JP4619459B2 - 多糖類をタンパクに結合する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、複合ワクチンを調製する際のリンカーとしてのアミノチオール化合物の使用に関する。
多糖類又は他のハプテンを免疫原性タンパク又はペプチド又は他の生体有機分子に共有結合することは、例えばb型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)(髄膜炎、中耳炎)、百日咳菌(Bordetella pertussis)(百日咳)、破傷風菌(Clostridium tetani)(破傷風)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis、髄膜炎、中耳炎)および肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae、肺炎、髄膜炎、中耳炎)のような病原体に対する有効なワクチンを調製する適当な方法であることが証明されている。そのような複合ワクチンは、例えば、米国特許第4,762,713号に述べられている。この米国特許に従えば、多糖類と担体タンパク間の結合は、タンパク中のアミノ基による多糖類のアルデヒドあるいはヘミアセタール官能基の還元的アミノ化によって実現される。多糖類をタンパク物質に共有結合するもうひとつの適当な方法は、ヒドロキシル官能基を活性化して、タンパクに結合することができる官能基を含む側鎖を生じさせることである。このようにして、多糖類を活性化し、その後システアミンのようなチオール含有基に結合して、それをタンパク中の活性化されたアミノ酸に結合することができる。オリゴ糖をタンパクに結合するためのシステアミンの使用は、Verheulら(Infect.Immun.59(1991)843-851)が記述している。この使用は、以下のスキームに従って、カルボキシル基をN-スクシニミジルエステル(NSu)に転換することによる糖類の活性化を含む：
Ps-COOH+XONS→Ps-CO-ONSu+HOX (1)
Ps-CO-ONSu+H2N-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2→
Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2+HONSu (2)
Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2+DTT-rd→
→Ps-CO-NH-CH2-CH2-SH+HS-CH2-CH2-NH2+DTT-ox (3)
Ps-CO-NH-CH2-CH2-SH+Br-CH2-CO-NH-Pr→
Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-NH-Pr+HBr (4)
ここでPsは多糖類であり、Prはタンパクまたはペプチドを表わし、DTT-rdは還元された(ジチオール)形態、DTT-oxは酸化された(１，２-ジチアン)形態のジチオトレイトールを表わす。しかし、このアプローチは多糖類中にカルボキシル基が存在する必要があるが、多くの生物学的に興味深い多糖類はカルボキシル基を含まない。
多糖類は、以下のスキームに従った臭化シアンによる活性化により、ヒドロキシル基以外の官能基が存在する必要なしにシステアミン様のリンカーに有効に結合しうることが認められた。
Ps-OH+Br-CN→Ps-O-CN+HBr (5)
Ps-O-CN+H2N-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2→
→Ps-O-C(=NH)-HN-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2 (6)
反応(5)は、環状イミドカルボネートを生じる第二のヒドロキシル基との反応を含む副反応を伴い、反応(6)と同様にアミノ基との結合をもたらしうる。
それ故、本発明は、多糖類を別の生体高分子に結合する方法であって、ハロゲン化シアンで該多糖類を活性化し、該活性化された多糖類を式１のアミノチオールリンカー：
H2N-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 1
(ここでA、m、p、q、R1、R2、R3、R4、R5、R6、及びR7は、添付の請求項1に定義されている通りである)と反応させて、式2のチオール化多糖類
Ps-O-C(=NH)-NH-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 2
(Psは多糖類残基であり、A、m、p、q、R1、R2、R3、R4、R5、R6、及びR7は上に定義した通りである)を産生せしめ、その後、必要に応じて保護基R7を除去し、チオール化多糖類を活性化生体高分子と反応させる方法に関する。好ましいリンカーは、請求項3〜8に定義されている通りである。リンカーの適当な例は、システアミンあるいはその酸化形態であるシスタミンである。
この方法は、ほとんどの細菌多糖類を含めた大部分の多糖類に対して満足に作用する。しかし、１９Ｆ型肺炎球菌莢膜多糖類のような一部の多糖類とは有用な度合の結合が認められない。
本発明者は特定の理論に拘泥することを望むものではないが、システアミン結合の不完全性あるいは失敗について考えられるひとつの説明は、いったん形成されたシステアミン付加物が分子内置換によって元の物質に戻ってしまうのではないかということである。
さらに、式3のアミノ-チオールリンカー(式1でq=1の場合)
H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 3
(ここで、A、m、R1、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は添付の請求項２に定義されている通りである)を用いることにより、不十分な結合という問題が解決できることが認められ、好ましい実施態様が添付の請求項の中に述べられている。これらのリンカーは、システアミン結合の収率が改善されており(反応(6)および(3))、任意の多糖類と有効な結合をもたらす。
式３に記載のアミノ-チオールリンカーは、4-アミノブタンチオール、5-アミノペンタンチオール、2-(2-アミノエチルアミノ)エタンチオール等の、鎖中に少なくとも４個の炭素原子と必要に応じて１個以上の複素原子を持った直鎖又は分枝α,ω-アミノチオール誘導体であり得る。好ましい化合物は、H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-が、グリシン、アラニン、β-アラニン、セリン、グルタミン、γ-アミノ酪酸、リシン及びε-アミノカプロン酸のようなアミノ酸、又はNα-グリシル-リシンのようなオリゴペプチドならびにNα-ペプチジル-α,ω-ジアミノ酸のより高級な同族化合物である。H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-基は、グリシルグリシンのような直鎖オリゴペプチドでもよい。
