[go: up one dir, main page]

JP4533627B2 - Ｔ−ｂｅｔ組成物およびそれらの使用方法 - Google Patents

Ｔ−ｂｅｔ組成物およびそれらの使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP4533627B2
JP4533627B2 JP2003549556A JP2003549556A JP4533627B2 JP 4533627 B2 JP4533627 B2 JP 4533627B2 JP 2003549556 A JP2003549556 A JP 2003549556A JP 2003549556 A JP2003549556 A JP 2003549556A JP 4533627 B2 JP4533627 B2 JP 4533627B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
bet
cells
cell
expression
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2003549556A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2005511056A (ja
Inventor
グリムシヤー，ローリー・エイチ
スザボ，スザンヌ・ジエイ
Original Assignee
プレジデント・アンド・フエローズ・オブ・ハーバード・カレツジ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by プレジデント・アンド・フエローズ・オブ・ハーバード・カレツジ filed Critical プレジデント・アンド・フエローズ・オブ・ハーバード・カレツジ
Publication of JP2005511056A publication Critical patent/JP2005511056A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4533627B2 publication Critical patent/JP4533627B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Description

本出願は、１９９９年６月２日出願の米国仮出願中第０６／１３７，０８５号明細書への優先権を主張する英語のＰＣＴ条項第２１に従って公開された２０００年６月１日出願（係属中）の第ＰＣＴ／ＵＳ００／１５３４５号明細書の一部継続出願である２００１年１２月３日出願（係属中）の米国特許出願第１０／００８，２６４号明細書（これらの出願のそれぞれの内容全体はこの引用することにより本明細書に組み込まれる）の一部継続出願である。
本明細書に記述される研究は米国立衛生研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により授与された補助金第ＡＩ／ＡＧ ３７８３３、ＡＩ ３９６４６、ＡＩ ３６５３５、ＡＲ ６−２２２７、ＴＧＡＩ ０７２９０号で少なくとも部分的に支援された。米国政府は従って本発明においてある権利を有しうる。
免疫系の細胞は細胞外および細胞内シグナルに応答して遺伝子発現のパターンを変える。いくつかの細胞型においてある範囲の生物学的活性に影響を及ぼす、サイトカインもしくはリンホカインと称される一群のポリペプチドはこれらのシグナルのもっとも重要なものの１つである。免疫系中の多くの細胞型がサイトカインを分泌する一方、Ｔヘルパー（Ｔｈ）リンパ球がこれらのポリペプチドの主要供給源である。１０年以上前に、Ｔｈ細胞が、Ｔ細胞受容体会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に際して２つの別個のサブセット、Ｔｈ１およびＴｈ２（それらのまるで異なった機能的能力および独特のサイトカインプロフィルの双方により定義される）に分化することが発見された（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。Ｔｈ１細胞は遅延型過敏性応答およびマクロファージ活性化を媒介する一方、Ｔｈ２細胞はＢ細胞に対する援助を提供しまた、アレルギー応答において決定的に重要である（非特許文献２；非特許文献１；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。Ｔｈ１細胞が細胞媒介性免疫に向けられた一方でＴｈ２細胞は体液性応答に寄与していたという証拠は、生物体が病原体に応答して細胞媒介性もしくは体液性いずれかの応答を装備するがしかし双方はしない傾向があるという観察結果と申し分なく適合する。Ｔｈサブセット間のこれらの機能的差異はサイトカインそれら自身の活性により最も容易に説明が可能である。ＩＦＮ−γはＴｈ１細胞の「シグネチャ」サイトカインであるとは言え、Ｔｈ１細胞はＩＬ−２、ＴＮＦおよびＬＴもまた産生する。Ｔｈ２細胞の対応する「シグネチャ」サイトカインはＩＬ−４である。Ｔｈ２細胞はＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３もまた分泌する。
抗原との遭遇に際して、ナイーブなＣＤ４＋ Ｔヘルパー前駆体（Ｔｈｐ）細胞は、それをついにはＴｈ１もしくはＴｈ２系譜に送る遺伝プログラムを成立させる。Ｔｈｐにより受領される抗原および共刺激シグナルすなわち「シグナルの強度」を操作することにより極性化が達成され得ることが明白である（非特許文献８）一方、エフェクターＴｈ細胞の最も強力な誘導物質は明白にサイトカインそれら自身である。ＩＬ−４はＴｈ２の分化を促進しかつ同時にＴｈ１の発生（Ｓｔａｔ６シグナル伝達経路を介して媒介される効果）を遮断する。従って、ＩＬ−４もしくはＳｔａｔ６を欠くマウスはＴｈ２細胞を発生させることに失敗する（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。対照的にＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＦＮ−γはＴｈ１細胞の発生に決定的に重要なサイトカインである（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。Ｓｔａｔ１経路を介して作用するＩＦＮ−γ（非特許文献１７）およびＳｔａｔ−４シグナル伝達経路を介して作用するＩＬ−１２（非特許文献１９）は、一緒になってＴｈ１細胞の分化を促進しかつＴｈ２系譜への決定を遮断する（非特許文献２０；非特許文献２１）。ＩＬ−１２もしくはＳｔａｔ４が欠損のマウスはＴｈ１細胞を有しない（非特許文献１８；非特許文献１３；非特許文献１２）。別の重要なＴｈ１誘導性サイトカインはＩＬ−１８であり、その受容体はＩＬ−１受容体ファミリーに関係する（非特許文献２２）。ＩＬ−１８を欠くマウスは不完全なｉｎ ｖｉｖｏのＴｈ１応答を有し（非特許文献２３）、そしてＩＬ−１２およびＩＬ−１８双方がＩＦＮ−γ発現を調節する（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）。その後、サイトカインそれら自身がＴｈ極性化を駆動する正および負のフィードバック系を形成する（非特許文献２７；非特許文献２８：非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６：非特許文献１４）（（非特許文献３７；非特許文献１；非特許文献３８に総説される）。
過去数年にわたり、（非特許文献３９；非特許文献４０）に総説されたＩＬ−４産生を駆動するこうした因子の能力により明示されるところのＴｈｐからＴｈ２細胞への移行を制御する転写因子の同定において、大きな進歩がなされた。３種のまるで異なったタンパク質、すなわちｃ−Ｍａｆ癌原遺伝子、転写因子、活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）および新規核抗原、ＮＦＡＴ相互作用タンパク質４５ｋＤ（ＮＩＰ４５）の供給が、内因性のＩＬ−４を産生する能力を非Ｔ細胞に賦与することが示された（非特許文献４１；非特許文献４２）。これらの因子ならびにＧＡＴＡ−３（非特許文献４３）およびＳｔａｔ６のような他者は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ双方でＩＬ−４の産生および従ってＴｈ２細胞の発生をはっきりと駆動し得る。
対照的に、Ｔｈ１の分化の分子的基礎についてはほとんど知られていない。例えば、その非存在がＴｈ１細胞を生成させることの失敗をもたらす既知の転写因子はＳｔａｔ４（非特許文献４４；非特許文献４５）およびＩＲＦ−１（非特許文献４６；非特許文献４７）のみであり、それらのいずれもＴｈ１特異的でない。Ｓｔａｔ４依存性の様式でＩＬ−１２により誘導されるＥｔｓファミリーのメンバーＥＲＭがＴｈ１特異的であることが最近報告されたが、しかしそれはＴｈ１サイトカインの産生に影響を及ぼさない（非特許文献４８）。Ｓｔａｔ４欠損マウスにおけるＴｈ１細胞の非存在はＴｈ１プログラムを駆動することのＩＬ−１２の失敗に対し二次的である一方、ＩＲＦ−１欠損マウスにおけるＴｈ１細胞の欠如はＩＬ−１２遺伝子の転写の制御におけるその直接的影響によることがありそうである（非特許文献４６；非特許文献４７）。しかしながら、こうした推定のＴｈ１特異的調節因子の上流のシグナル伝達経路のいくつかが解明され始めている。ｐ３８キナーゼは、構成的に活性化されるＭＡＰキナーゼキナーゼ６（ＭＫＫ６）のＩＦＮ−γ産生を高める能力により示されるとおり、１つのこうしたシグナル伝達分子である。逆に、ドミナントネガティブのｐ３８ ＭＡＰキナーゼの過剰発現またはＪｎｋ２もしくはＪｎｋ１に標的を定めた破壊はＴｈ１応答を低下させる（非特許文献４９；非特許文献５０；非特許文献５１）。ＪＮＫシグナル伝達経路はＩＦＮ−γ遺伝子の転写に対する直接的影響によりＴｈの発生に影響を及ぼすかもしれないが、しかしこれは示されていない。例えば、ＡＴＦ−２およびＡＰ−１転写因子は双方ともＪＮＫキナーゼの基質であり、また、これらの因子ならびにＮＦκＢおよびＳｔａｔ４タンパク質はＩＦＮ−γプロモーター中の部位に結合することが知られている（非特許文献５２；非特許文献５３；非特許文献２４；非特許文献５４）。ＩＦＮ−γの産生はしかしながらＡＴＦ−２を欠くマウスで正常である。サイトカインは、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞の発生、ならびにそれにより免疫応答が主として細胞性となるかもしくは体液性となるかの決定において決定的に重要であるため、Ｔｈ１および／もしくはＴｈ２サイトカインの産生の調節のための組成物および方法は免疫応答の調節において非常に大きな利益があるとみられる。
ＰａｕｌとＳｅｄｅｒ、１９９４、Ｃｅｌｌ ７６、２４１−２５１ ＭｏｓｍａｎｎとＣｏｆｆｍａｎ、１９８９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７、１４５−１７３ Ｍｏｓｍａｎｎら、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６、２３４８−２３５７ ＳｎａｐｐｅｒとＰａｕｌ、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６、９４４−９４７ ＡｒｔｈｕｒとＭａｓｏｎ、１９８６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３、７７４−７８６ Ｐａｌｉａｒｄら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１、８４９−８５５ Ｆｉｎｋｅｌｍａｎら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１、２３３５−２３４１ ＣｏｎｓｔａｎｔとＢｏｔｔｏｍｌｙ、１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５、２９７−３２２ Ｋｏｐｆら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６２、２４５−２４８ Ｋｕｈｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４、７０７−７１０ Ｋａｐｌａｎら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４、３１３−３１９ Ｓｈｉｍｏｄａら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ ３８０、６３０−６３３ Ｔａｋｅｄａら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ ３８０、６２７−６３０ Ｈｓｉｅｈら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０、５４７−５４９ Ｏｋａｍｕｒａら、１９９５、ｎａｔｕｒｅ ３７８、８８−９１ Ｇｕら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５、２０６−２０９ Ｍｅｒａｚら、１９９６、Ｃｅｌｌ ８４、４３１−４４２ Ｍａｇｒａｍら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４、４７１−４８１ Ｊａｃｏｂｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１、１７５５−１７６２ Ｓｚａｂｏら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２、６６５−６７５ Ｓｚａｂｏら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：８１７−８２４ Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６、９７−１００ Ｔａｋｅｄａら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８、３８３−３９０ Ｂａｒｂｕｌｅｓｃｕら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、１０９８−１１０７ Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７、５７１−５８１ Ａｈｎら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９、２１２５−２１３１ ＰｏｗｒｉｅとＣｏｆｆｍａｎ、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４、２７０−２７４ Ｓｃｏｔｔ、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７、３１４９ Ｍａｇｇｉら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８、２１４２ Ｐａｒｒｏｎｃｈｉら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９、２９７７ Ｆａｒｇｅａｓら、１９９２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９、２９７７ Ｍａｎｅｔｔｉら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７、１１９９ Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４、３３５−３３８ Ｍａｃａｔｏｎｉａら、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．５、１１１９ Ｓｅｄｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、１０１８８−１０１９２ Ｗｕら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１、１９３８ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１２中、ＳｅｄｅｒとＰａｕｌ、１９９４、６３５−６７３ Ｏ’Ｇａｒｒａ、１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８、２７５−２８３ ＧｌｉｍｃｈｅｒとＳｉｎｇｈ、１９９９ Ｃｅｌｌ ９６、１３−２３ Ｓｚａｂｏら、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９、７７６−７８１ Ｈｏｄｇｅら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、１９０３−１９０５ Ｈｏら、１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１８５９−１８６６ ＺｈｅｎｇとＦｌａｖｅｌｌ、１９９７、Ｃｅｌｌ ８９、５８７−５９６ Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ ３８２、１７１−１７４ Ｋａｐｌａｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ ３８２、１７４−１７７ Ｌｏｈｏｆｆら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：６８１−６８９ Ｔａｋｉら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：６７３−６７９ Ｏｕｙａｎｇら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：３８８８ Ｒｉｎｃoｎら、１９９８、ＥＭＢＯ Ｊ．１７、２８１７−２８２９ Ｙａｎｇら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９、５７５−５８５ Ｄｏｎｇら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２、２０９２−２０９５ Ｚｈａｎｇら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、６１０５−６１１２ Ｙｅら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７４４ Ｓｉｃａら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、３０４１２−３０４２０
［発明の要約］
本発明は少なくとも部分的に、Ｔｈ１細胞の遺伝プログラムを開始することおよびＴｈ２細胞中での相反するプログラムを抑制することの双方により、ナイーブなＴヘルパー前駆細胞（Ｔｈｐ）におけるＴｈ１表現型を促進するようにはたらく新規組成物の発見に基づく。具体的には、本発明はＴ−ｂｅｔをコードする単離された核酸分子および単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質を提供する。Ｔ−ｂｅｔ（Ｔ細胞中で発現されるＴボックス（Ｔ ｂｏｘ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ））は、その創設メンバーがｂｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子である転写因子のＴボックスファミリーの新たな１メンバーである。Ｔ−ｂｅｔは選択的に胸腺細胞およびＴｈ１細胞中で構成的に発現される。Ｔ−ｂｅｔは、インターフェロン−γ遺伝子をトランス活性化し得、レトロウイルスで形質導入した初代Ｔ細胞中でのインターフェロン−γ産生を誘導し得かつ極性化Ｔｈ２細胞をＴｈ１経路に向け直し（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）得る最初のＴｈ１特異的転写因子である。Ｔ−ｂｅｔはまた、ＣＤ８＋ Ｔ細胞ならびに自然免疫系の細胞、例えばＮＫ細胞および樹状細胞中でのＩＦＮ−γ産生も制御する。本発明はこれらの新規Ｔ−ｂｅｔ組成物の使用方法もまた提供する。
本発明の一局面は、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質とＣＤ８＋ Ｔ細胞を接触させてそれによりＣＤ８＋ Ｔ細胞中でのＩＦＮ−γの産生を調節することを含んでなる、ＣＤ８＋細胞中でのＩＦＮ−γの産生の調節方法に関する。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。一局面において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が増大されてそれによりＩＦＮ−γの産生を増大させる。別の局面において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が減少されてそれによりＩＦＮ−γの産生を減少させる。該方法で使用する細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで作用物質と接触させてよい。
別の局面において、本発明は、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質とＣＤ８＋ Ｔ細胞を接触させてそれによりＣＤ８＋エフェクターメモリー細胞の産生を調節することを含んでなる、ＣＤ８＋エフェクターメモリー細胞の生成の調節方法に関する。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。特定の一態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が増大されてそれによりＣＤ８エフェクターメモリー細胞の生成を増大させる。別の特定の態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が減少されてそれによりＣＤ８エフェクターメモリー細胞の生成を減少させる。該方法で使用する細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで作用物質と接触させてよい。
本発明の別の局面は、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質とＣＤ８＋ Ｔ細胞を接触させてそれによりＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の調節によって利益を得ることができる障害を治療することを含んでなる、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の調節によって利益を得ることができる障害の治療方法に関する。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。ある態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が増大されてそれによりＣＤ８細胞の活性を増大させる。他の態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が減少されてそれによりＣＤ８細胞の活性を減少させる。特定の態様において、障害はウイルス感染症、例えば癌である。該方法で使用する細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで作用物質と接触させてよい。
本発明はさらに、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質とＣＤ８＋ Ｔ細胞を接触させてそれによりＣＤ８＋ Ｔ細胞中でのＩＬ−１０の産生を調節することを含んでなる、ＣＤ８＋細胞中でのＩＬ−１０の産生の調節方法に関する。請求項２４の方法、ここで作用物質は天然に生じるサイトカインでない。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。一態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が増大されてそれによりＩＬ−１０の産生を減少させる。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が減少されてそれによりＩＬ−１０の産生を増大させる。該方法で使用する細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで作用物質と接触させてよい。
本発明はさらに、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質とＣＤ８＋ Ｔ細胞を接触させてそれによりＣＤ８＋細胞の細胞溶解活性を調節することを含んでなる、ＣＤ８＋細胞の細胞溶解活性の調節方法に関する。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。一態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が増大されてそれによりＣＤ８＋細胞の細胞溶解活性を増大させる。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が減少されてＣＤ８＋細胞の細胞溶解活性を減少させる。該方法で使用する細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで作用物質と接触させてよい。
本発明はさらに、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質とＮＫ細胞を接触させてそれによりＮＫ細胞中でのＩＦＮ−γの産生を調節することを含んでなる、ＮＫ細胞中でのＩＦＮ−γの産生の調節方法に関する。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。一態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が増大されてそれによりＩＦＮ−γの産生を増大させる。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が減少されてそれによりＩＦＮ−γの産生を減少させる。
別の局面において、本発明は、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質とＮＫ細胞を接触させてそれによりＮＫ細胞の細胞溶解活性を調節することを含んでなる、ＮＫ細胞の生成の調節方法に関する。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。一態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が増大されてそれによりＮＫ細胞の生成を増大させる。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が減少されてそれによりＮＫ細胞の生成を減少させる。
なお別の局面において、本発明は、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質とＮＫ細胞を接触させてそれによりＮＫ細胞の細胞溶解活性を調節することを含んでなる、ＮＫ細胞の細胞溶解活性の調節方法に関する。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。一態様において、 作用物質がＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を増大させそしてＮＫ細胞の細胞溶解活性が増大される。別の態様において、作用物質がＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を減少させそしてＮＫ細胞の活性が減少される。ある態様において、グランザイムｂの発現が減少される。他の態様において、作用物質はパーフォリンの発現を減少させる。
本発明はまた、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質とＮＫ細胞を接触させてそれにより樹状細胞中でのＩＦＮ−γの産生を調節することを含んでなる、樹状細胞中でのＩＦＮ−γの産生の調節方法にも関する。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。一態様において、 Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が増大されてそれによりＩＦＮ−γの産生を増大させる。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が減少されてそれによりＩＦＮ−γの産生を減少させる。該方法で使用する細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで作用物質と接触させてよい。
本発明はさらに、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質を被験体に投与してそれによりＴ細胞の抗原提示の部位でのＩＦＮ−γの産生を調節することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞への抗原提示の部位でのＩＦＮ−γの産生の調節方法に関する。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。該方法は被験体に抗原を投与することをさらに含み得る。
なお別の局面において、本発明は、Ｔ−ｂｅｔとＴｅｃキナーゼとの間の相互作用を調節する作用物質と細胞を接触させてそれによりＴ−ｂｅｔの活性を調節することを含んでなる、Ｔ−ｂｅｔの活性の調節方法に関する。一態様においてキナーゼはＩＴＫである。別の態様において細胞はＴ細胞である。
本発明はさらに、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質を被験体に投与してそれにより末梢Ｔ細胞中での寛容の誘導を調節することを含んでなる、末梢Ｔ細胞における寛容の誘導の調節方法に関する。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。一態様において、被験体におけるＴｒ細胞の数もしくは割合が調節される。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの活性もしくは発現が増大されそして末梢の寛容が増大される。なお別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの活性もしくは発現が減少されそして末梢の寛容が減少される。
別の態様において、ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達を調節する作用物質と細胞を接触させることを含んでなる、Ｔ−ｂｅｔの活性。一態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。なお他の態様において、ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達が増大されそしてＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が減少される。一態様において、該方法はｉｎ ｖｉｖｏで実施される。本発明の別の局面において、該方法は先天性免疫および／もしくは適応免疫系の細胞による低下されたＩＦＮ−γの産生によって利益を得ることができる被験体で実施される。なお別の局面において、 ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達が減少されそしてＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が増大される。特定の一局面において、該方法はｉｎ ｖｉｖｏで実施される。なお別の特定の局面において、該方法は先天性免疫および／もしくは適応免疫系の細胞による増大されたＩＦＮ−γの産生によって利益を得ることができる被験体で実施される。
本発明はさらに、ＳＴＡＴ１媒介性のシグナル伝達を調節する作用物質と細胞を接触させることを含んでなる、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性の調節方法に関する。一局面において、作用物質は天然に生じるサイトカインでない。別の態様において、作用物質は天然に生じるサイトカインに対する抗体もしくはサイトカイン受容体に対する抗体でない。特定の一態様において、ＳＴＡＴ１媒介性のシグナル伝達が増大されそしてＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が増大される。特定の一局面において、該方法はｉｎ ｖｉｖｏで実施される。別の特定の局面において、該方法は先天性免疫および／もしくは適応免疫系の細胞による増大されたＩＦＮ−γ産生によって利益を得ることができる被験体で実施される。一態様において、ＳＴＡＴ１媒介性のシグナル伝達が減少されそしてＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が減少される。別の態様において、該方法は先天性免疫および／もしくは適応免疫系の細胞による減少されたＩＦＮ−γ産生によって利益を得ることができる被験体で実施される。
本発明はなおさらに、Ｔ−ｂｅｔの活性が調節されるような、Ｔｅｃキナーゼの活性を調節する作用物質（該作用物質は天然に生じるサイトカインもしくは天然に生じるサイトカインに対する抗体でない）と細胞を接触させることを含んでなる、Ｔ−ｂｅｔの活性の調節方法に関する。一態様において、ＴｅｃキナーゼはＩｔｋである。特定の一態様において、該方法は先天性免疫および／もしくは適応免疫系の細胞によるＩＦＮ−γ産生の調節によって利益を得ることができる被験体で実施される。
本発明はさらに、ａ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質を含んでなる指標組成物を提供すること；ｂ）該指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；ｃ）Ｔ−ｂｅｔとＴｅｃキナーゼとの間の相互作用を調節する目的の化合物を試験化合物のライブラリーから選択してそれによりＩＦＮ−γ産生の調節において有用な薬物を同定することを含んでなる、ＩＦＮ−γ産生の調節において有用な薬物の同定方法に関する。
別の局面において、本発明は、ａ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質を含んでなる指標組成物を提供すること；ｂ）該指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；ｃ）Ｔ−ｂｅｔとＴｅｃキナーゼとの間の相互作用を調節する目的の化合物を試験化合物のライブラリーから選択してそれによりＩＬ−４産生の調節において有用な薬物を同定することを含んでなる、ＩＬ−４産生の調節において有用な薬物の同定方法に関する。
別の局面において、本発明は、ａ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質を含んでなる指標組成物を提供すること；ｂ）該指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；ｃ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する目的の化合物を試験化合物のライブラリーから選択してそれによりＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達を調節する化合物を同定することを含んでなる、ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達の調節において有用な薬物の同定方法に関する。Ｔ−ｂｅｔ活性は、サイトカイン産生すなわちＳｍａｄ７の発現を測定することにより、ＴＧＦ β媒介性のシグナル伝達を測定することもしくはＴＧＦβの量を測定することにより決定される。指標組成物はＴ−ｂｅｔタンパク質を発現する細胞であってよい。一態様において、細胞は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする発現ベクターを細胞中に導入することによりＴ−ｂｅｔタンパク質を発現するよう工作されている。別の態様において、指標組成物は、細胞を含まない組成物もしくはＴ−ｂｅｔタンパク質および標的分子を発現する細胞でありかつ標的分子とＴ−ｂｅｔタンパク質の相互作用を調節する試験化合物の能力がモニターされるか、もしくはＴ−ｂｅｔタンパク質およびＴ−ｂｅｔタンパク質に応答性のレポーター遺伝子を含んでなる指標細胞を含んでなる。別の局面において、本発明は、前記指標細胞が：Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする組換え発現ベクター；およびＴ−ｂｅｔ応答性の調節要素が効果的に連結されたレポーター遺伝子を含んでなるベクターを含有する方法に関し；かつ、前記方法は：ａ）指標細胞を試験化合物と接触させること；ｂ）試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルを測定すること；およびｃ）試験化合物の非存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルと試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルを比較してそれによりＴ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する目的の化合物を選択することを含んでなる。
本発明はまた、ａ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質を含んでなる指標組成物を提供すること；ｂ）該指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；ｃ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する目的の化合物を試験化合物のライブラリーから選択してそれによりＪａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路を調節する化合物を同定することを含んでなる、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路の調節において有用な薬物の同定方法にも関する。Ｔ−ｂｅｔの活性は、サイトカイン産生（例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦα、ＴＧＦ−β、ＬＴ（リンホトキシン）およびＩＬ−１０よりなる群から選択されるサイトカイン）を測定することにより測定可能である。
本発明はさらに、ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達が調節されるようなＴ−ｂｅｔの活性もしくは発現を調節する作用物質と細胞を接触させることを含んでなる、細胞中でのＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達の調節方法に関する。一態様において、Ｔ−ｂｅｔの活性もしくは発現が細胞中で減少されかつＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達が増大される。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの活性もしくは発現が細胞中で増大されかつＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達が減少される。
本発明はなおさらに、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性が調節されるようなＴＧＦ−βの活性および／もしくは発現を調節する作用物質と細胞を接触させることを含んでなる、細胞中でのＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性の調節方法に関する。一局面において、野性型動物に比較して減少されたＩＦＮ−γ産生を特徴とする表現型を示す、非ヒト動物のＴ−ｂｅｔ遺伝子を機能的に破壊する外因性ＤＮＡ分子をそのゲノム中に含んでなる非ヒト動物。
［発明の詳細な説明］
本発明はＴ−ｂｅｔをコードする単離された核酸分子および単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質のようなＴ−ｂｅｔ組成物、ならびに従って使用方法に関する。本発明を使用してＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節し得る。下により詳細に論考されるとおり、Ｔ−ｂｅｔは多様な細胞外シグナルの重要な細胞内トランスデューサーもしくはメディエーターである。Ｔ−ｂｅｔは多様な細胞型において細胞外シグナルを特定のパターンの遺伝子発現に伝達するよう作動する転写因子である。とりわけ、Ｔ−ｂｅｔがサイトカイン遺伝子発現において中心的役割を有することが今や示された。多様な細胞型および多様な遺伝子がＴ−ｂｅｔに応答し、それは多様な細胞応答を調節するようはたらく。Ｔ−ｂｅｔはまた数種の遺伝子の発現も制御し、これらの遺伝子および同様に影響を受ける他者の発現は、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を制御することにより調節され（例えば高められもしくは低下され）得る。
本発明を使用して、その発現がＴ−ｂｅｔにより調節されるタンパク質のそれぞれ増大もしくは減少された産生を提供するように、Ｔ−ｂｅｔに応答性の遺伝子の発現を正にもしくは負に制御し得る。さらに、当該技術分野で既知の技術を使用して適切な位置にＴ−ｂｅｔ結合部位を挿入することにより、それらの天然に生じる形態でＴ−ｂｅｔ認識配列を有しない遺伝子をＴ−ｂｅｔの制御下に置くことができる。加えて、Ｔ−ｂｅｔを介して伝達される細胞外シグナルは、例えばこうした細胞外の影響のＴ−ｂｅｔに媒介される影響が調節されるようなＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する作用物質と細胞を接触させることにより調節可能である。従って、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を制御して、Ｔ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路を介するシグナル伝達を調節することができる。
本発明がより容易に理解されうるように、ある種の用語を最初に定義する。
本明細書で使用されるところのＴ−ｂｅｔに関して「調節される」という用語は、それが同一条件下でのＴ−ｂｅｔの天然に生じる発現、機能もしくは活性と異なる様式でＴ−ｂｅｔの発現、活性もしくは機能を変えることを包含する。例えば、発現、機能もしくは活性は、例えば結合特異性などの変化のゆえに天然に生じるＴ−ｂｅｔのものより大きくもしくは小さくなり得る。本明細書で使用されるところの、多様な形態の「調節する」という用語は、刺激（例えば特定の応答すなわち活性を増大すなわちアップレギュレートすること）および阻害（例えば特定の応答すなわち活性を減少すなわちダウンレギュレートすること）を包含する。
本明細書で使用されるところの「Ｔ−ｂｅｔ分子」という用語は、配列番号１および３に示される核酸分子と構造的特徴を共有するＴ−ｂｅｔ核酸分子、ならびに配列番号２および４に示されるＴ−ｂｅｔタンパク質の特徴的な構造的および機能的特徴を共有するＴ−ｂｅｔタンパク質を包含する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質はＴボックスファミリーのタンパク質のメンバーであり、そしてＢｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｔｂｘ１−６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）に対するなんらかのアミノ酸配列の相同性を共有する。Ｔボックスタンパク質はＴボックス結合部位でＤＮＡに結合するＴボックスドメインを含んでなる。Ｔ−ｂｅｔタンパク質のさらなる構造的および機能的特徴は下に提供される。
本明細書で使用されるところの「核酸分子」という用語はＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）を包含することを意図している。核酸分子は一本鎖であってももしくは二本鎖であってもよいが、しかし好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
本明細書で使用されるところの「単離された核酸分子」は、該核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中で該核酸に天然に隣接する遺伝子配列（すなわち該核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中で該単離された核酸分子の遺伝子に隣接して配列されている遺伝子配列）を含まない核酸分子を指す。例えば、多様な態様において、単離されたＴ−ｂｅｔ核酸分子は、該核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で該核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約１０ｋｂ未満を典型的に含有し、そしてより好ましくは、天然に隣接するヌクレオチド配列の約５、ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂもしくは０．１ｋｂ未満を含有する。「単離された」Ｔ−ｂｅｔ核酸分子はしかしながらゲノムＤＮＡ中でＴ−ｂｅｔ配列に通常は隣接しない他のヌクレオチド配列に連結されていてもよい（例えばＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列はベクター配列に連結されていてもよい）。ある好ましい態様において、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子はまた他の細胞物質を含まないかもしれない。しかしながら、Ｔ−ｂｅｔ核酸分子が「単離された」と見なされるために他の細胞物質を含まないことは必要でない（例えば、他の哺乳動物のＤＮＡから分離されかつ細菌細胞に挿入されたＴ−ｂｅｔ ＤＮＡ分子はなお「単離された」と見なされることができる）。
本明細書で使用されるところの「高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」という用語は、相互に対する実質的相同性（例えば、典型的には７０％以上の相同性）を有するヌクレオチド配列が相互に対し安定にハイブリダイズされたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述することを意図している。高ストリンジェンシー条件の好ましい制限しない一例は、約４５℃の温度で数時間ないし一夜の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中でのハイブリダイゼーション、次いで約５０〜６５℃の温度での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する洗浄緩衝液中での１回もしくはそれ以上の洗浄である。
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の情況で使用されるところの（例えば、１アミノ酸配列が別のアミノ酸配列にＸ％同一であると言われる場合）「同一性パーセント（％）」という用語は、至適に整列される場合に２配列間で共有される同一の残基の割合を指す。２ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を至適の比較の目的上整列する（例えば、他配列との至適のアライメントのために１配列中にギャップを導入してよい）。その後、対応する位置の残基を比較し、そして、１配列中の１位置が他配列中の対応する位置と同一の残基により占有されている場合には、該分子はその位置で同一である。２配列間の同一性パーセントは、従って、２配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。
２ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列を至適に整列かつ比較して該２配列間の同一性パーセントを定義するのに当該技術分野で既知のコンピュータアルゴリズムを使用し得る。２配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい制限しない一例は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７７でのように改変されたＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。こうした１アルゴリズムがＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。比較の目的上ギャップ付きアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（１７）：３３８９−３４０２に記述されるところのＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータが使用可能である。ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。例えば、本発明のヌクレオチド配列は：存在（ｅｘｉｓｔａｎｃｅ）５および伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）２に設定したギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を用いデフォルトのＢｌａｓｔｎマトリックス１−３を使用してブラストした（ｂｌａｓｔｅｄ）。本発明のアミノ酸配列は、デフォルトの設定、すなわち存在（ｅｘｉｓｔａｎｃｅ）１１および伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）１に設定したギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を用いＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを使用してブラストした。
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい制限しない例はＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を使用し得る。複数のプログラムを使用して配列を比較する場合は、至適のアライメント（すなわち２配列間の最高の同一性パーセント）を提供するプログラムを比較の目的上使用する。
本明細書で使用されるところの「天然に生じる」核酸分子は天然に生じる（例えば天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡもしくはＤＮＡ分子を指す。
本明細書で使用されるところの「アンチセンス」核酸は、あるタンパク質をコードする「センス」核酸に相補的、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的、ｍＲＮＡ配列に相補的もしくは遺伝子のコーディング鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合し得る。
本明細書で使用されるところの「コーディング領域」という用語はアミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域を指す一方、「非コーディング領域」とう用語はアミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば５’および３’非翻訳領域）を指す。
本明細書で使用されるところの「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸の輸送を可能にする核酸分子を指す。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、これは、付加的なＤＮＡセグメントをそれに連結しうる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターはウイルスベクターであり、ここでは付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結しうる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中での自律複製が可能である（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノムに組込まれ、そしてそれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが効果的に連結されている遺伝子の発現を指図することが可能である。こうしたベクターは本明細書で「組換え発現ベクター」もしくは単純に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態にある。本明細において、「プラスミド」および「ベクター」は互換性に使用しうる。プラスミドが最も普遍的に使用される形態のベクターであるためである。しかしながら、本発明は、同等の機能を供するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のようなこうした他の形態の発現ベクターを包含することを意図している。
本明細書で使用されるところの「宿主細胞」という用語は本発明の組換え発現ベクターのような本発明の核酸が導入された細胞を指すことを意図している。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は本明細書で互換的に使用する。こうした用語は特定の被験体細胞のみならずしかしこうした細胞の子孫もしくは潜在的子孫を指すことが理解されるべきである。突然変異もしくは環境の影響のいずれかによりある種の修飾が次の世代で起こりうるため、こうした子孫は事実上親細胞と同一でなくてもよいが、しかし本明細書で使用されるところの該用語の範囲内になお包含される。
本明細書で使用されるところの「トランスジェニック動物」は該動物の細胞の１個もしくはそれ以上が「トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」を包含する非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスを指す。「トランスジーン」という用語は、例えばトランスジェニック動物の１種もしくはそれ以上の細胞型もしくは組織中でのコードされる遺伝子産物の発現を指図する、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれかつ成熟動物のゲノム中に留まる外因性ＤＮＡを指す。
本明細書で使用されるところの「相同的組換え動物」は、内因性遺伝子と該動物の発生前に該動物の１細胞、例えば該動物の１胚細胞に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同的組換えにより内因性遺伝子が変えられた、ある型のトランスジェニック非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスを指す。
本明細書で使用されるところの「単離されたタンパク質」は、細胞から単離されるかもしくは組換えＤＮＡ技術により製造される場合は他のタンパク質、細胞物質および培地、または化学的に合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質を指す。
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分すなわちＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗原を特異的に結合する（それと免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を包含することを意図している。本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は抗原の特定の１エピトープと免疫反応することが可能な１種の抗原結合部位のみを含有する抗体分子の一集団を指す一方、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は特定の抗原と相互作用することが可能な複数の種の抗原結合部位を含有する抗体分子の一集団を指す。モノクローナル抗体組成物は従って、典型的にはそれが免疫反応する特定の１抗原に対し単一の結合親和性を表す。
ここで使用されるところの「イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」という用語は、細胞の内側の標的、例えばＴ−ｂｅｔのような細胞内タンパク質に対し向けられた細胞内で発現される抗体構築物、通常は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体を指す。
本明細書で使用されるところの「自己免疫疾患」という用語は、免疫系が身体自身の細胞を攻撃して組織破壊を引き起こす、被験体における障害もしくは状態を指す。自己免疫疾患は全身性自己免疫疾患（すなわち自己免疫反応が多数の組織で同時に起こる）もしくは器官特異的自己免疫疾患（すなわち自己免疫反応が単一器官を標的とする）を包含する。本発明の方法および組成物により診断、予防もしくは治療し得る自己免疫疾患の例は、限定されるものでないが、糖尿病、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物の咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、化合物発疹、らい境界反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴覚障害、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーヴス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ならびに間隙性肺線維症、ならびに自己免疫疾患の結果として引き起こされる二次的疾患を挙げることができる。
本明細書で使用されるところの「Ｔ細胞」（すなわちＴリンパ球）という用語は、哺乳動物（例えばヒトもしくはマウス）からの胸腺細胞、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞などを包含するＴ細胞系譜内の全細胞を包含することを意図している。
本明細書で使用されるところの「免疫応答」という用語はＴ細胞媒介性および／もしくはＢ細胞媒介性免疫を包含する。例示的免疫応答はＴ細胞応答、例えばサイトカイン産生および細胞傷害性を包含する。加えて、免疫応答という用語は、抗体産生（体液性応答）および先天性免疫系の細胞、例えばマクロファージのようなサイトカイン応答性細胞の活性化を包含する。
本明細書で使用されるところの「Ｔヘルパー１型応答」という用語は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ、ならびにリンホトキシン（ＬＴ）およびＴｈ２細胞よりむしろＴｈ１細胞により優先的にもしくは独占的に産生される他のサイトカインから選択される１種もしくはそれ以上のサイトカインの産生を特徴とする応答を指す。
本明細書で使用されるところの「Ｔヘルパー２型応答」（Ｔｈ２応答）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０から選択される１種もしくはそれ以上のサイトカインの産生を特徴としかつＴｈ２細胞により提供される効率的なＢ細胞の「援助（ｈｅｌｐ）」（例えば高められたＩｇＧ１および／もしくはＩｇＥ産生）を伴うＣＤ４＋ Ｔ細胞による応答を指す。
本明細書で使用されるところの「Ｔｈ２応答の発生を調節するサイトカイン」という用語は、Ｔｈ２応答の発生および／もしくは進行に対する影響を有するサイトカイン、とりわけＴｈ２応答の発生を促進するサイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を包含することを意図している。
本明細書で使用されるところの「先天性免疫系」という用語は天然のすなわち生来の免疫機構、すなわち感染前に存在し、微生物に対する迅速応答が可能でありかつ反復感染に対し実質的に同一の方法で反応する機構を包含する。
本明細書で使用されるところの「適応免疫系」もしくは「特異的免疫系」という用語は、感染性病原体の曝露により刺激されかつ特定の１微生物に対するそれぞれの引き続いての曝露で大きさおよび防禦能力が増大する免疫機構を包含する。
「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語は本発明の方法もしくはアッセイで使用されるまたは組成物中に存在する試薬もしくは試験作用物質を包含する。「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語は、Ｔ−ｂｅｔ発現もしくは活性の調節物質として以前に同定もしくは調節物質であることが認識されていない化合物を包含する。一態様において、１種以上の化合物、例えば複数の化合物を、Ｔ−ｂｅｔまたはシグナル伝達経路中のＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する分子の発現および／もしくは活性を調節するそれらの能力についてのスクリーニングアッセイで同時に試験し得る。「試験化合物のライブラリー」という用語は多数の試験化合物を含んでなる一団を指す。
一態様において、「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語はサイトカインのような天然に生じる化合物を除外する。別の態様において、作用物質という用語は天然に生じるサイトカインに結合する抗体を除外する。別の態様において、「作用物質」という用語はサイトカイン受容体に結合する抗体を除外する。なお別の態様において、「作用物質」という用語はＴ細胞受容体を介してシグナルを伝達する作用物質、例えばＴ細胞受容体複合体の成分に対するＭＨＣ分子もしくは抗体の情況における抗原を除外する。一態様において、作用物質もしくは試験化合物は、Ｔ−ｂｅｔと直接相互作用するかもしくはＴ−ｂｅｔが相互作用する分子と直接相互作用する化合物（例えばＴ−ｂｅｔとＴ−ｂｅｔ標的分子との間の相互作用を阻害もしくは刺激する化合物、例えばＤＮＡもしくは他のタンパク質）である。別の態様において、化合物は、例えばＴ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路中でＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流にある分子の活性を調節することによりＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を間接的に調節するものである。こうした化合物は下に詳細に記述されるところのこうした化合物について選択するスクリーニングアッセイを使用して同定可能である。
「小分子」という用語は当該技術分野の１用語でありかつ約１０００分子量未満もしくは約５００分子量未満である分子を包含する。一態様において、小分子はペプチド結合を独占的に含むわけではない。別の態様において、小分子はオリゴマーでない。活性についてスクリーニング可能な例示的小分子化合物は、限定されるものでないがペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、小有機分子（例えばポリケチド）（Ｃａｎｅら １９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：６３）および天然産物抽出物ライブラリーを挙げることができる。別の態様において、化合物は小型の有機非ペプチド化合物である。さらなる一態様において、小分子は生合成的でない。
本明細書で使用されるところの「Ｔ−ｂｅｔの調節物質」という用語は、Ｔ−ｂｅｔの発現、プロセシング、翻訳後修飾もしくは活性の調節物質を包含する。該用語は、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の転写、Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡのプロセシング、Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの翻訳、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の翻訳後修飾（例えばグリコシル化、ユビキチン化もしくはリン酸化）またはＴ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する作用物質、例えば化合物（１種もしくは複数）を包含する。「Ｔ−ｂｅｔ活性の調節物質」はＴ−ｂｅｔ活性を直接もしくは間接的に調節する化合物を包含する。例えば、Ｔ−ｂｅｔ活性の間接的調節物質はＴ−ｂｅｔを包含するシグナル伝達経路を調節するかもしれない。Ｔ−ｂｅｔ活性を直接調節する調節物質の例は、Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡに結合するアンチセンス核酸分子、Ｔ−ｂｅｔに細胞内で結合しかつＴ−ｂｅｔ活性を調節（すなわち阻害）する細胞内抗体、標的分子とＴ−ｂｅｔの相互作用を阻害するＴ−ｂｅｔペプチド、および細胞中でのＴ−ｂｅｔ活性の増大された発現を見込むＴ−ｂｅｔをコードする発現ベクター、ドミナントネガティブの形態のＴ−ｂｅｔ、ならびにＴ−ｂｅｔの活性を特異的に調節するよう作用する化合物を包含する。
本明細書で使用されるところのＴ−ｂｅｔタンパク質の「アゴニスト」は、天然に生じる形態のＴ−ｂｅｔタンパク質の生物学的活性もしくはそれの１サブセットを実質的に保持し得る。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の「アンタゴニスト」は、例えばＴ−ｂｅｔタンパク質の細胞活性を競合的に調節することにより天然に生じる形態のＴ−ｂｅｔタンパク質の活性の１種もしくはそれ以上を阻害し得る。
本明細書で互換的に使用されるところの「Ｔ−ｂｅｔ活性」、「Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性」もしくは「機能的活性Ｔ−ｂｅｔ」は、Ｔ−ｂｅｔ応答性の細胞もしくは組織、例えばＴ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、または標準的技術に従ってｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されるところのＴ−ｂｅｔ標的分子例えば核酸分子もしくはタンパク質標的分子に対してＴ−ｂｅｔタンパク質により発揮される活性を包含する。一態様において、Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ−標的分子との会合のような直接的活性である。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ標的分子とのＴ−ｂｅｔタンパク質の相互作用により媒介される下流の生物学的事象のような間接的活性である。Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性は本明細書に記述され、かつ、限定されるものでないが：先天性および適応免疫系の細胞中のＩＦＮ−γ産生の調節、Ｔ細胞系譜の決定の調節、サイトカインの産生の調節、ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達の調節、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路の調節、ＩｇＧクラススイッチングの調節、Ｂリンパ球機能の調節、ならびにＴ−ｂｅｔの調節によって利益を得ることができる障害、例えば自己免疫疾患、多発性硬化症もしくは慢性関節リウマチ、例えばウイルスもしくは細菌への感染、喘息およびＴｈ１もしくはＴｈ２サイトカインが関与する他の障害もしくは望まれない状態例えば炎症の調節を挙げることができる。これらの知見は薬物標的および多様な疾患、障害もしくは状態における治療的介入の標的としてのＴ−ｂｅｔ（およびＴ−ｂｅｔが関与する経路中の他の分子）の使用を提供する。本発明はなおさらに、Ｔ−ｂｅｔ活性を調節する作用物質を含んでなるワクチンのような免疫調節組成物を提供する。
本明細書で使用されるところの「標的分子」もしくは「結合パートナー」という用語は、Ｔ−ｂｅｔが事実上結合もしくは相互作用しかつその相互作用が生物学的応答をもたらす分子である。標的分子はタンパク質もしくは核酸分子であり得る。本発明の例示的標的分子は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質と同一のシグナル伝達経路中のタンパク質、例えば、例えばＴ細胞系譜の決定の調節、サイトカインの産生を調節すること、ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達を調節すること、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路を調節すること、ＩｇＧクラススイッチングを調節すること、Ｂリンパ球機能を調節することおよび自己免疫疾患を調節することを必要とする経路中でＴ−ｂｅｔタンパク質の上流（活性の賦活剤および阻害剤の双方を包含する）もしくは下流で機能しうるタンパク質を包含する。例示的Ｔ−ｂｅｔ標的分子はチロシンキナーゼ ｓ、例えばＩＴＫもしくはｒｌｋのようなＴｅｃキナーゼ、またはＴ−ｂｅｔがそれと相互作用して遺伝子転写を調節するもしくはＤＮＡ配列を包含する。
本明細書で使用されるところの「その転写がＴ−ｂｅｔにより調節される遺伝子」という用語は、Ｔ−ｂｅｔにより調節される制御領域を有する遺伝子を包含する。こうした遺伝子はＴ−ｂｅｔにより正もしくは負に調節される可能性がある。該用語は、Ｔ−ｂｅｔにより間接的に調節される、すなわちＴ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路の活性化の結果として調節される遺伝子もまた包含する。Ｔ−ｂｅｔにより調節される例示的遺伝子は例えばサイトカイン遺伝子、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦα、ＴＧＦ−β、ＬＴ（リンホトキシン）およびＩＬ−１０を包含する。
本明細書で使用されるところの「シグナル伝達経路」という用語は、細胞が細胞外の影響すなわちシグナル（例えばサイトカイン受容体もしくは抗原受容体のような細胞の表面上の受容体により伝達されるシグナル）を細胞応答（例えば遺伝子転写の調節）に転換する手段を包含する。例示的シグナル伝達経路は、ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ−１経路（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｗ．２００１．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７３：２７１）およびＴＧＦ−β経路（ＡｔｔｉｓａｎｏとＷｒａｎａ．２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９６：１６４６）を包含する。「Ｔ−ｂｅｔを巻き込むシグナル伝達経路」はＴ−ｂｅｔがシグナルを伝達する１シグナル伝達分子であるものである。
本明細書で使用されるところの「接触させること」（すなわち細胞、たとえば１個の細胞を化合物と接触させること）という用語は、化合物および細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで一緒にインキュベートすること（例えば化合物を培養物中の細胞に添加すること）、ならびに化合物および被験体の細胞がｉｎ ｖｉｖｏで接触されるような被験体に化合物を投与することを包含する。「接触させること」という用語は被験体中に天然に存在しうるＴ−ｂｅｔ調節物質への細胞の曝露（すなわち天然の生理学的過程の結果として起こりうる曝露）を包含しない。
本明細書で使用されるところの「ドミナントネガティブのＴ−ｂｅｔタンパク質」という用語は、天然の（すなわち天然に生じる野性型）Ｔ−ｂｅｔ分子と競合するがしかしＴ−ｂｅｔ活性を有しないＴ−ｂｅｔ分子（例えばその部分もしくは変異体）を包含する。こうした分子は細胞中のＴ−ｂｅｔ活性を効果的に減少させる。本明細書で使用されるところの「ドミナントネガティブのＴ−ｂｅｔタンパク質」はＴ−ｂｅｔ活性の強力な阻害剤である改変された形態のＴ−ｂｅｔを指す。
本明細書で使用されるところの「指標組成物」という用語は目的のタンパク質（例えばＴ−ｂｅｔ）を包含する組成物、例えば該タンパク質を天然に発現する細胞、該タンパク質をコードする発現ベクターを該細胞中に導入することにより該タンパク質を発現するよう工作された細胞、または該タンパク質を含有する細胞を含まない組成物（例えば精製された天然に生じるタンパク質もしくは組換え的に工作されたタンパク質）を指す。
本明細書で使用されるところの「細胞」という用語は原核生物および真核生物細胞を包含する。一態様において本発明の細胞は細菌細胞である。別の態様において本発明の細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。別の態様において本発明の細胞は脊椎動物細胞、例えばトリもしくは哺乳動物細胞である。好ましい一態様において本発明の細胞はマウスもしくはヒト細胞である。
本明細書で使用されるところの「樹状細胞」という用語はＴ細胞の刺激においてとりわけ活性である１つの型の抗原提示細胞を指す。樹状細胞はＧＭ−ＣＳＦの存在下で骨髄細胞を培養すること、ならびにＭＨＣクラスＩＩ分子およびＣＤ１１ｃを発現する細胞を選択することにより得ることができる。樹状細胞はＣＤ１１ｂ＋、ＤＥＣ−２０５＋、ＣＤ８−α＋もまた発現し得る。
本明細書で使用されるところの「ナイーブなＴ細胞への抗原提示の部位」という用語は、例えばｉｎ ｖｉｖｏの初期免疫応答の間に樹状細胞を相互連結することにより提示されるところの抗原とナイーブなＣＤ４ Ｔ細胞が最初に接触するリンパ組織内の部位を包含する。
本明細書で使用されるところの「ＣＤ８＋エフェクターメモリー細胞」という用語は特定の１病原体に対する長期免疫の維持を司るＣＤ８ Ｔ細胞を指す。ＣＤ８エフェクター／メモリー細胞はＣＤ８＋、ＣＤ４４ Ｈｉｇｈ、ＣＤ６２ Ｈｉｇｈ、ＣＤ６９ ＨｉｇｈおよびＬｙ６Ｃ Ｈｉｇｈである。
本明細書で使用されるところの「細胞溶解活性」という用語は標的細胞を溶解する細胞例えばＣＤ８＋細胞もしくはＮＫ細胞の能力を指す。こうした細胞溶解活性は、例えば標的細胞を放射活性に標識することにより標準的技術を使用して測定可能である。
本明細書で使用されるところの「ＴＲ細胞」という用語は自己特異的Ｔ細胞応答のリプレッサーとして機能するＣＤ２５を発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を指す。ＴＲ細胞は末梢Ｔ細胞における寛容の維持を司る。
本明細書で使用されるところの「末梢Ｔ細胞」という用語は胸腺を離れかつ末梢循環に進入する成熟シングルポジティブなＴ細胞を指す。
本明細書で使用されるところの「Ｔｅｃキナーゼ」という用語はそのＩＴＫおよびＲｌｋ／Ｔｘｋ（ｒｌｋ）が優勢なファミリーメンバーであるチロシンキナーゼの１ファミリーを指す。ＴｅｃキナーゼはＴ細胞中で発現され、そしてＴ細胞のＴ細胞抗原受容体媒介性の活性化に関与する。タンパク質チロシンキナーゼのＴｅｃファミリーは、ＴＣＲ、ＢＣＲおよびＦｃε受容体のような抗原受容体によるシグナル伝達において重要な役割を演じている。チロシンキナーゼのＴｅｃキナーゼファミリーのメンバーは例えばＴｅｃ、Ｂｔｋ、Ｉｔｋ、ＲｌｋおよびＢｍｘを包含する。
本明細書で使用されるところの「寛容」という用語はＴ細胞によるＴ細胞受容体媒介性のシグナルに対する不応答性を指す。こうしたＴ細胞媒介性のシグナルは例えばＭＨＣ分子もしくは外来ＭＨＣ分子の情況での抗原を包含する。
本明細書で使用されるところの「系譜の決定」という用語は前駆細胞例えばＴｈｐ細胞から特殊な１系譜の完全に分化したエフェクター細胞、例えばＴｈ１もしくはＴｈ２細胞のような受容体媒介性の刺激に際してサイトカインの特定の１プロフィルを分泌するＴ細胞へのＴ細胞系譜の発生を開始するプログラムを指す。
本明細書で使用されるところの「工作された」（工作された細胞でのような）という用語は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子が導入された細胞を指す。
本明細書で使用されるところの「細胞を含まない組成物」という用語は無傷の細胞を含有しない単離された組成物を指す。細胞を含まない組成物の例は細胞抽出物および単離されたタンパク質を含有する組成物を包含する。
本明細書で使用されるところの「レポーター遺伝子」という用語は検出可能な遺伝子産物例えばＲＮＡもしくはタンパク質を発現するいかなる遺伝子も指す。好ましいレポーター遺伝子は容易に検出可能であるものである。レポーター遺伝子は、所望の転写制御配列を包含するかもしくは他の所望の特性を表す遺伝子との融合遺伝子の形態の構築物中に包含されてもまたよい。レポーター遺伝子の例は、限定されるものでないがＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（ＡｌｔｏｎとＶａｐｎｅｋ（１９７９）、Ｎａｔｕｒｅ ２８２：８６４−８６９）ルシフェラーゼ、ならびに、β−ガラクトシダーゼ；ホタルルシフェラーゼ（ｄｅＷｅｔら（１９８７）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７）；細菌のルシフェラーゼ（ＥｎｇｅｂｒｅｃｈｔとＳｉｌｖｅｒｍａｎ（１９８４）、ＰＮＡＳ １：４１５４−４１５８；Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：３６６３−３６６７）；アルカリホスファターゼ（Ｔｏｈら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２３１−２３８、Ｈａｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（ＣｕｌｌｅｎとＭａｌｉｍ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３６２−３６８）、および緑色蛍光タンパク質（米国特許第５，４９１，０８４号明細書；第ＷＯ ９６／２３８９８号明細書）のような他の酵素検出系を挙げることができる。
本明細書で使用されるところの「Ｔ−ｂｅｔ応答配列」という用語はＴ−ｂｅｔの活性により直接もしくは間接的に調節される（それにより例えばレポーター遺伝子の転写を介してＴ−ｂｅｔの活性をモニターし得る）ＤＮＡ配列を指す。
本明細書で使用されるところの「Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞」という用語は、Ｔ−ｂｅｔが天然に欠損である被験体の細胞、ならびに非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物、例えばそれらがＴ−ｂｅｔが欠損であるような変えられたマウスの細胞を包含することを意図している。「Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞」という用語はｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される非ヒトのＴ−ｂｅｔ欠損動物もしくは被験体から単離された細胞もまた包含することを意図している。
本明細書で使用されるところの「非ヒトのＴ−ｂｅｔ欠損動物」という用語は、内因性遺伝子と動物の細胞、例えば動物の発生前の該動物の胚細胞中に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同的組換えにより内因性の遺伝子が変えられ、その結果内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が変えられてそれによりＴ−ｂｅｔの非産生もしくは不完全なＴ−ｂｅｔ活性を有する突然変異体の形態のＴ−ｂｅｔの産生のいずれかに至る、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスを指す。好ましくは、Ｔ−ｂｅｔの活性は完全に遮断されるが、とは言え該動物中でのＴ−ｂｅｔ活性の部分的阻害もまた包含される。「非ヒトのＴ−ｂｅｔ欠損動物」という用語は、特定の器官（１種もしくは複数）（例えばリンパ系器官）がＴ−ｂｅｔ遺伝子のホモ接合性突然変異を伴う胚幹（ＥＳ）細胞から生じるＲＡＧ−２胚盤胞相補系のような胚盤胞相補系を使用して生じられるキメラ動物（例えばマウス）を包含することもまた意図している。
特定の１タンパク質のアミノ酸配列と該タンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間に、遺伝暗号（下に示される）により定義されるところの既知のかつ決定的な対応が存在する。同様に、特定の１核酸分子のヌクレオチド配列とその核酸分子によりコードされるアミノ酸配列との間に、遺伝暗号により定義されるところの既知のかつ決定的な対応が存在する。
Figure 0004533627
Figure 0004533627
遺伝暗号の重要かつ公知の一特徴はその冗長性であり、それによりタンパク質を作成するのに使用されるアミノ酸の大部分について、１以上のコーディングヌクレオチドトリプレットが使用されるかもしれない（上に具体的に説明される）。従って、多数の異なるヌクレオチド配列が所定の一アミノ酸配列をコードするかもしれない。こうしたヌクレオチド配列は、それらが全生物体において同一のアミノ酸配列の産生をもたらすために機能的に同等とみなされる（とは言えある種の生物体はそれらが他者を行うよりも効率的にいくつかの配列を翻訳するかもしれない）。さらに、ときに、プリンもしくはピリミジンのメチル化変異体が所定のヌクレオチド配列中で見出されうる。こうしたメチル化は、三ヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコーディング関係に影響を及ぼさない。
前述を鑑み、本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質（もしくはそのいずれかの部分）をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子をアミノ酸配列に翻訳するための遺伝暗号を使用してＴ−ｂｅｔアミノ酸配列を生じさせるのに使用し得る。同様に、いずれのＴ−ｂｅｔアミノ酸配列についても、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードし得る対応するヌクレオチド配列を遺伝暗号（その冗長性のため、いずれかの所定のアミノ酸配列について複数の核酸配列を生じさせることができる）から推定し得る。従って、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列の本明細書の記述および／もしくは開示は、該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の記述および／もしくは開示もまた包含するとみなされるべきである。同様に、本明細書のＴ−ｂｅｔアミノ酸配列の記述および／もしくは開示は、該アミノ酸配列をコードし得る全部の可能なヌクレオチド配列の記述および／もしくは開示もまた包含するとみなされるべきである。
ＢｒａｃｈｙｕｒｙもしくはＴは、Ｔボックスと呼ばれる２００アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを共有する転写因子の１ファミリーの創設メンバーである（Ｓｍｉｔｈ、１９９７；Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ、１９９７；Ｍｅｉｓｌｅｒ、１９９７に総説される）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（「短い尾」のギリシア語）突然変異は、短いわずかにもつれた尾部を有したヘテロ接合性突然変異体動物で１９２７年に最初に記述された（Ｈｅｒｒｍａｎｎら、１９９０）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔボックスタンパク質のアミノ末端の半分（アミノ酸１〜２２９）は、配列特異的ＤＮＡ結合活性を表すことが示されているＴボックスとして知られる保存された１ドメインを含有する（Ｋｉｓｐｅｒｔ，Ａ．とＨｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：３２１１；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，Ｃ．ら １９９７．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４０９：２０１；Ｋｉｓｐｅｒｔ，Ａ．ら、１９９５．ＥＭＢＯ Ｊ．１４：４７６３）。Ｃ末端の半分は２対のトランス活性化および抑制ドメインを含有する。オルソロガス（ｏｔｒｈｏｌｏｇｏｕｓ）種のＴボックス領域間の配列の類似性は約９９％であり得、また、非オルソロガス遺伝子間で約４０〜７０％である。Ｔボックスドメインは最近ＤＮＡと共結晶化され、そしてタンパク質が主および副溝双方でＤＮＡを接触する新規の配列特異的ＤＮＡ認識構造を示す（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃ．Ｗ．とＨｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ ３８９、８８４）。
酵母１ハイブリッドアプローチを使用してＴｈ−１特異的転写因子が同定された。酵母細胞はＩＬ−２プロモーター−レポーター遺伝子構築物を発現するようにし、そして抗ＣＤ３活性化Ｔｈ１細胞クローンから作成したｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。ＩＬ−２プロモーターの検査はＮＦκＢ部位のすぐ５’の−２４０ないし−２２０に１個の優れたＴボックス結合部位を示す。付属として付けられる実施例に記述されるとおり、Ｔ−ｂｅｔをＩＬ−２プロモーターに結合するその能力に基づく酵母１ハイブリッドスクリーニングアッセイで単離した。
マウスＴ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列を配列番号３に示す。マウスＴ−ｂｅｔは残基１３６〜３２６に位置する１９０アミノ酸のＴボックスドメインをもつ５３０アミノ酸のタンパク質である。マウスＴ−ｂｅｔのアミノ酸配列を配列番号４に示す。マウスＴ−ｂｅｔ配列を本明細書で記述されるとおりクローン化した後に、いずれかの既知タンパク質をコードすることが以前に知られていなかった核酸フラグメントからＴ−ｂｅｔのヒトオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）の配列を編纂することが可能であった。ヒトＴ−ｂｅｔのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ヒトＴ−ｂｅｔは残基１３８〜３２７に位置する１９０アミノ酸のＴボックスドメインをもつ５３５アミノ酸のタンパク質である。ヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子は第１７染色体に位置する（ｍａｐ）。Ｔ−ｂｅｔファミリーのタンパク質の２メンバー（ヒトおよびマウス）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１および配列番号１〜４に示す。
本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質はＴボックスタンパク質に対する相同性を有する。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙを包含しないマウスに今や８種のＴボックス遺伝子が存在する。これらはＴｂｘ１−６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）および今やＴ−ｂｅｔを包含し、それぞれまるで異なりかつ通常は複雑な発現パターンをもつ。例えばＴ−ｂｒａｉｎ−１の発現は主として大脳皮質内の別個の領域に限定される（Ｂｕｌｆｏｎｅ，Ａ．ら １９９５．Ｎｅｕｒｏｎ １５、６３。Ｔ−ｂｅｔは配列がＴｂｒ−１に最も似ている。Ｔボックスの外に、本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は他のＴボックスタンパク質に対する類似性をもたない。
Ｔ−ｂｅｔはＴ細胞中でのみ発現されるＴボックスタンパク質であり、そして配列がＴｂｒ−１に最も似ている。他の種もまたＢｒａｃｈｙｕｒｙ様遺伝子を発現する。こうした脊椎動物種は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ゼブラフィッシュ、ニワトリおよびヒト（Ｒａｏ、１９９４；ＨｏｒｂとＴｈｏｍｓｅｎ、１９９７；Ｃｏｎｌｏｎら、１９９６；Ｒｙａｎら、１９９６；Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｍｅｒｋｅｒら、１９９４；Ｅｄｗａｒｄｓら、１９９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９６；Ｌａｗら、１９９５；Ｃａｍｂｅｌｌら、１９９８）、ならびにナメクジウオ、ホヤ、棘皮動物、ケノルハブディティス エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および他の昆虫のようなより離れた種を包含する（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９９５）。これらの遺伝子は配列および発現パターン双方が保存されている。
Ｔ−ｂｅｔは、それがチロシンリン酸化されるべき唯一のＴボックスタンパク質であるために独特である。ヒトＴ−ｂｅｔのＴｙｒ７６、Ｔｙｒ１１９およびＴｙｒ５３１の３個、ならびにマウスＴ−ｂｅｔのＴｙｒ５２５の１個の予測されるチロシンリン酸化部位が存在する。核局在化配列もまたヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸４９８〜５０１およびマウスＴ−ｂｅｔの４９３〜４９６に存在する。マッピング実験は２個のトランス活性化ドメイン（Ｔボックスドメインの５’に１個および３’に１個）を位置づける。本明細書に示されるデータは、Ｔ−ｂｅｔが、コンセンサスＴボックス部位（５’−ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣＣ−３’として標的部位選択によりｉｎ ｖｉｔｒｏで定義される）ならびにヒトＩＬ−２プロモーター、マウスＩＬ−２プロモーター、ヒトＩＦＮ−γイントロンＩＩＩおよびマウスＩＦＮ−γ近位プロモーターの２個の結合部位に結合することを示す。（Ｓｚａｂｏら ２０００．Ｃｅｌｌ １００：６５５−６６９）。Ｔ−ｂｅｔは胸腺および末梢リンパ系中でのみ発現される。末梢においてＴ−ｂｅｔはＴｈ１細胞中でのみ発現され、そこでそれはＴｃＲ刺激およびＩＬ−１２双方に応答して誘導される。胸腺におけるＴ−ｂｅｔのレベルはＤＮおよびＲａｇ２−／−胸腺細胞中で最高である。
