タンパク質から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを生成する。タンパク質分解酵素の作用した試料はさらに下流に設置された透析モジュール（２７）に運ばれ、膜厚さ２０μｍ、分子量分画１２０００〜１４０００の再生セルロース膜で試料中の低分子成分のみがグルコースと糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出機構（１７、１８、１９、２０）に導かれる。緩衝液槽（１）より緩衝液Ａがポンプ（２）により送液されているので、透析モジュール（２７）で透析された試料中の低分子成分はグルコースオキシダーゼ固定化体（１７）と過酸化水素電極（１８）を通過し、グルコースオキシダーゼ固定化体（１７）で生成した過酸化水素が検知される。続いてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムまたはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム（１９）と過酸化水素電極（２０）を通過し、生成した過酸化水素を検知する。透析モジュール（２７）の透析膜を通過しなかった試料中の高分子成分は廃液ボトル（２２）に溜まる。 FIG. 2 is an example of a flow-type glucose and glycated amino acid or glycated peptide simultaneous measurement apparatus incorporating a dialysis module capable of continuously removing contamination of a measurement system by a blood sample. Buffer B is sent from the buffer tank (24) by the pump (25), and the sample (6) is injected into the flow of the buffer B by the sample injection mechanism (4, 5, 7). The injected sample passed through the flow colorimeter (16) installed in the thermostat (13) along the flow of the buffer B, and after the hemoglobin concentration was detected from the change in absorbance at a certain wavelength, Further, the glycated amino acid or the glycated peptide is generated from the glycated protein in the sample through the proteolytic enzyme immobilization column (14) arranged downstream. The sample on which the proteolytic enzyme acts is transported to a dialysis module (27) installed downstream, where only low molecular components in the sample are saccharified with glucose in a regenerated cellulose membrane having a film thickness of 20 μm and a molecular weight fraction of 12000 to 14000. Guided to amino acid or glycated peptide detection mechanism (17, 18, 19, 20). Since the buffer A is sent from the buffer tank (1) by the pump (2), the low-molecular components in the sample dialyzed by the dialysis module (27) are peroxidized with the glucose oxidase immobilized body (17). Hydrogen peroxide produced by the glucose oxidase immobilized body (17) passing through the hydrogen electrode (18) is detected. Subsequently, it passes through a fructosyl amino acid oxidase-immobilized column or a fructosyl peptide oxidase-immobilized column (19) and a hydrogen peroxide electrode (20), and the generated hydrogen peroxide is detected. The polymer component in the sample that has not passed through the dialysis membrane of the dialysis module (27) accumulates in the waste liquid bottle (22).
プロテアーゼ分解後の試料中の低分子成分分離機構で用いる膜（２７）は、タンパク質分解酵素による分解の過程で共存すると考えられるペンタペプチドやヘキサペプチドやさらに大きなペプチド類が透過し難いもしくは透過せず、フルクトシルバリン及びフルクトシルバリルヒスチジンが透過できるものであれば良い。用いる膜としては、再生セルロース製、アセチルセルロース製、ポリフッ化ビニリデン製などの透析膜が例示できる。透析膜の分子量分画は平衡透析を行った際に透過する最小分子量で表示される。一方分析用途に利用する場合は、透析の初速度の差で分離する場合が多く、必ずしも分画を希望する分子量と透析膜の性能表示が一致するとは限らない。本発明の目的には分画分子量３００以上５０万以下のものが利用できる。より好ましくは１０００以上１０万以下、さらに望ましくは１万以上２万以下のものが良い。 The membrane (27) used in the low-molecular component separation mechanism in the sample after protease degradation is difficult or does not permeate pentapeptides, hexapeptides or larger peptides that are considered to coexist in the process of degradation by proteolytic enzymes. Any fructosyl valine and fructosyl valyl histidine may be used. Examples of the membrane used include dialysis membranes made of regenerated cellulose, acetyl cellulose, polyvinylidene fluoride, and the like. The molecular weight fraction of the dialysis membrane is displayed as the minimum molecular weight that permeates when equilibrium dialysis is performed. On the other hand, when used for analytical purposes, separation is often based on the difference in the initial rate of dialysis, and the molecular weight desired for fractionation does not always match the performance display of the dialysis membrane. For the purpose of the present invention, those having a fractional molecular weight of 300 to 500,000 can be used. More preferably, it is 1,000 or more and 100,000 or less, and more preferably 10,000 or more and 20,000 or less.