式1及び3の両リンカーにおいて、A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7基は、例えば、2-アミノエタンチオール(システアミン)、2-メルカプトエタノール、1,2-エタンジチオール、2-アミノ-2-メチルプロパンチオール、3-アミノプロパンチオール、2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンチオール、モノチオ-及びジチオ-トレイトールまたは-エリトリトール、システイン、ホモシステイン、ならびにそれらのエステル又はアミド等から誘導されうる。式３に記載の最も好ましい化合物は、N-グリシル-システアミン及びそのジスルフィド前駆体N,N’-ジグリシル-シスタミンである。
N,N’-ジグリシルシスタミンおよびN-アラニル-S-アセチルシステアミンのような、式１および３の化合物の大半は、放射線防護物質として第WO85/00167号から既知である。
本発明の方法によって複合できる生体高分子には、ヒドロキシル、アミノ及び/又はメルカプト基を含む任意の高分子(分子量＞１ｋＤａ)天然又は天然様化合物が含まれる。特に、そのような生体高分子には、天然又は修飾多糖類、天然、修飾又は合成ペプチド及びタンパク、リポタンパク、糖タンパク及び核酸が含まれる。最も好ましくは、本発明のリンカーは１個以上の多糖類をタンパク又はペプチドに複合するために使用される。
複合できる多糖類には、デンプン様のセルロース物質が含まれるが、本方法は特に、ハプテン又は免疫原である微生物多糖類を複合するのに適している。その例は、たとえばデンマーク式1、3、4、6A、6B、7S、9V、14、18C、19F及び23Fを含む様々なタイプの肺炎球菌莢膜多糖類、B型連鎖球菌多糖類、肺炎杆菌の莢膜多糖類、b型を含むインフルエンザ菌多糖類、髄膜炎菌(グループA及びC)、緑膿菌又は大腸菌である。本明細書で用いる「多糖類」なる語には、糖を含有するポリマー及びオリゴマーが含まれ、これらはグリコシド結合のみを含有しているか、ホスホジエステル結合若しくは他の結合も含有している。多糖類は同時に、酸性基、リン酸基、アミノ基、糖アルコールおよびアミノ酸のような非糖部分を含んでいてもよく、またそれらは解重合されいてもよく、解重合されていなくてもよい。例示として、肺炎球菌莢膜多糖類6B、14、19F及び23型並びにb型インフルエンザ菌莢膜多糖類の反復単位を以下に示す:
Pn6B→2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→4)-D-リビトール-5-(PO4→
Pn14→4)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Glcp*NAc-(1→3)-β-D-Galp-(1→*:β-D-Galp(1→4)側鎖基を持つ
Pn19F→4)-β-D-ManpNAc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-α-L-Rhap-(1-PO4→
Pn23F→4)-β-D-Glcp#-(1→4)-β-D-Galp&-(1→4)-β-L-Rhap-(1→#:ホスホグリセリル-(→3)側鎖基を持つ
&:α-L-Rhap-(1→2)側鎖基を持つ
Hib→3)-β-D-Ribf-(1→1)-D-リビトール-5-(PO4→
対象となる細菌多糖類のレビューは次の文献中に認められる：Lennart KenneとBengt Lindberg、“Bacterial polysaccharides”in The polysaccha-rides,Vol.2,Ed.G.O.Aspinall,1983,Ac.Press,p.287-363。
本発明の方法によって複合できるタンパクとペプチドは、免疫原性および非免疫原性タンパクを含む。その例は、血清アルブミン、ならびにジフテリア毒素、破傷風トキソイド、肺炎球菌溶血毒素、ニューモライソイド(pneumolysoid)のような種々の細菌毒素及びトキソイド、シュードモナス、ブドウ球菌、百日咳菌、大腸菌のような他の微生物の毒素、必要に応じて無毒化されたいわゆる交叉反応物質(たとえばCRM197)およびヘモシアニンである。また髄膜炎菌又は百日咳菌のような生物の外膜タンパクもその例である。タンパクはまた、別のバイオマテリアルを所望の部位に運搬するために使用される抗体でもよい。タンパクとペプチドは独立した免疫原として使用することができ、あるいはハプテン等の他の物質の免疫原性を高めるためにも使用できる。それらは天然又は無毒化又は突然変異型のいずれでもよい。タンパクは一般にペプチドよりも分子量の高い物質を意味するが、本明細書においては、「ペプチド」と「タンパク」の語は、区別せずに用いる。
式３のリンカーは、第EP-A-131500号に述べられているもののような、それ自体公知の方法によって調製できる。例えば、リンカー化合物は、A基の性質に従って、2-アミノエタンチオール(システアミン)、3-アミノプロパンチオール又はシステインのような適当なアミノ-チオール、ジチオールあるいはメルカプトアルコール(ここで、チオール基は、例えば、アシル基又はジスルフィド基によって保護されていることが好ましい)から調製できる。A基が-(Z-CHR1-CR2R3-)n-の式を持つ鎖を含んでいれば、これを適当な条件下で、例えばエチレンイミン、酸化プロピレンと反応させることによって導入し、所望する数値のnを持つ付加物を得ることができる。あるいは、-(Z-CHR1-CR2R3-)n-がオリゴペプチド鎖であれば、従来のペプチド合成法によってこの基を導入することができる。末端基H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-は、適当な活性化された化合物を前駆体HA-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7と反応させることによって導入できる。H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-がグリシン、アラニンあるいはリシンのようなアミノ酸残基である場合には、やはり従来の方法によって結合することができる。
アミノ-チオールリンカーの使用は必要に応じて活性化された第一の生体高分子、特に多糖類に、好ましくはチオール官能基上に保護基を持つリンカーを結合することを含む。活性化は、多糖類のカルボキシル基(存在する場合には)を、例えばカルボジイミドによって活性化すること、又は、例えば酸化によってアルデヒド基を導入することのような公知の方法を用いて実施することができる。好都合なことには、臭化シアンとの反応によって結合が行われる。これは反応性イソシアネート基の存在を生じさせ、この反応性イソシアネート基はリンカーのアミノ官能基と容易に反応してイソウレウム(isoureum)結合を生じる。CNBrによる活性化は、反復単位(RU)(多糖類では：反復モノ又はオリゴ糖単位)当り少なくとも0.1活性化部位が導入されるようにして実施される。結合は、好ましくは1-10RU当り１アミノ官能基を与える。
チオール保護基が存在する場合には、続いて、例えば、保護ジスルフィドを還元剤、例えば2-メルカプトエタノール若しくはジチオトレイトールのようなメルカプタン、又はトリアルキルホスフィンと反応させることによって除去する。還元は、好ましくは5-15RU当り１チオール基を生じる。チオール官能基はその後、好ましくはタンパクのリシン残基に結合した、ブロモアシル基、ヨードアシル基、ピリジルジチオ基又はマレイミド-アルキル(又は-アリール又は-シクロアルキル)基のような第二の生体高分子の活性な官能基と反応することができる。活性化された官能基は、N-スクシニミジル-ブロモアセテート若しくはN-(ω-(マレイミドアルキルオキシ)スクシニミドとの反応のようなタンパクの化学的なポスト修飾によって、又は既に活性な官能基を含む１個以上のアミノ酸前駆体を用いたペプチド合成によって導入することができる。