これらのデータは、新規ＴボックスファミリーメンバーＴ−ｂｅｔの選択的発現が組織特異的ＩＦＮ−γ発現の原因であることを示す。Ｔ−ｂｅｔはＴｈ１細胞中でのみ発現されかつＴｈ２細胞中でされず、また、Ｔ細胞受容体によるシグナルの伝達に際して前者中で誘導される。
加えて、Ｔ−ｂｅｔはＩＦＮ−γ遺伝子の強力なトランス活性化因子である。Ｔ−ｂｅｔの発現は：Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞を包含する適応および先天性免疫系の細胞中でのＩＦＮ−γ発現と相関する。Ｔ−ｂｅｔは、ナイーブなＴｈｐ細胞からのＴｈ１系譜の発生を開始させかつＴｈ１遺伝プログラムを開始することおよびＴｈ２細胞中の相反するプログラムを抑制することの双方により作用する遺伝プログラムを司る。
本発明の多様な局面を以下の小区分にさらに詳細に記述する：
Ｉ．単離された核酸分子
本発明の一局面はＴ−ｂｅｔをコードする単離された核酸分子に関する。好ましい一態様において、本発明の核酸分子は配列番号１もしくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、本発明の核酸分子は配列番号１の最低約７００の連続するヌクレオチドもしくは配列番号３の最低約５００の連続するヌクレオチドを含んでなる。好ましい一態様において、本発明の核酸分子は配列番号１の最低約８００、最低約１０００、最低約１２００、最低約１４００もしくは最低約１６００の連続するヌクレオチドを含んでなる。別の好ましい態様において、本発明の核酸分子は配列番号３の最低約６００、最低約８００、最低約１０００、最低約１２００もしくは最低約１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる。
他の態様において、該核酸分子は：配列番号１の最低約７００、最低約８００、最低約１０００、最低約１２００、最低約１４００もしくは最低約１６００の連続するヌクレオチドを含んでなる核酸分子と最低７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、およびなおより好ましくは９０％の同一性を有する。他の態様において、該核酸分子は：配列番号３の最低約６００、最低約８００、最低約１０００、最低約１２００もしくは最低約１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる核酸分子と最低７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、およびなおより好ましくは９０％のヌクレオチド同一性を有する。
遺伝暗号の縮重により配列番号１もしくは３と異なりかつ従って配列番号１および３によりコードされるものと同一のＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子が本発明により包含される。従って、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
加えて、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子は標準的分子生物学技術および本明細書に提供される配列情報を使用して他の供給源から単離され得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔ ＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１もしくは３の全部もしくは部分、および標準的ハイブリダイゼーション技術（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９に記述されるところの）を使用してヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離し得る。さらに、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の全部もしくは一部分を包含する核酸分子は配列番号１もしくは３の配列に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により単離し得る。例えば、ｍＲＮＡを（例えばＣｈｉｒｇｗｉｎら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−５２９９のチオシアン酸グアニジウム抽出手順により）細胞から単離し得、そして逆転写酵素（例えばギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、メリーランド州ベセスダから入手可能なモロニーＭＬＶ逆転写酵素；もしくはセイカガク アメリカ インク（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）、フロリダ州セントピーターズバーグから入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を使用してｃＤＮＡを調製し得る。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列に基づき設計が可能である。本発明の核酸は、標準的ＰＣＲ増幅技術に従い、鋳型としてのｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し得る。そのように増幅した核酸を適切なベクターにクローン化しかつＤＮＡ配列分析により特徴づけが可能である。さらに、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは例えば自動ＤＮＡ合成装置を使用する標準的合成技術により製造し得る。
配列番号１および３に示されるＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列に加え、Ｔ−ｂｅｔのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の小さな変化につながるＤＮＡ配列多形が集団内に存在しうることが当業者により認識されるであろう。Ｔ−ｂｅｔ遺伝子中のこうした遺伝子多形は天然の対立遺伝子変異により集団内の個体間で存在しうる。こうした天然の対立遺伝子変異は典型的には１遺伝子のヌクレオチド配列中の１〜２％の変化をもたらし得る。天然の対立遺伝子変異の結果でありかつＴ−ｂｅｔの機能的活性を変えないＴ−ｂｅｔ中のいかなるそして全部のこうしたヌクレオチド変異および生じるアミノ酸の多形も、本発明の範囲内にあることを意図している。
本発明のＴ−ｂｅｔ ＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体に対応する核酸分子は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標準的ハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとしてヒトＤＮＡもしくはその一部分を使用して本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔ核酸分子に対するそれらの相同性に基づき単離が可能である。例示的高ストリンジェンシー条件は、約４５℃の温度で数時間ないし一夜の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中でのハイブリダイゼーション、次いで約５０〜６５℃の温度での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する洗浄緩衝液中での１回もしくはそれ以上の洗浄を包含する。従って、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列を含んでなる第二の核酸分子に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。好ましくは、配列番号１もしくは３の配列番号の配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子。一態様において、こうした核酸分子は長さが最低約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００、１５００もしくは１６００ヌクレオチドである。別の態様において、こうした核酸分子は配列番号１の最低約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００、１５００もしくは１６００の連続するヌクレオチドまたは配列番号３の最低約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００もしくは１５００の連続するヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、単離された核酸分子はＴ−ｂｅｔ核酸分子の天然に生じる対立遺伝子変異体に対応する。
集団中に存在しうるＴ−ｂｅｔ配列の天然に生じる対立遺伝子変異体に加え、当業者は、配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列中に突然変異により小さな変化を導入してそれによりＴ−ｂｅｔタンパク質の機能的活性を変えることなくコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化に至るかもしれないことをさらに認識するであろう。例えば、「非不可欠の」アミノ酸残基のアミノ酸置換に至るヌクレオチド置換を配列番号１もしくは３の配列中で行いうる。１個の「非不可欠の」アミノ酸残基はＤＮＡと相互作用するその能力もしくはＩＦＮ−γプロモーターからの転写を高めるその能力のようなＴ−ｂｅｔの機能的活性を変えることなくＴ−ｂｅｔの野性型配列（例えば配列番号１もしくは３の配列）から変えることができる残基である一方、「不可欠の」アミノ酸残基は機能的活性に必要とされる。
従って、本発明の別の局面はＴ−ｂｅｔ活性に不可欠でないアミノ酸残基の変化を含有するＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子に関する。こうしたＴ−ｂｅｔタンパク質は配列番号２もしくは４とアミノ酸配列が異なるがそれでもなおＴ−ｂｅｔ活性を保持する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の非天然の変異体をコードする単離された核酸分子は、コードされるタンパク質に１個もしくはそれ以上のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失が導入されるような配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列中に１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失を導入することにより創製し得る。突然変異は部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発のような標準的技術により配列番号１もしくは３に導入可能である。好ましくは、保存的アミノ酸置換を１個もしくはそれ以上の非不可欠のアミノ酸残基で行う。「保存的アミノ酸置換」はアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるものである。塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電しない極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝状側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義されている。従って、Ｔ−ｂｅｔ中の非不可欠なアミノ酸残基は、好ましくは同一の側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換える。
あるいは、別の態様において、突然変異は、飽和突然変異誘発によるようにＴ−ｂｅｔのコーディング配列の全部もしくは一部に沿って無作為に導入可能であり、そして、結果として生じる突然変異体は、ＤＮＡに結合するおよび／もしくは転写を活性化するそれらの能力についてスクリーニングして機能的活性を保持する突然変異体を同定し得る。突然変異誘発後に、コードされるＴ−ｂｅｔ突然変異体タンパク質を宿主細胞中で組換え的に発現させることができ、そして、Ｔ−ｂｅｔ活性を評価するための当該技術分野で利用可能なアッセイを使用して（例えばＤＮＡ中に存在するＴボックス結合配列に結合する該タンパク質の能力を測定することにより、またはＴ細胞のＴｈ１もしくはＴｈ２表現型を調節する該タンパク質の能力を測定することにより突然変異体タンパク質の機能的活性を測定し得る。
本発明の別の局面はＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡもしくは遺伝子のコーディング鎖に対しアンチセンスである単離された核酸分子に関する。本発明のアンチセンス核酸分子はＴ−ｂｅｔコーディング鎖全体もしくはその一部分のみに相補的であり得る。一態様において、アンチセンス核酸分子はタンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーに独特であるかもしくは特定の種からのＴ−ｂｅｔ配列に独特であるＴ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖のコーディング領域に対しアンチセンスである。別の態様において、アンチセンス核酸分子はタンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーに独特であるかもしくは特定の種からのＴ−ｂｅｔ配列に独特であるＴ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コーディング領域に対しアンチセンスである。好ましい態様において、本発明のアンチセンス分子は配列番号１の非コーディング鎖の最低約７００の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列番号１の非コーディング鎖の最低８００、１０００、１２００、１４００もしくは１６００の連続するヌクレオチド、または配列番号３の非コーディング鎖の最低約５００の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列番号３の最低６００、８００、１０００、１２００もしくは１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる。
本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔをコードするコーディング鎖配列（例えば配列番号１および３が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸はワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って設計が可能である。アンチセンス核酸分子はＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的であってよいか、あるいはＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡのコーディングもしくは非コーディング領域の一部分のみに対しアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的であってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば長さが約１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は当該技術分野で既知の手順を使用する化学合成および酵素的連結反応を使用して構築し得る。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチド、または該分子の生物学的安定性を増大させるかもしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるよう設計された多様に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的合成が可能であり、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用可能である。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンスの向きでサブクローニングした発現ベクターを使用して生物学的に製造し得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、以下の小区分にさらに記述される目的の標的核酸に対しアンチセンスの向きのものであることができる）。
別の態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらがそれに対する相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断することが可能であるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒的ＲＮＡ分子である。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列に基づき設計し得る。例えば、活性部位の塩基配列がＴ−ｂｅｔをコードするｍＲＮＡ中の切断されるべき塩基配列に相補的であるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えばＣｅｃｈら 米国特許第４，９８７，０７１号明細書；およびＣｅｃｈら 米国特許第５，１１６，７４２号明細書を参照されたい。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡを使用してＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択し得る。例えばＢａｒｔｅｌ，Ｄ．とＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照されたい。
別の態様において、ＲＮＡｉを使用してＴ−ｂｅｔ発現を阻害し得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して該ｄｓＲＮＡと同一の配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する転写後の標的を定められた遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．とＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７、２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ら Ｃｅｌｌ １０１、２５−３３（２０００）。Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３、３１９１−３１９７（１９９９））。該過程は、内因性リボヌクレアーゼがより長いｄｓＲＮＡを低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡと命名されるより短い２１もしくは２２ヌクレオチド長のＲＮＡに切断する場合に起こる。該より小さいＲＮＡセグメントがその後標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。
ＲＮＡｉのアンチセンスＲＮＡ鎖は、Ｔ−ｂｅｔのコーディング領域の少なくとも一部分またはＴ−ｂｅｔ遺伝子の５’もしくは３’非翻訳領域の少なくとも一部分に対しアンチセンスであり得る。一態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は２ｎｔの３’オーバーハングを有するための様式で対にされた２１ｎｔのセンスおよび２１ｎｔのアンチセンス鎖から構成される。一態様においてオーバーハング中にＴＴを伴うｓｉＲＮＡ配列。標的領域は例えば開始コドンの５０ないし１００ｎｔ下流であり得、３’−ＵＴＲもまた標的とされうる。一態様において、２３ｎｔの配列モチーフＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ（Ｎ、いずれかのヌクレオチド）を探索しそして約３０〜７０％の間のＧ／Ｃ含量を伴うヒットを選択し得る。適する配列が見出されない場合はモチーフＮＡ（Ｎ２１）を使用して検索を拡大する。ｓｉＲＮＡは好ましくは適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび慣習的ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して化学的に合成する。ｓｉＲＮＡは例えばダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ゼラゴン インク（Ｘｅｒａｇｏｎ Ｉｎｃ）、プロリゴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）およびアムビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からまた商業的にも入手可能である。一態様において、アンチセンスＲＮＡでの使用について上述された化学の１種もしくはそれ以上を使用し得る。
本発明のなお別の局面はＴ−ｂｅｔ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。非Ｔ−ｂｅｔタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列に効果的に連結されたＴ−ｂｅｔタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする最低１種の第一のヌクレオチド配列を含んでなるこうした核酸分子が標準的組換えＤＮＡ技術により製造可能である。Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質は下の小区分ＩＩＩにさらに詳細に記述する。
ＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の局面はＴ−ｂｅｔ（もしくはその一部分）をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは組換え発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは宿主細胞中での核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含んでなり、これは、該組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に効果的に連結されている発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された１種もしくはそれ以上の制御配列を包含することを意味する。組換え発現ベクター内で、「操作可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系でもしくはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞中で）該ヌクレオチド配列の発現を見込む様式で制御配列（１種もしくは複数）に連結されることを意味することを意図している。「制御配列」という用語はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節領域（例えばポリアデニル化シグナル）を包含する。こうした制御配列は例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記述される。制御配列は、多くの型の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、およびある宿主細胞中でのみ該ヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば組織特異的制御配列）を包含する。発現ベクターの設計は形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存しうることが当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入してそれにより本明細書に記述されるところの核酸によりコードされる融合タンパク質もしくはペプチド（例えばＴ−ｂｅｔタンパク質、突然変異体の形態のＴ−ｂｅｔタンパク質、Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質など）を包含するタンパク質もしくはペプチドを産生し得る。
本発明の組換え発現ベクターは原核生物もしくは真核生物細胞中でのＴ−ｂｅｔタンパク質の発現のため設計可能である。例えば、Ｔ−ｂｅｔは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞中で発現させ得る。適する宿主細胞はＧｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）にさらに論考されている。あるいは、組換え発現ベクターは例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで転写かつ翻訳してもよい。
原核生物中でのタンパク質の発現は、融合もしくは非融合いずれかのタンパク質の発現を指図する構成的もしくは誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で最もしばしば実施される。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、通常は該組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。こうした融合ベクターは１種もしくはそれ以上の目的すなわち１）組換えタンパク質の発現を増大させる；２）組換えタンパク質の溶解性を増大させる；３）親和性精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製において補助する；４）タンパク質の検出および／もしくは精製で補助するためのエピトープ標識を提供する；ならびに／または５）タンパク質の検出で補助するためのマーカー（例えばβ−ガラクトシダーゼ融合物を使用する色マーカー）を提供する、にかなう可能性がある。しばしば、融合発現ベクターにおいてタンパク質分解性切断部位が融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入され、融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。こうした酵素およびそれらのコグネイト認識配列は第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質もしくはプロテインＡを融合するｐＧＥＸ（ファルマシア バイオテック インク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．とＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ニュー イングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリー）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を包含する。組換えタンパク質はまた、上で論考されたと同一の目的上融合タンパク質として真核生物細胞中でも発現し得る。
適する誘導可能な非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）６０−８９）を包含する。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現はハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼの転写に頼る。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は共発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎｌ）により媒介されるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に頼る。このウイルスのポリメラーゼはｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写制御下にＴ７ ｇｎｌ遺伝子をもつ常在性λプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）もしくはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での組換えタンパク質発現を最大にする１戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する損なわれた能力をもつ宿主細菌中で該タンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）１１９−１２８）。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で優先的に利用されるものとなるように発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである（Ｗａｄａら、（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のこうした変更は標準的ＤＮＡ合成技術により実施可能である。
別の態様においてＴ−ｂｅｔ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）中での発現のためのベクターの例はｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎとＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）およびｐＹＥＳ２（インビトロジェン コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）を包含する。
あるいは、Ｔ−ｂｅｔはバキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現し得る。培養された昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．とＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）を包含する。
なお別の態様において、本発明の核酸は哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＭｅｘ−ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）を包含する。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの調節要素により提供される。例えば、普遍的に使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０由来である。
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指図することが可能である（例えば核酸を発現させるのに組織特異的調節要素を使用する）。組織特異的調節要素は当該技術分野で既知である。適する組織特異的プロモーターの制限しない例は、リンパ組織特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅとＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、とりわけＴ細胞受容体（ＷｉｎｏｔｏとＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎとＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）のプロモーター、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、ニューロン特異的プロモーター（例えば神経細糸プロモーター；ＢｙｒｎｅとＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば乳ホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）を包含する。発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌとＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓとＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含される。
さらに、哺乳動物細胞中での使用のための誘導可能な調節系、例えば遺伝子発現が重金属イオン（例えばＭａｙｏら（１９８２）Ｃｅｌｌ ２９：９９−１０８；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２；Ｓｅａｒｌｅら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９を参照されたい）、熱ショック（例えばＨｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ、フロリダ州ボカレイトン中Ｎｏｕｅｒら（１９９１）、ｐｐ１６７−２２０を参照されたい）、ホルモン（例えばＬｅｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９４：２２８−２３２；Ｈｙｎｅｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０３８−２０４２；Ｋｌｏｃｋら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：７３４−７３６；ＩｓｒａｅｌとＫａｕｆｍａｎ（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４；およびＰＣＴ公開第ＷＯ ９３／２３４３１号明細書を参照されたい）、ＦＫ−５０６関連分子（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９４／１８３１７号明細書を参照されたい）、もしくはテトラサイクリン（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．とＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９；ＰＣＴ公開第ＷＯ ９４／２９４４２号明細書；およびＰＣＴ公開第ＷＯ ９６／０１３１３号明細書を参照されたい）により調節される系が当該技術分野で既知である。従って、別の態様において、本発明はＴ−ｂｅｔ ＤＮＡが誘導可能な真核生物プロモーターに効果的に連結されてそれにより真核生物細胞中でのＴ−ｂｅｔタンパク質の誘導可能な発現を見込む組換え発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、発現ベクターにアンチセンスの向きでクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子はＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を見込む様式で制御配列に効果的に連結される。多様な細胞型でのアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図する、アンチセンスの向きでクローン化された核酸に効果的に連結された制御配列を選ぶことができ、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的発現を指図するウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサーまたは制御配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、高効率の制御領域の制御下にアンチセンス核酸を産生する組換えプラスミド、ファージミドもしくは弱毒化ウイルスの形態にあることができ、その活性はベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考についてはＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照されたい。
本発明の別の局面は、本発明のベクター、好ましくは組換え発現ベクターが導入されている組換え宿主細胞に関する。宿主細胞はいかなる原核生物もしくは真核生物細胞であってもよい。例えば、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母もしくは哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞のような）中で発現させてよい。他の適する宿主細胞が当業者に既知である。ベクターＤＮＡは慣習的形質転換もしくはトランスフェクション技術を介して原核生物もしくは真核生物細胞中に導入し得る。本明細書で使用されるところの「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔法を包含する、宿主細胞中に外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための多様な技術的に認識される技術を指すことを意図している。宿主細胞の適する形質転換もしくはトランスフェクション方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ）（１９８９））および他の実験室手引き書に見出し得る。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して細胞の小部分のみがそれらのゲノム中に外来ＤＮＡを組込みうることが既知である。これらの組込み体を同定かつ選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を一般に目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーはＧ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような化合物に対する耐性を賦与するものを包含する。選択可能なマーカーをコードする核酸はＴ−ｂｅｔをコードするものと同一ベクター上で宿主細胞に導入してよいか、もしくは別個のベクター上で導入してよい。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は化合物選択により同定可能である（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組込んだ細胞は生き残ることができる一方、他の細胞は死ぬ）。
培養物中の原核生物もしくは真核生物宿主細胞のような本発明の宿主細胞を使用してＴ−ｂｅｔタンパク質を産生（すなわち発現）させ得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用するＴ−ｂｅｔタンパク質の製造方法を提供する。一態様において、該方法は、本発明の宿主細胞（Ｔ−ｂｅｔをコードする組換え発現ベクターが導入されている）をＴ−ｂｅｔが産生されるまで適する培地中で培養することを含んでなる。別の態様において、該方法は培地もしくは宿主細胞からＴ−ｂｅｔを単離することをさらに含んでなる。その天然の形態において、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は細胞内タンパク質であり、そして従って組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は組換え宿主細胞中で細胞内で発現され得そしてその後例えば宿主細胞を溶解することおよびライセートから組換えＴ−ｂｅｔタンパク質を回収することにより宿主細胞から単離し得る。あるいは、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は該タンパク質が宿主細胞から分泌されるような該タンパク質のアミノ末端に異種シグナル配列を効果的に連結することにより細胞外タンパク質として製造し得る。この場合、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は細胞を培養する培地から回収可能である。
本発明のある宿主細胞は非ヒトトランスジェニック動物を製造するためにもまた使用可能である。例えば、一態様において、本発明の宿主細胞は、Ｔ−ｂｅｔコーディング配列が導入されている受精卵母細胞もしくは胚幹細胞である。その後、こうした宿主細胞を使用して、外因性のＴ−ｂｅｔ配列がそれらのゲノム中に導入されている非ヒトトランスジェニック動物、もしくは内因性のＴ−ｂｅｔ配列が変えられている相同的組換え動物を創製し得る。こうした動物はＴ−ｂｅｔの機能および／もしくは活性を研究するためならびにＴ−ｂｅｔ活性の調節物質を同定かつ／もしくは評価するために有用である。従って、本発明の別の局面はＴ−ｂｅｔタンパク質もしくはＴ−ｂｅｔタンパク質の一部分をコードするトランスジーンを運搬する細胞を含有する非ヒトトランスジェニック動物に関する。本発明のトランスジェニック動物の一下位態様（ｓｕｂｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）において、トランスジーンは内因性のＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする内因性遺伝子を変える（例えば、内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に混乱もしくは「ノックアウト」されている、または内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列が突然変異されている、または内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子の転写制御領域が変えられている相同的組換え動物）。
本発明のトランスジェニック動物は、Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸を例えば微小注入法により受精卵母細胞の雄性前核中に導入すること、および該卵母細胞を偽妊娠の雌性育成動物中で発生させることにより創製し得る。配列番号１もしくは３のＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列をトランスジーンとして非ヒト動物のゲノム中に導入し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、該トランスジーンの発現の効率を増大させるために該トランスジーン中に包含し得る。組織特異的調節配列（１種もしくは複数）をＴ−ｂｅｔトランスジーンに操作可能に連結してＴ−ｂｅｔタンパク質の発現を特定の細胞に向かわせることが可能である。胚操作および微小注入を介するトランスジェニック動物、とりわけマウスのような動物の生成方法は当該技術分野で慣習的になっており、そして例えば、双方ともＬｅｄｅｒらによる米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号明細書、Ｗａｇｎｅｒらによる米国特許第４，８７３，１９１号明細書、ならびにＨｏｇａｎ，Ｂ．、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、（コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８６）に記述される。類似の方法を他のトランスジェニック動物の製造で使用する。トランスジェニック創始体動物はそのゲノム中のＴ−ｂｅｔトランスジーンの存在および／または該動物の組織もしくは細胞中でのＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの発現に基づき同定し得る。その後、トランスジェニック創始体動物を使用してトランスジーンを運搬する付加的な動物を繁殖させ得る。さらに、Ｔ−ｂｅｔをコードするトランスジーンを運搬するトランスジェニック動物を、他のトランスジーンを運搬する他のトランスジェニック動物とさらに交配させ得る。
相同的組換え動物を創製するために、欠失、付加もしくは置換が導入されておりそれにより内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子を変える、例えば機能的に混乱させる、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを調製する。一態様において、相同的組換えに際して内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊される（すなわちもはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターともまた称される）ような相同的組換えベクターを設計する。あるいは、相同的組換えに際して内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が該Ｔ−ｂｅｔ遺伝子で取り替えたようなベクターを設計し得る。相同的組換えベクターにおいて、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の変えられた部分は、その５’および３’端でＴ−ｂｅｔ遺伝子の付加的核酸により隣接され、該ベクターにより運搬される外因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と胚幹細胞中の内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子との間で相同的組換えを起こさせる。付加的な隣接するＴ−ｂｅｔ核酸は内因性遺伝子との成功裏の相同的組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５’および３’双方の端で）がベクター中に包含される（例えば、相同的組換えベクターの記述についてＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．とＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照されたい）。ベクターを（例えば電気穿孔法により）胚幹細胞系に導入し、そして導入されたＴ−ｂｅｔ遺伝子が内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と相同的に組換わった細胞を選択する（例えばＬｉ，Ｅ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照されたい）。その後、選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成させる（例えば、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、オックスフォード、１９８７）中、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．ｐｐ．１１３−１５２を参照されたい）。その後、キメラ胚を適する偽妊娠雌性育成動物に埋植しかつ胚を分娩までもたらし得る。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡをもつ子孫を使用して、該動物の全細胞が該トランスジーンの生殖系列伝達により相同的に組換えられたＤＮＡを含有する動物を繁殖し得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：８２３−８２９ならびにＬｅ ＭｏｕｅｌｌｅｃらによるＰＣＴ国際公開第ＷＯ ９０／１１３５４号；Ｓｍｉｔｈｉｅｓらによる同第ＷＯ ９１／０１１４０号；Ｚｉｊｌｓｔｒａらによる同第ＷＯ ９２／０９６８号；およびＢｅｒｎｓらによる同第ＷＯ ９３／０４１６９号明細書にさらに記述される。
前述に加え、当業者は相同的組換えのための当該技術分野で既知の他のアプローチを本発明に適用し得ることを認識するであろう。酵素支援型の部位特異的組込み系が当該技術分野で既知であり、そして第二の標的ＤＮＡ分子中の予め決められた位置にＤＮＡ分子を組込むのに適用可能である。こうした酵素支援型の組込み系の例はＣｒｅリコンビナーゼ−ｌｏｘ標的系（例えばＢａｕｂｏｎｉｓ，Ｗ．とＳａｕｅｒ，Ｂ．（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２０２５−２０２９；およびＦｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．とＳａｕｅｒ，Ｂ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７９０５−７９０９に記述されるところの）ならびにＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例えばＤａｎｇ，Ｄ．Ｔ．とＰｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．（１９９２）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１３：３６７−３７５：およびＦｉｅｒｉｎｇ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８４６９−８４７３に記述されるところの）を包含する。ＰＣＴ公開第ＷＯ ９４／２９４４２号明細書およびＰＣＴ公開第ＷＯ ９６／０１３１３号明細書に記述されるようなテトラサイクリン調節型の誘導可能な相同的組換え系もまた使用し得る。
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔが例えばＣＤ４エンハンサーを使用して全Ｔ細胞中で発現されるトランスジェニック動物を作成し得る（Ｚｈｅｎｇ，Ｗ−Ｐ．とＦｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．１９９７．Ｃｅｌｌ ８９、５８７）。最近の研究はＣＤ２エンハンサーもまた使用し得ることを示唆している。事実、それはＴ細胞中での高レベル発現の達成においてより強力であり、発現は変化されずかつトランスジーン発現はコピー数依存性である（Ｚｈｕｍａｂｅｋｏｖ，Ｔ．ら １９９５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８５、１３３；Ｓｈａｒｐ，Ｌ．Ｌ．ら １９９７．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７、６０９）。Ｔ−ｂｅｔ ＲＮＡの高レベル発現を伴うマウス（トランスジーンに駆動されるＴ−ｂｅｔ ＲＮＡを内因性のＴ−ｂｅｔと識別するためのプローブとしてヒト成長ホルモンイントロンを使用する）は、十分な数の創始体をスクリーニングすることにより同定可能である。
別のアプローチにおいて、ドミナントリプレッサー（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）トランスジェニックを創製し得る。例えば、ドミナントリプレッサーのＴ−ｂｅｔは近位ｌｃｋエンハンサーを使用することにより作成することができ（Ａｌｂｅｒｏｌａ−Ｉｌａ，Ｊ．ら １９９６ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４、９）、Ｔ−ｂｅｔおよびｅｎｇｒａｉｌｅｄの融合を駆動することを作成し得る（Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．、１９９６．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０、２７３２；Ｌｉ，Ｊ．、Ｔｈｕｒｍ，Ｈ．ら １９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０８８５）。この構築物は多量体化したＴ−ｂｅｔレポーターのＴ−ｂｅｔトランス活性化を特異的に抑制し、かつ、ＮＦＡＴ依存性のレポーターのトランス活性化に影響を及ぼさない。
あるいは、無発現変異をＥＳ細胞中での標的を定められた突然変異誘発により生成し得る（Ｒａｎｇｅｒ，Ａ．Ｍ．ら １９９８．Ｎａｔｕｒｅ ３９２、１８６；Ｈｏｄｇｅ，Ｍ．Ｒ．ら １９９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：１．、１４４；Ｇｒｕｓｂｙ，Ｍ．Ｊ．ら １９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３、１４１７；Ｒｅｉｍｏｌｄ，Ａ．Ｍ．ら １９９６．Ｎａｔｕｒｅ ３７９：２６２；Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．、１９９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ：３１３；Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．ら １９９６．Ｎａｔｕｒｅ ３８２、１７４；Ｓｍｉｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．ら １９９７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５、９７７）。例えば当該技術分野で既知である技術を使用して、ゲノムＴ−ｂｅｔクローンをゲノムライブラリーから単離し、イントロン−エキソンの構成を描き、そして第一のエキソンおよび上流のプロモーター配列の４５０ｂｐが欠失されているはずであるｃｒｅ−ｌｏｘベクター（下の論考を参照されたい）中のターゲッティング構築物を創製し得る。本構築物をＥＳ細胞系中に電気穿孔しそしてサザンブロット分析により二重化合物耐性（例えばネオマイシン、ガンシクロビル）クローンを同定し得る。その後、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子座に相同的組換え事象をもつクローンを同定しかつ第３．５日のＢＡＬＢ／ｃ妊娠マウスから得られた胚盤胞に注入し得る。その後、キメラマウスが生じられることができ、そして野性型ＢＡＬＢ／ｃマウスと交尾させて混乱されたＴ−ｂｅｔ遺伝子の生殖系列伝達を生成し得る。
別の態様において、ＲＡＧ−２欠損胚盤胞中への埋植（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら １９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、４５２８）もしくはｃｒｅ−ｌｏｘ誘導可能な欠失アプローチを使用して、免疫系中でのみＴ−ｂｅｔを欠いているマウスを発生させ得る。例えば、ターゲッティング構築物をｃｒｅ−ｌｏｘベクター中で作成し得る。胚盤胞補完系を使用してＮＦＡＴｃ（胚の一致死的表現型）が研究されている（Ｒａｎｇｅｒ，Ａ．Ｍ．ら １９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：１２５）。このアプローチはＥＳ細胞中の双方の染色体上のＴ−ｂｅｔ遺伝子を混乱させることを必要とし、それは例えば記述された（Ｃｈｅｎ，Ｊ．１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０；４５２８）とおり、突然変異体ネオマイシン遺伝子を使用することおよびＥＳ培養物中のＧ４１８濃度を上昇させることにより、もしくはｎｅｏ遺伝子にｃｒｅ−ｌｏｘ部位を隣接させることにより達成し得る。第二の対立遺伝子を混乱させるために、ＥＳクローンをｃｒｅリコンビナーゼでトランスフェクトすることによりネオマイシン遺伝子を欠失させ得、そしてその後該ＥＳクローンを同一のターゲッティング構築物で再トランスフェクトして双方の対立遺伝子上にＴ−ｂｅｔ欠失を伴うクローンを選択し得る。ｃｒｅリコンビナーゼでの第三のトランスフェクションが所望の二重欠損ＥＳ細胞を生じる。その後、こうした二重にターゲッティングしたＥＳ細胞をＲＡＧ２胚盤胞に埋植し、そしてかように生成させたキメラマウスのリンパ系器官は移入されたＥＳ細胞により完全にコロニー形成されることができる。これは、Ｔ−ｂｅｔの非存在が致死性を引き起こすかもしれない他の器官系に影響を及ぼすことなくリンパ系の細胞へのＴ−ｂｅｔの非存在の影響の評価を可能にする。
ｃｒｅ−ｌｏｘ系を使用する条件消失（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ａｂｌａｔｉｏｎ）のアプローチもまた使用可能である。簡潔には、欠失されるべきエキソンに隣接するイントロン領域中にｌｏｘ組換え配列が置かれているターゲッティング構築物を生成させる。その後、この構築物をＥＳ細胞にトランスフェクトしそして突然変異体マウスを上のとおり生成させる。生じる突然変異体マウスはその後、誘導可能なプロモーターにより駆動されるｃｒｅリコンビナーゼに関してトランスジェニックのマウスと交尾させる。ｃｒｅが発現される場合にそれはＴ−ｂｅｔ遺伝子中の導入されたｌｏｘ部位間の組換えを誘導し、従って遺伝子機能を効果的に破壊する。このアプローチの重要な特徴は、ｃｒｅリコンビナーゼを活性化することにより成体動物中で随意に遺伝子破壊を誘導し得ることである。
組織特異的プロモーターは免疫系の外の器官の異常を回避するのに使用し得る。ｃｒｅを発現するトランスジーンは誘導可能なプロモーターにより駆動されうる。いくつかの誘導可能な系が現在ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え戦略で使用されており、最も普遍的なものはテトラサイクリンおよびエクダイソン系である。Ｔ−ｂｅｔヌルマウスで胚の致死性が存在する場合には組織特異的な誘導可能なプロモーターが使用可能である。
代替の一アプローチは、調節されたＴ−ｂｅｔ遺伝子をもつトランスジェニックマウスを生成させ（例えばテトラサイクリンｏｆｆプロモーターを使用して；例えばＳｔ−Ｏｎｇｅら １９９６．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２４、３８７５−３８７７）そしてその後このトランスジェニックをＴ−ｂｅｔ欠損マウスと交配させることである。このアプローチは正常なＴ−ｂｅｔ機能をもつマウスの創製を可能にし；テトラサイクリンを成体動物に投与して末梢Ｔ細胞でのＴ−ｂｅｔ機能の混乱を誘導し得、そしてその後Ｔ−ｂｅｔ欠損の影響を長期間にわたって検査し得る。化合物（テトラサイクリン）の供給およびその後の除去の反復周期が、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子のスイッチを随意に入れるおよび切ることを可能にする。
ＩＩＩ．単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質および抗Ｔ−ｂｅｔ抗体
本発明の別の局面は単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質に関する。好ましくは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は配列番号１もしくは３によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様において、該タンパク質は配列番号２もしくは４のアミノ酸配列を含んでなる。他の態様において、該タンパク質は配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列と最低６０％のアミノ酸同一性、より好ましくは７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは８０％、およびなおより好ましくは９０％もしくは９５％のアミノ酸同一性を有する。
他の態様において、本発明はＴ−ｂｅｔタンパク質の単離された部分を提供する。例えば、本発明はＴボックスドメインを包含するＴ−ｂｅｔのアミノ末端部分をさらに包含する。多様な態様において、このアミノ末端部分はヒトＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸１３８〜３２７もしくはマウスＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸１３７〜３２６を包含する。本発明により提供されるＴ−ｂｅｔの別の単離された部分はチロシンリン酸化部位を包含する一部分である。この部分はＴ−ｂｅｔの最低約２０、最低約５０、最低約１００もしくは最低約２００アミノ酸を含んでなり、また、ヒトＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸Ｔｙｒ７６、Ｔｙｒ１１９および／もしくはＴｙｒ５３１またはマウスＴ−ｂｅｔのアミノ酸Ｔｙｒ５２５を包含する。本明細書で提供されるＴ−ｂｅｔのなお別の単離された部分は、ヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸４９８〜５０１もしくはマウスＴ−ｂｅｔの４９３〜４９６に示される核局在化配列を包含する一部分である。
本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は好ましくは組換えＤＮＡ技術により製造される。例えば、該タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクター（上述されるところの）にクローン化し、該発現ベクターを宿主細胞（上述されるところの）に導入しそしてＴ−ｂｅｔタンパク質を宿主細胞中で発現させる。その後、標準的タンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによりＴ−ｂｅｔタンパク質を細胞から単離し得る。組換え発現に代わり、標準的ペプチド合成技術を使用してＴ−ｂｅｔポリペプチドを化学的に合成し得る。さらに、天然のＴ−ｂｅｔタンパク質は例えば抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を使用する免疫沈降により細胞（例えばＴ細胞）から単離し得る。
本発明はＴ−ｂｅｔアゴニスト（模倣物）もしくはＴ−ｂｅｔアンタゴニストのいずれかとして機能するＴ−ｂｅｔタンパク質の変異体にもまた関する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の変異体はＴ−ｂｅｔタンパク質の突然変異誘発、例えば別個の点突然変異もしくは短縮により生成させ得る。従って、制限された機能の変異体での処置により特定の生物学的影響を導き出し得る。一態様において、天然に生じる形態の該タンパク質の生物学的活性の１サブセットを有する変異体での被験体の処置は、天然に生じる形態のＴ−ｂｅｔタンパク質での処置に関して被験体中でより少ない副作用を有する。一態様において、本発明は、酸化、還元もしくは当該技術分野で既知の他の誘導体化方法によりＴ−ｂｅｔの最低１個のアミノ酸残基を修飾することにより形成しうるＴ−ｂｅｔの誘導体に関する。
一態様において、Ｔ−ｂｅｔアゴニスト（模倣物）もしくはＴ−ｂｅｔアンタゴニストのいずれかとして機能するＴ−ｂｅｔタンパク質の変異体は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の突然変異体、例えば短縮突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをＴ−ｂｅｔタンパク質アゴニストもしくはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定可能である。一態様において、Ｔ−ｂｅｔ変異体の多様なライブラリーは核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により生成され、そして多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。Ｔ−ｂｅｔ変異体の多様なライブラリーは例えば潜在的Ｔ−ｂｅｔ配列の縮重組を個々のポリペプチドとしてあるいはその中にＴ−ｂｅｔ配列の組を含有する一組のより大きい融合タンパク質（例えばファージディスプレイのために）として発現可能であるような遺伝子配列中に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することにより製造し得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的Ｔ−ｂｅｔ変異体のライブラリーを製造するのに使用可能である多様な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成装置で実施し得かつ合成遺伝子をその後に適切な発現ベクターに連結し得る。遺伝子の縮重組の使用は所望の組の潜在的Ｔ−ｂｅｔ配列をコードする配列の全部の一混合物での供給を見込む。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該技術分野で既知である（例えばＮａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．、１９８３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｄ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。
加えて、Ｔ−ｂｅｔタンパク質コーディング配列のフラグメントのライブラリーを使用して、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の変異体のスクリーニングおよびその後の選択のためにＴ−ｂｅｔフラグメントの多様な集団を生成させ得る。一態様において、ニッキングが１分子あたり約１回のみ起こる条件下でＴ−ｂｅｔコーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生させて多様なニックの生成物からセンス／アンチセンス対を包含し得る二本鎖ＤＮＡを形成させること、再形成された二重鎖からＳ１ヌクレアーゼでの処理により一本鎖部分を除去すること、および生じるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、コーディング配列のフラグメントのライブラリーを生成させ得る。この方法により、多様な大きさのＴ−ｂｅｔタンパク質のＮ末端、Ｃ末端および内的フラグメントをコードする発現ライブラリーを生じさせ得る。
点突然変異もしくは短縮により作成したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングためのいくつかの技術が当該技術分野で既知である。こうした技術はＴ−ｂｅｔタンパク質のコンビナトリアル突然変異誘発により生成させた遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適応可能である。大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高スループット分析に応じやすい最も広範に使用される技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローン化すること、ベクターの生じるライブラリーで適切な細胞で形質転換すること、および所望の活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を助長する条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを包含する。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を高める新たな技術、再帰アンサンブル突然変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、Ｔ−ｂｅｔ変異体を同定するためのスクリーニングアッセイとともに使用し得る（ＡｒｋｉｎとＹｏｕｒｖａｎ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら、１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
本発明はまたＴ−ｂｅｔ融合タンパク質も提供する。本明細書で使用されるところのＴ−ｂｅｔ「融合タンパク質」はＴ−ｂｅｔ以外のポリペプチドに効果的に連結されたＴ−ｂｅｔポリペプチドを含んでなる。「Ｔ−ｂｅｔポリペプチド」はＴ−ｂｅｔタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔタンパク質に独特であるそのペプチドフラグメントを指す一方、「Ｔ−ｂｅｔ以外のポリペプチド」は別のタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。融合タンパク質内で、「効果的に連結される」という用語はＴ−ｂｅｔポリペプチドおよび他のポリペプチドが相互に同じ読み枠で融合されることを示すことを意図している。他のポリペプチドはＴ−ｂｅｔポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に融合されてよい。例えば、一態様において、融合タンパク質はＴ−ｂｅｔ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されているＧＳＴ−Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質である。別の態様において、融合タンパク質は、Ｔ−ｂｅｔ配列がインフルエンザヘマグルチニンエピトープ標識に同じ読み枠で融合されているようなｐＣＥＰ４−ＨＡベクター（Ｈｅｒｒｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：３０６７−３０８２）のようなベクター中にＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列が挿入されるＴ−ｂｅｔ−ＨＡ融合タンパク質である。こうした融合タンパク質は組換えＴ−ｂｅｔの精製を助長する可能性がある。
好ましくは、本発明のＴ−ｂｅｔ融合タンパク質は標準的組換えＤＮＡ技術により製造する。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、慣習的技術（例えば連結のための平滑端もしくはねじれ型の（ｓｔａｇｇｅｒ）端にされた末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切なように付着端を埋めること、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および酵素的連結を使用すること）に従って一緒に同じ読み枠で連結する。別の態様において、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成装置を包含する慣習的技術により合成し得る。あるいは、２種の連続した遺伝子フラグメント間で相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施することができ、それをその後アニーリングしかつ再増幅してキメラ遺伝子配列を生成させ得る（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ジョン ワイリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）：１９９２を参照されたい）。さらに、融合部分（例えばＧＳＴポリペプチドもしくはＨＡエピトープ標識）を既にコードしている多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸は、融合部分がＴ−ｂｅｔタンパク質に同じ読み枠で連結されているようなこうした発現ベクターにクローン化し得る。
単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質もしくはそのフラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造のための標準的技術を使用してＴ−ｂｅｔに特異的に結合する抗体を生成させるための免疫原として使用可能である。Ｔ−ｂｅｔタンパク質を使用して抗体を生成させ得る。例えば、ポリクローナル抗血清は、完全長の組換えの細菌で産生されたＴ−ｂｅｔを免疫原として使用してウサギで産生させ得る。この同一の免疫原を使用してマウスを免疫しかつ免疫したマウスから脾細胞を取り出すことによりｍＡｂを製造し得る。Ｔ−ｂｅｔに対する免疫応答を装備するマウスからの脾細胞を骨髄腫細胞例えばＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫に融合し得る。付属として付けられる実施例に記述されるとおり、本方法を使用してＴ−ｂｅｔに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作成した。一態様において、該抗体はＴ−ｂｅｔノックアウト動物のようなＴ−ｂｅｔを発現しない動物中で産生され得る。別の態様において、抗体は例えば戻し交雑することにより達成されるとおり、特定の遺伝的背景を有する非ヒト動物中で生成され得る。
あるいは、Ｔ−ｂｅｔの抗原性ペプチドフラグメントを免疫原として使用し得る。Ｔ−ｂｅｔの抗原性ペプチドフラグメントは配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列の最低８アミノ酸残基を典型的に含んでなり、かつ、該ペプチドに対し生じられた抗体がＴ−ｂｅｔと特異的免疫複合体を形成するようなＴ−ｂｅｔのエピトープを包含する。好ましくは、該抗原性ペプチドは最低１０アミノ酸残基、より好ましくは最低１５アミノ酸残基、なおより好ましくは最低２０アミノ酸残基、および最も好ましくは最低３０アミノ酸残基を含んでなる。抗原性ペプチドにより包含される好ましいエピトープは該タンパク質の表面（例えば親水性領域）に位置しかつＴ−ｂｅｔに独特であるＴ−ｂｅｔの領域である。一態様において、こうしたエピトープはマウスもしくはヒトのような１種からのＴ−ｂｅｔタンパク質に特異的であり得る（すなわち、種を横断して保存されないＴ−ｂｅｔの一領域にわたる抗原性ペプチドを免疫原として使用する；こうした保存されない残基は本明細書に提供されるもののような整列を使用して決定可能である）。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の標準的疎水性分析を実施して親水性領域を同定可能である。
Ｔ−ｂｅｔ免疫原は、典型的には、適する被験体（例えばウサギ、ヤギ、マウスもしくは他の哺乳動物）を該免疫原で免疫することにより抗体を調製するのに使用する。適切な免疫原性調製物は例えば組換え的に発現されたＴ−ｂｅｔタンパク質もしくは化学的に合成されたＴ−ｂｅｔペプチドを含有し得る。該調製物はフロイントの完全もしくは不完全アジュバントのようなアジュバントまたは類似の免疫賦活剤をさらに包含し得る。免疫原性Ｔ−ｂｅｔ調製物での適する被験体の免疫感作はポリクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体応答を誘導する。
従って、本発明の別の局面は抗Ｔ−ｂｅｔ抗体に関する。ポリクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は上述されたとおり適する被験体をＴ−ｂｅｔ免疫原で免疫することにより製造可能である。免疫された被験体中での抗Ｔ−ｂｅｔ抗体力価は、固定したＴ−ｂｅｔを使用する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いるような標準的技術により長期間にわたってモニターし得る。所望の場合は、Ｔ−ｂｅｔに対し向けられた抗体分子を哺乳動物から（例えば血液から）単離しかつＩｇＧ画分を得るためプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製し得る。免疫感作後の適切な時点で、例えば抗Ｔ−ｂｅｔ抗体力価が最高である場合に、抗体産生細胞を被験体から得かつＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）により元は記述されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）ＰＮＡＳ ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９−７５もまた参照されたい）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、アラン Ｒ．リス インク（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、ｐｐ．７７−９６）もしくはトリオーマ技術のような標準的技術によりモノクローナル抗体を製造するのに使用し得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマの製造技術は公知である（全般的に、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ、プレナム パブリッシング コーポレーション（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８０）中Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．、３：２３１−３６を参照されたい）。簡潔には、不死細胞系（典型的には骨髄腫）を上述されたところのＴ−ｂｅｔ免疫原で免疫した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）に融合させ、そして生じるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、Ｔ−ｂｅｔに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
リンパ球および不死化細胞系を融合するのに使用される多くの公知のプロトコルのいずれも、抗Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体を生成させる目的上応用し得る（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒら Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．、上記に引用される；Ｌｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、上記に引用される；Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、上記に引用されるを参照されたい）。さらに、当業者はこうした方法の多くの変法が存在し、それらもまた有用であるとみられることを認識するであろう。典型的には、不死細胞系（例えば骨髄腫細胞系）はリンパ球と同一の哺乳動物種由来である。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫したマウスからのリンパ球を不死化マウス細胞系と融合することにより作成し得る。好ましい不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に対し感受性であるマウス骨髄腫細胞系である。多数の骨髄腫細胞系のいずれか、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３もしくはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系統を標準的技術に従って融合パートナーとして使用してよい。これらの骨髄腫系統はアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、メリーランド州ロックビルから入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞はポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞に融合する。融合から生じるハイブリドーマ細胞をその後、融合されないおよび非生産的に融合された骨髄腫細胞を殺すＨＡＴ培地を使用して選択する（融合されない脾細胞は形質転換されていないためそれらは数日後に死亡する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＴ−ｂｅｔを結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
こうした方法を使用してＴ−ｂｅｔに対する数種の抗体が生成されている。完全長の組換えの細菌に産生されたＴ−ｂｅｔタンパク質に対してモノクローナルおよびポリクローナル双方の抗体が生成された。３Ｄ１０抗体はＩｇＧサブタイプのものであり、また、４Ｂ１０抗体はＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫へのマウス脾細胞の融合により製造しかつＩｇＧサブタイプのものである。３９Ｄ抗体はヒトおよびマウス双方のＴ−ｂｅｔを認識する。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造することに代わり、モノクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライブラリー）をＴ−ｂｅｔでスクリーニングしてそれによりＴ−ｂｅｔを結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することにより同定かつ単離可能である。ファージディスプレイライブラリーを生成かつスクリーニングするためのキットが商業的に入手可能である（例えばファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の組換えファージ抗体系（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ）、カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のサーブザップ［ＳｕｒｆＺＡＰ］ＴＭファージディスプレイキット（Ｐｈａｒｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ）、カタログ番号２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにおける使用にとりわけ応じやすい方法および試薬の例は、例えばＬａｄｎｅｒら 米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｋａｎｇら 国際公開第ＷＯ ９２／１８６１９号明細書；Ｄｏｗｅｒら 国際公開第ＷＯ ９１／１７２７１号明細書；Ｗｉｎｔｅｒら 国際公開第ＷＯ ９２／２０７９１号明細書；Ｍａｒｋｌａｎｄら 国際公開第ＷＯ ９２／１５６７９号明細書；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら 国際公開第ＷＯ ９３／０１２８８号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら 国際公開第ＷＯ ９２／０１０４７号明細書；Ｇａｒｒａｒｄら 国際公開第ＷＯ ９２／０９６９０号明細書；Ｌａｄｎｅｒら 国際公開第ＷＯ ９０／０２８０９号明細書；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４に見出し得る。
加えて、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して作成し得るヒトおよび非ヒト双方の部分を含んでなるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗Ｔ−ｂｅｔ抗体が本発明の範囲内にある。こうしたキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎら 国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号明細書；Ａｋｉｒａら 欧州特許出願第１８４，１８７号明細書；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．欧州特許出願第１７１，４９６号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら 欧州特許出願第１７３，４９４号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら ＰＣＴ出願第ＷＯ ８６／０１５３３号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙら 米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙら 欧州特許出願第１２５，０２３号明細書；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ 米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記述される方法を使用して製造可能である。
別の態様において、完全にヒトの抗体を当該技術分野で既知である技術を使用して作成し得る。例えば、特定の１抗原に対する完全にヒトの抗体は、抗原攻撃に応答してこうした抗体を産生するよう改変されているがしかしその内因性の遺伝子座が不能にされているトランスジェニック動物に該抗原を投与することにより製造し得る。抗体を作成するのに使用し得る例示的技術は米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号明細書に記述される。他の技術は当該技術分野で既知である。
抗Ｔ−ｂｅｔ抗体（例えばモノクローナル抗体）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーもしくは免疫沈降法のような標準的技術によりＴ−ｂｅｔを単離し得る。抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は細胞からの天然のＴ−ｂｅｔおよび宿主細胞中で発現された組換え的に産生されたＴ−ｂｅｔの精製を助長する可能性がある。さらに、抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を使用して（例えば細胞ライセートもしくは細胞上清中の）Ｔ−ｂｅｔタンパク質を検出し得る。検出可能な物質に抗体を結合（すなわち物理的に連結）することにより検出が助長されうる。従って、一態様において、本発明の抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を検出可能な物質で標識する。検出可能な物質の例は、多様な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質および放射活性物質を包含する。適する酵素の例はワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適する補欠分子団複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適する蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンを包含し；発光物質の一例はルミノールを包含し；そして適する放射活性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓもしくは３Ｈを包含する。
本発明のなお別の局面は：
（ａ）免疫原性のＴ−ｂｅｔタンパク質もしくはＴ−ｂｅｔタンパク質に独特のその免疫原性の部分で動物を免疫すること；および
（ｂ）該動物からＴ−ｂｅｔタンパク質に特異的に結合する抗体を単離すること
を含んでなる方法により得ることができる抗Ｔ−ｂｅｔ抗体に関する。
免疫感作および特異的抗Ｔ−ｂｅｔ抗体の回収方法は上にさらに記述されている。
なお別の局面において本発明はＴ−ｂｅｔイントラボディに関する。イントラボディは細胞の内側の標的、例えばＴ−ｂｅｔのような細胞内タンパク質に対し向けられた細胞内で発現される抗体構築物、通常は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である（Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ，Ｄ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５（１）：１８２−９１）。例えば、イントラボディ（例えばおよびｓｃＦｖ）はフレキシブルリンカーにより結合されかつ単一遺伝子から発現されたＨおよびＬ鎖の可変領域を含有し得る。ＨおよびＬ鎖の可変ドメインは、該ｓｃＦｖの特異性を決定する親抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）すなわち主抗原結合ドメインを含有する。ｓｃＦｖ遺伝子を細胞中に移入することができ、ここでｓｃＦｖタンパク質発現がその標的例えばＴ−ｂｅｔの特性を調節し得る。従って、一態様において、本発明は例えば細胞がこうしたイントラボディを発現するよう改変されるｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏのアプローチにおいて細胞中でＴ−ｂｅｔ活性を予防するためのこうしたＴ−ｂｅｔイントラボディの使用方法を提供する。特定の一態様において、本発明のＴ−ｂｅｔイントラボディを使用してＴ−ｂｅｔ活性を直接阻害し得る。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔイントラボディを使用してＴ−ｂｅｔおよびＴ−ｂｅｔが相互作用するタンパク質の相互作用を阻害し得る。従って、本発明のＴ−ｂｅｔイントラボディはＴ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路の調節において有用である。
