JP4598338B2 - 核酸検出方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、試料中に存在する核酸分子を検出または定量する方法に関する。
背景技術
生体試料中に存在する特定の核酸分子を検出する技術は、基礎的研究分野および臨床学的分野の両方において重要である。特に、該技術は、例えば、特定の臓器において発現および機能するタンパク質を核酸分子レベルで解析する場合や、情報伝達系（例えば、神経系および免疫系等）におけるタンパク質の発現およびその発現の制御メカニズムに関する研究を行う場合等に重要である。また、遺伝子的疾患に関連する変異遺伝子、癌に関連する遺伝子、およびウイルスに関連する遺伝子等を検出することによって遺伝子診断を行う際にも、該技術は極めて重要な技術である。
例えば、ハイブリダイゼーション法は、核酸分子を検出するための代表的な方法である。この方法において、目的核酸は、この目的の核酸に相補的な配列を有した核酸プローブに対してハイブリダイズする。その後、当該プローブを使用にして該目的核酸が検出される。この方法の欠点は、少ないコピー数、例えば、１から１０００個程度の標的核酸を検出することが困難なことである。また、特異性が低いため、類似した配列を各々認識して夫々に検出することも困難である。
所謂、ＤＮＡチップは、多種類の核酸プローブが基体に固相化された装置である。従来のハイブリダイゼーション法に比べて、ＤＮＡチップを用いた検出方法はその操作が簡単である。しかしながら、固相された各プローブの至適条件が異なるために、偽陽性のハイブリダイゼーション反応が生じることが問題である。また、検出すべき核酸に応じて、固相されるプローブのデザインを変更し、適切なＤＮＡチップをその都度製造することも必要である。一方、臨床検査では、極めて多種類の核酸が検出対象となる。従って、従来の方法では、多くの種類のＤＮＡチップを用意しなくてはならない。
上述の方法を含む従来の技術は、多くの工程を含み煩雑である。その上、検出には長時間を要し、実施者には熟練した技術が必要とされる。
また、通常、遺伝子診断は確定診断として使用されるため、誤診は許されず、同時に迅速性も要求される。公知の従来の中には、このような要請を十分に満足する方法はない。
発明の開示
本発明の目的は、試料中から、高い特異性をもって目的とする核酸分子を検出する方法を提供することである。本発明によれば、複数種類の核酸分子が存在する試料の中から、高精度に且つ迅速に特定の核酸のみを検出および定量することが可能である。
また、本発明の他の目的は、少ないコピー数で標的配列を検出することができ、ＤＮＡチップの所要数を節約することが可能な方法を提供することである。また、本発明の他の目的は、少ない工程で簡単に実行できる方法を提供することである。
上記の目的は、以下に示す本発明により達成される；
試料中の所定の配列を有する標的核酸を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブＡとプローブＢを準備する工程と；
前記標的核酸中の第１の部分配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、このＦ’に連結された結合分子とを含む第１のプローブであるプローブＡ、および
前記標的核酸中の第２の部分配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、このＳ’に連結されたフラッグとを含む第２のプローブであるプローブＢ［ここで、前記フラッグは二本鎖配列であり、その一方の鎖には標識物質が含まれる］；
（ｂ）前記標的核酸中の前記第１の部分配列Ｆに前記第１のプローブＡをハイブリダイズさせると共に、前記第２の部分配列Ｓに前記第２のプローブＢをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸にハイブリダイズした前記第１のプローブＡと前記第２のプローブＢを連結してプローブ（Ａ＋Ｂ）を生じる工程と、
（ｄ）前記結合対の一方である物質を、前記結合分子に高親和性の物質に結合させて前記プローブ（Ａ＋Ｂ）を回収する工程と、並びに
（ｅ）前記フラッグを構成する核酸のうちの標識物質を含む一本鎖を回収し、前記標識物質を検出または定量することによって、前記試料中の標的核酸を検出または定量する工程と
を具備する方法である。
本発明の方法は、２つのプローブを用いて標的核酸を検出する。これによって本方法は、非特異的結合を防ぎ、且つ安定したハイブリダイゼーションを行うことが可能である。また、本方法は、プローブ（Ａ＋Ｂ）を検出することにより標的核酸の検出が達成される。従って、配列特異性が高く、且つ検出精度も高い。
また本発明は、フラッグを検出することによって標的核酸の検出を実施する。後に詳細に説明する通り、本発明の利点は、基本的に、標的核酸に関する情報をフラッグに置き換え、当該フラッグを検出または解析することによって、前記情報を入手することにある。施行者は、都合良くフラッグを設計することが可能である。従って、どのような核酸を検出対象とした場合であっても、検出対象毎にＤＮＡチップを製造することなく、共通するＤＮＡチップを一律に使用することが可能である。それにより、ＤＮＡチップの所要数を節約することが可能である。また、ＤＮＡチップに固相化するプローブの種類を少なくすることが可能である。また、当該フラッグの設計を工夫することにより、標的核酸の検出効率は飛躍的に向上する。また、検出工程もより簡便になる。
例えば、安定な核酸配列を有するフラッグを設計すれば、安定した検出結果が得られる。或いは、該フラッグを複数のユニットから構成することも可能である。当該複数のユニットを使用することにより、標的核酸の情報をコード化することが可能である。即ち、フラッグ配列に含まれる複数のユニットの組合せに応じて、標的核酸の多種多様な情報をシンプルなコードに変換することが可能である。また更に、得られるコードをＤＮＡを用いて構築すれば、当該ＤＮＡコード自体を増幅することが可能である。長さと安定性が一様なＤＮＡコードを同一のプライマー対を用いて増幅すると、従来の標的核酸を増幅する方法に比較して顕著な定量性が得られる。従って、少ないコピー数の標的配列も正確に検出および定量することが可能である。また、特定のアルゴリズムを用いてＤＮＡコードを数値に変換できるように設計すれば、ＤＮＡ分子反応を利用する計算が可能になる。これにより、血球型やＳＮＰＳ等の個人の遺伝子情報の解析の簡便化が達成できる。また、本発明では、標的核酸の情報を、任意に構成した該ユニットの組合せをコードとして読みとることが可能である。
更に、本発明は、簡便な操作により、試料中から複数種類の標的核酸を同時に検出する方法を提供することを目的とする。
この目的は、複数種類の標的核酸Ｎ１からＮｎ（ここで、ｎは２以上の整数）の各々に対して、プローブＡ１からＡｎ（ここで、ｎは２以上の整数）と、プローブＢ１からＢｎ（ここで、ｎは２以上の整数）とを用意し、上述の場合と同様の工程を経ることにより達成される。本発明によれば、各々の標的核酸は、高い特異性を持って簡便に検出される。複数種類の標的核酸を検出する場合に、フラッグは特に有利である。
発明を実施するための最良の形態
ここで使用される「核酸」の語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡ並びにＲＮＡを意味する。
ここで使用される「標的核酸」の語は、任意の配列を有する任意の核酸を示す。これに限定するものではないが、遺伝病の原因遺伝子、癌関連遺伝子、またはウイルス由来の核酸等の疾患のマーカーとなる得る核酸が特に好ましい。
ここで使用される「結合対」の語は、互いに特異的に結合し得る１対の物質をいう。例えば、アビジンとビオチン、ストレプトアビジンとビオチン、およびジゴキシニゲンとジゴキシニゲン抗体等をいうが、これに限られるものではなく、互いに特異的に結合するものであれば何れの物質を使用してもよい。従って、例えば、アビジンとビオチンの場合であれば、「結合対の一方」と言えば、アビジンまたはビオチンの何れかを指し、「結合対のもう一方の物質」と言えば、残りの一方を指す。また、ここで使用される「結合分子」の語は、「結合対の一方」または「結合対のもう一方の物質」の語と交換可能である。同様に［結合分子に高親和性な分子」または「結合分子に特異的に結合する分子」の語は「結合対の一方」または「結合対のもう一方の物質」の語と交換可能に使用される。
ここで使用される「試料」の語は、血液、尿および唾液等の体液を示すが、これに限られるものではなく、体液以外の任意の試料も含まれる。例えば、試料が固体である場合、酵素処理、界面活性剤または有機溶媒の添加等の適切な方法で液体にすればよい。
ここで使用される「相補的な配列」とは、適切な条件下において、所定の標的核酸のみに特異的にハイブリダイズし得る配列を意味する。
例１．検出方法
本発明の検出方法の１例を図１を用いて説明する（図１）。本例の方法では、以下に示すような２種類の核酸プローブ（以下、単にプローブとも称す）、即ち、プローブＡ１およびプローブＢ２が使用される（図１ａ）。
プローブＡ１は、該標的核酸３の一部の領域における塩基配列Ｆに対して相補的な配列Ｆ’と、配列Ｆ’に結合された結合分子４からなる。ここで、結合分子４は、直接に配列Ｆ’に結合しても、または、任意の塩基配列等の何らかの仲介部分を介して間接的に配列Ｆ’に結合してもよい。プローブＡ１の塩基配列Ｆ以外の部分をタグ、タグ配列ＴｇまたはＴｇともとも称す。例えば、任意の配列をもって間接的に結合させる場合、当該配列は如何なる塩基配列であっても、如何なる塩基数であってもよい。好ましくは、標的核酸上の塩基配列に非相補的である。或いは、他の化学的または物理的な手段により結合されていてもよい。また、Ｔｇは、標的核酸の何れの部分とも結合せず、またＴｇは標的核酸とどの様な相互作用も生じないことが必要である。ここで使用する「非相補的」の語は、標的核酸の配列、特に、検出に使用する任意の領域の配列とハイブリダイズしない塩基配列をいう。
本発明に使用される配列Ｆ’は、１以上の塩基数を有す。安定なハイブリダイゼーションを達成するためには、好ましくは１５以上の塩基数を有す。
本発明に使用される結合分子４は、上述した通り、互いに特異的に結合する１対の分子の何れか１方であってよい。
プローブＢ２は、標的核酸３の一部の領域の塩基配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、配列Ｓ’に結合した任意のフラッグ（以下、ＦＬとも示す）とからなる。この例では、フラッグは、配列Ｓ’に連なる二本鎖配列とこれに続く標識物質５からなる。一般的に、フラッグは、これ自身が標的核酸３と結合はせず、また、これらは互いに如何なる相互作用も示さないことが必要である。従って、フラッグが塩基配列である場合、必ずしも全長に亘り二本鎖である必要はなく、標的核酸３に結合せず、且つ標的核酸と如何なる相互作用も示さない配列であれば部分的あるいは全体が一本鎖であってもよい。また、いかなる塩基数であってもよい。或いは以下の例３で詳述するように配列Ｓ’に何れかの手段により標識物質５が結合される構造であってもよい。また、フラッグが二本鎖配列である場合、これは如何なる塩基配列であっても、如何なる塩基数であってもよいが、配列Ｆおよび配列ＳのＴｍより十分に高いＴｍをもつ配列であることが必要である。特に、ここでは、フラッグが二本鎖である場合には、配列Ｓ’に直接に結合しておらず、即ち、配列Ｓ’に直接結合している配列にハイブリダイズしている配列をフラッグ配列という。
本発明で使用される標識物質５は、一般的に標識物質として使用される如何なる物質であってもよい。好ましい標識物質は、例えば、蛍光物質、発光物質、３２Ｐ等の放射性物質、高吸収性物質、高光反射性物質、高電位性物質、磁性物質および色素等を含み、好ましくは、ＦＩＴＣ等の蛍光物質である。
本発明に使用される配列Ｓ’は、１以上の塩基数を有し、好ましくは１５以上の塩基数を有する。
また、プローブＡ１に具備されるＴｇと、プローブＢ２に具備されるＦＬとは、図１ｂに示すように、両プローブが標的核酸３の各々目的とする領域に結合したときに、互いに遠方の端に位置するように設計されることが好ましい。また、プローブＡ１およびプローブＢ２は、両プローブが標的核酸３の各々目的とする領域に結合したときに、標的核酸３の隣り合う塩基に対して相補的な塩基を近方の端に有することが好ましい。これにより、以後の工程におけるライゲーションに有利となる。しかし、これに限定されるものではない。
また、プローブＡ１およびＢ２は、配列Ｆおよび配列ＳのＴｍが同一になるように、例えば、ＧＣ含量や塩基の組成等の条件を適切に選択してもよい。
この例は、以下のように実施する。まず、標的核酸３に応じて、上述のようなプローブＡ１とプローブＢ２を準備する。これらを適切な割合で、標的核酸３と混合する（図１ａ）。
次に、該混合物をハイブリダイゼーションに適した任意の条件で一定時間インキュベーションし、ハイブリダイゼーションを行なう（図１ｂ）。
該ハイブリダイゼーションは、一般的な何れの手法によっても行なうことが可能である。好ましいハイブリダイゼーションは、先ず、核酸の変性に有効な適宜の高温、例えば、９５℃で５分間静置することにより、標的核酸の相補的結合を解除して二本鎖から一本鎖へと変性させる。標的核酸が一本鎖の場合は７０℃で５分間静置することにより、その２次構造へ変性させる。次に、相補的塩基配列の再結合に有効な適宜の温度、例えば５５℃にて１５分間静置することにより、一本鎖の標的核酸が、相補的な塩基配列と再び結合するように実施される。 かかるハイブリダイゼーションにより、プローブＡ１およびプローブＢ２の両方が、同一の標的核酸３上に結合してハイブリッドを生成する。従って、使用する緩衝液の種類、温度条件等は、上述の条件に限定される必要はなく、プローブＡ１およびプローブＢ２が標的核酸３にハイブリダイズする条件であれば、どのような条件であってもよい。
次に、プローブＡ１とプローブＢ２を連結する（図１ｃ）。本発明では、標的核酸３上にハイブリダイズした状態のプローブＡ１とプローブＢ２を連結し、プローブ（Ａ＋Ｂ）７を生成する。この連結は連結部６の形成により達成される。
この連結には、例えば、サームス・アクアチウス（Ｔａｑ）ＤＮＡ・リガーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）等のＴａｑＤＮＡリガーゼを利用できる。しかし、これに限られず、一般的に使用される何れの連結剤も使用可能である。また、酵素的な手段に代わって、何らかの化学的な手段により、両プローブを連結してもよい。
また、標的核酸３上の配列Ｆと配列Ｓが、互いに隣接していない場合には、ＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼを用いて、ギャップの充填反応を行えばよい。それにより、両プローブ間隙に核酸塩基が導入される。使用されるＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼは、一般的に使用される何れのものでもよいが、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼが好ましい。
続いて、前記で得たプローブ（Ａ＋Ｂ）７を標的核酸３から解離する（図１ｄ）。該解離は、熱的変性等の変性処理により行なえばよい。例えば、熱的変性により行なう場合には、生理的条件下では、８５℃以上、好ましくは９０℃以上の温度にすればよいが、これに限定されない。ただし、フラッグ配列が二本鎖の場合はそのＴｍよりも低い温度で行うことが望ましい。
次に、結合分子４、即ち、結合対の一方を、これ対して高親和性な分子に結合させることによりプローブ（Ａ＋Ｂ）７を回収する（図１ｅ）。続いて、フラッグを一本鎖に変性し、標識物質５の結合した一本鎖について、これに相補的な配列にハイブリダイズすることにより回収する（図１ｇ）。その後、標識物質２を検出または定量し、標的核酸の検出または定量を達成する（図１ｇ）。該検出は、使用した標識物質に応じて、一般的に使用される何れの方法も使用できる。
ここで、プローブ（Ａ＋Ｂ）７と標識物質５の結合した一本鎖を、Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ分離（以降、Ｂ／Ｆ分離と称する）により回収することにより、精度が向上されている。このＢ／Ｆ分離は、一般的に使用されるＢ／Ｆ分離に準じて行なうことが可能である。
本方法において、標識物質５の結合した一本鎖のための好ましいＢ／Ｆ分離は、当該一本鎖に相補的な塩基配列を適当な支持体上に固相化させた固相担体を用いて行える（図１ｇ）。プローブ（Ａ＋Ｂ）７のための好ましいＢ／Ｆ分離は、当該結合分子４に特異的に結合する分子を適当な支持体上に固相化させた固相担体を用いて行える（図１ｅ）。
使用される支持体には、例えば、シリコンおよびガラス等の基板、ビーズ等の粒子、試験管やバイアル瓶等の容器、繊維、キャピラリー等を含む管、フィルター、アフィニティカラム、電極等が含まれるが、これに限定されない。該支持体の材質または表面処理は、プローブの固定成績に応じて適宜選ぶのが好ましい。
フラッグは、人為的な配列であるので、プローブ（Ａ＋Ｂ）のハイブリダイゼーションの特異性が向上するような特性を持つように、配列を設計することが可能である。
例２．検出方法の例
本方法は、複数の標的核酸を同時に検出する場合にも有効である。図２に複数の標的核酸Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３・・・Ｎｎ（ここで、ｎは２以上の整数。以下、Ｎ１−Ｎｎと称する）を同時に検出する例を示した。
検出対象が複数であることを除けば、各工程および各プローブの構成は、例１と同様である（図２ａからｅ）。
具体的には、標的核酸Ｎ１−Ｎｎと、プローブＡ１−Ａｎと、およびプローブＢ１−Ｂｎを混合する（図２ａ）。次に、これらをハイブリダイゼーションし、プローブＡ１−ＡｎとプローブＢ１−Ｂｎを連結する（図２ｂ）。得られたプローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を解離する（図示せず）。次に、プローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する（図２ｃ）。フラッグを変性して一本鎖とする（図２ｄ）。当該標識物質の結合している一本鎖を回収し、該標識物質を検出または定量する（図２ｅ）。これにより複数の種類の標的核酸を一度に、且つ同じ標識物質を用いることにより検出または定量することが可能である。従って、従来よりも少ない工程で複数の標的核酸を容易に検出できる。
同じ標識物質を使用して、複数の標的核酸を識別するには、標識核酸毎にフラッグの配列を変更すればよい。また、図２の工程ｅ、即ち、標識一本鎖の回収に使用する相補的な配列を基板に固相化するときに、配列毎に異なる領域に固相化すればよい。前記フラッグの配列の変更と、領域毎の固相化を同時に行うことも可能である。
或いは、標的核酸毎に、各々異なる標的物質を結合して使用することも可能である。この場合には、フラッグを変更すること、または領域毎の固相化を行う必要性は必ずしもない。
プローブ（Ａ１＋Ｂ１）、（Ａ２＋Ｂ２）・・・（Ａｎ＋Ｂｎ）［以下、（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）と称する］のＦｎ’およびＳｎ’配列のＧＣ含量や、核酸塩基の組成等を適切に選択すれば、各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩濃度等）のバラツキを抑制することが可能である。また、複数種類のフラッグ配列を用いる場合にも、フラッグ間でのハイブリダイゼーション条件を統一することが好ましい。これにより、検出精度が向上する。更に、Ｆｎ’およびＳｎ’配列のＴｍ値よりフラッグの配列のＴｍ値を十分に高くすることにより、検出精度が更に向上する。
これに対して、標的核酸の相補的配列を固相化する従来の核酸検出方法では、固相化されている各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件は、一般に異なるので、全プローブに適した条件を設定することは不可能である。
例３．検出方法の例
次に図３を参照しながら、本発明の方法の更なる例を説明する。本例の方法は、複数の標的核酸Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３・・・Ｎｎ（ここで、ｎは２以上の整数。以下、Ｎ１−Ｎｎと称する）を同時に検出する例である。標的核酸Ｎ１−Ｎｎに応じて、プローブＡ１、Ａ２、Ａ３・・・Ａｎ（ｎは２以上の整数。以下、Ａ１−Ａｎと称する）とプローブＢ１、Ｂ２、Ｂ３・・・Ｂｎ（ここで、ｎは２以上の整数。以下、Ｂ１−Ｂｎと称する）を準備する。これらは、更に以下に示すような特徴を有す核酸プローブである（図３ａ）。
プローブＡ１−Ａｎは、該標的核酸Ｎ１−Ｎｎの一部の領域における塩基配列Ｆ１からＦｎに対して相補的な配列Ｆ１’からＦｎ’と、夫々の配列Ｆ１’からＦｎ’に結合されたタグＴｇ１からＴｇｎ（以下、Ｔｇ１−Ｔｇｎとも称す）からなる。本例のタグＴｇ１からＴｇｎ（以下、Ｔｇ１’−Ｔｇｎ’とも称す）は塩基配列であり、夫々のタグＴｇ１からＴｇｎは、標的核酸の何れの部分とも結合せず、また標的核酸とどの様な相互作用も生じないことが必要である。ここで、タグＴｇ１からＴｇｎは、直接に配列Ｆ１’からＦｎ’に結合しても、または、任意の塩基配列等の何らかの仲介部分を介して間接的に配列Ｆ１’からＦｎ’に結合してもよい。例えば、任意の配列をもって間接的に結合させる場合、当該配列は如何なる塩基配列であっても、如何なる塩基数であってもよい。好ましくは、標的核酸上の塩基配列に非相補的である。或いは、他の化学的または物理的な手段により結合されていてもよい。
本発明に使用される配列Ｆ１’からＦｎ’は、夫々異なる１以上の塩基数を有す。安定なハイブリダイゼーションを達成するためには、好ましくは１５以上の塩基数を有す。
図３ａに示すように、プローブＢ１−Ｂｎは、標的核酸の一部の領域の塩基配列Ｓ１からＳｎに相補的な配列Ｓ１’からＳｎ’と、配列Ｓ１’からＳｎ’に結合した任意のフラッグ（以下、ＦＬとも示す）とからなる。この例では、フラッグは標識物質を含む。上述の例と同様にフラッグは、これ自身が標的核酸と結合はせず、また、これらは互いに如何なる相互作用も示さないことが必要である。本例のプローブＢ１−Ｂｎは、配列Ｓ１’からＳｎ’に何れかの手段により標識物質が結合される構造である。
本発明で使用される標識物質は、例１において記載通りの一般的に標識物質として使用される如何なる物質であってもよい。
本発明に使用される配列Ｓ１’からＳｎ’は、１以上の塩基数を有し、好ましくは１５以上の塩基数を有する。
また、プローブＡ１−Ａｎに具備されるＴｇと、プローブＢ１−Ｂｎに具備されるＦＬとは、図３ｂに示すように、両プローブが標的核酸の各々目的とする領域に結合したときに、互いに遠方の端に位置するように設計されることが好ましい（図３ｂ）。また、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎは、両プローブが標的核酸の各々目的とする領域に結合したときに、標的核酸の隣り合う塩基に対して相補的な塩基を近方の端に有することが好ましい。これにより、以後の工程におけるライゲーションに有利となる。しかし、これに限定されるものではない。