中間産物と最終複合体は、クロマトグラフィー(イオン交換、疎水的相互作用あるいはアフィニティー)、ゲル濾過、透析、膜濾過、硫化アンモニウムまたはアルコール等を用いた選択的沈降反応等のようなそれ自体公知の方法を用いて、必要に応じて精製することができる。
複合体は、適当なアジュバント、希釈剤、安定剤、緩衝剤等を用いて、予防接種の分野において公知の方法でワクチン製剤に組み込むことができる。ワクチンは、病原体からヒトを保護する、又は動物を保護するのに使用することができる。あるいは、適当な生体高分子の複合体は、ヒト若しくは動物の治療において、又は診断薬として使用することもできる。
本発明の方法のもうひとつの有益な用途は、例えばアフィニティークロマトグラフィーによる抗原、抗体および他の生物学的に関連する分子の精製を目的とした、又は免疫測定法等における使用を目的とした、デキストランアガロース、セファロースのような多糖類へのタンパクおよびペプチドの固定に関する。
例
例では次の略語を使用する：
Boc tert-ブチルオキシカルボニル
BrAC ブロモアシル
DTE ジチオエリトリトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
Gly グリシル
GP(C) ゲル浸透(クロマトグラフィー)
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
m.w. 分子量
Nsu N-スクシニミジル
ONSu N-オキシスクシニミジル
PBS リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水中10mMリン酸ナトリウム、pH7.2
Pn 肺炎球菌／肺炎球菌の
PS 多糖類
RP 逆相
RU 多糖類の反復単位
TNBS トリニトロベンゼンスルホン酸
TTd 破傷風トキソイド
注：肺炎球菌血清型の分類にはデンマーク式命名法を使用する；アメリカ式命名法を括弧内に示す。
例１
リンカーの調製
N,N’-ビス[tert-ブチルオキシカルボニルグリシル]シスタミン(N,N’-ビス[Boc-Gly]シスタミン)
N,N-ジメチルアセトアミド(42mL)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(14.6mL、83.8mmol)を、N’-スクシニミジルN-(tert-ブチルオキシカルボニル)グリシネート、Boc-Gly-ONSu(11.4g、41.9mmol)及びシスタミンジヒドロクロリド(3.77g、16.7mmol)の混合物に加えた。懸濁液を室温で一晩撹拌した(シスタミンジヒドロクロリドは徐々に数時間で溶解した)。透明な溶液を水(16.7mL)で希釈し、相の分離を生じさせた。１時間撹拌した後、ジエチルエーテル(170mL)を加え、得られた混合物を水(170mL)で洗浄した。相の分離後、水相をジエチルエーテル(85mL)で抽出した。有機相を集めて、1M NaHCO3(3×85mL)、水(3×85mL)および1M NaH2PO4(3×85mL)で連続的に洗浄し、MgSO4で乾燥した。MgSO4を濾過によって除去し、濾液を真空中で濃縮し、N,N’-ビス[Boc-Gly]シスタミン(4.81g、62％)をガラス状固体として生成した。RP-HPLCは単一の鋭いピークを示す。
N,N’-ビスグリシルシスタミン(ビストリフルオロアセテート)
前の段階で得られたN,N’-ビス[Boc-Gly]シスタミン(4.81g、10.3mmol)をジクロロメタン(16.7mL)に溶解した。溶液を撹拌し、トリフルオロ酢酸(16.7mL)を加えた。約５分間イソブテンと二酸化炭素の形成が肉眼で認められた。合計30分の期間後、反応混合物を、ジエチルエーテル(170mL)とペンタン(170mL)を強く撹拌した混合物に一滴ずつ加えた。撹拌を終了し、沈降物を５分間沈降させた。傾瀉してジエチルエーテル／ペンタンを除去し、ジエチルエーテル(50mL)とペンタン(50mL)の混合物で固形物を洗浄した。再び傾瀉してジエチルエーテル／ペンタンを除去した。吸湿性固形物を水(40mL)に溶解した。室温で真空下に極微量のジエチルエーテル／ペンタンを除去した。その後、溶液を凍結乾燥してN,N’-ビスグリシルシスタミンビストリフルオロアセテート(4.93g、97％)を生成した。最後に、化合物を1.0Mの濃度で水に溶解し、-20℃で凍結保存した。RP-HPLCは単一の鋭いピークを示す。
実施例２
N,N’-ビスグリシルシスタミンを用いたPn PS 19F/TTd複合ワクチンの調製
Pn PS 19Fの部分的解重合
肺炎球菌多糖類の部分的解重合のために、音波破砕工程を使用した。肺炎球菌多糖血清型19F(アメリカ式19、RIVM、ロット番号19FEXP2A/S13；275mg、乾燥重量)を水20mLに溶解し、約15分間ずつ合計125分間、1/4”マイクロチップ(Branson Sonifier250、出力レベル7、50％デューティサイクル)で音波破砕した。PSの分子量は約980から49kDa(約1660〜83RU)に低下した。溶液を0.45μm膜で濾過し、PSの回収率は94％であった(アントロンアッセイ)。
N,N’-ビスグリシルシスタミンによるPn PS 19F(49kD)の修飾
修飾のために、PS 19F水溶液3.25mL(6.15mg/mL)を等量の1M炭酸ナトリウム溶液(pH〜12)と混合した。混合物を約2℃に冷却した。撹拌しながら、CNBr試薬(アセトニトリル中100mg/mL)250μLを加えた。10分後、溶液を約4℃でSephadex G25M(Pharmacia)でのゲル濾過に供した(溶出剤：0.2M炭酸-重炭酸ナトリウム緩衝液pH9.25)。PS含有分画を、予め冷却しておいた0.2M炭酸-重炭酸ナトリウム緩衝液pH9.25/1.0M N,N’-ビスグリシルシスタミン(ビストリフルオロアセテート)、1/1、v/v溶液4.73mLと混合した。pHが6.5に低下し、6M水酸化ナトリウムで9.3に再調整した。１時間半の間、時々pHを調べ、必要に応じて再調整した。その後、混合物を約4℃で一晩放置した。最後に、サンプルを、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH8と緩衝液交換し、Centriprep-10(Amicon)濃縮器で2mLの容量に濃縮した。アミノ基を分析すると1NH2/4.2RUを示した(TNBSアッセイ)。
N,N’-ビス[グリシル]シスタミン修飾Pn PS 19Fの還元
N,N’-ビス[グリシル]シスタミン修飾Pn PS 19F(5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液1.75mL、pH8中13mg)を、11倍モル過剰のDTE(PSに導入されたアミノ基の数に基づく)を加えて還元した。室温で一晩インキュベーションした後、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7を溶出剤として用いて、サンプルをSephadex G25M(Pharmacia)でのゲル濾過に供し、Centriprep-10で3.5mLの容量に濃縮した。スルフヒドリル基についての分析は1SH/8.5RUを示した(エルマンアッセイ)。
破傷風トキソイドのブロモアセチル化