Ｔ−ｂｅｔイントラボディは当該技術分野で既知の技術を使用して製造可能である。例えば、ファージディスプレイ技術を使用してｓｃＦｖをライブラリーから単離し得る（Ｌｏｗｍａｎ，ＨＢら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（１０）：８３２−８）。特定の抗原に結合するｓｃＦｖを選択するためにｓｃＦｖを外被タンパク質、典型的には繊維状Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ（ｇ３ｐ）に融合する。固定された抗原を結合するファージ上のｓｃＦｖが結合、溶出および増幅の連続周期の間に濃縮される。別の例において、リボソームディスプレイを使用してＴ−ｂｅｔイントラボディを製造し得る（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４（１）：９３７−４４）。リボソームディスプレイはペプチドを遺伝情報（ｍＲＮＡ）に直接連結するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。転写翻訳系を使用してｓｃＦｖ ＣＤＮＡライブラリーをｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させる。翻訳されたＳｃＦｖを、コーディングｍＲＮＡに連結されたリボソームに閉じこめさせる。その後、固定された抗原にｓｃＦｖを結合させそして非特異的リボソーム複合体を徹底的な洗浄により除去する。残存する複合体を溶出しかつＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写しかつその後ＰＣＲにより再増幅する。なお別の例において、タンパク質フラグメント補完アッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）（ＰＣＡ）を使用して本発明のＴ−ｂｅｔイントラボディを製造し得る（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，ＪＮら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５（１２）：１４１−６．）これは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の突然変異体ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のマウスタンパク質（ｍＤＨＦＲ）による補完に基づく細胞選択処置である。マウスＤＨＦＲを２部分に切断し、これらを潜在的に相互作用性のペプチドとの融合タンパク質として発現させる。該融合タンパク質の相互作用がｍＤＨＦＲの酵素活性、および従って細菌増殖を復帰させる。抗体および抗原の特定の１相互作用のみがｓｃＦｖの選択に応じやすい系を作成するＤＨＦＲの機能補完を可能にする（Ｍｏｓｓｎｅｒ，Ｅ．ら（２００１）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８：１１５−２２）。
ＩＶ．製薬学的組成物
本発明のＴ−ｂｅｔ調節物質（例えば、Ｔ−ｂｅｔ核酸分子、タンパク質、抗体、または本明細書に記述されるもしくはＴ−ｂｅｔ活性の調節物質として同定される化合物を包含するＴ−ｂｅｔ阻害剤もしくは賦活剤）は投与に適する製薬学的組成物中に組込むことができる。こうした組成物は典型的に調節剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる。本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は製薬学的投与と適合性のいかなるおよび全部の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含することを意図している。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および作用物質の使用は当該技術分野で公知である。いずれかの慣習的媒体もしくは作用物質が有効成分と不適合性である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が企図されている。補助的有効成分もまた組成物中に組込み可能である。
本発明の製薬学的組成物はその意図される投与経路と適合性であるように処方される。例えば、非経口、皮内もしくは皮下適用に使用される溶液もしくは懸濁剤は、以下の成分、すなわち注射用水、生理的食塩水溶液、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒のような滅菌の希釈剤；ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩のような緩衝剤および塩化ナトリウムもしくは右旋糖のような張性の調節のための作用物質を包含し得る。ｐＨは塩酸もしくは水酸化ナトリウムのような酸もしくは塩基で調節し得る。非経口製剤はガラスもしくはプラスチックから作成されるアンプル、使い捨てシリンジもしくは複数用量バイアル中に封入し得る。
注入可能な使用に適する製薬学的組成物は滅菌の水性溶液（水に可溶性の場合）もしくは分散剤、および滅菌の注入可能な溶液もしくは分散剤の即座の調製のための無菌粉末を包含する。静脈内投与に適する担体は生理学的生理的食塩水、静菌水、クレモフォア ＥＬ［Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ］ＴＭ（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー）もしくはリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を包含する。全部の場合で、組成物は滅菌でなくてはならず、また、容易な注入可能性が存在する程度まで流動性であるべきである。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなくてはならず、また、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対し保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適する混合物を含有する溶媒もしくは分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用、分散剤の場合は必要とされる粒子径の維持および界面活性剤の使用により維持し得る。微生物の作用の予防は多様な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成し得る。多くの場合に等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に包含することが好ましいであろう。注入可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に包含することによりもたらすことができる。
滅菌の注入可能な溶液は、必要とされるところの上で挙げられた成分の１種もしくは組合せを含む適切な溶媒中に必要とされる量の有効成分を組込むこと、次いで濾過滅菌により製造可能である。一般に、分散剤は上で挙げられたものからの基礎分散媒および必要とされる他の成分を含有する滅菌ベヒクル中に有効成分を組込むことにより製造する。滅菌の注入可能な溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥、ならびにその以前に滅菌濾過された溶液から有効成分およびいずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる凍結乾燥である。
経口組成物は一般に不活性希釈剤もしくは可食担体を包含する。それらはゼラチンカプセル中に封入し得るかもしくは錠剤に圧縮し得る。経口の治療的投与の目的上、有効成分を賦形剤とともに組込みかつ錠剤、トローチ剤もしくはカプセル剤の形態で使用し得る。経口組成物は含嗽剤としての使用のため液体担体を使用してもまた製造可能であり、ここでは液体担体中の化合物を口腔に適用しそして音をたてかつ喀出もしくは嚥下する。製薬学的に適合性の結合剤および／もしくは補助物質を組成物の一部として包含し得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分もしくは類似の性質の化合物、すなわち微晶質セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）もしくはトウモロコシデンプンのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）のような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；ショ糖もしくはサッカリンのような甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料のような香味料のいずれかを含有し得る。
一態様において、有効成分は埋植物および微小被包化送達系を包含する制御放出製剤のような身体からの迅速な排泄に対し該化合物を保護することができる担体とともに調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生物分解可能な生物適合性のポリマーが使用可能である。こうした製剤の製造方法は当業者に明らかであろう。該物質はまたアルザ コーポレーション（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバ ファーマシューティカルズ インク（Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）から商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞に標的を定めたリポソームを包含する）もまた製薬学的に許容できる担体として使用可能である。これらは例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記述されるところの当業者に既知の方法に従って製造してよい。
一態様において、Ｔ−ｂｅｔ調節剤を含んでなる組成物はＴ−ｂｅｔにより影響を及ぼされる細胞応答の調節において有用である第二の作用物質を含み得る。例えば、一態様において、Ｔ−ｂｅｔ活性をダウンレギュレートする作用物質を、細胞の免疫応答をダウンレギュレートする第二の作用物質とともに投与してよい。こうした作用物質はＴ−ｂｅｔ調節剤と同一の製薬学的組成物の一部として投与してよいか、もしくは別個の投与のために処方してよい。
Ｖ．本発明の方法
診断アッセイ／予後アッセイ
本発明の別の局面は本発明の多様なＴ−ｂｅｔ組成物の使用方法に関する。例えば、本発明は生物学的サンプル中のＴ−ｂｅｔ活性の存在の検出方法を提供する。該方法はＴ−ｂｅｔ活性の存在が生物学的サンプル中で検出されるようなＴ−ｂｅｔタンパク質もしくはＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡのようなＴ−ｂｅｔ活性を検出することが可能な作用物質と生物学的サンプルを接触させることを必要とする。
Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの検出のための好ましい作用物質はＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能な標識核酸プローブである。該核酸プローブは例えば長さが最低約５００、６００、８００、９００、１０００、１２００、１４００もしくは１６００ヌクレオチドのかつストリンジェントな条件下でＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのような、配列番号１もしくは３のＴ−ｂｅｔ ＤＮＡであり得る。
Ｔ−ｂｅｔタンパク質の検出のための好ましい作用物質はＴ−ｂｅｔタンパク質に結合することが可能な標識抗体である。抗体はポリクローナルもしくはより好ましくはモノクローナルであり得る。無傷の抗体またはそのフラグメント（例えばＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２）を使用し得る。プローブもしくは抗体に関する「標識」という用語は、検出可能な物質をプローブもしくは抗体に結合（すなわち物理的に連結）することによるプローブもしくは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブもしくは抗体の間接標識を包含することを意図している。間接標識の例は蛍光標識二次抗体を使用する一次抗体の検出、およびそれが蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を包含する。「生物学的サンプル」という用語は組織、細胞および生物学的液体を包含することを意図している。例えばＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの検出のための技術はノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを包含する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の検出のための技術は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を包含する。
こうしたアッセイは発生異常を特徴とする症候群の検出において有用である。例えばヒトＴボックス遺伝子ＴＢＸ５およびＴＢＸ３（マウスＴｂｘ５およびＴｂｘ３のオルソログ）中の突然変異はそれぞれ常染色体優性遺伝疾患ホールト−オーラム症候群および尺骨乳腺症候群の原因である（Ｂａｍｓｈａｄ，Ｍ．ら １９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：３１１；Ｂａｓｓｏｎ，Ｃ．Ｔ．ら １９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：３０；Ｌｉ，Ｑ．Ｙ．ら １９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：２１；Ｓｐｒａｎｇｅｒ，Ｓ．ら １９９７．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３：９７８）。これらの症候群は発生異常を特徴とし、そしてそれぞれＴｂｘ５およびＴｂｘ３の発現のパターンにより予測されていたかもしれない。ホールト−オーラム症候群は心および上肢を冒す一方、尺骨乳腺症候群は四肢、アポクリン腺、歯および生殖器の発生に影響を及ぼす。双方の症候群は発生異常を特徴とし、そしてそれぞれＴｂｘ５およびＴｂｘ３の発現のパターンにより予測されていたかもしれない。これらの患者における突然変異はＴボックス遺伝子中の一対立遺伝子のみを関わらせ、従ってＴｂｘ３およびＴｂｘ５のハプロ不全（ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）がこれら２疾患を引き起こすと仮定されている。最近、発生中のニワトリ胚へのＴｂｘ４およびＴｂｘ５の供給が肢芽のアイデンティティー（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を制御することが示された（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｅｓｔｅｂａｎら、１９９９；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９９９）。これらの発見は脊椎動物の発生におけるこのファミリーの決定的な重要性を強調する。
加えて、多くの種におけるＴ遺伝子相同物の存在は、中胚葉発生に関与する今のところは未知の一組の標的遺伝子を調節する転写因子としてのその機能に関する強力な証拠を提供する。Ｔボックスファミリーの最近の突出は、ヒト疾患においてＴボックス突然変異により最も劇的に例示される多彩な発生過程におけるその明らかな重要性から生じる。胸腺細胞幹細胞からの成熟Ｔ細胞およびナイーブな前駆細胞からの分化したＴｈ細胞の生成もまた厳格に調節される発生過程としてみることができる。Ｔ−ｂｅｔがＴｈ１系譜の発生を司るというこの発見は、リンパ系におけるこの最新のＴボックスファミリーメンバーの重要な役割を示している。
スクリーニング法
本発明はさらに、Ｔ−ｂｅｔの発現（細胞中のＴ−ｂｅｔの量）および／もしくはＴ−ｂｅｔポリペプチドの活性（細胞に対する細胞外の影響の結果としてもたらされる細胞中でシグナルを伝播させるＴ−ｂｅｔの能力を調節する化合物の同定方法を提供する。例えば、本発明は
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを含んでなる指標組成物を提供すること；
該指標組成物を試験化合物と接触させること；および
指標組成物中のＴ−ｂｅｔポリペプチドの活性に対する試験化合物の影響を測定してそれによりＴ−ｂｅｔポリペプチドの活性を調節する化合物を同定すること
を含んでなる、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方法を提供する。
Ｔ−ｂｅｔ分子の活性は多様な方法で検出可能である。Ｔ−ｂｅｔは転写因子であり、そして従ってＤＮＡに結合しかつ遺伝子、例えば実施例で教示されるところのサイトカイン遺伝子の発現を調節する能力を有する。従って、本発明のスクリーニング方法の特定の態様は、ＤＮＡ；（例えばＩＬ−２もしくはＩＦＮ−γプロモーター）に結合する；遺伝子発現を調節する（例えば、例えばＩＬ−２遺伝子を抑制する、ＩＦＮ−γ遺伝子をトランス活性化することによりＴｈ１関連サイトカイン遺伝子の発現を調節する、または例えばＩＬ−４遺伝子もしくはＩＬ−１０遺伝子を抑制することによりＴｈ２関連サイトカイン遺伝子の発現を調節する、または他の遺伝子、（例えばＴＧＦ−βもしくはＴＬＲ６のようなＴｏｌｌ様受容体遺伝子）の発現を調節する）Ｔ−ｂｅｔポリペプチドの能力を活用する。他の態様において、他の細胞応答を調節するＴ−ｂｅｔの能力は例えば本明細書に示されるとおり測定することができ、Ｔ−ｂｅｔはとりわけ：免疫グロブリンクラススイッチング；ＣＤ８エフェクター／メモリー細胞、末梢寛容（例えば存在するＴｒ細胞の数を調節することにより）の生成を調節し；Ｔｈ１サイトカイン分泌プロフィルに対しナイーブなＣＤ４＋細胞を駆動し、および／もしくは極性化Ｔｈ２細胞をＴｈ１経路に向け直す。従って、細胞に対するＴ−ｂｅｔのこれらもしくは他のこうした影響のいずれもＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する化合物のスクリーニングにおける読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）として使用可能である。
本発明のスクリーニングアッセイの好ましい一態様において、指標組成物は指標細胞を含んでなり、前記指標細胞は：（ｉ）Ｔ−ｂｅｔポリペプチドおよび（ｉｉ）Ｔ−ｂｅｔポリペプチドに応答性のレポーター遺伝子を含んでなる。好ましくは、指標細胞は：
ｉ）Ｔ−ｂｅｔをコードする組換え発現ベクター；および
ｉｉ）Ｔｈ１関連サイトカイン遺伝子に効果的に連結されたレポーター遺伝子の制御配列を含んでなるベクター
を含有し；また、前記方法は：
ａ）指標細胞を試験化合物と接触させること；
ｂ）試験化合物の存在下での指標細胞中でのレポーター遺伝子の発現のレベルを測定すること；および
ｃ）試験化合物の存在下での指標細胞中でのレポーター遺伝子の発現のレベルを、試験化合物の非存在下での指標細胞中でのレポーター遺伝子の発現のレベルと比較してそれによりＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する化合物を同定すること
を含んでなる。
別の好ましい態様において、指標組成物は：（ｉ）Ｔ−ｂｅｔポリペプチドおよび（ｉｉ）Ｔ−ｂｅｔが結合するＤＮＡ分子の調製物を含んでなり、かつ、
前記方法は：
ａ）指標組成物を試験化合物と接触させること；
ｂ）試験化合物の存在下でのＴ−ｂｅｔポリペプチドおよびＤＮＡ分子の相互作用の程度を測定すること；ならびに
ｃ）試験化合物の存在下でのＴ−ｂｅｔおよびＤＮＡ分子の相互作用の程度を、試験化合物の非存在下でのＴ−ｂｅｔポリペプチドおよびＤＮＡ分子の相互作用の程度と比較してそれによりＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節する化合物を同定すること
を含んでなる。
好ましくは、Ｔ−ｂｅｔが結合するＤＮＡ分子はＴボックス結合配列を含んでなる。こうした配列は当該技術分野で既知であり、例えば（Ｓｚａｂｏら ２０００．Ｃｅｌｌ １００：６５５−６６９）を参照されたい。
別の好ましい態様において、該方法はＴ−ｂｅｔと相互作用するポリペプチドを同定する。本態様において、
指標組成物は指標細胞であり、この指標細胞は：
ｉ）転写制御配列に操作可能に連結されたレポーター遺伝子；および
ｉｉ）第一の融合タンパク質をコードする第一のキメラ遺伝子（前記第一の融合タンパク質はＴ−ｂｅｔを包含する）
を含んでなり；
試験化合物は第二のキメラ遺伝子のライブラリーを含んでなり、このライブラリーは第二の融合タンパク質をコードし；
レポーター遺伝子の発現は第一の融合タンパク質、第二の融合タンパク質および転写制御配列の間の相互作用に対し感受性であり；ならびに
指標組成物中のＴ−ｂｅｔに対する試験化合物の影響を、指標細胞中でのレポーター遺伝子の発現のレベルを測定することにより測定してそれによりＴ−ｂｅｔと相互作用するポリペプチドを含んでなる試験化合物を同定する。
好ましい一態様において、第二のキメラ遺伝子のライブラリーはＴｈ２細胞からのｃＤＮＡライブラリーから調製する。
本発明のスクリーニングアッセイの好ましい一態様において、試験化合物が一旦Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節すると同定されれば、その後、Ｔ−ｂｅｔにより調節される細胞応答に対する試験化合物の影響を試験する。従って、本発明のスクリーニング方法は、免疫応答に対する化合物の影響を測定してそれによりこうした細胞応答、例えばＴ細胞もしくはＢ細胞応答を調節する化合物を同定することをさらに含み得る。一態様において、免疫応答に対する化合物の影響は、インターフェロン−γ遺伝子のようなＴｈ１関連サイトカイン遺伝子の発現に対する化合物の影響を測定することにより測定する。本明細書で使用されるところの「Ｔｈ１関連サイトカイン」という用語は、Ｔｈ２細胞によるよりはむしろＴｈ１細胞により優先的にもしくは独占的に産生されるサイトカインを指すことを意図している。Ｔｈ１関連サイトカインの例はＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦおよびリンホトキシン（ＬＴ）を包含する。別の態様において、免疫応答に対する目的の化合物の影響はＴヘルパー１型（Ｔｈ１）もしくはＴヘルパー２型（Ｔｈ２）細胞の発生に対する化合物の影響を測定することにより測定する。
一態様において、本発明は調節物質、すなわちＴ−ｂｅｔポリペプチドに結合する；Ｔ−ｂｅｔ発現；Ｔ−ｂｅｔプロセシング；Ｔ−ｂｅｔ翻訳後修飾（例えばグリコシル化、ユビキチン化もしくはリン酸化）；またはＴ−ｂｅｔ活性に対する賦活もしくは阻害効果を有する；あるいはＴ−ｂｅｔの標的分子の発現、プロセシングもしくは活性に対する賦活もしくは阻害効果を有する候補もしくは試験化合物もしくは作用物質（例えば酵素、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、リボザイムもしくはＴ−ｂｅｔアンチセンス分子）の同定方法を提供する。
指標組成物はＴ−ｂｅｔポリペプチドを発現する細胞、例えば天然に発現する細胞、もしくはより好ましくは該ポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞中に導入することにより該ポリペプチドを発現するよう工作されている細胞であることができる。あるいは、指標組成物はポリペプチドを包含する細胞を含まない組成物（例えばＴ−ｂｅｔ発現細胞からの細胞抽出物または天然のもしくは組換えいずれかの精製されたＴ−ｂｅｔポリペプチドを包含する組成物）であることができる。
本明細書に記述されるアッセイを使用して同定される化合物は、異常なＴ−ｂｅｔ発現、プロセシング、翻訳後修飾もしくは活性、例えばＴ細胞系譜の決定の調節、サイトカインの産生を調節すること、ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達を調節すること、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路を調節すること、ＩｇＧクラススイッチングを調節することおよびＢリンパ球の機能を調節することと関連する障害を治療するのに有用であるかもしれない。
Ｔ−ｂｅｔの調節によって利益を得るかもしれない状態は：糖尿病、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物の咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、化合物発疹、らい境界反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴覚障害、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーヴス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ならびに間隙性肺線維症を包含する自己免疫障害を包含する。
被験体スクリーニングアッセイを他の作用物質の存在もしくは非存在下で実施し得る。例えば、スクリーニングされている細胞の活性化状態を調節する多様な作用物質の存在下で被験体アッセイを実施し得る。例えば、一態様においてＴ細胞受容体を介してシグナルを伝達する作用物質を包含する。別の態様において、サイトカインもしくはサイトカイン受容体に対する抗体を包含する。
別の局面において、本発明は本明細書に記述されるアッセイの２種もしくはそれ以上の組合せに関する。例えば、細胞に基づくもしくは細胞を含まないアッセイを使用して調節剤を同定することができ、また、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドの発現および／もしくは活性を調節する作用物質の能力をｉｎ ｖｉｖｏ、例えば多発性硬化症（ＥＡＥ）、慢性関節リウマチもしくは感染症の動物モデルのような動物で確認し得る。
さらに、本明細書に記述されるとおり同定されたＴ−ｂｅｔ調節物質（例えばドミナントネガティブＴ−ｂｅｔ分子、Ｔ−ｂｅｔ核酸もしくはポリペプチド分子、アンチセンスＴ−ｂｅｔ核酸分子、Ｔ−ｂｅｔ特異的抗体もしくは小分子）を動物モデルで使用してこうした調節物質での処置の有効性、毒性もしくは副作用を決定し得る。あるいは、本明細書に記述されるとおり同定されたＴ−ｂｅｔ調節物質を動物モデルで使用してこうした調節物質の作用機序を決定し得る。
別の態様において、類似のスクリーニングアッセイを使用して、例えば上述されたもののようなスクリーニングアッセイを実施すること、しかしＴ−ｂｅｔが相互作用する分子、すなわちＴｅｃキナーゼのようなシグナル伝達経路中でＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流いずれかで作用する分子を使用することによりＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を間接的に調節する化合物を同定し得る。
従って、下述されるとおり、本発明はＴ−ｂｅｔおよびＴボックス結合領域（例えばＩＬ−２もしくはＩＦＮ−γ遺伝子制御領域のようなサイトカイン遺伝子制御領域）の相互作用を調節する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。標的ＤＮＡ配列とのＤＮＡ結合タンパク質の相互作用を検出するアッセイは当該技術分野で既知である（例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮアーゼＩフットプリンティングアッセイなど）。試験化合物の存在および非存在下でこうしたアッセイを実施することにより、これらのアッセイを使用してその標的ＤＮＡ配列とのＤＮＡ結合タンパク質の相互作用を調節する（例えば阻害するもしくは高める）化合物を同定し得る。
本発明の細胞に基づくおよび細胞を含まないアッセイを下により詳細に記述する。
Ａ．細胞に基づくアッセイ
本発明の指標組成物はＴ−ｂｅｔポリペプチド（もしくはＩＦＮ−γのような非Ｔ−ｂｅｔポリペプチド）を発現する細胞、例えば内因性のＴ−ｂｅｔを天然に発現する細胞、またはより好ましくは該ポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞中に導入することにより外因性のＴ−ｂｅｔポリペプチドを発現するよう工作されている細胞であり得る。あるいは、指標組成物はＴ−ｂｅｔもしくはＩＦＮ−γのような非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを包含する細胞を含まない組成物（例えばＴ−ｂｅｔ発現細胞からの細胞抽出物または精製されたＴ−ｂｅｔ（天然もしくは組換えいずれかのポリペプチド）を包含する組成物）であり得る。
Ｔ−ｂｅｔ（もしくはＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する非Ｔ−ｂｅｔポリペプチド）の発現および／もしくは活性を調節する化合物は多様な「読み出し」を使用して同定し得る。
例えば、指標細胞をＴ−ｂｅｔ発現ベクターでトランスフェクトし得、試験化合物の存在および非存在下でインキュベートし得、そして該分子の発現もしくはＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答に対する該化合物の影響を測定し得る。Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性は標準的技術に従ってｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される活性を包含する。Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ標的分子（例えばサイトカイン遺伝子の転写制御領域のようなＴ−ｂｅｔが結合する核酸分子）もしくはキナーゼのようなポリペプチドとの会合のような直接の活性であり得る。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ活性は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドのＴ−ｂｅｔ標的分子との相互作用の下流で起こる細胞のシグナル伝達活性、もしくはその相互作用により誘発されたシグナル伝達カスケードの結果として起こる生物学的影響のような間接的活性である。例えば、本明細書に記述されるＴ−ｂｅｔの生物学的活性は：Ｔ細胞系譜の決定の調節、サイトカインの産生を調節すること、ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達を調節すること、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路を調節すること、ＩｇＧクラススイッチングを調節することおよびＢリンパ球の機能を調節することを包含する。Ｔ−ｂｅｔの多様な生物学的活性は当該技術分野で既知である技術を使用して測定可能である。例示的技術は実施例により詳細に記述する。
試験化合物がＴ−ｂｅｔ発現を調節するかどうかを決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写アッセイを実施し得る。こうしたアッセイを実施するために、Ｔ−ｂｅｔの完全長のプロモーターおよびエンハンサーをクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）もしくはルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に操作可能に連結しかつ宿主細胞中に導入し得る。
本明細書で互換性に使用されるところの「操作可能に連結される」および「効果的に連結される」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞中での（もしくは細胞抽出物による）該ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御配列に連結されていることを意味することを意図している。制御配列は技術的に認識されかつ適切な宿主細胞中での所望のポリペプチドの発現を指図するように選択し得る。制御配列という用語はプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび他の発現調節領域を包含することを意図している。こうした制御配列は当業者に既知でありかつＧｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記述される。発現ベクターの設計はトランスフェクトされるべき宿主細胞の選択ならびに／または発現されるべき所望のポリペプチドの型および／もしくは量のような因子に依存しうることが理解されるべきである。
多様なレポーター遺伝子が当該技術分野で既知でありかつ本発明のスクリーニングアッセイでの使用に適する。適するレポーター遺伝子の例は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはルシフェラーゼをコードするものを包含する。これらの遺伝子産物の活性の標準的測定方法は当該技術分野で既知である。
多様な細胞型が該スクリーニングアッセイでの指標細胞としての使用に適する。好ましくは、Ｔｈ２細胞クローンもしくはノックアウト動物からの細胞のような通常はＴ−ｂｅｔを発現しない細胞系を使用する。ＨｅｐＧ２肝癌細胞系のような非リンパ系細胞系もまた指標細胞として使用可能である。酵母細胞もまた指標細胞として使用可能である。
主題のアッセイでの使用のための細胞は真核生物および原核生物双方の細胞を包含する。例えば、一態様において細胞は細菌細胞である。別の態様において細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。別の態様において細胞は脊椎動物細胞、例えばトリ細胞または哺乳動物細胞（例えばマウス細胞もしくはヒト細胞）である。
一態様において、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルは、試験化合物の非存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより高く、そして該試験化合物はＴ−ｂｅｔの発現を刺激する化合物と同定される。別の態様において、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルは、試験化合物の非存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより低く、そして該試験化合物はＴ−ｂｅｔの発現を阻害する化合物と同定される。
一態様において、本発明はＴ−ｂｅｔが関与する細胞応答を調節する化合物の同定方法を提供する。
標的分子へのＴ−ｂｅｔ結合を調節するもしくはＴ−ｂｅｔに結合する試験化合物の能力もまた測定し得る。標的分子（例えば結合パートナー）へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する試験化合物の能力を測定することは、例えば複合体中の標識Ｔ−ｂｅｔ標的分子を検出することによりＴ−ｂｅｔへのＴ−ｂｅｔ標的分子の結合が測定可能であるような放射性同位元素、酵素もしくは蛍光標識とＴ−ｂｅｔ標的分子を結合することにより達成し得る。あるいは、Ｔ−ｂｅｔを放射性同位元素、酵素もしくは蛍光標識と結合して複合体中のＴ−ｂｅｔ標的分子へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する試験化合物の能力をモニターし得る。Ｔ−ｂｅｔを結合する試験化合物の能力を測定することは、例えば複合体中の標識Ｔ−ｂｅｔ化合物を検出することによりＴ−ｂｅｔへの該化合物の結合が測定可能であるような放射性同位元素、酵素もしくは蛍光標識と該化合物を結合することにより達成し得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔ標的は直接もしくは間接的にのいずれかで１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３Ｈで標識可能であり、そして放射能発射の直接計数もしくはシンチレーション計数により放射性同位元素を検出し得る。あるいは、化合物を例えばワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはルシフェラーゼで酵素的に標識可能であり、そして適切な基質の産物への転化の測定により酵素標識を検出し得る。
相互作用体のいずれの標識も伴わずにＴ−ｂｅｔと相互作用する化合物の能力を測定することもまた本発明の範囲内にある。例えば、微小生理機能測定器を使用して化合物もしくはＴ−ｂｅｔいずれの標識も伴わずにＴ−ｂｅｔとの化合物の相互作用を検出し得る（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書で使用されるところの「微小生理機能測定器」（例えばサイトセンサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ））は光接近可能な電位測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を化合物とＴ−ｂｅｔとの間の相互作用の指標として使用し得る。
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用するＴ−ｂｅｔが関与する経路中で作用する異なる（すなわち非Ｔ−ｂｅｔ）分子を、スクリーニングアッセイでの使用のため指標組成物中に包含し得る。こうした分子を使用するスクリーニングアッセイで同定される化合物もまた、間接的にではあろうともＴ−ｂｅｔ活性の調節において有用であることができる。Ｔ−ｂｅｔが相互作用する例示的一分子はＴｅｃキナーゼ、例えばＩＴＫもしくはｒｌｋキナーゼを包含する。
本アッセイで使用される細胞は起源が真核生物もしくは原核生物であり得る。例えば、一態様において細胞は細菌細胞である。別の態様において細胞は真菌細胞、例えば酵母細胞である。別の態様において細胞は脊椎動物細胞、例えばトリもしくは哺乳動物細胞である。好ましい一態様において細胞はヒト細胞である。
本発明の細胞は内因性のＴ−ｂｅｔ（もしくはＴ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路中の別のポリペプチド）を発現し得るか、またはそうするように工作してもよい。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドまたはＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを発現するよう工作されている細胞は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞中に導入することにより製造可能である。
指標細胞中でＴ−ｂｅｔポリペプチドまたはＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドの発現に使用し得る組換え発現ベクターは当該技術分野で既知である。一態様において、発現ベクター内で指標細胞中でのＴ−ｂｅｔの誘導可能なもしくは構成的発現を見込む制御配列（例えばサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーのようなウイルス制御配列を使用し得る）にＴ−ｂｅｔコーディング配列を効果的に連結する。指標細胞中でのＴ−ｂｅｔの誘導可能なもしくは構成的発現を見込む組換え発現ベクターの使用が、Ｔ−ｂｅｔの活性を高めるもしくは阻害する化合物の同定に好ましい。代替の一態様において、発現ベクター内でＴ−ｂｅｔコーディング配列を内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子の制御配列（すなわち内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子由来のプロモーター制御領域）に効果的に連結する。Ｔ−ｂｅｔ発現が内因性制御配列により制御される組換え発現ベクターの使用が、Ｔ−ｂｅｔの転写発現を高めるもしくは阻害する化合物の同定に好ましい。
Ｔｈ１関連サイトカイン遺伝子を（例えばレポーター遺伝子としてもしくはＴ−ｂｅｔ活性を評価するための読み出しとして）利用する方法においては、好ましくはＴｈ１関連サイトカインはインターフェロン−γもしくはＩＬ−２である。付属として付けられる実施例に記述されるとおり、Ｔ−ｂｅｔをＩＬ−２プロモーターに結合するその能力に基づく酵母１ハイブリッドスクリーニングアッセイで単離した。従って、一態様において、本発明の一方法は近位ＩＬ−２プロモーターのこの領域、最も好ましくはＩＬ−２プロモーターのヌクレオチド−２４０ないし−２２０を含有するレポーター遺伝子構築物を利用する。使用し得る他の配列は：コンセンサスＴボックス部位、ヒトＩＬ−２プロモーター、マウスＩＬ−２プロモーター、ヒトＩＦＮ−γイントロンＩＩＩ、マウスＩＦＮ−γ近位プロモーター中の２個の結合部位を包含する。（Ｓｚａｂｏら ２０００．Ｃｅｌｌ １００：６５５−６６９）。
一態様において、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性に影響を及ぼす標的化合物を同定かつ特徴づけするための高スループットの細胞に基づくスクリーニングにおいて誘導可能な系を構築しかつ使用し得る。誘導可能な系は、例えば、エクダイソンに駆動されるＴ−ｂｅｔ発現プラスミドとコトランスフェクトしたエクダイソン受容体およびＩＦＮ− プロモータールシフェラーゼレポーターを発現する接着性２９３Ｔヒト胚腎細胞系のサブクローンを使用することにより、通常はＩＦＮ−γを産生しない細胞系を使用して構築可能である。（Ｗａｋｉｔａら ２００１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３１：４１４；Ｎｏら Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ９３：３３４６；Ｇｒａｈａｍ．２００２ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：５２５）。昆虫ホルモンエクダイソンでの処理に際してＴ−ｂｅｔが発現され、ＩＦＮ− レポーターが活性化されかつルシフェラーゼ活性が生成される。この系において、Ｔ−ｂｅｔは該細胞系に内因性のＩＦＮ− を産生する能力を賦与する。
Ｂ．細胞を含まないアッセイ
別の態様において、指標組成物は細胞を含まない組成物である。宿主細胞もしくは培地中で組換え方法により発現されたＴ−ｂｅｔもしくはＴ−ｂｅｔが関与する経路中でＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを、ポリペプチドの標準的精製方法を使用して、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＴ−ｂｅｔに特異的な抗体との免疫親和性精製により宿主細胞もしくは細胞培地から単離して細胞を含まない組成物中で使用し得るタンパク質を生じさせることが可能である。あるいは、細胞を含まない組成物としての使用のためにＴ−ｂｅｔもしくは非Ｔ−ｂｅｔ発現細胞の抽出物を調製し得る。
一態様において、Ｔ−ｂｅｔ活性を特異的に調節する化合物は、Ｔ−ｂｅｔを結合する標的分子とのＴ−ｂｅｔの相互作用を調節するそれらの能力に基づき同定される。標的分子はＤＮＡ分子、例えばサイトカイン遺伝子の制御領域のようなＴ−ｂｅｔ応答性因子）もしくはポリペプチド分子例えばＴｅｃキナーゼであり得る。タンパク質−タンパク質相互作用（例えば免疫沈降、蛍光偏光もしくはエネルギー伝達、２ハイブリッドアッセイなど）の検出を見込む、または標的ＤＮＡ配列とＤＮＡ結合タンパク質との間の相互作用の検出を見込む（例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮアーゼＩフットプリンティングアッセイなど）適するアッセイが当該技術分野で既知である。試験化合物の存在および非存在下でこうしたアッセイを実施することにより、これらのアッセイを使用して標的分子とのＴ−ｂｅｔの相互作用を調節する（例えば阻害するもしくは高める）化合物を同定し得る。
一態様において、試験化合物の存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量は該試験化合物の非存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量より大きく、この場合は該該試験化合物がＴ−ｂｅｔの結合を高める化合物と同定される。別の態様において、試験化合物の存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量は試験化合物の非存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量より小さく、この場合は該試験化合物がＴ−ｂｅｔの結合を阻害する化合物と同定される。
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドへの試験化合物の結合は上述されたとおり直接もしくは間接的いずれかで測定し得る。試験化合物に結合するＴ−ｂｅｔポリペプチドの能力を測定することはまた、リアルタイム生体分子相互作用分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）のような技術を使用しても達成し得る（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．とＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）。本明細書で使用されるところの「ＢＩＡ」は相互作用体のいずれも標識することなくリアルタイムで生物特異的相互作用を研究するための技術である（例えばバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ））。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化を生物学的分子間のリアルタイム反応の表示として使用し得る。
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用を調節する試験化合物の本発明の同定方法において、完全長のＴ−ｂｅｔポリペプチドを該方法で使用してよいか、あるいはＴ−ｂｅｔの部分のみを使用してよい。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度は、例えばポリペプチドの一方を検出可能な物質（例えば放射標識）で標識すること、非標識ポリペプチドを単離すること、および非標識ポリペプチドと会合するようになった検出可能な物質の量を定量することにより測定可能である。該アッセイを使用してＴ−ｂｅｔタンパク質と標的分子との間の相互作用を刺激もしくは阻害のいずれかをする試験化合物を同定し得る。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用を刺激する試験化合物は、該試験化合物の非存在下での相互作用の程度と比較してＴ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度を増大させるその能力に基づいて同定される。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用を阻害する試験化合物は、該化合物の非存在下での相互作用の程度と比較してＴ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度を減少させるその能力に基づいて同定される。
本発明の上のアッセイ方法の１以上の態様において、例えば複合体形成されない形態のポリペプチドの一方もしくは双方からの複合体形成された形態の分離を助長するため、またはアッセイの自動化に適応させるために、Ｔ−ｂｅｔもしくはＴ−ｂｅｔ標的分子すなわちキナーゼのいずれかを固定することが望ましいかもしれない。試験化合物の存在および非存在下での試験化合物のＴ−ｂｅｔポリペプチドへの結合もしくはＴ−ｂｅｔポリペプチドのＴ−ｂｅｔ標的分子との相互作用は、反応体を含有するのに適するいかなる容器中でも達成し得る。こうした容器の例はマイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管を包含する。一態様において、ポリペプチドの一方もしくは双方をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（シグマ ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ミズーリ州セントルイス）もしくはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、これをその後試験化合物または試験化合物および吸着されない標的ポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔポリペプチドのいずれかと組合せ、そして該混合物を複合体形成に伝導性の条件下で（例えば塩およびｐＨについて生理学的条件で）インキュベートする。インキュベーション後にビーズもしくはマイクロタイタープレートウェルを洗浄していかなる未結合の化合物も除去し、ビーズの場合はマトリックスを固定し、そして例えば上述されたとおりに直接もしくは間接的いずれかで複合体形成を測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させかつ標準的技術を使用してＴ−ｂｅｔ結合もしくは活性のレベルを測定し得る。
マトリックス上にポリペプチドを固定するための他の技術もまた本発明のスクリーニングアッセイで使用可能である。例えば、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔ標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定し得る。ビオチニル化Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子を当該技術分野で既知の技術（例えばビオチニル化キット、ピアース ケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、イリノイ州ロックフォード）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製することができ、そしてストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（ピアース ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ））のウェル中に固定し得る。あるいは、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子と反応性であるがしかしＴ−ｂｅｔポリペプチドのその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、そして未結合の標的もしくはＴ−ｂｅｔポリペプチドを抗体結合によりウェル中で捕捉する。こうした複合体の検出方法は、ＧＳＴ固定された複合体について上述されたものに加え、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびにＴ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子と関連する酵素活性を検出することに頼る酵素結合アッセイを包含する。
本発明のなお別の局面において、Ｔ−ｂｅｔに結合するかもしくはそれと相互作用し（「Ｔ−ｂｅｔ結合タンパク質」もしくは「Ｔ−ｂｅｔ」）かつＴ−ｂｅｔ活性に関与する他のポリペプチドを同定するための２ハイブリッドアッセイもしくは３ハイブリッドアッセイ（例えば米国特許第５，２８３，３１７号明細書；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ 第ＷＯ９４／１０３００号明細書を参照されたい）において、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはそのフラグメントを「餌（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用し得る。こうしたＴ−ｂｅｔ結合タンパク質もまた、例えばＴ−ｂｅｔ媒介性のシグナル伝達経路の下流の要素としてＴ−ｂｅｔポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔ標的によるシグナルの伝播に関与していることがありそうである。あるいは、こうしたＴ−ｂｅｔ結合ポリペプチドはＴ−ｂｅｔ阻害剤であることがありそうである。
２ハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインよりなる大部分の転写因子のモジュールの性質に基づく。簡潔には、該アッセイは２種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。一構築物において、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドをコードする遺伝子を既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物において、未同定のタンパク質（「餌食（ｐｒｅｙ）」もしくは「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーからの１ＤＮＡ配列を既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「餌」および「餌食」タンパク質はｉｎ ｖｉｖｏで相互作用することが可能であり、Ｔ−ｂｅｔ依存性の複合体を形成し、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインが近い近接にもたらされる。この近接が、該転写因子に応答性の転写調節部位に操作可能に連結されているレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、そして機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し得、そしてＴ−ｂｅｔポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローン化された遺伝子を得るのに使用し得る。
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ標的遺伝子を単離するための発現差解析法（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）およびマイクロチップＤＮＡアレイ分析。例えば、減算（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）もしくは未減算プローブを使用するＰＣＲと結合したディファレンシャルディスプレイもしくはサブトラクション法（ＲＤＡ；例えばＨｕｂａｎｋ，Ｍ．とＳｃｈａｔｚ，Ｄ．Ｇ．１９９４．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２、５６４０−５６４８；Ｃｈａｎｇ，Ｙ．ら １９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６、１８６５；ｖｏｎ Ｓｔｅｉｎ，Ｏ．Ｄ．ら １９９７．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５、２５９８；Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，Ｎ．とＷｉｇｌｅｒ，Ｍ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９、９４６を参照されたい）、またはより最近はＤＮＡマイクロチップアレイハイブリダイゼーション（Ｗｅｌｆｏｒｄら １９９８．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：３０５９）を使用し得る。こうしたアッセイの実施において多様な細胞を使用し得、例えば正常細胞、Ｔ−ｂｅｔを発現するよう工作された細胞またはＴ−ｂｅｔを欠くもしくはＴ−ｂｅｔを過剰発現するマウスから（例えばトランスジェニック非ヒト動物から）の細胞を使用し得る。
なお別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ標的タンパク質を記述するためのプロテオミクスのアプローチを実施し得る。例えば、減算分析、発現パターンの分析、タンパク質レベルでの遺伝子型変異の同定およびタンパク質同定ならびに翻訳後修飾の検出を例えばＷａｎｇら（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７８２（１−２）：２９１−３０６；Ｌｕｂｍａｎら（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７８２（１−２）：１８３−９６；およびＲａｉら（２００２）Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１２６（１２）：１５１８−２６に記述されるとおり実施し得る。
Ｃ．Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞を使用するアッセイ
別の態様において、本発明はＴ−ｂｅｔが欠損の細胞を使用するＴ−ｂｅｔの生物学的影響を調節する化合物の同定方法を提供する。実施例に記述されるとおり、Ｂ細胞における（例えばＴ−ｂｅｔ遺伝子の混乱による）Ｔ−ｂｅｔ活性の阻害はＩｇＧ２ａ産生の欠損をもたらす。従って、Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞を使用して、Ｔ−ｂｅｔそれ自身を調節すること以外の手段によりＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節する作用物質を同定し得る（すなわちＴ−ｂｅｔ欠損表現型を「救助する」化合物）。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子が条件的様式で非機能的にされている「条件的ノックアウト」系を使用してスクリーニングアッセイでの使用のためのＴ−ｂｅｔ欠損細胞を創製し得る。例えば、第ＷＯ ９４／２９４４２号明細書および米国特許第５，６５０，２９８号明細書に記述されるところの遺伝子の条件的混乱のためのテトラサイクリンに調節される系を使用して細胞もしくはそれから細胞を単離可能であるＴ−ｂｅｔ欠損動物を創製することができ、それらは細胞と接触するテトラサイクリン濃度の調節により制御された様式でＴ−ｂｅｔ欠損にされることができる。Ｔ−ｂｅｔの他の生物学的影響に関するアッセイに、類似の条件的混乱のアプローチを使用し得るか、あるいは、ＲＡＧ−２欠損胚盤胞補完系を使用して、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子のホモ接合性突然変異を伴う胚幹細胞から生じるリンパ系器官をもつマウスを生成させ得る。こうした動物からのＴ−ｂｅｔ欠損リンパ系細胞（例えば胸腺、脾および／もしくはリンパ節細胞）または精製されたＴ−ｂｅｔ欠損Ｂ細胞をスクリーニングアッセイで使用し得る。
該スクリーニング方法において、Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞を試験化合物と接触させ、そしてＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答をモニターする。Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞における応答の調節（例えば未処理細胞もしくは対照作用物質で処理した細胞のような適切な対照と比較した）が、試験化合物をＴ−ｂｅｔに調節される応答の調節物質と同定する。
一態様において、試験化合物を非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物、好ましくはマウス（例えばＴ−ｂｅｔ遺伝子が上述された手段により条件的に混乱されているマウス、もしくはリンパ系器官が上述されたとおりＴ−ｂｅｔが欠損であるキメラマウス）に直接投与してＴ−ｂｅｔが欠損の細胞のｉｎ ｖｉｖｏ応答を調節する試験化合物を同定する。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞を非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物から単離し、そしてｅｘ ｖｉｖｏで試験化合物と接触させてＴ−ｂｅｔが欠損の細胞中でＴ−ｂｅｔにより調節される応答を調節する試験化合物を同定する。
Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞はＴ−ｂｅｔが欠損であるように創製された非ヒト動物から得ることができる。好ましい非ヒト動物はサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジを包含する。好ましい態様においてＴ−ｂｅｔ欠損動物はマウスである。Ｔ−ｂｅｔが欠損のマウスは実施例に記述されるとおり作成し得る。特定の１遺伝子産物が欠損の非ヒト動物は、典型的には相同的組換えにより創製する。簡潔には、欠失、付加もしくは置換が導入されてそれにより内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子を変える、例えば機能的に混乱させるＴ−ｂｅｔ遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを調製する。Ｔ−ｂｅｔ遺伝子は好ましくはマウスＴ−ｂｅｔ遺伝子である。例えば、マウスＴ−ｂｅｔ遺伝子はマウスＴ−ｂｅｔ ｃＤＮＡをプローブとして使用してマウスゲノムＤＮＡライブラリーから単離し得る。その後、マウスＴ−ｂｅｔ遺伝子を使用してマウスゲノム中の内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子を変えるのに適する相同的組換えベクターを構築し得る。好ましい一態様において、相同的組換えに際して内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊されるようなベクターを設計する（すなわち、機能的ポリペプチドをもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともまた称される）。あるいは、相同的組換えに際して内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が突然変異されるかもしくは別の方法で変えられるがしかし機能的ポリペプチドをなおコードするようなベクターを設計し得る（例えば上流の制御領域を変えてそれにより内因性のＴ−ｂｅｔポリペプチドの発現を変えることができる）。該相同的組換えベクターにおいて、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の変えられた部分はその５’および３’端でＴ−ｂｅｔ遺伝子の付加的な核酸により隣接されて、該ベクターにより運搬される外因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と胚幹細胞中の内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子との間で相同的組換えを起こさせる。付加的な隣接するＴ−ｂｅｔ核酸は内因性遺伝子との成功裏の相同的組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５’および３’双方の端で）がベクターに包含される（例えば、相同的組換えベクターの記述についてＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．とＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照されたい）。ベクターを胚幹細胞系に（例えば電気穿孔法により）導入し、そして導入されたＴ−ｂｅｔ遺伝子が内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と相同的に組換わった細胞を選択する（例えばＬｉ，Ｅ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照されたい）。その後、選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成させる（例えば、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、オックスフォード、１９８７）中、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、ｐｐ．１１３−１５２を参照されたい）。その後、キメラ胚を適する偽妊娠雌性育成動物中に埋植し得かつ胚を分娩までもたらし得る。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡをもつ子孫を使用して、該動物の全細胞が該トランスジーンの生殖系列伝達により相同的に組換えられたＤＮＡを含有する動物を繁殖し得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：８２３−８２９ならびにＬｅ ＭｏｕｅｌｌｅｃらによるＰＣＴ国際公開第ＷＯ ９０／１１３５４号；Ｓｍｉｔｈｉｅｓらによる同第ＷＯ ９１／０１１４０号；Ｚｉｊｌｓｔｒａらによる同第ＷＯ ９２／０９６８号；およびＢｅｒｎｓらによる同第ＷＯ ９３／０４１６９号明細書にさらに記述される。
別の態様において、野性型およびＴ−ｂｅｔヌル双方のマウスからのドナー骨髄細胞のレトロウイルス形質導入を、照射されたＲＡＧレシピエントを再構成するためにＤＮすなわちドミナントネガティブ構築物を用いて実施し得る。これは、そのリンパ系細胞がドミナントネガティブバージョンのＴ−ｂｅｔのみを発現するマウスの生産をもたらすことができる。その後、これらのマウスからのＢ細胞を、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節する化合物について試験し得る。
該スクリーニングアッセイの一態様において、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節するそれらの能力について試験された化合物を、非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物に該試験化合物をｉｎ ｖｉｖｏで投与すること、および該動物における応答に対する該試験化合物の影響を評価することによりＴ−ｂｅｔ欠損細胞と接触させる。試験化合物は製薬学的組成物として非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物に投与し得る。こうした組成物は、典型的には試験化合物および製薬学的に許容できる担体を含んでなる。本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は製薬学的投与と適合性のいかなるおよび全部の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌性化合物、等張および吸収を遅らせる化合物などを包含することを意図している。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および化合物の使用は当該技術分野で公知である。いずれかの慣習的媒体もしくは化合物が有効成分と不適合性である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が企図されている。補助的有効成分もまた組成物中に組込み可能である。
Ｄ．試験化合物
本明細書に記述されるスクリーニングアッセイを使用して多様な試験化合物を評価し得る。ある態様において、試験されるべき化合物はライブラリー由来であり得る（すなわち化合物の１ライブラリーのメンバーである）。ペプチドのライブラリーの使用が当該技術分野で十分に確立されている一方、ベンゾジアゼピン（Ｂｕｎｉｎら（１９９２）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０９８７；ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９）ペプトイド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８）オリゴカルバメート（Ｃｈｏら（１９９３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６１：１３０３−）およびヒダントイン（ＤｅＷｉｔｔら 上記）のような他の化合物の混合物の製造を可能にした新たな技術が開発された。１０４〜１０５の多様性をもつ小有機分子の分子ライブラリーの合成のための１アプローチが記述されている（Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９−；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１−）。
本発明の化合物は：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー、デコンヴォリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を包含する当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれを使用しても得ることができる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドのライブラリーに制限される一方、他の４アプローチは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは小分子ライブラリーに応用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｐｏｎｄ Ｄｅｓ．１２：１４５）。分子ライブラリーの他の例示的合成方法は当該技術分野で、例えば：Ｅｒｂら（１９９４）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２−；Ｈｏｒｗｅｌｌら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３３：６８−；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−に見出し得る。
化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、スポア（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第’４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）もしくはファージ上（ＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）に提示されているかもしれず；なお別の態様において、コンビナトリアルポリペプチドはｃＤＮＡライブラリーから製造される。
活性についてスクリーニングし得る例示的化合物は、限定されるものでないがペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子および天然産物抽出物ライブラリーを挙げることができる。
候補／試験化合物は、例えば、１）Ｉｇ尾部をつけられた（ｔａｉｌｅｄ）融合ペプチドならびにＤ−および／もしくはＬ−配置アミノ酸より作成されるランダムペプチドライブラリー（例えばＬａｍ，Ｋ．Ｓ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６を参照されたい）およびコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバーを包含する可溶性ペプチドのようなペプチド；２）ホスホペプチド（例えば無作為かつ部分的に縮重の定方向ホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えばＳｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８を参照されたい）；３）抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラおよび一本鎖抗体ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメントおよび抗体のエピトープ結合フラグメント）；４）小有機および無機分子（例えばコンビナトリアルおよび天然産物のライブラリーから得られる分子）；５）酵素（例えばエンドリボヌクレアーゼ、加水分解酵素、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、合成酵素、異性化酵素、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、酸化還元酵素およびＡＴＰアーゼ）、ならびに６）突然変異体の形態もしくはＴ−ｂｅｔ分子、例えばドミナントネガティブ突然変異体の形態の該分子を包含する。
本発明の試験化合物は：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；デコンヴォリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法：およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を包含する当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれを使用しても得ることができる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドのライブラリーに制限される一方、他の４アプローチは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは小分子ライブラリーに応用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｐｏｎｄ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野で、例えば：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出し得る。
化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、スポア（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第’４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）もしくはファージ上（ＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ 上記）に提示されているかもしれない。
主題のスクリーニングアッセイで同定される化合物は、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答の１種もしくはそれ以上の調節方法で使用し得る。こうした化合物（１種もしくは複数）を細胞と接触させる前にそれらを製薬学的組成物（上述される）として処方することが望ましいかもしれないことが理解されるであろう。
Ｔ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を直接もしくは間接的に調節する試験化合物が上述される多様な方法の１つにより一旦同定されれば、選択された試験化合物（もしくは「目的の化合物」）をその後、例えばｉｎ ｖｉｖｏ（例えば目的の化合物を被験体に投与することにより）もしくはｅｘ ｖｉｖｏ（例えば被験体から細胞を単離しかつ該単離された細胞を目的の化合物と接触させることにより、あるいは目的の化合物を細胞系と接触させることにより）のいずれかで細胞と目的の化合物を接触させること、および適切な対照（未処理の細胞または生物学的応答を調節しない対照化合物もしくは担体で処理した細胞のような）と比較して細胞に対する目的の化合物の影響を決定することにより、細胞に対するその影響についてさらに評価し得る。目的の化合物はまた当該技術分野で既知の技術を使用する構造に基づく薬物設計を使用しても同定可能である。
本発明は上のアッセイで同定される化合物にもまた関する。
Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答の調節方法
本発明のなお別の局面は細胞中でのＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性の調節方法に関する。本発明の調節方法は、細胞中でのＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性が調節されるようなＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を調節する作用物質と細胞を接触させることを必要とする。Ｔ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性が細胞中で調節されるために、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を調節するのに十分な量の調節剤と細胞を接触させる。
一態様において、本発明の調節方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。別の態様において、本発明の調節方法はｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性の調節によって利益を得ることができる障害もしくは状態を有する被験体中で実施される。
作用物質は、（例えば、細胞を例えばそれが相互作用する分子へのＴ−ｂｅｔの結合を妨害する、Ｔ−ｂｅｔの結合特異性を変える、もしくはＴ−ｂｅｔを転写後修飾する作用物質と接触させることにより）細胞中でのＴ−ｂｅｔポリペプチドの活性または（例えばＴ−ｂｅｔ遺伝子の転写もしくはＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの翻訳を調節することにより）Ｔ−ｂｅｔの発現を調節することにより作用するかもしれない。
従って、本発明は、生物学的応答が調節されるようなＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性の調節物質と細胞を接触させることによる、Ｔ−ｂｅｔにより調節される１種もしくはそれ以上の生物学的応答の調節方法を特徴とする。
付属として付けられる実施例に記述されるとおり、Ｔ−ｂｅｔは、細胞により産生されるＴヘルパー２型および／もしくはＴヘルパー１型サイトカインの量を調節すること、Ｔ細胞系譜の決定の調節、ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達を調節すること、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路を介するシグナル伝達を調節すること、ＩｇＧクラススイッチングを調節することおよびＢリンパ球機能を調節することを包含する細胞に対する多様な生物学的影響を有する。
別の態様において、その転写がＴ−ｂｅｔにより調節される遺伝子が本発明の方法を使用して調節され得る。その発現がＴ−ｂｅｔにより調節される例示的遺伝子は例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを包含する。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答は、Ｔ−ｂｅｔを巻き込むシグナル伝達経路中のＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する非Ｔ−ｂｅｔ分子を調節することにより間接的に調節される可能性がある。例えば、本例で示されるとおり、Ｔ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を調節する細胞外の影響はＴＧＦ−βおよびＩＦＮ−γを包含する。従って、ＴＧＦ−βもしくはＩＦＮ−γを調節するまたはＴＧＦ−βもしくはＩＦＮ−γシグナル伝達経路中の分子を調節する作用物質を使用してＴ−ｂｅｔを調節可能である。
主題の方法は、Ｔ−ｂｅｔが調節されるようなＴ−ｂｅｔの発現、プロセシング、翻訳後修飾もしくは活性（またはＴ−ｂｅｔシグナル伝達経路中の別の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾もしくは活性）を調節する作用物質を使用する。主題の方法は臨床および非臨床双方の設定で有用である。
一態様において、本方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し得る。例えば、商業的に価値のあるポリペプチド、例えば組換え的に発現されるポリペプチドの生産は、ＩＦＮ−経路を刺激することにより増大し得る。好ましい一態様において、Ｔ−ｂｅｔはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞中で調節可能であり、そしてその後処理された細胞を被験体に投与し得る。
主題の発明はＴ−ｂｅｔの調節によって利益を得ることができる多様な状態もしくは障害を治療するのにもまた使用し得る。Ｔ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性の調節によって利益を得ることができる例示的障害は本明細書に示す。一態様において、本発明は、被験体中でのＴ−ｂｅｔの生物学的影響が調節されるような治療上有効な量のＴ−ｂｅｔの調節物質を被験体に投与することによりｉｎ ｖｉｖｏでのＴ−ｂｅｔの調節を提供する。例えば、Ｔ−ｂｅｔを調節して自己免疫障害もしくは免疫不全を治療し得る。
「被験体」という用語は免疫応答を導き出し得る生存生物体を包含することを意図している。好ましい被験体は哺乳動物である。とりわけ好ましい被験体はヒトである。被験体の他の例はサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ならびに他の家畜およびペットを包含する。ヒトならびに家畜の応用におけるＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性の調節は多様な疾患状態において異常なＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性から生じる障害を調節する手段を提供し、そして本発明により包含される。
Ｔ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を直接もしくは間接的に調節することによりＴ−ｂｅｔの生物学的影響を調節する化合物の同定は、本発明の調節方法を使用しての多様な臨床状況でのこれらの生物学的影響の選択的操作を見込む。例えば、本発明の刺激方法（すなわち賦活剤を使用する方法）は、例えばＩＦＮ−γ産生、ＩｇＧクラススイッチングおよびＣＤ８エフェクター細胞の産生を刺激しかつ例えばＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を阻害するＴ−ｂｅｔの増大された発現および／もしくは活性をもたらすことができ、かつ、（例えばＴｒ細胞の数もしくは割合を低下させることにより）寛容を低下させ得る。対照的に、本発明の阻害方法（すなわちＴ−ｂｅｔを阻害する作用物質を使用する方法）は相反する効果を有し得る。
障害の処置への本発明の調節方法の応用は、障害の治癒、長期もしくは短期いずれかの障害と関連する症状の型もしくは数の減少（すなわち状態の軽減）、または単純に被験体に対する一過性の有益な影響をもたらすかもしれない。
本発明の免疫調節方法の応用を下にさらに詳細に記述する。
Ａ．阻害剤
本発明の調節方法により、Ｔ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性は、細胞を阻害剤と接触させることにより細胞中で阻害される。本発明の阻害剤は例えばＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を阻害するよう作用する細胞内結合分子であり得る。本明細書で使用されるところの「細胞内結合分子」という用語は、ポリペプチドそれ自身、該ポリペプチドをコードする核酸（例えばｍＲＮＡ分子）もしくは該ポリペプチドが通常相互作用する標的（例えばＴ−ｂｅｔが結合するＤＮＡ標的配列）に結合することによりポリペプチドの発現および／もしくは活性を阻害するよう細胞内で作用する分子を包含することを意図している。下にさらに詳細に記述される細胞内結合分子の例は、アンチセンスＴ−ｂｅｔ核酸分子（例えばＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための）、細胞内抗Ｔ−ｂｅｔ抗体（例えばＴ−ｂｅｔポリペプチドの活性を阻害するための）およびＴ−ｂｅｔポリペプチドのドミナントネガティブ突然変異体を包含する。
一態様において、本発明の阻害剤は、Ｔ−ｂｅｔをコードする遺伝子もしくは前記遺伝子の一部分に相補的であるアンチセンス核酸分子、または前記アンチセンス核酸分子をコードする組換え発現ベクターである。細胞中での特定の１ポリペプチドの発現をダウンレギュレートするためのアンチセンス核酸の使用は当該技術分野で公知である（例えばＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）１９８６；Ａｓｋａｒｉ，Ｆ．Ｋ．とＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３１６−３１８；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．とＳｃｈｗａｒｔｚ，Ｓ．Ｍ．（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９２：１９８１−１９９３；Ｍｅｒｃｏｌａ，Ｄ．とＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：４７−５９：Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．５１：２１７−２２５；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５を参照されたい）。アンチセンス核酸分子は別の核酸分子（例えばｍＲＮＡ配列）のコーディング鎖に対し相補的でありそして従って該他の核酸分子のコーディング鎖に水素結合することが可能であるヌクレオチド配列を含んでなる。ｍＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス配列は、ｍＲＮＡのコーディング領域、ｍＲＮＡの５’もしくは３’非翻訳領域またはコーディング領域および非翻訳領域を架橋する領域（例えば５’非翻訳領域およびコーディング領域の結合部で）に見出される配列に相補的であり得る。さらに、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の制御領域、例えば転写開始配列もしくは調節要素に対し配列が相補的であり得る。好ましくは、アンチセンス核酸はコーディング鎖上の開始コドンに先行するもしくはそれにわたる、またはｍＲＮＡの３’非翻訳領域中の領域に相補的であるように設計する。細胞中でのＴ−ｂｅｔポリペプチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸は、ワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って構築されるＴ−ｂｅｔポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号１もしくは３）に基づいて設計が可能である。
アンチセンス核酸は多様な異なる形態で存在し得る。例えば、アンチセンス核酸はＴ−ｂｅｔ遺伝子の一部分にのみ相補的であるオリゴヌクレオチドであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは当該技術分野で既知の化学合成手順を使用して構築し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に生じるヌクレオチド、または該分子の生物学的安定性を増大させるかもしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるよう設計された多様に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用し得る。培養物中の細胞中でのＴ−ｂｅｔ発現を阻害するために、１種もしくはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを典型的には約２００μｇオリゴヌクレオチド／ｍｌで培地中の細胞に添加し得る。
あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンスの向きでサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的に製造し得る（すなわち、挿入された核酸から転写される核酸は目的の標的核酸に対しアンチセンスの向きのものであることができる）。目的の細胞中での該アンチセンスＲＮＡ分子の発現を指図するアンチセンスの向きでクローン化された核酸に効果的に連結された調節配列を選ぶことができ、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的もしくは誘導可能な発現を指図するプロモーターおよび／もしくはエンハンサーまたは他の制御配列を選ぶことができる。例えば、アンチセンスＲＮＡの誘導可能な発現のために、Ｔｅｔ系（例えばＧｏｓｓｅｎ，Ｍ．とＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９；ＰＣＴ公開第ＷＯ ９４／２９４４２号明細書；およびＰＣＴ公開第ＷＯ ９６／０１３１３号明細書に記述されるところの）のような誘導可能な真核生物制御系を使用し得る。アンチセンス発現ベクターは、ｃＤＮＡ（もしくはその部分）がベクター中にアンチセンスの向きでクローン化されることを除き、組換え発現ベクターについて上述されたとおり製造する。アンチセンス発現ベクターは例えば組換えプラスミド、ファージミドもしくは弱毒化ウイルスの形態にあり得る。アンチセンス発現ベクターは組換え発現ベクターについて上述されたところの標準的トランスフェクション技術を使用して細胞中に導入する。