これらのプローブに含まれるＦ１’からＦｎ’およびＳ１’からＳｎ’の配列は、例えば、ＧＣ含量や核酸塩基の組成等を適切に選択すれば、各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件のばらつきを抑制することが可能である。また複数種類のタグ配列を用いる場合にも、タグ間のハイブリダイゼーション条件を統一することが好ましい。さらにＦｎ’およびＳｎ’配列のＴｍ値よりタグ配列のＴｍ値を十分に高くすることにより、検出感度が向上する。
この例は、以下のように実施する。まず、標的核酸Ｎ１−Ｎｎに応じて、上述のようなプローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを準備する。これらを適切な割合で、標的核酸Ｎ１−Ｎｎと混合する（図３ａ）。
次に、該混合物をハイブリダイゼーションに適した任意の条件で一定時間インキュベーションし、ハイブリダイゼーションを行なう（図示せず）。
該ハイブリダイゼーションは、一般的な何れの手法によっても行なうことが可能である。好ましいハイブリダイゼーションは、先ず、核酸の変性に有効な適宜の高温、例えば、９５℃で５分間静置することにより、標的核酸の相補的結合を解除して二本鎖から一本鎖へと変性させる。標的核酸が一本鎖の場合は７０℃で５分間静置することにより、その２次構造へ変性させる。次に、相補的塩基配列の再結合に有効な適宜の温度、例えば５５℃にて１５分間静置することにより、一本鎖の標的核酸が、相補的な塩基配列と再び結合するように実施される。
かかるハイブリダイゼーションにより、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎの両方が、夫々の組毎に同一の標的核酸上に結合してハイブリッドを生成する。従って、使用する緩衝液の種類、温度条件等は、上述の条件に限定される必要はなく、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎが標的核酸にハイブリダイズする条件であれば、どのような条件であってもよい。
次に、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを夫々連結する（図３ｂ）。本発明では、標的核酸Ｎ１−Ｎｎ上にハイブリダイズした状態のプローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを連結し、プローブ（Ａ１＋Ｂ１）−プローブ（Ａｎ＋Ｂｎ）を生成する。この連結は連結部の形成により達成される。この連結は、例１と同様に行えばよい。
また、標的核酸上の配列Ｆと配列Ｓが、互いに隣接していない場合には、ＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼを用いて、ギャップの充填反応等を行えばよい。それにより、両プローブ間隙に核酸塩基が導入される。使用されるＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼは、一般的に使用される何れのものでもよいが、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼが好ましい。
続いて、前記で得たプローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を標的核酸から解離する（図３ｃ）。該解離は、熱的変性等の変性処理により行なえばよい。例えば、熱的変性により行なう場合には、生理的条件下では、８５℃以上、好ましくは９０℃以上の温度にすればよいが、これに限定されない。
次に、プローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を、夫々のＴｇ１からＴｇｎに相補的な配列Ｔｇ１’からＴｇｎ’にハイブリダイゼーションすることにより回収する（図３ｄ）。その後、標識物質を検出または定量し、標的核酸の検出または定量を達成する（図３ｄ）。該検出は、使用した標識物質に応じて、一般的に使用される何れの方法も使用できる。
相補的な配列Ｔｇ１’からＴｇｎ’は支持体に固定されて使用することが好ましい。使用される支持体には、例えば、シリコンおよびガラス等の基板、ビーズ等の粒子、試験管やバイアル瓶等の容器、繊維、キャピラリー等を含む管、フィルター、アフィニティカラム、電極等が含まれるが、これに限定されない。該支持体の材質または表面処理は、プローブの固定成績に応じて適宜選ぶのが好ましい。
例３では、複数の標的核酸についての例を示したが、１種類の標的核酸についてもこの方法を使用することも可能である。更に、標識物質の種類を増やすことにより、更に多くの種類の標的核酸を簡便に識別することが可能である。
例４
次に図４を参照しながら、本発明の方法の更なる例を説明する。本例の方法は、複数の標的核酸Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３・・・Ｎｎ（ここで、ｎは２以上の整数。以下、Ｎ１−Ｎｎと称する）を同時に検出する例である。標的核酸Ｎ１−Ｎｎに応じて、プローブＡ１、Ａ２、Ａ３・・・Ａｎ（ｎは２以上の整数。以下、Ａ１−Ａｎと称する）とプローブＢ１、Ｂ２、Ｂ３・・・Ｂｎ（ここで、ｎは２以上の整数。以下、Ｂ１−Ｂｎと称する）を準備する。これらは、更に以下に示すような特徴を有す核酸プローブである（図４ａ）。
プローブＡ１−Ａｎは、該標的核酸Ｎ１−Ｎｎの一部の領域における塩基配列Ｆ１からＦｎに対して相補的な配列Ｆ１’からＦｎ’と、夫々の配列Ｆ１’からＦｎ’に結合されたタグＴｇ１からＴｇｎからなる。本例のタグＴｇ１からＴｇｎは塩基配列であり、夫々のタグＴｇ１からＴｇｎは、標的核酸の何れの部分とも結合せず、また標的核酸とどの様な相互作用も生じないことが必要である。ここで、タグＴｇ１からＴｇｎは、直接に配列Ｆ１’からＦｎ’に結合しても、または、任意の塩基配列等の何らかの仲介部分を介して間接的に配列Ｆ１’からＦｎ’に結合してもよい。例えば、任意の配列をもって間接的に結合させる場合、当該配列は如何なる塩基配列であっても、如何なる塩基数であってもよい。好ましくは、標的核酸上の塩基配列に非相補的である。或いは、他の化学的または物理的な手段により結合されていてもよい。
本発明に使用される配列Ｆ１’からＦｎ’は、夫々異なる１以上の塩基数を有す。安定なハイブリダイゼーションを達成するためには、好ましくは１５以上の塩基数を有す。
図４ａに示すように、プローブＢ１−Ｂｎは、標的核酸の一部の領域の塩基配列Ｓ１からＳｎに相補的な配列Ｓ１’からＳｎ’と、配列Ｓ１’からＳｎ’に結合した任意のフラッグとからなる。この例では、フラッグは任意の塩基配列ＦＬ１からＦＬｎと標識物質とを含む。上述の例と同様にフラッグは、これ自身が標的核酸と結合はせず、また、これらは互いに如何なる相互作用も示さないことが必要である。本例のプローブＢ１−Ｂｎは、配列Ｓ１’からＳｎ’に何れかの手段により標識物質が結合される構造である。
本発明で使用される標識物質は、例１において記載した通りの一般的に標識物質として使用される如何なる物質であってもよい。
本発明に使用される配列Ｓ’は、１以上の塩基数を有し、好ましくは１５以上の塩基数を有する。
また、プローブＡ１−Ａｎに具備されるＴｇと、プローブＢ１−Ｂｎに具備されるＦＬとは、図４ｂに示すように、両プローブが標的核酸の各々目的とする領域に結合したときに、互いに遠方の端に位置するように設計されることが好ましい（図４ｂ）。また、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎは、両プローブが標的核酸の各々目的とする領域に結合したときに、標的核酸の隣り合う塩基に対して相補的な塩基を近方の端に有することが好ましい。これにより、以後の工程におけるライゲーションに有利となる。しかし、これに限定されるものではない。
これらのプローブに含まれるＦ１’からＦｎ’およびＳ１’からＳｎ’の配列は、例えば、ＧＣ含量や核酸塩基の組成等を適切に選択すれば、各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件のばらつきを抑制することが可能である。また複数種類のタグ配列およびフラッグ配列を用いる場合にも、タグ間およびフラッグ間のハイブリダイゼーション条件を統一することが好ましい。さらにＦｎ’およびＳｎ’配列のＴｍ値よりもタグ配列およびフラッグ配列のＴｍ値を十分に高くすることにより、検出感度が向上する。また一つのタグ配列に対して複数種類のフラッグ配列を用いると互いに区別できる標的核酸の種類を飛躍的に増やすことができる。
この例は、以下のように実施する。まず、標的核酸Ｎ１−Ｎｎに応じて、上述のようなプローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを準備する。これらを適切な割合で、標的核酸Ｎ１−Ｎｎと混合する（図４ａ）。
次に、該混合物をハイブリダイゼーションに適した任意の条件で一定時間インキュベーションし、ハイブリダイゼーションを行なう（図示せず）。
該ハイブリダイゼーションは、一般的な何れの手法によっても行なうことが可能である。好ましいハイブリダイゼーションは、先ず、核酸の変性に有効な適宜の高温、例えば、９５℃で５分間静置することにより、標的核酸の相補的結合を解除して二本鎖から一本鎖へと変性させる。次に、相補的塩基配列の再結合に有効な適宜の温度、例えば５５℃にて１５分間静置することにより、一本鎖の標的核酸が、相補的な塩基配列と再び結合するように実施される。
かかるハイブリダイゼーションにより、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎの両方が、夫々の組毎に同一の標的核酸上に結合してハイブリッドを生成する。従って、使用する緩衝液の種類、温度条件等は、上述の条件に限定される必要はなく、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎが標的核酸にハイブリダイズする条件であれば、どのような条件であってもよい。
次に、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを夫々連結する（図４ｂ）。本発明では、標的核酸Ｎ１−Ｎｎ上にハイブリダイズした状態のプローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを連結し、プローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を生成する。この連結は連結部の形成により達成される。この連結は、例１と同様に行えばよい。
また、標的核酸上の配列Ｆと配列Ｓが、互いに隣接していない場合には、ＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼを用いて、ギャップの充填反応等を行えばよい。それにより、両プローブ間隙に核酸塩基が導入される。使用されるＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼは、一般的に使用される何れのものでもよいが、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼが好ましい。
続いて、前記で得たプローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を標的核酸から解離する（図示せず）。該解離は、熱的変性等の変性処理により行なえばよい。例えば、熱的変性により行なう場合には、生理的条件下では、８５℃以上、好ましくは９０℃以上の温度にすればよいが、これに限定されない。
次に、プローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を、夫々のＴｇ１からＴｇｎに相補的な配列Ｔｇ１’からＴｇｎ’にハイブリダイゼーションすることにより回収する（図４ｃ）。続いて、変性により当該プローブを解離し、その後、ＦＬ１からＦＬｎの配列に相補的な配列ＦＬ１’からＦＬｎ’にハイブリダイゼーションすることにより回収する（図４ｄ）。次に、夫々の標識物質を検出または定量し、標的核酸の検出または定量を達成する（図４ｅ）。該検出は、使用した標識物質に応じて、一般的に使用される何れの方法も使用できる。
相補的な配列Ｔｇ１’からＴｇｎ’および配列ＦＬ１’からＦＬｎ’は、支持体に固定されて使用することが好ましい。使用される支持体には、例えば、シリコンおよびガラス等の基板、ビーズ等の粒子、試験管やバイアル瓶等の容器、繊維、キャピラリー等を含む管、フィルター、アフィニティカラム、電極等が含まれるが、これに限定されない。該支持体の材質または表面処理は、プローブの固定成績に応じて適宜選ぶのが好ましい。
例５．検出方法の例
以下に、本発明の好ましい更なる例について説明する。以下の方法は、フラッグの設計を工夫することにより、多種類の標的核酸を、高精度に且つ効率よく検出することが可能な方法である。
この方法では、以下に示すような２種類の核酸プローブ、即ち、プローブＡおよびプローブＢが使用される（図５ａ）。
プローブＡは、標的核酸の一部の領域の塩基配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、これに結合した結合分子からなる。
ここで、結合分子は、互いに特異的に高親和性を有する２つの物質の内の何れか一方の物質である。例えば、ビオチンまたはアビジン若しくはストレプトアビジン等である。また、結合分子は、直接に配列Ｆ’に結合しても、或いは任意の配列を解して間接的に配列Ｆ’に結合してもよい。間接的に結合する場合の任意の配列は、如何なる塩基配列であっても、如何なる塩基数であってもよい。好ましくは、標的核酸上の塩基配列に非相補的な配列である。
プローブＢは、標的核酸の一部の領域の塩基配列Ｓに相補的な配列Ｓ’とフラッグとからなる。本例におけるフラッグは二本鎖からなる。前記二本鎖は、複数のユニットからなる任意の配列を有す。また、フラッグは、これ自身が標的核酸と結合はせず、また、これらは互いに如何なる相互作用も示さないことが必要である。
本方法に使用される配列Ｆ’および配列Ｓ’は、１以上の塩基数を有し、より好ましくは１５以上の塩基数を有する。
ユニットの設計例を図７に示す。フラッグＦＬの複数のユニットの各１ユニットは、１０塩基数以上としてよく、より好ましくは約１５塩基数である。フラッグＦＬのユニット数は、何れでもよいが、解析の容易さから４ユニットが好ましい。しかし、これに限られるものではない。
複数の標的核酸を同時に検出する場合には、多種類のユニットを組み合わせてフラッグＦＬを構築する。たとえば、ＳＤ、ＤＯ、Ｄ１、ＥＤの４ユニットからなるフラッグＦＬを設計する場合を例とすると、先ず、２２種類のユニットを設計し、その中から２種類を選択してプライマーとなるＳＤユニットと、もう１つのプライマーであるＥＤユニットとする。残りの２０種類のユニットを用いて、各標的核酸の種類毎に、選択する２つのユニットの種類を変えることによりＤ０、Ｄ１を設計すると、１００種類の異なる核酸配列を検出することが可能である（図７Ａ）。
２２種類のユニットは、正規直交化された塩基配列により設計することが好ましい。正規直交化された塩基配列はＴｍ値が揃っており、相補配列以外とは安定したハイブリッドは形成しない。また、相補配列とのハイブリッド形成を阻害するような安定した２次構造は形成しない。これにより、最終的な検出時のミスハイブリを少なくし、ハイブリの形成速度を上げることが可能になる。したがって、検出精度を向上すること、および検出時間を短縮することが可能になる。また、ユニット数を増すことや、ユニットの種類を増すことにより、１００００種類の異なる核酸配列をも検出することが可能である。
図５を用いて、本例の方法を更に説明する。図５ａに、４ユニットからなるフラッグＦＬの例を示した。該４ユニットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；以後、ＰＣＲ増幅またはＰＣＲ反応と称す）においてプライマーとなるＳＤユニットと、標的核酸の種類を認識するための認識用ユニット、即ち、Ｄ０ユニットおよびＤ１ユニットと、およびもう１つのプライマー配列であるＥＤユニットとからなる。これらの各ユニットは、後の工程においては、夫々が読み取り枠となる。
検出は、まず上記のプローブＡとプローブＢを、標的核酸と混合する（図５ａ）ことにより行う。このとき、試料に含まれる標的核酸は、複数の異なる核酸分子群であってもよい。例えば、検出されるべき標的核酸の種類が１００種類以下であるならば、Ｄ０ユニットは、Ｄ０−１からＤ０−１０の１０種類の中から選択され、且つＤ１ユニットは、Ｄ１−１からＤ１−１０の１０種類の中から選択される（図７Ａ）。
次に、プローブＡ、プローブＢ、および標的核酸をハイブリダイゼーションに適した条件で一定時間インキュベーションし、ハイブリダイゼーションを行なう（図５ｂ）。ハイブリダイゼーションの条件は、例１に示す通りでよい。
かかるハイブリダイゼーションにより、プローブＡおよびプローブＢの両方が同一の標的核酸上に結合する（図５ｂ）。
次に、標的核酸にハイブリダイズしたプローブＡおよびプローブＢを連結する（図５ｃ）。連結の条件は、例１に示す通りでよい。
また、フラッグＦＬのＴｍ値は、配列Ｆ’およびＳ’より高い温度に設計することが好ましい。これにより本検出方法におけるハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび変性等の操作の加熱または冷却の際に、検出感度の低下をもたらすフラッグの変性を防ぐことが可能である。
次に、得られたフラッグＦＬの情報をＢ／Ｆ分離する。具体的には、プローブ（Ａ＋Ｂ）に具備される結合分子を、その対となるべき結合分子を介して固相担体に補足する（図５ｅ）。
前記固相担体は、基板、ビーズ等の粒子、容器、繊維、管、フィルター、アフィニティ・カラム、電極等を用いることが可能であるが、好ましくはビーズである。
次に、結合分子に捕捉された状態で、プローブ（Ａ＋Ｂ）のフラッグＦＬを変性し一本鎖にする（図５ｆ）。得られた液相中の一本鎖配列ＦＬ’に対してＰＣＲ増幅を行なう（図５ｇ）。上述したように、予めフラッグＦＬには、２つのプライマー配列ＳＤおよびＥＤが配置してある。従って、このプライマー配列を利用してＰＣＲ反応が容易に行ない得る。また、このとき、ＰＣＲに使用する２つのプライマーの一方、たとえばＳＤ配列に、ビオチン等の結合分子を結合しておくことが好ましい。このときのＰＣＲの詳細な条件は、設計したフラッグＦＬに依存する。
続いて、該ＰＣＲ反応の終了後、結合分子を固相した固相担体に結合することによって、ＰＣＲ産物である二本鎖配列を回収する（図５ｉ）。ここで、固相化された担体は、前記結合分子と対になる結合対のもう一方の物質である。さらに、変性により配列ＦＬ’を除き、一本鎖配列ＦＬのみを固相担体上で回収する（図５ｉ）。
続いて、固相上の一本鎖フラッグ配列ＦＬの解析を行なう。まず、一本鎖フラッグ配列ＦＬが結合した前記固相担体を１０等分する（Ｄ１ユニットがＤ１−１からＤ１−Ｄ１０の場合）。各々に、標識分子と結合したＤ１−１’からＤ１−１０’配列の一つおよび全てのＤ０’配列（Ｄ０−１’からＤ０−１０’）を加え、フラッグ配列ＦＬにハイブリダイズする。
続いて、ハイブリダイズした２つの核酸分子をライゲーションにより連結する。ここで、ライゲーションの条件および標識物質に関する定義は上述した通りである。その後、変性により連結された分子を液相に回収する。
得られた標識された核酸分子の解析は、予めＤ０−１からＤ０−１０の核酸分子を固相化したＤＮＡチップまたはＤＮＡキャピラリ等に対して、ハイブリダイズすることにより行うことができる。特に、ＤＮＡキャピラリは、Ｄ０−１からＤ０−１０で１０等分に分けられたものを同時に処理できるので、これにより分析は容易になるであろう。
例えば、各１０種類のＤ０−１からＤ０−１０と、Ｄ１−０からＤ１−１０の配列を用いてフラッグＦＬを設計した場合、図７Ａの１の位置にはＤ０−１に相当する配列が固定され、標識されたＤ１−１’分子と連結された拡散分子６３にハイブリダイズされる。同様に、他の位置には列により相当するＤ０配列が固定され、行により相当するＤ１分子と連結された拡散分子にハイブリダイズされる。このような行列の配置を、後述するＤＮＡキャピラリに対して用いる（図７Ｂ）と解析が容易に行える。
ここでは、１０種類のユニットを用いた例を挙げたが、ユニットの種類は１０種類に限られるものではなく、それ以下でも、それ以上でもよい。
ここで使用する「ＤＮＡキャピラリ」とは、標的核酸を検出するための装置であり、その内側に該標的核酸に対する相補的配列が結合されており、該相補的配列に標的核酸を結合することにより、該標的分子を検出する装置をいう。図７Ｂに示す通り、多数のＤＮＡキャピラリを同時に使用し、且つ斜線で示した部分に、互いに異なるプローブを配置することにより、同時に多くの標的核酸を検出することが可能である。
また、本方法では、フラッグ配列ＦＬの各ユニットには正規直交化配列が使用されているので、実施されるハイブリダイズの反応温度等の条件を均一化することが可能である。これにより、ミスハイブリを防止でき、高い精度が得られる。また、同一条件の下で一度に多くの解析を行なうことが可能であるため、検出時間の短縮化を達成することが可能である。また、本方法により複雑なゲノム情報をＤＮＡの塩基配列で表現した数値に変換することも可能となり、ＤＮＡ分子反応を利用した計算を行うことにより、多種類の情報や、互いに連鎖した複雑な遺伝子情報を容易に解析することが可能になる。また、コード化したのちに容易にコード化核酸を増幅できるので、少ないコピー数の標的配列であっても正確に且つ定量的に検出することが可能である。また、コード化することにより、多くの情報を圧縮することが可能である。従ってＤＮＡチップまたはキャピラリーアレイ等の検出手段の所要数を節約することが可能である。
ここで使用する「エンコード反応」とは、ある塩基配列を、正規直交化塩基配列で表現されるコードに変換することをいう。上述の図５ａからｆの工程がこれに相当する。
また、ここで使用する「デコード反応」とは、前記で変換されたコードの読み取りを行ない、それにより元の情報を復元することをいう。上述の図５ｊの工程がこれに相当する。
上記の例５では、１種類の標的核酸を検出する例を示したが、複数種類のフラッグ配列を設計すれば、同様な工程を経ることにより複数種類の標的核酸を同時に検出することも可能である。
また、例５の応用例を図６に示す。図６に示した例では、検出する標的核酸に応じて、Ｄ０１−Ｄ１１からＤ０１−Ｄ１ｎ（ここで、ｎは整数である）を含むフラッグ配列が設計される。これを例５の工程ａからｆと同様に処理し、更に、以下のようなデコード反応を行う（図６）。即ち、得られた一本鎖配列ＦＬ’に対して、２つのプライマー配列ＳＤおよびＥＤを用いて、ＰＣＲ反応を行う（図６ｇ）。ここで図６ｇからｉの工程は、多種類のプローブ等を代表してｎについて図示したが、この工程では、１からｎの多種類のプローブ等も同様に存在していると理解されるべきである。また、このとき、ＳＤ配列にはビオチン等の結合分子を結合しておくことが好ましい。のときのＰＣＲの詳細な条件は、設計したフラッグＦＬに依存してよい。得られた二本鎖を前記結合分子と対となる物質を用いて回収する（図６ｈ）。これを変性し、洗浄して一本鎖にする（図６ｉ）。続いて、夫々のＦＬ配列のＤ１１−Ｄ１ｎに相補的であり、且つ標識物質を付与されたプライマーをハイブリダイズして伸長する（図６ｊ）。得られた各Ｄ１１’−Ｄ１ｎ’を、Ｄ０１−Ｄ１ｎが固相されたチップまたはキャピラリーアレイを用いることによって検出する（図６ｋ）。また、当該反応は、以下のような方法によっても実施することが可能である。即ち、プローブＡとプローブＢを連結し、プローブＢに付与した結合物質またはＴｇｎ配列を利用してＢ／Ｆ分離を行った後で、ＰＣＲを行わずに、得られたＦＬを直接に検出することも可能である。この場合にも、Ｓｎ’に連結する配列は、２ユニットでもよい。また、その場合には、Ｄ０ｎ配列およびＤ１ｎ配列をＤＮＡチップまたはキャピラリーアレイに固相化して用いてもよい。この場合の検出は、予め当該ＦＬ配列毎に異なる上述の標識物質を付与しておいても、または、ＤＮＡチップ等の所望する領域に配列毎に結合した後に標識物質を付与してもよい。
