JP4521797B2 - Constant potential electrolytic hydrogen sensor - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、水素の検知には水素ガスセンサとして、水素と他のガスとの気体熱伝導率の違いを利用する気体熱伝導式、水素の触媒燃焼による素子温度の上昇を利用する接触燃焼式、水素よる半導体粒子表面の吸着酸素の消費に伴う半導体素子の自由電子の増加(抵抗値の減少)を利用する半導体式などが用いられている。また、水素の電気化学的酸化に伴う電流値を測定する電気化学式（定電位電解式）が用いられており、これは電解液を用いる湿式と固体電解質を用いる乾式が知られている。これら水素ガスセンサはそれぞれ得意とする濃度範囲や設置条件があり、用途に応じて使い分けられている。また、これら水素ガスセンサは、様々な工夫により他の可燃性ガスに対する水素の感度比を大きく向上させることにより、感度良く水素を認識することができるため、水素ガス漏洩を検知する手段として広く使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述した従来の水素ガスセンサは、他の可燃性ガスに対する水素の感度比を大きく向上させることにより水素を感度良く検知できるようにしたものであり、原理的に水素だけに感度を有するというようなものではない。このため、水素に対する高感度化には限界があり、さらに、水素以外の可燃性ガスを検知する可能性を否定できないため、水素ガスセンサからの警報には誤報が含まれている可能性があるといった問題を常に考慮した上で使用する必要があった。
【０００４】
従って、本発明の目的は、高水素選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
近年、水素とプロトンとの酸化還元反応を特異的に触媒する蛋白質として知られるヒドロゲナ−ゼについての研究が進み、熱や酸素に対して十分な安定性を有するヒドロゲナ−ゼが発見された。さらに、ヒドロゲナーゼ生成菌の培養技術、ヒドロゲナーゼの分離精製技術が確立されている。また、ヒドロゲナーゼの電極への固定化技術等が研究されている。このように電極にヒドロゲナーゼを固定することにより、ヒドロゲナーゼを触媒として電気化学的もしくは光化学的に電流を検出したり、水素を発生させる試みがなされている。また、ヒドロゲナーゼにおいては、水素の酸化還元に作用する活性部位は局在化していると考えられており、電極とヒドロゲナーゼとの直接的な電子の授受は困難であると考えられているため、電極とヒドロゲナーゼとの間の電子の授受を仲介するメディエータが不可欠である。つまり、電子キャリアーとしてメディエータを化学結合したポリマーを電極表面に固定化し、緩衝液中において、水素溶存下でのヒドロゲナーゼの水素酸化による電流を検出したり、光励起により電子を放出する亜鉛錯体を用いることで、光化学的に水素を発生させるのである。
【０００６】
この反応は、化１の正反応に示したように、ヒドロゲナーゼを触媒として、緩衝液中のプロトンを還元することにより水素を発生させたものである。
【０００７】
【化１】
本発明者らは、ヒドロゲナーゼは水素とプロトンの酸化還元反応を特異的に触媒する蛋白質であるから、化１で示した正反応の逆反応においても、緩衝液中の電極上で起こさせることが可能ではないかと考えた。さらに、上記目的を達成すべく、水素の酸化によるプロトンと電子の生成を電極に固定されたヒドロゲナーゼを触媒として行わせ、生じた電子を出力回路により検出することによって、水素に対して高選択性を有する水素ガスセンサとして利用できるのではないかと考え本発明に想到した。
【０００９】
ここで、前述のように、ヒドロゲナーゼを電極に固定し、メディエータを使用してヒドロゲナーゼと電極間の電子の授受を行い水素を発生させる反応は周知の技術であったが、水素を高感度に選択するための水素ガスセンサとして機能する電気化学的なセンサとしてヒドロゲナーゼを使用する技術はこれまで提案されていなかった。つまり、本発明は、本発明者らの前述の知見に基づき、多くの実験を重ねた上で実験的に確認され、完成に至ったものである。
【００１０】
〔構成１〕
この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項１に記載のように、
ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサであって、
前記作用電極として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設け、前記第１水素酸化活性物質が有効成分としてヒドロゲナーゼを含有し、
前記電解液として、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含有することにある。
【００１１】
また、この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項２に記載のように、請求項1に記載の発明において、
前記水素酸化活性層が、ポリ−Ｌ−リジン (ＰＬＬ) を改質材として用いたヒドロゲナーゼの単分子膜あるいはＬＢ膜あるいはキャスト膜であることにある。
【００１２】
〔作用効果１〕