別の態様において、阻害剤としての使用のためのアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらがそれに対する相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断することが可能であるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒的ＲＮＡ分子である（リボザイムに関する総説については例えばＯｈｋａｗａ，Ｊ．ら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：２５１−２５８；Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．とＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２８６−２８９；Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：３０１−３０６；Ｋｉｅｈｎｔｏｐｆ，Ｍ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３：６５−７１を参照されたい）。Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡに対する特異性を有するリボザイムはＴ−ｂｅｔ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づき設計し得る。例えば、活性部位の塩基配列がＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡ中の切断されるべき塩基配列に相補的であるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば双方ともＣｅｃｈらによる米国特許第４，９８７，０７１号および同第５，１１６，７４２号明細書を参照されたい。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡを使用して特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡをＲＮＡ分子のプールから選択し得る。例えばＢａｒｔｅｌ，Ｄ．とＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照されたい。
別の態様において、ＲＮＡｉを使用してＴ−ｂｅｔ発現を阻害し得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して該ｄｓＲＮＡと同一の配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する転写後の標的を定められた遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．とＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７、２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ら Ｃｅｌｌ １０１、２５−３３（２０００）。Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３、３１９１−３１９７（１９９９））。該過程は、内因性リボヌクレアーゼがより長いｄｓＲＮＡを低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡと命名されるより短い、２１もしくは２２ヌクレオチド長のＲＮＡに切断する場合に起こる。該より小さいＲＮＡセグメントがその後、標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットが例えばニュー イングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびアムビオン（Ａｍｂｉｏｎ）から商業的に入手可能である。一態様において、アンチセンスＲＮＡでの使用のための上述された化学の１種もしくはそれ以上を使用し得る。
細胞中でＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を阻害するのに使用し得る別の型の阻害剤はＴ−ｂｅｔポリペプチドに特異的な細胞内抗体である。細胞中でポリペプチド機能を阻害するための細胞内抗体の使用は当該技術分野で既知である（例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２６３８−２６４６；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ら（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９：１０１−１０８；Ｗｅｒｇｅ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７４：１９３−１９８；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７４２７−７４２８；Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７８８９−７８９３；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ら（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：３９６−３９９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．ら（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：５９５−６０１；Ｄｕａｎ，Ｌら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５０７５−５０７９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５９３２−５９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３９３１−２３９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：６６６−６７２；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１５４２−１５５１；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３１３７−３１４１；ＭａｒａｓｃｏらによるＰＣＴ公開第ＷＯ ９４／０２６１０号明細書；およびＤｕａｎらによるＰＣＴ公開第ＷＯ ９５／０３８３２号明細書を参照されたい）。
細胞内抗体を使用してポリペプチド活性を阻害するために、細胞中へのベクターの導入に際して抗体鎖が該細胞の細胞内区画中で機能的抗体として発現されるような形態の抗体鎖をコードする組換え発現ベクターを製造する。本発明の阻害方法によるＴ−ｂｅｔ活性の阻害のために、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを特異的に結合する細胞内抗体を細胞の細胞質中で発現させる。細胞内抗体発現ベクターを製造するために、目的の標的タンパク質例えばＴ−ｂｅｔに特異的な抗体鎖をコードする抗体ＬおよびＨ鎖ｃＤＮＡを、典型的にはＴ−ｂｅｔポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離する。抗Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体もしくは組換え抗Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは上述されるとおり製造し得る。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体が同定されておりこうしたハイブリドーマ由来モノクローナル抗体を使用し得るか、もしくはコンビナトリアルライブラリーからの組換え抗体を使用し得る）、モノクローナル抗体のＬおよびＨ鎖をコードするＤＮＡを標準的分子生物学技術により単離する。ハイブリドーマ由来抗体については、ＬおよびＨ鎖ｃＤＮＡは例えばＰＣＲ増幅もしくはｃＤＮＡライブラリースクリーニングにより得ることができる。ファージディスプレイライブラリーからのような組換え抗体については、ＬおよびＨ鎖をコードするｃＤＮＡを、ライブラリースクリーニング過程の間に単離されるディスプレイパッケージ（例えばファージ）から回収し得る。ＰＣＲプライマーもしくはｃＤＮＡライブラリープローブをそれから調製し得る抗体ＬおよびＨ鎖遺伝子のヌクレオチド配列は当該技術分野で既知である。例えば、多くのこうした配列がＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号および「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースに開示されている。
一旦得られれば、抗体ＬおよびＨ鎖配列は、標準的方法を使用して組換え発現ベクター中にクローン化する。ＬおよびＨ鎖の細胞質発現を見込むために、ＬおよびＨ鎖の疎水性リーダーをコードするヌクレオチド配列を除去する。細胞内抗体発現ベクターはいくつかの異なる形態の１つの細胞内抗体をコードし得る。例えば、一態様において、該ベクターは完全長抗体を細胞内で発現させるように完全長の抗体ＬおよびＨ鎖をコードする。別の態様において、該ベクターはＦａｂフラグメントを細胞内で発現させるように完全長のＬ鎖しかしＨ鎖のＶＨ／ＣＨ１領域のみをコードする。最も好ましい態様において、該ベクターはＬおよびＨ鎖の可変領域がフレキシブルペプチドリンカー（例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）により連結されかつ一本鎖分子として発現される一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする。細胞中のＴ−ｂｅｔ活性を阻害するために、抗Ｔ−ｂｅｔ細胞内抗体をコードする発現ベクターを、上で論考されたところの標準的トランスフェクション法により細胞中に導入する。
本発明のなお別の形態の阻害剤は、本明細書でドミナントネガティブ阻害剤ともまた称される阻害性の形態のＴ−ｂｅｔ、例えば本実施例で教示されるところのｅｎｇｒａｉｌｅｄ配列を含むことにおけるＴ−ｂｅｔの１形態である。こうした分子は変えられた形態のＴ−ｂｅｔの細胞中での発現を見込むように標準的技術を使用して細胞中に導入し得る。
好ましい一態様において、Ｔ−ｂｅｔの活性および／もしくは発現を低下させる本発明の阻害化合物はまた、例えばＭＳ、関節炎、クローン病およびＴｈ１媒介性実験的大腸炎のような自己免疫疾患の発症もしくは重症度も低下させる。Ｔ−ｂｅｔの活性および／もしくは発現を低下させる本発明の阻害化合物はまた、例えば喘息およびＴｈ２媒介性大腸炎を包含する疾患の発症もしくは重症度も増大させる。
別の態様において、本発明の阻害剤はＴ−ｂｅｔタンパク質と相互作用してそれによりＴ−ｂｅｔの活性を阻害する小分子である。Ｔ−ｂｅｔの小分子阻害剤は、当該技術分野で既知の標的タンパク質部位に適合する候補について既知の三次元構造の小分子のデータベースを走査することが可能なデータベース検索プログラムを使用して同定可能である。適するソフトウェアプログラムは、例えばＣＡＴＡＬＹＳＴ（モレキュラー シミュレーションズ インク（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＵＮＩＴＹ（トライポス インク（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ．）、ミズーリ州セントルイス）、ＦＬＥＸＸ（Ｒａｒｅｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６１：４７０−４８９（１９９６））、ＣＨＥＭ−３ＤＢＳ（オックスフォード モレキュラー グループ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ）、英国オックスフォード）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １６１：２６９−２８８（１９８２））およびＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ インフォーメーション システムズ インク（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンレアンドロ）を包含する。
該検索で見出される分子は必ずしもリード化合物（ｌｅａｄｓ）それら自身でなくてもよいが、しかしながらこうした候補はさらなる設計のための枠組みとして作用して分子骨格を提供し、それに対し適切な原子置換を行うことができる。足場構造、官能基、リンカーおよび／もしくは単量体は、標的タンパク質との静電的、水素結合および疎水性相互作用を最大にするよう変えてもよい。Ｇｏｏｄｆｏｒｄ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２８：８４９−８５７（１９８５））は、結合部位の分子表面上の多様な化学的基（プローブと命名される）に対し高親和性の領域を決定することを試みるコンピュータプログラムＧＲＩＤを製造した。ＧＲＩＤは、これゆえに結合を高めるかもしれない既知のリガンドに対する修飾を示唆するための手段を提供する。静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用、脱溶媒和効果、コンホメーション障害もしくは移動性、キレート形成ならびに協同的相互作用ならびにリガンドおよび酵素の動きを包含するある範囲の因子全部が結合効果に影響し、そして小分子阻害剤を設計するための試みにおいて考慮に入れられるべきである。
Ｔ−ｂｅｔの小分子阻害剤は結合領域の下位部位（ｓｕｂｓｉｔｅ）に適合しかつ予め定義された足場構造に連結するフラグメントについて検索することを含んでなるコンピュータ支援分子設計方法を使用してもまた同定し得るを使用し得る。足場構造それ自身をこうした様式で同定してもよい。こうした官能基および単量体の検索に適するプログラムは、ＬＵＤＩ（Ｂｏｅｈｍ、Ｊ Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．６：６１−７８（１９９２））、ＣＡＶＥＡＴ（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ”、Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．の特別刊行物中Ｂａｒｔｌｅｔｔら、７８：１８２−１９６（１９８９））およびＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒら Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１：２９−３４（１９９１））を包含する。
Ｔ−ｂｅｔタンパク質の小分子阻害剤を同定するためのなお別のコンピュータ支援分子設計方法は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の活性の結合部位との所望の構造的および静電的相補性を表すことができる小分子フラグメントのアルゴリズム的結合による潜在的阻害剤のｄｅ ｎｏｖｏ合成を含んでなる。該方法論はＴ−ｂｅｔ結合部位のモデル中で一緒に反復して継ぎ合わせられる小分子の大きな一組の鋳型を使用する。このタスクに適するプログラムはＧＲＯＷ（Ｍｏｏｎら Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１：３１４−３２８（１９９１））およびＳＰＲＯＵＴ（Ｇｉｌｌｅｔら Ｊ Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．７：１２７（１９９３））を包含する。
小分子阻害剤候補の適合性は、一組の阻害剤に対する結合親和性の順位づけが可能な経験的スコアリング関数得点機能を使用して決定可能である。こうした方法の一例についてはＭｕｅｇｇｅらおよびその中の参考文献（Ｍｕｅｇｇｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：７９１−８０４（１９９９））を参照されたい。他のモデル化技術、例えばＣｏｈｅｎら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３：８８３−８９４（１９９４））；Ｎａｖｉａら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：２０２−２１０（１９９２））；Ｂａｌｄｗｉｎら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２：２５１０−２５１３（１９８９））；Ａｐｐｅｌｔら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：１９２５−１９３４（１９９１））；およびＥａｌｉｃｋら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１５４０−１１５４４（１９９１））により記述されるものを本発明により使用し得る。
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドの発現および／もしくは活性を阻害するために使用し得る他の阻害剤はＴ−ｂｅｔを直接阻害する化合物またはＴ−ｂｅｔと標的ＤＮＡもしくは別のポリペプチドとの間の相互作用を阻害する化合物を包含する。こうした化合物は上に詳細に記述されたところのこうした化合物について選択するスクリーニングアッセイを使用して同定可能である。
Ｂ．賦活剤
本発明の調節方法により、Ｔ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性は細胞を賦活剤と接触させることにより細胞中で刺激される。こうした賦活剤の例は活性のＴ−ｂｅｔポリペプチド、ならびに細胞中でのＴ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性を増大させるために細胞中に導入されるＴ−ｂｅｔをコードする核酸分子を包含する。好ましい一賦活剤はＴ−ｂｅｔポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここでは該核酸分子が細胞中での活性のＴ−ｂｅｔポリペプチドの発現に適する形態で細胞中に導入されている。細胞中でＴ−ｂｅｔをポリペプチド発現させるためには、典型的には、Ｔ−ｂｅｔをコードするＤＮＡを最初に本明細書に記述されるところの標準的分子生物学技術を使用して組換え発現ベクターに導入する。Ｔ−ｂｅｔをコードするＤＮＡは例えばＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列に基づくプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅により得ることができる。Ｔ−ｂｅｔをコードするＤＮＡの単離もしくは増幅後に、該ＤＮＡフラグメントを発現ベクターに導入し、そして本明細書に記述されるところの標準的方法により標的細胞中にトランスフェクトする。
一態様において、本発明の刺激性化合物はＴ−ｂｅｔの活性および／もしくは発現を増大させてそれにより例えばＩＬ−２プロモーターの活性化、ＩＬ−４産生の活性化を減少させ、ＴＧＦ−βの産生およびシグナル伝達ならびにＴｒ細胞の産生の増大を活性化する作用物質を包含する。別の態様において、本発明の刺激性化合物はＴ−ｂｅｔの活性および／もしくは発現を増大させてそれにより例えばＩＦＮ−γの活性化、病原となる自己抗体産生の刺激、ＩｇＧクラススイッチング、およびＣＤ８エフェクター細胞の産生を増大させる作用物質を包含する。
好ましい一態様において、Ｔ−ｂｅｔの活性および／もしくは発現を増大させる本発明の刺激性化合物はまた、例えばＭＳ、関節炎、クローン病およびＴｈ１媒介性実験的大腸炎のような自己免疫疾患の発症もしくは重症度も増大させる。Ｔ−ｂｅｔの活性および／もしくは発現を増大させる本発明の刺激性化合物はまた、例えば喘息およびＴｈ２媒介性大腸炎を包含する疾患の発症もしくは重症度も低下させる。
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドの活性を刺激するのに使用し得る他の賦活剤は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを直接刺激する化合物およびＴ−ｂｅｔと標的ＤＮＡもしくは他のポリペプチドとの間の相互作用を促進する化合物のような細胞中のＴ−ｂｅｔ活性を刺激する化合物である。こうした化合物は、上に詳細に記述されるところのこうした化合物について選択するスクリーニングアッセイを使用して同定可能である。
本発明の調節方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば作用物質とともに細胞を培養することもしくは培養物中の細胞中に作用物質を導入することにより）、あるいはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば被験体に作用物質を投与することもしくは遺伝子治療によるような被験体の細胞中に作用物質を導入することにより）実施し得る。調節方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施するためには、細胞を標準的方法により被験体から得そして本発明の調節剤とともにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベート（すなわち培養）して細胞中のＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を調節し得る。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を被験体から得そして例えばフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／ハイパーク（Ｈｙｐａｑｕｅ）を用いる密度勾配遠心分離により単離し得る。標準的方法を使用して特定の細胞集団を枯渇もしくは濃縮し得る。例えば、Ｔ細胞は例えばＴ細胞表面マーカーに対する抗体を使用するポジティブ選択により、例えば細胞を特異的一次モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とともにインキュベートすること、次いで該一次ｍＡｂを結合する二次抗体で被覆した磁性ビーズを使用するｍＡｂを結合する細胞の単離により濃縮し得る。特定の細胞集団は標準的方法に従った蛍光標示式細胞分取によってもまた単離し得る。所望の場合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明の調節剤で処理した細胞を被験体に再投与し得る。被験体への投与のために、被験体にそれらを投与する前に、培養物中の残余の作用物質を細胞から最初に除去することが好ましいかもしれない。これは例えば細胞のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／ハイパーク（Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配遠心分離により行い得る。細胞のｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子改変、次いで被験体への再投与のさらなる論考についてはＷ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎらによる米国特許第５，３９９，３４６号明細書もまた参照されたい。
核酸を含んでなる賦活もしくは阻害剤（Ｔ−ｂｅｔポリペプチドをコードする組換え発現ベクター、アンチセンスＲＮＡ、細胞内抗体もしくはドミナントネガティブ阻害剤を包含する）については、該作用物質はｉｎ ｖｉｖｏで細胞中に核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための当該技術分野で既知の方法を使用して被験体の細胞中に導入し得る。こうした方法の例は以下を包含する非ウイルスおよびウイルス双方の方法を包含する。すなわち、
直接注入：裸のＤＮＡは細胞中に該ＤＮＡを直接注入することによりｉｎ ｖｉｖｏで細胞中に導入し得る（例えばＡｃｓａｄｉら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：８１５−８１８；Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−１４６８を参照されたい）。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞中にＤＮＡを注入するための送達装置（例えば「遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）」）を使用し得る。こうした装置は商業的に入手可能である（例えばバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）から）。
陽イオン性脂質：裸のＤＮＡは、ＤＮＡを陽イオン性脂質と複合体形成することもしくはＤＮＡを陽イオン性リポソーム中に被包化することによりｉｎ ｖｉｖｏで細胞中に導入可能である。適する陽イオン性脂質処方の例は、塩化Ｎ−［−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）ならびに１：１のモル比の臭化１，２−ジミリスチルオキシ−プロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を包含する（例えばＬｏｇａｎ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：３８−４９；Ｓａｎ，Ｈ．ら（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：７８１−７８８を参照されたい）。
受容体媒介性のＤＮＡ取込み：裸のＤＮＡは、細胞表面受容体のリガンドに結合されているポリリシンのような陽イオンと該ＤＮＡを複合体形成させることによってもまたｉｎ ｖｉｖｏで細胞中に導入し得る（例えばＷｕ，Ｇ．とＷｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；および米国特許第５，１６６，３２０号明細書を参照されたい）。受容体へのＤＮＡ−リガンド複合体の結合は受容体媒介性のエンドサイトーシスによるＤＮＡの取込みを助長する。通常はエンドソームを混乱させてそれにより物質を細胞質中に放出するアデノウイルスキャプシドに連結させたＤＮＡ−リガンド複合体を使用して細胞内リソゾームによる複合体の分解を回避することができる（例えばＣｕｒｉｅｌら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８８５０；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２１２２−２１２６を参照されたい）。
レトロウイルス：欠損レトロウイルスは遺伝子治療の目的上の遺伝子移入での使用について十分に特徴づけられている（総説についてはＭｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１を参照されたい）。レトロウイルスゲノムに組込まれた目的のヌクレオチド配列を有する組換えレトロウイルスを構築し得る。加えて、レトロウイルスゲノムの部分を除去して該レトロウイルスを複製欠損とすることができる。その後、該複製欠損レトロウイルスがビリオン中にパッケージングされ、標準的技術によりヘルパーウイルスの使用により標的細胞を感染させるのにこれを使用することが可能である。組換えレトロウイルスを製造するためおよび細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでこうしたウイルス感染させるためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）グリーン パブリッシング アソシエーツ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、（１９８９）、第９．１０〜９．１４節および他の標準的実験室手引き書に見出し得る。適するレトロウイルスの例はｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭを包含しこれらは当業者に公知である。適するパッケージングウイルス系統の例は、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍを包含する。レトロウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／もしくはｉｎ ｖｉｖｏで上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を包含する多くの異なる細胞型に多様な遺伝子を導入するのに使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓとＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙら（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；Ｄａｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願第ＷＯ ８９／０５３４５号；およびＰＣＴ出願第ＷＯ ９２／０７５７３号明細書を参照されたい）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノム（およびそれ中に挿入された外来核酸）が宿主ゲノム中に組込まれて核酸を細胞中に安定に導入するために標的細胞の分裂を必要とする。従って標的細胞の複製を刺激する必要があるかもしれない。
アデノウイルス：それが目的の遺伝子産物をコードかつ発現するがしかし通常の溶解性ウイルスの生活環において複製するその能力に関して不活性化されているようなアデノウイルスのゲノムを操作し得る。例えばＢｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ ｄｌ３２４もしくは他の株のアデノウイルス（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適するアデノウイルスベクターが当業者に公知である。組換えアデノウイルスは、それらが有効な遺伝子送達ベヒクルとなるのに細胞を分裂させることを必要とせずかつ気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）上に引用される）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６４８２−６４８６）、肝細胞（ＨｅｒｚとＧｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８１２−２８１６）および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２５８１−２５８４）を包含する広範な細胞型を感染させるのに使用し得るために有利である。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含有される外来ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノム中に組込まれないがしかしエピソームのまま留まり、それにより導入されたＤＮＡが宿主ゲノム中に組込まれたようになる（例えばレトロウイルスＤＮＡ）状況で挿入突然変異誘発の結果として起こり得る潜在的な問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡにとってアデノウイルスゲノムの運搬能力は他の遺伝子送達ベクターに関して大きい（８キロ塩基まで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら 上に引用される；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄとＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。現在使用中の大部分の複製欠損アデノウイルスベクターはウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部もしくは一部について欠失されているがしかしアデノウイルスの遺伝物質の約８０％を保持している。
アデノ随伴ウイルス：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は効率的な複製および生産的生活環のためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルスもしくはヘルペスウイルスのような別のウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである。（総説についてはＭｕｚｙｃｚｋａら Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９を参照されたい）。それはまた非分裂細胞中にそのＤＮＡを組込みうる数種のウイルスの１つでもあり、そして、高頻度の安定な組込みを表す（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照されたい）。ＡＡＶの約３００塩基対を含有するベクターがパッケージングされ得かつ組込み得る。外因性のＤＮＡのための空間は約４．５ｋｂに制限されている。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０に記述されるもののようなＡＡＶベクターを使用して細胞中にＤＮＡを導入し得る。多様な核酸がＡＡＶベクターを使用して多様な細胞型中に導入されている（例えばＨｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照されたい）。
特定の発現ベクター系および細胞中への核酸導入方法の効力は当該技術分野で慣例に使用される標準的アプローチにより評価が可能である。例えば、細胞中に導入されたＤＮＡはフィルターハイブリダイゼーション技術（例えばサザンブロッティング）により検出可能であり、また、導入されたＤＮＡの転写により産生されたＲＮＡは例えばノーザンブロッティング、ＲＮアーゼ保護もしくは逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出可能である。遺伝子産物は適するアッセイにより、例えば特定の抗体を用いるような産生されたタンパク質の免疫学的検出、もしくは該遺伝子産物の機能的活性を検出するための機能アッセイにより検出可能である。
好ましい一態様において、Ｔ−ｂｅｔをコードするレトロウイルス発現ベクターを使用してｉｎ ｖｉｖｏで細胞中でＴ−ｂｅｔポリペプチドを発現させてそれによりＴ−ｂｅｔポリペプチド活性をｉｎ ｖｉｖｏで刺激する。こうしたレトロウイルスベクターは当該技術分野で既知の標準的方法に従って製造し得る（上でさらに論考された）。
化合物のような調節剤は製薬学的組成物として被験体に投与し得る。こうした組成物は典型的に調節剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる。本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は製薬学的投与と適合性のいかなるおよび全部の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを包含することを意図している。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および作用物質の使用は当該技術分野で公知である。いずれかの慣習的媒体もしくは作用物質が有効成分と不適合性である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が企図されている。補助的有効成分もまた組成物中に組込み可能である。製薬学的組成物は小区分ＩＶで上述されたとおり製造し得る。
本明細書に記述されるＴｈ１細胞の発生のおよびＴｈ２表現型の抑制における重要な調節物質としてのＴ−ｂｅｔの同定は、本発明の調節方法を使用する多様な臨床状況におけるＴ細胞サブセットの選択的操作を見込む。本発明の刺激方法（すなわちＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を高める賦活剤を使用する方法）は、Ｔｈ１応答の付随する促進ならびにＩＬ−２およびＩＬ−４双方のダウンレギュレーション（従ってＴｈ２応答をダウンレギュレートすること）を伴いＩＦＮ−γの産生をもたらす。対照的に、本発明の阻害方法（すなわちＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性をダウンレギュレートする阻害剤を使用する方法）は、Ｔｈ１応答の付随するダウンレギュレーションおよびＴｈ２応答の促進を伴いＩＦＮ−γの産生を阻害する。従って、Ｔｈ１応答が有益である疾患状態を治療するために、Ｔｈ２応答をダウンレギュレートしつつＴｈ１応答が促進されるような本発明の刺激方法が選択される。あるいは、Ｔｈ２応答が有益である疾患状態を治療するために、Ｔｈ２応答を促進しつつＴｈ１応答がダウンレギュレートされるような本発明の阻害方法が選択される。疾患もしくは状態の処置への本発明の方法の応用は、該状態の治癒、長期もしくは短期いずれかの該状態と関連する症状の型もしくは数の減少（すなわち状態の軽減）または単純に被験体に対する一過性の有益な影響をもたらすかもしれない。
優勢なＴｈ１もしくはＴｈ２型応答を伴う多数の疾患もしくは状態が同定されており、そして該疾患状態に罹っている個体に装備された応答の型の調節によって利益を得ることができる。こうした疾患もしくは状態への本発明の免疫調節方法の応用を下にさらに詳細に記述する。
Ａ．アレルギー
アレルギーは、その産生がＴｈ２細胞の活性およびそれにより産生されるサイトカインにより調節されるＩｇＥ抗体により媒介される。アレルギー反応では、ＩＬ−４がＴｈ２細胞により産生され、これはＩｇＥ抗体の産生ならびにアレルギー反応を媒介する細胞すなわち肥満細胞および好塩基球の活性化をさらに刺激する。ＩＬ−４はまた好酸球媒介性の炎症反応でも重要な役割を演じる。従って、病原となるＩｇＥ抗体の産生をダウンレギュレートする手段としてアレルギー患者におけるＴｈ２関連サイトカインおよびとりわけＩＬ−４の産生を阻害するのに本発明の刺激方法を使用し得る。賦活剤は被験体に直接投与してよいか、または細胞（例えばＴｈｐ細胞もしくはＴｈ２細胞）を被験体から得、ｅｘ ｖｉｖｏで賦活剤と接触させそして被験体に再投与してもよい。さらに、ある状況においては、賦活剤、もしくはアレルゲン特異的応答を阻害（例えば脱感作）するよう賦活剤で処理した細胞と一緒にアレルゲンを被験体に共投与することが有益であるかもしれない。該処置は、Ｔｈ１型応答をさらに刺激するのに十分な量のサイトカインＩＬ−１２もしくはＴｈ２関連サイトカインに対する抗体（例えば抗ＩＬ−４抗体）のような他のＴｈ１促進剤をアレルギーの被験体に投与することによりさらに高められるかもしれない。
Ｂ．癌
Ｔｈ２を促進するサイトカインの発現が癌患者で上昇されることが報告されており（例えばＹａｍａｍｕｒａ，Ｍ．ら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１００５−１０１０；Ｐｉｓａ，Ｐ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７７０８−７７１２を参照されたい）、また、悪性疾患は疾患の経過の悪化と一緒にＴｈ１型応答からＴｈ２型応答への移動をしばしば伴う。従って、本発明の刺激方法は、Ｔｈ１からＴｈ２への移動を打ち消しかつそれにより癌患者における進行中のＴｈ１応答を促進して疾患の経過を改善する手段として、癌患者におけるＴｈ２関連サイトカインの産生を阻害するのに使用し得る。該刺激方法は、癌を伴う被験体への賦活剤の直接投与、または被験体から得られた細胞（例えばＴｈｐもしくはＴｈ２細胞）の賦活剤でのｅｘ ｖｉｖｏ処置、次いで該細胞の被験体への再投与のいずれかを必要とする可能性がある。該処置は、Ｔｈ１型応答をさらに刺激するのに十分な量のサイトカインＩＬ−１２もしくはＴｈ２関連サイトカインに対する抗体（例えば抗ＩＬ−４抗体）のような他のＴｈ１促進剤をレシピエントに投与することによりさらに高められるかもしれない。
Ｃ．感染性疾患
Ｔｈ２を促進するサイトカインの発現は、ＨＩＶ感染症、結核、リーシュマニア症、住血吸虫病、糸状線虫感染症および腸管寄生線虫感染症を包含する多様な感染性疾患の間に増大することもまた報告されており（例えば；Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｇ．Ｍ．とＣｌｅｒｉｃｉ，Ｍ．（１９９２）Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５４：２１−４３；Ｃｌｅｒｉｃｉ，Ｍ．とＳｈｅａｒｅｒ，Ｇ．Ｍ．（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １４：１０７−１１１；Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：６１７−６２３；Ｌｏｃｋｓｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．とＳｃｏｔｔ，Ｐ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １：Ａ５８−Ａ６１；Ｐｅａｒｃｅ，Ｅ．Ｊ．ら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１５９−１６６；Ｇｒｚｙｃｈ，Ｊ−Ｍ．ら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１３２２−１３２７；Ｋｕｌｌｂｅｒｇ，Ｍ．Ｃ．ら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３２６４−３２７０；Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ａ．Ｊ．ら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１３９５−１４０２；Ｐｅａｒｌｍａｎ，Ｅ．ら（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：１１０５−１１１２；Ｅｌｓｅ，Ｋ．Ｊ．ら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：３４７−３５１を参照されたい）、そしてこうした感染性疾患もまた免疫応答のＴｈ１からＴｈ２への移動を伴う。従って、本発明の刺激方法は、Ｔｈ１からＴｈ２への移動を打ち消しかつそれにより患者における進行中のＴｈ１応答を促進して疾患の経過を改善する手段として感染性疾患を伴う被験体におけるＴｈ２関連サイトカインの産生を阻害するのに使用し得る。該刺激方法は、感染性疾患を伴う被験体への阻害剤の直接投与、または被験体から得られた細胞（例えばＴｈｐもしくはＴｈ２細胞）の賦活剤でのｅｘ ｖｉｖｏ処置、次いで該細胞の被験体への再投与のいずれかを必要とする可能性がある。該処置は、Ｔｈ１型応答をさらに刺激するのに十分な量のサイトカインＩＬ−１２もしくはＴｈ２関連サイトカインに対する抗体（例えば抗ＩＬ−４抗体）のような他のＴｈ１促進剤をレシピエントに投与することによりさらに高められるかもしれない。
Ｄ．自己免疫疾患
本発明の阻害方法はＴｈ２型の機能不全を伴う自己免疫疾患の処置において治療的に使用し得る。多くの自己免疫障害は自己組織に対し反応性でありかつ該疾患の病理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するＴ細胞の不適切な活性化の結果である。Ｔヘルパー型応答の調節は自己免疫疾患の経過に対する影響を有する可能性がある。例えば、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、疾患の誘導の時点でのＩＬ−４の投与によるＴｈ２型応答の刺激は該自己免疫疾患の強度を減少させる（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．ら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７６：２４１−２５１）。さらに、疾患からの動物の回復は、Ｔｈ２特異的サイトカインの増大により明示されるところのＴｈ２型応答の増大を伴うことが示されている（Ｋｏｕｒｙ，Ｓ．Ｊ．ら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１３５５−１３６４）。さらに、ＥＡＥを抑制し得るＴ細胞はＴｈ２特異的サイトカインを分泌する（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：１４７−１５４）。ＥＡＥにおけるＴｈ２型応答の刺激は該疾患に対する保護効果を有するため、多発性硬化症（ＥＡＥはそのモデルである）を伴う被験体におけるＴｈ２応答の刺激は治療上有益であることがありそうである。本発明の阻害方法はこうした減少を遂げるために使用し得る。
同様に、マウスのＩ型糖尿病におけるＴｈ２型応答の刺激は該疾患に対する保護効果を提供する。事実、ＩＬ−４（Ｔｈ２応答を促進する）でのＮＯＤマウスの処置はこれらのマウスで通常発症するＩ型糖尿病の発症を予防するかもしくは遅らせる（Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：８７−９９）。従って、糖尿病に罹っているもしくはそれに罹りやすい被験体におけるＴｈ２応答の刺激は該疾患の影響を改善するかもしくは該疾患の発症を阻害するかもしれない。
Ｔｈ２型応答の刺激が有益であるかもしれないなお別の自己免疫疾患は慢性関節リウマチ（ＲＡ）である。研究は、慢性関節リウマチを伴う患者が滑膜組織中で顕著にＴｈ１細胞を有することを示した（Ｓｉｍｏｎ，Ａ．Ｋ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８５６２−８５６６）。ＲＡを伴う被験体においてＴｈ２応答を刺激することにより、有害なＴｈ１応答が付随してダウンレギュレートされてそれにより該疾患の影響を改善する可能性がある。
従って、本発明の阻害方法を使用して、Ｔｈ２型応答が疾患の経過に対し有益である自己免疫疾患に罹っているもしくはそれに罹りやすい被験体におけるＴｈ２関連サイトカインの産生を刺激し得る。該阻害方法は、被験体への阻害剤の直接投与、または被験体から得られた細胞（例えばＴｈｐ、Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、非リンパ系細胞）の阻害剤でのｅｘ ｖｉｖｏ処置、次いで該細胞の被験体への再投与のいずれかを必要とする可能性がある。該処置は、Ｔｈ２型応答をさらに刺激するのに十分な量のＩＬ−４それ自身もしくはＴｈ１関連サイトカインに対する抗体のような他のＴｈ２促進剤を被験体に投与することによりさらに高められるかもしれない。
Ｔｈ２応答が望ましい上述された自己免疫疾患と対照的に、他の自己免疫疾患はＴｈ１型応答により改善されるかもしれない。こうした疾患は本発明の賦活剤（癌および感染性疾患について上述されたところの）を使用して治療し得る。該処置は、Ｔｈ１型応答をさらに刺激するのに十分な量のＴｈ１を促進するサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）を被験体に投与することによりさらに高められるかもしれない。
自己免疫疾患を治療するための作用物質の有効性は、ヒト疾患の上述された動物モデル（例えば多発性硬化症のモデルとしてのＥＡＥおよび糖尿病のモデルとしてのＮＯＤマウス）もしくはヒト自己免疫疾患の他の十分に特徴づけられた動物モデルで試験し得る。こうした動物モデルは紅斑性狼瘡のモデルとしてのｍｒｌ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス、慢性関節リウマチのモデルとしてのマウスコラーゲン誘発性関節炎およびマウス実験的重症筋無力症を包含する（Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、レイバン プレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８９、ｐｐ．８４０−８５６を参照されたい）。本発明の調節（すなわち賦活もしくは阻害）剤を試験動物に投与し、そして該試験動物における疾患の経過をその後、使用されている特定のモデルについての標準的方法によりモニターする。調節剤の有効性は、未処理の動物（もしくは対照作用物質で処理された動物）と比較しての該作用物質で処理された動物における疾患状態の改善により明示される。
本発明により治療されうる自己免疫成分を有する自己免疫疾患、障害および状態の制限しない例は、糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を包含する）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を包含する）、乾癬、シェーグレン症候群に続発性の乾性角結膜炎を包含するシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物の咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、化合物発疹、らい境界反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴覚障害、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーヴス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎ならびに間隙性肺線維症を包含する。
特定の一態様において、本発明の方法により治療されうる疾患、障害および状態は、ヒトにおける炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の２つの主要な形態であるクローン病および潰瘍性大腸炎を包含する。Ｔリンパ球により産生されるサイトカインが慢性の腸の炎症を開始かつ永続させるようである。クローン病はＩＦＮ−γおよびＴＮＦのようなＴヘルパー１（Ｔｈ１）型サイトカインの増大された産生を伴う。潰瘍性大腸炎は一般に大量のＴｈ２型サイトカインを産生するＴ細胞を伴い、そして本明細書で「Ｔｈ２媒介性大腸炎」と称される。「Ｔｈ１媒介性大腸炎」は、クローン病の特徴ならびに潰瘍永大腸炎で起こり得るＴｈ１型応答を指す。Ｔｈ１媒介性大腸炎においてはＴ−ｂｅｔの活性を阻害する作用物質が保護効果を提供する。Ｔｈ２媒介性大腸炎においてはＴ−ｂｅｔの活性を刺激する作用物質が保護効果を提供する。
別の特定の態様において、本発明の方法により治療されうる疾患、障害および状態は喘息を包含し、これはこれらの気道の狭窄を特徴とする気管支管もしくは肺の気道の疾患である。ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生が喘息様表現型の発生と関連づけられている。従って、Ｔ−ｂｅｔの活性を刺激する本発明の作用物質は喘息に対する保護効果を提供する。
Ｅ．移植
移植片拒絶もしくは移植片受容は移植片レシピエントにおけるの特定の１Ｔ細胞サブセット（すなわちＴｈ１もしくはＴｈ２細胞）の作用に独占的に帰されないかもしれない（論考について、Ｄａｌｌｍａｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６３２−６３８を参照されたい）一方、多数の研究が、長期の移植片生存における優勢なＴｈ２応答もしくは移植片拒絶における優勢なＴｈ１応答を意味している。例えば、移植片受容はＴｈ２サイトカインパターンの産生を伴い、かつ／もしくは移植片拒絶はＴｈ１サイトカインパターンの産生を伴う（例えばＴａｋｅｕｃｈｉ，Ｔ．ら（１９９２）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５３：１２８１−１２９１；Ｔｚａｋｉｓ，Ａ．Ｇ．ら（１９９４）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２９：７５４−７５６；Ｔｈａｉ，Ｎ．Ｌ．ら（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５９：２７４−２８１を参照されたい）。加えて、Ｔｈ２サイトカイン表現型を有する細胞の養子移入は皮膚移植片の生存を延長させ（Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：８５５−８６２）かつ対宿主性移植片病を低下させる（Ｆｏｗｌｅｒ，Ｄ．Ｈ．ら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ ８４：３５４０−３５４９；Ｆｏｗｌｅｒ，Ｄ．Ｈ．ら（１９９４）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３８９：５３３−５４０）。なおさらに、Ｔｈ２分化を促進するＩＬ−４の投与は心同種移植片の生存を延長させる（Ｌｅｖｙ，Ａ．Ｅ．とＡｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：４０５−４０６）一方、抗ＩＬ−１０抗体（Ｔｈ１分化を促進する）とともにのＩＬ−１２の投与は皮膚同種移植片の拒絶を高める（Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９５）Ｔｌａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：１３３７−１３４１）。
従って、本発明の阻害方法を使用して、移植レシピエントにおけるＴｈ２関連サイトカインの産生を刺激して移植片の生存を延長させ得る。該阻害方法は充実性臓器移植および骨髄移植（例えば対宿主性移植片病を阻害するための）双方で使用し得る。該阻害方法は、移植レシピエントへの阻害剤の直接投与、または被験体から得られた細胞（例えばＴｈｐ、Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、非リンパ系細胞）の阻害剤でのｅｘ ｖｉｖｏ処置、次いで該細胞の被験体への再投与のいずれかを必要とする可能性がある。該処置は、Ｔｈ２型応答をさらに阻害するのに十分な量のＩＬ−４それ自身もしくはＴｈ１関連サイトカインに対する抗体のような他のＴｈ２促進剤をレシピエントに投与することによりさらに高められるかもしれない。
前述の疾患状況に加え、本発明の調節方法は他の目的上もまた有用である。例えば、本発明の刺激方法（すなわち賦活剤を使用する方法）を使用してＴｈ１を促進するサイトカイン（例えばインターフェロン−γ）の商業的生産のためにｉｎ ｖｉｔｒｏでのこれらのサイトカインの産生を刺激し得る（例えば、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで賦活剤と接触させてインターフェロン−γ産生を刺激することができ、そして、インターフェロン−γを培養上清から回収し、必要な場合はさらに精製しかつ商業的使用のため包装し得る）。
さらに、本発明の調節方法は被験体における目的の抗原に対するＴｈ１もしくはＴｈ２いずれかの応答を促進するためのワクチン接種に応用可能である。すなわち、本発明の作用物質はＴｈ１応答もしくはＴｈ２応答いずれかに対するワクチンに免疫応答を向けるためのアジュバントとして作用し得る。例えば、目的の抗原に対する抗体応答を促進するために（すなわちワクチン接種の目的上）、本発明の抗原および阻害剤を被験体に共投与して被験体における該抗原に対するＴｈ２応答を促進することが可能である。Ｔｈ２応答は効率的なＢ細胞援助（ｈｅｌｐ）を提供しかつＩｇＧ１産生を促進するためである。あるいは、目的の抗原に対する細胞性免疫応答を促進するために、本発明の抗原および賦活剤を被験体に共投与して被験体における該抗原に対するＴｈ１応答を促進することが可能である。Ｔｈ１応答は細胞媒介性免疫応答（例えば遅延型過敏性応答）の発生に好都合であるためである。目的の抗原および調節剤は一緒に単一の製薬学的組成物もしくは別個の組成物に処方し得る。好ましい一態様において、目的の抗原および調節剤は被験体に同時に投与する。あるいは、ある状況では抗原を最初にそしてその後調節剤を投与することが望ましいかもしれないか、もしくは逆もまた真である（例えば、Ｔｈ１応答を天然に惹起する抗原の場合、最初に該抗原を単独で投与してＴｈ１応答を刺激し、そしてその後阻害剤を単独でもしくは抗原の追加免疫と一緒に投与して免疫応答をＴｈ２応答に移動させることが有益であるかもしれない）。
本発明は以下の実施例によりさらに具体的に説明され、これらは制限するとして解釈されるべきでない。本出願を通じて引用される全部の参考文献、特許および公開特許出願の内容はこれにより引用することにより組み込まれる。加えて、本明細書に引用される公的データベースに寄託された全部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列もまたこれにより引用することにより組み込まれる。
ｐＪＧ４−５ベクターのＥｃｏＲＩ部位にクローン化したマウスＴ−ｂｅｔ ｃＤＮＡを含んでなる核酸分子は１９９９年１１月９日にアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（バージニア州マナサス）に寄託され、そして寄託番号ＰＴＡ−９３０を割り当てられた。ＰＣＲ ２．１−ＴＯＰＯベクター中にクローン化したヒトＴ−ｂｅｔ ｃＤＮＡ（ヒトＴｈ１クローンＲＯＴ−１０からのＲＮＡから調製した）を含んでなる核酸分子は２０００年１月２８日にアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（バージニア州マナサス）に寄託され、そして寄託番号ＰＴＡ−１３３９を割り当てられた。双方の寄託はブダペスト条約の規定の下になされた。
Ｖ．本発明のキット
本発明の別の局面は、本発明のスクリーニングアッセイ、調節方法もしくは診断アッセイを実施するためのキットに関する。例えば、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットは、Ｔ−ｂｅｔを含有する指標組成物、読み出し（例えばポリペプチド分泌）を測定するための手段、およびＴ−ｂｅｔの生物学的影響の調節物質を同定するためのキットの使用説明書を包含し得る。別の態様において、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットはＴ−ｂｅｔ欠損細胞、読み出しを測定するための手段およびＴ−ｂｅｔの生物学的影響の調節物質を同定するためのキットの使用説明書を含んでなる。
別の態様において、本発明は本発明の調節方法を実施するためのキットを提供する。該キットは、例えばＴ−ｂｅｔの生物学的影響を調節するための調節物質の使用説明書とともに、適する担体中のかつ適する容器中に包装された本発明の調節剤（例えばＴ−ｂｅｔ阻害もしくは賦活剤）を包含し得る。
本発明の別の局面は被験体におけるＴ−ｂｅｔの生物学的活性と関連する障害を診断するためのキットに関する。該キットは、Ｔ−ｂｅｔの発現を測定するための試薬（例えばＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡを検出するための核酸プローブもしくはＴ−ｂｅｔポリペプチドの検出のための抗体）、被験体の結果を比較する対照および診断目的上の該キットの使用説明書を包含し得る。
ＶＩ．免疫調節組成物
Ｔ−ｂｅｔの発現、プロセシング、翻訳後修飾もしくは活性を調節する作用物質は免疫調節組成物での使用にもまた適切である。本発明の賦活もしくは阻害剤は被験体における免疫応答をアップもしくはダウンレギュレートするのに使用可能である。好ましい態様において、体液性免疫応答が調節される。
Ｔ−ｂｅｔ調節剤は単独で、またはそれに対する高められた免疫応答もしくは低下された免疫応答が望ましい抗原とともに投与し得る。
別の態様において、既知のアジュバントである作用物質を主題の調節剤とともに投与可能である。現時点で、ヒトで広範に使用されている唯一のアジュバントはミョウバン（リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム）である。サポニンおよびその精製された成分Ｑｕｉｌ Ａ、フロイントの完全アジュバントならびに研究および獣医学の応用で使用される他のアジュバントがヒトワクチンにおける潜在的使用を有する。しかしながらムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡ、Ｇｏｏｄｍａｎ−Ｓｎｉｔｋｏｆｆら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０−４１５（１９９１）により記述されるもののようなリン脂質複合物、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤、酵素阻害剤は膵トリプシンインヒビターを包含する、フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＥＰ）およびトラシロールのような新たな化学的に定義された製剤もまた使用し得る。抗原が投与される態様においては、抗原は例えばＭｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１７３９−１７４４（１９９２）により記述されかつ本明細書で引用することにより組み込まれるところのプロテオリポソーム内に、もしくはノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）ＴＭ脂質小胞（マイクロ ベシキュラー システムズ インク（Ｍｉｃｒｏ Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ニューハンプシャー州ナシュア）のような脂質小胞中に被包化して免疫応答をさらに高めることができる。
一態様において、Ｔ−ｂｅｔ分子もしくはその部分をコードする核酸分子をＤＮＡワクチンとして投与する。これはレポーターもしくは治療的遺伝子の送達に用いられるものに類似であるプラスミドＤＮＡ構築物を使用して行うことができる。こうした構築物は、好ましくは、大量の該プラスミドＤＮＡの増幅を可能にする細菌の複製起点；原核生物の選択可能なマーカー遺伝子；Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはその部分をコードする核酸配列；宿主細胞中での遺伝子発現を指図する真核生物転写調節要素；および発現されるｍＲＮＡの適切な終了を確実にするポリアデニル化配列を含んでなる（Ｄａｖｉｓ．１９９７．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：６５３）。ＤＮＡ免疫感作に使用されるベクターは場合によってはシグナル配列を含んでもよい（Ｍｉｃｈｅｌら １９９５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．９２：５３０７；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら １９９６．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１７３：３１４）。ＤＮＡワクチンは多様な手段により、例えば注入により（例えば、筋肉内、皮内、もしくは皮膚中に粒子を注入するのに粒子加速器もしくは加圧ガスを使用する遺伝子銃を用いる表皮中へのＤＮＡ被覆された金粒子の微粒子銃注入（Ｈａｙｎｅｓら １９９６．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：３７））投与し得る。あるいは、ＤＮＡワクチンは非侵襲的手段により投与し得る。例えば純粋なもしくは脂質で処方されたＤＮＡは、呼吸器系に送達し得るか、もしくはＤＮＡの経口送達により別の場所に（例えばＰｅｙｅｒｓ貼付剤）標的を定めることができる（Ｓｃｈｕｂｂｅｒｔ．１９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：９６１）。弱毒化微生物は粘膜表面への送達に使用し得る。（Ｓｉｚｅｍｏｒｅら １９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７０：２９）。
一態様において、ＤＮＡワクチン接種のためのプラスミドは、Ｔ−ｂｅｔ、ならびにそれに対し免疫応答が望ましい抗原を発現し得るか、またはリンホカイン遺伝子もしくは共刺激分子のような免疫応答の調節物質をコードし得る（Ｉｗａｓａｋｉら １９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４５９１）。
例えば本明細書の別の場所に記述されるかもしくは当該技術分野で既知のところのＴ−ｂｅｔの他の発現手段もまた使用し得る。例えば、別の態様において、レトロウイルスベクターもまたＴ−ｂｅｔ免疫調節組成物の発現に適切である。組換えレトロウイルスベクターは宿主細胞ゲノム中へのトランスジーンの組込みを見込む。分裂細胞に形質導入するために、レンチウイルスベクターを免疫調節組成物として使用することができ、そして、本発明により包含することを意図している。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、それらのより高レベルの複雑さに基づけば、潜伏感染の経過でのように非増殖細胞のゲノム中に組込みかつそれらの生活環を調節し得る。これらのウイルスはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶを包含する。他のレトロウイルスと同様、レンチウイルスはｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有し、それらは２個の末端反復配列（ＬＴＲ）の配列により隣接される。これらの遺伝子のそれぞれは、最初は１個の前駆体ポリタンパク質として発現される複数のポリペプチドをコードする。ｇａｇ遺伝子は内的構造（マトリックスキャプシドおよびヌクレオキャプシド）ポリペプチドをコードする。ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡに指図されるＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素、組込み酵素およびプロテアーゼ）をコードする。ｅｎｖ遺伝子はウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードし、そして付加的にウイルスＲＮＡの核輸出を司るシス作用性エレメント（ＲＲＥ）を含有する。５’および３’ＬＴＲはビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するようはたらき、かつ、ウイルス複製に必要な全部の他のシス作用性配列を含有する。ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子中への効率的な被包化（Ｐｓｉ部位）に必要な配列が５’ＬＴＲに隣接する。被包化（すなわちレトロウイルスＲＮＡの感染性ビリオンへのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠けている場合、該結果はゲノムＲＮＡの被包化を予防するシス欠損である。しかしながら、生じる突然変異体は全ビリオンタンパク質の合成を指図することがなお可能である。ＨＩＶのようなレンチウイルスの包括的な総説は例えばＦｉｅｌｄ’ｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（レイバン パブリッシャーズ（Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編、１９９６に提供されている。
本発明は以下の実施例によりさらに具体的に説明され、これらは制限すると解釈されるべきでない。本出願を通じて引用される全部の参考文献、特許および公開特許出願の内容、ならびに図および配列表は引用することにより本明細書に組み込まれる。
以下の実験手順を本実施例で使用した：
マウス、細胞系、サイトカイン、抗体およびプラスミド
ＢＡＬＢ／ｃマウスはジャクソン ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から得、ＤＯ１１．１０ ＴｃＲトランスジェニックマウス（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら １９９５．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１、１７５５−１７６２）およびＭＢＰ−ＴｃＲトランスジェニックマウス（Ｌａｆａｉｌｌｅ，Ｊ．Ｊ．、１９９４．Ｃｅｌｌ ７８、３９９−４９８．）は記述されている。マウスは第５〜６週齢で使用した。加えて、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）およびＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜８週齢）をタコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ）（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入した。Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスの生成およびスクリーニングは記述されており（４４、４６）；そして使用したマウスはＢ６およびＢＡＬＢ／ｃ背景で最低６世代戻し交雑した。
細胞系および初代細胞は、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン ラボラトリーズ（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０□ｇ／ｍｌ）、Ｈｅｐｅｓ（１００ｍＭ）およびβ−ＭＥ（５０μＭ）を補充したＲＰＭＩ １６４０を含有する完全培地中で維持した。ＪｕｒｋａｔはヒトＴｈ１リンパ腫、ＥＬ４はマウスＴｈＯ胸腺腫、ＮＫ３．３はヒトＮＫ細胞系（Ｙｅ，Ｊ．、１９９５．Ｊ．Ｌｅｕｋｏ．Ｂｉｏｌ．５８、２２５−２３３．；Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ，Ｊ．、１９８２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９、２８３１−２８３７）、ＹＴはヒトＮＫ細胞系（Ｙｏｄｏｉ，Ｊ．、１９８５．Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ．１３４、１６２３−１６３０）、ＡＥ７はマウスＴｈ１クローン、Ｄ１０はマウスＴｈ２クローンであり、そしてＭ１２はＢ細胞リンパ腫系統である。組換えＩＬ−４はＤＮＡＸから得、ヒトｒＩＬ−２はカイロン コープ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）から得、ｒＩＬ−１２はホフマン ラロシュ（Ｈｏｆｆｍａｎ ＬａＲｏｃｈｅ）から得、そしてｒＩＬ−１８はペプロテック インク（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）から購入した。モノクローナル抗ＩＬ−１２、モノクローナル抗ＩＦＮ−γおよびモノクローナル抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１）もまた使用した（Ｏｈａｒａ，Ｊ．とＰａｕｌ，Ｗ．Ｅ．１９８５．Ｎａｔｕｒｅ ３１５、３３３−３３６）。ウサギ中で生じさせたＴ−ｂｅｔポリクローナル抗血清およびｍＡｂ双方は、完全長の組換えの細菌で産生されたＴ−ｂｅｔに対して生じさせた。ｍＡｂはマウスからの脾細胞のＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫への融合により製造し、そしてＩｇＧ１サブタイプのものである。発現プラスミドはｃ−Ｍａｆ（ｐＭｅｘ−ｍａｆ）（Ｈｏ，Ｉ−Ｃ．ら １９９６．Ｃｅｌｌ ８５、９７３−９８３．）。ＮＦＡＴｐ（Ｈｏｄｇｅ，Ｍ．Ｒ．ら １９９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４、１−２０）およびｐ６５を包含し、後者２種はｐＣＤＮＡベクター中にクローン化した。
ＣＤ４＋ Ｔ細胞の精製およびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物
ＣＤ４＋ Ｔ細胞はＰＥ結合抗ＣＤ４（ＲＭ４−４）（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を使用するフローサイトメトリーによりリンパ節（ＬＮ）から精製し、そしてＦＡＣＳ（Ｍｏ Ｆｌｏ、ベクトン ディッケンソン（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ））を使用して９８〜９９％純度まで分取した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化のために、２×１０６／ｍｌのＣＤ４＋細胞を完全培地に再懸濁し、そして１００単位／ｍｌのＩＬ２の存在下で３日間、プレートに結合した１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（２Ｃ１１）および２□ｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））で活性化した。その後、細胞を完全培地中で１：４に分割しかつ１００単位／ｍｌのＩＬ２の存在下で４日間培養した。初回刺激後第７日に細胞を収集し、２回洗浄しかつ１×１０６細胞／ｍｌで１μｇ／ｍｌのプレートに結合した抗ＣＤ３で１、３および６時間再刺激した。Ｔｈ１およびＴｈ２分化培養物については、非トランスジェニックもしくはＤＯ１１．１０のＬＮおよび脾細胞をプールし、１×１０６細胞／ｍｌ完全培地で再懸濁しそして１μｇ／ｍｌのプレートに結合した抗ＣＤ３とともにＴｈ１（１０ｍｇ／ｍｌ抗ＩＬ４［１１Ｂ１１］、１０ｎｇ／ｍｌ ｒＩＬ１２）もしくはＴｈ２（１０ｍｇ／ｍｌ抗ＩＦＮ−γ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ４）条件下で培養した。細胞を第３日に完全培地＋１００ｕ／ｍｌ ＩＬ２で１：４に分割した。第７日に細胞を１□ｇ／ｍｌ抗ＣＤ３で４時間再刺激しそしてＲＮＡ調製のため収集した（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら １９９５）．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１、１７５５−１７６２）。サイトカインについて試験するため上清を２４時間に採取した。
樹状細胞およびマクロファージの精製および単離
骨髄由来ＤＣ（ｂｍＤＣ）を生成させるために使用した組換えマウス顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子（Ｉ．Ｍｅｌｌｍａｎ博士の贈品）でトランスフェクトしたマウスマクロファージ細胞系（Ｊ５５８Ｌ）から培養上清として製造した。Ｌ−９２９細胞（Ｍ．Ｓｔａｒｎｂａｃｈ博士の贈品）をＢＭ由来マクロファージを生じさせるためのＬ細胞培地の供給源として使用した。
ｂｍＤＣはより多数のＤＣを生じさせる変法（４７）により生じさせた。簡潔には、ＢＭ細胞をＧＭ−ＣＳＦ含有ＤＭＥＭ−１０培地中で培養した。第８日に浮遊細胞を収集しかつＣＤ１１ｃ＋磁性ビーズ（ミルテニイ バイオテック（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、カリフォルニア州オーバーン）で精製した。ＦＩＴＣ−Ｉ−ＡｂおよびＰＥ−ＣＤ１１ｃ＋に対するＡｂを用いるＦＡＣＳ分析は＞９５％純度を示した。同様に、マクロファージはＬ細胞培地中で培養したＢＭ細胞から生じさせた（４８）。第８日に付着細胞を穏やかに剥がしかつＣＤ１１ｂ＋磁性ビーズで精製した。ＦＩＴＣ−Ｆ４／８０およびＰＥ−ＣＤ１４＋（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）に対するＡｂを用いるＦＡＣＳ分析は＞９５％マクロファージを示した。
脾ＤＣ（ｓｐＤＣ）およびマクロファージをコラゲナーゼ処理により単離し（４９）、そしてアクデンズ（Ａｃｃｕｄｅｎｚ）細胞分離媒体（アキュレート ケミカル アンド サイエンティフィック コープ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．）、カリフォルニア州サンディエゴ）中での遠心分離により濃縮した。Ｔ細胞およびＮＫ細胞をその後、ＣＤ９０およびＮＫ１．１磁性ビーズを使用して枯渇させ、そしてその後ＤＣをＣＤ１１ｃ＋磁性ビーズでポジティブ選択した。いくつかの実験では、コラゲナーゼ処理した脾からＣＤ１１ｃ＋磁性ビーズでＤＣを最初にポジティブ選択し、そして、ＦＩＴＣ−ＭＨＣ ＩＩ（Ｉ−Ｅ／Ｉ−Ａ）、ＰＥ−ＣＤ１１ｃ＋、ＣｙＣ−ＣＤ８□＋もしくはＣｙｃ−ＣＤ４＋（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）で染色することにより亜集団にＦＡＣＳ分取した。マクロファージは、ＰＥ−ＣＤ１１ｂ＋およびＦＩＴＣ−Ｆ４／８０もしくはＦＩＴＣ−ＣＤ１１ｂ＋およびＰＥ−ＣＤ１４＋に対するＡｂを用いてＦＡＣＳ分取した。活性化された腹腔マクロファージを生成させるために、１ｍｌの３％チオグリコーラゲート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｇａｔｅ）（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、カリフォルニア州アーヴィン）を若齢もしくは高齢マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注入し；３ないし５日後に腹腔滲出液細胞を収集し、ＰＢＳ中で洗浄しかつＤＭＥＭ−１０中で培養した。
ＤＣおよびマクロファージの刺激
ＤＣおよびマクロファージを１×１０６／ｍｌの濃度でＤＭＥＭ−１０中で培養した。細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−１２もしくはＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州ミネアポリス）；１〜１００Ｕ／ｍｌのｒＩＦＮ−α／β（ＮＩＨ、メリーランド州ベセスダ）；２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５もしくはＩＬ−１（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ロッキーヒル）；１〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ロッキーヒル）；１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ））；および１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミズーリ州セントルイス）で刺激した。
ノーザンおよびウェスタンブロット分析
全ＲＮＡを、トライゾール（ＴＲＩＺＯＬ）試薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）を使用して休止期（ｒｅｓｔｉｎｇ）および刺激された細胞から単離し、そして各サンプル１０μｇを１．２％アガロース６％ホルムアルデヒドゲル上で分離し、２０×ＳＳＣ中でジーンスクリーン（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ）メンブレン（ＮＥＮ）に一夜転写し、そしてＵＶストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して共有結合した。ブロットのハイブリダイゼーションは、３２Ｐで標識した以下のｃＤＮＡプローブすなわちＴ−ｂｅｔ、γ−アクチンを使用して記述された（Ｈｏｄｇｅ，Ｍ．Ｒ．ら １９９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４、１−２０）とおり４２℃で実施した。ウェスタンブロット分析のための核および細胞質抽出物をＡＥ７、Ｄ１０およびＮＫ３．３細胞から調製した。核は記述された（Ｄｏｌｍｅｔｓｃｈ，Ｒ．Ｅ．ら １９９７．Ｎａｔｕｒｅ ３８６、８５５−８５８）とおり単離した。抽出されたタンパク質を８％ＰＡＧＥにより分離し、次いでニトロセルロースメンブレンに電気転写し、そしてＴ−ｂｅｔに特異的なｍＡｂ、次いでワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧでプロービングしかつ製造元（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の説明書に従って化学発光を高めた。
一過性トランスフェクションアッセイ
ＥＬ４およびＪｕｒｋａｔ細胞は、バイオラッド（Ｂｉｏ Ｒａｄ）電気穿孔装置（２８０Ｖ、９７５μＦ）を使用し、５μｇレポータープラスミドおよび５〜１０μｇ発現プラスミドでのトランスフェクションあたり０．４ｍｌ ＲＰＭＩ中５×１０６細胞を使用してトランスフェクトした。ルシフェラーゼアッセイを２４時間後に実施し、各サンプルの２０％のルシフェラーゼ活性を説明書（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））に従って測定した。ＩＦＮ−γレポーター−ルシフェラーゼ構築物は、ヒトＩＦＮ−γ遺伝子全体を含有するプラスミドｐＢ９由来である（Ｐ．ＧｒａｙとＤ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ．１９８２．Ｎａｔｕｒｅ．２９８：８５９）。ｐＧＬ２ルシフェラーゼ遺伝子をｐＢ９の第一エキソン中に挿入した。ＩＬ−２−プロモーター−レポーター構築物 ＩＬ−４プロモーターレポーター構築物ＩＬ−４ＬｕｃはマウスＩＬ−４遺伝子の下流に８０７ｂｐを含有する。
レトロウイルス構築物および形質導入
ＧＦＰ−ＲＶバイシストロン性ベクターがＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏパッケージング細胞系（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｓ．ら １９９８．Ｃｅｌｌ ９５、５９５−６０４）を有するとして記述されている（Ｏｕｙａｎｇ，Ｗ．ら １９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：７４５−７５５）。ＧＦＰ−ＲＶベクターは脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）およびＧＦＰ対立遺伝子をＭＳＣＶ２．２レトロウイルスベクター中（Ｏｕｙａｎｇ，Ｗ．ら １９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：７４５−７５５）もしくはＩＬ−２−ＭＳＣＶベクター中に挿入することにより構築した。双方のベクターは、各ｍＲＮＡの翻訳を別個に開始するのに１個のＩＲＥＳを同時に使用して２種のｃＤＮＡすなわちＴ−ｂｅｔおよびＧＦＰをコードするｃＤＮＡを発現する。パッケージング細胞系のトランスフェクションおよび初代Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入は、本質的には記述された（Ｏｕｙａｎｇ，Ｗ．ら １９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：７４５−７５５）とおり実施した。
細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳ分析
サイトカインに対する細胞内染色は記述された（Ｏｕｙａｎｇ，Ｗ．ら １９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：７４５−７５５）とおり実施した。示されるところの多様な時間の期間レトロウイルスに感染されていた初代トランスジェニックもしくは非トランスジェニックＴ細胞をＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌおよびイオノマイシン（１μＭ）で２時間再刺激し、そして１０μｇ／ｍｌのブレフェルジン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａを追加の２時間添加した。
疾患の特徴づけ
ホルマリン固定した組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色、ＯＣＴに埋込んだ凍結切片上での免疫蛍光研究、リンパ系細胞のフローサイトメトリーならびに血清自己抗体のアッセイは記述された７とおり実施した。この研究で使用した特異的抗体は、Ｒ４−６Ａ２およびＸＭＧ１．２（抗マウスＩＦＮ−γ）、ＢＶＤ４−１Ｄ１１およびＢＶＤ６−２４Ｇ２（抗マウスＩＬ−４）、ＭＰ５−２０Ｆ３およびＭＰ５−３２Ｃ１１（抗マウスＩＬ−６）、ＪＥＳ５−２Ａ５およびＳＸＣ−１（抗マウスＩＬ−１０）、ＭＰ１−２２Ｅ９およびＭＰ１−３１Ｇ６（抗マウスＧＭ−ＣＳＦ）、ＴＮ３−１９．１２（抗マウスＴＮＦ−□）、ウサギ抗ＴＮＦ−α、ＨＭ４０−３（抗マウスＣＤ４０）、１Ｄ３（抗マウスＣＤ１９）、ならびにＰＥ−Ｒ３−３４（ラットＩｇＧ１、κ）（ＢＤ ファーミンゲン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）；ＰＥ−Ｈ１０６．７７１（ラットＩｇＧ１、κ抗マウスＩｇＧ２ａ）（サザン バイオテクノロジー アソシエーツ インク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、アラバマ州バーミンガム）；ＦＩＴＣ−ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）を包含した。抗ＤＮＡ活性は高分子量マウスＤＮＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を使用するＥＬＩＳＡにより測定し、そしてクリシジア ルシリエ（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ ｌｕｃｉｌｌｉａｅ）キネトプラスト（アンチボディーズ インコーポレーテッド（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、カリフォルニア州デービス）で免疫蛍光により確認した。
Ｔ細胞アッセイ
ナイーブなＣＤ４＋ Ｔ細胞をネガティブ選択（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州ミネアポリス）により脾およびリンパ節から精製し、そしてＲＰＭＩ／１０％中で１μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ２８（３７．５１）抗体および１μｇ／ｍＬのプレートに結合した抗マウスＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）抗体（ＢＤ ファーミンゲン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））で４８〜７２時間刺激した。サイトカイン産生をＥＬＩＳＡ（ＢＤ ファーミンゲン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）により培養上清中で評価した。増殖はＢｒｄＵの取り込み（アマーシャム ファルマシア バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）により測定した。アポトーシスは、細胞を２０μｇ／ｍＬの可溶性抗マウスＣＤ３および抗マウスＣＤ２８、５μｇ／ｍＬデキサメサゾン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に２４時間曝露すること、もしくはストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ）中での１２００ＪのＵＶ照射により評価し、次いでキャスペース［ＣａｓｐＡＣＥ］ＴＭアッセイ系（プロメガ コーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウィスコンシン州マディソン）により評価した。
免疫グロブリンアッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析のため、精製した成熟Ｂ細胞を磁性ＣＤ４３枯渇（ミルテニイ バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、カリフォルニア州オーバーン）により脾およびリンパ節から単離し、そして１０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＩＬ−４、１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ、１ｎｇ／ｍＬのヒトＴＧＦ−β１（ペプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ニュージャージー州ロッキーヒル）もしくは１００Ｕ／ｍＬのマウスＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州ミネアポリス）を補充した２５μｇ／ｍＬ ＬＰＳ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含むＲＰＭＩ／１０％中で刺激した。レトロウイルス感染研究のため、精製したＣＤ４３枯渇成熟Ｂ細胞を２５μｇ／ｍＬのＬＰＳにより２４時間刺激し、次いでＴ−ｂｅｔ−ＧＦＰもしくは対照−ＧＦＰレトロウイルスにより感染させた２。血清もしくは培養上清中の血清免疫グロブリンアイソタイプの定量を以前に記述されたとおり実施した。生殖系列およびスイッチ後転写物は以前に記述されたとおりＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
リアルタイムＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析
ＲＮＡを未刺激および刺激したＤＣおよびマクロファージからトライゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で単離した。ｃＤＮＡ合成は、１μｇの全ＲＮＡを用いて、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー、２０ｎＭの各ｄＮＴＰ、０．１Ｍ ＤＴＴ、１×第一鎖緩衝液、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩおよびＲＮアーゼＯＵＴ（全部インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバードから）を使用して実施した。Ｔ−ｂｅｔ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２サブユニットｐ４０およびｐ３５、ならびに他の炎症性サイトカインのレベルを測定するための半定量的ＲＴ−ＰＣＲをＯｖｅｒｂｅｒｇｈら（５０）により記述されたとおり実施した。タックマン（ＴａｑＭａｎ）ユニバーサルＰＣＲマスターミックスを全部の反応に使用した（ＡＢ アプライド バイオシステムズ（ＡＢ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ニュージャージー州ブランチバーグ）。β−アクチンを包含する大部分のサイトカインのプライマーおよびタックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブの配列は記述された（５１）とおりである。目的の遺伝子の発現レベルはβ−アクチンの豊富さに関して報告する。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２ｐ４０のタンパク質レベルは、刺激したＤＣおよびマクロファージの収集した上清からＥＬＩＳＡにより検出した（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の発現を検出するために、多様な時間の期間刺激したＤＣからの全抽出物を収集し、そして以前に記述された（４５）ところのイムノブロット分析により検出した。