破傷風トキソイド(RIVM)をSephadex G25Mでゲル濾過して緩衝液交換した(溶出剤：5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8)。タンパク中のリシンの側鎖のアミノ基を、６倍過剰(TTd内のリシンの数に基づく)のN-スクシニミジルブロモアセテートを加えて修飾した。混合物を室温で１時間半インキュベーションし、Sephadex G25Mのカラムに充填した(溶出剤：5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7)。タンパク含有分画を分析すると、アミノ基の40％(当初量：33.5NH2/モルTTd)が修飾されたことを示した(TNBSアッセイ)。
N-(グリシル)システアミン修飾Pn PS 19Fとブロモアセチル化破傷風トキソイドの複合
N-(グリシル)システアミン修飾Pn PS 19F(11.5mg)を室温でBrAc-TTd(5mg)と、PS/TTdモル比7:1で混合した。GP-HPLC分析によって複合をモニターした(Shodex OHpak KB-805及び804をシリーズで、PBSを溶出剤とし、1mL/分で35℃において)。約110時間後、PS上の残りのチオール基を10倍モル過剰のブロモアセトアミド(還元前のPSに関して測定した、当初のアミノ基含量に基づく)により室温で６時間キャップした。BrAc-TTd上の残りのブロモアセチル基を2.5倍モル過剰の2-アミノエタンチオール(前に加えたブロモアセトアミドの量に基づく)により室温で一晩キャップした。複合体を、PBSを溶出剤として使用し、0.8mL／分の流量で、Sephacryl S-400HR(Pharmacia)カラム(100×1.6cm)での低圧GPCにより室温で精製した。適当な分画(8mL)を炭水化物とタンパク含量に関して分析し(アントロンおよびローリーアッセイ)、滅菌濾過して、4℃で保存した。
実施例３
シスタミンを用いたPn PS 6B/TTd複合ワクチンの調製
Pn PS 6Bの部分的解重合
肺炎球菌多糖類血清型6B(アメリカンタイプ26、ATCC、ロット番号2008862;107mg、乾燥重量)を水17mLに溶解し、15分間ずつ合計150分間、１／４”マイクロチップ(Branson Sonifier250、出力レベル６、50％デューティサイクル)で音波破砕した。PSの分子量は約1350から46kDa(約2,000から65RU)に低下した。溶液を0.45μm膜で濾過し、PSの回収率は80％であった(デュボワアッセイ)。
シスタミンによるPn PS 6B(46kD)の修飾
修飾のために、PS 6B溶液4mLを等量の1M炭酸ナトリウム溶液(pH〜12)と混合した。混合物を約2℃に冷却した。撹拌しながら、CNBr試薬(アセトニトリル中100mg/mL)170μLを加えた。10分間反応させた後、溶液を約4℃でSephadex G25Mでのゲル濾過に供した(溶出剤：0.2M炭酸-重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.25)。PS含有分画を、あらかじめ冷却しておいた0.2M炭酸-重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.25中0.5Mシスタミンジヒドロクロリド3.25mLと混合した。pHが8.7に低下し、0.3M水酸化ナトリウムでpH9.25に再調整した。混合物を１時間半pH9.25に保持し、必要に応じてpHを矯正した。その後、サンプルを約４℃で一晩放置した。サンプルを、5mM EDTAを含む、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8と緩衝液交換し、その後Centriprep-10(Amicon)濃縮器で2.2mLの容量に濃縮した。第一級アミノ基の分析は1NH2／3RUを示した(TNBSアッセイ)。
シスタミン修飾Pn PS 6Bの還元
10倍モル過剰のDTE(PSに関して測定したアミノ基に基づく)を加えて、シスタミン変性Pn PS 6B(5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8中16mg)を還元した。室温で一晩インキュベーションした後、サンプルを、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7と緩衝液交換し、Centriprep-10で1.8mLの容量に濃縮した。スルフヒドリル基についての分析は1SH/8RUを示した(エルマンアッセイ)。
破傷風トキソイドのブロモアセチル化
破傷風トキソイド(RIVM)を、Sephadex G25Mでのゲル濾過によって緩衝液交換した(溶出剤：5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8)。タンパク中のリシンの側鎖のアミノ基を、6倍過剰(TTd内のリシンの数に基づく)のBrAc-ONSuを加えて修飾した。該混合物を室温で2時間インキュベーションし、Sephadex G25Mのカラムにかけた(溶出剤：5mM EDTA0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7)。タンパク含有分画を分析すると、すべてのNH2基の55％が修飾されたことを示した(TNBSアッセイ)。
システアミン修飾Pn PS 6Bとブロモアセチル化破傷風トキソイドの複合
システアミン修飾Pn PS 6B(12mg)を室温でBrAc-TTd(5mg)と、PS/TTdモル比7.5:1で混合した。GP-HPLC分析によって複合をモニターした(Shodex OHpak KB-805および804をシリーズで、PBSを溶出剤とし、1mL/分で35℃において)。91時間後、PS上に残存するチオール基を10倍モル過剰のブロモアセトアミド(還元前のPSに関して測定した、当初のアミノ基含量に基づく)により室温で6時間キャップした。BrAc-TTd上の残りのブロモアセチル基を2.5倍モル過剰の2-アミノエタンチオール(前に加えたブロモアセトアミドの量に基づく)により室温で一晩キャップした。溶出剤としてPBSを使用した、0.8mL/分の流量によるSephacryl S-400HR(Pharmacia)カラム(100×1.6cm)での低圧GPCにより、室温で複合体を精製した。適当な分画(8mL)を炭水化物とタンパク含量に関して分析し(デュボワおよびローリーアッセイ)、滅菌濾過して、４℃で保存した。
多糖類又は他のハプテンを免疫原性タンパク又はペプチド又は他の生体有機分子に共有結合することは、例えばb型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)(髄膜炎、中耳炎)、百日咳菌(Bordetella pertussis)(百日咳)、破傷風菌(Clostridium tetani)(破傷風)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis、髄膜炎、中耳炎)および肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae、肺炎、髄膜炎、中耳炎)のような病原体に対する有効なワクチンを調製する適当な方法であることが証明されている。そのような複合ワクチンは、例えば、米国特許第4,762,713号に述べられている。この米国特許に従えば、多糖類と担体タンパク間の結合は、タンパク中のアミノ基による多糖類のアルデヒドあるいはヘミアセタール官能基の還元的アミノ化によって実現される。多糖類をタンパク物質に共有結合するもうひとつの適当な方法は、ヒドロキシル官能基を活性化して、タンパクに結合することができる官能基を含む側鎖を生じさせることである。このようにして、多糖類を活性化し、その後システアミンのようなチオール含有基に結合して、それをタンパク中の活性化されたアミノ酸に結合することができる。オリゴ糖をタンパクに結合するためのシステアミンの使用は、Verheulら(Infect.Immun.59(1991)843-851)が記述している。この使用は、以下のスキームに従って、カルボキシル基をN-スクシニミジルエステル(NSu)に転換することによる糖類の活性化を含む：