血液試料（６）は、ヘモグロビン測定試薬で処理した後、直接分析装置内に供給してもよいが、ヘモグロビン測定試薬で処理し、さらにタンパク質分解酵素で処理された後装置内に供給されてもよい。分析装置内にヘモグロビン測定試薬で処理し、さらにタンパク質分解酵素で処理された血液試料を供給する場合には、例えばタンパク質分解酵素とヘモグロビン測定試薬で処理した試料を一緒に供給し、緩衝液の流路内においてタンパク質分解酵素で処理されてもよい。フロー型比色計（１６）の一定波長での吸光度変化からヘモグロビン濃度を定量し、過酸化水素電極（１８）および（２０）の電流値の変化を検知することによりグルコース及び糖化アミノ酸または糖化ペプチド濃度を定量することができる。 The blood sample (6) may be directly supplied into the analyzer after being treated with the hemoglobin measuring reagent, or may be supplied into the apparatus after being treated with the hemoglobin measuring reagent and further treated with a proteolytic enzyme. Good. When supplying a blood sample that has been treated with a hemoglobin measurement reagent and further processed with a proteolytic enzyme into the analyzer, for example, the sample treated with the proteolytic enzyme and the hemoglobin measurement reagent is supplied together, and the flow of the buffer solution is increased. It may be treated with a proteolytic enzyme in the tract. Glucose and glycated amino acid or glycated peptide by quantifying the hemoglobin concentration from the change in absorbance at a constant wavelength of the flow-type colorimeter (16) and detecting the change in the current value of the hydrogen peroxide electrodes (18) and (20) The concentration can be quantified.
これらの装置に流す緩衝液は特に限定されないが、固定化酵素(１４、１７、１９)の活性が高くなるようなｐＨ（例えばｐＨ７〜９）になるように選択すればよい。また固定化酵素（１４、１７、１９）と過酸化水素電極（１８、２０）に負の影響を与えない種類や濃度範囲の制菌剤や界面活性剤を含んでいてもよく、過酸化水素電極（１８、２０）に妨害を与えない固定化酵素（１４、１７、１９）の賦活剤を含んでいてもよい。 The buffer solution to be passed through these devices is not particularly limited, but may be selected so that the pH of the immobilized enzyme (14, 17, 19) is high (for example, pH 7-9). Further, it may contain antibacterial agents and surfactants of a kind and concentration range that do not negatively affect the immobilized enzyme (14, 17, 19) and the hydrogen peroxide electrode (18, 20). An activator of the immobilized enzyme (14, 17, 19) that does not interfere with the electrodes (18, 20) may be included.
以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさらに詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
耐火レンガ（３０〜６０メッシュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうしてアミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒドに１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン株式会社製）を１８ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液４００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムとする。
（２）過酸化水素電極の製造
直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロン（登録商標）で被覆し、その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥硬化する。これを過酸化水素電極とする。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is of course not limited thereto.
Example 1
(1) Production of fructosyl amino acid oxidase-immobilized column 150 mg of refractory brick (30-60 mesh) was dried well, immersed in an anhydrous toluene solution of 10% γ-aminopropyltriethoxysilane for 1 hour, and then thoroughly washed with toluene. And dry. The carrier thus treated with aminosilanization is immersed in 5% glutaraldehyde for 1 hour, then thoroughly washed with distilled water, and finally replaced with 100 mM sodium phosphate buffer at pH 7.0, and this buffer is removed as much as possible. 400 μl of a solution obtained by dissolving fructosyl amino acid oxidase (manufactured by Kikkoman Co., Ltd.) at a concentration of 18 units / ml in 100 mM sodium phosphate buffer was brought into contact with this formylated refractory brick at 0 to 4 ° C. Leave on the sun and fix. This enzyme-immobilized carrier is packed in a column having an inner diameter of 3.5 mm and a length of 30 mm to obtain a fructosyl amino acid oxidase-immobilized column.
(2) Production of hydrogen peroxide electrode The side surface of a platinum wire having a diameter of 2 mm is covered with heat-shrinkable Teflon (registered trademark), and one end of the wire is smoothed with a file and 1500-mm emery paper. Using this platinum wire as a working electrode, a 1 cm square platinum plate as a counter electrode, and a saturated calomel electrode as a reference electrode, electrolytic treatment is performed in 0.1 M sulfuric acid at +2.0 V for 10 minutes. Thereafter, the platinum wire is thoroughly washed with water, dried at 40 ° C. for 10 minutes, immersed in an anhydrous toluene solution of 10% γ-aminopropyltriethoxysilane for 1 hour, and then washed. 20 mg of bovine serum albumin (manufactured by Sigma, Fraction V) is dissolved in 1 ml of distilled water, and glutaraldehyde is added to 0.2% therein. This mixed solution is quickly put on 5 μl of the previously prepared platinum wire and dried and cured at 40 ° C. for 15 minutes. This is a hydrogen peroxide electrode.