実施例１．新規転写因子Ｔ−ｂｅｔのクローニング
ＩＬ−２プロモーターのＴｈ１特異的領域は十分に限局されているため（Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒ，Ｆ．ら １９９４．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１８９−１９７；Ｒｏｏｎｅｙ，Ｊ．ら １９９５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５、６２９９−６３１０；Ｌｅｄｅｒｅｒ，Ｊ．Ａ．ら １９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、７７−８６；Ｄｕｒａｎｄ，Ｄ．ら １９８８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、１７１５−１７２４；Ｈｏｙｏｓ，Ｂ．ら １９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４、４５７−４５０）、Ｔｈ１特異的転写因子を同定するのにＩＬ−２プロモーター−レポーター、およびＯＦ６ Ｔｈ１クローンから作成したｃＤＮＡライブラリーを使用する酵母１ハイブリッドアプローチを選んだ。このアプローチを検証するために、ＩＬ−４プロモーターのＴｈ２特異的領域を酵母中で発現させ、そしてｃ−Ｍａｆの導入によりトランス活性化されることが示されたが、しかし数種の他の転写因子（例えばＮＦＡＴ）によってはされなかった。ｃ−Ｍａｆ応答因子（ＭＡＲＥ）を突然変異させた場合にｃ−Ｍａｆのトランス活性化は起こらなかった。従って、酵母１ハイブリッドアプローチを利用した。
ＥＧＹ４８酵母株をＩＬ−２プロモーター／ヒスチジン構築物で安定に組込み、そして抗ＣＤ３で活性化したＴｈ１細胞クローンＯＦ６から作成したｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。スクリーニングした５．６×１０６クローンのうち４８８個が一次スクリーニングで陽性であった。二次スクリーニングの間に試験した２１０クローンのうち７２個がＩＬ−２プロモーターに特異的であることが判明した。陽性クローンの数を減少させるため、われわれはＴｈ１およびＴｈ２細胞系で差別的に発現されたｃＤＮＡと酵母クローンｃＤＮＡをハイブリダイズさせた。これらのＴｈ１−Ｔｈ２およびＴｈ２−Ｔｈ１ ｃＤＮＡは、放射標識しかつ１６個の最も強く陽性の酵母クローンをスクリーニングするためのパイロット実験で最初に使用したクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＰＣＲ選択キットを使用して作成した。それら１６クローンのうち８個がＴｈ１（ＰＬ１７）特異的ｃＤＮＡ産物プローブで陽性でありかつＴｈ２（Ｄ１０）特異的ｃＤＮＡ産物プローブで陽性でなかった。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４へのプローブの対照ハイブリダイゼーションを用いた１６個の陽性クローンでのＴｈ１−Ｔｈ２プローブを用いる発現差解析法（ＲＤＡ；例えばＬｉｓｉｔｓｙｎ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５９：９４６；Ｏ’ＮｅｉｌとＳｉｎｃｌａｉｒ．１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２６８１；ＨｕｂａｎｋとＳｃｈａｔｚ．１９９４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２２：５６４０；Ｗｅｌｆｏｒｄら １９９８．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２６：３０５９）を実施した。Ｔｈ１およびＴｈ２を減算したｃＤＮＡプローブの特異性はＩＬ−４に対するそれぞれＩＬ−２およびＩＦＮ−γのそれらの検出により示される。
制限酵素分析および配列決定データは、該クローンの８個全部が関係づけられたことを示した。それらは５’および３’非翻訳領域中の差異に基づき３つのグループ分けに入り、これらの範疇のそれぞれは独立したｃＤＮＡ分子を表した。これらのクローンの配列をＮＣＢＩジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列データベースと比較することは転写因子のＴボックスファミリーとの相同性を生じた。図１にはＴ−ｂｅｔのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が示されている。
実施例２．Ｔ−ｂｅｔはＴボックスファミリーのメンバーＴ−ｂｒａｉｎおよびエオメソデルミン（ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ）と相同な１領域を共有する
ＢｒａｃｈｙｕｒｙもしくはＴはＴボックスと呼ばれる２００アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを共有する転写因子の１ファミリーの創設メンバーである（（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．１９９７．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７、４７４−４８０；ＰａｐａｉｏａｎｎｏｕとＳｉｌｖｅｒ．１９９８．Ｂｉｏｅｓｓａｙ．２０：９；Ｍｅｉｓｌｅｒ，Ｍ．Ｈ．１９９７．Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ８、７９９−８００に総説される。）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（「短い尾」のギリシア語）突然変異は、短いわずかにもつれた尾部を有したヘテロ接合性の突然変異体動物で１９２７年に最初に記述された（Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．、１９９０．Ｎａｔｕｒｅ ３４３、６１７−６２２）。マウスでＢｒａｃｈｙｕｒｙを包含せずに今や８種のＴボックス遺伝子が存在する。これらはＴｂｘ１−６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）および今やＴ−ｂｅｔを包含し、それぞれまるで異なったかつ通常は複雑な発現パターンをもつ。転写因子のＴボックスファミリーはＤＮＡ結合ドメイン中のファミリーメンバーの相同性により定義される。Ｔ−ｂｅｔ ＤＮＡ結合ドメイン（マウスＴ−ｂｅｔの残基１３８〜３２７）はマウスＴ−ｂｒａｉｎおよびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）エオメソデルミンのＴボックスドメインに最も類似であり、そして従ってＴ−ｂｅｔをＴボックス遺伝子ファミリーのＴｂｒ１サブファミリーに置く。マウスＴ−ｂｅｔタンパク質のヒト相同物はマウスＴ−ｂｅｔにおよそ８８％同一である。図１ＡはＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎのタンパク質アライメント（４に設定されたＧペナルティ（Ｇ ｐｅｎａｌｔｙ）および１２に設定されたギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）で）を使用して得た。類似性指数は８６．６であると計算され；ギャップ数（ｇａｐ ｎｕｍｂｅｒ）２、ギャップ長（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ）５およびコンセンサス長（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｌｅｎｇｔｈ）５３５）。Ｔ−ｂｅｔはＴボックスファミリーメンバーのＴ−ｂｒａｉｎおよびエオメソデルミンと相同な１領域を共有する。マウスＴ−ｂｅｔ ＤＮＡ結合ドメインはマウスＴ−ｂｒａｉｎおよびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）エオメソデルミンのＴボックスドメインに最も類似である。該３種のＴボックス領域間におよそ６９％のアミノ酸の同一性が存在する。Ｔ−ｂｅｔはＴボックスドメイン以外では他のＴボックスファミリーメンバーに対する配列の相同性をもたない。
実施例３．Ｔ−ｂｅｔはコンセンサスＴボックス部位に結合しかつトランス活性化し、また、５’および３’双方の領域に位置する機能上重要なドメインを有する
組換えＴ−ｂｅｔタンパク質はコンセンサスＴボックス部位およびＩＬ−２プロモーター中のＴ−ｂｅｔ部位に結合し、また、抗ＣＤ３で刺激したＡＥ７ Ｔｈ１細胞からの核抽出物中に存在する複合体はコンセンサス（ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣ）Ｔボックスオリゴヌクレオチドプローブに特異的に結合する。Ｔ細胞中のＴ−ｂｅｔの活性について試験するために以下の実験を実施した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔｈ１細胞をＴ−ｂｅｔおよびルシフェラーゼレポーター構築物でコトランスフェクトした。図２Ａは４コピーのコンセンサスＴボックス部位を伴うもしくは伴わない最小のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを含有するルシフェラーゼレポーター構築物のＪｕｒｋａｔ細胞中での基礎レベル（白棒）ならびにＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）で誘導した（黒棒）プロモーター活性を示す。各レポーター構築物は、図中に示されるとおり空のｐＣＤＮＡベクターもしくは完全長のＴ−ｂｅｔ ｃＤＮＡを含有するｐＣＤＮＡとコトランスフェクトした。示されるデータは３回の独立した実験を代表する。図２Ｂは最小のＴＫプロモーターおよび多量体化したコンセンサスＴボックス部位を含有するルシフェラーゼレポーター構築物、ならびに棒グラフの左側に図解したＴ−ｂｅｔ ｃＤＮＡの示される領域を含有するｐＣＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞を示す。ルシフェラーゼ活性をトランスフェクション２４時間後に測定した。該実験は３回反復し結果は同様であった。基礎レベル（白棒）、ならびに得られたＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）で誘導した（黒棒）プロモーター活性は、Ｔ−ｂｅｔがＴ細胞中で活性であること、およびその活性は刺激に際してさらに増大される可能性があることを示す。
実施例４．Ｔ細胞中のＴ−ｂｅｔ発現はＴｈ１サブセットに限定されかつＴｃＲを介して伝達されるシグナルにより調節される
Ｔ−ｂｅｔをＴｈ１ ｃＤＮＡライブラリーから単離し、そして多臓器ノーザンブロット分析は肺、胸腺および末梢リンパ系器官のみでＴ−ｂｅｔ転写物を示した。
図３ＡはＴ−ｂｅｔがダブルポジティブ（ＤＰ）もしくはシングルポジティブ（ＳＰ）細胞中でなくダブルネガティブ（ＤＮ）の胸腺細胞中で優先的に発現されていることを示す。培地もしくはプレートに結合した抗ＣＤ３（２Ｃ１１）で６時間処理したＴｈ１細胞クローン（ＡＥ７およびＤ１．１）もしくはＴｈ２クローン（Ｄ１０およびＣＤＣ３５）から単離された全細胞ＲＮＡのノーザンブロット分析は、Ｔｈ１クローン中でのみＴ−ｂｅｔ転写物を示した。全細胞ＲＮＡは、培地もしくはプレートに結合した抗ＣＤ３（２Ｃ１１）で６時間処理したＴｈ１細胞クローン（ＡＥ７およびＤ１．１）もしくはＴｈ２クローン（Ｄ１０およびＣＤＣ３５）から単離した。全ＲＮＡはまた、培地もしくはＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）で６時間処理したＭ１２（Ｂ細胞リンパ腫およびＥＬ４（Ｔ細胞胸腺腫）からも単離した。ノーザンブロット分析は標準的手順を使用してレーンあたり１０μｇの全ＲＮＡを用いて実施し、そして完全長のＴ−ｂｅｔ ｃＤＮＡを使用してプロービングした。Ｔ−ｂｅｔはＴｈ１クローン中で優先的に発現される。さらに、Ｔ−ｂｅｔ発現のレベルは、抗ＣＤ３によるＴ−ｂｅｔ転写物の誘導により明示されるとおりＴｃＲを介して伝達されるシグナルにより増強された。Ｔ−ｂｅｔ転写物は、これらの細胞を培地もしくはＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）で６時間処理した場合に、Ｍ１２、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔｈ１リンパ腫ＪｕｒｋａｔもしくはＥＬ４、Ｔｈ０細胞胸腺腫中で検出されなかった。
初代Ｔ細胞中でのＴ−ｂｅｔのタンパク質レベルを測定するために、ＤＯ１１．１０ ＴｃＲトランスジェニック脾細胞をＴｈ１もしくはＴｈ２極性化条件下で培養した。７２時間に細胞を２００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮培地中で３倍に拡張した。初回刺激後第７日に、休止期もしくはＰＭＡ／イオノマイシンで活性化（１時間）したバルク培養物ＤＯ１１．１０ Ｔｈ１およびＴｈ２細胞から核およびサイトゾル抽出物を調製した。核抽出物は休止期のＭ１２、ＥＬ４、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＫ３．３およびＹＴ細胞からもまた調製した。図３Ｃに示されるとおり、該細胞系のなかでＴ−ｂｅｔタンパク質はＹＴ細胞中にのみ存在した。図３ＣはＴ−ｂｅｔタンパク質がＴｈ１細胞およびＮＫ細胞に限定されることを示す。上のような休止期もしくはＰＭＡ／イオノマイシンで活性化（１時間）したバルク培養物ＤＯ１１．１０ Ｔｈ１およびＴｈ２細胞から調製した核およびサイトゾル抽出物でウェスタンブロット分析を実施した。簡潔には、Ｄ０１１．１０ Ｔｃｒトランスジェニック脾細胞を、Ｔｈ１表現型の発生を促進するための１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２および１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１）、もしくはＴｈ２表現型の発生を促進するための１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４および１０μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γの存在下に３×１０６細胞／ｍｌでＯＶＡペプチド（３２３−３３９）で活性化した。７２時間に細胞を２００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮培地中で３倍に拡張した。初回刺激後第７日に、休止期もしくはＰＭＡ／イオノマイシンで活性化（１時間）したバルク培養物Ｄ０１１．１０ Ｔｈ１およびＴｈ２細胞から核およびサイトゾル抽出物を調製した。核抽出物は休止期のＭ１２細胞、ＥＬ４、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＫ３．３およびＹＴからもまた調製した。３０μｇの核およびサイトゾル抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ゲル）により分離し、ニトロセルロースに転写し、そして抗Ｔ−ｂｅｔ抗血清でプロービングした。初代Ｔ細胞中では、上に示されたＴ細胞クローンおよび初代Ｔ細胞のノーザンブロット分析と一致して、Ｔ−ｂｅｔタンパク質がＴｈ１に沿って駆動されるＴ細胞中で選択的に発現されるがしかしＴｈ２経路ではされない。
Ｔ−ｂｅｔに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）がＦＡＣＳ分析によるＴ−ｂｅｔタンパク質の直接可視化を可能にした。図３ＤはＴ−ｂｅｔが活性化されたＡＥ７ Ｔｈ１細胞中でＦＡＣＳにより可視化され得ることを示す。Ｄ１０（Ｔｈ２）もしくはＡＥ７（Ｔｈ１）細胞を培地もしくはＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）で２時間ならびに２μＭモネンシンで追加の３時間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、０．５％サポニンで浸透化し（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅｄ）、そして培地（破線）もしくはＩｇＧ１アイソタイプの対照抗体（点線）または親和性精製した抗Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体３Ｄ１０（実線）で染色し、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＰＥ染色した。細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでのフローサイトメトリーにより分析した。マウスモノクローナル抗体は完全長の細菌で産生されたＴ−ｂｅｔに対し生じさせた。Ｔ−ｂｅｔタンパク質はＤ１０細胞中で検出可能でなく、未刺激のＡＥ７細胞中で低レベルで存在し、そして刺激したＡＥ７中に増大されたレベルで存在した。一緒にすれば、ここで詳述した実験は、Ｔ細胞においてＴ−ｂｅｔはＴｈ１細胞中で選択的に発現され、そこでその発現レベルはＴｃＲから発するシグナルにより調節されていることを示す。
実施例５．Ｔ−ｂｅｔ発現はＮＫおよびＢ細胞中でのＩＦＮ−γ誘導と相関する
ＩＬ−２プロモーター中のＴボックス部位への結合に基づくその単離と結びつけられたＴ−ｂｅｔのＴｈ１に制限される発現は、Ｔ−ｂｅｔがＩＬ−２遺伝子の転写を活性化するかもしれないことを示唆した。しかしながら、２種のＩＬ−２産生細胞系、ＪｕｒｋａｔおよびＥＬ４がＴ−ｂｅｔを発現しなかった一方で、ＩＦＮ−γを産生するがしかしＩＬ−２はしないＮＫ細胞系ＹＴがＴ−ｂｅｔを発現したことは困惑させた。さらに、予備実験は、ＩＬ−２プロモーター中の優れたＴボックス部位の存在にもかかわらずＴ−ｂｅｔによるＩＬ−２遺伝子のトランス活性化を示さなかった。他のＴｈ１特異的サイトカインはＩＦＮ−γ、ＴＮＦαおよびＬＴを包含する。Ｔ−ｂｅｔの発現はＩＦＮ−γの発現と良好に相関した。さらに、Ｔボックス部位はヒトＩＦＮ−γ遺伝子の第三イントロン中に存在することが見出された。Ｔｈ１特異的ＤＮアーゼＩ高感受性部位が最近この領域に位置づけられたため、これはとりわけ注目に値すべきであった。
Ｔ−ｂｅｔがＩＦＮ−γ遺伝子の発現を制御したという可能性を検査するために、Ｔｈ１細胞以外の細胞中でのＴ−ｂｅｔの発現およびＩＦＮ−γの発現を測定した。ＩＦＮ−γはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞中で低レベルで発現され、そしてＩＬ−２およびＩＬ−１２での処理に際して高レベルまで誘導される（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ，Ｊ．ら １９８２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：２８３１；Ｙｅら １９９５．Ｊ．Ｌｅｕｋｏ．Ｂｉｏｌ．５８：２２５）。従って、ＮＫ３．３細胞系をＩＬ−２、ＩＬ−１２、ならびにＩＬ−２およびＩＬ−１２で２４時間処理し、ライセートを調製し、そして上のようなＴ−ｂｅｔ ｍＡｂを用いてウェスタンブロット分析を実施した。図４ｂはＮＫ３．３細胞中でのＴ−ｂｅｔタンパク質およびＩＦＮ−γの分泌の協調的誘導を示す。ＮＫ３．３細胞系を、ＮＫ細胞中でＩＦＮ−γを誘導することが既知の試薬ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ならびにＩＬ−２およびＩＬ−１２で２４時間処理し、ライセートを調製し、そして上のようなＴ−ｂｅｔ ｍＡｂを用いてウェスタンブロット分析を実施した。細胞から収集した上清でＥＬＩＳＡを実施した。
基礎にてＩＦＮ−γを産生しないＢ細胞は抗ＣＤ４０抗体ならびにＩＬ−１２およびＩＬ−１８の組合せ剤での処理に際して大量のＩＦＮ−γを産生するよう駆動される可能性がある（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．、１９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、３９４８−３９５３）。精製されたＢ細胞を抗ＣＤ４０ ｍＡｂ、ｒＩＬ−１２およびｒＩＬ−１８で７２時間処理し、ＲＮＡを単離しかつ上のようなＴ−ｂｅｔ ｃＤＮＡを使用してノーザンブロットを実施した。図４Ａは試薬のこの組合せで処理したＢ細胞中でのＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの誘導を示し、また、これらの細胞中でのＩＦＮ−γ転写物の誘導が確認された。結論として、いずれの細胞型もＴ−ｂｅｔを構成的に発現しない一方、ＮＫ３．３細胞およびＢ細胞双方はＩＦＮ−γ産生もまたもたらす条件下でそうするように誘導し得る。従って、Ｔ−ｂｅｔの発現のパターンはＩＦＮ−γ遺伝子の転写と良好に相関する。
実施例６．Ｔ−ｂｅｔはＴｈ細胞中でＩＦＮ−γ遺伝子をトランス活性化する
ＩＦＮ−γ遺伝子の制御領域については未だほとんど知られていない。とりわけ、その組織特異的発現を指図する遺伝子の領域はｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで同定されていない。上流配列の５００ｂｐもしくは３ｋｂを含有するレポーター構築物がＴｈ１およびＴｈ２双方の細胞で発現されることが示されている（Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．、１９９４．Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ．１５３、３６０３−３６１０）。ＩＦＮ−γプロモーターもしくはイントロン中のＡＴＦ−２、ＮＦ□Ｂ、ＡＰ−１およびＳｔａｔ４部位が機能上重要であると考えられるが、しかし組織特異的発現の原因では明らかにない（Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．、１９９４．Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ．１５３、３６０３−３６１０；Ｓｉｃａ，Ａ．、１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、３０４１２−３０４２０；Ｐｅｎｉｘ，Ｌ．、１９９３．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８、１４８３−１４９６；Ｐｅｎｉｘ，Ｌ．Ａ．、１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、３１９６４−３１９７２）。同様に、Ｔｈ１優先的なＤＮアーゼＩ高感受性部位が第一および第三双方のイントロン中で示されているとは言え、これらのイントロン中に位置する関連するシスエレメントは同定されていない（Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．ら １９９４．Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３、３６０３−３６１０；Ａｇａｒｗａｌ，Ｓ．とＲａｏ，Ａ．１９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９、７６５−７７５）。従って、ＩＦＮ−γ遺伝子全体を含有するレポーター構築物をこれらの研究に利用した。使用したＩＦＮ−γレポーター遺伝子は上流配列の３ｋｂ、全３個のイントロンを伴うコーディング配列全体および下流の１．５ｋｂを包含する（Ｘｕ．Ｘ．ら １９９６．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、７９４−７９６）。
ＪｕｒｋａｔヒトＴｈ１リンパ腫およびマウスＥＬ４ Ｔｈ０胸腺腫中でのＩＦＮ−γ遺伝子の９ｋｂを含有するルシフェラーゼレポーター構築物の活性を試験した。各レポーター構築物（１０μｇ）は空のｐＣＤＮＡベクターまたは完全長のＴ−ｂｅｔ ｃＤＮＡ、ｃ−Ｍａｆ、ＮＦＡＴｐもしくはｐ６５を含有するｐＣＤＮＡ（１０μｇ）とコトランスフェクトした。該構築物は−４００ないし−４０のＩＬ−２およびＩＬ−４プロモータールシフェラーゼレポーターもまた包含する。
ＩＬ−２およびＩＬ−４を産生するがしかしＩＦＮ−γを産生しないＴｈ０マウスＴ細胞胸腺腫ＥＬ４をＴ−ｂｅｔ ｃＤＮＡ発現プラスミドおよびＩＦＮ−γ−ルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトした（図５）。Ｔ−ｂｅｔ発現プラスミドの導入は空のベクター単独に比較してＩＦＮ−γ遺伝子のトランス活性化（およそ２０〜３０倍）をもたらした。これは２種の他の因子すなわちＴｈ２特異的転写因子ｃ−ＭａｆおよびＴｈ非選択的転写因子ＮＦＡＴによるトランス活性化の非存在とよい対照をなした。興味深いことに、ＮＦ□Ｂファミリーメンバーｐ６５は独力でＩＦＮ−γレポーターをトランス活性化しなかったとは言え、Ｔ−ｂｅｔおよびｐ６５のコトランスフェクションは相乗的活性化をもたらした。
Ｔｈ１特異的であることが既知のプロモーターの１領域を使用してＩＬ−２プロモーターの検査もまた行った（Ｌｅｄｅｒｅｒ，Ｊ．Ａ．ら １９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、７７−８６）。Ｔ−ｂｅｔはＩＬ−２プロモーターの活性をおよそ１／１０に抑制した。これはＰＭＡおよびイオノマイシンによるプロモーターの活性化に際してとりわけ明らかであった。前のとおり、ＩＦＮ−γ遺伝子の実質的トランス活性化が示された。ＩＬ−４プロモーター（図５）もしくはＴＮＦ−αプロモーターのトランス活性化に対する影響が存在しなかったため、Ｔ−ｂｅｔ活性はＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子に対し特異的であった。これらのデータは、Ｔ−ｂｅｔがＩＦＮ−γ遺伝子の転写を特異的に活性化しかつＩＬ−２遺伝子の転写を抑制することを示す。
内因性遺伝子発現を検査するために、ＥＬ４細胞をＴ−ｂｅｔもしくは空のベクターで一過性にトランスフェクトし、そしてＰＭＡ／イオノマイシンでの刺激４８時間後にＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡにより測定した（図５）。上に示したトランス活性化のデータと矛盾せず、ＥＬ４細胞中でのＴ−ｂｅｔの異所性発現は測定可能なＩＦＮ−γ産生につながった一方、ベクター対照でのトランスフェクションは検出可能なＩＦＮ−γをもたらさなかった。
実施例７．初代Ｔｈ細胞中へのＴ−ｂｅｔのレトロウイルス遺伝子媒介性の移入は増大されたＩＦＮ−γ産生をもたらす
上述された実験はＩＦＮ−γ遺伝子の転写制御におけるＴ−ｂｅｔの決定的な役割に強く賛成の論を唱える。
ウシコラーゲン特異的Ｔｈ０ハイブリッドを、ＴｃＲで誘導可能なＩＬ−２プロモーターの制御下でのみＴ−ｂｅｔ ＧＦＰもしくはＧＦＰを含有するレトロウイルス構築物で形質導入した。形質導入された集団をＧＦＰで２回ＦＡＣＳ分取し、休止させ、そしてその後抗ＣＤ３で刺激し、そして上清を６０時間に収集してＥＬＩＳＡによりサイトカイン産生を測定した。（図６）。効果を有しなかったコントロールレトロウイルスベクターはアンチセンスＴ−ｂｅｔを包含した。
Ｔ−ｂｅｔがＩＦＮ−γの組織特異的発現の原因であるかどうかをさらに試験するために、非トランスジェニックおよびＴｃＲトランスジェニック双方の初代Ｔ細胞中へのＴ−ｂｅｔのレトロウイルス遺伝子媒介性の移入を実施した。Ｔ−ｂｅｔおよびＧＦＰ双方を発現する２種の異なるバイシストロン性レトロウイルスを使用した。第一のものはＩＬ−２誘導可能なプロモーターの制御下にＴ−ｂｅｔを発現し、そして第二のものはＭＳＣＶ ＬＴＲの制御下にＴ−ｂｅｔを発現する。双方の構築物で類似の結果が得られた。
ＢＡＬＢ／ｃ ＣＤ４ Ｔ細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８により初回活性化の３６時間後に感染させ、第７日に収集し、そして実験手順に記述されるとおりＰＭＡおよびイオノマイシンでの刺激５時間後に細胞内ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２染色を実施した。データはＣＤ４の発現に基づきゲーティングした事象の細胞内サイトカイン（ＦＬ２）に対するＧＦＰ発現（ＦＬ１）を示す２色プロットとして示す。ＭＢＰ ＴｃＲトランスジェニックマウスからの初代Ｔ細胞を６μＭのＭＢＰ（Ａｃ１−１１）を使用して刺激しそしてＩＬ−２／ＧＦＰおよびＩＬ−２／Ｔ−ｂｅｔ／ＧＦＰを用いて感染を第１日に実施した。第７日に細胞をＧＦＰ発現について分取し、１日間休ませ、そしてその後ＰＭＡおよびイオノマイシンでの刺激５時間後に細胞内サイトカイン分析を実施した。
ナイーブなＭＢＰトランスジェニックもしくは非トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ ＣＤ４ Ｔ細胞を、記述されたとおり（Ｏｕｙａｎｇ，Ｗ．ら １９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：７４５−７５５）非極性化条件下にＭＢＰ １−１１および抗ＣＤ３で活性化しかつ初回活性化後第１日にレトロウイルスに感染させた。細胞を７日間培養し、そしてその後ＧＦＰ発現を測定して感染した細胞の割合を決定した。ＧＦＰ陽性細胞を分取し、そしてＰＭＡおよびイオノマイシンでの追加の４時間刺激後に細胞内染色によりサイトカイン産生を測定した。
Ｔ−ｂｅｔでのＭＢＰ−ＴｃＲトランスジェニックおよび非トランスジェニック双方のＴ細胞の形質導入は、双方とも、ＧＦＰ単独で形質導入した細胞に比較して、ＩＦＮ−γを産生する細胞の数および細胞あたりに産生されるＩＦＮ−γの量の印象的な増大をもたらした。（図７）。
ナイーブなＴｈｐ細胞は刺激後早期に大量のＩＬ−２を産生し、これはその後極性化Ｔｈ細胞中でエフェクターサイトカインＩＦＮ−γおよびＩＬ−４により徐々に置き換えられる。極性化Ｔｈ１細胞はＩＬ−２をしかしナイーブなＴｈｐよりかなり少ない量で産生し続ける。極性化Ｔｈ２細胞はＩＬ−２の産生を遮断する。Ｔ−ｂｅｔで形質導入したＴｈ細胞はＧＦＰ／ＲＶ対照で形質導入した細胞よりいくぶんより少ないＩＬ−２を産生し、ＥＬ４細胞中でわれわれが観察したＴ−ｂｅｔによるＩＬ−２プロモーターのトランス活性化の抑制と矛盾しない。Ｔ−ｂｅｔによるＩＬ−２の抑制は、ナイーブな前駆細胞から完全に分化したエフェクター細胞への系譜の決定の駆動におけるＴ−ｂｅｔの機能と矛盾しない。
実施例８．Ｔ−ｂｅｔは発生中のＴｈ２細胞中でＩＦＮ−γを活性化しかつＩＬ−４産生を抑制する
上の実験はＴ−ｂｅｔが未分化（ｕｎｓｋｅｗｅｄ）のＴｈ細胞をＴｈ１経路に向かわせ得ることを示す。Ｔ−ｂｅｔは、通常はそれらをＴｈ２経路に駆動することができる刺激の存在下で試験されてさえ、Ｔｈ細胞をＴｈ１経路に沿ってそれらの遺伝プログラムに余儀なく向かわせることができた。図８の実験において、ＢＡＬＢ／ｃ ＣＤ４＋ Ｔ細胞をｒＩＬ−４ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２に対する抗体の存在下で抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で活性化し、３６時間にレトロウイルス感染を実施し、ＩＬ−２で細胞を拡張し、ＧＦＰ陽性細胞を第７日に分取し、そしてＰＭＡおよびイオノマイシンでの追加の４時間刺激後に細胞内染色によりサイトカイン産生を測定した。ＧＦＰ−ＲＶ単独での形質導入は１３．４％のＩＬ−４産生細胞および０．９％のＩＦＮ−γ産生体を含有した集団をもたらした（図８）。期待されたとおり、Ｔｈｐ細胞はこの時点で未だ完全に極性化されていない。Ｔ−ｂｅｔ／ＧＦＰ／ＲＶの導入は、Ｔｈ１分化を阻害する条件（ｒＩＬ−４および抗ＩＬ−１２）下でさえ、ＩＦＮ−γを産生する多数の細胞（５０％）および低下された数のＩＬ−４を産生する細胞（３．５％）により明示されるとおりＴｈｐのＴｈ１経路への実質的な移動を生じた。従って、Ｔ−ｂｅｔは発生中のＴｈ細胞をＴｈ１経路に駆動するサイトカインにより送達されるＴｈ２を促進するシグナルを克服し得る。
実施例９．Ｔ−ｂｅｔは極性化Ｔｈ２細胞をＴｈ１経路に向け直す
極性化条件下での長期刺激後にＴｈ１およびＴｈ２集団の可逆性が失われることが示されている。可逆性は大部分が１週間後に阻害されそして３週間後に完全に喪失される（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｅ．ら １９９６．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３、９０１−９１３）。Ｔ−ｂｅｔが既に極性化したＴｈ２細胞の純粋な集団の決定の方向を定め直し（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）得るかどうかを決定するために、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を上のとおり培養しそして培養第９日にレトロウイルス遺伝子形質導入を実施した。Ｔｈ２極性化条件下で９日間培養したＴｈ細胞において、対照のＧＦＰ／ＲＶで形質導入した細胞はわずかに検出可能なＩＦＮ−γ産生体細胞（６％）を伴い事実上全部がＩＬ−４およびＩＬ−５産生体である（２３％および１１％）（図９）。従って期待されたとおりほぼ完全な極性化が起こっていた。注目すべきことに、これらの完全に極性化したＴｈ２細胞中へのＴ−ｂｅｔの導入は、ＩＦＮ−γ発現の誘導ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５発現の喪失の双方により明示されるとおり極性化Ｔｈ１細胞へとそれらを向け直しすなわち転換した。この転換は外因性のＩＬ−４の存在下で起こった。完全に７７％のＴ−ｂｅｔで形質導入したＴｈ２細胞が今やＩＦＮ−γを産生した一方、ＩＬ−４およびＩＬ−５を産生する細胞の割合はそれぞれ１３％および１％に低下していた。これらのＴ−ｂｅｔで形質導入した細胞は従ってＩＦＮ−γおよびＩＬ−４双方を産生するＴｈ０細胞ではない。従って、Ｔ−ｂｅｔはＴｈ２細胞におけるＩＦＮ−γ産生を単純に誘導していないが、しかし実際はＴｈ２細胞を相反するＴｈ１サブセットに再プログラムした。
実施例１０．Ｔ−ｂｅｔはまた極性化Ｔｃ２細胞もＴｃ１経路に向け直す
大部分の注意はＣＤ４＋ Ｔリンパ球に集中されていたとは言え、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞がＩＦＮ−γ産生（Ｔｃ１）およびＩＬ−４産生（Ｔｃ２）サブセットにもまた分割されるかもしれないことが明らかである。完全に極性化したＴｃ２細胞をＴｃ１経路に向け直すＴ−ｂｅｔの能力を試験した。精製したＣＤ８＋ Ｔ細胞を従って９日間Ｔｃ２極性化条件下で培養物中で分化させて完全な分化を達成した。図１０は、Ｔ−ｂｅｔで形質導入したＴｃ２細胞が、Ｔ−ｂｅｔで形質導入したＣＤ４ Ｔｈ２細胞に類似にＩＦＮ−γを産生し（８５％対１５％）かつＩＬ−４およびＩＬ−５の産生を抑制する（それぞれ３％対３４％および１％対４５％）ように再プログラムされていたことを示す。従って、Ｔ−ｂｅｔは完全に分化したＣＤ８＋ Ｔｃ２細胞をＴｃ１細胞に転換し得る。
実施例１１．Ｔ−ｂｅｔはチロシンリン酸化される
Ｔ−ｂｅｔがチロシンリン酸化されるタンパク質であるかどうか決定するために、過バナジウム酸との０、５、１０、３０分間のインキュベーション後にＡＥ７ Ｔｈ１細胞からの全細胞ライセートを調製した。ライセートを抗Ｔ−ｂｅｔ抗血清で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ゲル）により分離し、ニトロセルロースに転写しそして抗ホスホチロシンｍＡＢ ４Ｇ１０でプロービングした。曝露後にブロットをストリッピングし、細片に切りかつ抗Ｔ−ｂｅｔ抗血清で再プロービングした。図１１に示されるとおり、Ｔ−ｂｅｔは明らかにＴ細胞中でチロシンリン酸化されるタンパク質である。
実施例１２．ドミナントネガティブＴ−ｂｅｔ分子の創製
Ｔ−ｂｅｔ ＤＮＡ結合ドメイン（残基１３８〜３２７）およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）タンパク質ｅｎｇｒａｉｌｅｄのリプレッサードメインを用いてキメラｃＤＮＡ分子を作成した。ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質は転写の強力な活性のリプレッサーである（Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．、１９９６．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０、２７３２；Ｌｉ，Ｊ．、Ｔｈｕｒｍ，Ｈ．ら １９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、１０８８５）。多量体化したＴボックスコンセンサス部位／ＴＫ最小プロモータールシフェラーゼレポーター構築物を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ−ｂｅｔ−ｅｎｇｒａｉｌｅｄ構築物。図１２に示されるとおり、Ｔ−ｂｅｔ／ｅｎｇｒａｉｌｅｄはＴボックスレポーター構築物をトランス活性化する野性型Ｔ−ｂｅｔの能力を５：１の比で特異的かつ有意に抑制し、また、ＮＦＡＴｐおよびｐ６５発現構築物によるそれぞれＮＦＡＴもしくはＮＦｋＢレポーターのトランス活性化を抑制しない。
実施例１３．Ｔ−ｂｅｔはインターフェロン−γ産生およびＴｈ１系譜の決定に必要とされる
Ａ．Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスの生成
ＩＦＮ−γ産生およびＴｈ１系譜の決定におけるＴ−ｂｅｔの役割を決定的に取り扱うためにＴ−ｂｅｔ欠損マウスを生成した。Ｔ−ｂｅｔ遺伝子は、第一エキソン、上流配列の５００ｂｐ、イントロン配列の１ｋｂをネオマイシン耐性遺伝子で置き換えることによる相同的組換えにより混乱させた。標的を定められたＴＣ１胚幹細胞クローンから生成させた生殖系列キメラ動物はヘテロ接合性マウスを生じさせ、これをその後異系交配させてＴ−ｂｅｔ突然変異に関してホモ接合性のマウス（Ｔ−ｂｅｔ−／−）を得た。Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスが期待されたメンデル比で生まれ、そして表現型上正常かつ交配能力があった。Ｔ−ｂｅｔ突然変異がＴ−ｂｅｔ遺伝子を不活性化したことを確認するために、野性型同腹子対照およびヘテロ接合性もしくはホモ接合性突然変異体マウスからの休止期もしくはＰＭＡ／イオノマイシン活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞から全ＲＮＡもしくは全タンパク質ライセートを単離した。Ｔ−ｂｅｔ発現はＴ−ｂｅｔ−／− ＣＤ４＋ Ｔ細胞中でノーザンもしくはウェスタンブロット分析により検出されず、そしてＴ−ｂｅｔ＋／−ヘテロ接合体で低下されたレベルで存在した。
同腹子対照およびＴ−ｂｅｔ−／−マウスからの胸腺細胞、脾細胞およびリンパ節細胞のフローサイトメトリー分析は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０の発現においても、各末梢リンパ系器官内のリンパ球集団の組成においても異常を示さなかった。従って、Ｔ−ｂｅｔは正常胸腺細胞の成熟もしくは末梢器官への成熟Ｔ／Ｂ細胞のホーミングに必要とされない。
Ｂ．Ｔ−ｂｅｔはＩＦＮ−γ産生およびＴｈ１系譜の決定を制御する
Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスからのＣＤ４＋ Ｔ細胞からのサイトカイン産生プロフィルを検査した。Ｔ−ｂｅｔ−／−、Ｔ−ｂｅｔ＋／−およびＴ−ｂｅｔ＋／＋マウスのリンパ節からＣＤ４＋ Ｔ細胞を精製して９５％純粋のナイーブなＣＤ４＋／Ｍｅｌ１４＋ Ｔ細胞の集団を生じた。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激７２時間後のＥＬＩＳＡにより測定されるところの、野性型同腹子対照Ｔ−ｂｅｔ＋／＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞に比較してのＴ−ｂｅｔ−／− ＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の著しい減少が観察された。ＩＬ−４産生の対応する増大がＴ−ｂｅｔ−／− ＣＤ４＋ Ｔ細胞中で観察された。これらの結果は、Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞が中立条件（サイトカインもしくは抗サイトカイン抗体が添加されなかった）下での初回刺激の間にＴｈ２型サイトカインを産生することを示す。
これがサイトカイン産生に対する中間的な影響であったのかもしくはＴヘルパー細胞分化に対する影響であったのかを決定するために、Ｔ−ｂｅｔ−／−、Ｔ−ｂｅｔ＋／−およびＴ−ｂｅｔ＋／＋マウスのリンパ節からＣＤ４＋ Ｔ細胞を精製しそして中立条件下またはＴｈ１もしくはＴｈ２を誘導する条件下でＴＣＲにより刺激してエフェクターＴヘルパー細胞を生成させた。抗ＣＤ３での再刺激に際してサイトカイン産生をＥＬＩＳＡにより測定した。Ｔ−ｂｅｔ−／− ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＩＬ−４およびＩＬ−５産生の付随する増大を伴い対照Ｔ−ｂｅｔ＋／＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞より劇的により少ないＩＦＮ−γを産生した。この影響は、Ｔｈ１を誘導する条件の存在下で細胞を刺激した場合であってもみられた。再刺激に際してこれらの細胞は非常に低レベルのＩＦＮ−γを産生し、そしてＩＬ−４およびＩＬ−５の産生を抑制し得なかった。従って、Ｔｈ１を誘導する条件下でさえＴ−ｂｅｔ−／− ＣＤ４＋ Ｔ細胞はＴｈ２系譜へとデフォルトで向かう（ｄｅｆａｕｌｔ）。これらの結果は、各ＩＦＮ−γ産生細胞の検査を考慮するアッセイ、ＩＣＣにより確認された。これはＴ−ｂｅｔの非存在下でのＩＦＮ−γ産生細胞の数の著しい減少を示した。われわれは、Ｔ−ｂｅｔは中間のサイトカインの産生を制御するのみならずしかしまたＴヘルパーエフェクター機能に対する大きな影響も有すると結論する。
興味深いことに、ヘテロ接合性のＴ−ｂｅｔ＋／− ＣＤ４＋ Ｔ細胞はサイトカイン産生の中間的表現型を表した。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の対応する減少を伴うＴ−ｂｅｔの１対立遺伝子の非存在が野性型細胞の約半分のＩＦＮ−γを産生する全部のＣＤ４ Ｔ細胞をもたらしたことが可能である。あるいは、閾値レベルのＴ−ｂｅｔに対する非常に強い感受性が存在して約半数の細胞が野性型レベルのＩＦＮ−γを産生したのかもしれない。これらの可能性を識別するためにＩＣＣアッセイを実施した。Ｔｈ１を誘導する条件下で細胞を７日間刺激し、その後ＰＭＡ／イオノマイシンで再刺激しそして細胞内ＩＦＮ−γについて分析した。これは８５％の野性型Ｔｈ１細胞がＩＦＮ−γ産生体であった一方で著しい減少がＴ−ｂｅｔ欠損Ｔｈ１細胞で観察され（９％）かつ中間的な表現型がヘテロ接合性Ｔ細胞で観察された（４６％）ことを示した。従って、ＩＦＮ−γ産生の制御におけるＴ−ｂｅｔの機能は高度に投薬量感受性であり、Ｔｂｘ３およびＴｂｘ５の半数体不足が遺伝的障害（それぞれ尺骨乳腺およびホールト−オーラム症候群）につながる他のＴボックスファミリーの遺伝子の既知の機能と矛盾しない知見である。別の可能性は、ある種のサイトカイン遺伝子（例えばＩＬ−２およびＩＬ−４）について報告されたところのＴ−ｂｅｔの両対立遺伝子（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ）よりはむしろ単一対立遺伝子（ｍｏｎｏａｌｌｅｌｉｃ）発現である。
Ｄ．結論
上述されたところのＴ−ｂｅｔを欠くマウスにおける免疫系の分析は、Ｔｈ１系譜の決定に必要とされる転写因子としてＴ−ｂｅｔをしっかりと確立する。さらに、これが起こる１機構はｉｎ ｖｉｖｏでのＴ−ｂｅｔによるＩＦＮ−γ遺伝子転写の制御であることが明らかである。Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスは、着実な極性化に際してさえ特徴のＴｈ１サイトカイン、ＩＦＮ−γを産生することのＣＤ４ Ｔ細胞の失敗により明示されるとおり、確固たるＴｈ１区画を発生しない。多数の転写因子がＩＦＮ−γ遺伝子の制御に関与している。ＩＦＮ−γプロモーターもしくはイントロン中のＡＴＦ−２、ＮＦκＢ、ＡＰ−１、ＹＹ１、ＮＦ−ＡＴおよびＳｔａｔ部位はｉｎ ｖｉｔｒｏで機能上重要であるが、しかしＩＦＮ−γの組織特異的発現（Ｙｏｕｎｇら、１９９４；Ｓｉｃａら、１９９７；Ｐｅｎｉｘら、１９９６；Ｘｕら、１９９６；Ｓｗｅｅｔｓｅｒら、１９９８）の原因でなく、またそれらはｉｎ ｖｉｖｏでＩＦＮ−γを選択的に制御しない。ここでわれわれはＴ−ｂｅｔがｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞中でのＩＦＮ−γ産生に選択的に必要とされることを示した。自己免疫および癌におけるＴｈ１細胞の病原性の役割ならびに喘息におけるそれらの保護的役割を考えれば、これらの観察結果はヒト疾患の処置に関する明瞭な意味を有する。
実施例１４．Ｔ−ｂｅｔは、ＣＤ４および抗原で活性化されるがしかし抗ＣＤ３で活性化されないＣＤ８ Ｔ細胞におけるインターフェロン−γ産生および系譜の決定に必要とされる
Ｔ−ｂｅｔはＣＤ４およびＣＤ８双方のＴ細胞中で発現される。Ｔ−ｂｅｔがＣＤ４およびＣＤ８双方のＴ細胞中でのＩＦＮ−γ産生に関与しているかどうかを決定するために以下の実験を実施した。精製したＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ｒＩＬ−１２およびｒＩＬ−１８で７２時間刺激し、ＲＮＡを調製しそしてＴ−ｂｅｔ、ＩＦＮ−γおよびＨＰＲＴプローブを使用してノーザンブロット分析を実施した。Ｔ−ｂｅｔ−／−、Ｔ−ｂｅｔ＋／−およびＴ−ｂｅｔ＋／＋ ＬＮから精製したＣＤ８ Ｔ細胞およびＣＤ４ Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で７日間刺激した。ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）での刺激５時間後にＩＣＣ分析を実施した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８での再刺激２４時間後にＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡにより測定した。Ｔ−ｂｅｔ＋／＋もしくは−／−脾細胞からのＣＴＬ前駆細胞をコンカナバリンＡ（５μｇ／ｍｌもしくはプレートに結合した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８および１００Ｕ／ｍｌ ｈＩＬ−２でｉｎ ｖｉｔｒｏで５日間プライミングした（３２）。第５日にＭＡＣＳ精製を使用するポジティブ選択によりＣＤ８ Ｔ細胞（Ｈ−２ｂ）を精製し、そして示されたエフェクター対標的比の５１Ｃｒ標識Ｐ８１５（Ｈ−２ｄ）同種異系標的細胞とともに４時間インキュベートした。
これらの実験の結果は、ＣＤ４ ＴおよびＮＫ細胞と対照的に、Ｔ−ｂｅｔは、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体でＴ細胞受容体および共刺激性のＣＤ２８受容体を介してＴ細胞の他の主要なサブセットすなわち細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞を刺激する場合にこの細胞中でのＩＦＮ−γ産生の制御に関与していないことを示した。しかしながら、実施例２８に記述されるとおり、Ｔ−ｂｅｔは抗原で活性化したＣＤ８細胞からのＩＦＮ−γの産生を制御する。
実施例１５．Ｔ−ｂｅｔはＩｇＧクラススイッチングおよび病原性の自己抗体産生を調節する
Ｔｈ１応答におけるその役割により、Ｔ−ｂｅｔが病因に関してＴｈ１ Ｔ細胞に大きく頼る狼瘡のような全身性自己免疫症候群において決定的に重要な役割を演じているであろうことがありそうである。Ｔ−ｂｅｔ欠損系統をＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓ（ＣＤ９５）ｌｐｒ／ｌｐｒマウス狼瘡系統と異系交配させて４種の遺伝子型すなわちＴ−ｂｅｔ＋／＋Ｆａｓ＋／＋、Ｔ−ｂｅｔ−／−Ｆａｓ＋／＋、Ｔ−ｂｅｔ＋／＋Ｆａｓｌｐｒ／ｌｐｒ（Ｔ−ｂｅｔ＋ｌｐｒ）およびＴ−ｂｅｔ−／−Ｆａｓｌｐｒ／ｌｐｒ（Ｔ−ｂｅｔ−ｌｐｒ）の動物を生成させることにより狼瘡傾向のＴ−ｂｅｔ欠損マウスを生成した。成体６週齢の動物からの組織のフローサイトメトリー分析は、Ｔ−ｂｅｔが脾もしくはリンパ節中のＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＢ２２０陽性Ｂ細胞の均衡のとれた数に対する有意の影響を有しなかったことを示した。加齢に際して、Ｔ−ｂｅｔ−ｌｐｒ動物は、著しく低下された糸球体、間隙および血管周囲の炎症ならびに糸球体免疫複合体沈着を特徴とした免疫複合体腎疾患から保護された。また、それらは蛍光抗核抗体試験および抗ＤＮＡ抗体に対する２種の試験により評価されるとおり有意により少ない体液性自己免疫を発生した。それらの血清はＥＬＩＳＡにより評価されるところのＤＮＡに対する低下されているものの若干の自己免疫を含有したが、しかしクリチジア属（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ）免疫蛍光により評価されるところの本来の二本鎖ＤＮＡを認識することが不可能であり、Ｔ−ｂｅｔ−ｌｐｒ動物における全身性（例えば抗ｓｓＤＮＡ）のしかし突然変異されていない（例えば抗ｄｓＤＮＡ）自己免疫の存在を示唆した。Ｔ−ｂｅｔ＋ｌｐｒ動物に比較して、Ｔ−ｂｅｔ−ｌｐｒ動物は糸球体腎炎関連の死亡から比較的保護された（５７％の生存、ｎ＝７対１００％、ｎ＝６、それぞれ第２８週で）。
驚くべきことに、Ｔ−ｂｅｔ−ｌｐｒ動物は、しばしばそれらのＴ−ｂｅｔ＋ｌｐｒ同腹子よりも多く、皮膚、唾液腺および肝の浸潤物、ならびにリンパ系臓器巨大を包含するＴ細胞自己免疫と矛盾しない他の症状発現を発生し続けた。これらのリンパ系浸潤物は免疫組織病理学により評価されるとおり主としてＴ細胞よりなった。こうした知見は、このモデルにおけるＴｈ１ドミナントＴ細胞の自己免疫がＴ−ｂｅｔの非存在下でほとんど無傷であったことを示唆する。Ｔ−ｂｅｔはＣＤ９５が無傷の動物からのナイーブなＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生に必要とされたとは言え、Ｔ−ｂｅｔ−ｌｐｒ Ｔ細胞はＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を包含する過剰のサイトカインを産生し、また、それらのＴ−ｂｅｔ＋ｌｐｒ同腹子に比較して自己の混合型リンパ球反応における類似の増殖活性を示した。
病原性の自己抗体は免疫複合体糸球体腎炎を誘導するのに必要かつ十分であり、また、Ｔ−ｂｅｔは活性化に際してヒトおよびマウス双方のＢ細胞中で誘導されるため、Ｔ−ｂｅｔがＢリンパ球の機能で直接必要とされることがありそうである。血清レベルにより評価されるとおり、Ｔ−ｂｅｔは高γグロブリン血症ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３（Ｆａｓｌｐｒ／ｌｐｒ動物で増幅される要件）のこれらの狼瘡傾向の動物における完全な発現に必要とされたが、しかしながらＩｇＧ２ａレベルはいずれのＦａｓ遺伝子型からのＴ−ｂｅｔ欠損血清中でもひどく減少されていた。ＩｇＧ２ａ免疫沈着物はＴ−ｂｅｔ−ｌｐｒ動物の腎中で有意に低下された。精製したＴ−ｂｅｔ欠損Ｂ細胞は、分泌された免疫グロブリンによりアッセイされたとおりｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激された場合にＩｇＧ２ａへのクラススイッチングを完了させることが不可能であった。ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３へのクラススイッチングは有意に低下されたが、しかしそれにもかかわらずＴ−ｂｅｔ欠損細胞中に存在した。クラススイッチングアッセイにおいてＴ−ｂｅｔ欠損Ｂ細胞が表面ＩｇＧ２ａを蓄積することも生殖系列もしくはスイッチ後ＩｇＧ２ａ転写物を生成させることも可能でなかったため、これらの欠損は転写レベルで起きているようであった。逆に、Ｔ−ｂｅｔ欠損Ｂ細胞は過剰量のＴｈ２関連アイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＥを産生した。Ｂ細胞培養物への１０μｇ／ｍＬまでの抗ｍＩＬ−４抗体の添加がＩｇＧ２ａ欠損もしくはＩｇＧ１／ＩｇＥ過剰に影響を及ぼさなかったため、これらの欠損はＩＬ−４の相反しない影響から単純に生じたわけではなかった。これらの観察結果は、生殖系列の転写物のレベルでのＩｇＧ２ａの調節におけるＴ−ｂｅｔの大きな役割を示唆し、そしてさらにそれをＩｇＧ１およびＩｇＥの調節に関与させる。
Ｔ−ｂｅｔがＩｇＧ２ａの調節を直接制御するというさらなる証拠は以下を包含する。Ｔ−ｂｅｔ発現プラスミドでのマウスプレＢ細胞リンパ腫１８．８１のトランスフェクションは内因性のＩｇＧ２ａ生殖系列の転写物を誘導した。加えて、Ｔ−ｂｅｔを発現するレトロウイルスでの初代Ｔ−ｂｅｔ欠損Ｂ細胞の形質導入はＩｇＧ２ａ生殖系列の転写物ならびに分泌型ＩｇＧ２ａを生成させる能力を賦与する。さらに、ＣＭＶ初期プロモーターの制御下にＴ−ｂｅｔを発現するＣＭＶ−Ｔ−ｂｅｔトランスジェニックマウス系列から精製したＢ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＰＳおよびｒｍＩＦＮ−γで刺激した場合に非トランスジェニックの同腹子からのＢ細胞に比較して増大された量のＩｇＧ２ａを産生した（４９０±５０ｎｇ／ｍＬ対１０５８±１２０ｎｇ／ｍＬ、ｎ＝３）。Ｔ−ｂｅｔがＩＦＮ−γシグナル伝達経路中である役割を演じているかどうかを決定するために、ＣＭＶ−Ｔ−ｂｅｔトランスジェニック系列をＩＦＮ−γ受容体（ＩＦＮγＲ）欠損背景と交配した。Ｔ−ｂｅｔはＩｇＧ２ａの産生をこのときはＩＦＮ−γシグナル伝達の非存在下で増強することが可能であった。Ｔ−ｂｅｔ欠損Ｂ細胞の増殖能力ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＧＭ−ＣＳＦを包含するＢ細胞活性化のいくつかのマーカーをアップレギュレートするそれらの能力はｉｎ ｖｉｔｒｏで影響を受けず、ＩｇＧ転写の調節におけるＢ細胞の活性化状態に依存しないＴ−ｂｅｔの直接的役割をさらに示唆した。
Ｔ−ｂｅｔは従って、ＩＦＮ−γに応答してＩｇＧ２ａにクラススイッチする能力をＢリンパ球に賦与する。Ｔ−ｂｅｔは他のＩｇアイソタイプの調節においてもまた重要な役割を演じ、そして従って病原性の自己抗体産生の調節において主要な役割を演じている。特定の一理論により拘束されずに転写因子としてのその役割を考えれば、Ｔ−ｂｅｔは、アイソタイプスイッチ組換えの前提条件として強く関係づけられている生殖系列の転写物の制御を介してクラススイッチングを調節することがありそうである。あるいは、Ｔ−ｂｅｔは、それがＣＤ４ Ｔ細胞中でＩＦＮ−γについてそうするように転写もしくは組み換え因子へのＩｇＧ遺伝子座の接近可能性の媒介に参画しているかもしれない。いずれのシナリオにおいても、Ｔ−ｂｅｔは古典的ＩＦＮ−γ関連免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ２ａをトランス活性化するためのシグナルのメディエーターとしてはたらくが、それでもなお古典的Ｔｈ２関連アイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＥを阻害する。Ｔ−ｂｅｔは外因性のＩＦＮ−γの非存在下で生殖系列の転写物を誘導することが可能である一方、ＩｇＧ２ａの完全な野性型レベルの産生はＩＦＮ−γシグナル伝達を必要とするようであり、Ｔ−ｂｅｔがＳＴＡＴ１のようなＩＦＮγＲ経路において別の因子と共同しているか、もしくは例えば完全な活性のためのＩＦＮγＲにより活性化されるチロシンリン酸化のようなシグナル伝達メッセージを少なくとも必要とすることを示唆する。
ＩｇＧアイソタイプのクラススイッチングの調節物質としてのＴ−ｂｅｔの同定は、それらの見かけ上非常に離れた遺伝子座の調節領域によりその研究が大きく妨げられてきたＩＬ−４非依存性ＩｇＧサブクラスの今後の転写分析において有用と判明するかもしれない。本結果はＴ−ｂｅｔが全細胞中で内因性のＩｇＧ２ａ転写物をトランス活性化し得ることを示すとはいえ、それは、少なくとも１８．８１細胞中ではＩエキソンの上流の推定のＩｇＧ２ａプロモーターの３ｋＢよりなるレポーター構築物をトランス活性化し得ない。従って、ＩｇＧ２ａの調節領域は、少なくともそれがＴ−ｂｅｔに関する際には極めて離れているかもしれない。本結果は従って、Ｔ−ｂｅｔ欠損Ｂ細胞におけるＩｇＧ２ａ生殖系列の転写物の完全なしかしそれでもなお選択的な非存在を考えればとりわけ重要である。比較すると、他の転写因子ノックアウトにより引き起こされるいくつかの報告された免疫グロブリンアイソタイプ免疫不全は複数のＩｇアイソタイプおよび／もしくは他の発生上のＢ細胞異常を伴う。従って、本発明はＴ−ｂｅｔをクラススイッチ機構における１アイソタイプ特異的な参画体と同定する。
実施例１６．Ｔ−ｂｅｔは実験的大腸炎およびクローン病における粘膜Ｔ細胞活性化を調節する
クローン病および潰瘍性大腸炎はヒトにおける２つの主要な形態の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。クローン病は消化管中のどこでも起こり得る経壁肉芽腫性炎症を特徴とする一方、潰瘍性大腸炎は大腸に限定されるより表層的な連続的炎症を引き起こす。該疾患の病因は未知であるとは言え、連続的な病原性サイトカイン産生を伴う細菌抗原に応答しての粘膜免疫系の活性化およびマトリックスメタロプロテイナーゼの活性化が重要な病原性の役割を演じていることが示唆されている。とりわけ、Ｔリンパ球により産生されるサイトカインが慢性の腸炎症を開始かつ永続させるようである。興味深いことに、粘膜固有層のＣＤ４＋ Ｔリンパ球によるサイトカイン産生がクローン病と潰瘍性大腸炎との間で異なる。前者の疾患はＩＦＮ−γおよびＴＮＦのようなＴヘルパー１（Ｔｈ１）型サイトカインの増大された産生を伴う一方、後者の疾患は、ＩＦＮ−γ産生は影響を及ぼされずに大量のＴｈ２型サイトカインＩＬ−５を産生するＴ細胞を伴う。Ｔｈ１およびＴｈ２双方媒介性の炎症性腸疾患において、主としてＴｈ３細胞および調節性Ｔ細胞（Ｔｒ）の独特の１集団により分泌される免疫抑制サイトカインＴＧＦ−βが強力な保護効果を提供する。
Ａ．クローン病を伴う患者からの粘膜固有層Ｔ細胞におけるＧＡＴＡ−３およびＴ−ｂｅｔの交互の発現
粘膜固有層Ｔ細胞によるサイトカイン産生の変化は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の病因における重要な一現象として関係づけられているため、ＩＢＤ患者における精製した粘膜固有層（ＬＰ）Ｔ細胞によるＴ−ｂｅｔの発現に関する一連の実験を実施した。免疫蛍光二重染色研究は、クローン病（ＣＤ）を伴う患者におけるＴ−ｂｅｔ発現ＬＰ Ｔ細胞の蓄積を示した。加えて、Ｔ−ｂｅｔはクローン病を伴う患者のＬＰ単核細胞の細胞質および核双方中で強く発現された一方、対照患者および潰瘍性大腸炎を伴う患者においては核周囲領域の弱い染色のみが観察されたかもしくは染色は観察されなかったことが見出された。クローン病を伴う患者におけるＴ−ｂｅｔの増大された発現を確認するために、クローン病を伴う患者および対照患者からの精製したＬＰ Ｔ細胞の核抽出物を単離し、そしてＥＭＳＡおよびウェスタンブロット分析によるＴ−ｂｅｔの発現を分析した。クローン病を伴う患者は対照患者に比較してより多量の核Ｔ−ｂｅｔを発現した。
ＣＤ患者からのＬＰ Ｔ細胞中のＧＡＴＡ−３の発現もまた評価した。ＧＡＴＡ−３発現は、結腸凍結切片上でのＣＤ３およびＧＡＴＡ−３の免疫組織化学的二重染色分析により評価されるとおり、対照患者に比較してＣＤ患者からのＬＰ Ｔ細胞中でダウンレギュレートされていた。これらのデータは、本疾患における増大されたＩＦＮ−γしかし減少されたＩＬ−４およびＩＬ−５産生と関連するＣＤのＬＰ Ｔ細胞中でのＧＡＴＡ−３およびＴ−ｂｅｔの交互発現パターンを暗示する。
Ｂ．慢性腸炎症のＴｈ１（しかしＴｈ２でない）媒介性の動物モデルにおけるＴ−ｂｅｔ発現の誘導
多様な動物の大腸炎モデル中のＴ細胞濃縮粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）からの核タンパク質を単離し、そしてＥＭＳＡおよびウェスタンブロット分析によりＴ−ｂｅｔ発現を評価した。ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞で再構成したＳＣＩＤもしくはＲＡＧマウスにて観察されるＴＨ１媒介性の大腸炎モデルのＴ細胞濃縮ＬＰ細胞中でＴ−ｂｅｔが強く発現されることが見出された。時間経過研究は、結腸中での増大したＴ−ｂｅｔ発現が大腸炎の発症前に細胞移入後約３週間で発生したことを示した。最大の発現は、マウスが大腸炎を発症し始めた細胞移入６週後に示されたとは言え、増大したＴ−ｂｅｔ発現はまたＴ細胞移入後１２週で見られた十分に発達した大腸の炎症でも観察された。さらに、増大したＴ−ｂｅｔ発現は慢性腸炎症の２種の追加のＴＨ１媒介性の動物モデル、すなわちＩＬ−１０欠損マウスにおける大腸炎およびハプテン試薬２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）により誘導される大腸炎で一貫して示された。対照的に、不変のもしくは低レベルのＴ−ｂｅｔがオキサゾロン大腸炎およびＴＣＲα−／−μ−／−関連大腸炎；（それぞれＩＬ−４産生Ｔ細胞およびＴｈ２細胞により媒介されると考えられている２種の大腸炎モデル）のＴ細胞濃縮ＬＰ細胞中で検出された。これらの知見は、Ｔ−ｂｅｔが潜在的に実験的大腸炎においてｉｎ ｖｉｖｏで粘膜のＴＨ１／ＴＨ２サイトカインの均衡の重要な調節物質であることを示す。
Ｃ．Ｔ−ｂｅｔのレトロウイルスもしくはトランスジェニック過剰発現はＳＣＩＤマウスにおいて重症のＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔｈ１ Ｔ細胞媒介性大腸炎の早期発症を誘導する
トランスジェニックもしくはレトロウイルス過剰発現技術によりｉｎ ｖｉｖｏでのＴｈ１媒介性大腸炎におけるＴ−ｂｅｔの潜在的な調節的役割を決定するために、Ｔ−ｂｅｔレトロウイルスへの感染後のＴ細胞の大腸炎誘発性の潜在能力を分析した。レトロウイルスでＴ−ｂｅｔを形質導入したＦＡＣＳ分取ＧＦＰ＋ ＣＤ６２Ｌ＋ダブルポジティブＣＤ４＋ Ｔ細胞は、体重減少曲線により評価されるとおり、対照で形質導入したＣＤ６２Ｌ＋ Ｔ細胞で再構成したＳＣＩＤマウスに比較してＳＣＩＤマウスにおける重症の大腸炎のより早期の発症を誘導した。この表現型はＴ−ｂｅｔの過剰発現がＴＨ１媒介性の慢性腸炎症の発生を加速することを示す。Ｔ−ｂｅｔトランスジェニックマウスからのＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の移入が野性型同腹子からのＴ細胞に比較してＳＣＩＤマウスにおける大腸炎活動のより早期の発生を誘導したことがさらに観察された。
Ｄ．Ｔ−ｂｅｔを欠く（Ｔ−ｂｅｔノックアウト）マウスはＴｈ２媒介性大腸炎に対しより感受性である
Ｔ−ｂｅｔ遺伝子がＴ細胞媒介性大腸炎について相同的組換えにより不活性化されているマウスの感受性を決定するために、Ｔ細胞によるＩＬ−４産生に依存することが以前に示されているオキサゾロン誘発性大腸炎モデルを使用してＴｈ２媒介性大腸炎に対する変えられた感受性を表したＴ−ｂｅｔ欠損マウスを分析した。Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウスは、体重曲線により）、巨視的および組織病理学的基準に基づき野性型同腹子およびヘテロ接合性Ｔ−ｂｅｔマウス双方に比較してオキサゾロン誘発性大腸炎に対する高められた感受性を有した。これは脾ＣＤ３＋ Ｔ細胞によるＩＬ−４産生の顕著な増大により付随された一方、これらの細胞によるＩＦＮ−γ産生は有意に変化しなかった。
ＩＬ−４産生の観察された増大が野性型とＴ−ｂｅｔノックアウトマウスとの間の差異の原因であったかどうかを決定するために、ＩＬ−４に対する抗体もしくは対照ラットＩｇをオキサゾロン感作後のＴ−ｂｅｔノックアウトマウスに投与した。ＩＬ−４に対する抗体はオキサゾロン処理Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウスにおける組織学的な大腸炎の活動を抑制し、Ｔｈ２媒介性大腸炎におけるＴ−ｂｅｔの保護的役割がＩＬ−４産生のその直接もしくは間接的調節によることを示した。
Ｅ．Ｔ−ｂｅｔ欠損は、ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を使用する養子移入モデルにおけるＴｈ１媒介性の実験的大腸炎から保護する
ＳＣＩＤおよびＲＡＧノックアウトマウスにおけるＣＤ４＋ ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５Ｒｂｈｉｇｈ Ｔ細胞の移入により誘発されるＴｈ１媒介性大腸炎におけるＴ−ｂｅｔ欠損の影響を評価した。野性型マウスからのＴ−ｂｅｔを発現するＣＤ４＋ ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔ細胞の移入は重症の大腸炎の臨床的および内視鏡的兆候をもたらした。対照的に、Ｔ−ｂｅｔ−／−ＣＤ４＋ ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔ細胞の移入は慢性下痢、体重減少、直腸脱および大腸炎の内視鏡的兆候を誘発することに失敗した。さらに、Ｔ−ｂｅｔ欠損Ｔ細胞の移入は、巨視的および組織学的基準により評価されるとおり３回の独立した実験でＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５Ｒｂｈｉｇｈ ＣＤ４＋ Ｔ細胞で再構成したＳＣＩＤマウスにおける顕著に低下された大腸炎の活動性をもたらした。ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞誘発性大腸炎に対するＴ−ｂｅｔ欠損のこの保護効果は、少なくともＳＴＡＴ−１欠損ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の移入に際してみられるものと同じくらい顕著であった（組織病理学的スコア：ＳＴＡＴ−１−／−再構成マウス：１．２５＋／−０．９対Ｔ−ｂｅｔ−／−再構成マウス：０．８＋／−０．２）。Ｔ−ｂｅｔノックアウトＴ細胞再構成マウスからのＬＰ Ｔ細胞は野性型のＴ細胞再構成マウスからのＬＰ細胞に比較してより少ないＩＦＮ−γを産生し（３３６＋／−２４ｐｇ／ｍｌ対１１５９＋／−２５ｐｇ／ｍｌ）、Ｔ−ｂｅｔ欠損が粘膜ＣＤ４＋ Ｔ細胞による炎症前サイトカイン産生を抑制することを示す。興味深いことに、ヘテロ接合性Ｔ−ｂｅｔマウスからのＣＤ４＋ ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔ細胞は、おそらくサイトカイン遺伝子発現およびこれゆえにＴ細胞の大腸炎誘発性の潜在能力の制御におけるＴ−ｂｅｔ発現の閾値効果により、３回の独立した実験で大腸炎を誘発することの顕著な変動性を示した。
Ｆ．Ｔ−ｂｅｔは大腸炎誘発性の刺激の非存在下でＴ細胞濃縮粘膜固有層細胞によるＩＦＮ−γとＩＬ−４産生との間の粘膜の均衡を制御する
Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスにおける粘膜固有層の構造および粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）によるサイトカイン産生を評価した。大腸炎誘発性の刺激の非存在下で、Ｔ−ｂｅｔヘテロ接合性およびＴ−ｂｅｔノックアウトマウスの小腸および大腸における巨視的もしくは組織学的異常は観察されなかった。Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスおよび野性型同腹子からのＴ細胞濃縮ＬＰＭＣによるサイトカイン産生を分析するために、細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８により４８時間刺激し、そして培養上清中のサイトカイン産生をＥＬＩＳＡにより測定した。２回の独立した実験は、Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウスからのＴ細胞濃縮ＬＰＭＣが大腸炎誘発性刺激の非存在下で野性型同腹子からの細胞より低レベルのＩＦＮ−γを分泌したことを示した。対照的に、Ｔ細胞濃縮ＬＰＭＣによるＴｈ２型サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の産生はＴ−ｂｅｔ欠損動物で野性型マウスに比較して高められた。とりわけ、Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＴ−ｂｅｔ＋／− ＬＰＭＣによるＩＬ−４産生は野性型同腹子からのＴ−ｂｅｔを発現するＬＰＭＣに比較して増大された（図７ｂ）。サイトカイン産生のこれらの変化は、小腸および大腸双方からのＬＰＭＣを使用してみられ、Ｔ−ｂｅｔが腸免疫系全体における粘膜のＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインの均衡の調節物質であることを示した。
Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウスにおけるＬＰＭＣによる増大されたＴｈ２サイトカイン産生がＬＰ Ｔ細胞における活性化されたＩＬ−４シグナル伝達についての証拠と関連したかどうかを次に評価した。ゲル遅延アッセイおよびウェスタンブロット分析の双方により示されるとおり、Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウスの粘膜におけるＴｈ２エフェクターＴ細胞の増大された存在と矛盾しない、Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスのＴ細胞濃縮ＬＰＭＣからの核抽出物中での増大されたＧＡＴＡ−３発現が存在した。
Ｇ．Ｔ−ｂｅｔ欠損の調節性ＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、Ｔｈ１媒介性大腸炎において高められた保護的機能を示しかつ増大されたＴＧＦ−β産生およびシグナル伝達を表す
Ｔ細胞中でのＴＧＦ−β産生およびシグナル伝達に対するＴ−ｂｅｔ欠損の影響を決定するために、Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウス中のＴ細胞濃縮ＬＰＭＣを観察し、そして野性型同腹子からの細胞に比較して増大された量のＴＧＦ−βを産生することが示された。Ｔ細胞によるＴＧＦ−β産生は最近、慢性の腸炎症の抑制において重要な役割を演じることが示唆されたため、Ｔ−ｂｅｔの非存在下でのＴＧＦ−βのこの増大された産生は大腸炎におけるＴ−ｂｅｔの調節機能に重要である可能性がある。腸の炎症において、ＴＧＦ−βは、ＣＤ４＋ ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔ細胞と共移入される場合にＳＣＩＤマウスにおいて大腸炎の活動性を抑制することが示されている調節性ＣＤ２５＋ ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ ＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞の独特の１集団により主として産生される。さらに、少なくとも脾において、ＩＬ−４産生Ｔ細胞は二次培養物中で大量のＴＧＦ−βを産生することが示されている。
健康なマウスからの脾ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞双方がウェスタンブロット分析により示されるとおり大量の核Ｔ−ｂｅｔを発現した。しかしながら、脾ＣＤ２５＋細胞はより少量の核Ｔ−ｂｅｔ発現を示した。さらに、Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウスからのＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、野性型マウスからの細胞に比較して、Ｓｍａｄ７（Ｔ細胞中でＩＦＮ−γにより誘導されかつＴＧＦ−βのシグナル伝達を抑制する阻害性Ｓｍａｄタンパク質）の減少された発現を示した。一貫して、脾Ｔ−ｂｅｔ−／− ＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、高められたＴＧＦ−βシグナル伝達を暗示する、Ｔ−ｂｅｔを発現するＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞に比較して増大された核Ｓｍａｄ３発現を表した。これらの知見に基づき、Ｔ−ｂｅｔを発現するＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞により誘発される大腸炎を抑制する野性型、Ｔ−ｂｅｔヘテロ接合性およびＴ−ｂｅｔノックアウトマウスからのＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔリンパ球の潜在的調節能力を分析した。調節性ＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＴ−ｂｅｔを発現する野性型マウスからのナイーブなＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の共移入は、ｉｎ ｖｉｖｏでのこのＴ細胞サブセットの保護的役割を確認する、ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞で再構成したマウスに比較してより少なく重症の大腸炎に至った。さらに、Ｔ−ｂｅｔ欠損の調節性ＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞の共移入は、野性型マウスからの調節性ＣＤ６２Ｌ−細胞に比較してＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞媒介性大腸炎に対するより顕著な保護効果を引き起こした。この知見は、再構成したマウスからの粘膜固有層Ｔ細胞および再構成したマウスの脾における調節性ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の数の拡大によるＴＧＦ−βの増大された産生を伴った。
Ｈ．Ｔ−ｂｅｔは調節性Ｔ細胞におけるＴＧＦ−β産生およびシグナル伝達を制御し、また、ＴＧＦ−βはＴ−ｂｅｔ発現を阻害する
ＩＬ−１０もしくはＴＧＦ−βを産生する調節性Ｔ細胞は、Ｔリンパ球の活動性を抑制することによりＴｈ１媒介性大腸炎における保護効果を媒介する。Ｔ−ｂｅｔが調節性Ｔ細胞中でのＴＧＦ−β産生およびシグナル伝達においてある役割を有するかどうかを決定するために以下の研究を実施した。組換えＩＬ−４およびＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）を伴いもしくは伴わないＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体の存在下で細胞を培養した。細胞抽出物を４８時間後に作成しそしてウェスタンブロット分析によりＴ−ｂｅｔおよびβ−アクチンの発現について分析した。大腸炎誘発性の刺激の非存在下で野性型（ＷＩＬＤ ＴＹＰＥ）、Ｔ−ｂｅｔヘテロ接合性（ＨＥＴ）およびＴ−ｂｅｔノックアウト（ＫＮＯＣＫ ＯＵＴ）マウスからのＴ細胞濃縮ＬＰＭＣによりＴＧＦ−βが産生されるかどうかを決定するために、細胞をＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体で刺激しかつ上清をＥＬＩＳＡにより分析した。Ｔ−ｂｅｔが健康な野性型マウスからの脾ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞中で発現されるかどうかを決定するために、これらの細胞からの細胞質（ＣＹＴ）および核（ＮＵＣ）抽出物を単離しそしてウェスタンブロッティングによりＴ−ｂｅｔ発現について分析した。ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達がＴ−ｂｅｔ欠損ＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞中で増大されるかどうかを決定するために、野性型およびＴ−ｂｅｔノックアウトマウスからのＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ならびにｒＩＦＮ−γで１２時間刺激し、次いでタンパク質を抽出しかつウェスタンブロット分析した。細胞抽出物はＳｍａｄ７発現について分析した一方、核抽出物をＳｍａｄ３レベルについて分析した。ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋で再構成したマウスの炎症スコアを測定するために、野性型マウスからのＴ細胞ならびにＴ−ｂｅｔノックアウトマウス（ＫＮＯＣＫ ＯＵＴ）および野性型（ＷＩＬＤ ＴＹＰＥ）対照マウスからのＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞を測定した。
野性型マウスからのＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、およびＴ−ｂｅｔノックアウトマウス（ＫＮＯＣＫ ＯＵＴ）もしくは野性型（ＷＩＬＤ ＴＹＰＥ）対照マウスからのＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞で再構成したマウスからの脾ＣＤ４＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析もまた実施した。最後に、血清を含まない培地中でＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体で細胞を刺激することにより、上の再構成したマウスからのＬＰＭＣによるＴＧＦ−β産生を測定した。上清を３日後に収集し、次いで上清をＥＬＩＳＡにより分析した。
前述の研究は粘膜のサイトカイン産生におけるＴ−ｂｅｔの調節性の役割を示す。とりわけ、本発明は、Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウスからのＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞が野性型マウスからの対応する細胞集団よりもＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞誘発性の大腸炎に対するより強い保護効果を現すことを示す。Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスからのＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞は増大された核Ｓｍａｄ３発現を表したため、この観察結果はＴＧＦ−β産生およびシグナル伝達の差異に関係する。Ｔ細胞上のその受容体へのＴＧＦ−βの結合後、Ｓｍａｄ３はＴＧＦ−β受容体Ｉと相互作用し、次いでＳｍａｄ３がインポーチン−１βおよびＲａｎＧＴＰアーゼに媒介されて核中に輸入され、ここでそれがβ標的遺伝子の発現を制御する。ＩＦＮ−γは阻害性Ｓｍａｄ−７タンパク質の合成のＪａｋ１／ＳＴＡＴ−１媒介性の迅速な活性化によりＴＧＦ−βのシグナル伝達を阻害することが以前に示されており、それが順にＴＧＦ−β Ｉ型受容体とのＳｍａｄ３の相互作用を予防し得る。さらに、Ｓｍａｄ７は、分解のためＴＧＦ−β受容体を標的に定めるユビキチンリガーゼＳｍｕｒｆ２と複合体を形成し得る。従って、Ｔ−ｂｅｔ欠損動物における脾ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＴ細胞濃縮粘膜固有層細胞によるＩＦＮ−γの低下された産生は、Ｓｍａｄ７の低下された発現、次いでＳｍａｄ３／４を介する増大されたＴＧＦ−βシグナル伝達を引き起こす。事実、Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスからのＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞は野性型マウスからのＴ細胞に比較して低下されたレベルのＳｍａｄ７を発現する。
ＴＧＦ−βに対する中和抗体の投与がＴｈ１媒介性大腸炎に対するＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ Ｔ細胞の保護能力を抑制することが知られているため、本発明は、Ｔ−ｂｅｔ欠損ＣＤ６２Ｌ− ＣＤ４＋ 細胞の高められた調節能力が増大されたＴＧＦ−β産生およびシグナル伝達によることを示す。ＴＧＦ−βがそれ自身の産生を正に調節することが示されているために、Ｔ細胞移入後にＴ−ｂｅｔ欠損Ｔ細胞の高められたＴＧＦ−β産生が増強されることがありそうである。粘膜免疫系についてのＳｍａｄ３を介するＴＧＦ−β１発現もしくはＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達の異常の関連は、これらのタンパク質についてのノックアウトマウスがＴ細胞媒介性の慢性腸炎症を発症させるという観察結果により示されている。ＴＧＦ−βは順に粘膜細胞中のＴ−ｂｅｔ発現をダウンレギュレートし、Ｔ細胞中でのＴＧＦ−βとＴ−ｂｅｔ間のレベルの交互の関係を示す。われわれは、ＴＧＦ−βとＴ−ｂｅｔとの間の交互の関係を示唆する、活性化されたＴ細胞濃縮ＬＰＭＣのＴＧＦ−β（しかしＩＬ−４でない）での処理がＴ−ｂｅｔ発現を抑制したことを観察した（図１３）。
要約すれば、本発明は、Ｔ−ｂｅｔをＴ細胞媒介性慢性腸炎症およびＴＧＦ−βによる保護的免疫応答の調節の支配的スイッチとして同定する。Ｔ−ｂｅｔは大腸炎においてＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン産生を制御し、そしてそのレベルはＴＧＦ−βによりダウンレギュレートされる。さらに、Ｔ−ｂｅｔのダウンレギュレーションはＳｍａｄ７のＴ−ｂｅｔ媒介性の活性化の失敗による増大されたＴＧＦ−βレベルを伴う。さらに、ＴＧＦ−βレベルはＴ−ｂｅｔを欠くマウスにおける大腸炎と相関する。従って、Ｔ−ｂｅｔ機能の調節は、クローン病で観察されるようなＴｈ１媒介性の慢性腸炎症における局所の治療的介入の価値ある標的となる。
実施例１７．Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスはヒト喘息と矛盾しない気道変化を自発的に発生させる
ヒト喘息は、可逆性の気道閉塞、気道炎症、気道過剰応答性（ＡＨＲ）および慢性喘息においては気道リモデリングを伴う。喘息のマウスモデルはヒト疾患の特徴の多くを模倣する。これらのモデルにおいて、ＩＬ４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生が喘息様表現型の発生と関連づけられている。養子移入モデルにおいて、気道中のＴｈ１細胞によるＩＦＮγの高められた発現はアレルギー性疾患に対し保護するが、しかしＴｈ１細胞の存在はＴｈ２細胞誘発性の気道の過反応性および炎症を弱めない。
Ｔ−ｂｅｔが正常個体の肺およびアレルギー性喘息を伴う患者において発現されたかどうかを決定するために、Ｔ−ｂｅｔに対するｍＡｂを使用する免疫組織化学を実施した。該結果は、１３名の正常対照肺中でのＴ−ｂｅｔの発現、しかしアレルギー性喘息を伴う７例の患者での非常にわずかな発現を示した。連続切片中でのＣＤ４およびＴ−ｂｅｔについての二重染色は、Ｔ−ｂｅｔを発現する細胞の大部分がＣＤ４＋ Ｔ細胞であったことを示した。従ってＴ−ｂｅｔ欠損は喘息の表現型の多くの局面を概括する。
こうした動物が誘発された喘息の表現型の多様な局面を明示することができるかどうかを確かめたるため、Ｔ−ｂｅｔの標的を定められた欠失を伴うナイーブなマウス（すなわち抗原感作も攻撃もされていない）を検査した。野性型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）マウスに比較して、Ｔ−ｂｅｔの標的を定められた欠失についてヘテロ接合性（Ｔ−ｂｅｔ ＋／−）もしくはホモ接合性（Ｔ−ｂｅｔ−／−）いずれのものも、麻酔されない動物において増強休止応答（ｐａｕｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（Ｐｅｎｈ）次いでメタコリンへのエアゾル曝露により測定されるとおり、より大きな気道応答性を表した。これらの知見は、卵アルブミンへの全身曝露により感作されたがしかしエアゾルのリン酸緩衝生理的食塩水で偽攻撃されたマウス（ＯＶＡ／ＰＢＳと命名される）において、メタコリンの静脈内注入から生じる肺抵抗性応答を転帰指標として使用した場合に野性型マウスに比較してＴ−ｂｅｔ（＋／−）および（−／−）双方のマウスが気道過剰応答性を明示したという実例により確認された。Ｔ−ｂｅｔ（−／−）マウスの気道の基礎での組織病理学的分析は対照の野性型同腹子と比較して好酸球およびリンパ球を伴う気管支周囲および細静脈周囲の浸潤を示した。Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスは基底膜の下の線維芽細胞様細胞の増大された沈着を有した。好酸球は、ＩＬ−５の高められた回収にもかかわらずＴ−ｂｅｔ欠損マウスの気管支肺胞洗浄液中に存在しなかった。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の５０％減少のみを有するＴ−ｂｅｔ＋／−ヘテロ接合性マウスは、Ｔ−ｂｅｔの完全な非存在を伴うマウスに非常に類似の表現型を表した。
Ｔ−ｂｅｔ−／−および＋／−動物で観察される自発性喘息と対照的に、喘息の多くのマウスモデルは疾患を導き出すプライミングおよびアレルゲンへの感作のプロトコルに依存する。従って、それが野性型マウスでそうであるように、それがＴ−ｂｅｔ欠損マウスにおいて高められた気道応答性につながることができるのかどうかを決定するために、以前にＯＶＡに感作させたマウスのＯＶＡエアゾル攻撃を試験した。ＯＶＡに対し感作されかつエアゾル攻撃を受領するＴ−ｂｅｔ欠損マウスにおけるメタコリンの静脈内注入後に観察された肺抵抗性応答は、エアゾルＯＶＡ攻撃を受領しなかったマウスで観察されたものに類似であった。ＯＶＡ／ＯＶＡ曝露後に、好酸球もしくはリンパ球を伴う気道の浸潤に関してまたは気管支肺胞洗浄液の細胞組成において、野性型もしくはＴ−ｂｅｔ欠損マウスの間で差異は観察されなかった。従って、低下されたもしくは非存在のレベルのＴ−ｂｅｔを伴うマウスは、抗原刺激でさらに悪化されない自発性のアレルゲン非誘発性の喘息表現型を表す。
上皮下コラーゲン層の厚さを野性型ならびにＴ−ｂｅｔ−／−および＋／−欠損動物で評価した。野性型動物においては基底膜下にコラーゲンの最小限の沈着が存在した一方、Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスにおいては、基底膜下のコラーゲン層は、それが野性型マウスでそうであったよりも有意により厚かった。肥厚したコラーゲン層に加え、α−平滑筋アクチンの免疫染色により評価されるところの増大された数の気管支筋芽細胞が存在した。これらのデータは、Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスの気道が慢性喘息を伴うヒトで観察されるものに類似のリモデリングを受けることを示す。
気道におけるこれらの構造的変化が野性型とＴ−ｂｅｔ欠損マウスとの間のサイトカイン発現のパターンの差異と関連するかどうかを検査した。ＴＧＦ−β（組織線維症の強力な刺激物質）、ＴＮＦαおよびＩｌ−４（喘息における気道の慢性リモデリングに関与する別の炎症前サイトカイン）が、Ｔ−ｂｅｔの標的を定められた欠失についてホモ接合性のマウスのＢＡＬＦから増大された量で回収された。Ｔ−ｂｅｔ欠損はサイトカイン発現のパターンの選択的変化を誘導した。ＩＬ−１０およびＩＬ−６産生で有意の変化が観察されなかったためである。標的を定められた欠失についてヘテロもしくはホモ接合性いずれのマウスにおいても生理学的および組織学的知見が同様であったとは言え、ホモ接合性マウスのみがサイトカインの増大された産生を表した。
気道過反応性および気道炎症の原因であるＴ−ｂｅｔ欠損マウス中の細胞の同自性を多様な群のＯＶＡ感作マウスからの脾ＣＤ４＋細胞の組織適合性ＳＣＩＤマウスへの養子移入により検査した。マウスの肺への移入されるＴ細胞の局在化を高めるため、Ｔ細胞の養子移入１日前にＯＶＡエアゾルを投与した。養子移入の翌日にＯＶＡエアゾル曝露を開始しかつ３日間継続した。細胞移入４日後に肺の構造を評価した。対照ＳＣＩＤマウスは生理的食塩水に懸濁したＴ細胞ではなく、生理的食塩水の腹腔内注入を受領した。野性型脾ＣＤ４細胞のレシピエントは、ＯＶＡ感作を受領したがしかし攻撃されなかった野性型マウスに匹敵する気道応答性を有した。Ｔ−ｂｅｔを欠くＣＤ４細胞で再構成したマウスは野性型同腹子由来のＣＤ４細胞で再構成したマウスと比較して増大しかつＯＶＡ感作されたＴ−ｂｅｔを欠くマウスのものに類似の気道過剰応答性を示した。肺構造の測定後に収集したＢＡＬＦ細胞のＣＤ４染色を実施してＣＤ４＋細胞が肺に動員されたことを保証し；野性型（＋／＋）マウスでのＣＤ４陽性であったリンパ球の比率は３８．９％＋／−２．２であり；ＣＤ４ Ｔ−ｂｅｔ（＋／−）マウスでは３９．５７％＋／−６．４８であり；そしてＴ−ｂｅｔ（−／−）マウスでは３８．５％＋／−５．４８であった。加えて、Ｔ−ｂｅｔ（−／−）マウス由来のＣＤ４細胞で再構成したＳＣＩＤマウスの肺は野性型マウス由来の脾ＣＤ４＋細胞で再構成したレシピエントマウスに比較してＢＡＬＦ中の増大されたＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を表し、Ｔ−ｂｅｔ（−／−）マウスで観察される気道過反応性がＴ細胞媒介性であることを示す。さらに、ＩＬ−１３に対する抗体でのＴ−ｂｅｔノックアウトマウスの処置は気道の過反応性を阻止し、Ｔ−ｂｅｔが作用する一機構がＩＬ−１３の産生を調節することであることを示す。
本発明は、Ｔ−ｂｅｔの標的を定められた欠失が、誘発された炎症応答の非存在下で、感作されたマウスにおいてアレルゲン曝露により創製されるものに類似のマウス気道における生理学的および炎症の表現型をもたらすことを示す。急性の炎症性変化に加え、Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスはヒト疾患を連想させる喘息と一致した気道リモデリングを示す。珍しいことに、この表現型は自発的に存在しそして十分に発達している。アレルゲンで感作かつ攻撃される場合にＴ−ｂｅｔ欠損マウスはそれらの生理学的もしくは病理学的いずれの応答も高めることに失敗するためである。