Ps-COOH+XONS→Ps-CO-ONSu+HOX (1)
Ps-CO-ONSu+H2N-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2→
Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2+HONSu (2)
Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2+DTT-rd→
→Ps-CO-NH-CH2-CH2-SH+HS-CH2-CH2-NH2+DTT-ox (3)
Ps-CO-NH-CH2-CH2-SH+Br-CH2-CO-NH-Pr→
Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-NH-Pr+HBr (4)
ここでPsは多糖類であり、Prはタンパクまたはペプチドを表わし、DTT-rdは還元された(ジチオール)形態、DTT-oxは酸化された(１，２-ジチアン)形態のジチオトレイトールを表わす。しかし、このアプローチは多糖類中にカルボキシル基が存在する必要があるが、多くの生物学的に興味深い多糖類はカルボキシル基を含まない。
多糖類は、以下のスキームに従った臭化シアンによる活性化により、ヒドロキシル基以外の官能基が存在する必要なしにシステアミン様のリンカーに有効に結合しうることが認められた。
Ps-OH+Br-CN→Ps-O-CN+HBr (5)
Ps-O-CN+H2N-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2→
→Ps-O-C(=NH)-HN-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2 (6)
反応(5)は、環状イミドカルボネートを生じる第二のヒドロキシル基との反応を含む副反応を伴い、反応(6)と同様にアミノ基との結合をもたらしうる。
それ故、本発明は、多糖類を別の生体高分子に結合する方法であって、ハロゲン化シアンで該多糖類を活性化し、該活性化された多糖類を式１のアミノチオールリンカー：
H2N-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 1
(ここでA、m、p、q、R1、R2、R3、R4、R5、R6、及びR7は、添付の請求項1に定義されている通りである)と反応させて、式2のチオール化多糖類
Ps-O-C(=NH)-NH-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 2
(Psは多糖類残基であり、A、m、p、q、R1、R2、R3、R4、R5、R6、及びR7は上に定義した通りである)を産生せしめ、その後、必要に応じて保護基R7を除去し、チオール化多糖類を活性化生体高分子と反応させる方法に関する。好ましいリンカーは、請求項3〜8に定義されている通りである。リンカーの適当な例は、システアミンあるいはその酸化形態であるシスタミンである。
この方法は、ほとんどの細菌多糖類を含めた大部分の多糖類に対して満足に作用する。しかし、１９Ｆ型肺炎球菌莢膜多糖類のような一部の多糖類とは有用な度合の結合が認められない。
本発明者は特定の理論に拘泥することを望むものではないが、システアミン結合の不完全性あるいは失敗について考えられるひとつの説明は、いったん形成されたシステアミン付加物が分子内置換によって元の物質に戻ってしまうのではないかということである。
さらに、式3のアミノ-チオールリンカー(式1でq=1の場合)
H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 3
(ここで、A、m、R1、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は添付の請求項２に定義されている通りである)を用いることにより、不十分な結合という問題が解決できることが認められ、好ましい実施態様が添付の請求項の中に述べられている。これらのリンカーは、システアミン結合の収率が改善されており(反応(6)および(3))、任意の多糖類と有効な結合をもたらす。
式３に記載のアミノ-チオールリンカーは、4-アミノブタンチオール、5-アミノペンタンチオール、2-(2-アミノエチルアミノ)エタンチオール等の、鎖中に少なくとも４個の炭素原子と必要に応じて１個以上の複素原子を持った直鎖又は分枝α,ω-アミノチオール誘導体であり得る。好ましい化合物は、H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-が、グリシン、アラニン、β-アラニン、セリン、グルタミン、γ-アミノ酪酸、リシン及びε-アミノカプロン酸のようなアミノ酸、又はNα-グリシル-リシンのようなオリゴペプチドならびにNα-ペプチジル-α,ω-ジアミノ酸のより高級な同族化合物である。H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-基は、グリシルグリシンのような直鎖オリゴペプチドでもよい。
式1及び3の両リンカーにおいて、A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7基は、例えば、2-アミノエタンチオール(システアミン)、2-メルカプトエタノール、1,2-エタンジチオール、2-アミノ-2-メチルプロパンチオール、3-アミノプロパンチオール、2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンチオール、モノチオ-及びジチオ-トレイトールまたは-エリトリトール、システイン、ホモシステイン、ならびにそれらのエステル又はアミド等から誘導されうる。式３に記載の最も好ましい化合物は、N-グリシル-システアミン及びそのジスルフィド前駆体N,N’-ジグリシル-シスタミンである。
N,N’-ジグリシルシスタミンおよびN-アラニル-S-アセチルシステアミンのような、式１および３の化合物の大半は、放射線防護物質として第WO85/00167号から既知である。
本発明の方法によって複合できる生体高分子には、ヒドロキシル、アミノ及び/又はメルカプト基を含む任意の高分子(分子量＞１ｋＤａ)天然又は天然様化合物が含まれる。特に、そのような生体高分子には、天然又は修飾多糖類、天然、修飾又は合成ペプチド及びタンパク、リポタンパク、糖タンパク及び核酸が含まれる。最も好ましくは、本発明のリンカーは１個以上の多糖類をタンパク又はペプチドに複合するために使用される。
複合できる多糖類には、デンプン様のセルロース物質が含まれるが、本方法は特に、ハプテン又は免疫原である微生物多糖類を複合するのに適している。その例は、たとえばデンマーク式1、3、4、6A、6B、7S、9V、14、18C、19F及び23Fを含む様々なタイプの肺炎球菌莢膜多糖類、B型連鎖球菌多糖類、肺炎杆菌の莢膜多糖類、b型を含むインフルエンザ菌多糖類、髄膜炎菌(グループA及びC)、緑膿菌又は大腸菌である。本明細書で用いる「多糖類」なる語には、糖を含有するポリマー及びオリゴマーが含まれ、これらはグリコシド結合のみを含有しているか、ホスホジエステル結合若しくは他の結合も含有している。多糖類は同時に、酸性基、リン酸基、アミノ基、糖アルコールおよびアミノ酸のような非糖部分を含んでいてもよく、またそれらは解重合されいてもよく、解重合されていなくてもよい。例示として、肺炎球菌莢膜多糖類6B、14、19F及び23型並びにb型インフルエンザ菌莢膜多糖類の反復単位を以下に示す:
Pn6B→2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→4)-D-リビトール-5-(PO4→
Pn14→4)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Glcp*NAc-(1→3)-β-D-Galp-(1→*:β-D-Galp(1→4)側鎖基を持つ
Pn19F→4)-β-D-ManpNAc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-α-L-Rhap-(1-PO4→
Pn23F→4)-β-D-Glcp#-(1→4)-β-D-Galp&-(1→4)-β-L-Rhap-(1→#:ホスホグリセリル-(→3)側鎖基を持つ
&:α-L-Rhap-(1→2)側鎖基を持つ
Hib→3)-β-D-Ribf-(1→1)-D-リビトール-5-(PO4→
対象となる細菌多糖類のレビューは次の文献中に認められる：Lennart KenneとBengt Lindberg、“Bacterial polysaccharides”in The polysaccha-rides,Vol.2,Ed.G.O.Aspinall,1983,Ac.Press,p.287-363。
本発明の方法によって複合できるタンパクとペプチドは、免疫原性および非免疫原性タンパクを含む。その例は、血清アルブミン、ならびにジフテリア毒素、破傷風トキソイド、肺炎球菌溶血毒素、ニューモライソイド(pneumolysoid)のような種々の細菌毒素及びトキソイド、シュードモナス、ブドウ球菌、百日咳菌、大腸菌のような他の微生物の毒素、必要に応じて無毒化されたいわゆる交叉反応物質(たとえばCRM197)およびヘモシアニンである。また髄膜炎菌又は百日咳菌のような生物の外膜タンパクもその例である。タンパクはまた、別のバイオマテリアルを所望の部位に運搬するために使用される抗体でもよい。タンパクとペプチドは独立した免疫原として使用することができ、あるいはハプテン等の他の物質の免疫原性を高めるためにも使用できる。それらは天然又は無毒化又は突然変異型のいずれでもよい。タンパクは一般にペプチドよりも分子量の高い物質を意味するが、本明細書においては、「ペプチド」と「タンパク」の語は、区別せずに用いる。
式３のリンカーは、第EP-A-131500号に述べられているもののような、それ自体公知の方法によって調製できる。例えば、リンカー化合物は、A基の性質に従って、2-アミノエタンチオール(システアミン)、3-アミノプロパンチオール又はシステインのような適当なアミノ-チオール、ジチオールあるいはメルカプトアルコール(ここで、チオール基は、例えば、アシル基又はジスルフィド基によって保護されていることが好ましい)から調製できる。A基が-(Z-CHR1-CR2R3-)n-の式を持つ鎖を含んでいれば、これを適当な条件下で、例えばエチレンイミン、酸化プロピレンと反応させることによって導入し、所望する数値のnを持つ付加物を得ることができる。あるいは、-(Z-CHR1-CR2R3-)n-がオリゴペプチド鎖であれば、従来のペプチド合成法によってこの基を導入することができる。末端基H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-は、適当な活性化された化合物を前駆体HA-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7と反応させることによって導入できる。H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-がグリシン、アラニンあるいはリシンのようなアミノ酸残基である場合には、やはり従来の方法によって結合することができる。
アミノ-チオールリンカーの使用は必要に応じて活性化された第一の生体高分子、特に多糖類に、好ましくはチオール官能基上に保護基を持つリンカーを結合することを含む。活性化は、多糖類のカルボキシル基(存在する場合には)を、例えばカルボジイミドによって活性化すること、又は、例えば酸化によってアルデヒド基を導入することのような公知の方法を用いて実施することができる。好都合なことには、臭化シアンとの反応によって結合が行われる。これは反応性イソシアネート基の存在を生じさせ、この反応性イソシアネート基はリンカーのアミノ官能基と容易に反応してイソウレウム(isoureum)結合を生じる。CNBrによる活性化は、反復単位(RU)(多糖類では：反復モノ又はオリゴ糖単位)当り少なくとも0.1活性化部位が導入されるようにして実施される。結合は、好ましくは1-10RU当り１アミノ官能基を与える。
チオール保護基が存在する場合には、続いて、例えば、保護ジスルフィドを還元剤、例えば2-メルカプトエタノール若しくはジチオトレイトールのようなメルカプタン、又はトリアルキルホスフィンと反応させることによって除去する。還元は、好ましくは5-15RU当り１チオール基を生じる。チオール官能基はその後、好ましくはタンパクのリシン残基に結合した、ブロモアシル基、ヨードアシル基、ピリジルジチオ基又はマレイミド-アルキル(又は-アリール又は-シクロアルキル)基のような第二の生体高分子の活性な官能基と反応することができる。活性化された官能基は、N-スクシニミジル-ブロモアセテート若しくはN-(ω-(マレイミドアルキルオキシ)スクシニミドとの反応のようなタンパクの化学的なポスト修飾によって、又は既に活性な官能基を含む１個以上のアミノ酸前駆体を用いたペプチド合成によって導入することができる。
中間産物と最終複合体は、クロマトグラフィー(イオン交換、疎水的相互作用あるいはアフィニティー)、ゲル濾過、透析、膜濾過、硫化アンモニウムまたはアルコール等を用いた選択的沈降反応等のようなそれ自体公知の方法を用いて、必要に応じて精製することができる。
複合体は、適当なアジュバント、希釈剤、安定剤、緩衝剤等を用いて、予防接種の分野において公知の方法でワクチン製剤に組み込むことができる。ワクチンは、病原体からヒトを保護する、又は動物を保護するのに使用することができる。あるいは、適当な生体高分子の複合体は、ヒト若しくは動物の治療において、又は診断薬として使用することもできる。
本発明の方法のもうひとつの有益な用途は、例えばアフィニティークロマトグラフィーによる抗原、抗体および他の生物学的に関連する分子の精製を目的とした、又は免疫測定法等における使用を目的とした、デキストランアガロース、セファロースのような多糖類へのタンパクおよびペプチドの固定に関する。
例
例では次の略語を使用する：
Boc tert-ブチルオキシカルボニル
BrAC ブロモアシル
DTE ジチオエリトリトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
Gly グリシル
GP(C) ゲル浸透(クロマトグラフィー)
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
m.w. 分子量
Nsu N-スクシニミジル
ONSu N-オキシスクシニミジル
PBS リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水中10mMリン酸ナトリウム、pH7.2
Pn 肺炎球菌／肺炎球菌の
PS 多糖類
RP 逆相
RU 多糖類の反復単位
TNBS トリニトロベンゼンスルホン酸
TTd 破傷風トキソイド
注：肺炎球菌血清型の分類にはデンマーク式命名法を使用する；アメリカ式命名法を括弧内に示す。
例１
リンカーの調製
N,N’-ビス[tert-ブチルオキシカルボニルグリシル]シスタミン(N,N’-ビス[Boc-Gly]シスタミン)
N,N-ジメチルアセトアミド(42mL)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(14.6mL、83.8mmol)を、N’-スクシニミジルN-(tert-ブチルオキシカルボニル)グリシネート、Boc-Gly-ONSu(11.4g、41.9mmol)及びシスタミンジヒドロクロリド(3.77g、16.7mmol)の混合物に加えた。懸濁液を室温で一晩撹拌した(シスタミンジヒドロクロリドは徐々に数時間で溶解した)。透明な溶液を水(16.7mL)で希釈し、相の分離を生じさせた。１時間撹拌した後、ジエチルエーテル(170mL)を加え、得られた混合物を水(170mL)で洗浄した。相の分離後、水相をジエチルエーテル(85mL)で抽出した。有機相を集めて、1M NaHCO3(3×85mL)、水(3×85mL)および1M NaH2PO4(3×85mL)で連続的に洗浄し、MgSO4で乾燥した。MgSO4を濾過によって除去し、濾液を真空中で濃縮し、N,N’-ビス[Boc-Gly]シスタミン(4.81g、62％)をガラス状固体として生成した。RP-HPLCは単一の鋭いピークを示す。
N,N’-ビスグリシルシスタミン(ビストリフルオロアセテート)
前の段階で得られたN,N’-ビス[Boc-Gly]シスタミン(4.81g、10.3mmol)をジクロロメタン(16.7mL)に溶解した。溶液を撹拌し、トリフルオロ酢酸(16.7mL)を加えた。約５分間イソブテンと二酸化炭素の形成が肉眼で認められた。合計30分の期間後、反応混合物を、ジエチルエーテル(170mL)とペンタン(170mL)を強く撹拌した混合物に一滴ずつ加えた。撹拌を終了し、沈降物を５分間沈降させた。傾瀉してジエチルエーテル／ペンタンを除去し、ジエチルエーテル(50mL)とペンタン(50mL)の混合物で固形物を洗浄した。再び傾瀉してジエチルエーテル／ペンタンを除去した。吸湿性固形物を水(40mL)に溶解した。室温で真空下に極微量のジエチルエーテル／ペンタンを除去した。その後、溶液を凍結乾燥してN,N’-ビスグリシルシスタミンビストリフルオロアセテート(4.93g、97％)を生成した。最後に、化合物を1.0Mの濃度で水に溶解し、-20℃で凍結保存した。RP-HPLCは単一の鋭いピークを示す。
実施例２
N,N’-ビスグリシルシスタミンを用いたPn PS 19F/TTd複合ワクチンの調製
Pn PS 19Fの部分的解重合
肺炎球菌多糖類の部分的解重合のために、音波破砕工程を使用した。肺炎球菌多糖血清型19F(アメリカ式19、RIVM、ロット番号19FEXP2A/S13；275mg、乾燥重量)を水20mLに溶解し、約15分間ずつ合計125分間、1/4”マイクロチップ(Branson Sonifier250、出力レベル7、50％デューティサイクル)で音波破砕した。PSの分子量は約980から49kDa(約1660〜83RU)に低下した。溶液を0.45μm膜で濾過し、PSの回収率は94％であった(アントロンアッセイ)。
N,N’-ビスグリシルシスタミンによるPn PS 19F(49kD)の修飾
修飾のために、PS 19F水溶液3.25mL(6.15mg/mL)を等量の1M炭酸ナトリウム溶液(pH〜12)と混合した。混合物を約2℃に冷却した。撹拌しながら、CNBr試薬(アセトニトリル中100mg/mL)250μLを加えた。10分後、溶液を約4℃でSephadex G25M(Pharmacia)でのゲル濾過に供した(溶出剤：0.2M炭酸-重炭酸ナトリウム緩衝液pH9.25)。PS含有分画を、予め冷却しておいた0.2M炭酸-重炭酸ナトリウム緩衝液pH9.25/1.0M N,N’-ビスグリシルシスタミン(ビストリフルオロアセテート)、1/1、v/v溶液4.73mLと混合した。pHが6.5に低下し、6M水酸化ナトリウムで9.3に再調整した。１時間半の間、時々pHを調べ、必要に応じて再調整した。その後、混合物を約4℃で一晩放置した。最後に、サンプルを、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH8と緩衝液交換し、Centriprep-10(Amicon)濃縮器で2mLの容量に濃縮した。アミノ基を分析すると1NH2/4.2RUを示した(TNBSアッセイ)。
N,N’-ビス[グリシル]シスタミン修飾Pn PS 19Fの還元
N,N’-ビス[グリシル]シスタミン修飾Pn PS 19F(5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液1.75mL、pH8中13mg)を、11倍モル過剰のDTE(PSに導入されたアミノ基の数に基づく)を加えて還元した。室温で一晩インキュベーションした後、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7を溶出剤として用いて、サンプルをSephadex G25M(Pharmacia)でのゲル濾過に供し、Centriprep-10で3.5mLの容量に濃縮した。スルフヒドリル基についての分析は1SH/8.5RUを示した(エルマンアッセイ)。
破傷風トキソイドのブロモアセチル化
破傷風トキソイド(RIVM)をSephadex G25Mでゲル濾過して緩衝液交換した(溶出剤：5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8)。タンパク中のリシンの側鎖のアミノ基を、６倍過剰(TTd内のリシンの数に基づく)のN-スクシニミジルブロモアセテートを加えて修飾した。混合物を室温で１時間半インキュベーションし、Sephadex G25Mのカラムに充填した(溶出剤：5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7)。タンパク含有分画を分析すると、アミノ基の40％(当初量：33.5NH2/モルTTd)が修飾されたことを示した(TNBSアッセイ)。
N-(グリシル)システアミン修飾Pn PS 19Fとブロモアセチル化破傷風トキソイドの複合
