JP4586164B2 - 麹菌由来ホスホリパーゼａ２ - Google Patents

Description

本発明は麹菌由来のホスホリパーゼＡ_２及びそれをコードするＤＮＡ、並びにそれらの利用に関する。

糸状菌の中でも、特にアスペルギルス・オリゼ（キコウジ菌）等を含む麹菌は、清酒、みそ、醤油、及び、みりん等を製造する、わが国における醸造産業において古くから利用され、直接に食されてきた菌類であり、米国のＦＤＡ（食品医薬局）によりＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ）にリストアップされている安全な遺伝子源である。
従って、通常の菌由来の遺伝子を食品などに利用する際に必要な慢性毒性検査等の安全審査において、通常の菌由来の遺伝子の場合には約１０億円要するのに対して、上記のＧＲＡＳグレードである遺伝子の場合にはその約３分の１程度の経費で済むし、更に、該審査に要する時間もより短いというメリットがある。
このように、糸状菌、特に麹菌は、安全性及び経済性の点から極めて利用価値の高い遺伝子の宝庫と言える。
従って、これら菌のゲノムＤＮＡ情報を明らかにし、それにコードされる遺伝子等の機能を明らかにすることによって、バイオテクノロジーを利用した物質生産等のような、食品産業において安全な遺伝子資源の有効な活用法を提供するとともに、農薬及び医薬分野における各種遺伝子スクリーニングの為の有用な情報を提供することが出来る。
更に、近縁種であるアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）等のように穀物汚染菌、ヒト感染菌のゲノム情報を解析する有用なツールともなり得るものである。
以上の背景の下で検討を行った結果、本発明者らは麹菌の一種であるアスペルギルス・オリゼのゲノムを解析することに成功し、それらの塩基配列（及びそれがコードするアミノ酸配列）及び各種機能等を決定した。かかる成果に基づいて、先の出願（特願２００１−４０３２６１）においてアスペルギルス・オリゼ由来の各種ＤＮＡ、並びに、これらのＤＮＡから調製されるヌクレオチド配列からなるＧＲＡＳグレードの糸状菌遺伝子の増幅用プライマーセット及び糸状菌遺伝子検出用プローブ等を開示した。
本発明者らは得られた麹菌ゲノム情報を基に更なる検討を行った。即ち、ホスホリパーゼＡ_２に注目し、得られた塩基配列の中からホスホリパーゼＡ_２をコードする配列を特定し、またその配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を同定することを試みた。尚、ホスホリパーゼＡ_２はグリセロ燐脂質の２位のエステル結合を加水分解し脂肪酸とリゾ燐脂質を遊離する酵素である。動物由来のホスホリパーゼＡ_２については古くからその存在が知られており、かかるホスホリパーゼＡ_２は、乳化剤としてのリゾレシチンの製造（例えば特開平１０−０４２８８４号公報を参照）、油脂の脱ガム工程（例えばＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２^ｎｄ ｅｄ．，ｐ２９９−３００（１９９６）を参照）、製パン（例えば特開昭６０−２１３５号公報を参照）、機能性燐脂質（例えばオレオサイエンス 第２巻第１号（２００２）を参照）など食品工業で広く利用されている。また抗炎症薬、敗血症治療薬、リウマチ治療薬、喘息治療薬、虚血性疾患治療薬、虚血再潅流傷害治療薬などの開発に使用することも出来る。しかしながら、動物由来の酵素は、近年その由来故に消費者、食品製造会社に敬遠される傾向にあり、より安全性が高いとみなされる微生物由来の酵素が望まれてきている。近年になって微生物由来のホスホリパーゼＡ_２についての研究がなされ、放線菌の一種ストレプトマイセス・ビオラセオルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）の酵素（特開平６−３２７４６８号公報を参照）が見出されていた。さらに最近になって糸状菌の一種であるチューバー・ボルチー（Ｔｕｂｅｒ ｂｏｒｃｈｉｉ）由来の酵素（Ｓｏｒａｇｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０（１８）５０７９−５０９０（２００１）を参照）、ヘリコスポリウム属糸状菌（Ｈｅｌｉｃｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）由来の酵素（Ｗａｋａｔｓｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５２２，７４，（２００１）を参照）が報告された。しかしながらこれらの微生物は食品としての使用経験がなく、より安全性の高い菌種由来の酵素が望まれていた。
そこで、本発明は麹菌由来のホスホリパーゼＡ_２及びそれをコードするＤＮＡ、並びに当該麹菌由来ホスホリパーゼＡ_２の生産方法等を提供することを課題とする。

本発明者らは以上の課題に鑑み鋭意検討し、その結果、既報の微生物由来のホスホリパーゼＡ_２遺伝子と相同性の高い２種類の配列を麹菌ゲノム内に見出すことに成功した（以下、それぞれ「ｓｐａＡ遺伝子」及び「ｓｐａＢ遺伝子」ともいう）。そして、大腸菌及び麹菌を宿主として当該配列がコードする２種類のタンパク質（以下、それぞれ「ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ」及び「ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ」ともいう）を発現させたところいずれにもホスホリパーゼＡ_２活性が認められ、この結果から当該２種の配列がホスホリパーゼＡ_２をコードすることが実験的に確認された。一方で当該２種の配列におけるコード領域の特定に成功し、当該配列がコードする２種のタンパク質が新規なアミノ酸配列を有することを見出した。このように、本発明者らは麹菌由来のホスホリパーゼＡ_２遺伝子及びそのアミノ酸配列の同定に初めて成功した。
本発明は以上の成果に基づき完成されたものであって、以下の構成を提供する。
［１］ 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質からなるホスホリパーゼＡ_２：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有し、ホスホリパーゼＡ_２として機能するタンパク質。
［２］ 以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質からなるホスホリパーゼＡ_２：
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有し、ホスホリパーゼＡ_２として機能するタンパク質。
［３］ 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡ：
（Ａ）［１］に記載のホスホリパーゼＡ_２をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、それがコードするタンパク質がホスホリパーゼＡ_２として機能するＤＮＡ。
［４］ 以下の（Ｃ）又は（Ｄ）のＤＮＡ：
（Ｃ）［２］に記載のホスホリパーゼＡ_２をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）（Ｃ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、それがコードするタンパク質がホスホリパーゼＡ_２として機能するＤＮＡ。
［５］ 以下の（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの配列を有するＤＮＡ：
（ｉ）配列番号３で示される塩基配列；
（ｉｉ）配列番号４で示される塩基配列；
（ｉｉｉ）配列番号５で示される塩基配列；
（ｖｉ）配列番号６で示される塩基配列；
（ｖ）配列番号７で示される塩基配列；
（ｖｉ）配列番号８で示される塩基配列；