実施例１８．Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスはＥＡＥ発症に対し抵抗性である
Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスをＥＡＥのマウスモデルにて評価した。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）は、正常動物において百日咳トキシンの存在下で脳炎誘発性Ｔ細胞応答を生成させることが可能である。Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＴ−ｂｅｔ−／＋マウスをミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質由来のペプチド（ＭＯＧ ３５−５５）で免疫してＥＡＥを誘発させた。マウスの群を２５日まで追跡して臨床疾患について記述されたとおり（Ｂｅｔｔｅｌｌｉら、１９９８．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３２９９−３３０６）評価した。簡潔には、２００□ｇのペプチドＭＯＧ３５−５５（Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスの脳炎誘発性エピトープである（２４））、および４００μｇのヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ Ｒａ（ディフコ ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を補充したＣＦＡを含有する乳剤をマウスの脇腹にｓ．ｃ．で注入する。マウスを毎日観察し、そして以下の基準、すなわち０、疾患なし；１、尾を引きずる；２、後肢虚弱もしくは部分的麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、前肢および後肢麻痺；５、瀕死状態、に従って疾患の臨床兆候について評価した。平均臨床スコアを以下のとおり計算する。すなわち、個々のスコアを加算しかつ観察の各日について各群のマウスの総数により除算し；これはいかなる疾患も発症しない動物を包含する。動物を実験の終了時もしくは疾患の最高点で殺した。図１４に示されるとおり、Ｔ−ｂｅｔ−／＋マウスは重症の麻痺に苦しめられ、この群の動物の平均臨床スコアは第４５日でおよそ３であった。対照的に、Ｔ−ｂｅｔ−／−マウスは麻痺を発症せず；この群の動物は１未満の平均臨床スコアを有した。
２Ｄ２ ＭＯＧ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックマウスをＴ−ｂｅｔ＋／＋およびＴ−ｂｅｔ−／−マウスと交尾させた。群のそれぞれからのマウスを百日咳トキシンで免疫してＥＡＥを誘発させた。図１５に示されるとおり、Ｔ−ｂｅｔを欠く動物は０．５未満の平均臨床スコアを有し、そしてこのモデルでＥＡＥから保護された。Ｔ−ｂｅｔの上流に作用する別の転写因子の役割もまたＥＡＥのこのモデルで試験した。大部分のＩＦＮ−γ応答は、Ｊａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路、とりわけタンパク質チロシンキナーゼＪａｋ１およびＪａｋ２ならびに転写因子Ｓｔａｔ１と結びつけられる。
これらのマウスからのＣＤ４＋細胞の増殖もまた検査した。ＣＤ４＋細胞は標準的方法を使用して抗原提示細胞としての照射脾細胞の存在下で０、１、１０もしくは１００μｇ／ｍｌのＭＯＧ ３５−５５ペプチドとともに培養した。３Ｈ−チミジンの取り込みを使用して細胞の増殖を測定した。ＣＤ４細胞によるＩＦＮ−γ産生を細胞内染色（Ｓｚａｂｏら Ｃｅｌｌ．（２０００ Ｍａｒ １７）１００（６）：６５５−６９）により測定した。
図１６は、ＩＦＮ−γに対し陽性に染色するＣＤ４＋細胞の割合が２Ｄ２ ＭＯＧｘＴ−ｂｅｔ＋／＋動物で３３％および２Ｄ２ ＭＯＧｘＴ−ｂｅｔ−／−動物で３％であったことを示す。
実施例１９．Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスは減弱した関節炎を示す
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は関節を内張する膜もしくは組織が炎症を起こしたようになる（滑膜炎）関節炎の一形態である。関節の炎症は腫脹および疼痛を引き起こし、そして長い間に関節組織を破壊しかつ障害に至ることがある。ＲＡは手、手首、肘、足、足関節、膝もしくは頸を冒す。それは通常身体の両側を同時に冒す。異常な症例では慢性関節リウマチが眼、肺、心、神経もしくは血管を冒すことがある。後期段階のＲＡは親指のボタン孔変形、中手指節関節の尺側偏位および指のスワン−ネック変形を引き起こし得る。Ｔ−ｂｅｔ欠損がＴＡの発症を遂げるかどうか決定するためにＲＡの動物モデルを使用した。６〜８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃ対照およびＴ−ｂｅｔ−／−マウスに、尾静脈注入により抗ＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体カクテル（Ｔｅｒａｔｏら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４８、２１０３−２１０８、１９９２；Ｋａｇａｒｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６９：１４５９）を注入してコラーゲン抗体誘発性関節炎（ＣＡＩＡ）を誘発させた。マウスに７２時間後にＬＰＳ注入（５０ないし１００マイクログラム）を腹腔内投与し、そして関節炎の発症を第５および１５日に評価した。ｂｅｔ欠損マウスは野性型対照に比較して減弱した関節炎を示した。
実施例２０．Ｔ−ｂｅｔはＣＤ８エフェクター／メモリー細胞の生成を調節する
ＣＤ８細胞の機能におけるＴ−ｂｅｔの役割を評価するために、Ｋｂの情況で卵アルブミンペプチド２５７−２６４を認識するＴＣＲトランスジェニックマウスＯＴ−１とＴ−ｂｅｔ−／−マウスを交尾させた。これらのマウスにおいては事実上全部のＴ細胞がＣＤ８細胞でありかつ１ペプチドに特異的である。Ｔ−ｂｅｔの非存在下でのＣＤ８細胞の数の実質的減少（およそ２／３の低下）が観察された。エフェクターＣＤ８集団の損なわれた生成が、ＣＤ８＋、ＣＤ４４Ｈｉ、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＣＤ６９ＨｉおよびＬｙ６ＣＨｉ細胞の減少により明示されるとおりＴ−ｂｅｔ−／−マウスで観察された。図１７は野性型およびＴ−ｂｅｔ−／−マウスからの細胞で実施したＦＡＣＳ分析の結果を示す。
Ｔ−ｂｅｔ転写物がＣＤ４ Ｔ細胞中でのようにＣＤ８ Ｔ細胞中で発現かつ誘導されたかどうかを決定するために、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８の存在もしくは非存在下でプレートに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて７２時間活性化した精製したＣＤ８細胞からＲＮＡを単離した（Ｓｚａｂｏら Ｃｅｌｌ．（２０００ Ｍａｒ １７）１００（６）：６５５−６９）。ノーザンブロット分析はＴ−ｂｅｔおよびＩＦＮ−γ双方のＲＮＡの同等の誘導を示し、Ｔ−ｂｅｔ発現がＣＤ８細胞中でのＩＦＮγ産生と相関したことを示した。細胞傷害性ＣＤ８細胞からのＩＦＮγ産生はこれらの細胞がウイルス感染と戦う重要な機構であり；エフェクターおよびメモリーＣＤ８細胞は大量のＩＦＮγを産生する。
ＩＦＮ−γ産生がＴ−ｂｅｔ欠損ＣＤ８細胞中で影響を及ぼされたかどうかを決定するために、ＣＤ８ Ｔ細胞をＴ−ｂｅｔ−／−、Ｔ−ｂｅｔ＋／−およびＴ−ｂｅｔ＋／＋マウスのリンパ節から精製し、そしてプレートに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で７日間刺激した。第７日にこれらの細胞をプレートに結合した抗ＣＤ３で２４時間もしくはＰＭＡ／イオノマイシンで５時間のいずれかで再刺激し、そしてＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡもしくは細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）により測定した。３種の遺伝子型の間での産生されたＩＦＮγのレベルもしくはＩＦＮγ産生細胞の数の差異は見出されなかった。従って、ＣＤ８＋ Ｔｃ２細胞中へのＴ−ｂｅｔのレトロウイルス形質導入はそれらをＴｃ１細胞に転換することが見出されたとは言え、これらのデータはＴ−ｂｅｔがこれらの細胞中でのＩＦＮγ遺伝子転写に必要とされなかったことを示唆した。
しかしながら、より大きな生理学的刺激を使用するその後の実験でＴ−ｂｅｔの非存在がＣＤ８＋細胞中でのＩＦＮ−γ産生を低下させることが見出された。抗原およびＡＰＣでの刺激に際して、ＯＴ−１ ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋細胞はＩＦＮ−γを産生する。しかしながらＴ−ｂｅｔ−／−動物において、ＩＦＮ−γ産生はほぼ完全に排除された（図１８）。従ってＴ−ｂｅｔはＣＤ８＋細胞中でのＩＦＮ−γ産生に必要とされる。
ナイーブなエフェクターおよびメモリーＣＤ８細胞は４種のマーカー、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９およびＬｙ−６Ｃの発現により表現型で識別し得る。２種のサイトカインＩＬ−７およびＩＬ−１５はＣＤ８メモリー細胞の生成および恒常性を制御する。従って、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒノックアウトマウスは低下した数のＣＤ８細胞を有しかつ事実上ＣＤ４４ｈｉメモリーＣＤ８細胞を欠く。ＩＬ−１５の非存在下でＩＬ−１７はメモリー応答を維持し得る。しかしながら、ＣＤ８細胞の運命、すなわちサイトカインのような細胞外刺激に対するその応答を決定する転写因子は未知である。
ＣＤ８細胞中のＴ−ｂｅｔの機能を探すためにＣＤ８機能の２種の異なるモデルを検査した。第一のモデルにおいて、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスＬＣＭＶへの感染の取り扱いにおけるＴ−ｂｅｔの役割を検査した。Ｔ−ｂｅｔ野性型（ＷＩＬＤ ＴＹＰＥ）もしくはノックアウト（ＫＮＯＣＫ ＯＵＴ）マウスをＬＣＭＶに感染させた。初期応答の第７日にＴｂｅｔ−／− ＬＣＭＶ ＣＤ８細胞をクラスＩ四量体染色（ｇｐ１２０抗原）により単離し、そして四量体染色（Ａｌｔｍａｎら １９９６．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４；ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら １９９６．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：２１）により等しい数で存在しかつＬＣＭＶに感染した標的細胞のＣＴＬ溶解およびＩＦＮγ産生により評価されるとおり機能上損なわれていないことが見出された。しかしながら、第１４日までに、Ｔｂｅｔ−／−マウスは、四量体染色およびＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色双方により測定されるとおりＬＣＭＶ特異的ＣＤ８細胞の数の減少を有した。
これらの結果はＴ−ｂｅｔの非存在下でのＬＣＭＶに対する損なわれたＣＤ８メモリー応答を示す。ＬＣＭＶモデル系において、第８日に開始するエフェクター／メモリー応答の慎重な時間経過ならびに表現型マーカー、細胞数、サイトカインについてのＩＣＣＳおよびＣＴＬ活性のモニタリングを実施しなければならない。得られた結果についての１つの可能性は、ＣＤ８エフェクター／メモリーの欠如がＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生するＴｈ１ ＣＤ４細胞の欠損の結果であり得たことである。ＭＨＣクラスＩＩ欠損マウスは正常のＣＤ８ ＬＣＭＶ ＣＴＬ応答を有するとは言えＣＤ４細胞は免疫適格宿主におけるＬＣＭＶ感染において重要である。加えて、Ｔ−ｂｅｔは実際にＩＬ−２産生を抑制し、また、Ｔｂｅｔ−／−マウスからのＣＤ８細胞は対照ＣＤ８細胞より実質的により多いＩＬ−２を産生する。
第二のモデルにおいて、Ｔ−ｂｅｔノックアウト系統をＯＴ−１ ＴｃＲについてトランスジェニックのマウスと交尾させた。野性型およびＴ−ｂｅｔノックアウトマウスからのＯＴ１トランスジェニックＣＤ８細胞の数およびサイトカインプロフィルの比較において、Ｔ−ｂｅｔの非存在下でのＣＤ８細胞の数の実質的減少、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのＯＶＡペプチドおよびＡＰＣに応答してのＩＬ−１０の大きく増大された産生が見出された。このモデルにおけるＣＤ８細胞の表現型の検査は、Ｔ−ｂｅｔの非存在下でのエフェクターＣＤ８細胞の生成の実質的減少およびＩＬ−１０のレベルの劇的な増大を示した。加えて、ＩＬ−１５受容体の発現は新たに単離したＯＴ１ ＣＤ８ Ｔ−ｂｅｔ−／−細胞中で変えられていない。
実施例２１．Ｔ−ｂｅｔはエフェクターＣＤ８細胞中でのＩＬ−１０の産生を抑制する
ＣＤ８細胞におけるＴ−ｂｅｔの１つの重要な機能は免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の産生の制御であるようである。Ｔ−ｂｅｔを欠くＣＤ８細胞は実質的に増大されたレベルのＩＬ−１０およびＩＬ−２を産生することが見出され、Ｔ−ｂｅｔがＣＤ８細胞中のＩＬ−１０およびＩＬ−２の抑制因子であることを示唆した（図３６）。ＩＬ−１０は、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のような細胞内病原体の効果的な取り扱いの妨害において重要な役割を演じる。それがＩＦＮ−γおよびＴＮＦαのマクロファージ活性化機能に対抗するためである。ＩＬ−１０は急性ワクシニアウイルス感染症に対するＩＬ−１２媒介性の保護に拮抗し、また、樹状細胞における内因性のＩＬ−１０の抑制はＴｈ１誘導のための抗原提示を高める。従って、Ｔ−ｂｅｔの発現もしくは活性を高める化合物は、ＩＦＮ−γを増大させかつＩＬ−１０産生を阻害するの双方であるはずであり、病原体に対する強力な免疫応答に有利に働く。Ｔ−ｂｅｔがＩＬ−１０もしくはＩＬ−２産生を抑制する機構は、ＣＤ８細胞中でのＩＬ−１０もしくはＩＬ−２遺伝子の転写の直接の調節またはＩＬ−１０もしくはＩＬ−２の産生を調節する遺伝子の調節によるとみられる。
実施例２２．Ｔ−ｂｅｔはＮＫ細胞中でのＩＦＮ−γの産生を調節する
Ｔ−ｂｅｔはまた自然免疫系の細胞中でのＩＦＮ−γ産生も調節する。例えば、ＩＦＮ−γ産生はＴ−ｂｅｔが欠損の動物で低下している。ＤＸ５＋脾ＮＫ細胞をＮＡＣＳ精製（Ｓｚａｂｏら ２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９５：３３８−４２）でのポジティブ選択によりＴ−ｂｅｔ−／−、Ｔ−ｂｅｔ＋／−およびＴ−ｂｅｔ＋／＋マウスから精製した。ＩＦＮ−γ産生をＩＬ−１２単独もしくはｒＩＬ−１２およびｒＩＬ−１８での処理７２時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色もまた実施した。図１９はＩＦＮ−γ産生がＴ−ｂｅｔ−／＋およびＴ−ｂｅｔ−／−双方の動物で低下されたことを示す。
ＩＦＮ−γ産生に対するこれらの影響に加えて、ＮＫ細胞の生成はＴ−ｂｅｔの非存在下でもまた損なわれる。ＷＩＬＤ ＴＹＰＥおよびＴ−ｂｅｔ−／−動物での脾ＮＫ細胞の割合を比較した。ＤＸ５＋ ＮＫ細胞の割合はＴ−ｂｅｔの非存在下で５０％だけ低下された（図２０）。別の実験において、ＤＸ５＋ ＮＫ細胞の割合をＲＡＧ２−／−動物およびＲａｇ２−／−ｘＴ−ｂｅｔ−／−動物で検査した。ＲＡＧ２はＴおよびＢ細胞の発生の間の効率的なＶからＤＪへの再配列に必要であり、従ってＲＡＧ２−／−動物はＴおよびＢ細胞が欠損である。ＤＸ５＋ ＮＫ細胞の割合もまたＲＡＧ２−／−動物に比較してＲＡＧ２−／−ｘＴ−ｂｅｔ−／−動物で減少していた（図２０）。
ＮＫの細胞溶解活性もまた検査した。減少した自発性腫瘍細胞溶解がＴ−ｂｅｔ−／− ＮＫ細胞で観察された。未分画の脾細胞を図２１の左図に示されるエフェクター対標的細胞比で５１Ｃｒ標識ＮＫ感受性ＹＡＣ−１標的細胞とともに４時間インキュベートした（Ｓｚａｂｏら ２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９５：３３８−４２）。右図で、Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＴ−ｂｅｔ＋／＋マウスに脾細胞単離２４時間前に１００μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）を腹腔内注入した。別の実験において、溶解性遺伝子の発現に対するＴ−ｂｅｔの影響を評価した。ＤＸ５＋ ＮＫ細胞をＴ−ｂｅｔ＋／＋およびＴ−ｂｅｔ−／−動物の脾から単離し、そしてｒＩＬ−１２およびｒＩＬ−１８の存在下で６時間インキュベートした。β−アクチンを参照として使用して溶解性タンパク質パーフォリンおよびグランザイムＢをコードするｍＲＮＡの豊富さを測定した。これらの溶解性遺伝子の発現はＴ−ｂｅｔの非存在下で損なわれた（図２２）。
実施例２３．Ｔ−ｂｅｔは樹状細胞中でのＩＦＮ−γの産生を調節する
樹状細胞（ＤＣ）はナイーブなＴ細胞を活性化する並はずれた能力をもつ専門的抗原提示細胞である（Ｌｉｕ，Ｙ．Ｊ．ら（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：５８５；Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．ら（２００１）Ｃｅｌｌ １０６：２５５；およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．ら（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７６７）。それらはリンパ系および非リンパ系中に広範に分布され、そしてリンパ節中で抗原を捕捉しかつそれを多彩なペプチドとしてＣＤ４およびＣＤ８細胞に提示して初期免疫応答を開始するそれらの強い能力により多くの興味が刺激された。それらは実際、「天然のアジュバント」と呼ばれており、そして、現在のワクチン戦略はしばしば弱い免疫を生成させるために、あらゆるワクチン接種戦略の肝要な成分であると考えられなければならない。病原体によって始動される場合、未熟ＤＣ上で発現されるパターン認識受容体（Ｔｏｌｌ受容体）はそれらを免疫原性ＤＣに成熟させるよう導く。ヒトおよびマウス双方のＤＣがＴヘルパーサブセットの拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の駆動において異なる機能を組み込むサブセットに分割される。ＤＣがこれを行う１機構はＩＬ−１２およびＩＬ−１０のようなサイトカインの分泌である。
樹状細胞はまたＩＦＮ−γも産生することが最近発見された（Ｆｒｕｃｈｔ，Ｄ．Ｍ．ら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２：５５６；Ｏｈｔｅｋｉ，Ｔ．ら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１９８１；Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２０００）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１４５３；Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：５４４８；Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：４４４６；Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：６４；およびＳｔｏｂｅｒ，Ｄ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：９５７）。ＩＦＮ−γは、広範に発現されるＩＦＮ−γ受容体に結合することにより作用する先天性および適応双方の免疫に不可欠な多面発現性サイトカインである（Ｂａｃｈ，Ｅ．Ａ．ら（１９９７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：５６３；Ｂｏｅｈｍ，Ｕ．、（１９９７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：７４９）。大部分のＩＦＮ−γ応答はＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路、とりわけタンパク質チロシンキナーゼＪａｋ１およびＪａｋ２ならびに転写因子Ｓｔａｔ１に結びつけられている（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｗ．Ｊ．ら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２９３．）。ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−γ受容体もしくはＳｔａｔ１を欠くマウスの分析は、微生物病原体およびウイルスによる感染から死亡をもたらす先天性および適応双方の免疫の大きな混乱を示す（Ｄｅｃｋｅｒ，Ｔ．、（２００２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０９：１２７１；Ｄａｌｔｏｎ，Ｄ．Ｋ．、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７３９；Ｄｕｒｂｉｎ，Ｊ．Ｅ．、（１９９６）Ｃｅｌｌ ８４：４４３；Ｈｕａｎｇ，Ｓ．、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４２；Ｍｅｒａｚ，Ｍ．Ａ．、（１９９６）Ｃｅｌｌ ８４：４３１）。機能的ＩＦＮ−γ遺伝子を欠くマウスにおいて、播種性結核が発生した。ＩＦＮ−γシグナル伝達経路の成分中に不活性化突然変異を伴うヒトは制御されないミコバクテリウム感染症で若年時に死亡する。
ＩＦＮ−γを産生しかつそれに応答する細胞が先天性および適応双方の免疫系に存する。例えば、このエフェクターサイトカインは、おそらくＭＨＣ抗原、抗原提示能力およびサイトカイン分泌をアップレギュレートすることにより、マクロファージを活性化しかつ樹状細胞をより免疫原性にする（Ｇｉａｃｏｍｉｎｉ，Ｅ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：７０３３；Ｒｅｍｏｌｉ，Ｍ．Ｅ．ら（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：３６６；Ｋｉｎｊｏ，Ｙ．ら（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：３２３；ＭｃＳｈａｎｅ，Ｈ．ら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０：１６２３）。感染および抗原提示の部位でのＩＦＮ−γ分泌を調節する分子機構を明らかにすることは従って重要な責務である。今日まで、Ｓｔａｔ４が骨髄細胞中でのＩＦＮ−γの産生を制御することが知られている唯一の転写因子である（Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：４４４６；Ｆｒｕｃｈｔ，Ｄ．Ｍ．ら（２０００）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ．１６４：４６５９）。
Ｔ−ｂｅｔが樹状細胞中でＴｈ１細胞に匹敵するレベルで発現されかつＩＦＮ−γの至適の産生に必要であるかどうかを決定するために、以下の研究を実施した：
１．Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスでのマウス樹状細胞の正常の発生および活性化
非常に少数の転写因子がＤＣの発生および成熟に関係している（Ｏｕａａｚ，Ｆ．ら（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：２５７）。これらのなかで最も注目すべきはＮＦκＢファミリーのメンバーである。最近の研究は、ＲｅｌＡ（ｐ６５）およびＰ５０双方のＮＦκＢサブユニットを欠くマウスにおけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ａ＋およびＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ａ−双方のＤＣの損なわれた発生を示した。しかしながら、マクロファージの発生および分化はこれらのマウスで影響を及ぼされなかったが、但し、ＤＣの生成におけるｐ５０およびＲｅｌＡの要件は特異的かつ細胞自律性である（Ｏｕａａｚ，Ｆ．ら（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：２５７）。Ｔ−ｂｅｔはヒト骨髄および臍帯血からの幹細胞および前駆細胞中で発現されるため、それがＤＣの発生、分化もしくは活性化にもまた関与していたかもしれないことが可能であった。
骨髄起源のＤＣはＧＭ−ＣＳＦの存在下で骨髄（ＢＭ）を培養することにより最も容易に得ることができ、また、発生の段階はＭＨＣクラスＩＩ分子およびＣＤ１１ｃの表面発現を評価することにより長期にわたりモニターし得る（Ｌｕｔｚ，Ｍ．Ｂ．ら（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３：７７；Ｉｎａｂａ，Ｋ．ら（１９９２）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７６：１６９３）。
前駆体ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ ＩＩｌｏ）が第４日に、未熟ＤＣ（ＣＤ１１ｃｈｉ ＭＨＣ ＩＩ＋）が第４ないし８日に、および成熟ＤＣ（ＣＤ１１ｃｈｉ ＭＨＣ ＩＩｈｉ）が第８ないし１０日に、次いでアポトーシスが識別できる。Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスの発生のいずれの段階でもＤＣの収量に有意差は存在せず、また、表面の表現型により決定されるところの前駆体、未熟および成熟ＤＣの類似の比率がＴ−ｂｅｔ−／−および対照ＢＭから得られた（図２３Ａに示される第８日）。
ＧＭ−ＣＳＦを含有するＢＭ培養物は骨髄前駆細胞由来であるＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１１ｂ＋ ＤＣの大きな集団を提供する。しかしながら、この集団は、通常二次リンパ系器官中に存しかつＣＤ４＋およびＣＤ８α＋マーカーの表面発現を特徴とするＤＣ亜集団を欠く（Ｗｕ，Ｌ．ら（１９９６）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４：９０３；Ｖｒｅｍｅｃ，Ｄ．ら（１９９７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９：５６５；Ｌｅｅｎｅｎ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：２１６６；Ｋａｍａｔｈ，Ａ．Ｔ．ら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５：６７６２；Ｈｅｎｒｉ，Ｓ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：７４１．２０；Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：５４４８）。われわれは野性型およびＴ−ｂｅｔ−／−マウスからの脾調製物中のこれらのＤＣ亜集団を検査した。ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ１１ｃ＋ならびにＩ−Ａｂ（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８α＋の組合せに対する抗体での染色に基づくＤＣ組成の明らかな変化を示さなかった（図２３Ｂ）。野性およびノックアウト動物からの脾の複数の独立した調製物から類似の数のＣＤ１１ｃ＋ ＤＣが単離された。
微生物の刺激、炎症前サイトカインおよびＣＤ４０Ｌを発現するＴ細胞との相互作用がＤＣの成熟を誘導し得る。成熟ＤＣは、ＭＨＣＩＩのアップレギュレーション、共刺激および接着分子発現を特徴とする。Ｔ−ｂｅｔがｉｎ ｖｉｖｏでのＤＣ成熟においてある役割を演じているかどうかを試験するために、多様な時間間隔の間マウスにＬＰＳを腹腔内注入し、そしてＤＣ成熟をＦＡＣＳ分析により評価した。Ｔ−ｂｅｔ−／−ＤＣ中でのＣＤ８６（Ｂ７−２）のアップレギュレーションは野性型マウスからの細胞に比較して正常であった（図２３Ｃ）。ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ４０およびＭＨＣ ＩＩのアップレギュレーションについて類似の結果が得られた。
これらの研究は、Ｔ−ｂｅｔがＤＣの発生、分化もしくは活性化で注目すべき役割を演じていないことを示す。
２．マウス樹状細胞中でのＴ−ｂｅｔ発現
Ｔ−ｂｅｔ発現はほとんど独占的にマウス発生の間の造血系に限定され、唯一の例外は嗅球である（Ｆａｅｄｏ，Ａ．ら（２００２）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １１６：１５７）。Ｔ−ｂｅｔはヒト骨髄および臍帯血中で見出される前駆細胞／幹細胞を包含する数種の血液系譜で発現される（Ｆａｅｄｏ，Ａ．ら（２００２）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １１６：１５７）。成体動物において、Ｔ−ｂｅｔの発現は主としてリンパ系器官中で明白である。Ｔ−ｂｅｔはＴｈ１細胞、ＣＤ８細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞中でもまた発現され、また、他者は、ヒト単球および骨髄ＤＣ中でのＴ−ｂｅｔ発現を示している。
マウス樹状細胞およびマクロファージ中での構成的および調節されたＴ−ｂｅｔ発現を検査するため、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養したＢＭ細胞から骨髄起源の未熟ＤＣを得た。こうした骨髄培養物は典型的に７０ないし９０％の間の純度範囲のＤＣを生じる。汚染するマクロファージもしくは骨髄前駆細胞からＤＣをさらに精製するためにＣＤ１１ｃ＋磁性ビーズを使用し、９５％以上のＤＣの集団をもたらした。未刺激のＢＭ細胞中で、もしくは第８日までの発生の間の異なる日のＣＤ１１ｃ＋磁性ビーズで単離した細胞からはＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡが検出されなかった。第８日にＣＤ１１ｃ＋ ＢＭ由来ＤＣ細胞はＩＦＮ−γでの刺激後にＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの迅速なアップレギュレーションを表した（図２３Ｂ）。Ｔ−ｂｅｔの匹敵する発現パターンがＢ６系統およびＢＡＬＢ／ｃ系統から得られたＢＭ由来ＤＣで得られた。
脾ＤＣの純粋な集団を得るために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの脾細胞をＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞での汚染を回避するためＣＤ１１ｃ＋およびＩ−Ａｂ（ＭＨＣ クラスＩＩ）に対する抗体を用いてＦＡＣＳ分取した。こうした分取した集団は＞９５％純粋であった。分取したＤＣを組換えＩＦＮ−γの存在もしくは非存在下で多様な時間の期間培養し、そしてリアルタイムＰＣＲ分析のためＲＮＡを単離した。これらの実験は未刺激のＤＣ中での低レベルのＴ−ｂｅｔ発現およびＩＦＮ−γでの処理後のＴ−ｂｅｔ転写物レベルの迅速なアップレギュレーションを示した（図２４Ａ）。ＢＭ由来ＤＣと同様に、Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡ発現は最初の１時間の間に頂点に達し、４時間まで高いまま留まり、そして８時間後に劇的に減少した（図２４Ｂ）。注目すべきは、樹状細胞中でのＴ−ｂｅｔ転写物のレベルがＴｈ１細胞中で観察されたものに非常に類似しておりβ−アクチン１分子あたり１０−３ないし１０−２分子のＴ−ｂｅｔの間の範囲にわたった（図２４Ａ〜Ｂ）。
ＩＦＮ−γで処理されないもしくは処理した脾ＤＣから調製した抽出物のウェスタンブロット分析により評価されるところのＴ−ｂｅｔタンパク質の発現は、ＩＦＮ−γでの刺激３時間後に開始し、１２時間後に頂点に達しかつ２４時後に減少するＴ−ｂｅｔタンパク質の迅速な誘導を伴うＲＮＡ発現を反映した（図２４Ｃ）。Ｂ６とＢＡＬＢ／ｃ系統との間でＴ−ｂｅｔ発現に差異は示されなかった。３色ＦＡＣＳ分取はＣＤ８α＋およびＣＤ８α−ＤＣ亜集団中でのＴ−ｂｅｔ発現の検査を可能にした。双方のサブセットはＩＦＮ−γでの刺激後にＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡレベルを同様にアップレギュレートした。樹状細胞を活性化することが既知の（例えばＬＰＳ）もしくはＮＫ細胞中でＴ−ｂｅｔ発現を増大させることが最近記述された（例えばＩＬ２１およびＩＬ１５）他の刺激はＴ−ｂｅｔ発現を誘導しなかった。
これらの研究は、樹状細胞がＴ−ｂｅｔを発現すること、およびこの発現はＴ細胞中で観察されたものに類似の正のフィードバックループ中でＩＦＮ−γにより制御されていることを示す。これらのデータは、ヒト単球および骨髄樹状細胞中でのＴ−ｂｅｔ発現を制御するＩＦＮ−γの能力に関するより早期の観察結果を確認し、かつ、それを多様な発生段階のマウス骨髄ＤＣならびにマウス脾からの成熟ＤＣまで拡大する（Ｌｉｇｈｖａｎｉ，Ａ．Ａ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１５１３７）。しかしながら種間のいくつかの重要な差異が出現した。例えば、われわれはヒト骨髄ＤＣについて報告されたところの２４時間でのＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡもしくはタンパク質の有意の発現レベルを観察しなかった（Ｔ−ｂｅｔ誘導のキネティクスはマウス骨髄および脾ＤＣ中でより迅速である）。加えて、低用量のＩＦＮ−γに対するきわめて鋭敏な感受性が１ｎｇ／ｍｌで得られたＴ−ｂｅｔの最大レベルで観察された。これは、Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡレベルがより高濃度のＩＦＮ−γと比例して増大したヒト単球とよい対比をなす（Ｌｉｇｈｖａｎｉ，Ａ．Ａ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１５１３７）。さらに、Ｔ−ｂｅｔ発現はＩＦＮ−γでの処理に際してもしくはラテックスビーズの貪食作用後に、腹腔、脾もしくは骨髄いずれか由来のマクロファージ中で検出されなかった。これらの研究は、これらの細胞からのＩＦＮ−γの産生がＢＡＬＢ／ｃ背景のマクロファージ中でＳｔａｔ４のようなＴ−ｂｅｔ以外の転写因子により制御されることを示す（Ｆｒｕｃｈｔ，Ｄ．Ｍ．ら（２０００）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ．１６４：４６５９；Ｌａｗｌｅｓｓ、Ｖ．Ａ．ら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６８０３；Ｋｕｒｏｄａ，Ｅ．ら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：５４７７）。
３．Ｔ−ｂｅｔは樹状細胞によるＩＦＮ−γの至適の産生に不可欠である
ＩＬ１２およびＩＬ１８での７２時間刺激に際してＤＣは１０ないし３００ｎｇ ｍｌ−１の間の範囲にわたるかなりの量のＩＦＮ−γを分泌する（Ｏｈｔｅｋｉ，Ｔ．ら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１９８１；Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２０００）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１４５３；Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：５４４８；Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：４４４６；Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：６４；Ｓｔｏｂｅｒ，Ｄ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：９５７）。今日まで、Ｓｔａｔ４は骨髄細胞中でのＩＦＮ−γの産生を制御することが既知の唯一の転写因子である。ＤＣおよびマクロファージ双方において、ＩＦＮ−γのＩＬ１２依存性の分泌はＳｔａｔ４の非存在下でひどく減少される（Ｂａｃｈ，Ｅ．Ａ．ら（１９９７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：５６３）。加えて、Ｓｔａｔ４−／−マクロファージは、ＩＬ−１２に応答しての硝酸塩酸化物の不完全な産生を表し、そしてトキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）感染症に感受性である（Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：４４４６）。Ｔ−ｂｅｔはＣＤ４＋ Ｔ細胞中のＩＦＮ−γ遺伝子の転写を制御するがしかし例えばＢ細胞中ではしないため、Ｔ−ｂｅｔがＤＣ中でＩＦＮ−γの転写を制御するかどうかを研究した。
ＩＦＮ−γ分泌の非常に顕著な減損がＴ−ｂｅｔ欠損Ｂ６マウス由来のＢＭ ＤＣで観察された。ＢＭ由来ＤＣによるＩＦＮ−γ産生は典型的に脾ＤＣからよりも低く、１００から５０００ｐｇ ｍｌ−１までの範囲にわたる（Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：４４４６；Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：６４；Ｓｔｏｂｅｒ，Ｄ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７；９５７）とは言え、Ｔ−ｂｅｔ−／− ＢＭ ＤＣはＥＬＩＳＡにより測定されるとおり検出可能なＩＦＮ−γを全く産生しなかった（図２５Ａ、左図）。ＢＭ由来野性型Ｂ６ ＤＣは１００から５００ｐｇ ｍｌ−１までの範囲にわたるレベルを産生した（図２５Ａ、左図）。４８ないし７２時間後に培養物中で死亡する脾ＤＣと異なり、ＢＭ由来ＤＣはわれわれがＩＦＮ−γ転写物を同様に測定することを可能にするのに十分長い時間の期間生存する。生存率はＴ−ｂｅｔおよび野性型マウスからのＢＭ由来ＤＣで７２時間の刺激後に同様であった。リアルタイムＰＣＲ分析は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８とともに７２時間培養したＴ−ｂｅｔ−／− ＢＭ由来ＤＣ中のＩＦＮ−γ転写物の非常に顕著な減少（１／６ないし１２）を確認した（図２５Ａ、右図）。ＢＡＬＢ／ｃ背景のＴ−ｂｅｔ−／−マウスからのＢＭ由来ＤＣで匹敵する結果が得られた。
同様に、ＩＬ−１２、もしくはＩＬ−１２およびＩＬ−１８で刺激した脾ＤＣの６個の独立した調製物からの４０から８０％までの範囲にわたるＩＦＮ−γ分泌の有意の低下がＴ−ｂｅｔ欠損において対照マウスと比較して観察された（図２５Ａ）。同様の結果がＢＡＬＢ／ｃ背景のＴ−ｂｅｔ−／−マウス由来のＤＣで観察された。Ｔ−ｂｅｔは、ナイーブなＴｈ前駆細胞中でのＴｈ分化の非常に早期にＩＦＮ−γ遺伝子転写を調節するよう機能する。マウス樹状細胞によるＩＦＮ−γの至適の産生は３と５日との間で発生することが報告されている（Ｏｈｔｅｋｉ，Ｔ．ら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１９８１；Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２０００）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１４５３；Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：５４４８；Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：４４４６；Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：６４；Ｓｔｏｂｅｒ，Ｄ．ら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：９５７）。Ｔ−ｂｅｔが脾ＤＣによるＩＦＮ−γの早期産生の間にある役割を演じているかどうかを検討するために、単独もしくはＩＬ−１８と組合せでのＩＬ−１２刺激後最初の３日間のＩＦＮ−γ分泌の時間経過分析を実施し、そしてＴ−ｂｅｔの１つの重要な役割を示した（図２５Ｃ）。Ｔ−ｂｅｔの非存在下で、脾ＤＣは最初の２４時間のＩＦＮ−γ産生の４０ないし４５％低下を表し、これは６０ないし７０％の間の範囲にわたるＩＦＮ−γ産生の減少を伴い次の４８時間にわたって継続した（図２５Ｃ）。ＩＦＮ−γ産生のこの減損はまたＢＡＬＢ／ｃマウスからのＴ−ｂｅｔ欠損ＤＣでも存在した。
これらの研究は、Ｔ−ｂｅｔがマウスＤＣ中で発現されることおよびその発現がＩＦＮ−γにより制御されることを当該技術分野で最初に示す。従ってＴ−ｂｅｔはこの重要な細胞型によるＩＦＮ−γの至適の分泌に不可欠である。ＩＬ−１２およびＩＬ−１８もしくはＬＰＳでの刺激後のＩＬ−１２、ｐ３５およびｐ４０サブユニット、ＴＮＦαならびにＩＬ−１のような他のＤＣサイトカインの発現がＴ−ｂｅｔの非存在により影響を及ぼされなかったため、この役割はＤＣ中でＩＦＮ−γに対し極めて選択的である。
さらに、Ｓｔａｔ４が骨髄細胞中でのＩＦＮ−γのＩＬ−１２依存性の産生の開始に絶対的に必要とされることが明らかである一方、Ｔ−ｂｅｔはこのサイトカインの制御にもまた参画する。１つの可能な機構のシナリオは、Ｔｏｌｌ受容体ファミリーメンバーとの病原体の相互作用に際してＤＣがＩＬ−１２およびＩＦＮ−γを分泌するよう刺激されてそれによりＳｔａｔ１およびＳｔａｔ４双方のシグナル伝達経路を活性化することである。Ｓｔａｔ１はＴ−ｂｅｔおよびＳｔａｔ４双方のの発現を制御し、従って同時にＩＦＮ−γの産生を最大にする。
結論として、これらの研究は、Ｔ−ｂｅｔが、適応免疫系においてＴｈ１系譜の決定を制御することによるのみならずしかしまた樹状細胞中でのＩＦＮ−γ遺伝子の転写に対する直接の影響によってもＩ型免疫の生成に影響することを示す。Ｔ−ｂｅｔは従って先天性免疫系と適応免疫系との間の分子的架橋であるかもしれない転写因子である。
実施例２４．ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のマウスモデルにおけるＴ−ｂｅｔの役割
ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）および野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）に対する感受性は近交マウス系統でかなり変動する（高度に感受性から中間ないし比較的耐性までの範囲にわたる）。Ｔ−ｂｅｔを過剰発現するトランスジェニックマウスを製造しかつＣ５７ＢＬ６背景で特徴づけし、そして感染のモデルにおけるその機能を最良に評価するために比較的耐性の系統Ｃ５７ＢＬ／６のＴ−ｂｅｔ欠損系統の数世代と戻し交雑した。Ｔ−ｂｅｔが無発病性および有毒性双方の細菌株に対する耐性を提供する機構を、Ｔ−ｂｅｔ過剰発現体、および多様な細胞集団例えばＣＤ４もしくはＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫおよび樹状細胞を欠く欠損マウスを利用することにより探究した。Ｔ−ｂｅｔノックアウトおよび過剰発現体系統はＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃ双方の系統で広範囲に戻し交雑した。
ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）への感染におけるＴ−ｂｅｔの機能を試験するために、２群のマウス（Ｔ−ｂｅｔノックアウトおよび野性型同腹子）を標準用量の有毒性ＭＴＢ（１００，０００ＣＦＵ）に静脈内で感染させ、そしてそれらの生存をモニターした。結果は以下の通りであった。死亡までの時間（ＴＴＤ）（日数（±ＳＤ））：Ｔ−ｂｅｔノックアウト（４マウス）＝４１（±０．８）、野性型（３マウス）＝１０６（±３６）、ｐ＜０．０２。比較のため、その実験での非常に感受性の系統のマウス（Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ）のＴＴＤ＝２６（±１．２）およびＨｃＢ１５（別の感受性系統）のＴＴＤ＝３４（±２．４）。さらなる比較のため、これまで同定された最も高度に感受性の系統すなわちＢ６背景のＩＦＮγノックアウトマウスは、同一実験条件下で通常１５日以内に死亡した。
感染後第４１日に、３匹のＴ−ｂｅｔノックアウトマウスの器官を死亡の時点もしくは瀕死状態（１マウス）で１匹の野性型マウス（殺した）と一緒に収集し、そして組織病理学、細菌の抗酸染色およびｉＮＯＳ発現研究を実施した。Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウスのマクロファージ１個あたりより多数の抗酸細菌が見出されたが、しかしながら大部分の感受性の系統のマウスでしばしばみられる肺炎もしくは壊死病変いずれも観察されなかった。
要約すれば、Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウスはヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）への感染に対しそれらの野性型同腹子対照より明らかにより感受性であった。Ｔ−ｂｅｔの非存在により賦与される感受性の程度はＩＦＮγ欠損マウスと比較して中間的である。ＩＦＮγノックアウトと比較して保持される有意の程度の保護は、Ｔ−ｂｅｔ−／− ＣＤ８細胞による残余のＩＦＮγ産生によるかもしれない。
実施例２５．ＴｅｃキナーゼによるＴ−ｂｅｔのリン酸化
Ｔ−ｂｅｔタンパク質はリン酸化される。Ｔ−ｂｅｔをリン酸化するキナーゼはチロシンキナーゼのＴｅｃファミリーの１メンバーとして同定されている。ＩＴＫおよびＲｌｋ／ＴｘｋがＴ細胞中で発現されるチロシンキナーゼの支配的なＴｅｃファミリーである。図２６はＴｅｃファミリーメンバーの保存された構造を示す。Ｔｅｃファミリーキナーゼはサイトカイン分泌において重要であることが示されている。Ｒｌｋ／ｔｋｋはＴｈｙ特異的でありかつＩＦＮ−γ産生の制御である役割を演じている。Ｉｔｋ−／−マウスは低下されたＩＬ−４産生を有する一方、ｒｌｋ／ｉｔｋ−／−マウスは減少されたＴｈ１およびＴｈ２サイトカインを示した。ＲＩＢＰはｒｌｋおよびｉｔｋを結合するアダプタータンパク質である。ＲＩＢＰ−／−マウスは減少されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を表す。
ＩＴＫおよびＲｌｋ／ｔｘｋ双方のキナーゼがｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ−ｂｅｔをリン酸化することが見出されている。ヒトＴ−ｂｅｔの予測されるチロシンリン酸化部位を図２７に示す。修飾された形態のＴ−ｂｅｔタンパク質を作成しそしてｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイで基質として使用した（図２８）。ＩＴＫおよびＲｌｋ双方がｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイでＴ−ｂｅｔのＮ末端およびＣ末端をリン酸化したがしかしＤＮＡ結合領域はしなかった（図２９）。
Ｔｅｃキナーゼの重要性をさらに示す、Ｔ−ｂｅｔの減少されたチロシンリン酸化がＩＴＫノックアウト動物で観察された。Ｂ６、Ｂａｌｂ／Ｃ、ＩＴＫノックアウトおよびＲＬＫノックアウト動物からのＴ細胞からＴ−ｂｅｔを免疫沈降させた。免疫沈降物のウェスタンブロットを抗ホスホチロシン抗体もしくは抗Ｔ−ｂｅｔ抗体いずれかでプロービングした。図３０に示されるとおり、Ｔ−ｂｅｔはＩＴＫノックアウト動物からのＴ細胞中に存在するとは言え、該分子のチロシンリン酸化は減少される。対照的に、Ｔ−ｂｅｔはＲｌｋノックアウトＴ細胞中で過剰リン酸化され（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）、Ｔ−ｂｅｔチロシンリン酸化の阻害におけるＲｌｋの役割を示す。
実施例２６．Ｔ−ｂｅｔの非存在下の増大されたＴＲ細胞
Ｔ調節性（ＴＲ）細胞は末梢寛容の誘導に不可欠である。ＣＤ２５を構成的に発現しかつ直接の細胞と細胞の相互作用を介して免疫応答を抑制するＣＤ４（＋）Ｔ細胞、ならびにインターロイキン（ＩＬ）−１０およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βの分泌を介して機能するＩ型Ｔ調節性（ＴＲ１）細胞を包含するいくつかの型のＴＲ細胞が存在する。ＣＤ２５（＋）ＣＤ４（＋）Ｔ細胞クローンにより媒介される抑制は部分的にＴＧＦ−βに依存するがしかしＣＤ２５の構成的高発現に依存しない。ＴＲ細胞はＴ−ｂｅｔの非存在下で増大される。ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の割合をＴ−ｂｅｔ＋／＋、Ｔ−ｂｅｔ＋／−およびＴ−ｂｅｔ−／−マウスでＦＡＣＳ分析により測定した。図３１に示されるとおり、Ｔ−ｂｅｔ＋／＋動物はおよそ３％のＴＲ細胞を有し、Ｔ−ｂｅｔ＋／−動物はおよそ２０％のＴＲ細胞を有し、そしてＴ−ｂｅｔ−／−動物はおよそ３８％のＴＲ細胞を有する。
実施例２７．Ｔ−ｂｅｔ発現はＩＦＮ−γシグナル伝達経路により制御される
以下の材料および方法を実施例２６で使用した：
マウス、抗体およびサイトカイン。
ＢＡＬＢ／ｃ背景で５世代戻し交雑したＴ−ｂｅｔ−／−マウスは本明細書に記述される技術を使用して生成させた。ＢＡＬＢ／ｃ、１２９、ＳＴＡＴ−／−およびＩＦＮγＲ１−／−マウスはジャクソン ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入した。
モノクローナル抗ＣＤ３（２Ｃ１１）、抗ＣＤ２８、抗ＩＬ４、抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−１２およびｒｍＩＦＮ−γは全部ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）から購入した。抗ＩＬ−１８、ｒｍＩＬ−１８はペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）から購入した。
ＣＤ４＋ Ｔ細胞精製およびＴｈ分化
頸部、腋窩、鼡頸部および膝窩リンパ節を単離しそして４０μｍフィルターを通過させた。ＣＤ４＋ Ｔ細胞はＭＡＣＳ精製（ミルテニイ バイオテック（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ））を使用するポジティブ選択により精製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化のために、１×１０６／ｍｌのＴ細胞を完全培地（１０％ウシ胎児血清（ハイクローン ラボラトリーズ（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、Ｈｅｐｅｓ（１００ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（５０μＭ）、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充されたＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、そして１００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２の存在下にプレートに結合した２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８で３日間刺激した。その後細胞を完全培地中で１：４に分割しかつ１００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ２の存在下で４日間培養した。図の説明で示されたとおりＴｈ１およびＴｈ２分化を誘導するために、上の培養物はＴｈ１細胞発生のため（１０ｎｇ／ｍｌ ｒＩＬ−１２および１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４）もしくはＴｈ２細胞発生のため（１０ｎｇ／ｍｌ ｒＩＬ４、１０μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γおよび１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１２）を包含した。
ＥＬＩＳＡおよび細胞内サイトカイン染色
初回刺激後第７日に１×１０６細胞を２□ｇ／ｍｌのプレートに結合した抗ＣＤ３で再刺激した。上清をＥＬＩＳＡのため２４時間後に収集した。サイトカインは、２μｇ／ｍｌのプレートに結合した抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−４および抗ＩＬ−５抗体（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））との４℃で一夜インキュベーションの間に捕捉され、その後二次ビオチニル化抗体（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびアビジンを結合したアルカリホスファターゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で連続的に標識した。ホスファターゼ基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中でのインキュベーション後にサイトカインレベルを４０５ｎｍで標準（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））に対し測定した。細胞内サイトカイン染色のために、最後の３時間モネンシン（３μＭ）の添加を伴いＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）で６時間、細胞を再刺激した。その後細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で固定しそして０．１％サポニン／１％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で浸透化した。染色は、ＰＥ結合抗ＩＦＮ−γ（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））およびＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４を用いて実施し、そして記述された（Ｓｚａｂｏ，Ｓ．ら ２０００ Ｃｅｌｌ １００：６５５−６９）とおりＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを使用するフローサイトメトリーにより分析した。
リアルタイム転写物定量
ＣＤ４＋ Ｔ細胞を単離しかつ示されたサイトカインＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）もしくはサイトカイン中和抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で上述されたとおり刺激した。細胞（反応あたり５×１０６）を２ｍｌ培地中で刺激し、そして３、６および２４時間に収集した。ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して全ＲＮＡを単離し、そしてスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）第一鎖合成系（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用する逆転写にかけた。ＡＢＩ ７７００配列検出器を使用してＴ−ｂｅｔおよびＩＦＮ−γ転写物を定量し、そしてハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに相対的にプロットした。使用したプライマーおよびプローブは以下のとおりであった：ＩＦＮ−γ順５’ＴＣＡＡＧＴＧＧＣＡＴＡＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡ３’、ＩＦＮ−γ逆
５’ＴＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧ３’、ＩＦＮ−γプローブ
５’ＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＡＧ３’、Ｔ−ｂｅｔ順
５’ＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＡＧ３’、Ｔ−ｂｅｔ逆
５’ＴＣＣＣＣＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＡＧＴ３’、Ｔ−ｂｅｔプローブ
５’ＣＣＧＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＴＡＣＧＣ３’、ＧＡＰＤＨ順
５’ＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ３’、ＧＡＰＤＨ逆
５’ＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡ３’、ＧＡＰＤＨプローブ
５’ＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧ３’。
（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１１（４）：３０５−３１２；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１４：２０５−２１５）。
ノーザンおよびウェスタンブロット分析
全ＲＮＡはＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用してＣＤ４＋ Ｔ細胞から単離し、そして１０□ｇの各サンプルを１．２％アガロース６％ホルムアルデヒドゲル上で分離し、２０×ＳＳＣ中でジーンスクリーン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ）メンブレン（ＮＥＮ）に一夜転写し、そしてＵＶストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して共有結合した。ブロットのハイブリダイゼーションは、放射標識Ｔ−ｂｅｔ、ＨＰＲＴもしくはＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡプローブを使用して記述された（Ｈｏｄｇｅ，Ｍ．ら １９９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：１−２０；Ｈｏｄｇｅ，Ｍ．Ｒ．ら １９９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１９０３−１９０５）とおり４２℃で実施した。全細胞抽出物は記述された（Ｇｏｕｉｌｌｅｕｘら、（１９９４）ＥＭＢＯ １３（１８）：４３６１−９）とおり調製した。抽出物を１０％ＰＡＧＥにより分離し、次いでニトロセルロースメンブレンに電気転写し、そしてＴ−ｂｅｔに特異的なポリクローナル抗血清、次いでワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧでプロービングし、そして製造元の説明書（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従って化学発光を高めた。
Ｔ−ｂｅｔ発現は主としてＩＬ−１２Ｒ／ＳＴＡＴ４経路でなくＩＦＮ−γ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達経路により制御される。このシグナル伝達様式は、早期のＴＣＲ活性化の間にＩＦＮ−γとＴ−ｂｅｔとの間に正のフィードバックループを組み立て、それが抗原活性化されたＴｈｐ細胞をＴｈ１経路まで進ませる。従って、初期ＴＣＲ刺激の間のＩＬ−４とＩＦＮ−γとの間の均衡はＴヘルパー細胞の運命に対する大きな影響を有する。ＩＬ−１２は初期Ｔｈ１分化のより後の段階で必要とされる一方でＴｈ１系譜の誘導の初期段階に寄与してはいないようである。一緒にすれば、われわれのデータは、ＳＴＡＴ１、Ｔ−ｂｅｔおよびＳＴＡＴ４がまるで異なったかつ決定的に重要な役割を演じている別個のＴｈ１発生期が存在することを示唆する。Ｔ−ｂｅｔは、早期ＩＦＮ−γ産生を巻き込む自己増強性フィードバックループによるＴｈ１系譜の決定、次いで決定されたＴｈ１細胞のＳＴＡＴ４による増殖および安定化を指図する。
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８およびＴＣＣＲのような数種のサイトカインおよびサイトカイン受容体がＴｈ１分化の代替経路もしくはＩＬ−１２誘導性のＴｈ１発生の増強に関係づけられている（Ｏｋａｍｕｒａ、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ．３７８：８８；Ｓｃｈｍｉｔｔ、１９９４．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：７９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｄら （１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：５７１−８１；Ｍａｃａｔｏｎｉａ ＳＥら（１９９３）．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：１１１９−２８；Ｃｈｅｎ Ｑら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０７：９１６−２０）。ＩＦＮ−γは免疫応答の間に不可欠の役割を演じ、そして大部分の細胞型上に存在する２本の鎖ＩＦＮ−γＲ１およびＲ２より構成されるＩＦＮ−γ受容体に結合することによりその効果を発揮する（Ｂａｃｈ ＥＡら（１９９７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：５６３−９１；Ｂｏｅｈｍ Ｕ、Ｋｌａｍｐ Ｔら（１９９７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：７４９−９５）。しかしながら、Ｔｈ１分化のＩＦＮ−γの促進の部位および機構は不明確なままである。本実施例は、Ｔ−ｂｅｔ発現がＩＬ−１２Ｒ／ＳＴＡＴ４経路でなくＩＦＮ−γＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達経路により主として制御され、ＩＦＮ−γの初期供給源は抗原活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞それ自身から発することを示す。従って、Ｔ−ｂｅｔは早期ＩＦＮ−γ産生を巻き込む自己増強性フィードバックループによりＴｈ１系譜の決定を制御する。
早期Ｔ−ｂｅｔ発現はＩＦＮ−γを必要とする
Ｔｈ１分化およびＩＦＮ−γ産生の促進にいくつかのシグナル伝達経路が関連づけられている。これらはＭＨＣ：抗原複合体ならびにサイトカインＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＦＮ−γによるＴ細胞受容体の誘導を包含する。Ｔｈ１分化におけるＴ−ｂｅｔの中心的役割を考え、われわれはこれらのシグナルのいずれかがＴ−ｂｅｔ発現を誘導する原因であるかどうかを決定することを試みた。
ＢＡＬＢ／ｃマウスからの精製したＣＤ４＋リンパ節Ｔ細胞を２μｇ／ｍｌのプレートに結合した抗ＣＤ３で４８時間および抗ＣＤ２８で７２時間刺激した。指定される場合はＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１８（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）、抗ＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍｌ）、抗ＩＬ−１２（１０μｇ／ｍｌ）、抗ＩＬ−１８（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。ＲＮＡを調製し、そしてプローブとしてＴ−ｂｅｔ、ＩＦＮ−γ ＧＡＴＡ３およびＨＰＲＴ ｃＤＮＡを使用するノーザンブロット分析にかけた。この分析は、ＴＣＲ／ＣＤ２８経路によるシグナル伝達単独でＴ−ｂｅｔ発現を誘導するのに十分なようであり、ＩＬ−１２の包含がこの発現をわずかに増強させたことを示した。しかしながら、これらのＣＤ４＋ Ｔ細胞培養物中へのＩＦＮ−γに対する抗体の包含はＴ−ｂｅｔ発現の劇的な喪失をもたらした一方、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８双方に対する抗体はＴ−ｂｅｔ誘導を阻害することに失敗した（図３２）。これらの細胞からのＩＦＮ−γ発現はＴ−ｂｅｔ発現と並行した。Ｔ−ｂｅｔと対照的に、Ｔｈ２特異的転写因子ＧＡＴＡ−３は抗ＩＦＮ−γ処理により増大されかつＩＬ−１２処理により抑制された。これらのデータは、初回刺激の間のＴ−ｂｅｔならびにＩＦＮ−γの発現が主としてＩＦＮ−γに依存することを示唆する。ＩＬ−１２での刺激後のＴ−ｂｅｔの控えめな増大はＩＦＮ−γ発現を増強するＩＬ−１２の能力に従属的であるとみられる（下を参照されたい）。
Ｔ−ｂｅｔ転写の初期のキネティクスを評価するために、Ｔ−ｂｅｔおよびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲを実施した。前のとおり、ＣＤ４＋リンパ節Ｔ細胞をＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−４もしくはこれらのサイトカインに対する中和抗体の存在下に抗ＣＤ３／ＣＤ２８で３、６および２４時間刺激した。上のデータと矛盾せず、Ｔ−ｂｅｔ転写物がＴｈ１分化に関与するシグナルにより誘導された。際だったことに、抗体ＩＦＮ−γの存在下で刺激した細胞は有意のレベルのＴ−ｂｅｔを産生することに失敗した。この阻害はＴｈ１を促進するサイトカインＩＬ−１２の存在下でさえ観察された。興味深いことに、これらの初期の時点（刺激後３および６時間）では、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現の誘導はＴ−ｂｅｔ発現の阻害にもかかわらず抗ＩＦＮ−γ処理により影響を受けなかった。さらに、この早期のＩＦＮ−γ発現はＴｈ１もしくはＴｈ２いずれの誘導条件によっても影響を受けず、Ｇｒｏｇｅｎら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１４：２０５−１５）による最近の研究と矛盾しない結果であった。
しかしながら、抗ＩＦＮ−γ抗体の存在下での２４時間の刺激によりＩＦＮ−γ ｍＲＮＡは減少し始め、そして４８時間までにＩＦＮ−γおよびＴ−ｂｅｔ双方の転写物が存在しなくなった（図３２）。従って、Ｔ−ｂｅｔ発現のためのＩＦＮ−γおよび持続性のＩＦＮ−γ発現のためのＴ−ｂｅｔへの依存性は、自己増強性フィードバック機構がＩＦＮ−γとＴ−ｂｅｔとの間に存在しているかもしれないことを示唆する。
Ｔ−ｂｅｔ発現はＩＦＮ−γ受容体から発するシグナルの下流にある
サイトカインシグナル伝達およびＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞の分化におけるＳＴＡＴファミリーメンバーの重要性は十分に報告されている（Ｍｕｒｐｈｙ ＫＭら（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４５１−９４；Ｏ’Ｇａｒｒａ Ａら（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５４２−５０）。ＳＴＡＴ４およびＳＴＡＴ６を欠くマウスはそれぞれ有意のＴｈ１およびＴｈ２応答を装備することに失敗する（Ｋａｐｌａｎ ＭＨら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８２：１７４−７；Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ ＷＥら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８２：１７１−４；Ｓｈｉｍｏｄａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０（６５７５）：６３０−３；Ｔａｋｅｄａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０（６５７５）：６２７−３０）。加えて、ＩＦＮ−γはＳＴＡＴ１によりシグナルを伝達し、これはＴｈ１媒介性免疫応答の生成において決定的に重要な役割を演じている。従って、これらのシグナル伝達分子がＴ−ｂｅｔおよびＩＦＮ−γ発現の協調に関与するかどうかをはっきりと決定するための実験を実施した。ＣＤ４＋リンパ節Ｔ細胞をＩＦＮ−γ Ｒ−／−、ＳＴＡＴ１−／−およびＳＴＡＴ４−／−マウスから単離し、そしてプレートに結合した抗ＣＤ３／ＣＤ２８＋ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）（中立）で、またはＴｈ１（ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４）もしくはＴｈ２（ＩＬ４、抗ＩＦＮ−γおよび抗ＩＬ−１２）誘導条件下で７２時間刺激した。ＲＮＡ（第３日に）もしくは全細胞ライセート（第３日および第６日に）を調製し、そしてプローブとしてＴ−ｂｅｔ、ＩＦＮ−γおよびＨＰＲＴ ｃＤＮＡを使用するノーザンブロット分析もしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）およびその後のウェスタンブロッティングのいずれかにかけた。Ｔ−ｂｅｔタンパク質は抗Ｔ−ｂｅｔポリクローナル抗血清、次いでＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（サンタ クルズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ））およびＥＣＬ基質（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して検出した。野性型細胞において、期待されたとおり、Ｔ−ｂｅｔおよびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現はＴｈ１条件下で刺激されたＴ細胞に限定された。興味深いことに、全３種の欠損遺伝子型において、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現はこれらの細胞をＴｈ１条件下で刺激した場合に劇的に低下した。これらの同一のＴｈ１条件において、Ｔ−ｂｅｔ発現はＳＴＡＴ１およびＩＦＮ−γ Ｒ１欠損Ｔ細胞中で顕著に低下されたが、それでもなおＳＴＡＴ４欠損細胞は野性型対照に匹敵するＴ−ｂｅｔレベルを表した（図３３）。刺激３日後にＴ−ｂｅｔタンパク質発現をウェスタンブロット分析により検査した場合に同一のパターンが観察された。培養物中で６日後のみにＳＴＡＴ４−／− Ｔ細胞がＴ−ｂｅｔ発現の低減を示し始めた。これらのデータはＳＴＡＴ１を介するＩＦＮ−γ受容体から発するシグナルがＴ−ｂｅｔ発現の誘導に必要である一方、ＳＴＡＴ４経路によるシグナル伝達はこの早期のＴ−ｂｅｔ誘導に必要とされないことを明白に示す。ＳＴＡＴ４欠損Ｔ細胞中でのＴ−ｂｅｔ発現の後期の低減はこれらの培養物中でのＩＦＮ−γの低下されたレベルによることがありそうである。ＳＴＡＴ４欠損細胞中での低下されたＩＦＮ−γレベルは、ＳＴＡＴ４の重要な役割がＴｈ１応答の発生中に高レベルＩＦＮ−γ産生を持続することであるかもしれない。
Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＳＴＡＴ１−／− ＣＤ４＋ Ｔ細胞中での損なわれたＩＦＮ−γ発現
Ｔ−ｂｅｔ発現の誘導におけるＩＦＮ−γおよびＳＴＡＴ１の役割を確立したので、ＳＴＡＴ１もしくはＳＴＡＴ４のいずれかを欠く細胞に対してＴ−ｂｅｔを欠く細胞のＴｈ１分化能力およびサイトカインプロフィルを比較した。さらに、多数の研究がＴｈ１発生におけるＳＴＡＴ４の肝要な役割を示している（Ｍｕｒｐｈｙ ＫＭら（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４５１−９４）一方、ＳＴＡＴ１の類似の分析が欠けている。ＣＤ４＋ Ｔ−ｂｅｔ−／−、ＳＴＡＴ１−／−およびＳＴＡＴ４−／− ＣＤ４＋リンパ節Ｔ細胞の初代培養物を単離し、そしてプレートに結合した抗ＣＤ３／ＣＤ２８＋ ＩＬ−２（中立）もしくはＴｈ１誘導条件の付加で刺激した。培養物を第３日に追加のＩＬ−２で拡張させた。第７日に細胞を洗浄し、再刺激しそしてサイトカイン産生をＩＣＣおよびＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＩＣＣのために、最後の３時間の間モネンシンの添加を伴いＰＭＡ／イオノマイシンで細胞を６時間再刺激した。ＥＬＩＳＡのためには、プレートに結合した抗ＣＤ３で細胞を２４時間再刺激し、そして培養上清をＩＦＮ−γについて分析した。Ｃ．Ｔ−ｂｅｔ欠損Ｔ細胞からの増大されたＩＬ−４およびＩＬ−５産生。Ｔ−ｂｅｔ−／−、ＳＴＡＴ１−／−およびＳＴＡＴ４−／−ならびに野性型対照からＣＤ４＋ Ｔ細胞を単離し、そして中立、Ｔｈ１もしくはＴｈ２条件下で活性化した。第７日に細胞を再刺激しそしてＥＬＩＳＡによりＩＬ−４およびＩＬ−５産生についてアッセイした。これら３種の遺伝子型の比較は、ＩＦＮ−γ産生およびＴｈ１発生におけるＴ−ｂｅｔおよびＳＴＡＴ１の基礎的な役割を明瞭に具体的に説明する。最も劇的には、中立条件下で、ＩＣＣ染色はＴ−ｂｅｔ−／−およびＳＴＡＴ１−／−集団中で非常に少ないＩＦＮ−γ産生細胞を示した一方、ＳＴＡＴ４−／− Ｔ細胞中では野性型対照と比較してＩＦＮ−γ陽性細胞の割合に差異は存在しなかった（図３４）。Ｔｈ１極性化（ｓｋｅｗｉｎｇ）条件下での刺激後に、各欠損はＩＦＮ−γ陽性細胞の減少された割合を表し、最大の減少はＴ−ｂｅｔ−／−およびＳＴＡＴ１−／− Ｔ細胞で観察された（図３５Ａ）。培養上清中のＩＦＮ−γレベルのＥＬＩＳＡ測定はＩＣＣ染色に匹敵する結果を示した。
これらの培養物中でのＴｈ２サイトカイン産生の分析を実施してＴ−ｂｅｔ−／−、ＳＴＡＴ−／−およびＳＴＡＴ４−／− Ｔ細胞の発生中のＴｈ表現型をさらに特徴づけした。Ｔｈ２条件下で各遺伝子型は野性型対照に匹敵する量のＩＬ−４およびＩＬ−５（ＥＬＩＳＡにより測定されるところの）を産生した。Ｔ−ｂｅｔ欠損Ｔ細胞は、野性型対照と比較して中立的およびＴｈ１双方の条件下で顕著により高いＩＬ−４およびＩＬ−５を産生した。加えて、中立的およびＴｈ１条件下でＳＴＡＴ１欠損Ｔ細胞は野性型に比較して増大されたＩＬ−４産生を示した。対照的に、ＳＴＡＴ４欠損細胞は中立的もしくはＴｈ１いずれの条件下でも野性型と比較してＩＬ−４もしくはＩＬ−５いずれの産生の差異も示さなかった。一緒にすれば、これらの研究は、豊富なＩＦＮ−γ産生およびＴｈ２サイトカインの抑制を特徴とする至適のＴｈ１応答がＴ−ｂｅｔおよびＳＴＡＴ１双方の存在を必要とすることを示す。
ＩＦＮ−γをＳＴＡＴ４−／−およびＴ−ｂｅｔ−／−二重ノックアウト動物でもまた測定した。上のとおり、図３５Ｂは、ＳＴＡＴ４およびＴ−ｂｅｔノックアウト動物からのＴｈ１細胞が低下したＩＦＮ−γ産生を表し、Ｔ−ｂｅｔノックアウトが最大の減少を示したことを示す。ＳＴＡＴ４／Ｔ−ｂｅｔ二重ノックアウトはしかしながらＩＦＮ−γ産生のなおより大きな低減を示した。
これらのデータは、ＳＴＡＴ１、Ｔ−ｂｅｔおよびＳＴＡＴ４が別個の役割を有するＴｈ１細胞の別個の発生期が存在することを示す。ＩＬ−１２／ＳＴＡＴ４ではなくＩＦＮ−γ／ＳＴＡＴ１がＴ−ｂｅｔ発現の主要調節物質である。ＩＦＮ−γを初回刺激の間に中和した場合は、Ｔ−ｂｅｔ発現が喪失されかつ細胞はＴｈ１系譜に完全に決定することに失敗した。これらの研究は、ＩＦＮ−γのその後の産生がそうであったようにＴ−ｂｅｔ発現が大きく減少したことを示したＳＴＡＴ１−／−およびＩＦＮγＲ１−／− Ｔ細胞を使用する実験で確認された。
Ｔｈ１の発生はＳＴＡＴ４−／− Ｔ細胞中で大きく損なわれたとは言え、Ｔ−ｂｅｔの早期発現は損なわれなかった。当初、この観察結果はＴｈ１分化におけるＳＴＡＴ４およびＴ−ｂｅｔ双方の中心的役割を考えれば逆説的に思われた。しかしながら、中立的な（Ｔｈ１を促進する刺激の付加を伴わない）条件下で刺激したＴ−ｂｅｔ、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ４欠損Ｔ細胞の分析が１つの説明を提供し得た。ＩＦＮ−γ産生はＳＴＡＴ１−／−およびＴ−ｂｅｔ−／−双方のＴ細胞で本質的に非存在であった一方、ＳＴＡＴ４−／−細胞は野性型対照に匹敵するＩＦＮ−γレベルを生じた。この結果はＳＴＡＴ４がＩＦＮ−γ産生を直接誘導するのに必要でないことを示唆する。従って、Ｔｈ１発生におけるＳＴＡＴ４の中心的役割は、Ｔｈ１応答の間に産生されるＩＦＮ−γの量を増強しかつ安定化するＳＴＡＴ４の能力に帰されるかもしれない。
Ｌｏｃｋｓｌｅｙらは、ＴＣＲ／ＣＤ２８の会合直後に、ナイーブなＴｈｐ細胞がＳＴＡＴ４およびＳＴＡＴ６に独立にＩＬ−４およびＩＦＮ−γ双方の転写物を発現することを示した（Ｇｒｏｇａｎ ＪＬら（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：２０５−１５）。本実施例はこれを裏付け、そして、初期ＩＦＮ−γ発現もまたＴ−ｂｅｔに依存しないことを示す。その後、数時間以内にＴｈｐ細胞は第二のサイトカイン依存性の決定期に入る。ここで、われわれは、Ｔ−ｂｅｔ発現がＴｈ１の発生を支援するのに必要でありかつＩＦＮ−γＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達経路から発するシグナルに頼ることを見出す。この第二相の間は、ＩＦＮ−γ産生が維持される一方、発生中のＴｈ１細胞中でのＩＬ−４産生が静められる（Ｇｒｏｇａｎ ＪＬら（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：２０５−１５）。
いずれかの特定の機構により束縛されることを願わず、Ｔ−ｂｅｔはＩＦＮ−γ対立遺伝子のクロマチンリモデリングを開始することによらずしかしおそらく既に開放の（ｏｐｅｎ）ＩＦＮ−γ遺伝子座を安定化することによりこの段階でＩＦＮ−γ産生を増強するとみられる。Ｔ−ｂｅｔはまたＩＬ−１２Ｒα２鎖の発現も誘導してＴｈ１発生を第三のＩＬ−１２／ＳＴＡＴ４依存性の段階に入らせるかもしれない。ここでＩＬ−１２は産生されるＩＦＮ−γのレベルを至適化しかつ／もしくは決定されたＴｈ１細胞（すなわち機能的ＩＬ−１２Ｒ複合体を発現するもの）の増殖因子としてはたらく。
一緒にすれば、これらのデータはこの早期のサイトカイン発現がＴｈ細胞分化の確率論的局面でありうることを示唆する。従って、各Ｔｈｐ細胞はＩＬ−４およびＩＦＮ−γ双方を発現する一方で、それらは正確に同時に発現されないかもしれない。サイトカイン転写の初期の突発の間に、どのサイトカイン遺伝子が最初に発現されかつ２つの対立遺伝子のどちらが最初に発現されるかに関して自由裁量であるかもしれない。
このモデルは、この最初の確率論的段階の結果が、ＩＦＮ−γおよびＴ−ｂｅｔもしくはＩＬ−４およびＧＡＴＡ３を巻き込む自己増強性フィードバック機構により個々のＴｈｐ細胞の運命の指図において重要な役割を演じていることを提案する。例えば、ナイーブなＴｈｐ細胞がＴＣＲ／ＣＤ２８を介して刺激されそしてＩＦＮ−γ発現を無作為に開始するかもしれない。分泌されたＩＦＮ−γがその後そのナイーブなＴｈｐ細胞上に存在するＩＦＮ−γＲに作用してＴ−ｂｅｔを誘導し、それが順により多くのＩＦＮ−γ、次いでより多くのＴ−ｂｅｔの発現を支援する。いずれかの時点でＩＬ−４遺伝子が無作為に発現され、そして分泌されたＩＬ−４がその同一のナイーブな細胞上で発現されたＩＬ−４Ｒに結合し、それがＧＡＴＡ３発現を誘導する。しかしながら、この点でＧＡＴＡ３はＩＦＮ−γ発現の最初の確率論的行動により当初確立されるＴ−ｂｅｔの勾配を克服することが可能でないかもしれない。この段階で、Ｔ−ｂｅｔはＧＡＴＡ３発現を抑制することによりＩＬ−４およびＩＬ−５発現を阻害するかもしれない。加えて、発生中の応答において、ＩＬ−１２Ｒα２鎖が発現されてＩＬ−１２がＴｈ１細胞を発生させるための増殖因子として作用しかつ／もしくはＩＦＮ−γレベルを増大させるように作用することを可能にする。従って、早期のＩＦＮ−γおよびＴ−ｂｅｔはＴｈ１発生、次いでＴｈ１系譜の決定を高めかつ安定化するＳＴＡＴ４により伝達されるシグナルを開始かつ増強するよう作用する。
にもかかわらず、われわれの研究は純粋に選択的なモデルに反対を唱える。この仮説の下では、Ｔｈ細胞の発生は、Ｔｈ１もしくはＴｈ２分化のサイトカイン非依存性の確率論的過程を最初に受けたＴ細胞にサイトカインにより送達される増殖シグナルによってのみ決定される過程である。このモデルが正しいはずであれば、ＳＴＡＴ１を欠くＴ細胞がＩＦＮ−γを産生する能力を保持しているとみられることを期待するであろう。しかしながら、中立の培養条件下ではＩＦＮ−γ産生ＳＴＡＴ１−／−細胞は本質的に存在しない。さらに、ＩＦＮ−γは歴史的にその抗増殖能力について知られ、また、ＳＴＡＴ１−／−細胞は野性型細胞に比較して増大された成長速度を有する（Ｄｕｒｂｉｎ ＪＥら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８４：４４３−５０；Ｍｅｒａｚ ＭＡら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８４：４３１−４２）
従って、野性型細胞より多いＩＦＮ−γ産生ＳＴＡＴ１−／−細胞が存在するはずであることが選択モデルに基づき予期されるであろう。Ｔｈ１培養条件下でさえ、ＩＦＮ−γを産生しかつＴｈ１表現型に分化するＳＴＡＴ１−／− Ｔｈ細胞の能力の激烈な低下が存在する。従って、これらのデータはＩＬ−１２／ＳＴＡＴ４経路がＴｈ１分化の初期の促進に関与していないことを示唆する一方で、指導的（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ）機構を介してＩＦＮ−γ／ＳＴＡＴ１により伝達されるシグナルがＩＦＮ−γの効率的生成およびＴｈ１応答に必要とされるようである。
ＩＦＮ−γ受容体経路によるシグナル伝達がＴ−ｂｅｔの主要誘導体であるようである。Ｔ−ｂｅｔ転写物は中立条件下で刺激されたＳＴＡＴ１−／− Ｔ細胞中で完全に欠けていた。ＴＣＲ刺激単独ではＴ−ｂｅｔ発現を誘導するのにも十分でなく、それはまたＴ−ｂｅｔ自己調節も誘導しなかった。この知見は、異所性のＴ−ｂｅｔをＳＴＡＴ４−／− Ｔ細胞中にレトロウイルスで導入した場合に内因性Ｔ−ｂｅｔ転写物を測定する実験におけるＴ−ｂｅｔの自己調節機構を支持した以前の研究（Ｍｕｌｌｅｎ ＡＣら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１９０７−１０）とよい対照をなす。しかしながら、レトロウイルスで発現されたＴ−ｂｅｔは内因性のＩＦＮ−γ産生を強力に誘導し（Ｓｚａｂｏら（２０００）Ｃｅｌｌ １００：６５５−６９；Ｍｕｌｌｅｎ ＡＣら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１９０７−１０）かつ産生されたＩＦＮ−γがその後ＳＴＡＴ４−／− Ｔ細胞上に存在するＩＦＮ−γ受容体を結合しかつ内因性のＴ−ｂｅｔを誘導することが可能であるとみられることが示されている。従って、われわれは、無傷のＩＦＮ−γ Ｒ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達経路が高レベルＴ−ｂｅｔ発現を得るのに不可欠であることを見出す。しかしながら、Ｔｈ１条件下で発生するＳＴＡＴ１−／−およびＩＦＮγＲ１−／− Ｔ細胞中のＴ−ｂｅｔ転写物の際だった減少にもかかわらず、低レベルのＴ−ｂｅｔ転写物が残存した。これらの結果は、Ｔ−ｂｅｔおよびＴｈ１分化を誘導し得る未だ発見されるべきＩＦＮ−γ非依存性のシグナル／機構が存在することを示唆する。
以前のＴ−ｂｅｔ発現研究とともに提示されるデータは、早期のＴヘルパー細胞分化のその後のモデルを示唆する。シグネチャＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン（それぞれＩＦＮ−γおよびＩＬ−４）の初期の産生はＴＣＲ媒介性シグナルにより駆動される。いずれかの発生経路への決定は、転写因子Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３のサイトカイン媒介性の誘導、ならびに複数の成分（すなわちＳＴＡＴ類）による各系譜のその後の安定化に依存する。
同等物
当業者は、本明細書に記述される本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するかもしくはただ慣例の実験を使用して確認することが可能であろう。こうした同等物は以下の請求の範囲により包含されることを意図している。
図１ＡはマウスおよびヒトＴ−ｂｅｔのヌクレオチド配列のアライメントを示す。該アライメントはＡＬＩＧＮプログラムを使用して作成した。図１ＢはＬｉｐｍａｎ Ｐｅａｒｓｏｎタンパク質アライメントプログラムを使用して作成したマウスおよびヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸配列のアライメントを示す。Ｔボックス配列を太字で示す。チロシンリン酸化部位は下線をつけてある。核局在化部位は矢印で印をつけてある。 Ｔ−ｂｅｔが、５’および３’双方の領域に位置する機能上重要なドメインを伴うコンセンサスＴボックスに結合しかつトランス活性化することを示す。 図３ＡはＴ−ｂｅｔがダブルネガティブ胸腺細胞中で優先的に発現されることを示す。図ＢはＴｈクローンの調査においてＴ−ｂｅｔ発現がＴｈ１細胞に限定されていることを示す。図ＣはＴ−ｂｅｔのウェスタンブロット分析を示す。図ＤはＴ−ｂｅｔ発現のＦＡＣＳ分析を示す。 Ｔ−ｂｅｔ発現がＮＫおよびＢ細胞中でのＩＦＮ−γ誘導と相関することを示す。 Ｔ−ｂｅｔがＴｈ細胞中でＩＦＮ−γ遺伝子をトランス活性化することを示す。 Ｔ−ｂｅｔのレトロウイルス遺伝子形質導入がＩＦＮ−γ産生を減少増大させかつＩＬ−２産生を抑制することを示す。 Ｔ−ｂｅｔが初代Ｔ細胞中でＩＦＮ−γを活性化しかつＩＬ−２産生を抑制することを示す。 Ｔ−ｂｅｔが発生中のＴｈ２細胞中でＩＦＮ−γを誘導しかつＩＬ−４産生を阻害することを示す。 Ｔ−ｂｅｔが極性化Ｔｈ２細胞をＴｈ１経路に向け直すことを示す。Ｔｈの極性化は上のとおり実施しかつレトロウイルス感染を培養第９日に実施した。 Ｔ−ｂｅｔが極性化Ｔｃ２細胞をＴｃ１経路に向け直すことを示す。ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＭｏＦｌｏにより精製しかつＴｈ２ねじ曲げ条件下で上のとおり培養し、そしてレトロウイルス形質導入を培養第８日に実施した。 Ｔ−ｂｅｔがチロシンリン酸化されることを示す。 Ｔ−ｂｅｔのドミナントネガティブ突然変異体の活性を示す。 活性化されたＴ細胞濃縮したＬＰＭＣのＴＧＦ−β（しかしＩＬ−４でなく）での処理がＴ−ｂｅｔ発現を抑制し、ＴＧＦ−βとＴ−ｂｅｔとの間の交互の関係を示唆することを示す。 Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスがＥＡＥの発生に対し抵抗性であることを示す。。 Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスが０．５未満の平均臨床スコアを有しかつＥＡＥから保護されたことを示す。 ＩＦＮ−γについて陽性に染色するＣＤ４＋細胞の割合が２Ｄ２ ＭＯＧｘＴ−ｂｅｔ＋／＋動物で３３％かつ２Ｄ２ ＭＯＧｘＴ−ｂｅｔ−／−動物で３％であったことを示す。 ＣＤ８＋、ＣＤ４４Ｈｉ、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＣＤ６９ＨｉおよびＬｙ６ＣＨｉ細胞中での減少により明示されるところのＴ−ｂｅｔの非存在下でのＣＤ８細胞の数の実質的な減少（およそ２／３の減少）を示す。 Ｔ−ｂｅｔがＣＤ８＋細胞中でのＩＦＮ−γ産生に必要とされることを示す。 Ｔ−ｂｅｔがＮＫ細胞中でＩＦＮ−γの産生を調節することを示す。 ＮＫ細胞の生成がＴ−ｂｅｔの非存在下でもまた損なわれることを示す。 Ｔ−ｂｅｔ−／− ＮＫ細胞中での減少された自発的腫瘍細胞溶解を示す。 溶解性遺伝子の発現がＴ−ｂｅｔの非存在下で損なわれたことを示す。 Ｔ−ｂｅｔを欠くマウスにおけるマウス樹状細胞の正常な発生および活性化を示す。 未刺激のＤＣ中での低レベルのＴ−ｂｅｔ発現およびＩＦＮ−γでの処理後のＴ−ｂｅｔ転写物レベルの迅速なアップレギュレーションをを示す。 Ｔ−ｂｅｔが樹状細胞によるＩＦＮ−γの至適の産生に不可欠であることを示す。 Ｔｅｃファミリーメンバーの保存された構造を示す。 ヒトＴ−ｂｅｔの予測されるチロシンリン酸化部位を示す。 作成されかつｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイで基質として使用された改変された形態のＴ−ｂｅｔを示す。 ＩＴＫおよびＲｌｋの双方がｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイでＴ−ｂｅｔのＮ末端およびＣ末端をリン酸化したがしかしＤＮＡ結合領域はしなかったことを示す。 Ｔ−ｂｅｔはＩＴＫノックアウト動物からのＴ細胞中に存在しているとは言え、該分子のチロシンリン酸化が低下されていることを示す。対照的に、Ｔ−ｂｅｔはＲｌｋノックアウトのＴ細胞中で過剰リン酸化された。 ＴＲ細胞がＴ−ｂｅｔの非存在下で増大されることを示す。 ＩＦＮ−γがＩＦＮ−γとＴ−ｂｅｔとの間の自己増強性フィードバック機構でＴ−ｂｅｔ発現を調節することを示す。 Ｔ−ｂｅｔ発現がＳＴＡＴ１およびＩＦＮ−γ Ｒ１欠損Ｔ細胞中で顕著に低下されたがそれでもなおＳＴＡＴ４欠損細胞は野性型対照に匹敵するＴ−ｂｅｔレベルを表したことを示す。 Ｔ−ｂｅｔおよびＳＴＡＴ１（しかしＳＴＡＴ４でない）欠損ＣＤ４＋ Ｔ細胞中での低下されたＩＦＮ−γ発現を示す。 Ｔ−ｂｅｔ、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ４欠損Ｔｈ１細胞中での低下されたＩＦＮ−γ発現を示す。 Ｔ−ｂｅｔを欠くＣＤ８細胞が実質的に増大されたレベルのＩＬ−１０およびＩＬ−２を産生することを示す。