また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
（３）グルコース電極の製造
（２）と同様の手順で過酸化水素電極を作製する。グルコースオキシダーゼ（シグマ社製、ＴｙｐｅII）を１００ｍｇ／ｍｌとなるように１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解する。グルコースオキシダーゼが２０ｍｇ/ｍｌ、牛血清アルブミンが５ｍｇ／ｍｌ、グルタルアルデヒドが０．２％となるように、１００ｍｇ/ｍｌグルコースオキシダーゼ溶液と牛血清アルブミン溶液とグルタルアルデヒド溶液と１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０を混合してグルコースオキシダーゼ固定化酵素溶液とする。このグルコースオキシダーゼ固定化酵素溶液を手早く先に用意した過酸化水素電極上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥硬化する。これをグルコースオキシダーゼ電極とする。
An Ag / AgCl reference electrode was used as the reference electrode, and a conductive pipe was used as the counter electrode.
(3) Production of glucose electrode A hydrogen peroxide electrode is produced by the same procedure as in (2). Glucose oxidase (Sigma II, Type II) is dissolved in 100 mM phosphate buffer pH 6.0 so as to be 100 mg / ml. 100 mg / ml glucose oxidase solution, bovine serum albumin solution, glutaraldehyde solution, and 100 mM
また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
（４）測定装置
図２の測定装置において、フロー型比色計（１６）とタンパク質分解酵素固定化カラム（１４）と第１の固定化酵素カラム（１７）は配置せず、過酸化水素電極（１８）にグルコース電極、第２の固定化酵素カラム（１９）にはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム、過酸化水素電極（２０）に過酸化水素電極を配置する。緩衝液槽（２４）より緩衝液Ｂをポンプ（２５）により送液し、計量バルブ（４）を用いて試料１００μｌを注入する。注入された試料は緩衝液Ｂの流れにのって恒温槽（１３）内に設置された透析モジュール（２７）に運ばれ、膜厚さ２０μｍ、分子量分画１２０００〜１４０００の再生セルロース膜で試料中の低分子成分のみがグルコース検知系（１８）と糖化アミノ酸検知系（１９、２０）に導かれる。緩衝液槽（１）より緩衝液Ａがポンプ（２）により送液されているので、透析モジュール（２７）で透析された試料中の低分子成分はグルコース電極（１８）とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム（１９）と過酸化水素電極（２０）を通過し、試料中のグルコースと糖化アミノ酸から生成した過酸化水素が検知される。
An Ag / AgCl reference electrode was used as the reference electrode, and a conductive pipe was used as the counter electrode.
(4) Measuring device In the measuring device of FIG. 2, the flow-type colorimeter (16), the proteolytic enzyme-immobilized column (14) and the first immobilized enzyme column (17) are not arranged, but a hydrogen peroxide electrode A glucose electrode is disposed in (18), a fructosyl amino acid oxidase immobilized column is disposed in the second immobilized enzyme column (19), and a hydrogen peroxide electrode is disposed in the hydrogen peroxide electrode (20). Buffer B is sent from the buffer tank (24) by the pump (25), and 100 μl of sample is injected using the metering valve (4). The injected sample is carried along the flow of buffer B to the dialysis module (27) installed in the thermostatic chamber (13), and the sample is formed with a regenerated cellulose membrane having a film thickness of 20 μm and a molecular weight fraction of 12000 to 14000. Only the low molecular weight component is led to the glucose detection system (18) and the glycated amino acid detection system (19, 20). Since the buffer A is sent from the buffer tank (1) by the pump (2), the low molecular components in the sample dialyzed by the dialysis module (27) are fixed to the glucose electrode (18) and the fructosyl amino acid oxidase. Hydrogen peroxide generated from glucose and glycated amino acid in the sample is detected after passing through the glycation column (19) and the hydrogen peroxide electrode (20).