［６］ ［３］〜［５］のいずれかに記載のＤＮＡを保持するベクター。
［７］ ［３］〜［５］のいずれかに記載のＤＮＡが外来的に導入されている糸状菌。
［８］ 以下の（１）及び（２）のステップを含む、ホスホリパーゼＡ_２の生産方法：
（１）［７］に記載の糸状菌を、前記ＤＮＡのコードするタンパク質が産生可能な条件で培養するステップ；及び
（２）産生されたタンパク質を回収するステップ。
本発明における「ＤＮＡ」は２本鎖ＤＮＡに限らず、それを構成する１本鎖ＤＮＡ（センス鎖及びアンチセンス鎖）を含む意味で用いられる。また、本発明のＤＮＡにはコドンの縮重を考慮した任意の塩基配列を有するＤＮＡが包含される。さらにはその形態も限定されず、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡが含有される。
本発明において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡのことをいい、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡは勿論のこと、そのようなＤＮＡにアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなるＤＮＡ（例えば１又は複数個のイントロンを含むＤＮＡ）をも含む。
本発明における「麹菌由来ホスホリパーゼＡ_２」とは、麹菌を出発材料として調製されたホスホリパーゼＡ_２、或はそれを取得する過程において麹菌が保有するホスホリパーゼＡ_２の情報（アミノ酸配列やＤＮＡ配列）を利用して調製されたホスホリパーゼＡ_２のことをいい、麹菌から物理的手法や生化学的手法等を用いて調製されたホスホリパーゼＡ_２は勿論のこと、本発明において開示されるホスホリパーゼＡ_２のアミノ酸配列又はＤＮＡ配列を利用した遺伝子工学的手法などを用いて調製されたホスホリパーゼＡ_２を含む。

図１は、発現ベクターｐＮＧｓｐａＡの構成を模式的に示した図である。
図２は、発現ベクターｐＮＧｓｐａＢの構成を模式的に示した図である。
図３は、ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ形質転換体及びホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ形質転換体のホスホリパーゼ活性（培養上清中及び菌体破砕液中）を示した図である。
図４は、ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ遺伝子を保持する形質転換体から精製されたホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを示す図である。
図５は、ＣＭ−セルロース・カラムで精製したホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ形質転換体の培養上清を用いたホスホリパーゼＡ_２活性測定の結果をまとめたグラフである。

（タンパク質）
本発明の第１の局面は麹菌に由来するホスホリパーゼＡ_２に関する。本発明で提供されるホスホリパーゼＡ_２は例えば配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。後述の実施例で示されるように、当該タンパク質については糸状菌を用いた発現系において実際にホスホリパーゼＡ_２活性を示すことが確認されている。
ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。このことを考慮して、上述のホスホリパーゼＡ_２活性を有するタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１及び２）の一部を改変して得られるアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、「改変タンパク質」ともいう）であっても、ホスホリパーゼＡ_２としての機能を有する限りにおいて本発明のホスホリパーゼＡ_２（タンパク質）を構成することができる。換言すればホスホリパーゼＡ_２としての機能が維持される限りにおいて一部のアミノ酸の改変が許容される。尚、改変の前後においてホスホリパーゼＡ_２活性が低下しないことが好ましいが、多少の変動（上昇又は低下）があってもよい。
ここでの「アミノ酸配列の一部が改変されてなる」とは、アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、付加、及び／又は挿入されてなることを意味する。ホスホリパーゼＡ_２活性が維持される限りにおいて、アミノ酸配列の改変（変異）位置は特に限定されず、また複数の位置で改変が生じていてもよい。改変にかかるアミノ酸数は、例えば全アミノ酸の１０％以内に相当する数であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内に相当する数である。さらに好ましくは全アミノ酸の１パーセント以内に相当する数である。以上のような改変タンパク質は例えば、配列番号１又は２のアミノ酸配列をコードする塩基配列に改変を加えた配列を有する核酸断片を調製し、これを適当な発現系において発現させるなど、遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
本発明のタンパク質（改変タンパク質を含む）の中で天然の麹菌が有するものについては、当該麹菌より抽出、精製等の操作によって調製することができる。また、本明細書で開示されるホスホリパーゼＡ_２の情報を基にして遺伝子工学的手法を用いて本発明のタンパク質（改変タンパク質を含む）を調製することもできる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで適当な宿主細胞を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。組換えタンパク質として調製する場合には種々の修飾が可能である。例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、本発明のタンパク質に他のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
（ホスホリパーゼＡ_２をコードするＤＮＡ）
本発明の第２の局面は麹菌由来のホスホリパーゼＡ_２をコードするＤＮＡを提供する。このようなＤＮＡの具体例としては、配列番号３又は４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、或は配列番号７で示される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。配列番号３又は４の配列はホスホリパーゼＡ_２をコードするゲノムＤＮＡ（ホスホリパーゼＡ_２遺伝子）に由来する配列であり、配列番号７の配列は配列番号４の配列からイントロン領域を除いた配列である。本発明のＤＮＡの他の具体例としては、配列番号５、６、又は８で示される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。配列番号５の塩基配列は、配列番号３で示されるホスホリパーゼＡ_２遺伝子とその推定プロモータ及びターミネータ領域とを含むＤＮＡである。同様に配列番号６の塩基配列は、配列番号４で示されるホスホリパーゼＡ_２遺伝子とその推定プロモータ及びターミネータ領域とを含むＤＮＡである。また、配列番号８の塩基配列は、配列番号７で示されるＤＮＡ（ホスホリパーゼＡ_２遺伝子からイントロン領域を除いたＤＮＡ）とその推定プロモータ及びターミネータ領域とを含むＤＮＡである。これらのＤＮＡではプロモータ及びターミネータと構造遺伝子の組合わせが理想的となることから、当該ＤＮＡを利用してのホスホリパーゼＡ_２生産を行えば良好な遺伝子発現を期待できる。したがって、効率的なホスホリパーゼＡ_２生産系が構築される。
以上の本発明のＤＮＡは、適当な糸状菌ゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリー、或は糸状菌の菌体内抽出液から、本発明のホスホリパーゼＡ_２をコードする遺伝子（例えば配列番号３又は４で示される塩基配列を有するＤＮＡ）に対して特異的にハイブリダイズ可能なプローブ、プライマーなどを適宜利用して調製することができる。尚、本発明のＤＮＡを調製するために用いる糸状菌ゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照できる。
具体的には例えば、次の手順で本発明のＤＮＡを調製することができる。まず、目的のＤＮＡを保有すると予想される糸状菌を所定時間培養した後、ろ過により集菌する。洗浄後、菌体を凍結乾燥させる。続いて乳鉢などを用いて菌体を粉砕した後、適当量の抽出用緩衝液（例えばＳＤＳ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）を加えて抽出液とする。続いて、フェノール抽出、エタノール沈殿等によってゲノムＤＮＡの抽出、精製を行う。このようにして得られたゲノムＤＮＡを鋳型として目的のＤＮＡに特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法を実施することにより、目的のＤＮＡが増幅産物として得られる。
適当な糸状菌ゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを入手可能な場合にはこれらを利用して本発明のＤＮＡを調製することもできる。使用するライブラリーの種類に応じてプラークハイブリダイゼーション法あるいはコロニーハイブリダイゼーション法などが利用される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ等を参照）。例えばプラスミドを用いて構築されたライブラリーの場合を例に採ればコロニーハイブリダイゼーション法が利用される。目的のＤＮＡを保有するクローンの選択には、本発明のＤＮＡに特異的な配列を有するプローブが用いられる。目的とするクローンが選択されれば、このクローンが保有するＤＮＡを鋳型とし、目的のＤＮＡの配列に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法等を実施することにより、本発明のＤＮＡを増幅産物として得ることができる。
得られたクローンが保有するＤＮＡを適当なベクターにサブクローニングして以降の利用に供することができる。これによって例えば、形質転換用の組換えベクターの構築や、或は塩基配列解読に適したプラスミドの構築ができる。
ここで、一般に、あるタンパク質をコードするＤＮＡの一部に改変を施した場合において、改変後のＤＮＡがコードするタンパク質が、改変前のＤＮＡがコードするタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちＤＮＡ配列の改変が、コードするタンパク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。このことを考慮して、上述した本発明のＤＮＡの一部を改変した塩基配列を有するＤＮＡ（以下、「改変ＤＮＡ」ともいう）であっても、それがコードするタンパク質がホスホリパーゼＡ_２としての機能を有する限りにおいて本発明のＤＮＡを構成することができる。換言すれば、コードするタンパク質が有する、ホスホリパーゼＡ_２としての機能が維持される限りにおいて一部の配列の改変が許容される。尚、改変の前後において、コードするタンパク質のホスホリパーゼＡ_２活性が低下しないことが好ましいが、多少の変動（上昇又は低下）があってもよい。
ここで「一部の改変」とは、典型的には、改変前の塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加されることをいう。このような改変は複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは改変が行われる位置や改変の種類によっても異なるが例えば２〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜１０個である。以上のような改変ＤＮＡは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）による変異の導入などによって得られる。また、ホスホリパーゼＡ_２遺伝子を保有する糸状菌を紫外線で処理し、その後改変された遺伝子を単離することなど、公知の変異処理を利用した方法によっても取得することができる。
尚、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異にはホスホリパーゼＡ_２を保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合など、天然に生じる変異も含まれる。
改変ＤＮＡの調製方法としては、改変ＤＮＡを保有する天然の麹菌（アスペルギルス・オリゼ）からゲノム（染色体）ＤＮＡを抽出し、これを適当な制限酵素で処理した後に本発明のＤＮＡ（例えば配列番号３又は４で示される配列を有するＤＮＡ）又はその一部をプローブとしたスクリーニングにおいてストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを選択、単離する方法を例示することができる。改変ＤＮＡを保有するクローンを含むゲノム（染色体）ＤＮＡライブラリーを利用可能な場合には、当該ライブラリーを本発明のＤＮＡ（例えば配列番号３で示される配列を有するＤＮＡ）又はその一部をプローブとしてストリンジェントな条件下でスクリーニングすることによっても得ることができる
上記本発明のＤＮＡ（例えば配列番号３又は４で示される配列を有するＤＮＡやこれに上記改変を加えて得られるＤＮＡ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれがコードするタンパク質がホスホリパーゼＡ_２として機能するＤＮＡを本発明のＤＮＡとすることもできる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列の長さや構成塩基の種類によっても変動するが、例えば、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアルデヒド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて４２℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて６８℃で洗浄する条件である。更に好ましいストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる条件を例示することができる。
（ベクター）
本発明の他の局面は、上記本発明のＤＮＡ（改変ＤＮＡを含む）を保持するベクターを提供する。このようなベクターは、既存のベクター又はそれに改変を施したベクター内に本発明のＤＮＡを組込むことにより作製される。本発明のＤＮＡを保持し得るものであれば原則としていかなるベクターを出発材料としてもいが、使用目的（クローニング、ポリペプチドの発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。本発明のＤＮＡのベクターへの組込みは、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１．８４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により行うことができる。
尚、プロモータ領域をも含むＤＮＡ（例えば配列番号５、６、８のいずれかに示される配列を有するＤＮＡ）を保持するベクターを構築する場合には、当該ＤＮＡのプロモータ領域とその他の領域とを別個に容易し、それぞれをベクターに組込むことにより組換えベクターを構築してもよい。このような場合には、プロモータ機能が適切に発揮されることを条件として、ベクター内において両者（プロモータ領域とその他の領域）の間に他の配列が介在していてもよい。また、まずプロモータ領域を保持するベクターを構築し、その後にその他の領域の連結を行ってもよい。
形質転換用のベクターには、典型的には、ホスホリパーゼＡ_２遺伝子（例えば配列番号３に示される配列を有するＤＮＡ）、プロモータ、およびターミネータが含有される。プロモータによる構造遺伝子の適切な転写が達成されるように、上流から下流に向かって順にプロモータ、ホスホリパーゼＡ_２遺伝子、及びターミネータが配置される。ベクター内に、選択マーカーやエンハンサー機能を有する配列、シグナルペプチドをコードする配列などを含有させてもよい。
（形質転換体）
形質転換用ベクターは糸状菌の形質転換に利用される。即ち、上記の形質転換用ベクターを用いて、糸状菌の形質転換体の調製方法を構築することができる。かかる調製方法によれば、本発明のＤＮＡが外来的に導入された糸状菌が得られる。このようにして得られた糸状菌形質転換体はホスホリパーゼＡ_２の生産に利用され得る。具体的には、本発明のＤＮＡが外来的に導入された糸状菌形質転換体を、当該ＤＮＡのコードするタンパク質（ホスホリパーゼＡ_２）が発現可能な条件で培養することにより、ホスホリパーゼＡ_２を産生させることができる。培地は使用する宿主に応じて適切なものが用いられる。例えば市販の各種培地又はこれらにアルギニン、ウリジン等の形質転換体の生育、選択、タンパク質の発現促進などに必要な成分を添加した培地を用いることができる。
所望時間培養した後の培養液又は菌体より目的のタンパク質（ホスホリパーゼＡ_２）を回収することができる。菌体外に産生された場合には培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを組み合わせて分離、精製を行うことにより目的のタンパク質を取得することができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的のタンパク質を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。尚、本発明のホスホリパーゼＡ_２は通常菌体外に産生されることから、その分離、精製は比較的容易である。
形質転換に供される宿主糸状菌の種類は特に限定されず、アスペルギルス属（アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドランス、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタス等）、ペニシリウム属、トリコデルマ属、リゾプス属、ムコール属、又はフザリウム属等に分類される糸状菌を用いることができる。好ましくはアスペルギルス属の糸状菌が用いられる。中でもアスペルギルス・オリゼ、又はニガーを用いることが安全性点から好ましい。
形質転換用ベクターの宿主糸状菌への導入（形質転換）は公知の方法で行うことができる。例えば、プロトプラスト化した菌体を用いたＴｕｒｎｅｒら方法（Ｇｅｎｅ，３６，３２１−３３１（１９８５））により行うことができる。その他、五味らの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７））などを採用してもよい。

以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例の内容に限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、上記のＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）に記載されている方法に従った。
［実施例１］ ホールゲノムショットガンライブラリーの作製方法
１．インサート側の調製
（１）染色体ＤＮＡの取得
糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ−４０株（ＡＴＣＣ ４２１４９）の胞子をＹＰＤ培地（０．５％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，１％ Ｐｅｐｔｏｎｅ，２％ Ｇｌｕｃｏｓｅ）に植菌し３０℃で一晩振盪培養した。その後、飯村（Ａｒｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３２３−３２８，５１（１９８７））の方法に従ってゲノムＤＮＡの抽出を行った。ゲノムＤＮＡに混在しているミトコンドリアＤＮＡを除去するためＷａｔｓｏｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５７−７５ １１８（１９８６））に従って染色体ＤＮＡのみになるよう塩化セシウム超遠心による精製を行った。
（２）染色体ＤＮＡの断片化
取得した純粋な染色体ＤＮＡをランダムＤＮＡ断片化装置ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ（トミー精工）にかけ、染色体ＤＮＡを１−２ｋｂ程度に断片化した。
（３）断片化したＤＮＡの末端処理
断片化した染色体ＤＮＡをＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）処理、その後Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴＡＫＡＲＡ）処理を行い末端を平滑化した。
（４）末端へのＡｄａｐｔｏｒの付加
末端を平滑化した染色体ＤＮＡ断片の両端に、（Ｐ）５’−ＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣ−３’および（Ｐ）５’−ＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣ−３’からなるアダプターをＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて連結した。
２．形質転換
ｐＵＣ１９を制限酵素Ｓａｌｌ（ＴＡＫＡＲＡ）により切断を行った後、ｄＴをＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ．ダイアグノスティクス）によりＳａｌｌ切断部分に挿入した。このようにして作製したプラスミドをＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）処理により脱リン酸化しベクターとして利用した。ベクターと上記で作製した染色体ＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いて連結させ、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Ｇｉｂｃｏ）にエレクトロポレーション法により形質転換を行った。
３．塩基配列の決定
プラスミドＤＮＡは、大腸菌形質転換体を２ｘＹＰ培地で３７℃、１０時間培養し、集菌後、滅菌水中で９９℃、１０分間加熱処理した。この上澄を鋳型ＤＮＡ水溶液として用い、９８℃で２０秒、６８℃で２分の３０サイクルのＰＣＲによって、シークエンス用プライマーがアニールする部位を含む挿入断片全長を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、サンガー法の鋳型として用い、Ｍ１３ユニバーサルプライマーあるいはＭ１３リバースプライマーと、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒシークエンシングキットを用いて、キットに添付の説明書に従ってシークエンス反応を行った。シークエンス反応産物は、ゲルろ過法などを用いて未反応のＤｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを除去した後、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて、ＤＮＡ断片の塩基配列を解読した。３７００ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒによって出力された波形データは、Ｐｈｒｅｄ（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ）で再解析し、ベクター及びアダプター配列を除去した後、ＳＰＳ Ｐｈｒａｐ（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用してアッセンブルし、麹菌ゲノムＤＮＡ塩基配列のコンティグを構築した。
［実施例２］ 遺伝子の特定
ゲノムＤＮＡ塩基配列からの遺伝子の特定については、以下の手法を用いた。遺伝子の特定手法は、ゲノムＤＮＡ塩基配列のコンティグに対し、すでに取得したＥＳＴの配列情報、既知のタンパク質アミノ酸配列データベースとの相同性情報を考慮しながら、浅井潔らによるアルゴリズム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ９８，２２８−２３９．）に基づく遺伝子領域予測システムＧｅｎｅＤｅｃｏｄｅｒと後藤修によるアルゴリズム（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０００ １６：１９０−２０２．）に基づく遺伝子領域予測システムＡＬＮを組み合わせて用いた。また、ｔＲＮＡ遺伝子の予測はｔＲＮＡ−ｓｃａｎを用いた。
第１『ＢＬＡＳＴ相同性遺伝子候補領域の抽出』
ゲノムＤＮＡ塩基配列のコンティグから既知のタンパク質アミノ酸配列と高い相同性をもつ領域を抽出する。アミノ酸配列の相同性はＫａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができるが、このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されており（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）、ゲノムＤＮＡ塩基配列がアミノ酸配列に翻訳された場合に相同性が高い領域を直接検索することができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。本手法では、ゲノムＤＮＡ塩基配列のコンティグを問い合わせ配列、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴバージョン３９（Ｂａｉｒｏｃｈ，Ａ．＆ Ａｐｗｅｉｌｅｒ，Ｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，４５−４８（２０００）．）およびＮＲａａをデータベースとしてＢＬＡＳＴＸの検索を行い、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにおける相同性の指標であるＥ−ｖａｌｕｅで１０^−３０以下の値を持つ（Ｅ−ｖａｌｕｅは値が低いほど相同性が高いことを示す）領域を抽出する。これらの領域から、より相同性の高い部分を優先させるようにして、互いに重ならないＢＬＡＳＴ相同性遺伝子候補領域を抽出する。
第２『ＡＬＮ遺伝子候補領域の抽出』
ＢＬＡＳＴ相同性遺伝子候補領域のうち、相同性の対象となるタンパク質アミノ酸配列の全長の９０％以上の領域に対して相同性をもつものを核として、コンティグ配列に対して遺伝子領域予測システムＡＬＮを適用してＡＬＮ遺伝子候補領域を抽出する。ＡＬＮは、相同性の対象となるタンパク質アミノ酸配列の全長を、コンティグに対して整列させながらスプライス部位を特定することにより、遺伝子領域を予測する。
第３『ＧＤ相同性遺伝子候補領域の抽出』
ＢＬＡＳＴ相同性遺伝子候補領域のうち、相同性の対象となるタンパク質アミノ酸配列の残長の２０％以上９０％未満の領域に対して相同性を持つものを核として、コンティグ配列に対して遺伝子領域予測システムＧｅｎｅＤｅｃｏｄｅｒを適用してＧＤ相同性遺伝子候補領域を抽出する。ＧｅｎｅＤｅｃｏｄｅｒは、ＢＬＡＳＴＸのＥ−ｖａｌｕｅと、タンパク質コード領域の指向性の指標である２連コドン統計量を統合し、さらにスプライス部位の位置依存１次マルコフモデルによるスコアを考慮して遺伝子領域を予測する。
第４『ＥＳＴ−ＧＤ遺伝子候補領域の抽出』
コンティグ配列に対応したＥＳＴによって遺伝子発現が確認されている領域については、その付近のコンティグ配列にＧｅｎｅＤｅｃｏｄｅｒを適用することにより、ＥＳＴ配列によって決定される遺伝子領域のみならず、遺伝子領域全体を予測し、ＥＳＴ−ＧＤ遺伝子候補領域とする。
第５『一般ＧＤ遺伝子候補領域の抽出』
第１から第４までの遺伝子候補領域に含まれないコンティグ配列に対しては、ＧｅｎｅＤｅｃｏｄｅｒを適用することにより、遺伝子領域を予測する。
第６『ｔＲＮＡ遺伝子候補領域の抽出』
ｔＲＮＡ−ｓｃａｎを全コンティグに適用することにより、ｔＲＮＡ遺伝子候補領域を抽出する。
第７『遺伝子候補領域の統合』
以下の手順により、第２から第６までの遺伝子候補領域を統合する。まず、第２から第６までの遺伝子候補領域のうち、ＥＳＴによって決定されるスプライス部位と矛盾した遺伝子領域を予測するものは取り除かれる。残った遺伝子候補領域を、互いに重なるものを取り除くことによって統合する。その際、ｔＲＮＡ、ＡＬＮ相同性遺伝子候補領域、ＧＤ相同性遺伝子候補領域、ＧＤ−ＥＳＴ遺伝子候補領域、一般ＧＤ遺伝子候補領域の順で優先させて統合する。この統合された遺伝子候補領域を、予測遺伝子のセットとする。
以上の手順により、相同性の観点からは、既知タンパク質の全長にわたって相同性をもつ遺伝子、既知タンパク質と部分的に相同性をもつ遺伝子、既知タンパク質と相同性をもたない遺伝子がこの順に従った信頼性で特定されることが保証される。また、発現の確認の観点からは、ＥＳＴで発現が確認されている遺伝子、ＥＳＴで発現が確認されていない遺伝子の順に従った信頼性で特定され、また、すべての候補遺伝子がＥＳＴによって特定されるスプライス部位と矛盾しないことが保証される。
用いられた手法はすべて終始コドンをタンパク質コード領域中に含むことを許さないアルゴリズムを採用しており、偽遺伝子を遺伝子として予測する可能性は少ない。
機能決定に関しては、予測された遺伝子領域に対して、ＮｒａａをデータベースとするＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、機能を特定するために十分な相同性（Ｅ−ｖａｌｕｅで１０^−３０）を閾値として機能を決定した。
［実施例３］ ホスホリパーゼＡ_２をコードする配列の検索
ヘリコスポリウム属糸状菌（Ｈｅｌｉｃｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）由来ホスホリパーゼＡ２遺伝子のＤＮＡ配列を基にして、麹菌ゲノムＤＮＡの全ＤＮＡ配列を対象として、ＮＣＢＩが提供するＢＬＡＳＴサーチ（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ：ｂｌａｓｔｐ）を行った。その結果、ヘリコスポリウム属糸状菌（Ｈｅｌｉｃｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）由来ホスホリパーゼＡ２遺伝子と相同性の高い領域を２つ見いだすことに成功した。このうち一つについては、上記の遺伝子の特定の際に何らかの機能を有する配列として予想されたものの、その機能を推定するまでには至っていないものであった。尚、当該遺伝子のコード領域（推定ホスホリパーゼＡ２−ｓｐａＡコード領域）を配列番号３に示す。また、当該領域がコードするアミノ酸配列を配列番号１に示す。
一方、もう一つの領域（配列）はｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎの機能を持つものと当初予測され、機能推定されていない配列内部に存在していた。また、この配列は今回同定されたアミノ酸配列とは全く異なる６２４アミノ酸残基からなるタンパク質をコードするものと当初予測されていたが、今回の検討によって他の糸状菌由来のホスホリパーゼＡ２のアミノ酸配列とより相同性の高い１６０アミノ酸配列（配列番号２）をコードすることが見出された。当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号７（推定ホスホリパーゼＡ２−ｓｐａＢのコード領域）に示す（イントロンを含む配列は配列番号４に示される）。尚、このような相違が生じたことは、当初の予測ではイントロンの推定が正しく行われていなかったことに起因する。また、ノイロスポラ・クラッサに２種のホスホリパーゼＡ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ データベース：ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．ＮＣＵ０６６５０，ＮＣＵ０９４２３）が存在する事実を考慮することで本ゲノム配列中にも先の配列（配列番号３）以外に別のホスホリパーゼＡ２遺伝子が存在することを予測し、当該予測に基づいて検討を重ねたことが当該アミノ酸配列（配列番号２）を見出すことに成功した一因である。
以上のように特定された二つの領域（配列）の機能を解析する目的の下、以下に示す種々の実験を行った。
［実施例４］ 染色体ＤＮＡの取得
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ−４０株をＤＰＹ培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ｐＨ５．５）２００ｍｌを入れた三角フラスコを用いて３０℃で２日間培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。液体窒素で凍結させた菌体を乳鉢、乳棒を用いて破砕し、２０ｍｌ Ｓｏｌ Ｉ（５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、ｐＨ８．０）を加え、５０℃、４時間インキュベートした。フェノール処理２回、フェノール・クロロホルム処理１回、クロロホルム処理を１回行い（遠心は３，５００ｒｐｍ、１５分、４℃で行う）、上清に十分の一量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と等量のイソプロパノールを入れ一晩氷冷した。３，５００ｒｐｍ、２０分、４℃で遠心し、沈殿を７０％エタノールでリンスした後ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）溶液に溶解した。次にＲＮａｓｅ Ａを１０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃、３０分間インキュベートした。等量のフェノール・クロロホルムを加え混和した後、３，５００ｒｐｍ、２０分、４℃で遠心し上層を回収した。十分の一量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と２．５倍量のエタノールを入れ３，５００ｒｐｍ、２０分、４℃で遠心し沈殿を得た。これを染色体ＤＮＡ溶液とした。
［実施例５］ ホスホリパーゼＡ_２遺伝子の取得
実施例３で得られた麹菌ゲノムＤＮＡコンティグの配列情報をもとに、ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ及びホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ遺伝子を、実施例４で得られた麹菌のゲノムＤＮＡを鋳型にしてクローニングした。目的の遺伝子（推定ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ及びホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ遺伝子）のそれぞれの推定開始コドンから終止コドンまでと予想されるＤＮＡ断片を増幅させるプライマー対を以下の様に設計した。
ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ遺伝子用プライマー：

ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ遺伝子については、ノイロスポラ・クラッサ由来の２種のホスホリパーゼＡ_２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋデータベース：ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．ＮＣＵ０６６５０，ＮＣＵ０９４２３）にイントロンがそれぞれ見出されており、本遺伝子にも同様の位置に相当するイントロンが存在すると仮定すると、より他の微生物由来のホスホリパーゼＡ_２のアミノ酸配列と相同性が高くなる。このことを考慮してホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ遺伝子の増幅用プライマー対を以下のように設計した。
ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ遺伝子用プライマー：

尚、以上の４つのプライマー中のアンダーラインは制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ認識部位を、大文字はタンパク質コード領域をそれぞれ示す。
以上のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行った。尚、反応液の組成は以下のとおりとした。
滅菌水： ２９．７５μｌ
ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ用 １０ｘバッファー： ５μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ溶液： ５μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ Ａｏ１７２４ｓ若しくはＡｏ０９４０ｓ： ２．５μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ Ａｏ１７２４ａｓ若しくはＡｏ０９４０ａｓ： ２．５μｌ
６０ｎｇ／μｌ ＲＩＢ４０染色体ＤＮＡ： ５μｌ
５Ｕ／μｌ ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社）： ０．２５μｌ／５０μｌ
上記反応液をＭＪリサーチ社製ＰＴＣ−１００型ＰＣＲ装置を用い、以下の条件でＰＣＲを実施した。
（１）９４℃で１分間、（２）９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、及び７２℃で２分間のサイクルを３０サイクル、（３）４℃で放置。
ＰＣＲ反応の結果、約６７０ｂｐ及び約７００ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ特異的に増幅され、アガロースゲル電気泳動後ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩＩ（ＢＩＯ １０１社）を用いて増幅ＤＮＡ断片を抽出した。抽出したＤＮＡ断片をｐＴ７−Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションして常法により塩基配列を決定した。
［実施例６］ アミノ酸配列の分析
実施例５で得られた塩基配列を解析した結果、既に報告されている微生物由来のホスホリパーゼＡ_２のアミノ酸配列と約３５〜約５５％の相同性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号３及び４）であることが判明し、各ＤＮＡをｓｐａＡ及びｓｐａＢ遺伝子とした。前者によってコードされる推定ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡは全長２２２アミノ酸からなり、ＳＭＡＲＴ（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，５８５７−５８６４（１９９８）；Ｌｅｔｕｎｉｃ ｅｔ ａｌ，，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０，２４２−２４４（２００２）；ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）によって予測したシグナル配列領域（１９アミノ酸）を除いた分子量は２３．４ｋＤａであって、システインを６個含有していた。一方、ｓｐａＢ遺伝子によってコードされる推定ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢは全長１６０アミノ酸からなり、上記のＳＭＡＲＴによって予測したシグナル配列領域（１７アミノ酸）を除いた分子量は１６．４ｋＤａであって、システインを４個含有していた。また、いずれの酵素も分泌型ホスホリパーゼＡ_２に共通して見られる、活性中心のＨｉｓ−Ａｓｐペア配列を有していた。
［実施例７］ 麹菌発現ベクターｐＮＧｓｐａＡの構築
次に、ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡを麹菌で発現させるためのプラスミドｐＮＧｓｐａＡを構築した。まず、実施例５で得られた、ｐＴ７−ＢｌｕｅにクローニングされたホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ遺伝子を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｘｂａ Ｉ（宝酒造社）で消化して約６７０ｂｐのＤＮＡ断片として切り出し、インサートＤＮＡとした。一方選択マーカーとして麹菌由来ｎｉａＤ遺伝子、プロモータとして麹菌由来の改良型グルコアミラーゼ遺伝子の改良型プロモータ、ターミネータとして麹菌由来のα−グルコシダーゼ遺伝子のターミネータを有する麹菌発現ベクターｐＮＧＡ１４２（Ｍｉｎｅｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５０，４５９−４６７（１９８８））を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｘｂａ Ｉ（宝酒造社）で消化し、その後Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社）を用いて脱リン酸化し、ベクターＤＮＡとした。以上のようにして調製したインサートＤＮＡとベクターＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いてライゲーションし、これを用いて大腸菌ＤＨ５α株コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換してアンピシリン耐性形質転換体を得た。得られたクローンの保持するプラスミドをｐＮＧｓｐａＡと名づけ発現ベクター（図１）として用いた。
［実施例８］ 麹菌発現ベクターｐＮＧｓｐａＢの構築
次に、ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢを麹菌で発現させるためのプラスミドｐＮＧｓｐａＢを構築した。まず、実施例５で得られた、ｐＴ７−ＢｌｕｅにクローニングされたホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ遺伝子を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｘｂａ Ｉ（宝酒造社）で消化して７００ｂｐのＤＮＡ断片として切り出し、インサートＤＮＡとした。一方選択マーカーとして麹菌由来ｎｉａＤ遺伝子、プロモータとして麹菌由来の改良型グルコアミラーゼ遺伝子の改良型プロモータ、ターミネータとして麹菌由来のα−グルコシダーゼ遺伝子のターミネータを有する麹菌発現ベクターｐＮＧＡ１４２（Ｍｉｎｅｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５０，４５９−４６７（１９８８））を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｘｂａ Ｉ（宝酒造社）で消化し、その後Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社）を用いて脱リン酸化し、ベクターＤＮＡとした。以上のようにして調製したインサートＤＮＡとベクターＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いてライゲーションし、これを用いて大腸菌ＤＨ５α株コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換しアンピシリン耐性形質転換体を得た。得られたクローンの保持するプラスミドをｐＮＧｓｐａＢと名づけ発現ベクター（図２）として用いた。
［実施例９］ 麹菌の形質転換
硝酸還元酵素欠損株であるアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ｎｉａＤ３００株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ−４０株（ＡＴＣＣ ４２１４９）の硝酸還元酵素欠損変異株、Ｍｉｎｅｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３０，４３２−４３８（１９９６））をデキストリン・ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ｐＨ５．５）で３０℃、３日間振とう培養した後、得られた菌体を滅菌水で洗浄した。この菌体を細胞壁溶解液［１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０、０．８Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍｇ／ｍｌヤタラーゼ（宝酒造社製）］に懸濁し、３０℃、２〜３時間緩やかに振とうすることによりプロトプラスト化した。得られたプロトプラストをガラスフィルターで濾過することにより残存する菌体を除去した。
次に、このプロトプラストを用いて五味らの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７））によりコンピテントセルの調製およびｐＮＧＡ１４２（対照）、ｐＮＧｓｐａＡ或いはｐＮＧｓｐａＢを用いて形質転換を行い、単一窒素源として硝酸を含む培地、例えば、ツァペック・ドックス培地（０．２％ ＮａＮＯ_３、０．１％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２％ ＫＣｌ、０．０５％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００２％ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２％ グルコース、ｐＨ５．５）で生育可能な形質転換体をそれぞれのプラスミドにつき各４株づつ合計１２株取得した。プラスミドｐＮＧＡ１４２、ｐＮＧｓｐａＡ、及びｐＮＧｓｐａＢ由来の形質転換体を、それぞれベクター１〜ベクター４、ＳｐａＡ−１〜ＳｐａＡ−４、及びＳｐａＢ−１〜ＳｐａＢ−４と名づけた。
［実施例１０］ ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ形質転換体によるホスホリパーゼＡ_２の発現
得られたホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ形質転換体を以下に示すＤＰＹ培地で３０℃、３日間振盪培養した後、培養液を室温、１０，０００×ｇ、１０分間の条件で遠心分離して培養上清と菌体を得た。菌体をマルチビーズショッカー（安井器械社製）で破砕し、その結果得られた懸濁液を菌体破砕液とした。
＜ＤＰＹ培地＞
２％ デキストリン
１％ ポリペプトン
０．５％ 酵母エキス
０．５％ ＫＨ_２ＰＯ_４
０．０５％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
ｐＨ ５．５
得られた培養上清と菌体破砕液について以下の方法でホスホリパーゼＡ_２活性を測定した。その結果、特に培養上清中において対照株（即ちベクター１〜ベクター４株）に比べて明らかに高いホスホリパーゼＡ_２活性が確認された（図３）。この結果から明らかなように、取得した推定ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ遺伝子がホスホリパーゼＡ_２をコードすることが実証された。
（ホスホリパーゼＡ_２の酵素活性測定方法）
ホスホリパーゼＡ_２活性は、ｉｎ ｖｉｖｏでラベルした大腸菌の膜から遊離する標識オレイン酸を定量する方法（Ｅｌｓｂａｃｈ，Ｐ．，ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９７，２４−３１）に若干の変更を加えて行った。即ち、２．５ ｘ １０^８の［^３Ｈ］オレイン酸でラベルした後オートクレーブした大腸菌（￣５００，０００ｄｐｍ），２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ_２及び酵素液からなる反応液（最終液量１００μｌ）を３０℃で３０分間インキュベートし、氷冷した１％牛血清アルブミン（ｗ／ｖ）を添加した直後に遠心分離（１０，０００ ｘ ｇ）して得られる上清中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで計測した。本条件下で計測されたカウント数（Ｈ−ＤＰＭ）を基に酵素活性（Ｈ−ＤＰＭ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）を求めた。［^３Ｈ］オレイン酸でラベルした大腸菌は、以下の方法で調製した。栄養培地中で３７℃で１晩培養したＥｓｈｃｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α株の培養液１００μｌを１０ｍｌの５μＣｉ／ｍｌの［^３Ｈ］オレイン酸を含む栄養培地に接種し、３７℃で３時間培養した。その培養液を室温、３，０００ ｘ ｇ、１２分間遠心分離して集めた菌体を新鮮な１０ｍｌの上記培地に懸濁して３７℃で３０分間インキュベートした。菌体を、室温、３，０００ ｘ ｇ、１２分間の遠心分離で集め、５ｍｌの１％牛血清アルブミン（ｗ／ｖ）で洗浄し、最後に適量の蒸留水で５ ｘ １０^８細胞／ｍｌになるように懸濁し、［^３Ｈ］オレイン酸でラベルした大腸菌液とした。
［実施例１１］ ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ形質転換体によるホスホリパーゼＡ_２の発現
ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ形質転換体を用いて、実施例１０と同様の培養及び培養後の処理を行うことによって、ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ形質転換体の培養上清及び菌体破砕液を得た。尚、ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ形質転換体の場合に比較して、形質転換体の生育は大きく阻害された。これはホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢが大量に発現した結果、菌体に対して何らかの阻害効果を及ぼしたことによるものと考えられた。
得られた培養上清と菌体破砕液について、ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡの場合と同様にホスホリパーゼＡ_２活性を測定した。その結果、特に菌体破砕液中において対照株（即ちベクター１〜ベクター４株）に比べて明らかに高いホスホリパーゼＡ_２活性が確認された（図３）。この結果から明らかなように、取得した推定ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＢ遺伝子がホスホリパーゼＡ_２をコードすることが実証された。
［実施例１２］ ホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ形質転換体により発現されたホスホリパーゼＡ_２の精製
実施例１０で得られたホスホリパーゼＡ_２−ｓｐａＡ形質転換体の培養上清２０ｍｌを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で１０倍に希釈した後、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＣＭ−セルロース・カラムに供し、０．１Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、１．０ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液でステップワイズ・グラジエントで溶出した。それぞれの溶出液１０μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマージーブリリアントブルーで染色した。その結果、ＮａＣｌ濃度０．５−１．０Ｍでの溶出画分に分子量約１６ｋＤａの単一バンドが検出された（図４）。得られた未吸着、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１．０Ｍ ＮａＣｌの各画分のホスホリパーゼＡ_２活性を測定した結果、図５に示すように０．５Ｍ及び１．０Ｍ ＮａＣｌ画分に活性が検出されたのに対し、未吸着及び０．２５Ｍ ＮａＣｌ画分にはほとんど活性が検出されなかった。従って、０．５Ｍ及び１．０Ｍ ＮａＣｌ画分に溶出された分子量約１６ｋＤａの蛋白質がホスホリパーゼＡ_２であることが証明された。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。

産業上の利用の可能性

本発明によれば、麹菌由来のホスホリパーゼＡ_２及びそれをコードするＤＮＡが提供される。本発明のＤＮＡを利用すれば、安全性の高い糸状菌を用いたホスホリパーゼＡ_２の生産系が構築される。

Claims (6)

1. 以下の(c)又は(d)のタンパク質からなるホスホリパーゼA₂：
   (c)配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
   (d)配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有し、ホスホリパーゼA₂として機能するタンパク質であって、改変されるアミノ酸の数が、配列番号２のアミノ酸配列を構成する全アミノ酸の１０％以内に相当する数であるタンパク質。
2. 以下の(C)のDNA：
   （C）請求項１に記載のホスホリパーゼA₂をコードするDNA。
3. 以下の(i)〜(iv)のいずれかの配列を有するDNA：
   (i)配列番号４で示される塩基配列；
   (ii)配列番号６で示される塩基配列；
   (iii)配列番号７で示される塩基配列；
   (iv)配列番号８で示される塩基配列；
4. 請求項２又は３に記載のDNAを保持するベクター。
5. 請求項２又は３に記載のDNAが外来的に導入されている糸状菌。
6. 以下の(1)及び(2)のステップを含む、ホスホリパーゼA₂の生産方法：
   (1)請求項５に記載の糸状菌を、前記DNAのコードするタンパク質が産生可能な条件で培養するステップ；及び
   (2)産生されたタンパク質を回収するステップ。

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