Claims (1)

  1. ａ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質およびＴｅｃ、Ｂｔｋ、Ｉｔｋ、ＲｌｋおよびＢｍｘからなる群より選ばれるＴｅｃキナーゼファミリーメンバーのタンパク質を含んでなる指標組成物を提供する工程、
    ｂ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質と該キナーゼタンパク質の相互作用を可能にする条件下で該指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させる工程、
    ｃ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質と該キナーゼタンパク質の相互作用を検出する工程、
    ｄ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質と該キナーゼタンパク質との間の相互作用を調節する目的の化合物を試験化合物のライブラリーから選択する工程
    を含んでなる、Ｔ−ｂｅｔタンパク質とＴｅｃキナーゼファミリーメンバーのタンパク質との間の相互作用の調節において有用な薬物のインビトロの同定方法。
JP2003549556A 2001-12-03 2002-12-03 Ｔ−ｂｅｔ組成物およびそれらの使用方法 Expired - Fee Related JP4533627B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/008,264 US7393944B2 (en) 1999-06-02 2001-12-03 T-bet compositions and methods of use thereof
PCT/US2002/038514 WO2003048379A1 (en) 2001-12-03 2002-12-03 T-bet compositions and methods of use thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009200559A Division JP2010011857A (ja) 2001-12-03 2009-08-31 Ｔ−ｂｅｔ組成物およびそれらの使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2005511056A JP2005511056A (ja) 2005-04-28
JP4533627B2 true JP4533627B2 (ja) 2010-09-01