この装置に流す緩衝液の組成は、緩衝液Ａが１００ｍＭのリン酸、５０ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭのアジ化ナトリウムを含み、ｐＨが８．０で流速が０．８ｍｌ／分である。緩衝液Ｂは５０ｍＭのリン酸、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含み、ｐＨが８．０で流速が１．０ｍｌ／分である。 The composition of the buffer solution to be passed through this apparatus is that buffer A contains 100 mM phosphoric acid, 50 mM potassium chloride, 1 mM sodium azide, pH is 8.0, and the flow rate is 0.8 ml / min. Buffer B contains 50 mM phosphate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, has a pH of 8.0 and a flow rate of 1.0 ml / min.
恒温槽の温度は３７℃であった。
（５）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの基質特異性
（４）の測定装置を使用して、緩衝液のｐＨが８．０の場合の各種糖化アミノ酸や糖化ペプチド、アミノ酸、糖に対するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの基質特異性を調べた結果を表１に示す。表中の値はフルクトシルグリシンに対する応答を１００とした場合の相対値である。
The temperature of the thermostatic bath was 37 ° C.
(5) Substrate specificity of the fructosyl amino acid oxidase-immobilized column Using the measuring device of (4), fructosyl amino acids for various glycated amino acids, glycated peptides, amino acids, and sugars when the pH of the buffer is 8.0 Table 1 shows the results of examining the substrate specificity of the oxidase-immobilized column. The values in the table are relative values when the response to fructosylglycine is 100.
フルクトシルグリシンとフルクトシルバリンに対して大きな応答を示した。またフルクトシルリジンと糖化ペプチドであるフルクトシルバリルヒスチジンにはほとんど応答しなかった。その他のアミノ酸や糖では、グルタミン、メチオニン、グルコースに非常に小さいが応答した。 Great response to fructosylglycine and fructosyl valine. In addition, it hardly responded to fructosyl lysine and glycated peptide fructosyl valyl histidine. Other amino acids and sugars responded very little to glutamine, methionine, and glucose.
本フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムは、実質的に糖化ペプチドとε位が糖化したフルクトシルリジンに作用しない。 This fructosyl amino acid oxidase-immobilized column does not substantially act on a glycated peptide and fructosyl lysine glycated at the ε position.
しかし、グルコースに対して応答するため、試料中にグルコースが多量に含まれる場合には正の誤差を生じる可能性がある。正常人の血中でグルコースは１０ｍＭ程度、糖化アミノ酸は０．１ｍＭ程度であり、血中で約１００倍の濃度差があるので、血中グルコースによりフルクトシルバリンと同程度の大きさの妨害を与える可能性がある。このような妨害は、糖化アミノ酸と同時にグルコースを測定して差演算することで除くことができる。 However, since it responds to glucose, a positive error may occur if the sample contains a large amount of glucose. In normal human blood, glucose is about 10 mM, glycated amino acid is about 0.1 mM, and there is a concentration difference of about 100 times in blood. Therefore, blood glucose interferes with the same magnitude as fructosyl valine. May give. Such interference can be eliminated by measuring glucose simultaneously with the glycated amino acid and calculating the difference.
（６）グルコースとフルクトシルバリンの同時測定
（４）の測定装置を使用して、２、５、１０ｍＭのグルコース及び２０、５０、１００μＭのフルクトシルバリンを各１００μｌ注入し、検出値を得た。
(6) Simultaneous measurement of glucose and fructosyl valine Using the measuring device of (4), 100 μl each of 2, 5, 10 mM glucose and 20, 50, 100 μM fructosyl valine were injected, and the detected value was measured. Obtained.
グルコースに対するグルコース電極と糖化アミノ酸電極の検出値は図３、フルクトシルバリンに対するグルコース電極と糖化アミノ酸電極の検出値は図４のようになり、次に示す検量線が得られた。ただしＹは検出値、Ｘは試料中の濃度、ｒは相関係数である。 The detected values of the glucose electrode and the glycated amino acid electrode for glucose are as shown in FIG. 3, and the detected values of the glucose electrode and the glycated amino acid electrode for fructosyl valine are as shown in FIG. 4, and the following calibration curve was obtained. Where Y is the detected value, X is the concentration in the sample, and r is the correlation coefficient.
グルコース電極
グルコース検量線
Ｙ（ｎＡ）＝２．４４Ｘ（ｍＭ）−０．２５ ｒ＝０．９９９８
フルクトシルバリン検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．００Ｘ（μＭ）−０．００
糖化アミノ酸電極
グルコース検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．０３０Ｘ（ｍＭ）＋０．０２９ ｒ＝０．９７７８
フルクトシルバリン検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．０１４Ｘ（μＭ）＋０．００７ ｒ＝０．９９９９
この測定装置を用いてグルコース５ｍＭとフルクトシルバリン８０μＭの混合標準液を測定したところ、グルコース電極では１１．９７ｎＡの応答値を、糖化アミノ酸電極では１．２９ｎＡの応答値を得た。
Glucose electrode Glucose calibration curve Y (nA) = 2.44X (mM) -0.25 r = 0.9998
Fructosylvaline calibration curve Y (nA) = 0.00X (μM) −0.00
Glycated amino acid electrode Glucose calibration curve Y (nA) = 0.030X (mM) +0.029 r = 0.9778
Fructosylvaline calibration curve Y (nA) = 0.014X (μM) +0.007 r = 0.9999
When a mixed standard solution of glucose 5 mM and
グルコースの濃度ｘ１は、式ｘ１＝（ｙ１−ｂ１１）／ ａ１１よりｘ１＝ ５．００ｍＭ、またフルクトシルバリンの濃度ｘ２は、式ｘ２＝（ａ１１×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２１×（ｙ１−ｂ１１））／（ａ１１×ａ２２）よりｘ２＝ ８０．０μＭ と求めることができた。
比較例１
実施例１（６）と同様にしてグルコースとフルクトシルバリンを含む試料を、糖化アミノ酸電極のみで測定を行った。
（１）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例１（１）と同様にしてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムを製造した。
（２）過酸化水素電極の製造
実施例１（２）と同様に過酸化水素電極を作製した。
（３）測定装置
実施例１（４）と同様に図２の測定装置を利用して測定を行った。フロー型比色計（１６）とタンパク質分解酵素固定化カラム（１４）と第１の固定化酵素カラム（１７）と過酸化水素電極（１８）は配置せず、第２の固定化酵素カラム（１９）にはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム、過酸化水素電極（２０）に過酸化水素電極を配置した。試料は計量バルブにより１００μｌが注入される。
The concentration x 1 of glucose is x 1 = 5.00 mM from the formula x 1 = (y 1 −b 11 ) / a 11 , and the concentration x 2 of fructosyl valine is expressed by the formula x 2 = (a 11 × (y 2− b 21 −b 22 ) −a 21 × (y 1 −b 11 )) / (a 11 × a 22 ), x 2 = 80.0 μM was obtained.
Comparative Example 1
In the same manner as in Example 1 (6), a sample containing glucose and fructosyl valine was measured using only a glycated amino acid electrode.
(1) Production of fructosyl amino acid oxidase-immobilized column A fructosyl amino acid oxidase-immobilized column was produced in the same manner as in Example 1 (1).
(2) Production of hydrogen peroxide electrode A hydrogen peroxide electrode was produced in the same manner as in Example 1 (2).
(3) Measuring apparatus Measurement was performed using the measuring apparatus of FIG. 2 in the same manner as in Example 1 (4). The flow-type colorimeter (16), the proteolytic enzyme-immobilized column (14), the first immobilized enzyme column (17), and the hydrogen peroxide electrode (18) are not arranged, and the second immobilized enzyme column ( In 19), a hydrogen peroxide electrode was placed on a fructosyl amino acid oxidase-immobilized column and a hydrogen peroxide electrode (20). 100 μl of sample is injected through a metering valve.
この装置に流す緩衝液の組成、緩衝液の流速、恒温槽の温度等の条件は、実施例１（４）と同様の条件で使用した。
（４）グルコースとフルクトシルバリン混合標準液の測定
（３）の測定装置を使用し、２０、５０、１００μＭのフルクトシルバリンを１００μｌ注入し、検出値を得た。フルクトシルバリンの検量線は、
Ｙ（ｎＡ）＝０．０１４Ｘ（μＭ）＋０．００７ ｒ＝０．９９９９
となった。ただしＹは検出値、Ｘは試料中の濃度、ｒは相関係数である。
Conditions such as the composition of the buffer solution flowing through the apparatus, the flow rate of the buffer solution, and the temperature of the thermostatic bath were the same as in Example 1 (4).
(4) Measurement of glucose and fructosyl valine mixed standard solution Using the measuring device of (3), 100 μl of 20, 50, 100 μM fructosyl valine was injected to obtain a detection value. The calibration curve for fructosyl valine is
Y (nA) = 0.014X (μM) +0.007 r = 0.9999
It became. Where Y is the detected value, X is the concentration in the sample, and r is the correlation coefficient.
この測定装置を用いてグルコース５ｍＭとフルクトシルバリン８０μＭの混合標準液を測定したところ、１．２８ｎＡの応答値が得られ、試料中のフルクトシルバリンの濃度ｘ２は、式ｘ２＝（ｙ２−ｂ２２）／ ａ２２よりｘ２＝ ９２．３μＭ と求めることができたが、グルコースによる正の誤差を含んでいる。
実施例2
（１）フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例１（１）と同様に耐火レンガ（３０〜６０メッシュ）１５０ｍｇをホルミル化する。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にフルクトシルペプチドオキシダーゼ（キッコーマン株式会社製）を１４０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムとする。
（２）過酸化水素電極の製造
実施例１（２）と同様に過酸化水素電極を作製した。
（３）グルコース電極の製造
実施例１（３）と同様にしてグルコース電極を作製した。
（４）測定装置
図１の測定装置において、タンパク質分解酵素固定化カラム（１４）とフロー型比色計（１６）と第１の固定化酵素カラム（１７）は配置せず、過酸化水素電極（１８）にグルコース電極、第２の固定化酵素カラム（１９）にはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム、第２の過酸化水素電極（２０）に過酸化水素電極を配置する。緩衝液槽（１）より緩衝液Ａをポンプ（２）により送液し、計量バルブ（４）を用いて試料５μｌを注入する。注入された試料は緩衝液Ａの流れにのって恒温槽（１３）内に設置された混合用配管（１５）を通り、温度調整と緩衝液との混合が行われ、その下流のグルコース電極（１８）とフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム（１９）と過酸化水素電極（２０）を通り、試料中のグルコースとフルクトシルバリルヒスチジンから過酸化水素を生成し、電流値の変化を検知する。
When a mixed standard solution of glucose 5 mM and
Example 2
(1) Production of fructosyl peptide oxidase-immobilized column As in Example 1 (1), 150 mg of refractory brick (30 to 60 mesh) is formylated. This formylated refractory brick was brought into contact with 200 μl of a solution prepared by dissolving fructosyl peptide oxidase (manufactured by Kikkoman Co., Ltd.) at a concentration of 140 units / ml in a pH 7.0, 100 mM sodium phosphate buffer solution. Leave on the sun and fix. The enzyme-immobilized carrier is packed in a column having an inner diameter of 3.5 mm and a length of 30 mm to obtain a fructosyl peptide oxidase-immobilized column.
(2) Production of hydrogen peroxide electrode A hydrogen peroxide electrode was produced in the same manner as in Example 1 (2).
(3) Production of glucose electrode A glucose electrode was produced in the same manner as in Example 1 (3).
(4) Measuring device In the measuring device of FIG. 1, the proteolytic enzyme-immobilized column (14), the flow-type colorimeter (16), and the first immobilized enzyme column (17) are not arranged, but a hydrogen peroxide electrode A glucose electrode is disposed in (18), a fructosyl peptide oxidase immobilized column is disposed in the second immobilized enzyme column (19), and a hydrogen peroxide electrode is disposed in the second hydrogen peroxide electrode (20). Buffer A is sent from the buffer tank (1) by the pump (2), and 5 μl of sample is injected using the metering valve (4). The injected sample flows along the flow of the buffer A, passes through the mixing pipe (15) installed in the thermostatic chamber (13), is mixed with the temperature adjustment and the buffer, and the glucose electrode downstream thereof. (18), through a fructosyl peptide oxidase immobilization column (19) and a hydrogen peroxide electrode (20), hydrogen peroxide is generated from glucose and fructosylvalylhistidine in the sample, and a change in the current value is detected. .
この測定装置に使用する緩衝液Ａの組成は、１００ｍＭのリン酸と５０ｍＭの塩化カリウムと1ｍＭのアジ化ナトリウムを含み、ｐＨが７．０である。 The composition of buffer A used in this measuring apparatus contains 100 mM phosphoric acid, 50 mM potassium chloride, and 1 mM sodium azide, and has a pH of 7.0.
緩衝液の流速は１．０ｍｌ／分、恒温槽の温度は３０℃であった。
（５）フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムの基質特異性
（４）の測定装置を使用して、緩衝液ＡのｐＨが７．０の場合の各種糖化アミノ酸や糖化ペプチド、アミノ酸、糖に対するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの基質特異性を調べた結果を表２に示す。表中の値はフルクトシルバリンに対する応答を１００とした場合の相対値である。
The flow rate of the buffer solution was 1.0 ml / min, and the temperature of the thermostatic bath was 30 ° C.
(5) Substrate specificity of fructosyl peptide oxidase-immobilized column Fructosyl for various glycated amino acids, glycated amino acids, glycated peptides, amino acids, and sugars when pH of buffer A is 7.0 using the measuring device of (4) The results of examining the substrate specificity of the amino acid oxidase-immobilized column are shown in Table 2. The values in the table are relative values when the response to fructosyl valine is 100.
フルクトシルバリルヒスチジンとフルクトシルバリンに特異的で、α,ε−フルクトシルリジンにはほとんど応答せず、各種アミノ酸と糖類には全く応答しなかった。従って、糖化ヘモグロビン測定において、糖化ヘモグロビンのプロテアーゼによる分解がかなり進んだ場合にアミノ酸に由来する正の誤差や血中グルコースに由来する正の誤差が生じる可能性はないので、これらを補正する必要はない。 It was specific for fructosyl valylhistidine and fructosyl valine, hardly responded to α, ε-fructosyl lysine, and did not respond to various amino acids and saccharides at all. Therefore, in the measurement of glycated hemoglobin, there is no possibility that a positive error derived from amino acids or blood glucose will occur if the degradation of glycated hemoglobin by proteases has progressed considerably. Absent.
（６）グルコースとフルクトシルバリンの同時測定
（４）の測定装置を利用して、２、５、１０ｍＭのグルコース及び１０、２０、５０、１００μＭのフルクトシルバリンを各５μｌ注入し、検出値を得た。
(6) Simultaneous measurement of glucose and fructosyl valine Using the measuring device of (4), 5 μl each of 2, 5, 10 mM glucose and 10, 20, 50, 100 μM fructosyl valine were injected and detected. Got the value.
それぞれの検量線を以下に示す。ただしＹは検出値、Ｘは試料中の濃度、ｒは相関係数である。 Each calibration curve is shown below. Where Y is the detected value, X is the concentration in the sample, and r is the correlation coefficient.
グルコース電極
グルコース検量線
Ｙ（ｎＡ）＝６．７４Ｘ（ｍＭ）−０．２８ ｒ＝１．００００
フルクトシルバリン検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．００Ｘ（μＭ）＋０．００
糖化ペプチド電極
グルコース検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．００Ｘ（ｍＭ）＋０．００
フルクトシルバリン検量線
Ｙ（ｎＡ）＝０．０３５Ｘ（μＭ）＋０．０８７ ｒ＝０．９９９２
この測定装置を用いてグルコース５ｍＭとフルクトシルバリン８０μＭの混合溶液を測定したところ、グルコース電極では３４．１ｎＡの応答値を、フルクトシルペプチド電極では２．８７ｎＡの応答値を得た。
Glucose electrode Glucose calibration curve Y (nA) = 6.74X (mM) -0.28 r = 1.0000
Fructosylvaline calibration curve Y (nA) = 0.00X (μM) +0.00
Glycated peptide electrode Glucose calibration curve Y (nA) = 0.00X (mM) +0.00
Fructosylvaline calibration curve Y (nA) = 0.035X (μM) +0.087 r = 0.9992
When a mixed solution of glucose 5 mM and
グルコースの濃度ｘ１は、式ｘ１＝（ｙ１−ｂ１１）／ ａ１１よりｘ１＝ ５．０１ｍＭ、またフルクトシルバリンの濃度ｘ２は、式ｘ２＝（ｙ２−ｂ２２）／ ａ２２よりｘ２＝ ８０．０μＭ と求めることができた。 The concentration x 1 of glucose is x 1 = 5.01 mM from the formula x 1 = (y 1 −b 11 ) / a 11 , and the concentration x 2 of fructosyl valine is expressed by the formula x 2 = (y 2 −b 22 ) / A 22 to obtain x 2 = 80.0 μM.
フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体を用いた場合には、グルコースに対して応答しないため、差演算を行わずに正確に試料中のフルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドを測定できる。 When the immobilized fructosyl peptide oxidase is used, since it does not respond to glucose, fructosyl amino acid or fructosyl peptide in the sample can be accurately measured without performing a difference calculation.
本発明によれば、血液検体中の安定糖化ヘモグロビンとグルコースを簡便且つ正確に同時に定量することができ、糖尿病の検査を容易に行うことができる。 According to the present invention, stable glycated hemoglobin and glucose in a blood sample can be quantified easily and accurately at the same time, and a test for diabetes can be easily performed.
１ 緩衝液槽
２ 緩衝液送液ポンプ
３ ダンパー
４ 計量バルブ
５ 計量ループ
６ 試料管
７ 試料吸引ニードル
８ 廃棄ポット
９ 洗浄液槽
１０ バルブ
１１ バルブ
１２ シリンジポンプ
１３ 恒温槽
１４ タンパク質分解酵素固定化カラム
１５ 混合用配管
１６ フロー型比色計
１７ 第１の固定化酵素カラム
１８ 過酸化水素電極
１９ 第２の固定化酵素カラム
２０ 過酸化水素電極
２１ 背圧コイル
２２ 廃液ボトル
２３ 廃液ボトル
２４ 緩衝液槽
２５ 緩衝液送液ポンプ
２６ 恒温化用配管
２７ 透析モジュール
DESCRIPTION OF
10
Claims (5)
糖化ヘモグロビンを含む検体をタンパク質分解酵素で処理する工程；
グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体と、グルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のグルコース濃度を電気化学的に検知する工程；
フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体と、フルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のフルクトシルバリルヒスチジンを電気化学的に検知する工程；
全ヘモグロビンを検知する機構を用いて、検体中の全ヘモグロビンを検知する工程；
フルクトシルバリルヒスチジンの検知結果とヘモグロビンの検知結果に基づきＨｂＡ１ｃを得る工程；および
全血／血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血／血球グルコースを血漿グルコースに補正する工程。 A method for analyzing glucose and glycated hemoglobin in a sample, comprising the following steps:
Treating a sample containing glycated hemoglobin with a proteolytic enzyme;
A step of electrochemically detecting a glucose concentration in a specimen using an immobilized body in which an enzyme that catalyzes an oxidation reaction of glucose is immobilized, and a mechanism for detecting an electrochemically active substance that is increased or decreased by the glucose oxidation reaction ;
Full torque tosyl immobilized and body immobilized fructosyl peptide oxidase which valyl acting on histidine, full in a sample using a mechanism for detecting an electrochemically active material which increases or decreases the oxidation of full torque tosyl peptide Rukutoshirubariru Electrochemically detecting histidine;
Detecting all hemoglobin in the sample using a mechanism for detecting all hemoglobin ;
Step of correcting and whole blood / blood glucose and hemoglobin detection result to-out based whole blood / blood glucose plasma glucose; full torque tosyl the valyl histidine detection result and hemoglobin detection result obtained based on the Evaluation Technical H BA1c step .
糖化ヘモグロビンを含む検体をタンパク質分解酵素で処理する工程；Treating a sample containing glycated hemoglobin with a proteolytic enzyme;
グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体と、グルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のグルコース濃度を電気化学的に検知する工程；A step of electrochemically detecting a glucose concentration in a specimen using an immobilized body in which an enzyme that catalyzes an oxidation reaction of glucose is immobilized, and a mechanism for detecting an electrochemically active substance that is increased or decreased by the glucose oxidation reaction;
フルクトシルＬ−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体と、フルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを電気化学的に検知する工程；Immobilization of immobilized fructosyl amino acid oxidase acting on fructosyl L-valine or immobilized fructosyl peptide oxidase acting on fructosylvalylhistidine, and oxidation reaction of fructosyl amino acid or fructosyl peptide Electrochemically detecting fructosyl L-valine or fructosylvalylhistidine in a specimen using a mechanism for detecting an electrochemically active substance that increases or decreases by
全ヘモグロビンを検知する機構を用いて、検体中の全ヘモグロビンを検知する工程；Detecting all hemoglobin in the sample using a mechanism for detecting all hemoglobin;
検体中グルコースとフルクトシルＬ−バリンまたは検体中グルコースとフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果に基づき検体中グルコースの影響を排除したフルクトシルＬ−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定値を得る工程；Obtaining a measurement value of fructosyl L-valine or fructosyl valyl histidine excluding the influence of glucose in the sample based on the detection result of glucose in the sample and fructosyl L-valine or glucose in the sample and fructosyl valyl histidine;
フルクトシルＬ−バリンの前記測定値とヘモグロビンの検知結果またはフルクトシルバリルヒスチジンの前記測定値とヘモグロビンの検知結果に基づきＨｂＡ１ｃを得る工程；およびObtaining HbA1c based on the measurement value of fructosyl L-valine and the detection result of hemoglobin or the measurement value of fructosyl valylhistidine and the detection result of hemoglobin; and
全血／血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血／血球グルコースを血漿グルコースに補正する工程。A step of correcting whole blood / blood cell glucose to plasma glucose based on detection results of whole blood / blood cell glucose and hemoglobin.
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