例６．実験
本発明の方法が、実際に有用であることを示すために以下のような実験を行なった。使用した配列と、その結合様式を図８に示す。
（１）標的配列と変異配列
使用する標的配列は、ｒ−３２〜ｆｌを用いた（図９）。また、検出方法の特異性を確認するために該標的配列とその配列が異なる変異配列を使用した。変異配列は、ｆｌ−ｎｅｇ−ｒ−３２ＡＢである（図９）。
（２）プローブと検出用配列
プローブＡは、ｂ−１６Ａを用いた（図９）。プローブＡに含まれるｂは、ビオチンを示す。また、プローブＢは、Ｐ−１６Ｂ−４８を用いた（図９）。プローブＢは、フラッグＦＬを含み、Ｐはリン酸基を示す。プローブＢのＦＬ配列に相補的な配列が、検出用配列であり、ｆｌ−ｒ−４８を使用した（図９）。
（３）実験方法
上記のプローブ等を用いて、標的配列の検出を試みた。先ず、夫々、ｐＨ８．０のＴＥ緩衝液中で５００ｐｍｏｌのプローブＢ溶液と、同量の検出用配列の溶液を混合し、９５℃で１分間インキュベーションし、その後、７分間かけて２５℃とし二本鎖とした。
次に、得られた二本鎖化したプローブＢと、標的配列と、プローブＡとを混合し、１００μｌのライゲーション用緩衝液中で２０ＵのＴａｇＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いてライゲーション反応を行なった。この反応は、７０℃から５５℃まで５分間かけて温度を下げることでプローブＡおよびプローブＢを標的配列にアニールさせたのち、ＴａｇＤＮＡリガーゼを添加して、５５℃で１５分間ライゲーション反応を行い、次いで、室温に温度を下げることとにより進行した。ストレプト アビジンを固相した磁気ビーズに上記のライゲーション後の試料を加え、３０℃でプレコールドウォッシュ（ｐｒｅ−ｃｏｌｄ ｗａｓｈ）を行ない、未反応の標的配列を除去し、同一温度でコールドウォッシュを行ない標的配列を除去した。上清を除去した後、ＴＥ緩衝液を１００μｌ添加し、７０℃で洗浄、即ち、ホットウォッシュ（ｈｏｔ ｗａｓｈ）を行ない、検出用配列を回収した。
（４）．実験結果
以下に検出結果を示す。図１０は、各々の洗浄過程において上清から得られた配列をキャピラリ電気泳動により検出したものである。プレウォッシュで回収された上清には、ライゲーション反応に付されなかった標的配列が含まれることが示された。また、コールドウォッシュにより回収された上清には、ライゲーションに付された塩基配列の標的配列が含まれることが示された。また、ホットウォッシュにより回収された上清中には、検出用配列が含まれ、その塩基長に相応する長さのＤＮＡが検出されたことが示された。
図１１は、標的配列の濃度と回収された検出用配列の濃度との関係を示す結果である。これは、上述の方法において添加した標的配列の濃度を、０、５、１０、２０、２５および５０ｎＭと変えた場合に検出された検出用配列の回収率をパーセンテージで示したグラフである。グラフから明らかであるように、標的配列の濃度が増加するに従い、検出された検出用配列の回収率も増加した。このことは、本検出方法が有用であることの証明の１つである。
図１２は、本方法の特異性について検討した結果を示す。即ち、標的配列の一部の塩基配列が異なる変異配列を検出系に存在した場合の、検出用配列の回収率について示す結果である。上述の方法において、標的配列を添加するのと同時に、変異配列を０．０５、０．５および１μＭで添加した。その結果、図１２に示す通り、変異配列の存在は、検出用配列の回収率に影響を与えなかった。従って、本検出方法は、標的配列を特異的に検出できることが証明された。
例７．実験
本発明の方法、特に、エンコード反応とデコード反応の特異性と定量性について示すために以下のような実験を行なった。使用した配列を図１３Ａに示す。また、各プローブと、これを構成する要素との対応を図１３Ｂに示す。
７−１．エンコード反応の特異性
（１）実験方法
まず、ＩＧＴＰのプローブＢＩＡＴＰ（Ｓ’ＩＧＴＰ＋ＳＤ＋Ｄ０ＩＧＴＰ＋Ｄ１ＩＧＴＰ＋ＥＤ、０．３ｎＭ）、およびＬＲＧ−４７のプローブＢＬＲＧ−４７（Ｓ’ＬＲＧ−４７＋ＳＤ＋Ｄ０ＬＲＧ−４７＋Ｄ１ＩＧＴＰ＋ＥＤ、０．３ｎＭ）、ＩＧＴＰのプローブＡＩＧＴＰ（０．３ｎＭ）、標的遺伝子としてのＩＧＴＰ遺伝子を０．３ｎＭから０．００３ｎＭを、ＴａｑＤＮＡリガーゼ（ＴａｑＤＮＡｌｉｇａｓｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）に添付のライゲーション緩衝液中で混合した。得られた混合液の温度を、７０℃から１分間当たり３℃の割合で下げ、５５℃になったところで２０ユニットのリガーゼを添加し、総量を３０μＬとした。その後、ライゲーション反応を１５分間行った。その後、１０ｍｇ／ｍＬのダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を１μＬで添加して、１５分間混合した。上清を除去した後、ＴｒｉｓＥＤＴＡ緩衝液（以下、ＴＥを略す）を２０μＬ添加した。これを６０℃で洗浄し、未反応のプローブＡ、プローブＢおよび標的核酸配列を洗浄した（即ち、コールドウォッシュまたは室温洗浄である）この洗浄を２回行った。上清を除去した後、２０μＬのＴＥを添加した。９５℃で、エンコードされたフラッグ配列を回収した。ＬＲＧ−４７に対するエンコード反応についても、同様に、標的遺伝子であるＬＲＧ−４７遺伝子に対応するプローブＡとプローブＢとを、ライゲーションすることによって評価を行った。エンコード反応を行うことにより連結されたプローブに対して、ＳＤ配列とＥＤ配列を各々プライマーとして使用して、ＰＣＲを行った。本鎖用のキャピラリー電気泳動により計測した。
（２）．実験結果
図１５は、上述で行った試験の概要を示すスキーム図である。以下に検出結果を示す。図１４ＡおよびＢは、キャピラリー電気泳動に供した場合に得られる結果をしたものである。図１４ＡおよびＢに示す通り、本発明のエンコード反応により、各々のＦＬ配列に対して特異的なＰＣＲ増幅が達成され、それによって特異的なＰＣＲ産物が得られた。
７−２．エンコード反応後のＰＣＲ増幅の定量性
（１）実験方法
エンコード反応後に行うＰＣＲの一様性と定量性を以下の方法を用いて検証した。本試験は、上述の通りのＩＧＴＰを検出するためのフラッグ配列とＬＲＧ−４７を検出するためのフラッグ配列について行った。ＩＧＴＰおよびＬＲＧ−４７を検出するためのフラッグ配列は、各々ＳＤ配列とＥＤ配列を含む。従って、ＩＧＴＰ用のフラッグ配列と、ＬＲＧ−４７用のフラッグ配列について、ＳＤ配列およびＥＤ配列を用いて、各々ＰＣＲを行った。このＰＣＲに添加した両配列鎖は、夫々１００ｐＭから１０ｆＭとした。また、このＰＣＲは、９４℃で３０秒、６５℃で６０秒、７２℃で３０秒を２５回繰り返した。
（２）実験結果
図１７は、上述で行った試験の概要を示すスキーム図である。以下に検出結果を示す。図１５は、キャピラリー電気泳動に供した場合に得られる結果をしたものである。図１６に示す通り、本発明のエンコード反応後のＰＣＲ増幅量は標的配列の濃度依存していることが示された。
７−３．デコード反応の特異性と定量性
（１）実験方法
使用した配列は、上述した通りである。即ち、ビオチン化したＳＤ＋Ｄ０ＩＧＴＰ＋Ｄ１ＩＧＴＰ＋ＥＤ配列（以下、ｂ−ｃｏｄｅ１とも称す）と、ビオチン化したＳＤ＋Ｄ０ＬＲＧ−４７＋Ｄ１ＬＲＧ−４７＋ＥＤ配列（以下、ｂ−ｃｏｄｅ２とも称す）について、デコード反応を行った。夫々１００μＭの濃度のｂ−ｃｏｄｅ１およびｂ−ｃｏｄｅ２の０．２μＬと、１ＭのＮａＣｌを含有するＴＥ緩衝液４９．８μＬと、４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬのダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジンとを混合し、１５分間撹拌した。これを室温で洗浄して、その上清を除去した。得られた当該ビーズに、更に５０μＬのＴＥ緩衝液を添加して室温で洗浄した。上清を除去し、得られたビーズに更に５０μＬのＴＥ緩衝液を添加して、８０℃で洗浄し、その上清を除去した。その後、ライゲーション緩衝液を用いて、室温で洗浄し、その上清を除去した。続いて、Ｄ１に対するリバース鎖を、最終濃度で４００ｎｍ、並びにＤ０ＩＧＴＰおよびＤ０ＬＲＧ−４７に対するリバース鎖を、最終濃度で各々４００ｎｍになるように当該得られたビーズに添加した。これを９５℃に加温して一本鎖化を行い、次に、１分間当たり７℃の割合で温度を下げた。続いて、６０℃で２０ユニットのＴａｑリガーゼを添加してライゲーション反応を１５分間行った。その上清を除去した後、５０μＬのＴＥ緩衝液を添加して、室温で洗浄した。その上清を除去し、再度、５０μＬのＴＥ緩衝液を添加した。この温度を８０℃に加温し、その上清を回収することによって、前記ライゲーションしたプローブを回収した。得られた上清に、上記のストレプトアビジンビーズの４０μＬを添加し、更に、１ＭのＮａＣｌを含有するＴＥ緩衝液１２．５μＬを添加して、１５分間撹拌した。その後、８０℃で上清を回収し、２本のチューブに前記上清を各２０μＬずつ分注した。前記２本のチューブの各々に対して、ビオチン化したＤ０ＩＧＴＰに対応する配列を持ったプローブ（即ち、ｂ−１）と、ビオチン化したＤ０ＬＲＧ−４７に対応する配列を持ったプローブ（即ち、ｂ−２）を、各々、１００μｍｏｌずつ各チューブに添加し、更に、２ＭのＮａＣｌを含有する１６μＬのＴＥ緩衝液を添加した。これを９５℃に加温した。その後、１分間当たり１０℃の割合で２５℃まで温度を下げることによりハイブリダイゼーションを行った。この溶液に、４０μＬの上記のストレプトアビジンビーズを添加し、１５分間撹拌した。その後、上清を除去し、４０μＬのＴＥ緩衝液を添加して、室温で洗浄した。その上清を除去し、更なる４０μＬのＴＥ緩衝液を添加して、４０℃で洗浄した。その上清を除去し、更なる４０μＬのＴＥ緩衝液を添加して７０℃まで加温した。その上清を回収し、各々、一本鎖用のキャピラリー電気泳動を行った。
（２）実験結果
図１９は、上述で行った試験の概要を示すスキーム図である。以下に検出結果を示す。図１８ＡおよびＢは、キャピラリー電気泳動に供した場合に得られる結果をしたものである。本発明のデコードは、当該エンコード反応により増幅したＰＣＲ産物に対して、各々の遺伝子に対応したＤ１、ラベルしたＤ２配列を用いて連結反応を行った。ビオチン標識したＤ１ＩＧＴＰおよびＤ１ＬＲＧ−４７を用いて、連結反応が起こったプローブを検出した結果、図１７に示す通り、各々の遺伝子に対応した産物を特異的に検出することが可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
本発明の方法の幾つかの好ましい例を、添付の図面を参照して説明する。図面は以下の通りである。
図１は、本発明の方法の第１の例を示すフローチャートである。
図２は、本発明の方法の第２の例を示すフローチャートである。
図３は、本発明の方法の第３の例を示すフローチャートである。
図４は、本発明の方法の第４の例を示すフローチャートである。
図５は、本発明の方法の第５の例を示すフローチャートである。
図６は、本発明の方法の更なる例を示すフローチャートである。
図７Ａは、本発明で使用されるフラッグの設計例を示す表である。図７Ｂは、図７Ａの設計例に対応する検出装置の例を示す図である。
図８は、本発明の第１の例の評価実験において、プローブが標的核酸と結合した状態を示す模式図である。
図９は、本発明の第１の例の評価実験に使用したプローブＡおよびプローブＢ、標的配列、検出用配列および変異配列を示す図である。
図１０は、各々の洗浄過程における上清から得た配列を、キャピラリ電気泳動により検出した結果を示すチャートである。
図１１は、検出用核酸の回収率に対する標的核酸の濃度の影響を示すグラフである。
図１２は、検出用核酸の回収率に対する標的配列の一部が異なる変異配列の影響を示すグラフである。
図１３Ａは、本発明の第５の例の評価実験に使用した２種類のプローブＡ、プローブＢおよび標的配列を示す図である。図１３Ｂは、各プローブと、これを構成する要素との対応を示す図である。
図１４ＡおよびＢは、本発明のエンコード反応の特異性を示すグラフである。
図１５は、本発明のエンコード反応の特性を評価する実験のスキーム図である。
図１６は、本発明のエンコード反応後のＰＣＲの定量的増幅を示すグラフである。
図１７は、本発明のエンコード反応後のＰＣＲの定量的増幅の試験方法を示すスキーム図である。
図１８ＡおよびＢは、本発明のデコード反応の特異性と定量性を示すグラフである。
図１９は、本発明のデコード反応の特異性と定量性の試験方法のスキーム図である。
本発明は、試料中に存在する核酸分子を検出または定量する方法に関する。
背景技術
生体試料中に存在する特定の核酸分子を検出する技術は、基礎的研究分野および臨床学的分野の両方において重要である。特に、該技術は、例えば、特定の臓器において発現および機能するタンパク質を核酸分子レベルで解析する場合や、情報伝達系（例えば、神経系および免疫系等）におけるタンパク質の発現およびその発現の制御メカニズムに関する研究を行う場合等に重要である。また、遺伝子的疾患に関連する変異遺伝子、癌に関連する遺伝子、およびウイルスに関連する遺伝子等を検出することによって遺伝子診断を行う際にも、該技術は極めて重要な技術である。
例えば、ハイブリダイゼーション法は、核酸分子を検出するための代表的な方法である。この方法において、目的核酸は、この目的の核酸に相補的な配列を有した核酸プローブに対してハイブリダイズする。その後、当該プローブを使用にして該目的核酸が検出される。この方法の欠点は、少ないコピー数、例えば、１から１０００個程度の標的核酸を検出することが困難なことである。また、特異性が低いため、類似した配列を各々認識して夫々に検出することも困難である。
所謂、ＤＮＡチップは、多種類の核酸プローブが基体に固相化された装置である。従来のハイブリダイゼーション法に比べて、ＤＮＡチップを用いた検出方法はその操作が簡単である。しかしながら、固相された各プローブの至適条件が異なるために、偽陽性のハイブリダイゼーション反応が生じることが問題である。また、検出すべき核酸に応じて、固相されるプローブのデザインを変更し、適切なＤＮＡチップをその都度製造することも必要である。一方、臨床検査では、極めて多種類の核酸が検出対象となる。従って、従来の方法では、多くの種類のＤＮＡチップを用意しなくてはならない。
上述の方法を含む従来の技術は、多くの工程を含み煩雑である。その上、検出には長時間を要し、実施者には熟練した技術が必要とされる。
また、通常、遺伝子診断は確定診断として使用されるため、誤診は許されず、同時に迅速性も要求される。公知の従来の中には、このような要請を十分に満足する方法はない。
発明の開示
本発明の目的は、試料中から、高い特異性をもって目的とする核酸分子を検出する方法を提供することである。本発明によれば、複数種類の核酸分子が存在する試料の中から、高精度に且つ迅速に特定の核酸のみを検出および定量することが可能である。
また、本発明の他の目的は、少ないコピー数で標的配列を検出することができ、ＤＮＡチップの所要数を節約することが可能な方法を提供することである。また、本発明の他の目的は、少ない工程で簡単に実行できる方法を提供することである。
上記の目的は、以下に示す本発明により達成される；
試料中の所定の配列を有する標的核酸を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブＡとプローブＢを準備する工程と；
前記標的核酸中の第１の部分配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、このＦ’に連結された結合分子とを含む第１のプローブであるプローブＡ、および
前記標的核酸中の第２の部分配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、このＳ’に連結されたフラッグとを含む第２のプローブであるプローブＢ［ここで、前記フラッグは二本鎖配列であり、その一方の鎖には標識物質が含まれる］；
（ｂ）前記標的核酸中の前記第１の部分配列Ｆに前記第１のプローブＡをハイブリダイズさせると共に、前記第２の部分配列Ｓに前記第２のプローブＢをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸にハイブリダイズした前記第１のプローブＡと前記第２のプローブＢを連結してプローブ（Ａ＋Ｂ）を生じる工程と、
（ｄ）前記結合対の一方である物質を、前記結合分子に高親和性の物質に結合させて前記プローブ（Ａ＋Ｂ）を回収する工程と、並びに
（ｅ）前記フラッグを構成する核酸のうちの標識物質を含む一本鎖を回収し、前記標識物質を検出または定量することによって、前記試料中の標的核酸を検出または定量する工程と
を具備する方法である。
本発明の方法は、２つのプローブを用いて標的核酸を検出する。これによって本方法は、非特異的結合を防ぎ、且つ安定したハイブリダイゼーションを行うことが可能である。また、本方法は、プローブ（Ａ＋Ｂ）を検出することにより標的核酸の検出が達成される。従って、配列特異性が高く、且つ検出精度も高い。
また本発明は、フラッグを検出することによって標的核酸の検出を実施する。後に詳細に説明する通り、本発明の利点は、基本的に、標的核酸に関する情報をフラッグに置き換え、当該フラッグを検出または解析することによって、前記情報を入手することにある。施行者は、都合良くフラッグを設計することが可能である。従って、どのような核酸を検出対象とした場合であっても、検出対象毎にＤＮＡチップを製造することなく、共通するＤＮＡチップを一律に使用することが可能である。それにより、ＤＮＡチップの所要数を節約することが可能である。また、ＤＮＡチップに固相化するプローブの種類を少なくすることが可能である。また、当該フラッグの設計を工夫することにより、標的核酸の検出効率は飛躍的に向上する。また、検出工程もより簡便になる。
例えば、安定な核酸配列を有するフラッグを設計すれば、安定した検出結果が得られる。或いは、該フラッグを複数のユニットから構成することも可能である。当該複数のユニットを使用することにより、標的核酸の情報をコード化することが可能である。即ち、フラッグ配列に含まれる複数のユニットの組合せに応じて、標的核酸の多種多様な情報をシンプルなコードに変換することが可能である。また更に、得られるコードをＤＮＡを用いて構築すれば、当該ＤＮＡコード自体を増幅することが可能である。長さと安定性が一様なＤＮＡコードを同一のプライマー対を用いて増幅すると、従来の標的核酸を増幅する方法に比較して顕著な定量性が得られる。従って、少ないコピー数の標的配列も正確に検出および定量することが可能である。また、特定のアルゴリズムを用いてＤＮＡコードを数値に変換できるように設計すれば、ＤＮＡ分子反応を利用する計算が可能になる。これにより、血球型やＳＮＰＳ等の個人の遺伝子情報の解析の簡便化が達成できる。また、本発明では、標的核酸の情報を、任意に構成した該ユニットの組合せをコードとして読みとることが可能である。
更に、本発明は、簡便な操作により、試料中から複数種類の標的核酸を同時に検出する方法を提供することを目的とする。
この目的は、複数種類の標的核酸Ｎ１からＮｎ（ここで、ｎは２以上の整数）の各々に対して、プローブＡ１からＡｎ（ここで、ｎは２以上の整数）と、プローブＢ１からＢｎ（ここで、ｎは２以上の整数）とを用意し、上述の場合と同様の工程を経ることにより達成される。本発明によれば、各々の標的核酸は、高い特異性を持って簡便に検出される。複数種類の標的核酸を検出する場合に、フラッグは特に有利である。
発明を実施するための最良の形態
ここで使用される「核酸」の語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡ並びにＲＮＡを意味する。
ここで使用される「標的核酸」の語は、任意の配列を有する任意の核酸を示す。これに限定するものではないが、遺伝病の原因遺伝子、癌関連遺伝子、またはウイルス由来の核酸等の疾患のマーカーとなる得る核酸が特に好ましい。
ここで使用される「結合対」の語は、互いに特異的に結合し得る１対の物質をいう。例えば、アビジンとビオチン、ストレプトアビジンとビオチン、およびジゴキシニゲンとジゴキシニゲン抗体等をいうが、これに限られるものではなく、互いに特異的に結合するものであれば何れの物質を使用してもよい。従って、例えば、アビジンとビオチンの場合であれば、「結合対の一方」と言えば、アビジンまたはビオチンの何れかを指し、「結合対のもう一方の物質」と言えば、残りの一方を指す。また、ここで使用される「結合分子」の語は、「結合対の一方」または「結合対のもう一方の物質」の語と交換可能である。同様に［結合分子に高親和性な分子」または「結合分子に特異的に結合する分子」の語は「結合対の一方」または「結合対のもう一方の物質」の語と交換可能に使用される。
ここで使用される「試料」の語は、血液、尿および唾液等の体液を示すが、これに限られるものではなく、体液以外の任意の試料も含まれる。例えば、試料が固体である場合、酵素処理、界面活性剤または有機溶媒の添加等の適切な方法で液体にすればよい。
ここで使用される「相補的な配列」とは、適切な条件下において、所定の標的核酸のみに特異的にハイブリダイズし得る配列を意味する。
例１．検出方法
本発明の検出方法の１例を図１を用いて説明する（図１）。本例の方法では、以下に示すような２種類の核酸プローブ（以下、単にプローブとも称す）、即ち、プローブＡ１およびプローブＢ２が使用される（図１ａ）。
プローブＡ１は、該標的核酸３の一部の領域における塩基配列Ｆに対して相補的な配列Ｆ’と、配列Ｆ’に結合された結合分子４からなる。ここで、結合分子４は、直接に配列Ｆ’に結合しても、または、任意の塩基配列等の何らかの仲介部分を介して間接的に配列Ｆ’に結合してもよい。プローブＡ１の塩基配列Ｆ以外の部分をタグ、タグ配列ＴｇまたはＴｇともとも称す。例えば、任意の配列をもって間接的に結合させる場合、当該配列は如何なる塩基配列であっても、如何なる塩基数であってもよい。好ましくは、標的核酸上の塩基配列に非相補的である。或いは、他の化学的または物理的な手段により結合されていてもよい。また、Ｔｇは、標的核酸の何れの部分とも結合せず、またＴｇは標的核酸とどの様な相互作用も生じないことが必要である。ここで使用する「非相補的」の語は、標的核酸の配列、特に、検出に使用する任意の領域の配列とハイブリダイズしない塩基配列をいう。
本発明に使用される配列Ｆ’は、１以上の塩基数を有す。安定なハイブリダイゼーションを達成するためには、好ましくは１５以上の塩基数を有す。
本発明に使用される結合分子４は、上述した通り、互いに特異的に結合する１対の分子の何れか１方であってよい。
プローブＢ２は、標的核酸３の一部の領域の塩基配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、配列Ｓ’に結合した任意のフラッグ（以下、ＦＬとも示す）とからなる。この例では、フラッグは、配列Ｓ’に連なる二本鎖配列とこれに続く標識物質５からなる。一般的に、フラッグは、これ自身が標的核酸３と結合はせず、また、これらは互いに如何なる相互作用も示さないことが必要である。従って、フラッグが塩基配列である場合、必ずしも全長に亘り二本鎖である必要はなく、標的核酸３に結合せず、且つ標的核酸と如何なる相互作用も示さない配列であれば部分的あるいは全体が一本鎖であってもよい。また、いかなる塩基数であってもよい。或いは以下の例３で詳述するように配列Ｓ’に何れかの手段により標識物質５が結合される構造であってもよい。また、フラッグが二本鎖配列である場合、これは如何なる塩基配列であっても、如何なる塩基数であってもよいが、配列Ｆおよび配列ＳのＴｍより十分に高いＴｍをもつ配列であることが必要である。特に、ここでは、フラッグが二本鎖である場合には、配列Ｓ’に直接に結合しておらず、即ち、配列Ｓ’に直接結合している配列にハイブリダイズしている配列をフラッグ配列という。
本発明で使用される標識物質５は、一般的に標識物質として使用される如何なる物質であってもよい。好ましい標識物質は、例えば、蛍光物質、発光物質、３２Ｐ等の放射性物質、高吸収性物質、高光反射性物質、高電位性物質、磁性物質および色素等を含み、好ましくは、ＦＩＴＣ等の蛍光物質である。
本発明に使用される配列Ｓ’は、１以上の塩基数を有し、好ましくは１５以上の塩基数を有する。
また、プローブＡ１に具備されるＴｇと、プローブＢ２に具備されるＦＬとは、図１ｂに示すように、両プローブが標的核酸３の各々目的とする領域に結合したときに、互いに遠方の端に位置するように設計されることが好ましい。また、プローブＡ１およびプローブＢ２は、両プローブが標的核酸３の各々目的とする領域に結合したときに、標的核酸３の隣り合う塩基に対して相補的な塩基を近方の端に有することが好ましい。これにより、以後の工程におけるライゲーションに有利となる。しかし、これに限定されるものではない。
また、プローブＡ１およびＢ２は、配列Ｆおよび配列ＳのＴｍが同一になるように、例えば、ＧＣ含量や塩基の組成等の条件を適切に選択してもよい。
この例は、以下のように実施する。まず、標的核酸３に応じて、上述のようなプローブＡ１とプローブＢ２を準備する。これらを適切な割合で、標的核酸３と混合する（図１ａ）。
次に、該混合物をハイブリダイゼーションに適した任意の条件で一定時間インキュベーションし、ハイブリダイゼーションを行なう（図１ｂ）。
該ハイブリダイゼーションは、一般的な何れの手法によっても行なうことが可能である。好ましいハイブリダイゼーションは、先ず、核酸の変性に有効な適宜の高温、例えば、９５℃で５分間静置することにより、標的核酸の相補的結合を解除して二本鎖から一本鎖へと変性させる。標的核酸が一本鎖の場合は７０℃で５分間静置することにより、その２次構造へ変性させる。次に、相補的塩基配列の再結合に有効な適宜の温度、例えば５５℃にて１５分間静置することにより、一本鎖の標的核酸が、相補的な塩基配列と再び結合するように実施される。 かかるハイブリダイゼーションにより、プローブＡ１およびプローブＢ２の両方が、同一の標的核酸３上に結合してハイブリッドを生成する。従って、使用する緩衝液の種類、温度条件等は、上述の条件に限定される必要はなく、プローブＡ１およびプローブＢ２が標的核酸３にハイブリダイズする条件であれば、どのような条件であってもよい。
次に、プローブＡ１とプローブＢ２を連結する（図１ｃ）。本発明では、標的核酸３上にハイブリダイズした状態のプローブＡ１とプローブＢ２を連結し、プローブ（Ａ＋Ｂ）７を生成する。この連結は連結部６の形成により達成される。
この連結には、例えば、サームス・アクアチウス（Ｔａｑ）ＤＮＡ・リガーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）等のＴａｑＤＮＡリガーゼを利用できる。しかし、これに限られず、一般的に使用される何れの連結剤も使用可能である。また、酵素的な手段に代わって、何らかの化学的な手段により、両プローブを連結してもよい。
また、標的核酸３上の配列Ｆと配列Ｓが、互いに隣接していない場合には、ＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼを用いて、ギャップの充填反応を行えばよい。それにより、両プローブ間隙に核酸塩基が導入される。使用されるＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼは、一般的に使用される何れのものでもよいが、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼが好ましい。
続いて、前記で得たプローブ（Ａ＋Ｂ）７を標的核酸３から解離する（図１ｄ）。該解離は、熱的変性等の変性処理により行なえばよい。例えば、熱的変性により行なう場合には、生理的条件下では、８５℃以上、好ましくは９０℃以上の温度にすればよいが、これに限定されない。ただし、フラッグ配列が二本鎖の場合はそのＴｍよりも低い温度で行うことが望ましい。
次に、結合分子４、即ち、結合対の一方を、これ対して高親和性な分子に結合させることによりプローブ（Ａ＋Ｂ）７を回収する（図１ｅ）。続いて、フラッグを一本鎖に変性し、標識物質５の結合した一本鎖について、これに相補的な配列にハイブリダイズすることにより回収する（図１ｇ）。その後、標識物質２を検出または定量し、標的核酸の検出または定量を達成する（図１ｇ）。該検出は、使用した標識物質に応じて、一般的に使用される何れの方法も使用できる。
ここで、プローブ（Ａ＋Ｂ）７と標識物質５の結合した一本鎖を、Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ分離（以降、Ｂ／Ｆ分離と称する）により回収することにより、精度が向上されている。このＢ／Ｆ分離は、一般的に使用されるＢ／Ｆ分離に準じて行なうことが可能である。
本方法において、標識物質５の結合した一本鎖のための好ましいＢ／Ｆ分離は、当該一本鎖に相補的な塩基配列を適当な支持体上に固相化させた固相担体を用いて行える（図１ｇ）。プローブ（Ａ＋Ｂ）７のための好ましいＢ／Ｆ分離は、当該結合分子４に特異的に結合する分子を適当な支持体上に固相化させた固相担体を用いて行える（図１ｅ）。
使用される支持体には、例えば、シリコンおよびガラス等の基板、ビーズ等の粒子、試験管やバイアル瓶等の容器、繊維、キャピラリー等を含む管、フィルター、アフィニティカラム、電極等が含まれるが、これに限定されない。該支持体の材質または表面処理は、プローブの固定成績に応じて適宜選ぶのが好ましい。
フラッグは、人為的な配列であるので、プローブ（Ａ＋Ｂ）のハイブリダイゼーションの特異性が向上するような特性を持つように、配列を設計することが可能である。
例２．検出方法の例
本方法は、複数の標的核酸を同時に検出する場合にも有効である。図２に複数の標的核酸Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３・・・Ｎｎ（ここで、ｎは２以上の整数。以下、Ｎ１−Ｎｎと称する）を同時に検出する例を示した。
検出対象が複数であることを除けば、各工程および各プローブの構成は、例１と同様である（図２ａからｅ）。
具体的には、標的核酸Ｎ１−Ｎｎと、プローブＡ１−Ａｎと、およびプローブＢ１−Ｂｎを混合する（図２ａ）。次に、これらをハイブリダイゼーションし、プローブＡ１−ＡｎとプローブＢ１−Ｂｎを連結する（図２ｂ）。得られたプローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を解離する（図示せず）。次に、プローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する（図２ｃ）。フラッグを変性して一本鎖とする（図２ｄ）。当該標識物質の結合している一本鎖を回収し、該標識物質を検出または定量する（図２ｅ）。これにより複数の種類の標的核酸を一度に、且つ同じ標識物質を用いることにより検出または定量することが可能である。従って、従来よりも少ない工程で複数の標的核酸を容易に検出できる。
同じ標識物質を使用して、複数の標的核酸を識別するには、標識核酸毎にフラッグの配列を変更すればよい。また、図２の工程ｅ、即ち、標識一本鎖の回収に使用する相補的な配列を基板に固相化するときに、配列毎に異なる領域に固相化すればよい。前記フラッグの配列の変更と、領域毎の固相化を同時に行うことも可能である。
或いは、標的核酸毎に、各々異なる標的物質を結合して使用することも可能である。この場合には、フラッグを変更すること、または領域毎の固相化を行う必要性は必ずしもない。
プローブ（Ａ１＋Ｂ１）、（Ａ２＋Ｂ２）・・・（Ａｎ＋Ｂｎ）［以下、（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）と称する］のＦｎ’およびＳｎ’配列のＧＣ含量や、核酸塩基の組成等を適切に選択すれば、各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩濃度等）のバラツキを抑制することが可能である。また、複数種類のフラッグ配列を用いる場合にも、フラッグ間でのハイブリダイゼーション条件を統一することが好ましい。これにより、検出精度が向上する。更に、Ｆｎ’およびＳｎ’配列のＴｍ値よりフラッグの配列のＴｍ値を十分に高くすることにより、検出精度が更に向上する。
これに対して、標的核酸の相補的配列を固相化する従来の核酸検出方法では、固相化されている各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件は、一般に異なるので、全プローブに適した条件を設定することは不可能である。
例３．検出方法の例
次に図３を参照しながら、本発明の方法の更なる例を説明する。本例の方法は、複数の標的核酸Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３・・・Ｎｎ（ここで、ｎは２以上の整数。以下、Ｎ１−Ｎｎと称する）を同時に検出する例である。標的核酸Ｎ１−Ｎｎに応じて、プローブＡ１、Ａ２、Ａ３・・・Ａｎ（ｎは２以上の整数。以下、Ａ１−Ａｎと称する）とプローブＢ１、Ｂ２、Ｂ３・・・Ｂｎ（ここで、ｎは２以上の整数。以下、Ｂ１−Ｂｎと称する）を準備する。これらは、更に以下に示すような特徴を有す核酸プローブである（図３ａ）。
プローブＡ１−Ａｎは、該標的核酸Ｎ１−Ｎｎの一部の領域における塩基配列Ｆ１からＦｎに対して相補的な配列Ｆ１’からＦｎ’と、夫々の配列Ｆ１’からＦｎ’に結合されたタグＴｇ１からＴｇｎ（以下、Ｔｇ１−Ｔｇｎとも称す）からなる。本例のタグＴｇ１からＴｇｎ（以下、Ｔｇ１’−Ｔｇｎ’とも称す）は塩基配列であり、夫々のタグＴｇ１からＴｇｎは、標的核酸の何れの部分とも結合せず、また標的核酸とどの様な相互作用も生じないことが必要である。ここで、タグＴｇ１からＴｇｎは、直接に配列Ｆ１’からＦｎ’に結合しても、または、任意の塩基配列等の何らかの仲介部分を介して間接的に配列Ｆ１’からＦｎ’に結合してもよい。例えば、任意の配列をもって間接的に結合させる場合、当該配列は如何なる塩基配列であっても、如何なる塩基数であってもよい。好ましくは、標的核酸上の塩基配列に非相補的である。或いは、他の化学的または物理的な手段により結合されていてもよい。
本発明に使用される配列Ｆ１’からＦｎ’は、夫々異なる１以上の塩基数を有す。安定なハイブリダイゼーションを達成するためには、好ましくは１５以上の塩基数を有す。
図３ａに示すように、プローブＢ１−Ｂｎは、標的核酸の一部の領域の塩基配列Ｓ１からＳｎに相補的な配列Ｓ１’からＳｎ’と、配列Ｓ１’からＳｎ’に結合した任意のフラッグ（以下、ＦＬとも示す）とからなる。この例では、フラッグは標識物質を含む。上述の例と同様にフラッグは、これ自身が標的核酸と結合はせず、また、これらは互いに如何なる相互作用も示さないことが必要である。本例のプローブＢ１−Ｂｎは、配列Ｓ１’からＳｎ’に何れかの手段により標識物質が結合される構造である。
本発明で使用される標識物質は、例１において記載通りの一般的に標識物質として使用される如何なる物質であってもよい。
本発明に使用される配列Ｓ１’からＳｎ’は、１以上の塩基数を有し、好ましくは１５以上の塩基数を有する。
また、プローブＡ１−Ａｎに具備されるＴｇと、プローブＢ１−Ｂｎに具備されるＦＬとは、図３ｂに示すように、両プローブが標的核酸の各々目的とする領域に結合したときに、互いに遠方の端に位置するように設計されることが好ましい（図３ｂ）。また、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎは、両プローブが標的核酸の各々目的とする領域に結合したときに、標的核酸の隣り合う塩基に対して相補的な塩基を近方の端に有することが好ましい。これにより、以後の工程におけるライゲーションに有利となる。しかし、これに限定されるものではない。
これらのプローブに含まれるＦ１’からＦｎ’およびＳ１’からＳｎ’の配列は、例えば、ＧＣ含量や核酸塩基の組成等を適切に選択すれば、各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件のばらつきを抑制することが可能である。また複数種類のタグ配列を用いる場合にも、タグ間のハイブリダイゼーション条件を統一することが好ましい。さらにＦｎ’およびＳｎ’配列のＴｍ値よりタグ配列のＴｍ値を十分に高くすることにより、検出感度が向上する。
この例は、以下のように実施する。まず、標的核酸Ｎ１−Ｎｎに応じて、上述のようなプローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを準備する。これらを適切な割合で、標的核酸Ｎ１−Ｎｎと混合する（図３ａ）。
次に、該混合物をハイブリダイゼーションに適した任意の条件で一定時間インキュベーションし、ハイブリダイゼーションを行なう（図示せず）。
該ハイブリダイゼーションは、一般的な何れの手法によっても行なうことが可能である。好ましいハイブリダイゼーションは、先ず、核酸の変性に有効な適宜の高温、例えば、９５℃で５分間静置することにより、標的核酸の相補的結合を解除して二本鎖から一本鎖へと変性させる。標的核酸が一本鎖の場合は７０℃で５分間静置することにより、その２次構造へ変性させる。次に、相補的塩基配列の再結合に有効な適宜の温度、例えば５５℃にて１５分間静置することにより、一本鎖の標的核酸が、相補的な塩基配列と再び結合するように実施される。
かかるハイブリダイゼーションにより、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎの両方が、夫々の組毎に同一の標的核酸上に結合してハイブリッドを生成する。従って、使用する緩衝液の種類、温度条件等は、上述の条件に限定される必要はなく、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎが標的核酸にハイブリダイズする条件であれば、どのような条件であってもよい。
次に、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを夫々連結する（図３ｂ）。本発明では、標的核酸Ｎ１−Ｎｎ上にハイブリダイズした状態のプローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを連結し、プローブ（Ａ１＋Ｂ１）−プローブ（Ａｎ＋Ｂｎ）を生成する。この連結は連結部の形成により達成される。この連結は、例１と同様に行えばよい。
また、標的核酸上の配列Ｆと配列Ｓが、互いに隣接していない場合には、ＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼを用いて、ギャップの充填反応等を行えばよい。それにより、両プローブ間隙に核酸塩基が導入される。使用されるＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼは、一般的に使用される何れのものでもよいが、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼが好ましい。
続いて、前記で得たプローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を標的核酸から解離する（図３ｃ）。該解離は、熱的変性等の変性処理により行なえばよい。例えば、熱的変性により行なう場合には、生理的条件下では、８５℃以上、好ましくは９０℃以上の温度にすればよいが、これに限定されない。
次に、プローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を、夫々のＴｇ１からＴｇｎに相補的な配列Ｔｇ１’からＴｇｎ’にハイブリダイゼーションすることにより回収する（図３ｄ）。その後、標識物質を検出または定量し、標的核酸の検出または定量を達成する（図３ｄ）。該検出は、使用した標識物質に応じて、一般的に使用される何れの方法も使用できる。
相補的な配列Ｔｇ１’からＴｇｎ’は支持体に固定されて使用することが好ましい。使用される支持体には、例えば、シリコンおよびガラス等の基板、ビーズ等の粒子、試験管やバイアル瓶等の容器、繊維、キャピラリー等を含む管、フィルター、アフィニティカラム、電極等が含まれるが、これに限定されない。該支持体の材質または表面処理は、プローブの固定成績に応じて適宜選ぶのが好ましい。
例３では、複数の標的核酸についての例を示したが、１種類の標的核酸についてもこの方法を使用することも可能である。更に、標識物質の種類を増やすことにより、更に多くの種類の標的核酸を簡便に識別することが可能である。
例４
次に図４を参照しながら、本発明の方法の更なる例を説明する。本例の方法は、複数の標的核酸Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３・・・Ｎｎ（ここで、ｎは２以上の整数。以下、Ｎ１−Ｎｎと称する）を同時に検出する例である。標的核酸Ｎ１−Ｎｎに応じて、プローブＡ１、Ａ２、Ａ３・・・Ａｎ（ｎは２以上の整数。以下、Ａ１−Ａｎと称する）とプローブＢ１、Ｂ２、Ｂ３・・・Ｂｎ（ここで、ｎは２以上の整数。以下、Ｂ１−Ｂｎと称する）を準備する。これらは、更に以下に示すような特徴を有す核酸プローブである（図４ａ）。
プローブＡ１−Ａｎは、該標的核酸Ｎ１−Ｎｎの一部の領域における塩基配列Ｆ１からＦｎに対して相補的な配列Ｆ１’からＦｎ’と、夫々の配列Ｆ１’からＦｎ’に結合されたタグＴｇ１からＴｇｎからなる。本例のタグＴｇ１からＴｇｎは塩基配列であり、夫々のタグＴｇ１からＴｇｎは、標的核酸の何れの部分とも結合せず、また標的核酸とどの様な相互作用も生じないことが必要である。ここで、タグＴｇ１からＴｇｎは、直接に配列Ｆ１’からＦｎ’に結合しても、または、任意の塩基配列等の何らかの仲介部分を介して間接的に配列Ｆ１’からＦｎ’に結合してもよい。例えば、任意の配列をもって間接的に結合させる場合、当該配列は如何なる塩基配列であっても、如何なる塩基数であってもよい。好ましくは、標的核酸上の塩基配列に非相補的である。或いは、他の化学的または物理的な手段により結合されていてもよい。
本発明に使用される配列Ｆ１’からＦｎ’は、夫々異なる１以上の塩基数を有す。安定なハイブリダイゼーションを達成するためには、好ましくは１５以上の塩基数を有す。
図４ａに示すように、プローブＢ１−Ｂｎは、標的核酸の一部の領域の塩基配列Ｓ１からＳｎに相補的な配列Ｓ１’からＳｎ’と、配列Ｓ１’からＳｎ’に結合した任意のフラッグとからなる。この例では、フラッグは任意の塩基配列ＦＬ１からＦＬｎと標識物質とを含む。上述の例と同様にフラッグは、これ自身が標的核酸と結合はせず、また、これらは互いに如何なる相互作用も示さないことが必要である。本例のプローブＢ１−Ｂｎは、配列Ｓ１’からＳｎ’に何れかの手段により標識物質が結合される構造である。
本発明で使用される標識物質は、例１において記載した通りの一般的に標識物質として使用される如何なる物質であってもよい。
本発明に使用される配列Ｓ’は、１以上の塩基数を有し、好ましくは１５以上の塩基数を有する。
また、プローブＡ１−Ａｎに具備されるＴｇと、プローブＢ１−Ｂｎに具備されるＦＬとは、図４ｂに示すように、両プローブが標的核酸の各々目的とする領域に結合したときに、互いに遠方の端に位置するように設計されることが好ましい（図４ｂ）。また、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎは、両プローブが標的核酸の各々目的とする領域に結合したときに、標的核酸の隣り合う塩基に対して相補的な塩基を近方の端に有することが好ましい。これにより、以後の工程におけるライゲーションに有利となる。しかし、これに限定されるものではない。
これらのプローブに含まれるＦ１’からＦｎ’およびＳ１’からＳｎ’の配列は、例えば、ＧＣ含量や核酸塩基の組成等を適切に選択すれば、各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件のばらつきを抑制することが可能である。また複数種類のタグ配列およびフラッグ配列を用いる場合にも、タグ間およびフラッグ間のハイブリダイゼーション条件を統一することが好ましい。さらにＦｎ’およびＳｎ’配列のＴｍ値よりもタグ配列およびフラッグ配列のＴｍ値を十分に高くすることにより、検出感度が向上する。また一つのタグ配列に対して複数種類のフラッグ配列を用いると互いに区別できる標的核酸の種類を飛躍的に増やすことができる。
この例は、以下のように実施する。まず、標的核酸Ｎ１−Ｎｎに応じて、上述のようなプローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを準備する。これらを適切な割合で、標的核酸Ｎ１−Ｎｎと混合する（図４ａ）。
次に、該混合物をハイブリダイゼーションに適した任意の条件で一定時間インキュベーションし、ハイブリダイゼーションを行なう（図示せず）。
該ハイブリダイゼーションは、一般的な何れの手法によっても行なうことが可能である。好ましいハイブリダイゼーションは、先ず、核酸の変性に有効な適宜の高温、例えば、９５℃で５分間静置することにより、標的核酸の相補的結合を解除して二本鎖から一本鎖へと変性させる。次に、相補的塩基配列の再結合に有効な適宜の温度、例えば５５℃にて１５分間静置することにより、一本鎖の標的核酸が、相補的な塩基配列と再び結合するように実施される。
かかるハイブリダイゼーションにより、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎの両方が、夫々の組毎に同一の標的核酸上に結合してハイブリッドを生成する。従って、使用する緩衝液の種類、温度条件等は、上述の条件に限定される必要はなく、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎが標的核酸にハイブリダイズする条件であれば、どのような条件であってもよい。
次に、プローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを夫々連結する（図４ｂ）。本発明では、標的核酸Ｎ１−Ｎｎ上にハイブリダイズした状態のプローブＡ１−ＡｎおよびプローブＢ１−Ｂｎを連結し、プローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を生成する。この連結は連結部の形成により達成される。この連結は、例１と同様に行えばよい。
また、標的核酸上の配列Ｆと配列Ｓが、互いに隣接していない場合には、ＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼを用いて、ギャップの充填反応等を行えばよい。それにより、両プローブ間隙に核酸塩基が導入される。使用されるＤＮＡポリメラーゼＩとリガーゼは、一般的に使用される何れのものでもよいが、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼが好ましい。
続いて、前記で得たプローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を標的核酸から解離する（図示せず）。該解離は、熱的変性等の変性処理により行なえばよい。例えば、熱的変性により行なう場合には、生理的条件下では、８５℃以上、好ましくは９０℃以上の温度にすればよいが、これに限定されない。
次に、プローブ（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）を、夫々のＴｇ１からＴｇｎに相補的な配列Ｔｇ１’からＴｇｎ’にハイブリダイゼーションすることにより回収する（図４ｃ）。続いて、変性により当該プローブを解離し、その後、ＦＬ１からＦＬｎの配列に相補的な配列ＦＬ１’からＦＬｎ’にハイブリダイゼーションすることにより回収する（図４ｄ）。次に、夫々の標識物質を検出または定量し、標的核酸の検出または定量を達成する（図４ｅ）。該検出は、使用した標識物質に応じて、一般的に使用される何れの方法も使用できる。
相補的な配列Ｔｇ１’からＴｇｎ’および配列ＦＬ１’からＦＬｎ’は、支持体に固定されて使用することが好ましい。使用される支持体には、例えば、シリコンおよびガラス等の基板、ビーズ等の粒子、試験管やバイアル瓶等の容器、繊維、キャピラリー等を含む管、フィルター、アフィニティカラム、電極等が含まれるが、これに限定されない。該支持体の材質または表面処理は、プローブの固定成績に応じて適宜選ぶのが好ましい。
例５．検出方法の例
以下に、本発明の好ましい更なる例について説明する。以下の方法は、フラッグの設計を工夫することにより、多種類の標的核酸を、高精度に且つ効率よく検出することが可能な方法である。
この方法では、以下に示すような２種類の核酸プローブ、即ち、プローブＡおよびプローブＢが使用される（図５ａ）。
プローブＡは、標的核酸の一部の領域の塩基配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、これに結合した結合分子からなる。
ここで、結合分子は、互いに特異的に高親和性を有する２つの物質の内の何れか一方の物質である。例えば、ビオチンまたはアビジン若しくはストレプトアビジン等である。また、結合分子は、直接に配列Ｆ’に結合しても、或いは任意の配列を解して間接的に配列Ｆ’に結合してもよい。間接的に結合する場合の任意の配列は、如何なる塩基配列であっても、如何なる塩基数であってもよい。好ましくは、標的核酸上の塩基配列に非相補的な配列である。
プローブＢは、標的核酸の一部の領域の塩基配列Ｓに相補的な配列Ｓ’とフラッグとからなる。本例におけるフラッグは二本鎖からなる。前記二本鎖は、複数のユニットからなる任意の配列を有す。また、フラッグは、これ自身が標的核酸と結合はせず、また、これらは互いに如何なる相互作用も示さないことが必要である。
本方法に使用される配列Ｆ’および配列Ｓ’は、１以上の塩基数を有し、より好ましくは１５以上の塩基数を有する。
ユニットの設計例を図７に示す。フラッグＦＬの複数のユニットの各１ユニットは、１０塩基数以上としてよく、より好ましくは約１５塩基数である。フラッグＦＬのユニット数は、何れでもよいが、解析の容易さから４ユニットが好ましい。しかし、これに限られるものではない。
複数の標的核酸を同時に検出する場合には、多種類のユニットを組み合わせてフラッグＦＬを構築する。たとえば、ＳＤ、ＤＯ、Ｄ１、ＥＤの４ユニットからなるフラッグＦＬを設計する場合を例とすると、先ず、２２種類のユニットを設計し、その中から２種類を選択してプライマーとなるＳＤユニットと、もう１つのプライマーであるＥＤユニットとする。残りの２０種類のユニットを用いて、各標的核酸の種類毎に、選択する２つのユニットの種類を変えることによりＤ０、Ｄ１を設計すると、１００種類の異なる核酸配列を検出することが可能である（図７Ａ）。
２２種類のユニットは、正規直交化された塩基配列により設計することが好ましい。正規直交化された塩基配列はＴｍ値が揃っており、相補配列以外とは安定したハイブリッドは形成しない。また、相補配列とのハイブリッド形成を阻害するような安定した２次構造は形成しない。これにより、最終的な検出時のミスハイブリを少なくし、ハイブリの形成速度を上げることが可能になる。したがって、検出精度を向上すること、および検出時間を短縮することが可能になる。また、ユニット数を増すことや、ユニットの種類を増すことにより、１００００種類の異なる核酸配列をも検出することが可能である。
図５を用いて、本例の方法を更に説明する。図５ａに、４ユニットからなるフラッグＦＬの例を示した。該４ユニットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；以後、ＰＣＲ増幅またはＰＣＲ反応と称す）においてプライマーとなるＳＤユニットと、標的核酸の種類を認識するための認識用ユニット、即ち、Ｄ０ユニットおよびＤ１ユニットと、およびもう１つのプライマー配列であるＥＤユニットとからなる。これらの各ユニットは、後の工程においては、夫々が読み取り枠となる。
検出は、まず上記のプローブＡとプローブＢを、標的核酸と混合する（図５ａ）ことにより行う。このとき、試料に含まれる標的核酸は、複数の異なる核酸分子群であってもよい。例えば、検出されるべき標的核酸の種類が１００種類以下であるならば、Ｄ０ユニットは、Ｄ０−１からＤ０−１０の１０種類の中から選択され、且つＤ１ユニットは、Ｄ１−１からＤ１−１０の１０種類の中から選択される（図７Ａ）。
次に、プローブＡ、プローブＢ、および標的核酸をハイブリダイゼーションに適した条件で一定時間インキュベーションし、ハイブリダイゼーションを行なう（図５ｂ）。ハイブリダイゼーションの条件は、例１に示す通りでよい。
かかるハイブリダイゼーションにより、プローブＡおよびプローブＢの両方が同一の標的核酸上に結合する（図５ｂ）。
次に、標的核酸にハイブリダイズしたプローブＡおよびプローブＢを連結する（図５ｃ）。連結の条件は、例１に示す通りでよい。
また、フラッグＦＬのＴｍ値は、配列Ｆ’およびＳ’より高い温度に設計することが好ましい。これにより本検出方法におけるハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび変性等の操作の加熱または冷却の際に、検出感度の低下をもたらすフラッグの変性を防ぐことが可能である。
次に、得られたフラッグＦＬの情報をＢ／Ｆ分離する。具体的には、プローブ（Ａ＋Ｂ）に具備される結合分子を、その対となるべき結合分子を介して固相担体に補足する（図５ｅ）。
前記固相担体は、基板、ビーズ等の粒子、容器、繊維、管、フィルター、アフィニティ・カラム、電極等を用いることが可能であるが、好ましくはビーズである。
次に、結合分子に捕捉された状態で、プローブ（Ａ＋Ｂ）のフラッグＦＬを変性し一本鎖にする（図５ｆ）。得られた液相中の一本鎖配列ＦＬ’に対してＰＣＲ増幅を行なう（図５ｇ）。上述したように、予めフラッグＦＬには、２つのプライマー配列ＳＤおよびＥＤが配置してある。従って、このプライマー配列を利用してＰＣＲ反応が容易に行ない得る。また、このとき、ＰＣＲに使用する２つのプライマーの一方、たとえばＳＤ配列に、ビオチン等の結合分子を結合しておくことが好ましい。このときのＰＣＲの詳細な条件は、設計したフラッグＦＬに依存する。
続いて、該ＰＣＲ反応の終了後、結合分子を固相した固相担体に結合することによって、ＰＣＲ産物である二本鎖配列を回収する（図５ｉ）。ここで、固相化された担体は、前記結合分子と対になる結合対のもう一方の物質である。さらに、変性により配列ＦＬ’を除き、一本鎖配列ＦＬのみを固相担体上で回収する（図５ｉ）。
続いて、固相上の一本鎖フラッグ配列ＦＬの解析を行なう。まず、一本鎖フラッグ配列ＦＬが結合した前記固相担体を１０等分する（Ｄ１ユニットがＤ１−１からＤ１−Ｄ１０の場合）。各々に、標識分子と結合したＤ１−１’からＤ１−１０’配列の一つおよび全てのＤ０’配列（Ｄ０−１’からＤ０−１０’）を加え、フラッグ配列ＦＬにハイブリダイズする。
続いて、ハイブリダイズした２つの核酸分子をライゲーションにより連結する。ここで、ライゲーションの条件および標識物質に関する定義は上述した通りである。その後、変性により連結された分子を液相に回収する。
得られた標識された核酸分子の解析は、予めＤ０−１からＤ０−１０の核酸分子を固相化したＤＮＡチップまたはＤＮＡキャピラリ等に対して、ハイブリダイズすることにより行うことができる。特に、ＤＮＡキャピラリは、Ｄ０−１からＤ０−１０で１０等分に分けられたものを同時に処理できるので、これにより分析は容易になるであろう。
例えば、各１０種類のＤ０−１からＤ０−１０と、Ｄ１−０からＤ１−１０の配列を用いてフラッグＦＬを設計した場合、図７Ａの１の位置にはＤ０−１に相当する配列が固定され、標識されたＤ１−１’分子と連結された拡散分子６３にハイブリダイズされる。同様に、他の位置には列により相当するＤ０配列が固定され、行により相当するＤ１分子と連結された拡散分子にハイブリダイズされる。このような行列の配置を、後述するＤＮＡキャピラリに対して用いる（図７Ｂ）と解析が容易に行える。
ここでは、１０種類のユニットを用いた例を挙げたが、ユニットの種類は１０種類に限られるものではなく、それ以下でも、それ以上でもよい。
ここで使用する「ＤＮＡキャピラリ」とは、標的核酸を検出するための装置であり、その内側に該標的核酸に対する相補的配列が結合されており、該相補的配列に標的核酸を結合することにより、該標的分子を検出する装置をいう。図７Ｂに示す通り、多数のＤＮＡキャピラリを同時に使用し、且つ斜線で示した部分に、互いに異なるプローブを配置することにより、同時に多くの標的核酸を検出することが可能である。
また、本方法では、フラッグ配列ＦＬの各ユニットには正規直交化配列が使用されているので、実施されるハイブリダイズの反応温度等の条件を均一化することが可能である。これにより、ミスハイブリを防止でき、高い精度が得られる。また、同一条件の下で一度に多くの解析を行なうことが可能であるため、検出時間の短縮化を達成することが可能である。また、本方法により複雑なゲノム情報をＤＮＡの塩基配列で表現した数値に変換することも可能となり、ＤＮＡ分子反応を利用した計算を行うことにより、多種類の情報や、互いに連鎖した複雑な遺伝子情報を容易に解析することが可能になる。また、コード化したのちに容易にコード化核酸を増幅できるので、少ないコピー数の標的配列であっても正確に且つ定量的に検出することが可能である。また、コード化することにより、多くの情報を圧縮することが可能である。従ってＤＮＡチップまたはキャピラリーアレイ等の検出手段の所要数を節約することが可能である。
ここで使用する「エンコード反応」とは、ある塩基配列を、正規直交化塩基配列で表現されるコードに変換することをいう。上述の図５ａからｆの工程がこれに相当する。
また、ここで使用する「デコード反応」とは、前記で変換されたコードの読み取りを行ない、それにより元の情報を復元することをいう。上述の図５ｊの工程がこれに相当する。
上記の例５では、１種類の標的核酸を検出する例を示したが、複数種類のフラッグ配列を設計すれば、同様な工程を経ることにより複数種類の標的核酸を同時に検出することも可能である。
また、例５の応用例を図６に示す。図６に示した例では、検出する標的核酸に応じて、Ｄ０１−Ｄ１１からＤ０１−Ｄ１ｎ（ここで、ｎは整数である）を含むフラッグ配列が設計される。これを例５の工程ａからｆと同様に処理し、更に、以下のようなデコード反応を行う（図６）。即ち、得られた一本鎖配列ＦＬ’に対して、２つのプライマー配列ＳＤおよびＥＤを用いて、ＰＣＲ反応を行う（図６ｇ）。ここで図６ｇからｉの工程は、多種類のプローブ等を代表してｎについて図示したが、この工程では、１からｎの多種類のプローブ等も同様に存在していると理解されるべきである。また、このとき、ＳＤ配列にはビオチン等の結合分子を結合しておくことが好ましい。のときのＰＣＲの詳細な条件は、設計したフラッグＦＬに依存してよい。得られた二本鎖を前記結合分子と対となる物質を用いて回収する（図６ｈ）。これを変性し、洗浄して一本鎖にする（図６ｉ）。続いて、夫々のＦＬ配列のＤ１１−Ｄ１ｎに相補的であり、且つ標識物質を付与されたプライマーをハイブリダイズして伸長する（図６ｊ）。得られた各Ｄ１１’−Ｄ１ｎ’を、Ｄ０１−Ｄ１ｎが固相されたチップまたはキャピラリーアレイを用いることによって検出する（図６ｋ）。また、当該反応は、以下のような方法によっても実施することが可能である。即ち、プローブＡとプローブＢを連結し、プローブＢに付与した結合物質またはＴｇｎ配列を利用してＢ／Ｆ分離を行った後で、ＰＣＲを行わずに、得られたＦＬを直接に検出することも可能である。この場合にも、Ｓｎ’に連結する配列は、２ユニットでもよい。また、その場合には、Ｄ０ｎ配列およびＤ１ｎ配列をＤＮＡチップまたはキャピラリーアレイに固相化して用いてもよい。この場合の検出は、予め当該ＦＬ配列毎に異なる上述の標識物質を付与しておいても、または、ＤＮＡチップ等の所望する領域に配列毎に結合した後に標識物質を付与してもよい。
例６．実験
本発明の方法が、実際に有用であることを示すために以下のような実験を行なった。使用した配列と、その結合様式を図８に示す。
（１）標的配列と変異配列
使用する標的配列は、ｒ−３２〜ｆｌを用いた（図９）。また、検出方法の特異性を確認するために該標的配列とその配列が異なる変異配列を使用した。変異配列は、ｆｌ−ｎｅｇ−ｒ−３２ＡＢである（図９）。
（２）プローブと検出用配列
プローブＡは、ｂ−１６Ａを用いた（図９）。プローブＡに含まれるｂは、ビオチンを示す。また、プローブＢは、Ｐ−１６Ｂ−４８を用いた（図９）。プローブＢは、フラッグＦＬを含み、Ｐはリン酸基を示す。プローブＢのＦＬ配列に相補的な配列が、検出用配列であり、ｆｌ−ｒ−４８を使用した（図９）。
（３）実験方法
上記のプローブ等を用いて、標的配列の検出を試みた。先ず、夫々、ｐＨ８．０のＴＥ緩衝液中で５００ｐｍｏｌのプローブＢ溶液と、同量の検出用配列の溶液を混合し、９５℃で１分間インキュベーションし、その後、７分間かけて２５℃とし二本鎖とした。
次に、得られた二本鎖化したプローブＢと、標的配列と、プローブＡとを混合し、１００μｌのライゲーション用緩衝液中で２０ＵのＴａｇＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いてライゲーション反応を行なった。この反応は、７０℃から５５℃まで５分間かけて温度を下げることでプローブＡおよびプローブＢを標的配列にアニールさせたのち、ＴａｇＤＮＡリガーゼを添加して、５５℃で１５分間ライゲーション反応を行い、次いで、室温に温度を下げることとにより進行した。ストレプト アビジンを固相した磁気ビーズに上記のライゲーション後の試料を加え、３０℃でプレコールドウォッシュ（ｐｒｅ−ｃｏｌｄ ｗａｓｈ）を行ない、未反応の標的配列を除去し、同一温度でコールドウォッシュを行ない標的配列を除去した。上清を除去した後、ＴＥ緩衝液を１００μｌ添加し、７０℃で洗浄、即ち、ホットウォッシュ（ｈｏｔ ｗａｓｈ）を行ない、検出用配列を回収した。
（４）．実験結果
以下に検出結果を示す。図１０は、各々の洗浄過程において上清から得られた配列をキャピラリ電気泳動により検出したものである。プレウォッシュで回収された上清には、ライゲーション反応に付されなかった標的配列が含まれることが示された。また、コールドウォッシュにより回収された上清には、ライゲーションに付された塩基配列の標的配列が含まれることが示された。また、ホットウォッシュにより回収された上清中には、検出用配列が含まれ、その塩基長に相応する長さのＤＮＡが検出されたことが示された。
図１１は、標的配列の濃度と回収された検出用配列の濃度との関係を示す結果である。これは、上述の方法において添加した標的配列の濃度を、０、５、１０、２０、２５および５０ｎＭと変えた場合に検出された検出用配列の回収率をパーセンテージで示したグラフである。グラフから明らかであるように、標的配列の濃度が増加するに従い、検出された検出用配列の回収率も増加した。このことは、本検出方法が有用であることの証明の１つである。
図１２は、本方法の特異性について検討した結果を示す。即ち、標的配列の一部の塩基配列が異なる変異配列を検出系に存在した場合の、検出用配列の回収率について示す結果である。上述の方法において、標的配列を添加するのと同時に、変異配列を０．０５、０．５および１μＭで添加した。その結果、図１２に示す通り、変異配列の存在は、検出用配列の回収率に影響を与えなかった。従って、本検出方法は、標的配列を特異的に検出できることが証明された。
例７．実験
本発明の方法、特に、エンコード反応とデコード反応の特異性と定量性について示すために以下のような実験を行なった。使用した配列を図１３Ａに示す。また、各プローブと、これを構成する要素との対応を図１３Ｂに示す。
７−１．エンコード反応の特異性
（１）実験方法
まず、ＩＧＴＰのプローブＢＩＡＴＰ（Ｓ’ＩＧＴＰ＋ＳＤ＋Ｄ０ＩＧＴＰ＋Ｄ１ＩＧＴＰ＋ＥＤ、０．３ｎＭ）、およびＬＲＧ−４７のプローブＢＬＲＧ−４７（Ｓ’ＬＲＧ−４７＋ＳＤ＋Ｄ０ＬＲＧ−４７＋Ｄ１ＩＧＴＰ＋ＥＤ、０．３ｎＭ）、ＩＧＴＰのプローブＡＩＧＴＰ（０．３ｎＭ）、標的遺伝子としてのＩＧＴＰ遺伝子を０．３ｎＭから０．００３ｎＭを、ＴａｑＤＮＡリガーゼ（ＴａｑＤＮＡｌｉｇａｓｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）に添付のライゲーション緩衝液中で混合した。得られた混合液の温度を、７０℃から１分間当たり３℃の割合で下げ、５５℃になったところで２０ユニットのリガーゼを添加し、総量を３０μＬとした。その後、ライゲーション反応を１５分間行った。その後、１０ｍｇ／ｍＬのダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を１μＬで添加して、１５分間混合した。上清を除去した後、ＴｒｉｓＥＤＴＡ緩衝液（以下、ＴＥを略す）を２０μＬ添加した。これを６０℃で洗浄し、未反応のプローブＡ、プローブＢおよび標的核酸配列を洗浄した（即ち、コールドウォッシュまたは室温洗浄である）この洗浄を２回行った。上清を除去した後、２０μＬのＴＥを添加した。９５℃で、エンコードされたフラッグ配列を回収した。ＬＲＧ−４７に対するエンコード反応についても、同様に、標的遺伝子であるＬＲＧ−４７遺伝子に対応するプローブＡとプローブＢとを、ライゲーションすることによって評価を行った。エンコード反応を行うことにより連結されたプローブに対して、ＳＤ配列とＥＤ配列を各々プライマーとして使用して、ＰＣＲを行った。本鎖用のキャピラリー電気泳動により計測した。
（２）．実験結果
図１５は、上述で行った試験の概要を示すスキーム図である。以下に検出結果を示す。図１４ＡおよびＢは、キャピラリー電気泳動に供した場合に得られる結果をしたものである。図１４ＡおよびＢに示す通り、本発明のエンコード反応により、各々のＦＬ配列に対して特異的なＰＣＲ増幅が達成され、それによって特異的なＰＣＲ産物が得られた。
７−２．エンコード反応後のＰＣＲ増幅の定量性
（１）実験方法
エンコード反応後に行うＰＣＲの一様性と定量性を以下の方法を用いて検証した。本試験は、上述の通りのＩＧＴＰを検出するためのフラッグ配列とＬＲＧ−４７を検出するためのフラッグ配列について行った。ＩＧＴＰおよびＬＲＧ−４７を検出するためのフラッグ配列は、各々ＳＤ配列とＥＤ配列を含む。従って、ＩＧＴＰ用のフラッグ配列と、ＬＲＧ−４７用のフラッグ配列について、ＳＤ配列およびＥＤ配列を用いて、各々ＰＣＲを行った。このＰＣＲに添加した両配列鎖は、夫々１００ｐＭから１０ｆＭとした。また、このＰＣＲは、９４℃で３０秒、６５℃で６０秒、７２℃で３０秒を２５回繰り返した。
（２）実験結果
図１７は、上述で行った試験の概要を示すスキーム図である。以下に検出結果を示す。図１５は、キャピラリー電気泳動に供した場合に得られる結果をしたものである。図１６に示す通り、本発明のエンコード反応後のＰＣＲ増幅量は標的配列の濃度依存していることが示された。
７−３．デコード反応の特異性と定量性
（１）実験方法
使用した配列は、上述した通りである。即ち、ビオチン化したＳＤ＋Ｄ０ＩＧＴＰ＋Ｄ１ＩＧＴＰ＋ＥＤ配列（以下、ｂ−ｃｏｄｅ１とも称す）と、ビオチン化したＳＤ＋Ｄ０ＬＲＧ−４７＋Ｄ１ＬＲＧ−４７＋ＥＤ配列（以下、ｂ−ｃｏｄｅ２とも称す）について、デコード反応を行った。夫々１００μＭの濃度のｂ−ｃｏｄｅ１およびｂ−ｃｏｄｅ２の０．２μＬと、１ＭのＮａＣｌを含有するＴＥ緩衝液４９．８μＬと、４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬのダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジンとを混合し、１５分間撹拌した。これを室温で洗浄して、その上清を除去した。得られた当該ビーズに、更に５０μＬのＴＥ緩衝液を添加して室温で洗浄した。上清を除去し、得られたビーズに更に５０μＬのＴＥ緩衝液を添加して、８０℃で洗浄し、その上清を除去した。その後、ライゲーション緩衝液を用いて、室温で洗浄し、その上清を除去した。続いて、Ｄ１に対するリバース鎖を、最終濃度で４００ｎｍ、並びにＤ０ＩＧＴＰおよびＤ０ＬＲＧ−４７に対するリバース鎖を、最終濃度で各々４００ｎｍになるように当該得られたビーズに添加した。これを９５℃に加温して一本鎖化を行い、次に、１分間当たり７℃の割合で温度を下げた。続いて、６０℃で２０ユニットのＴａｑリガーゼを添加してライゲーション反応を１５分間行った。その上清を除去した後、５０μＬのＴＥ緩衝液を添加して、室温で洗浄した。その上清を除去し、再度、５０μＬのＴＥ緩衝液を添加した。この温度を８０℃に加温し、その上清を回収することによって、前記ライゲーションしたプローブを回収した。得られた上清に、上記のストレプトアビジンビーズの４０μＬを添加し、更に、１ＭのＮａＣｌを含有するＴＥ緩衝液１２．５μＬを添加して、１５分間撹拌した。その後、８０℃で上清を回収し、２本のチューブに前記上清を各２０μＬずつ分注した。前記２本のチューブの各々に対して、ビオチン化したＤ０ＩＧＴＰに対応する配列を持ったプローブ（即ち、ｂ−１）と、ビオチン化したＤ０ＬＲＧ−４７に対応する配列を持ったプローブ（即ち、ｂ−２）を、各々、１００μｍｏｌずつ各チューブに添加し、更に、２ＭのＮａＣｌを含有する１６μＬのＴＥ緩衝液を添加した。これを９５℃に加温した。その後、１分間当たり１０℃の割合で２５℃まで温度を下げることによりハイブリダイゼーションを行った。この溶液に、４０μＬの上記のストレプトアビジンビーズを添加し、１５分間撹拌した。その後、上清を除去し、４０μＬのＴＥ緩衝液を添加して、室温で洗浄した。その上清を除去し、更なる４０μＬのＴＥ緩衝液を添加して、４０℃で洗浄した。その上清を除去し、更なる４０μＬのＴＥ緩衝液を添加して７０℃まで加温した。その上清を回収し、各々、一本鎖用のキャピラリー電気泳動を行った。
（２）実験結果
図１９は、上述で行った試験の概要を示すスキーム図である。以下に検出結果を示す。図１８ＡおよびＢは、キャピラリー電気泳動に供した場合に得られる結果をしたものである。本発明のデコードは、当該エンコード反応により増幅したＰＣＲ産物に対して、各々の遺伝子に対応したＤ１、ラベルしたＤ２配列を用いて連結反応を行った。ビオチン標識したＤ１ＩＧＴＰおよびＤ１ＬＲＧ−４７を用いて、連結反応が起こったプローブを検出した結果、図１７に示す通り、各々の遺伝子に対応した産物を特異的に検出することが可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
本発明の方法の幾つかの好ましい例を、添付の図面を参照して説明する。図面は以下の通りである。
図１は、本発明の方法の第１の例を示すフローチャートである。
図２は、本発明の方法の第２の例を示すフローチャートである。
図３は、本発明の方法の第３の例を示すフローチャートである。
図４は、本発明の方法の第４の例を示すフローチャートである。
図５は、本発明の方法の第５の例を示すフローチャートである。
図６は、本発明の方法の更なる例を示すフローチャートである。
図７Ａは、本発明で使用されるフラッグの設計例を示す表である。図７Ｂは、図７Ａの設計例に対応する検出装置の例を示す図である。
図８は、本発明の第１の例の評価実験において、プローブが標的核酸と結合した状態を示す模式図である。
図９は、本発明の第１の例の評価実験に使用したプローブＡおよびプローブＢ、標的配列、検出用配列および変異配列を示す図である。
図１０は、各々の洗浄過程における上清から得た配列を、キャピラリ電気泳動により検出した結果を示すチャートである。
図１１は、検出用核酸の回収率に対する標的核酸の濃度の影響を示すグラフである。
図１２は、検出用核酸の回収率に対する標的配列の一部が異なる変異配列の影響を示すグラフである。
図１３Ａは、本発明の第５の例の評価実験に使用した２種類のプローブＡ、プローブＢおよび標的配列を示す図である。図１３Ｂは、各プローブと、これを構成する要素との対応を示す図である。
図１４ＡおよびＢは、本発明のエンコード反応の特異性を示すグラフである。
図１５は、本発明のエンコード反応の特性を評価する実験のスキーム図である。
図１６は、本発明のエンコード反応後のＰＣＲの定量的増幅を示すグラフである。
図１７は、本発明のエンコード反応後のＰＣＲの定量的増幅の試験方法を示すスキーム図である。
図１８ＡおよびＢは、本発明のデコード反応の特異性と定量性を示すグラフである。
図１９は、本発明のデコード反応の特異性と定量性の試験方法のスキーム図である。
Claims (19)
- 試料中の所定の配列を有する標的核酸を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブＡとプローブＢを準備する工程と；
前記標的核酸中の第１の部分配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、このＦ’に連結されたタグ配列Ｔｇとを含む第１のプローブであるプローブＡ、および
前記標的核酸中の第２の部分配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、このＳ’に連結された検出または定量可能な標識物質とを含む第２のプローブであるプローブＢ；
（ｂ）前記プローブＡと、前記プローブＢと、前記試料とを混合して、前記標的核酸中の前記配列Ｆに前記プローブＡをハイブリダイズさせると共に、前記配列Ｓに前記プローブＢをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸にハイブリダイズした前記プローブＡと前記プローブＢをライゲートして、プローブ（Ａ＋Ｂ）を生じる工程と、
ここで、前記タグ配列Ｔｇは、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の一端において含まれ、前記標識物質は、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の他端において含まれる：
（ｄ）得られたプローブ（Ａ＋Ｂ）と前記標的核酸とを解離する工程と、
（ｅ）前記タグ配列Ｔｇを、その配列と相補的な配列Ｔｇ’にハイブリダイズさせることにより、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）を回収する工程と、および
（ｆ）回収した前記プローブ（Ａ＋Ｂ）中の当該標識物質を検出または定量することにより、前記試料中の標的核酸を検出または定量する工程と
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブＡとプローブＢを準備する工程と；
前記標的核酸中の第１の部分配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、この配列Ｆ’の一端に連結された互いに特異的に結合する結合対の一方とを含む、前記結合対の一方がその一端に含まれる第１のプローブであるプローブＡ、および
前記標的核酸中の第２の部分配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、この配列Ｓ’に連結されたフラッグ配列ＦＬおよびその相補核酸ＦＬ’を含む二本鎖核酸であるフラッグとを含み、前記二本鎖核酸であるフラッグの末端において前記相補核酸ＦＬ’が検出または定量可能な標識物質を含む第２のプローブであるプローブＢ；
（ｂ）前記プローブＡと、前記プローブＢと、前記試料とを混合して、前記標的核酸中の前記配列Ｆに前記プローブＡをハイブリダイズさせると共に、前記配列Ｓに前記プローブＢをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸にハイブリダイズした前記プローブＡと前記プローブＢをライゲートしてプローブ（Ａ＋Ｂ）を生じる工程と、
ここで、前記結合対の一方は、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の一端において含まれ、前記フラッグは、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）と前記標的核酸とを解離させる工程と、
（ｅ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれる前記結合対の一方を、当該結合対の他方に結合させて、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）を回収する工程と、
（ｆ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれる前記フラッグを構成する二本鎖核酸を解離させ、前記相補核酸ＦＬ’を回収する工程と、
（ｇ）前記相補核酸ＦＬ’に含まれる当該標識物質を検出または定量することにより、前記試料中の標的核酸を検出または定量する工程と
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ（ｎは２以上の整数）を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）とプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）を準備する工程と；
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第１の部分配列群Ｆ１〜Ｆｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｆ１’〜Ｆｎ’（ｎは２以上の整数）と、各Ｆ１’〜Ｆｎ’の一端に連結された互いに特異的に結合する結合対の一方とを含み、且つ末端において前記結合対の一方を含む第１のプローブ群であるプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）、および
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第２の部分配列群Ｓ１〜Ｓｎ（ｎは２以上の整数）に相補的な配列群Ｓ１’〜Ｓｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｓ１’〜Ｓｎ’に連結されたフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎおよびその相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’とを含む二本鎖核酸であるフラッグとを含み、前記二本鎖核酸であるフラッグの末端において前記相補核酸ＦＬ１’〜ＦＬｎ’が検出または定量可能な標識物質を含む第２のプローブ群であるプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）；
（ｂ）前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと、前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎと、前記試料とを混合して、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の前記配列群Ｆ１〜Ｆｎに前記プローブ群Ａ１〜Ａｎをハイブリダイズさせると共に、前記配列群Ｓ１〜Ｓｎに前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記各標的核酸Ｎ１〜Ｎｎにハイブリダイズした前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをライゲートしてプローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）（ｎは２以上の整数）を生じる工程と、
ここで、前記結合対の一方は、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の夫々の一端において含まれ、前記フラッグ群は、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の夫々の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）と前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎとを解離させる工程と、
（ｅ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）にそれぞれ含まれる前記結合対の一方を、当該結合対の他方に結合させて、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する工程と、
（ｆ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる前記フラッグを構成する二本鎖核酸を解離させ、前記相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’を回収する工程と、
（ｇ）前記相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’に含まれる当該標識物質を検出または定量することにより、前記試料中の標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎを検出または定量する工程と
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブＡとプローブＢを準備する工程と；
前記標的核酸中の第１の部分配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、この配列Ｆ’に連結された配列であるタグ配列Ｔｇとを含む第１のプローブであるプローブＡ、および
前記標的核酸中の第２の部分配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、この配列Ｓ’に連結されたフラッグ配列ＦＬと、前記フラッグ配列ＦＬに連結された検出または定量可能な標識物質とを含む第２のプローブであるプローブＢ；
（ｂ）前記プローブＡと、前記プローブＢと、前記試料とを混合して、前記標的核酸中の前記配列Ｆに前記プローブＡをハイブリダイズさせると共に、前記配列Ｓに前記プローブＢをハイブリダイズさせた後に、前記標的核酸にハイブリダイズした前記プローブＡと前記プローブＢをライゲートして、プローブ（Ａ＋Ｂ）を生じる工程と、
（ｃ）得られたプローブ（Ａ＋Ｂ）と前記標的核酸とを解離させた後に、
解離された前記プローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれるタグ配列Ｔｇを、その配列に相補的な配列Ｔｇ’にハイブリダイズさせて、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）を回収する工程と、
（ｄ）（ｃ）で回収された当該プローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれる当該標識物質を検出または定量することにより前記試料中の標的核酸を検出または定量する工程と
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブＡとプローブＢを準備する工程と；
前記標的核酸中の第１の部分配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、この配列Ｆ’に連結された配列であるタグ配列Ｔｇとを含む第１のプローブであるプローブＡ、および
前記標的核酸中の第２の部分配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、この配列Ｓ’に連結されたフラッグ配列ＦＬおよびその相補核酸ＦＬ’を含む二本鎖核酸であるフラッグとを含み、前記二本鎖核酸であるフラッグの末端において前記相補核酸ＦＬ’が検出または定量可能な標識物質を含む第２のプローブであるプローブＢ；
（ｂ）前記プローブＡと、前記プローブＢと、前記試料とを混合して、前記標的核酸中の前記配列Ｆに前記プローブＡをハイブリダイズさせると共に、前記配列Ｓに前記プローブＢをハイブリダイズさせた後に、前記標的核酸にハイブリダイズした前記プローブＡと前記プローブＢをライゲートして、プローブ（Ａ＋Ｂ）を生じる工程と、
ここで、前記タグ配列Ｔｇは、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の一端において含まれ、前記フラッグは、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の他端において含まれる：
（ｃ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）と前記標的核酸とを解離させた後に、解離された前記プローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれるタグ配列Ｔｇを、その配列に相補的な配列Ｔｇ’にハイブリダイズさせて、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）を回収する工程と、
（ｄ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれる前記フラッグを構成する二本鎖核酸を解離させ、前記相補核酸ＦＬ’を回収する工程と、
（ｅ）（ｄ）で回収された相補核酸ＦＬ’に含まれる当該標識物質を検出または定量することにより前記試料中の標的核酸を検出または定量する工程と
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ（ｎは２以上の整数）を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）とプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）を準備する工程と；
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ（ｎは２以上の整数）中の第１の部分配列群Ｆ１〜Ｆｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列Ｆ１’〜Ｆｎ’（ｎは２以上の整数）と、各Ｆ１’〜Ｆｎ’に連結されたタグ配列Ｔｇ１〜Ｔｇｎ（ｎは２以上の整数）とを含む第１のプローブ群であるプローブ群Ａ１〜Ａｎ、および
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第２の部分配列群Ｓ１〜Ｓｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｓ１’〜Ｓｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｓ１’〜Ｓｎ’の一端に連結されたフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎと、前記各フラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎに連結された検出または定量可能な標識物質とを含む第２のプローブ群であるプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ；
（ｂ）前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと、前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎと、前記試料とを混合して、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の前記配列Ｆ１〜Ｆｎに前記プローブ群Ａ１〜Ａｎをハイブリダイズさせると共に、前記配列群Ｓ１〜Ｓｎに前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをハイブリダイズさせた後に、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎにハイブリダイズした前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをライゲートして、プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）（ｎは２以上の整数）を生じる工程と、
（ｃ）得られたプローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）と前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎとを解離させた後に、解離された前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれるタグ配列群Ｔｇ１〜Ｔｇｎを、その配列に相補的な配列群Ｔｇ１’〜Ｔｇｎ’にハイブリダイズさせて、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する工程と、
（ｄ）（ｃ）で回収された当該プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる当該標識物質を当該フラッグ配列の種類毎に選択的に検出または定量することにより前記試料中の標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎを夫々検出または定量する工程と
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ（ｎは２以上の整数）を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）とプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）を準備する工程と；
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ（ｎは２以上の整数）中の第１の部分配列群Ｆ１〜Ｆｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列Ｆ１’〜Ｆｎ’（ｎは２以上の整数）と、各Ｆ１’〜Ｆｎ’に連結されたタグ配列Ｔｇ１〜Ｔｇｎ（ｎは２以上の整数）とを含む第１のプローブ群であるプローブ群Ａ１〜Ａｎ、および
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第２の部分配列群Ｓ１〜Ｓｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列Ｓ１’〜Ｓｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｓ１’〜Ｓｎ’に連結されたフラッグ配列ＦＬ１〜ＦＬｎおよびその相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’とを含む二本鎖核酸であるフラッグと、を含み、前記二本鎖のフラッグの末端において前記相補核酸ＦＬ１’〜ＦＬｎ’が検出または定量可能な標識物質を含む第２のプローブ群であるプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）；
（ｂ）前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと、前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎと、前記試料とを混合して、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の前記配列Ｆ１〜Ｆｎに前記プローブＡ１〜Ａｎをハイブリダイズさせると共に、前記配列Ｓ１〜Ｓｎに前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをハイブリダイズさせた後に、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎにハイブリダイズした前記プローブＡ１〜Ａｎと前記プローブＢ１〜Ｂｎをライゲートして、プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）（ｎは２以上の整数）を生じる工程と、
ここで、前記タグ配列Ｔｇは、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の夫々の一端において含まれ、前記フラッグ群は、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の夫々の他端において含まれる：
（ｃ）得られたプローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）と前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎとを解離させた後に、解離された前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれるタグ配列群Ｔｇ１〜Ｔｇｎを、その配列に相補的な配列群Ｔｇ１’〜Ｔｇｎ’にハイブリダイズさせて、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する工程と、
（ｄ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる前記フラッグを構成する二本鎖核酸を解離させ、前記相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’を回収する工程と、
（ｅ）（ｄ）で回収された相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’に含まれる当該標識物質を当該フラッグ配列の種類毎に選択的に検出または定量することにより前記試料中の標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎを夫々検出または定量する工程と、
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ（ｎは２以上の整数）を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）とプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）を準備する工程と；
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第１の部分配列群Ｆ１〜Ｆｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｆ１’〜Ｆｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｆ１’〜Ｆｎ’に連結されたタグ配列群Ｔｇ１〜Ｔｇｎ（ｎは２以上の整数）を備えた第１のプローブであるプローブ群Ａ１〜Ａｎ、および
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第２の部分配列群Ｓ１〜Ｓｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｓ１’〜Ｓｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｓ群１’〜Ｓｎ’に連結された標識物質とを含む第２のプローブであるプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ
ここで、前記タグ配列Ｔｇ１〜ＴｇｎのＴｍ値は、配列Ｆ１’〜Ｆｎ’および配列Ｓ１〜ＳｎのＴｍ値よりも高い：
（ｂ）前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと、前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎと、前記試料とを混合して、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の前記配列群Ｆ１〜Ｆｎに前記プローブ群Ａ１−Ａｎをハイブリダイズさせるとともに、前記配列群Ｓ１〜Ｓｎに前記プローブ群Ｂ１−Ｂｎをハイブリダイズさせた後に、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎにハイブリダイズした前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎを夫々ライゲートして、プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）（ｎは２以上の整数）を生じる工程と、
（ｃ）得られたプローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）と前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎとを解離させた後に、解離された前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる前記タグ配列群Ｔｇ１〜Ｔｇｎを、その配列に相補的な配列Ｔｇ１’〜Ｔｇｎ’にハイブリダイズさせて、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する工程と、
（ｄ）（ｃ）で回収された当該プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）−（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる当該標識物質を検出または定量することにより、前記試料中の標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎを検出または定量する工程と、
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブＡとプローブＢを準備する工程と；
前記標的核酸中の第１の部分配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、この配列Ｆ’に連結された互いに特異的に結合する第１の結合対の一方とを含む第１のプローブであるプローブＡ、および
前記標的核酸中の第２の部分配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、この配列Ｓ’の一端に連結されたフラッグ配列ＦＬおよびその相補核酸ＦＬ’を含む二本鎖核酸のフラッグとを備えた第２のプローブであるプローブＢ；
（ｂ）前記プローブＡと、前記プローブＢと、前記試料とを混合して、前記標的核酸中の前記配列Ｆに前記プローブＡをハイブリダイズさせるとともに、前記配列Ｓに前記プローブＢをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸にハイブリダイズした前記プローブＡと前記プローブＢをライゲートして、プローブ（Ａ＋Ｂ）を生じる工程と、
ここで、前記第１の結合対の一方は、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の一端において含まれ、前記フラッグは、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）と前記標的核酸とを解離させる工程と、
（ｅ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれる前記第１の結合対の一方を、当該第１の結合対の他方に結合させて、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）を回収する工程と、
（ｆ）回収されたプローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれる二本鎖の前記フラッグから前記核酸ＦＬ’を解離させる工程と、
（ｇ）前記核酸ＦＬ’に対して、互いに特異的に結合する第２の結合対の一方をその末端に含む第１のプライマーと、検出または定量可能な標識物質をその末端に含む第２のプライマーとを用いてＰＣＲ増幅を行う工程と、
（ｈ）前記第２の結合対の一方を、当該第２の結合対の他方に結合させることにより、前記ＰＣＲ増幅産物を回収する工程と、
（ｉ）前記ＰＣＲ増幅産物に含まれる前記標識物質を検出または定量することにより、前記試料中の標的核酸を検出または定量する工程と、
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸Ｎ１〜Ｎｎ（ｎは２以上の整数）を検出または定量する方法であって、
（ａ）以下のプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）とプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）を準備する工程と；
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第１の部分配列群Ｆ１〜Ｆｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｆ１’〜Ｆｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｆ１’〜Ｆｎ’に連結された互いに特異的に結合する第１の結合対の一方とを含む第１のプローブ群であるプローブ群Ａ１〜Ａｎ、および
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第２の部分配列群Ｓ１〜Ｓｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｓ１’〜Ｓｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｓ１’〜Ｓｎ’の一端に連結されたフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎ（ｎは２以上の整数）およびその相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’（ｎは２以上の整数）を含む二本鎖核酸であるフラッグとを備えた第２のプローブ群であるプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ；
（ｂ）前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと、前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎと、前記試料とを混合して、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の前記配列Ｆ１〜Ｆｎに前記プローブ群Ａ１〜Ａｎをハイブリダイズさせるとともに、前記配列Ｓ１〜Ｓｎに前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎにハイブリダイズした前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎを夫々ライゲートして、プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を生じる工程と、
ここで、前記第１の結合対の一方は、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の一端において含まれ、前記各フラッグ配列ＦＬ１〜ＦＬｎは、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）と前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎとを解離させる工程と、
（ｅ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる第１の結合対の一方を、当該第１の結合対の他方に結合させて、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する工程と、
（ｆ）回収されたプローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる前記フラッグの二本鎖を解離させ、前記核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’を回収する工程と、
（ｇ）前記核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’に対して、互いに特異的に結合する第２の結合対の一端に含む第１のプライマーと、検出または定量可能な標識物質をその一端に含む第２のプライマーとを用いてＰＣＲ増幅を行う工程と、
（ｈ）得られたＰＣＲ増幅産物に含まれる前記第２の結合対の一方を、当該第２の結合対の他方に結合させることにより、前記ＰＣＲ増幅産物を回収する工程と、
（ｉ）回収されたＰＣＲ増幅産物に含まれる前記標識物質を検出または定量することにより、前記試料中の標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎを検出または定量する工程と、
を具備する方法。 - 所定の配列を有する試料中の標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ（ｎは２以上の整数）についての情報を得る方法であって、
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）の工程により前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報をエンコードすることと；
（ａ）以下のプローブＡとプローブＢを準備する工程と；
前記標的核酸中の第１の部分配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、この配列Ｆ’に連結された互いに特異的に結合する第１の結合対の一方を備えた第１のプローブであるプローブＡ、および
前記標的核酸中の第２の部分配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、各配列Ｓ’の一端に連結されたフラッグ配列ＦＬおよびその相補核酸ＦＬ’を含む二本鎖核酸であるフラッグとを備えた第２のプローブであるプローブＢ；
（ｂ）前記プローブＡと、前記プローブＢと、前記試料とを混合して、前記標的核酸中の前記配列Ｆに前記プローブＡをハイブリダイズさせるとともに、前記配列Ｓに前記プローブＢをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸にハイブリダイズした前記プローブＡと前記プローブＢをライゲートして、プローブ（Ａ＋Ｂ）を生じる工程と、
ここで、前記第１の結合対の一方は、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の一端において含まれ、前記フラッグは、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）と前記標的核酸とを解離させる工程と、 （ｅ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれる前記第１の結合対の一方を、当該結合対の他方に結合させて、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）を回収する工程と、
（ｆ）回収されたプローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれる前記フラッグの二本鎖を解離させ、前記核酸ＦＬ’を回収する工程と、
（２）前記（１）においてエンコードされた前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報を以下の（ｇ）〜（ｉ）の工程によりデコードすることと；
（ｇ）前記核酸ＦＬ’について、第２の結合対の一方をその一端に含む第１のプライマーと、検出または定量可能な標識物質をその一端に含む第２のプライマーとを用いてＰＣＲ増幅する工程と、
（ｈ）得られたＰＣＲ増幅産物に含まれる前記第２の結合対の一方を、当該第２の結合の他方に結合させることにより、前記ＰＣＲ増幅産物を回収する工程と、
（ｉ）回収されたＰＣＲ増幅産物に含まれる前記標識物質を検出または定量する工程と、
（３）前記（ｉ）により得られた結果に基づいて当該標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報を得る工程と
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸群Ｎ１−Ｎｎ（ｎは２以上の整数）についての情報を得る方法であって、
（１）以下の（ａ）〜（ｅ）の工程により前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報をエンコードすることと；
（ａ）以下のプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）とプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）を準備する工程と；
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第１の部分配列群Ｆ１〜Ｆｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｆ１’〜Ｆｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｆ１’〜Ｆｎ’に連結された互いに特異的に結合する第１の結合対の一方を備えた第１のプローブ群であるプローブ群Ａ１〜Ａｎ、および
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第２の部分配列群Ｓ１〜Ｓｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｓ１’〜Ｓｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｓ１’〜Ｓｎ’の一端に連結された４ユニットの配列からなるフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎ（ｎは２以上の整数）を含む第２のプローブ群であるプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ、
ここで、前記４ユニットは、互いに異なる配列のユニットであるＳＤ配列、Ｄ０配列、Ｄ１配列およびＥＤ配列をこの順序で含んでなり、前記Ｄ０配列は、Ｄ０１〜Ｄ０ｘ配列群（ｘは２以上の整数）からなり、且つ前記Ｄ１配列は、Ｄ１１〜Ｄ１ｙ配列群（ｙは２以上の整数）からなる；
（ｂ）前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと、前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎと、前記試料とを混合して、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の前記配列群Ｆ１〜Ｆｎに前記プローブ群Ａ１〜Ａｎをハイブリダイズさせるとともに、前記配列Ｓ１〜Ｓｎに前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎにハイブリダイズした前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをライゲートして、プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）（ｎは２以上の整数）を生じる工程と、
ここで、前記第１の結合対の一方は、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の一端において含まれ、前記各フラッグ配列ＦＬ１〜ＦＬｎは、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）と前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎとを解離させる工程と、
（ｅ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる第１の結合対の一方を、当該第１の結合対の他方に結合させて、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する工程と、
（２）前記（１）においてエンコードされた前記標的核酸についての情報を以下の工程によりデコードすることと；
前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれるＤ０１〜Ｄ０ｘ配列群およびＤ１１〜Ｄ１ｙ配列群またはその相補核酸群について、検出または定量可能な標識物質を含むプライマーを使用して伸長または増幅し、それにより得られた伸長産物または増幅産物に含まれる前記標的物質を検出または定量する工程と、
（３）（２）において得られた結果に基づいて、当該標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報を得る工程と、
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ（ｎは２以上の整数）についての情報を得る方法であって、
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）の工程により前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報をエンコードすることと；
（ａ）以下のプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）とプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）を準備する工程と；
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第１の部分配列群Ｆ１〜Ｆｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｆ１’〜Ｆｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｆ１’〜Ｆｎ’に連結された互いに特異的に結合する第１の結合対の一方を備えた第１のプローブ群であるプローブ群Ａ１〜Ａｎ、および
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第２の部分配列群Ｓ１〜Ｓｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｓ１’〜Ｓｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｓ１’〜Ｓｎ’の一端に連結された４ユニットの配列からなるフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎ（ｎは２以上の整数）およびその相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’（ｎは２以上の整数）を含む二本鎖核酸であるフラッグとを備えた第２のプローブ群であるプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ、
ここで、前記４ユニットは、互いに異なる配列のユニットであるＳＤ配列、Ｄ０配列、Ｄ１配列およびＥＤ配列をこの順序で含んでなり、前記Ｄ０配列は、Ｄ０１〜Ｄ０ｘ配列群（ｘは２以上の整数）からなり、且つ前記Ｄ１配列は、Ｄ１１〜Ｄ１ｙ配列群（ｙは２以上の整数）からなる；
（ｂ）前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと、前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎと、前記試料とを混合して、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の前記配列群Ｆ１〜Ｆｎに前記プローブ群Ａ１〜Ａｎをハイブリダイズさせるとともに、前記配列Ｓ１〜Ｓｎに前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎにハイブリダイズした前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをライゲートして、プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）（ｎは２以上の整数）を生じる工程と、
ここで、前記第１の結合対の一方は、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の一端において含まれ、前記各フラッグ配列ＦＬ１〜ＦＬｎは、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）と前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎとを解離させる工程と、
（ｅ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる第１の結合対の一方を、当該第１の結合対の他方に結合させて、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する工程と、
（ｆ）回収されたプローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる前記フラッグの二本鎖を解離させ、前記核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’を回収する工程と、
（２）前記（１）においてエンコードされた前記標的核酸についての情報を以下の（ｇ）〜（ｌ）の工程によりデコードすることと；
（ｇ）（ｆ）において回収された前記核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’に対して、互いに特異的に結合する第２の結合対の一方を一端に含み、且つフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎを伸長するための第１のプライマーと、核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’を伸長するための第２のプライマーとを用いてＰＣＲ増幅を行い、核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’とフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎからなる二本鎖ＰＣＲ増幅産物を生じる工程と、
（ｈ）得られた二本鎖ＰＣＲ増幅産物に含まれる前記第２の結合対の一方を、当該第２の結合対の他方に結合させる工程と、
（ｉ）結合された前記二本鎖ＰＣＲ増幅産物を解離させて、フラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎを回収する工程と、
（ｊ）フラッグ配列群に含まれるＤ０１〜Ｄ０ｘ配列群に相補的なプローブ群Ｄ０１’〜Ｄ０ｘ’と、Ｄ１１〜Ｄ１ｎ配列群に相補的であり且つ一端に検出または定量可能な標識物質を含むプローブ群Ｄ１１’〜Ｄ１ｙ’とを（ｉ）で回収されたフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎに対してハイブリダイズさせる工程と、
（ｋ）前記ハイブリダイズされたプローブ群Ｄ０１’〜Ｄ０ｘ’とプローブ群Ｄ１１’〜Ｄ１ｙ’とを夫々ライゲートする工程と、
（ｌ）（ｋ）において生じたライゲート産物群に含まれる前記標識物質を検出または定量することにより、当該フラッグ配列群に含まれる配列についての情報を得る工程と、
（３）（ｌ）において得られた結果に基づいて、当該標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報を得る工程と、
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸群Ｎ１−Ｎｎ（ｎは２以上の整数）についての情報を得る方法であって、
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）の工程により前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報をエンコードすることと；
（ａ）以下のプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）とプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）を準備する工程と；
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第１の部分配列Ｆ１〜Ｆｎ（ｎは２以上の整数）に相補的な配列Ｆ１’〜Ｆｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｆ１’〜Ｆｎ’に連結された互いに特異的に結合する第１の結合対の一方とを備えた第一のプローブ群であるプローブ群Ａ１〜Ａｎ、および
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第２の部分配列群Ｓ１〜Ｓｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｓ１’〜Ｓｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｓ１’〜Ｓｎ’の一端に連結された４ユニットの配列からなるフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎ（ｎは２以上の整数）およびその相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’（ｎは２以上の整数）を含む二本鎖核酸であるフラッグとを備えた第２のプローブ群であるプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ、
ここで、前記４ユニットは、互いに異なる配列のユニットであるＳＤ配列、Ｄ０配列、Ｄ１配列およびＥＤ配列をこの順序で含んでなり、前記Ｄ０配列は、Ｄ０１〜Ｄ０ｘ配列群（ｘは２以上の整数）からなり、且つ前記Ｄ１配列は、Ｄ１１〜Ｄ１ｙ配列群（ｙは２以上の整数）からなる；
（ｂ）前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと、前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎと、前記試料とを混合して、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の前記配列群Ｆ１−Ｆｎに前記プローブ群Ａ１〜Ａｎをハイブリダイズさせるとともに、前記配列群Ｓ１〜Ｓｎに前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎにハイブリダイズした前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをライゲートして、プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）（ｎは２以上の整数）を生じる工程と、
ここで、前記第１の結合対の一方は、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の一端において含まれ、前記各フラッグ配列ＦＬ１〜ＦＬｎは、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）と前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎとを解離させる工程と、
（ｅ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる第１の結合対の一方を、当該第１の結合対の他方に結合させて、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する工程と、
（ｆ）回収されたプローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる前記フラッグの二本鎖を解離させ、前記核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’を回収する工程と、
（２）前記（１）においてエンコードされた前記標的核酸についての情報を以下の（ｇ）〜（ｋ）の工程によりデコードすることと；
（ｇ）（ｆ）において回収された前記核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’に対して、ＳＤ配列を含み、且つ互いに特異的に結合する第２の結合対の一方を一端に含む第１のプライマーと、ＥＤ配列を含む第２のプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行う工程と、
（ｈ）（ｇ）で得られた二本鎖ＰＣＲ増幅産物に含まれる前記第２の結合対の一方を、当該結合対の他方に結合することにより回収する工程と、
（ｉ）回収された二本鎖ＰＣＲ増幅産物を解離する工程と、
（ｊ）前記解離により得られた一本鎖核酸に対して、配列群Ｄ１１〜Ｄ１ｎに夫々相補的な配列群Ｄ１１’〜Ｄ１ｙ’（ｙは２以上の整数）を含みその一端に検出または定量可能な標識物質を含むプライマー群Ｄ１１’〜Ｄ１ｙ’（ｙは２以上の整数）をハイブリダイズさせて伸長する工程と、
（ｋ）前記伸長により得られた伸長産物に含まれる当該標識物質を検出または定量することにより、当該フラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎに含まれる配列についての情報を得る工程と、
（３）（ｋ）において得られた結果に基づいて、当該標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報を得る工程と、
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸群Ｎ１−Ｎｎ（ｎは２以上の整数）についての情報を得る方法であって、
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）の工程により前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報をエンコードすることと；
（ａ）以下のプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）とプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）を準備する工程と；
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第１の部分配列Ｆ１〜Ｆｎ（ｎは２以上の整数）に相補的な配列Ｆ１’〜Ｆｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｆ１’〜Ｆｎ’に連結された互いに特異的に結合する第１の結合対の一方とを備えた第一のプローブ群であるプローブ群Ａ１〜Ａｎ、および
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第２の部分配列群Ｓ１〜Ｓｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｓ１’〜Ｓｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｓ１’〜Ｓｎ’の一端に連結された４ユニットの配列からなるフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎ（ｎは２以上の整数）およびその相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’（ｎは２以上の整数）を含む二本鎖核酸であるフラッグとを備えた第２のプローブ群であるプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ、
ここで、前記４ユニットは、互いに異なる配列のユニットであるＳＤ配列、Ｄ０配列、Ｄ１配列およびＥＤ配列をこの順序で含んでなり、前記Ｄ０配列は、Ｄ０１〜Ｄ０ｘ配列群（ｘは２以上の整数）からなり、且つ前記Ｄ１配列は、Ｄ１１〜Ｄ１ｙ配列群（ｙは２以上の整数）からなる；
（ｂ）前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと、前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎと、前記試料とを混合して、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の前記配列群Ｆ１−Ｆｎに前記プローブ群Ａ１〜Ａｎをハイブリダイズさせるとともに、前記配列群Ｓ１〜Ｓｎに前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎにハイブリダイズした前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをライゲートして、プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）（ｎは２以上の整数）を生じる工程と、
ここで、前記第１の結合対の一方は、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の一端において含まれ、前記各フラッグ配列ＦＬ１〜ＦＬｎは、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）と前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎとを解離させる工程と、
（ｅ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる第１の結合対の一方を、当該第１の結合対の他方に結合させて、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する工程と、
（ｆ）回収されたプローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる前記フラッグの二本鎖を解離させ、前記核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’を回収する工程と、
（２）前記（１）においてエンコードされた前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報を以下の（ｇ）〜（ｋ）の工程によりデコードすることと；
（ｇ）（ｆ）において回収された前記核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’に対して、ＳＤ配列を含み、且つ互いに特異的に結合する第２の結合対の一方を一端に含む第１のプライマーと、ＥＤ配列を含む第２のプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行う工程と、
（ｈ）（ｇ）で得られた二本鎖ＰＣＲ増幅産物に含まれる前記第２の結合対の一方を、当該結合対の他方に結合することにより回収する工程と、
（ｉ）回収された二本鎖ＰＣＲ増幅産物を解離する工程と、
（ｊ）前記解離により得られた一本鎖核酸に対して、配列群Ｄ１１〜Ｄ１ｙに夫々相補的な配列群Ｄ１１’〜Ｄ１ｙ’（ｙは２以上の整数）を含みその一端に検出または定量可能な標識物質を含むプローブ群Ｄ１１’〜Ｄ１ｙ’（ｙは２以上の整数）をハイブリダイズさせ、および
前記解離により得られた一本鎖核酸に対して、配列群Ｄ０１〜Ｄ０ｘに夫々相補的な配列群Ｄ０１’〜Ｄ０ｘ’（ｘは２以上の整数）を含むプローブ群Ｄ０１’〜Ｄ０ｘ’（ｘは２以上の整数）をハイブリダイズさせる工程と
（ｋ）前記ハイブリダイズされたプローブ群Ｄ０１’〜Ｄ０ｘ’とプローブ群Ｄ１１’〜Ｄ１ｙ’とを夫々ライゲートする工程と、
（ｌ）（ｋ）において生じたライゲート産物群に含まれる前記標識物質を検出または定量することにより、当該フラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎに含まれる配列についての情報を得る工程と、
（３）（ｌ）において得られた結果に基づいて、当該標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報を得る工程と、
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸についての情報を得る方法であって、
（ａ）以下のプローブＡとプローブＢを準備する工程と；
前記標的核酸中の第１の部分配列Ｆに相補的な配列Ｆ’と、この配列Ｆ’に連結された互いに特異的に結合する第１の結合対の一方とを備えた第１のプローブであるプローブＡ、および
前記標的核酸中の第２の部分配列Ｓに相補的な配列Ｓ’と、この配列Ｓ’の一端に連結された４ユニットの配列からなるフラッグ配列ＦＬおよびその相補核酸ＦＬ’を含む二本鎖核酸であるフラッグとを備えた第２のプローブであるプローブＢ、
ここで、前記４ユニットは、互いに異なる配列のユニットであるＳＤ配列、ＤＯ配列、Ｄ１配列およびＥＤ配列をこの順序で含んでなる；
（ｂ）前記プローブＡと、前記プローブＢと、前記試料とを混合して、前記標的核酸中の前記配列Ｆに前記プローブＡをハイブリダイズさせるとともに、前記配列Ｓに前記プローブＢをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸にハイブリダイズした前記プローブＡと前記プローブＢをライゲートして、プローブ（Ａ＋Ｂ）を生じる工程と、
ここで、前記第１の結合対の一方は、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の一端において含まれ、前記フラッグ配列ＦＬは、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）と前記標的核酸とを解離させる工程と、
（ｅ）前記プローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれる第１の結合対の一方を、当該第１の結合対の他方に結合させて、前記プローブ（Ａ＋Ｂ）を回収する工程と、
（ｆ）回収されたプローブ（Ａ＋Ｂ）に含まれる前記フラッグの二本鎖を解離させ、前記核酸ＦＬ’を回収する工程と、
（ｇ）（ｆ）において回収された前記核酸ＦＬ’に対して、Ｄ１配列に相補的な配列Ｄ１’を含みその一端に検出または定量可能な標識物質を含むプライマーＤ１’をハイブリダイズさせて伸長する工程と、
（ｈ）前記伸長により得られた伸長産物に含まれる当該標識物質を検出または定量することにより、当該フラッグ配列ＦＬに含まれる配列についての情報を得る工程と、
（ｉ）において得られた結果に基づいて、当該標的核酸についての情報を得る工程と、
を具備する方法。 - 試料中の所定の配列を有する標的核酸についての情報を得る方法であって、
（ａ）以下のプローブ群Ａ１〜Ａｎ（ｎは２以上の整数）とプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ（ｎは２以上の整数）を準備する工程と；
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第１の部分配列群Ｆ１〜Ｆｎ（ｎは２以上の整数）に相補的な配列群Ｆ１’〜Ｆｎ’（ｎは２以上の整数）と、この配列群Ｆ１’〜Ｆｎ’に連結された互いに特異的に結合する第１の結合対の一方とを備えた第１のプローブ群であるプローブ群Ａ１〜Ａｎ、および
前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の第２の部分配列群Ｓ１〜Ｓｎ（ｎは２以上の整数）に夫々相補的な配列群Ｓ１’〜Ｓｎ’（ｎは２以上の整数）と、各配列Ｓ１’〜Ｓｎ’の一端に連結された４ユニットの配列からなるフラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎ（ｎは２以上の整数）およびその相補核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’（ｎは２以上の整数）を含む二本鎖核酸であるフラッグとを備えた第２のプローブ群であるプローブ群Ｂ１〜Ｂｎ、
ここで、前記４ユニットは、互いに異なる配列のユニットであるＳＤ配列、ＤＯ配列、Ｄ１配列およびＥＤ配列をこの順序で含んでなり、前記Ｄ０配列は、Ｄ０１〜Ｄ０ｘ配列群（ｘは２以上の整数）からなり、且つ前記Ｄ１配列は、Ｄ１１〜Ｄ１ｙ配列群（ｙは２以上の整数）からなる；
（ｂ）前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと、前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎと、前記試料とを混合して、前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎ中の前記配列群Ｆ１−Ｆｎに前記プローブ群Ａ１〜Ａｎをハイブリダイズさせるとともに、前記配列群Ｓ１〜Ｓｎに前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎにハイブリダイズした前記プローブ群Ａ１〜Ａｎと前記プローブ群Ｂ１〜Ｂｎをライゲートして、プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）（ｎは２以上の整数）を生じる工程と、
ここで、前記第１の結合対の一方は、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の一端において含まれ、前記各フラッグ配列ＦＬ１〜ＦＬｎは、前記各プローブ（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）の他端において含まれる：
（ｄ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）と前記標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎとを解離させる工程と、
（ｅ）前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる第１の結合対の一方を、当該第１の結合対の他方に結合させて、前記プローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）を回収する工程と、
（ｆ）回収されたプローブ群（Ａ１＋Ｂ１）〜（Ａｎ＋Ｂｎ）に含まれる前記フラッグの二本鎖を解離させ、前記核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’を回収する工程と、
（ｇ）（ｆ）において回収された前記核酸群ＦＬ１’〜ＦＬｎ’に対して、配列群Ｄ１１〜Ｄ１ｙに夫々相補的な配列群Ｄ１１’〜Ｄ１ｙ’（ｙは２以上の整数）を含みその一端に検出または定量可能な標識物質を含むプライマー群Ｄ１１’〜Ｄ１ｙ’（ｎは２以上の整数）をハイブリダイズさせて伸長する工程と、
（ｈ）前記伸長により得られた伸長産物に含まれる当該標識物質を検出または定量することにより、当該フラッグ配列群ＦＬ１〜ＦＬｎに含まれる配列についての情報を得る工程と、
（ｉ）において得られた結果に基づいて、当該標的核酸群Ｎ１〜Ｎｎについての情報を得る工程と、
を具備する方法。 - 請求項６、１２、１３、１４、１５および１７の何れか１項に記載の方法であって、当該標識物質の検出または定量が、前記配列群Ｄ１１’〜Ｄ１ｙ’を含む二本鎖を解離して一本鎖にして、この一本鎖を、これに相補的な配列を含むプローブ核酸に対して結合させ、当該結合を検出または定量することにより行われることを特徴とする方法。
- 請求項１から１８の何れか１項に記載の方法であって、前記第１の部分配列と第２の部分配列が当該標的核酸上で隣接していることを特徴とする方法。
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