Family

ID=21730661

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003549556A Expired - Fee Related JP4533627B2 (ja) 2001-12-03 2002-12-03 Ｔ−ｂｅｔ組成物およびそれらの使用方法
JP2009200559A Withdrawn JP2010011857A (ja) 2001-12-03 2009-08-31 Ｔ−ｂｅｔ組成物およびそれらの使用方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009200559A Withdrawn JP2010011857A (ja) 2001-12-03 2009-08-31 Ｔ−ｂｅｔ組成物およびそれらの使用方法

Country Status (6)

Country Link
US (3) US7393944B2 (ja)
EP (1) EP1461450A4 (ja)
JP (2) JP4533627B2 (ja)
AU (2) AU2002357058C1 (ja)
CA (1) CA2468701A1 (ja)
WO (1) WO2003048379A1 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7393944B2 (en) * 1999-06-02 2008-07-01 President And Fellows Of Harvard College T-bet compositions and methods of use thereof
AU2003304486A1 (en) * 2003-09-26 2005-04-14 Department Of Biogenic Amines, Polish Academy Of Sciences Cells and methods useful in characterising the immunotoxic activity of xenobiotic substances
US8323970B2 (en) 2005-05-31 2012-12-04 President And Fellows Of Harvard College Modulation of T cell recruitment
WO2007056422A2 (en) * 2005-11-07 2007-05-18 President And Fellows Of Harvard College Modulation of il-2 production by t-bet
EP1977003A4 (en) * 2005-12-22 2009-11-11 Dermagene Oy DISEASE-RELATED METHODS AND MEDIUM
WO2009042642A2 (en) * 2007-09-24 2009-04-02 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for the treatment and prevention of ulcerative colitis and colon cancer
JP2012050440A (ja) * 2011-09-16 2012-03-15 Chiba Univ ヒトＴｈ１／Ｔｈ２分化誘導の評価方法
WO2020243537A1 (en) * 2019-05-29 2020-12-03 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Therapeutic t-cells with modified expression of t-bet, eomes, and c-myb transcription factors

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0676469A3 (en) * 1994-04-04 1998-03-25 Tadamitsu Kishimoto Transcription Factor APRF
WO1999011783A2 (en) 1997-09-03 1999-03-11 Smithkline Beecham Plc T-box polypeptides
US6207414B1 (en) 1998-01-29 2001-03-27 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Tyrosylprotein sulfotransferases and methods of use thereof
US6037148A (en) 1998-09-29 2000-03-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. MTBX protein and nucleic acid molecules and uses therefor
US6031078A (en) * 1998-06-16 2000-02-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. MTbx protein and nucleic acid molecules and uses therefor
JP4427218B2 (ja) 1999-06-02 2010-03-03 プレジデント・アンド・フエローズ・オブ・ハーバード・カレツジ Ｔ−ｂｅｔ組成物およびその使用の方法
US8048672B2 (en) * 1999-06-02 2011-11-01 President And Fellows Of Harvard College T-bet compositions and methods of use thereof
US7393944B2 (en) 1999-06-02 2008-07-01 President And Fellows Of Harvard College T-bet compositions and methods of use thereof
EP1442064A2 (en) 2001-10-19 2004-08-04 Incyte Genomics, Inc. Kinases and phosphatases
WO2006079119A2 (en) 2005-01-20 2006-07-27 President And Fellows Of Harvard College Modulation of th2 lineage commitment by t-bet

Also Published As

Publication number Publication date
US20060084118A1 (en) 2006-04-20
WO2003048379A1 (en) 2003-06-12
US20080300384A1 (en) 2008-12-04
AU2002357058A1 (en) 2003-06-17
US7745581B2 (en) 2010-06-29
US7365169B2 (en) 2008-04-29
US20030104528A1 (en) 2003-06-05
EP1461450A1 (en) 2004-09-29
JP2010011857A (ja) 2010-01-21
CA2468701A1 (en) 2003-06-12
US7393944B2 (en) 2008-07-01
JP2005511056A (ja) 2005-04-28
AU2002357058B2 (en) 2008-08-28
AU2002357058C1 (en) 2009-03-26
EP1461450A4 (en) 2008-04-02
AU2008207648A1 (en) 2008-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20120159661A1 (en) T-Bet Compositions and Methods of Use Thereof
US20090060902A1 (en) Methods and compositions for regulating T cell subsets by modulating transcription factor activity
JP2010011857A (ja) Ｔ−ｂｅｔ組成物およびそれらの使用方法
US20020086305A1 (en) Human c-Maf compositions and methods of use thereof
JP2010011856A (ja) Ｔ−ｂｅｔ組成物およびその使用の方法
JP2000510333A (ja) 因子活性を調節することによりｔ細胞サブセットを制御するための方法及び組成物
US20060223116A1 (en) Modulation of Th2 lineage commitment by T-bet
AU2006201827B2 (en) T-bet compositions and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20051201

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080902

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422

Effective date: 20081104

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20081104

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20081128

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20081215

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090428

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090831

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20090914

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100406

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100413

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20100608

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20100614

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130618

Year of fee payment: 3

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees