JP4601041B2 - Method for detecting genomic methylation - Google Patents
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Description
本発明は、ゲノムDNAのメチル化を検出する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting methylation of genomic DNA.
従来、二次元電気泳動を用いた高等生物のゲノムDNAのスキャニング法（制限酵素ランドマークゲノムスキャニング：RLGS法； Hatada I et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 9523-9527, 1991.、 特許第2794047号公報）においては、第1の制限酵素として切断頻度の低い、8塩基ないし6塩基認識の制限酵素が用いられてきた。これに続く工程では、順次切断頻度の高い制限酵素を用いて、DNA断片が順次短くなるように実験が行われており、一次元目の電気泳動による分画以前に、4塩基を認識する制限酵素を単独で反応させる例はなかった。これは、末端標識されてランドマークとなるDNA断片が膨大な数になり、しかもそれぞれのDNA断片長が極端に短くなると当然考えられてきたためである。したがって、従来のRLGS法における工程の中で、4塩基認識制限酵素を単独で反応に用いるのは、一次元目電気泳動後の工程に限られていた。かかる技術的制約から、RLGS法を利用したゲノムのメチル化の検出においても、これまでは、次の2通りの方法が採用されてきた。 Conventional method of scanning genomic DNA of higher organisms using two-dimensional electrophoresis (Restriction enzyme landmark genome scanning: RLGS method; Hatada I et al, Proc Natl Acad Sci US A. 88, 9523-9527, 1991., Patent No. 2794047), a restriction enzyme having a recognition frequency of 8 to 6 bases having a low cleavage frequency has been used as the first restriction enzyme. In the subsequent process, experiments were performed so that the DNA fragments were sequentially shortened using a restriction enzyme with a high frequency of cleavage. Restriction to recognize 4 bases before fractionation by the first dimensional electrophoresis was performed. There was no example of reacting the enzyme alone. This is because it has been naturally considered that the number of DNA fragments that are end-labeled and become landmarks becomes enormous, and that the length of each DNA fragment becomes extremely short. Therefore, among the steps in the conventional RLGS method, the use of the 4-base recognition restriction enzyme alone for the reaction has been limited to the step after the first-dimensional electrophoresis. Due to such technical limitations, the following two methods have been employed in the detection of genome methylation using the RLGS method.
1つは、第1の制限酵素としてNotIなどの8塩基認識でかつメチル化感受性の制限酵素を用いて、複数の供試材料間におけるRLGSパターンの違いの中からメチル化の影響を受けたスポットを検出する方法である（Hayashizaki Y et al, Nat Genet. 6, 33-40, 1994.）。 First, using a restriction enzyme that recognizes eight bases, such as NotI, and is sensitive to methylation as the first restriction enzyme, spot affected by methylation among the differences in RLGS patterns among multiple test materials (Hayashizaki Y et al, Nat Genet. 6, 33-40, 1994.).
他の1つは、メチル化感受性の4塩基認識の制限酵素を第3の制限酵素として、一次元目電気泳動の後に用いる方法である。 The other is a method in which a methylation-sensitive 4-base recognition restriction enzyme is used as the third restriction enzyme after the first-dimensional electrophoresis.
しかし、後者の方法においては、4塩基認識の制限酵素の価格は非常に高額であるにもかかわらず、第3の制限酵素として用いる場合には、1回の実験で多くのユニット数を用いる必要があり、多大なコストを必要とすることが大きな問題点となった。このため、この方法によって4塩基認識制限酵素サイトのゲノムのメチル化を検出する試みはほとんど行われていないのが現状である。 However, in the latter method, although the price of a 4-base recognition restriction enzyme is very high, when using it as a third restriction enzyme, it is necessary to use a large number of units in one experiment. There is a big problem that it requires a lot of cost. For this reason, there are almost no attempts to detect methylation of the genome of the 4-base recognition restriction enzyme site by this method.
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、RLGS法の原理に基づくゲノムスキャニングにおいて、ゲノムのメチル化を効率的かつ安価に検出する方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a method for efficiently and inexpensively detecting genome methylation in genome scanning based on the principle of the RLGS method. .
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、これまで当然避けられてきた制限酵素の使用方法をあえて採用したところ、意外にも、ゲノムのメチル化の検出を効率的に実施することが可能であることを見出した。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventor has deliberately adopted a method of using a restriction enzyme that has been naturally avoided. It was found that it can be implemented.
従来ゲノムDNAのスキャニング法（RLGS法；Hatada I et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 9523-9527, 1991.、特許第2794047号公報）において通常3回の制限酵素処理を行う工程の中で、まずDNAの切断頻度が低い制限酵素から用い、順次切断頻度が高い制限酵素を用いることが常識となっており、高い切断頻度を持つ制限酵素（例えば、4塩基認識する制限酵素）を、一次元目電気泳動以前に用いることは理論的にも考えられておらず、現実にもそのような実験は行われてこなかった。しかし、本発明者は、高い切断頻度を持つ制限酵素を一次元目電気泳動以前に用いても、ゲノムのメチル化の検出を有効に行うことができることを見出した。 In the conventional genomic DNA scanning method (RLGS method; Hatada I et al, Proc Natl Acad Sci US A. 88, 9523-9527, 1991., Patent No. 2794047) First, it is common sense to use restriction enzymes with a low cleavage frequency of DNA, and then use restriction enzymes with a high frequency of cleavage, and restriction enzymes with a high cleavage frequency (for example, restriction enzymes that recognize four bases) It has not been theoretically considered to be used before the first-dimensional electrophoresis, and such an experiment has not been actually conducted. However, the present inventor has found that genome methylation can be detected effectively even if a restriction enzyme having a high cleavage frequency is used before the first-dimensional electrophoresis.
すなわち、RLGS法において、一次元目電気泳動以前の、第2回目の制限酵素処理において、切断頻度の高い制限酵素であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素でゲノムDNAを切断すると、ゲノムDNA中にメチル化が存在している場合、該制限酵素による消化が阻害され、切断頻度が低くなる。その結果、メチル化のない状態のゲノムDNAをこの制限酵素で消化した場合より、産生されるDNA断片長が長くなると供に、制限酵素反応によって産生されるDNA断片数も減少する。ゲノムの座位単位でのゲノムのメチル化の頻度は、これまで不明であったが、本発明者により初めて植物におけるゲノムワイドなDNAのメチル化の解析が試みられ、この頻度が20〜30%であることが判明した。RLGS法では、通常、数百〜数千のスポットとして、1次元電気泳動で0.4〜23kbのDNAフラグメント、2次元電気泳動で0〜1600bpのDNAフラグメントの分画を行うが、このメチル化の頻度が、制限酵素処理後の適度なDNA断片数の減少をもたらし、これにより一次元目電気泳動以前の制限酵素処理において切断頻度の高い制限酵素を用いた場合でも、RLGS法に適したDNA断片数となり、効率的にゲノムのメチル化を検出することが可能となったものと考えられる。 That is, in the RLGS method, in the second restriction enzyme treatment before the first-dimensional electrophoresis, a restriction enzyme having a high cleavage frequency, and a DNA digestion reaction is caused by methylation of a recognition sequence and / or a base in the vicinity thereof. When genomic DNA is cleaved with a restriction enzyme to be inhibited, if methylation is present in the genomic DNA, digestion by the restriction enzyme is inhibited and the cleavage frequency is lowered. As a result, the number of DNA fragments produced by the restriction enzyme reaction also decreases as the length of the produced DNA fragment becomes longer than when the genomic DNA without methylation is digested with this restriction enzyme. The frequency of genome methylation at the genomic locus unit has not been known so far, but the present inventor has first attempted to analyze genome-wide DNA methylation in plants, and this frequency is 20-30%. It turned out to be. In the RLGS method, fractionation of DNA fragments of 0.4 to 23 kb by 1D electrophoresis and DNA fragments of 0 to 1600 bp by 2D electrophoresis is usually performed as hundreds to thousands of spots. However, the number of DNA fragments suitable for the RLGS method is reduced even when a restriction enzyme with high cleavage frequency is used in the restriction enzyme treatment before the first-dimensional electrophoresis. Thus, it is considered possible to efficiently detect genomic methylation.
また、このように一次元目電気泳動以前の制限酵素処理において切断頻度の高い制限酵素を用いることが可能となった結果、一回の実験で必要な制限酵素のうち、高額なメチル化感受性制限酵素の使用量を減少させることができ、ゲノムのメチル化の検出において、従来よりも、大幅にコストの削減を図ることが可能となった。 In addition, as a result of using restriction enzymes with a high cleavage frequency in the restriction enzyme treatment before the first-dimensional electrophoresis as described above, among the restriction enzymes required for one experiment, expensive methylation sensitivity restriction The amount of enzyme used can be reduced, and it has become possible to significantly reduce costs in detecting genomic methylation.
即ち、本発明は、ゲノムのメチル化の検出を効率的かつ安価に実施する方法を提供するものであり、より詳しくは、下記（１）および（２）に記載の発明を提供するものである。 That is, the present invention provides a method for efficiently and inexpensively detecting genomic methylation, and more specifically, provides the inventions described in (1) and (2) below. .
（１）二次元電気泳動法によるゲノムのメチル化の検出方法であって、
（ａ）第1の制限酵素によりゲノムDNAを切断する工程、
（ｂ）ゲノムDNAの切断末端を標識する工程、
（ｃ）第2の制限酵素でゲノムDNAを切断する工程、
（ｄ）ゲノムDNA断片を一次元電気泳動により分画する工程、
（ｅ）第3の制限酵素によりゲノムDNA断片を切断する工程、
（ｆ）ゲノムDNA断片のバンド群を二次元電気泳動により分画する工程
を、順次行うことを含み、第1の制限酵素および／または第2の制限酵素が下記（ｉ）または(ii)である方法。
(i) 連続する4塩基を認識する制限酵素であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素
(ii) 連続する5塩基を認識する制限酵素であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素
（２）二次元電気泳動法によるゲノムのメチル化の検出法であって、
（ａ）第1の制限酵素によりゲノムDNAを切断する工程、
（ｂ）ゲノムDNAの切断末端を標識する工程、
（ｃ）ゲノムDNA断片を一次元電気泳動により分画する工程、
（ｄ）第2の制限酵素によりゲノムDNA断片を切断する工程、
（ｅ）ゲノムDNA断片のバンド群を二次元電気泳動により分画する工程
を、順次行うことを含み、第1の制限酵素が下記（ｉ）または(ii)である方法。
(i) 連続する4塩基を認識する制限酵素であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素
(ii) 連続する5塩基を認識する制限酵素であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素
(1) A method for detecting genomic methylation by two-dimensional electrophoresis,
(A) cleaving genomic DNA with a first restriction enzyme;
(B) a step of labeling the cut ends of genomic DNA;
(C) cleaving genomic DNA with a second restriction enzyme;
(D) a step of fractionating genomic DNA fragments by one-dimensional electrophoresis;
(E) cleaving the genomic DNA fragment with a third restriction enzyme;
(F) sequentially performing a step of fractionating a band group of genomic DNA fragments by two-dimensional electrophoresis, wherein the first restriction enzyme and / or the second restriction enzyme is represented by the following (i) or (ii): There is a way.
(i) a restriction enzyme that recognizes four consecutive bases, the restriction enzyme that inhibits the DNA digestion reaction by methylation of the recognition sequence and / or its neighboring bases
(ii) a restriction enzyme that recognizes five consecutive bases, and the DNA digestion reaction is inhibited by methylation of the recognition sequence and / or the bases in the vicinity thereof (2) genomic methylation by two-dimensional electrophoresis Detection method
(A) cleaving genomic DNA with a first restriction enzyme;
(B) a step of labeling the cut ends of genomic DNA;
(C) a step of fractionating genomic DNA fragments by one-dimensional electrophoresis;
(D) cleaving the genomic DNA fragment with a second restriction enzyme;
(E) A method in which the step of fractionating a band group of genomic DNA fragments by two-dimensional electrophoresis is sequentially performed, and the first restriction enzyme is (i) or (ii) below.
(i) a restriction enzyme that recognizes four consecutive bases, the restriction enzyme that inhibits the DNA digestion reaction by methylation of the recognition sequence and / or its neighboring bases
(ii) A restriction enzyme that recognizes five consecutive bases, and that inhibits the DNA digestion reaction due to methylation of the recognition sequence and / or its neighboring bases
多くの植物ゲノムは、メチル化による修飾を受けており、メチル化状態の変化によって、多くの表現型が影響を受けている。メチル化が遺伝子の発現や遺伝子産物の機能にどのように影響を及ぼすかを理解することは重要である。しかしながら、これまでゲノム全体におけるメチル化座位を個々に検出することは困難であった。 Many plant genomes are modified by methylation, and many phenotypes are affected by changes in methylation status. It is important to understand how methylation affects gene expression and gene product function. However, until now it has been difficult to individually detect methylation loci in the entire genome.
本発明により、RLGS法を利用したゲノムのメチル化の検出において、一次元目の電気泳動前に認識する塩基数の少ないメチル化感受性制限酵素を用いた場合でも、効率的にゲノムのメチル化を検出しうることが見出された。また、本発明のゲノムのメチル化の検出法では、高価なメチル化感受性制限酵素の一回の実験当たりの使用量を減少させることができるため、多数のゲノムのメチル化を安価に検出できるという大きな利点を有する。 According to the present invention, in the detection of genome methylation using the RLGS method, even when a methylation sensitive restriction enzyme with a small number of bases recognized before the first-dimensional electrophoresis is used, genome methylation is efficiently performed. It was found to be detectable. In addition, according to the method for detecting genomic methylation of the present invention, the amount of expensive methylation-sensitive restriction enzyme used per experiment can be reduced, so that methylation of a large number of genomes can be detected at low cost. Has great advantages.
また、本発明の方法において、メチル化感受性に特色のあるイソシゾマ−制限酵素を用いて実験結果を比較すれば、1個体のサンプルを用いてゲノムのメチル化を多数特定することができる。本発明の方法で検出されるスポット位置のゲルには、メチル化されたDNA断片が含まれているため、これを抽出して解析することにより、例えば、植物の成長や開花、生殖に大きな影響を与える遺伝子の同定やクローニングができ、さらにはエピジェネティックな遺伝子調節メカニズムの研究を促進するための基盤情報を提供することもできよう。 In addition, in the method of the present invention, if the experimental results are compared using an isoschizomer-restriction enzyme that is characterized by methylation sensitivity, a large number of genome methylations can be identified using a single sample. The gel at the spot position detected by the method of the present invention contains a methylated DNA fragment. By extracting and analyzing this, for example, it has a large effect on plant growth, flowering, and reproduction. Can be identified and cloned, as well as provide basic information to facilitate research on epigenetic gene regulation mechanisms.
本発明は、二次元電気泳動法によるゲノムのメチル化の検出法を提供する。このようなゲノムDNA断片の検出は、例えば、RLGS法により同定することができる。RLGS法は、下記（ａ）から（ｆ）の工程を、順次行うことによってゲノムDNA断片を分画してゲノムのメチル化を検出する方法である。
（ａ） 第1の制限酵素によりゲノムDNAを切断する工程
（ｂ） ゲノムDNAの切断末端を標識する工程
（ｃ） 第2の制限酵素でゲノムDNAを切断する工程
（ｄ） ゲノムDNA断片を一次元電気泳動により分画する工程
（ｅ） 第3の制限酵素によりゲノムDNA断片を切断する工程
（ｆ） ゲノムDNA断片のバンド群を二次元電気泳動により分画する工程
The present invention provides a method for detecting genomic methylation by two-dimensional electrophoresis. Such a genomic DNA fragment can be detected by, for example, the RLGS method. The RLGS method is a method for detecting genomic methylation by fractionating genomic DNA fragments by sequentially performing the following steps (a) to (f).
(A) cleaving genomic DNA with a first restriction enzyme (b) labeling the cleaved end of genomic DNA (c) cleaving genomic DNA with a second restriction enzyme (d) primary genomic DNA fragment Step of fractionating by original electrophoresis (e) Step of cleaving genomic DNA fragments by a third restriction enzyme (f) Step of fractionating bands of genomic DNA fragments by two-dimensional electrophoresis
RLGS法の各工程については、公報（特許第2794047号公報）の記載の準じて実施することができる。 About each process of RLGS method, it can implement according to description of the gazette (patent 2794047 gazette).
本発明のゲノムのメチル化の検出においては、第1の制限酵素および／または第2の制限酵素として、4塩基を認識する制限酵素であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素を用い、ゲノムDNAの切断を行う。好ましくは、上記4塩基を認識する制限酵素は第2の制限酵素である。このような制限酵素としては、例えば4塩基配列（CCGG）を認識して切断するが、メチル化されたCを含むCCGG配列は切断しないHpaIIを用いることが効果的である。HpaII以外では、例えば表1左に示した制限酵素を使用することができるが、これらに制限されるものではない。 In the detection of genome methylation according to the present invention, the first restriction enzyme and / or the second restriction enzyme is a restriction enzyme that recognizes 4 bases, and comprises methylation of a recognition sequence and / or a base in the vicinity thereof. Cleave genomic DNA using a restriction enzyme that inhibits the DNA digestion reaction. Preferably, the restriction enzyme that recognizes the four bases is a second restriction enzyme. As such a restriction enzyme, for example, it is effective to use HpaII that recognizes and cleaves a 4-base sequence (CCGG) but does not cleave a CCGG sequence containing methylated C. Other than HpaII, for example, the restriction enzymes shown in the left of Table 1 can be used, but are not limited thereto.
上記第1の制限酵素または第2の制限酵素として4塩基認識制限酵素以外では、認識配列の塩基数が5塩基であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素を用いることができる。この制限酵素としては、例えば、表１右に示した制限酵素を使用することができるが、これらに制限されない。 Other than the 4-base recognition restriction enzyme as the first restriction enzyme or the second restriction enzyme, the number of bases of the recognition sequence is 5 bases, and the DNA digestion reaction is caused by methylation of the recognition sequence and / or the nearby bases. Inhibited restriction enzymes can be used. As this restriction enzyme, for example, the restriction enzymes shown in Table 1 right can be used, but are not limited thereto.
本発明においては、一次元電気泳動前の制限酵素処理の工程を一つ省略し、下記（ａ）から（ｅ）の工程を、順次行うことによってゲノムDNA断片を分画してゲノムのメチル化を検出することも可能である。
（ａ） 第1の制限酵素によりゲノムDNAを切断する工程
（ｂ） ゲノムDNAの切断末端を標識する工程
（ｃ） ゲノムDNA断片を一次元電気泳動により分画する工程
（ｄ） 第2の制限酵素によりゲノムDNA断片を切断する工程
（ｅ） ゲノムDNA断片のバンド群を二次元電気泳動により分画する工程
In the present invention, one step of restriction enzyme treatment prior to one-dimensional electrophoresis is omitted, and genomic DNA fragments are fractionated by sequentially performing the following steps (a) to (e) to genome methylation. Can also be detected.
(A) a step of cleaving genomic DNA with a first restriction enzyme (b) a step of labeling cleaved ends of genomic DNA (c) a step of fractionating genomic DNA fragments by one-dimensional electrophoresis (d) a second restriction The step of cleaving genomic DNA fragments with an enzyme (e) The step of fractionating bands of genomic DNA fragments by two-dimensional electrophoresis
この場合、第1の制限酵素として、メチル化によりDNA消化反応が阻害される、上記の制限酵素を用いる。 In this case, as the first restriction enzyme, the above restriction enzyme that inhibits the DNA digestion reaction by methylation is used.
さらにまた、以上に述べた実施形態のそれぞれについて、公報（特開2000-229000号公報、特開2002-350401号公報）の記載の準じ、一次元電気泳動前の工程においてDNA断片にアダプターを接続し、そのアダプターに放射標識を行う工程を付加したり、接続したアダプターの塩基配列に相補的なプライマーを利用してDNA断片を増幅する工程を付加することも可能である。 Furthermore, for each of the embodiments described above, an adapter is connected to a DNA fragment in the step before one-dimensional electrophoresis, as described in the publications (JP 2000-229000, JP 2002-350401). It is also possible to add a step of radiolabeling the adapter or a step of amplifying a DNA fragment using a primer complementary to the base sequence of the connected adapter.
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
[実施例１] 植物（シロイヌナズナ）のゲノムのメチル化の検出（その１）
（１） 試料の調製
シロイヌナズナの植物体の粉砕物0.1gに臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）緩衝液〔1％CTAB、0.05g/lプロテイナーゼＫ、0.05M EDTA（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）、10mg SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、10mg PVPP（ポリビニルポリピロリドン）、1.4M 塩化ナトリウム、0.1％ β-メルカプトエタノール、0.05M トリス−塩酸 pH8.0〕0.5mlを添加して、56℃で30分間保温した。つぎにPCI処理として、0.5mlのPCI（0.25mlフェノール、0.24mlクロロホルム、0.01mlイソアミルアルコール）を添加して、20分間振揺混合した。さらにCIA処理として、15,000rpm、10℃で10分間遠心分離した後、1mlのCIA（0.96mlクロロホルム、0.04mlイソアミルアルコール）を添加して10分間振揺混合した。15,000rpm、10℃で10分間遠心分離した後、イソプロパノール沈澱によりゲノムDNAを濃縮洗浄して乾燥し、0.2g/lになるようにRNaseA（リボ核酸分解酵素A）緩衝液（7g/l RNaseA、10mM トリス−塩酸pH7.9、50mM 塩化ナトリウム 10mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオスレイトール）に溶解して、37℃で2時間保温した。そして、該PCI処理、該CIA処理を行い、10℃で10分間遠心分離した後、エタノール沈殿を行いDNAを乾燥させた。
[Example 1] Detection of methylation of genome of plant (Arabidopsis thaliana) (Part 1)
(1) Preparation of sample 0.1 g of crushed plant of Arabidopsis plant was added to cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) buffer solution [1% CTAB, 0.05 g / l proteinase K, 0.05 M EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetate), 10 mg SDS (sodium dodecyl sulfate), 10 mg PVPP (polyvinyl polypyrrolidone), 1.4 M sodium chloride, 0.1% β-mercaptoethanol, 0.05 M tris-hydrochloric acid pH 8.0] 0.5 ml was added and incubated at 56 ° C. for 30 minutes . Next, as PCI treatment, 0.5 ml of PCI (0.25 ml phenol, 0.24 ml chloroform, 0.01 ml isoamyl alcohol) was added and shaken and mixed for 20 minutes. Further, as CIA treatment, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm and 10 ° C. for 10 minutes, 1 ml of CIA (0.96 ml chloroform, 0.04 ml isoamyl alcohol) was added, and the mixture was shaken and mixed for 10 minutes. After centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes at 10 ° C., the genomic DNA was concentrated, washed by isopropanol precipitation, dried, and RNase A (ribonuclease A) buffer (7 g / l RNase A, 0.2 g / l). 10 mM Tris-hydrochloric acid pH 7.9, 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM dithiothreitol), and incubated at 37 ° C. for 2 hours. Then, the PCI treatment and the CIA treatment were performed, followed by centrifugation at 10 ° C. for 10 minutes, followed by ethanol precipitation to dry the DNA.
（２） ゲノムDNAを DNAポリメラーゼにより修復する工程
上記工程により得られたゲノムDNA 0.1μg をDNAポリメラーゼ反応液（0.5ユニット DNAポリメラーゼ、0.4μM dNTP、0.1mM ジチオスレイトール、50mM トリス−塩酸pH7.8、10mM 塩化マグネシウム）2.5μｌに溶解し、37℃で20分間反応させた。その後65℃で60分間反応させて反応を終了させた。
(2) Step of repairing genomic DNA with DNA polymerase 0.1 μg of genomic DNA obtained by the above step was added to a DNA polymerase reaction solution (0.5 unit DNA polymerase, 0.4 μM dNTP, 0.1 mM dithiothreitol, 50 mM Tris-HCl pH 7.8). , 10 mM magnesium chloride) was dissolved in 2.5 μl and reacted at 37 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the reaction was terminated at 65 ° C. for 60 minutes.
（３） 第1の制限酵素（EagI）によりゲノムDNAを切断する工程
上記工程により得られたゲノムDNA 0.1μgにEagI反応液（10ユニットEagI、100mM トリス−塩酸pH7.9、200mM 塩化ナトリウム 20mM 塩化マグネシウム、2mM ジチオスレイトール）を2.5μl添加し、37℃で2時間反応させた。
(3) Step of cleaving genomic DNA with first restriction enzyme (EagI) 0.1 μg of genomic DNA obtained by the above step is added to EagI reaction solution (10 units EagI, 100 mM Tris-HCl pH 7.9, 200 mM sodium chloride 20 mM chloride) 2.5 μl of magnesium, 2 mM dithiothreitol) was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
（４） ゲノムDNAの切断末端を標識する工程
上記工程により得られたゲノムDNA の溶液に0.5μl ［α-32P］dGTP (10mCi/ml)、0.5μl ［α-32P］dCTP (10mCi/ml)、及び標識用緩衝液（0.5ユニット DNAポリメラーゼ、1mM ジチオスレイトール）を4μl添加し、37℃で30分間反応させた後、65℃で60分間反応させて反応を終了させた。
(4) Step of labeling the cut ends of genomic DNA 0.5 μl [α- 32 P] dGTP (10 mCi / ml), 0.5 μl [α- 32 P] dCTP (10 mCi / ml) were added to the genomic DNA solution obtained in the above step. ml) and 4 μl of labeling buffer (0.5 unit DNA polymerase, 1 mM dithiothreitol) were added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and then reacted at 65 ° C. for 60 minutes to complete the reaction.
（５） 第2の制限酵素（HpaII）によりゲノムDNA断片を切断する工程
上記工程により得られたゲノムDNA 溶液にHpaII緩衝液（20ユニットHpaII、10mM トリス−塩酸pH7.9、50mM 塩化ナトリウム 10mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオスレイトール）を10μl添加し、37℃で１時間反応させた。
(5) Step of cleaving genomic DNA fragment with second restriction enzyme (HpaII) HpaII buffer solution (20 units HpaII, 10 mM Tris-hydrochloric acid pH7.9, 50 mM sodium chloride 10 mM chloride) 10 μl of magnesium and 1 mM dithiothreitol were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
（６） ゲノムDNA断片を一次元電気泳動により分画する工程
0.8％アガロースゲル（直径2.5mm、長さ60cm）のキャピラリーの上端ウェル部（直径2.5mm、深さ1cm）に、上記工程により得られたゲノムDNAを0.1μg添加後、230Vの電圧で24時間泳動した。アガロースは１D緩衝液(0.1M トリスアセテート pH8.0、40mM ソディウムアセテート 3mM EDTA, 36mM 塩化ナトリウム)に溶解して調製した。なお、電気泳動用緩衝液として、１D緩衝液を使用した。
(6) Step of fractionating genomic DNA fragments by one-dimensional electrophoresis
0.1 μg of genomic DNA obtained in the above step is added to the upper end well (diameter 2.5 mm, depth 1 cm) of a 0.8% agarose gel (diameter 2.5 mm, length 60 cm) capillary, and then at a voltage of 230 V for 24 hours. Electrophoresed. Agarose was prepared by dissolving in 1D buffer (0.1 M trisacetate pH 8.0, 40 mM sodium acetate 3 mM EDTA, 36 mM sodium chloride). A 1D buffer was used as the electrophoresis buffer.
（７） HindIIIによりゲノムDNA断片を切断する工程
上記工程により得られたゲノムDNAのバンド群を有するゲルを、下記の反応液組成に浸し、37℃で2時間反応させた。すなわち1500ユニットのHindIIIを含むHindIII緩衝液（10mM トリス−塩酸pH7.5、50mM 塩化ナトリウム 10mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオスレイトール）に浸した。
(7) Step of cleaving genomic DNA fragment with HindIII The gel having the genomic DNA band group obtained by the above step was immersed in the following reaction solution composition and reacted at 37 ° C. for 2 hours. That is, it was immersed in a HindIII buffer (10 mM Tris-hydrochloric acid pH 7.5, 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM dithiothreitol) containing 1500 units of HindIII.
（８） ゲノムDNA断片のバンド群を二次元電気泳動により分画する工程
上記工程を経た泳動済ゲルを、2D緩衝液で2回洗浄し、2枚のガラス板で挟み作成された5％ポリアクリルアミドゲル（46cm幅×43cm高×1mm厚）の上にアガロースゲルの泳動方向とポリアクリルアミドゲルの上端縁とが平行になるように載置した。これらゲルの間隙を接続用0.8％アガロースゲルで満たして固化させ、アガロースゲルとポリアクリルアミドゲルとを接続した。150Vの電圧で24時間泳動した。
(8) Step of fractionating genomic DNA fragment bands by two-dimensional electrophoresis The 5% poly produced by washing the gel after the above steps twice with 2D buffer and sandwiching it between two glass plates It was placed on an acrylamide gel (46 cm wide × 43 cm high × 1 mm thick) so that the migration direction of the agarose gel and the upper edge of the polyacrylamide gel were parallel. The gap between these gels was filled with a 0.8% agarose gel for connection and solidified, and the agarose gel and the polyacrylamide gel were connected. Electrophoresis was performed at a voltage of 150 V for 24 hours.
電気泳動用緩衝液としては、2D緩衝液(0.05M Tris-塩酸pH7.5、0.062M ホウ酸、1mM EDTA)を使用した。5％ポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミド：ビスアクリルアミドを29:1の割合で混合し、2D緩衝液に溶解し、0.07％過硫酸アンモニウム、0.027％N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミンを添加してゲル化させた。接続用0.8％アガロースゲルは、2D緩衝液に溶解して調整した。 As the electrophoresis buffer, 2D buffer (0.05 M Tris-hydrochloric acid pH 7.5, 0.062 M boric acid, 1 mM EDTA) was used. For 5% polyacrylamide gel, mix acrylamide: bisacrylamide in a ratio of 29: 1, dissolve in 2D buffer, add 0.07% ammonium persulfate, 0.027% N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine And gelled. A 0.8% agarose gel for connection was prepared by dissolving in 2D buffer.
（９） 泳動終了後、泳動済のゲル（アガロースゲルとポリアクリルアミドゲルとが接続したもの）を、瀘紙（商品名:3MM、ワァットマン社製）に密着乾燥させた。この乾燥ゲルをイメージングプレート（商品名BAS2000、富士フィルム社製）に密着させ、1日間暗室中で静置した。 (9) After the electrophoresis was completed, the gel that had been electrophoresed (agarose gel and polyacrylamide gel connected) was closely dried on a paper (trade name: 3MM, manufactured by Wattman). This dried gel was brought into close contact with an imaging plate (trade name BAS2000, manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) and allowed to stand in a dark room for 1 day.
この感光したイメージングプレートのオートラジオグラムを図1に示す。 An autoradiogram of this exposed imaging plate is shown in FIG.
また、上記実施例１の工程(5)において、HpaIIの代わりにMspIを第2の制限酵素として用いてゲノムDNAを切断し、その他の工程(1)〜（4）および(6)〜(9)はまったく同じ操作の実験を行った結果の二次元電気泳動パターンを図2に示す。 In step (5) of Example 1 above, genomic DNA is cleaved using MspI as a second restriction enzyme instead of HpaII, and the other steps (1) to (4) and (6) to (9) are performed. 2) shows a two-dimensional electrophoresis pattern as a result of conducting the same operation experiment.
[実施例２] 植物（シロイヌナズナ）のゲノムのメチル化の検出（その２）
（１） 試料の調製
シロイヌナズナの植物体の粉砕物0.1gに臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）緩衝液〔1％CTAB、0.05g/lプロテイナーゼＫ、0.05M EDTA（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）、10mg SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、10mg PVPP（ポリビニルポリピロリドン）、1.4M 塩化ナトリウム、0.1％ β-メルカプトエタノール、0.05M トリス−塩酸 pH8.0〕0.5mlを添加して、56℃で30分間保温した。つぎにPCI処理として、0.5mlのPCI（0.25mlフェノール、0.24mlクロロホルム、0.01mlイソアミルアルコール）を添加して、20分間振揺混合した。さらにCIA処理として、15,000rpm、10℃で10分間遠心分離した後、1mlのCIA（0.96mlクロロホルム、0.04mlイソアミルアルコール）を添加して10分間振揺混合した。15,000rpm、10℃で10分間遠心分離した後、イソプロパノール沈澱によりゲノムDNAを濃縮洗浄して乾燥し、0.2g/lになるようにRNaseA（リボ核酸分解酵素A）緩衝液（7g/l RNaseA、10mM トリス−塩酸pH7.9、50mM 塩化ナトリウム 10mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオスレイトール）に溶解して、37℃で2時間保温した。そして、該PCI処理、該CIA処理を行い、10℃で10分間遠心分離した後、エタノール沈殿を行いDNAを乾燥させた。
[Example 2] Detection of methylation of genome of plant (Arabidopsis thaliana) (part 2)
(1) Preparation of sample 0.1 g of crushed plant of Arabidopsis plant was added to cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) buffer solution [1% CTAB, 0.05 g / l proteinase K, 0.05 M EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetate), 10 mg SDS (sodium dodecyl sulfate), 10 mg PVPP (polyvinyl polypyrrolidone), 1.4 M sodium chloride, 0.1% β-mercaptoethanol, 0.05 M tris-hydrochloric acid pH 8.0] 0.5 ml was added and incubated at 56 ° C. for 30 minutes . Next, as PCI treatment, 0.5 ml of PCI (0.25 ml phenol, 0.24 ml chloroform, 0.01 ml isoamyl alcohol) was added and shaken and mixed for 20 minutes. Further, as CIA treatment, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm and 10 ° C. for 10 minutes, 1 ml of CIA (0.96 ml chloroform, 0.04 ml isoamyl alcohol) was added, and the mixture was shaken and mixed for 10 minutes. After centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes at 10 ° C., the genomic DNA was concentrated, washed by isopropanol precipitation, dried, and RNase A (ribonuclease A) buffer (7 g / l RNase A, 0.2 g / l). 10 mM Tris-hydrochloric acid pH 7.9, 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM dithiothreitol), and incubated at 37 ° C. for 2 hours. Then, the PCI treatment and the CIA treatment were performed, followed by centrifugation at 10 ° C. for 10 minutes, followed by ethanol precipitation to dry the DNA.
（２） ゲノムDNAを DNAポリメラーゼにより修復する工程
上記工程により得られたゲノムDNA 0.1μg をDNAポリメラーゼ反応液（0.5ユニット DNAポリメラーゼ、0.4μM dNTP、0.1mM ジチオスレイトール、50mM トリス−塩酸pH7.8、10mM 塩化マグネシウム）2.5μｌに溶解し、37℃で20分間反応させた。その後65℃で60分間反応させて反応を終了させた。
(2) Step of repairing genomic DNA with DNA polymerase 0.1 μg of genomic DNA obtained by the above step was added to a DNA polymerase reaction solution (0.5 unit DNA polymerase, 0.4 μM dNTP, 0.1 mM dithiothreitol, 50 mM Tris-HCl pH 7.8). , 10 mM magnesium chloride) was dissolved in 2.5 μl and reacted at 37 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the reaction was terminated at 65 ° C. for 60 minutes.
（３） 第1の制限酵素（NotI）によりゲノムDNAを切断する工程
上記工程により得られたゲノムDNA 0.1μgにNotI反応液（10ユニットNotI、100mM トリス−塩酸pH7.9、200mM 塩化ナトリウム 20mM 塩化マグネシウム、2mM ジチオスレイトール）を2.5μl添加し、37℃で2時間反応させた。
(3) Step of cleaving genomic DNA with the first restriction enzyme (NotI) NotI reaction solution (10 units NotI, 100 mM Tris-hydrochloric acid pH7.9, 200 mM sodium chloride 20 mM chloride) is added to 0.1 μg of genomic DNA obtained by the above step. 2.5 μl of magnesium, 2 mM dithiothreitol) was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
（４） ゲノムDNAの切断末端を標識する工程
上記工程により得られたゲノムDNA の溶液に0.5μl ［α-32P］dGTP (10mCi/ml)、0.5μl ［α-32P］dCTP (10mCi/ml)、及び標識用緩衝液（0.5ユニット DNAポリメラーゼ、1mM ジチオスレイトール）を4μl添加し、37℃で30分間反応させた後、65℃で60分間反応させて反応を終了させた。
(4) Step of labeling the cut ends of genomic DNA 0.5 μl [α- 32 P] dGTP (10 mCi / ml), 0.5 μl [α- 32 P] dCTP (10 mCi / ml) were added to the genomic DNA solution obtained in the above step. ml) and 4 μl of labeling buffer (0.5 unit DNA polymerase, 1 mM dithiothreitol) were added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and then reacted at 65 ° C. for 60 minutes to complete the reaction.
（５） 第2の制限酵素（HpaII）によりゲノムDNA断片を切断する工程
上記工程により得られたゲノムDNA 溶液にHpaII緩衝液（20ユニットHpaII、10mM トリス−塩酸pH7.9、50mM 塩化ナトリウム 10mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオスレイトール）を10μl添加し、37℃で１時間反応させた。
(5) Step of cleaving genomic DNA fragment with second restriction enzyme (HpaII) HpaII buffer solution (20 units HpaII, 10 mM Tris-hydrochloric acid pH7.9, 50 mM sodium chloride 10 mM chloride) 10 μl of magnesium and 1 mM dithiothreitol were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
（６） ゲノムDNA断片を一次元電気泳動により分画する工程
0.8％アガロースゲル（直径2.5mm、長さ60cm）のキャピラリーの上端ウェル部（直径2.5mm、深さ1cm）に、上記工程により得られたゲノムDNAを0.1μg添加後、230Vの電圧で24時間泳動した。アガロースは１D緩衝液(0.1M トリスアセテート pH8.0、40mM ソディウムアセテート 3mM EDTA, 36mM 塩化ナトリウム)に溶解して調製した。なお、電気泳動用緩衝液として、１D緩衝液を使用した。
(6) Step of fractionating genomic DNA fragments by one-dimensional electrophoresis
0.1 μg of genomic DNA obtained in the above step is added to the upper end well (diameter 2.5 mm, depth 1 cm) of a 0.8% agarose gel (diameter 2.5 mm, length 60 cm) capillary, and then at a voltage of 230 V for 24 hours. Electrophoresed. Agarose was prepared by dissolving in 1D buffer (0.1 M trisacetate pH 8.0, 40 mM sodium acetate 3 mM EDTA, 36 mM sodium chloride). A 1D buffer was used as the electrophoresis buffer.
（７） BamHIによりゲノムDNA断片を切断する工程
上記工程により得られたゲノムDNAのバンド群を有するゲルを、下記の反応液組成に浸し、37℃で2時間反応させた。すなわち、1500ユニットのBamHIを含むBamHI緩衝液（50mM トリス−塩酸pH7.5、100mM 塩化ナトリウム 10mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオスレイトール）に浸した。
(7) Step of cleaving genomic DNA fragment with BamHI The gel having the genomic DNA band group obtained by the above step was immersed in the following reaction solution composition and reacted at 37 ° C. for 2 hours. That is, it was immersed in a BamHI buffer (50 mM Tris-hydrochloric acid pH 7.5, 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM dithiothreitol) containing 1500 units of BamHI.
（８） ゲノムDNA断片のバンド群を二次元電気泳動により分画する工程
上記工程を経た泳動済ゲルを、2D緩衝液で2回洗浄し、2枚のガラス板で挟み作成された5％ポリアクリルアミドゲル（46cm幅×43cm高×1mm厚）の上にアガロースゲルの泳動方向とポリアクリルアミドゲルの上端縁とが平行になるように載置した。これらゲルの間隙を接続用0.8％アガロースゲルで満たして固化させ、アガロースゲルとポリアクリルアミドゲルとを接続した。150Vの電圧で24時間泳動した。
(8) Step of fractionating genomic DNA fragment bands by two-dimensional electrophoresis The 5% poly produced by washing the gel after the above steps twice with 2D buffer and sandwiching it between two glass plates It was placed on an acrylamide gel (46 cm wide × 43 cm high × 1 mm thick) so that the migration direction of the agarose gel and the upper edge of the polyacrylamide gel were parallel. The gap between these gels was filled with a 0.8% agarose gel for connection and solidified, and the agarose gel and the polyacrylamide gel were connected. Electrophoresis was performed at a voltage of 150 V for 24 hours.
電気泳動用緩衝液としては、2D緩衝液(0.05M Tris-塩酸pH7.5、0.062M ホウ酸、1mM EDTA)を使用した。5％ポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミド：ビスアクリルアミドを29:1の割合で混合し、2D緩衝液に溶解し、0.07％過硫酸アンモニウム、0.027％N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミンを添加してゲル化させた。接続用0.8％アガロースゲルは、２D緩衝液に溶解して調整した。 As the electrophoresis buffer, 2D buffer (0.05 M Tris-hydrochloric acid pH 7.5, 0.062 M boric acid, 1 mM EDTA) was used. For 5% polyacrylamide gel, mix acrylamide: bisacrylamide in a ratio of 29: 1, dissolve in 2D buffer, add 0.07% ammonium persulfate, 0.027% N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine And gelled. A 0.8% agarose gel for connection was prepared by dissolving in 2D buffer.
（９） 泳動終了後、泳動済のゲル（アガロースゲルとポリアクリルアミドゲルとが接続したもの）を、瀘紙（商品名:3MM、ワァットマン社製）に密着乾燥させた。この乾燥ゲルをイメージングプレート（商品名BAS2000、富士フィルム社製）に密着させ、1日間暗室中で静置した。 (9) After the electrophoresis was completed, the gel that had been electrophoresed (agarose gel and polyacrylamide gel connected) was closely dried on a paper (trade name: 3MM, manufactured by Wattman). This dried gel was brought into close contact with an imaging plate (trade name BAS2000, manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) and allowed to stand in a dark room for 1 day.
この感光したイメージングプレートのオートラジオグラムを図3に示す。 An autoradiogram of this exposed imaging plate is shown in FIG.
また、上記実施例2の工程(5)において、HpaIIの代わりにMspIを第2の制限酵素として用いてゲノムDNAを切断し、その他の工程(1)〜(4)および(6）〜(9)はまったく同じ操作の実験を行った結果の二次元電気泳動パターンを図4に示す。 In step (5) of Example 2 above, genomic DNA was cleaved using MspI as the second restriction enzyme instead of HpaII, and the other steps (1) to (4) and (6) to (9 ) Shows a two-dimensional electrophoresis pattern as a result of conducting an experiment of exactly the same operation.
[実施例３] 検出されたメチル化サイトのPCRによる確認
上記実施例2で明らかにされたメチル化サイトについて、別の実験方法を用いてメチル化されていることを確認した。
[Example 3] Confirmation of detected methylation sites by PCR It was confirmed that the methylation sites identified in Example 2 were methylated using another experimental method.
対象としたRLGSスポットは、図3および図4において矢印で示したスポットである。このスポットは、RLGS二次元画像（スポットパターン）から、1次元目の電気泳動におけるDNA断片（NotIとMspIを両端に持つDNA断片）は約2Kbの分子量であり、2次元目におけるDNA断片（NotIとBamHIを両端に持つDNA断片）は約300bpの分子量であると考えられた。 The target RLGS spots are spots indicated by arrows in FIGS. 3 and 4. This spot is based on the RLGS 2D image (spot pattern). The DNA fragment (DNA fragment with NotI and MspI at both ends) in the first dimension electrophoresis has a molecular weight of about 2 Kb, and the DNA fragment in the second dimension (NotI And a DNA fragment having BamHI at both ends) was considered to have a molecular weight of about 300 bp.
公知のシロイヌナズナ全ゲノム塩基配列情報（URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=3702）を利用し、NotI、MspI（HpaII）、BamHIの各サイトを検索し、NotIサイトからMspIサイトまでの距離が約2Kbでかつ、NotIサイトからBamHIサイトまでの距離が約300bpである塩基配列を調べた。その結果、シロイヌナズナ第1染色体において対応する部分を見出した。これはNotIサイトからMspIサイトまでの距離が2087bpであり、NotIサイトからBamHIサイトまでの距離が319bpであった。この各制限酵素サイトの概略を図5に示す。 NotI, MspI (HpaII), and BamHI sites using known Arabidopsis whole genome base sequence information (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=3702) Was searched for a nucleotide sequence having a distance from the NotI site to the MspI site of about 2 Kb and a distance from the NotI site to the BamHI site of about 300 bp. As a result, a corresponding portion was found in Arabidopsis thaliana chromosome 1. The distance from the NotI site to the MspI site was 2087 bp, and the distance from the NotI site to the BamHI site was 319 bp. An outline of each restriction enzyme site is shown in FIG.
そこで、MspI（HpaII）サイトを挟み込む形でPCR反応のためのプライマーセット（P1およびP2）を図5に示すように設計した。各プライマーの塩基配列は、P1（5’-TTCCTGCAGGTTGTGATAAGC-3’／配列番号：1）とP2（5’-TTGCGAGATCTCATCAGTGTG-3’／配列番号：2）であり、これを用いて739bpのPCR産物DNAが期待された。 Therefore, a primer set (P1 and P2) for the PCR reaction was designed as shown in FIG. 5 with the MspI (HpaII) site in between. The base sequence of each primer is P1 (5'-TTCCTGCAGGTTGTGATAAGC-3 '/ SEQ ID NO: 1) and P2 (5'-TTGCGAGATCTCATCAGTGTG-3' / SEQ ID NO: 2), and 739 bp PCR product DNA is used therefor. Was expected.
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNA断片の増幅反応に使用した耐熱性ポリメラーゼは、KOD PLUS（登録商標：東洋紡製）であった。反応液の組成（20μl反応液中の濃度で示す）は、上述のように調製した、試験されるシロイヌナズナ由来のゲノムDNA（1ng）、KOD PLUSポリメラーゼ（0.4Unit）、5’-TTCCTGCAGGTTGTGATAAGC-3’／配列番号：1（Ｐ1）および5’-TTGCGAGATCTCATCAGTGTG-3’／配列番号：2（P2）のヌクレオチド配列を有するプライマー（0.75pmol）、デオキシヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dTTP、dGTP）（各0.2mmol）、硫酸マグネシウム（1mmol）およびKOD PLUSポリメラーゼに添付されていたバッファーであった。 The thermostable polymerase used for the amplification reaction of the DNA fragment by polymerase chain reaction (PCR) was KOD PLUS (registered trademark: manufactured by Toyobo). The composition of the reaction solution (indicated by the concentration in the 20 μl reaction solution) was prepared as described above, the genomic DNA from Arabidopsis to be tested (1 ng), KOD PLUS polymerase (0.4 Unit), 5′-TTCCTGCAGGTTGTGATAAGC-3 ′ / SEQ ID NO: 1 (P1) and 5′-TTGCGAGATCTCATCAGTGTG-3 ′ / SEQ ID NO: 2 (P2) having a nucleotide sequence (0.75 pmol), deoxynucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) ( 0.2 mmol each), magnesium sulfate (1 mmol) and the buffer attached to KOD PLUS polymerase.
PCRの前に、まず熱変性反応（94℃、2分）を行った。PCRは、1サイクルが熱変性（94℃、15秒）、アニーリング（50℃、30秒）、および伸長反応（68℃、1分）からなった。これを25サイクル行った。 Before PCR, first, a heat denaturation reaction (94 ° C., 2 minutes) was performed. PCR consisted of one cycle consisting of heat denaturation (94 ° C, 15 seconds), annealing (50 ° C, 30 seconds), and extension reaction (68 ° C, 1 minute). This was done for 25 cycles.
電気泳動法によるゲノムDNA断片の分画は、1％アガロースゲルのウェル部に、上記で得られたPCR反応液10μlをのせた。次いで、100Vで1時間泳動した。 For fractionation of genomic DNA fragments by electrophoresis, 10 μl of the PCR reaction solution obtained above was placed in the well part of a 1% agarose gel. Subsequently, electrophoresis was performed at 100 V for 1 hour.
なお、アガロースは、TBE緩衝液に溶解して調製した。また、電気泳動用緩衝液としてTBE緩衝液を使用した。ここで、DNAサイズマーカーは、2000bp、1550bp、1400bp、1000bp、750bpのDNA断片を含んでいるものを使用した。 Agarose was prepared by dissolving in TBE buffer. Moreover, TBE buffer was used as a buffer for electrophoresis. Here, the DNA size marker used included DNA fragments of 2000 bp, 1550 bp, 1400 bp, 1000 bp, and 750 bp.
泳動終了後、エチジウムブロマイドでDNAバンドの染色を行った。DNA断片の電気泳動パターンは、紫外線照射下でCCDカメラを用いて撮影した。 After the electrophoresis, the DNA band was stained with ethidium bromide. The electrophoresis pattern of the DNA fragment was photographed using a CCD camera under ultraviolet irradiation.
P1（5’-TTCCTGCAGGTTGTGATAAGC-3’／配列番号：1）とP2（5’-TTGCGAGATCTCATCAGTGTG-3’／配列番号：2）のプライマーセットによるPCR産物の電気泳動パターンを図6に示す。本図において、レーン1は「DNAサイズマーカー」であり、示されたバンドは上から順に2000bp、1550bp、1400bp、1000bp、750bpである。レーン2は、「制限酵素による消化反応処理をまったく行っていないシロイヌナズナゲノムDNA」、レーン3は「MspIで消化したシロイヌナズナゲノムDNA」、レーン4は「HpaIIで消化したシロイヌナズナゲノムDNA」をそれぞれテンプレートに用いてPCR反応を行ったものである。 FIG. 6 shows the electrophoresis pattern of the PCR product using the primer set of P1 (5′-TTCCTGCAGGTTGTGATAAGC-3 ′ / SEQ ID NO: 1) and P2 (5′-TTGCGAGATCTCATCAGTGTG-3 ′ / SEQ ID NO: 2). In this figure, lane 1 is a “DNA size marker”, and the bands shown are 2000 bp, 1550 bp, 1400 bp, 1000 bp, and 750 bp in order from the top. Lane 2 is `` Arabidopsis genomic DNA that has not been digested with restriction enzymes at all '', lane 3 is `` Arabidopsis genomic DNA digested with MspI '', and lane 4 is `` HpaII digested Arabidopsis genomic DNA '' The PCR reaction was performed using this.
レーン2では、制限酵素処理がなされていないため、P1およびP2の両プライマーにはさまれたDNAは切断されておらず、公知のゲノム塩基配列情報から予測された分子量（739bp）の位置にバンドが検出された。 In lane 2, since the restriction enzyme treatment is not performed, the DNA sandwiched between the P1 and P2 primers is not cleaved, and a band is located at the molecular weight (739 bp) predicted from the known genome sequence information. Was detected.
レーン3では、バンドが消失していた。ここでPCR反応に用いたテンプレートDNAは、MspIで消化されていたため、この位置でDNAが切断されておりPCRによる増幅ができなかったことを示している。なお、MspIは、認識配列にメチル化されたシトシンがあってもDNA消化することができる。なお、極めてうすいバンドが750bp付近に見られるが、これはゲノムDNAのMspI消化の際に切れ残ってしまったごく微量のDNAが増幅されたものと考えられる。 In lane 3, the band disappeared. Here, since the template DNA used for the PCR reaction was digested with MspI, the DNA was cleaved at this position, indicating that PCR amplification was not possible. MspI can be digested with DNA even if the recognition sequence contains methylated cytosine. A very faint band is seen at around 750 bp, which is considered to be a result of amplification of a very small amount of DNA that was left uncut during MspI digestion of genomic DNA.
レーン4では、バンドが検出された。ここでPCR反応に用いたテンプレートDNAは、HpaIIで消化処理されたものである。ただし、この制限酵素HpaIIは、MspIと認識配列は同じ5’-CCGG-3’であるが、メチル化感受性であり認識配列中のシトシンのメチル化があるとDNA消化しないことが知られている。したがって、PCR反応によるバンドが検出されたことは、このHpaIIの認識サイトがメチル化されていたためにこの位置でDNAが切断されず、PCRによる増幅ができたことを示している。すなわち、HpaIIサイトがメチル化されていることが確認された。 In lane 4, a band was detected. Here, the template DNA used for the PCR reaction was digested with HpaII. However, this restriction enzyme HpaII is 5'-CCGG-3 'with the same recognition sequence as MspI, but is known to be methylation sensitive and not to digest DNA if there is methylation of cytosine in the recognition sequence. . Therefore, the detection of a band by PCR reaction indicates that DNA was not cleaved at this position because the recognition site of HpaII was methylated, and amplification by PCR was possible. That is, it was confirmed that the HpaII site was methylated.
以上のことから、本発明のメチル化検出方法においては、PCR反応を利用した方法でもメチル化サイトが確認できることが証明された。 From the above, it was proved that the methylation detection method of the present invention can confirm a methylation site even by a method using a PCR reaction.
Claims (3)
（ａ）第1の制限酵素によりゲノムDNAを切断する工程、
（ｂ）ゲノムDNAの切断末端を標識する工程、
（ｃ）第2の制限酵素でゲノムDNAを切断する工程、
（ｄ）ゲノムDNA断片を一次元電気泳動により分画する工程、
（ｅ）第3の制限酵素によりゲノムDNA断片を切断する工程、
（ｆ）ゲノムDNA断片のバンド群を二次元電気泳動により分画する工程、
（ｇ）標識を検出して二次元電気泳動パターンを生成する工程、
（ｈ）第1の制限酵素および／または第2の制限酵素に対してイソシゾマーの関係にあるメチル化非感受性の制限酵素を用いて上記（ａ）〜（ｇ）の工程により得られた二次元電気泳動パターンとの比較により、ゲノムのメチル化を検出する工程
を、順次行うことを含み、第1の制限酵素および／または第2の制限酵素が下記（ｉ）または(ii)である方法。
(i)連続する4塩基を認識する制限酵素であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素
(ii)連続する5塩基を認識する制限酵素であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素 A method for detecting genomic methylation by two-dimensional electrophoresis,
(A) cleaving genomic DNA with a first restriction enzyme;
(B) a step of labeling the cut ends of genomic DNA;
(C) cleaving genomic DNA with a second restriction enzyme;
(D) a step of fractionating genomic DNA fragments by one-dimensional electrophoresis;
(E) cleaving the genomic DNA fragment with a third restriction enzyme;
(F) a step of fractionating a band group of genomic DNA fragments by two-dimensional electrophoresis ;
(G) detecting a label to generate a two-dimensional electrophoresis pattern;
(H) Two-dimensional obtained by the steps (a) to (g) using a methylation-insensitive restriction enzyme having an isoschizomer relationship with the first restriction enzyme and / or the second restriction enzyme. Detecting the methylation of the genome by comparison with the electrophoresis pattern , comprising sequentially performing the first restriction enzyme and / or the second restriction enzyme in the following (i) or (ii) The way that is.
(i) a restriction enzyme that recognizes four consecutive bases, the restriction enzyme in which the DNA digestion reaction is inhibited by methylation of the recognition sequence and / or the bases nearby
(ii) a restriction enzyme that recognizes five consecutive bases, and that inhibits the DNA digestion reaction by methylation of the recognition sequence and / or its neighboring bases
（ａ）第1の制限酵素によりゲノムDNAを切断する工程、
（ｂ）ゲノムDNAの切断末端を標識する工程、
（ｃ）ゲノムDNA断片を一次元電気泳動により分画する工程、
（ｄ）第2の制限酵素によりゲノムDNA断片を切断する工程、
（ｅ）ゲノムDNA断片のバンド群を二次元電気泳動により分画する工程、
（ｆ）標識を検出して二次元電気泳動パターンを生成する工程、
（ｇ）第1の制限酵素に対してイソシゾマーの関係にあるメチル化非感受性の制限酵素を用いて上記（ａ）〜（ｆ）の工程により得られた二次元電気泳動パターンとの比較により、ゲノムのメチル化を検出する工程
を、順次行うことを含み、第1の制限酵素が下記（ｉ）または(ii)である方法。
(i)連続する4塩基を認識する制限酵素であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素
(ii)連続する5塩基を認識する制限酵素であって、認識配列及び／またはその近傍の塩基のメチル化によりDNA消化反応が阻害される制限酵素 A method for detecting genomic methylation by two-dimensional electrophoresis,
(A) cleaving genomic DNA with a first restriction enzyme;
(B) a step of labeling the cut ends of genomic DNA;
(C) a step of fractionating genomic DNA fragments by one-dimensional electrophoresis;
(D) cleaving the genomic DNA fragment with a second restriction enzyme;
(E) a step of fractionating a band of genomic DNA fragments by two-dimensional electrophoresis ;
(F) detecting a label to generate a two-dimensional electrophoresis pattern;
(G) By comparison with the two-dimensional electrophoresis pattern obtained by the steps (a) to (f) using a methylation-insensitive restriction enzyme having an isoschizomer relationship with the first restriction enzyme, Detecting the methylation of the genome , wherein the first restriction enzyme is the following (i) or (ii).
(i) a restriction enzyme that recognizes four consecutive bases, the restriction enzyme in which the DNA digestion reaction is inhibited by methylation of the recognition sequence and / or the bases nearby
(ii) a restriction enzyme that recognizes five consecutive bases, and that inhibits the DNA digestion reaction by methylation of the recognition sequence and / or its neighboring bases
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