N-(グリシル)システアミン修飾Pn PS 19F(11.5mg)を室温でBrAc-TTd(5mg)と、PS/TTdモル比7:1で混合した。GP-HPLC分析によって複合をモニターした(Shodex OHpak KB-805及び804をシリーズで、PBSを溶出剤とし、1mL/分で35℃において)。約110時間後、PS上の残りのチオール基を10倍モル過剰のブロモアセトアミド(還元前のPSに関して測定した、当初のアミノ基含量に基づく)により室温で６時間キャップした。BrAc-TTd上の残りのブロモアセチル基を2.5倍モル過剰の2-アミノエタンチオール(前に加えたブロモアセトアミドの量に基づく)により室温で一晩キャップした。複合体を、PBSを溶出剤として使用し、0.8mL／分の流量で、Sephacryl S-400HR(Pharmacia)カラム(100×1.6cm)での低圧GPCにより室温で精製した。適当な分画(8mL)を炭水化物とタンパク含量に関して分析し(アントロンおよびローリーアッセイ)、滅菌濾過して、4℃で保存した。
実施例３
シスタミンを用いたPn PS 6B/TTd複合ワクチンの調製
Pn PS 6Bの部分的解重合
肺炎球菌多糖類血清型6B(アメリカンタイプ26、ATCC、ロット番号2008862;107mg、乾燥重量)を水17mLに溶解し、15分間ずつ合計150分間、１／４”マイクロチップ(Branson Sonifier250、出力レベル６、50％デューティサイクル)で音波破砕した。PSの分子量は約1350から46kDa(約2,000から65RU)に低下した。溶液を0.45μm膜で濾過し、PSの回収率は80％であった(デュボワアッセイ)。
シスタミンによるPn PS 6B(46kD)の修飾
修飾のために、PS 6B溶液4mLを等量の1M炭酸ナトリウム溶液(pH〜12)と混合した。混合物を約2℃に冷却した。撹拌しながら、CNBr試薬(アセトニトリル中100mg/mL)170μLを加えた。10分間反応させた後、溶液を約4℃でSephadex G25Mでのゲル濾過に供した(溶出剤：0.2M炭酸-重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.25)。PS含有分画を、あらかじめ冷却しておいた0.2M炭酸-重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.25中0.5Mシスタミンジヒドロクロリド3.25mLと混合した。pHが8.7に低下し、0.3M水酸化ナトリウムでpH9.25に再調整した。混合物を１時間半pH9.25に保持し、必要に応じてpHを矯正した。その後、サンプルを約４℃で一晩放置した。サンプルを、5mM EDTAを含む、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8と緩衝液交換し、その後Centriprep-10(Amicon)濃縮器で2.2mLの容量に濃縮した。第一級アミノ基の分析は1NH2／3RUを示した(TNBSアッセイ)。
シスタミン修飾Pn PS 6Bの還元
10倍モル過剰のDTE(PSに関して測定したアミノ基に基づく)を加えて、シスタミン変性Pn PS 6B(5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8中16mg)を還元した。室温で一晩インキュベーションした後、サンプルを、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7と緩衝液交換し、Centriprep-10で1.8mLの容量に濃縮した。スルフヒドリル基についての分析は1SH/8RUを示した(エルマンアッセイ)。
破傷風トキソイドのブロモアセチル化
破傷風トキソイド(RIVM)を、Sephadex G25Mでのゲル濾過によって緩衝液交換した(溶出剤：5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8)。タンパク中のリシンの側鎖のアミノ基を、6倍過剰(TTd内のリシンの数に基づく)のBrAc-ONSuを加えて修飾した。該混合物を室温で2時間インキュベーションし、Sephadex G25Mのカラムにかけた(溶出剤：5mM EDTA0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7)。タンパク含有分画を分析すると、すべてのNH2基の55％が修飾されたことを示した(TNBSアッセイ)。
システアミン修飾Pn PS 6Bとブロモアセチル化破傷風トキソイドの複合
システアミン修飾Pn PS 6B(12mg)を室温でBrAc-TTd(5mg)と、PS/TTdモル比7.5:1で混合した。GP-HPLC分析によって複合をモニターした(Shodex OHpak KB-805および804をシリーズで、PBSを溶出剤とし、1mL/分で35℃において)。91時間後、PS上に残存するチオール基を10倍モル過剰のブロモアセトアミド(還元前のPSに関して測定した、当初のアミノ基含量に基づく)により室温で6時間キャップした。BrAc-TTd上の残りのブロモアセチル基を2.5倍モル過剰の2-アミノエタンチオール(前に加えたブロモアセトアミドの量に基づく)により室温で一晩キャップした。溶出剤としてPBSを使用した、0.8mL/分の流量によるSephacryl S-400HR(Pharmacia)カラム(100×1.6cm)での低圧GPCにより、室温で複合体を精製した。適当な分画(8mL)を炭水化物とタンパク含量に関して分析し(デュボワおよびローリーアッセイ)、滅菌濾過して、４℃で保存した。
Claims (7)
- 多糖類を生体高分子に共有結合させる方法であって、活性化された多糖類を式１のアミノチオールリンカー：
H2N-(CH2)m-CHR1-CO-NH-CHR4-CH2-S-R7 1
(ここで、mは、0〜5の整数である；
R1は、水素またはC1〜C4アルキルである；
R4は、水素またはカルボキシルである；
R7は、水素又はチオール保護基又は式：-S-CH2-CHR4-NH-CO-CHR1-(CH2)m-NH2を有する基である)と反応させてチオール化多糖類を産生し、
その後に、R7がチオール保護基である場合、該保護基R7を除去し、該チオール化多糖類を活性化生体高分子と反応させることを具備する方法。 - 前記多糖類が臭化シアンで活性化され、かつチオール化多糖類が、
式２：Ps-O-C(=NH)-NH-(CH2)m-CHR1-CO-NH-CHR4-CH2-S-R7 2
(ここで、Psは多糖類残基であり、m、R1、R4およびR7は請求項1に定義したとおりである)を有する、請求項１に記載の方法。 - R7が、
式：-S-CH2-CHR4-NH-CO-CHR1-(CH2)m-NH2 3
を有する基である、請求項１又は２に記載の方法。 - mが0であり、および／またはR1が水素であり、およびR4が水素である、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
- 多糖類と生体高分子の複合体であって、
式：Ps-O-C(=NH)-NH-(CH 2 ) m -CHR 1 -CO-NH-CHR 4 -CH 2 -S- 4
または Ps-NH-(CH 2 ) m -CHR 1 -CO-NH-CHR 4 -CH 2 -S- 5
(ここで、Psは多糖類残基を表し、m、R1およびR4は、請求項1〜4の何れか1項で定義したとおりである)を有する基に、前記生体高分子が共有結合される複合体。 - 前記生体高分子がペプチドまたはタンパク質である、請求項５に記載の複合体。
- 請求項５または６に記載の複合体を含有するワクチン。
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