つまり、ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設けてあるから、前記ガス導入部より被検知ガスを前記作用電極に導くことが出来、導かれた前記被検知ガスが前記作用電極上において酸化反応することにより酸化電流が流れ、さらに、前記対極上では酸素の還元反応が起こり、前記作用電極上で生じた酸化電流と等量の還元電流が流れる。この反応に伴って流れる電流量は、前記作用電極上で反応した被検知ガス濃度に比例しており、前記各電極に電気接続してあるガス検知出力を得る出力回路によりこの電流量を測定することによって、前記被検知ガスの濃度が測定できるのである。
またガス種によって酸化還元電位が異なることを利用しているため、前記回路の設定電位によってはガスの選択的な検知が可能になる。また、ガス電極に用いる触媒を変えることで、目的とするガスに対して高い選択性を持たすことができるのである。
【００１３】
また、前記作用電極に水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設け、前記第１水素酸化活性物質が有効成分としてヒドロゲナーゼを含有することによって、前記作用電極に用いる触媒を水素に特異的な触媒とすることが出来る。つまり、前記ヒドロゲナーゼは、水素を特異的に酸化還元する蛋白質であるため、前記ヒドロゲナーゼを前記水素酸化活性層に含有させることによって、前記作用電極は水素に高い選択性を有することになるのである。
【００１４】
ここで、前記ヒドロゲナーゼは親水性の蛋白質であり、水素の酸化還元に作用する活性部位は局在化していると考えられており、電極とヒドロゲナーゼとの直接的な電子の授受は困難であると考えられているため、電極とヒドロゲナーゼとの間の電子の授受を仲介するメディエータが不可欠である。このため、前記電解液中に電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含有することにより、図３に示したように、前記作用電極付近で酸化分解された水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。
【００１５】
このように、水素に高い選択性を有する前記作用電極に前記メディエータを介して円滑に電子を伝達することが出来るのであるから、水素に高い選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
また、水素の原料となるメタノ−ル、メタンや一酸化炭素などには感度を示さず、水素に高い感度を有する水素ガスセンサ提供できれば、将来の水素エネルギーシステムのメンテナンスや安全対策に非常に役立つものと期待される。
【００１６】
ここで、高効率の電子伝達を可能にするための薄膜として、単分子膜、ＬＢ （Ｌａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）法により作成されたＬＢ膜、キャスト法により作成されたキャスト膜がある。これらの膜の作成に用いられる分子は分子内に疎水性と親水性が分極して存在することが好ましいことが知られている。また、ヒドロゲナーゼの多くは親水性であるため、例えば、後述の実施例１に記載のＰＬＬ等の改質材を用いることによりヒドロゲナーゼの活性を変化させること無く疎水性を付与することが出来る。つまり、ＰＬＬを改質材として用いたヒドロゲナーゼの単分子膜やＬＢ膜を水素酸化活性層として用いれば、親水基と疎水基とを配向配列させることができ、高効率の電子伝達が実現するのである。
【００１７】
〔構成２〕
この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項３に記載のように、
ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサであって、
前記電解液として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質としてヒドロゲナーゼが添加された溶液を用い、
前記作用電極として、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設けた電極を用いることにある。
【００１８】
〔作用効果２〕
つまり、ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してあるから、請求項１に記載の定電位電解式水素センサの基本的な構成を採用することが出来るのである。
【００１９】
また、前記電解液として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質としてヒドロゲナーゼが添加された溶液を用いることにより、前記電解液中に含まれる前記ヒドロゲナーゼによって水素を特異的に酸化分解することができる。さらに、前記作用電極として、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設けてある電極を用いることにより、図４に示したように前記作用電極付近で酸化分解された前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。
また、酸化反応の触媒としてヒドロゲナーゼを用いているから、水素に高い選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
【００２０】
〔構成３〕
この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項４に記載のように、
ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサであって、
前記作用電極として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質であるヒドロゲナーゼと、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質とを含んだ水素酸化活性層を設けたことにある。
【００２１】
〔作用効果３〕
つまり、ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してあるから、請求項１に記載の定電位電解式水素センサの基本的な構成を採用することが出来るのである。
【００２２】
また、前記作用電極として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質であるヒドロゲナーゼと、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質とを含んだ水素酸化活性層を設けてあるから、前記ヒドロゲナーゼによって水素を特異的に酸化分解することができ、さらに、図５に示したように、前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。
【００２３】
また、酸化反応の触媒としてヒドロゲナーゼを用いているから、水素に高い選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
【００２４】
〔構成４〕
また、この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項５に記載のように、請求項１〜４の発明において、
前記第２水素酸化活性物質が、ビオロゲン化合物あるいはシトクロムｃ3を含 有していることにある。
【００２５】
また、請求項６に記載のように、前記ビオロゲン化合物はメチルビオロゲン（ＭＶ）、ポリブチルビオロゲン（ＰＢＶ）、ポリオクチルビオロゲン（ＰＯＶ）であるのが好ましい。
【００２６】
また、この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項７に記載のように、請求項項１又は２又は４又は５のいずれか一項の発明において、
ヒドロゲナーゼを含む水素酸化活性層がＰＥＧＤＧＥを含有することにある。
【００２７】
〔作用効果４〕
つまり、前記第２水素酸化活性物質に含まれるメディエータとしてビオロゲン化合物あるいはシトクロムｃ3を使用するのが好ましい。
【００２８】
前記ビオロゲン化合物としては、ＭＶ、ＰＢＶ、ＰＯＶ等のビオロゲンポリマーが含まれる。図７に前記ＭＶをメディエータとして用いた場合の前記作用電極表面における電子伝達の様子を示す。つまり、水素がヒドロゲナーゼにより酸化され、この時生じた電子がＭＶに伝達され、前記ＭＶは還元型ＭＶとなる。この還元型ＭＶは速やかに酸化されるのであるが、この際、前記作用電極に電子を伝達するのである。
また、前記ビオロゲン化合物は、合成し易く、電極表面での固定も容易であることから、汎用性の高いメディエータとして期待される。
【００２９】
また、前記ビオロゲン化合物を用いた場合、前記ビオロゲン化合物は前記ヒドロゲナーゼと複合体を形成し安定な分子膜を形成しているものと考えられるため、前記ビオロゲン化合物は電子伝達のメディエータとして機能するだけでなく、安定した水素酸化活性層を有する作用電極を提供することが出来る。
【００３０】
前記シトクロムｃ3は、硫酸還元菌中ではヒドロゲナーゼから電子を受け取り 細胞内に運び込む、ヒドロゲナーゼの電子伝達体としての機能を有するものであり、乾燥状態でも電子伝達活性が保持されているものである。特に固体膜において高い電気導電性を有するものであるから、前記作用電極の前記水素酸化活性層に前記第２水素酸化活性物質として含有させた場合には、酸化反応の結果生じた電子の伝達を容易に行うことが出来るようになる。一方、前記電解液中に第２水素酸化活性物質として含有させた場合においても電子伝達活性が保持されているため、酸化反応の結果生じた電子の伝達を容易に行うことが出来るようになる。
【００３１】
また、ヒドロゲナーゼを含む前記水素酸化活性層に、ヒドロゲナーゼ膜安定化材として、Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ（ＰＥＧＤＧＥ）を加えてもよい。前記ＰＥＧＤＧＥを前記水素酸化活性層に添加した場合、前記水素酸化活性層は安定性を増すことが期待される。
【００３２】
〔構成５〕
また、この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項８に記載のように、請求項１〜７の発明において、
前記水素酸化活性層が前記第１水素酸化活性物質および前記第２水素酸化活性物質を担持した活性炭粉末を塗着して形成してあることにある。
【００３３】
〔作用効果５〕
つまり、前記水素酸化活性層が前記第１水素酸化活性物質であるヒドロゲナーゼや前記第２水素酸化活性物質であるメディエータを担持した活性炭粉末を塗着して形成すれば、前述のように単分子膜やＬＢ膜を作製して前記作用電極上に固定する必要が無いため、簡便に水素に高い選択性を有する作用電極を作製することができ、その結果、簡便に水素に高い選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することが出来る。そのため、製造コストの安価な定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
【００３４】
また、前記活性炭粉末等のカーボンは、作用電極材料としても用いられており、電導性が高いため、前記作用電極への電子の伝達が容易に行われる。
【００３５】
〔構成６〕
また、この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項９に記載のように、請求項１〜８の発明において、
前記ヒドロゲナーゼが、チオカプサ ロセオペルシシナ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）ＢＢＳ株由来であることにある。
【００３６】
〔作用効果６〕
つまり、チオカプサ ロセオペルシシナ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ、以下Ｔ．ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａとする）のＢＢＳ株より精製したヒドロゲナーゼは、熱や酸素に対して十分な安定性を有し、７０℃付近で最適な酵素活性を示す。さらに、前記ＬＢ膜中においても酵素活性は３０−７０℃において良好に保持されている（図９参照）。このため、水素検出のために前記定電位電解式水素センサにおける前記電解液や前記ＬＢ膜の温度が７０℃付近まで上昇したとしても、前記Ｔ．ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａのＢＢＳ株由来のヒドロゲナーゼを使用することによって、酵素活性が失活することなく安定性の高い定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を図面に基づいて説明するが、本発明は、これらによって限定されるものではない。
〔実施例１〕
本発明の定電位電解式水素センサは、図１に示すような水素発生測定用装置を水素を検知すべく改変して用いることで実施可能である。つまり、電解液１０１を収容する電解槽１０２を形成する容器を設け、その電解槽１０２に収容した電解液１０１と接触自在になるように、被検知ガスを化学反応させる作用電極１０３、作用電極に対する対極１０４、前記作用電極の電位を制御する参照電極１０５を設けて構成してある。また、前記作用電極１０３は、ガス導入部１１１より導入された被検知ガスを前記作用電極１０３上で反応させる反応部に形成してある。前記作用電極１０３は、材料として酸化インジウム（ＩＴＯ）、黒鉛、金、グラスカーボン等を用いることができる。また、前記対極１０４は白金ワイヤーや金ワイヤーを用いることができ、前記参照電極１０５は銀、塩化銀電極で形成してある。前記電解液１０１として、酸性水溶液等を用いることが出来る。また、前記電解液１０１の温度を一定に保つために循環ポンプにより、水を循環させてもよい。
【００３８】
前記作用電極１０３上で生じた電子に基づく電流を検知自在な電流測定部２０１と前記作用電極１０３の電位制御自在な電位制御部２０２とを備えたガス検知回路に接続してガス検知装置として用いられる。
【００３９】
前記作用電極１０３表面上に、水素酸化に特異的な酵素活性を有するヒドロゲナーゼを含有した水素酸化活性層を設けることにより前記作用電極１０３は水素に高い選択性を有することになるのである。この時、前記作用電極１０３とヒドロゲナーゼとの直接的な電子の授受は困難であると考えられているため、前記作用電極１０３とヒドロゲナーゼとの間の電子の授受を仲介するメディエータを前記電解液１０１中に含有させることにより、図３に示したように前記作用電極１０３付近で酸化分解された前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極１０３に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。この時、前記電解液１０１中に含有させる前記メディエータとしては、ビオロゲン化合物であるメチルビオロゲン（ＭＶ）を使用するのが好ましい。
【００４０】
前記ヒドロゲナーゼは、紅色硫黄細菌であるＴ．ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａのＢＢＳ株（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）６０、３７９−３８４（１９９５）参照）をＰｆｅｎｎｉｎｇの方法を改良して嫌気条件下で培養し、Ｚｏｒｉｎらの方法に従って精製したものを用いた（図８参照）。
【００４１】
また、前記作用電極１０３表面の前記水素酸化活性層が、ヒドロゲナーゼの単分子膜あるいはＬＢ膜として配向配列することによって、高効率の電子伝達を可能にすることが出来る。高効率の電子伝達を可能にするための薄膜作成技術として、ＬＢ（Ｌａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）法がある。
ＬＢ法に用いられる分子は、分子内に疎水性、親水性が分極して存在することが必要である。タンパク質分子表面には疎水、親水部位がモザイク状に存在し、脂質分子の様な分極が少ない。また、分子全体として親水性のものが多く、気液界面で展開できず、水に溶解してしまうものが多い。ヒドロゲナーゼの多くは親水性であり、前記Ｔ．ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａのＢＢＳ株より精製したヒドロゲナーゼにおいても同様である。それ故、水溶性タンパク質のＬＢ膜を作製する上で重要なことは、分子を変性させず、水溶性タンパク質に疎水性を付与することである。この目的のために、ＰＬＬを改質材として用いることにより、ヒドロゲナーゼのＬＢ膜を作製することができる。
ここで、ＬＢ膜作製におけるＰＬＬの役割は、ＰＬＬとヒドロゲナーゼが静電的相互作用により複合体を形成し、ヒドロゲナーゼの表面電荷が打ち消され、タンパク質の親水性が減少する。さらに、ＰＬＬがヒドロゲナーゼ間を架橋し、界面に展開されたタンパク質が下層水に溶け込みにくくなり、気液界面において単分子膜やＬＢ膜が形成されるのである。
【００４２】
前記下層水には１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に、１．１ｍｇ／ｍｌのヒドロゲナーゼ溶液２０μｌを滴下し、周知のグラスロッド法により展開することにより、気液界面上に分子膜を形成させた。ＰＬＬは前記下層水中にリジンモノマー濃度で０．５ｍＭを添加する。また、前記ＰＬＬが２０残基のペプチドの場合は、２５μＭを添加する。
気液界面上に展開した前記分子膜を、前記作用電極１０３であるＩＴＯ基板 （４ｘ３０ｘ１ｍｍ）上に３０ｍＮ／ｍの条件で積層化し、この層を水素酸化活性層とすることで前記作用電極１０３表面上にヒドロゲナーゼの単分子膜あるいはＬＢ膜を作成した。
【００４３】
つまり、ＰＬＬを用いることによりヒドロゲナーゼの活性を変化させること無く疎水性を付与することが出来る。つまり、ヒドロゲナーゼを単分子膜やＬＢ膜として水素酸化活性層に配列させることができるのであるから、高効率の電子伝達が実現するのである。
【００４４】
このようにして作製したＬＢ膜中のヒドロゲナーゼの熱安定性を、加熱後の水素発生による活性で評価した。水素発生は前述の周知の水素発生測定用装置を用いて周知の方法により行った。前記ＬＢ膜の加熱（３０−１００℃）は、電熱線のオーブンを用いて１０分間行った。測定に用いた前記ＬＢ膜は、石英基板上に一層に累積した膜 （０．３９ｍｇ／ｃｍ2）を用いた。比較対照として溶液状態のヒドロゲナーゼを用いた。前記ＬＢ膜中と等量のヒドロゲナーゼを含む緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を湯浴中で加熱（３０−１００℃）した後、活性測定を行った。
前記ＬＢ膜中のヒドロゲナーゼの熱安定性について評価を行った結果を図９に示す。前記ＬＢ膜中のヒドロゲナーゼの水素発生の活性は、３０−７０℃において保持されていた。完全な失活は前記緩衝液中のヒドロゲナーゼおよび前記ＬＢ膜中のヒドロゲナーゼともに１００℃であった。
尚、前記Ｔ．ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａのＢＢＳ株より精製されたヒドロゲナーゼの活性最適温度は７０℃であるため、前記ヒドロゲナーゼは、定電位電解式水素センサでの使用において十分な安定性を有することが判明した。
【００４５】
また、高効率の電子伝達を可能にするための薄膜として、キャスト法により作製されたキャスト膜がある。このキャスト膜は、ヒドロゲナーゼ（１３ｍｇ／ｍＬ）２μＬ、ポリビオロゲン（１０ｍｇ／ｍＬ）２μＬ、Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ（ＰＥＧＤＧＥ）（１０ｍｇ／ｍＬ）２μＬから成る６μＬの蛋白質溶液を、約７ｍｍ2の面積を有す るカーボン電極の表面に塗布することにより形成したキャスト面を４℃にて２４時間放置した後、前記キャスト面を透析膜にて被覆し、Ｏ−リングで固定することにより作製されるものである。
【００４６】
前記水素発生用測定装置に、逆に水素を通気し、各電極からの出力がどのように得られるかを求めたところ、図１０のようになった。通気は１００％水素及び１００％アルゴン（Ａｒ）によりコントロールした。
図１０によると、前記水素発生用測定装置に水素を通気すると次第に電極から電流出力が得られていることが判る。また、この電流値は、水素の通気に伴い上昇していることから、電解液中の水素濃度に比例することが読み取れる。また、アルゴンの通気により電解液中の水素濃度が低下すると電流出力が低下すると共に、再度水素を通気すると再現性よく電流出力が上昇することが判る。これにより、水素を含有する検知対象ガスを通気した時の定常的な電流出力強度あるいは、電流出力強度の上昇速度（電解液中での水素濃度の上昇速度）を知ることにより、前記検知対象ガス中の水素濃度を知ることが出来ることが判る。
【００４７】
〔実施例２〕
また、実施例１で用いた水素発生測定用装置の構成を採用し、前記電解液１０１としてヒドロゲナーゼを添加した溶液を用い、さらに、前記作用電極１０３として、ヒドロゲナーゼとの間の電子の授受を仲介するメディエータに被覆された電極を用いることも可能である。これにより、図４に示したように前記作用電極１０３付近で酸化分解された前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極１０３に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。
【００４８】
前記電解液１０１として、２０ｍＭリン酸カリウム（Ｋ3ＰＯ4）と２０ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）（ｐＨ７．０）に７μｇ／ｍＬの終濃度でヒドロゲナーゼを添加した。また、循環ポンプにより、水を循環させて前記電解液１０１を３０℃に維持して使用した。
【００４９】
前記作用電極１０３として、金電極を用い、前記メディエータとして前記ビオロゲン化合物に含まれるメチルビオロゲン化合物にチオール基を付し、これを自己集合単分子膜（ＳＡＭ膜）として図６に示したように前記作用電極上に固定した。この時、自己集合単分子膜上のビオロゲンの活性部位は、前記電解液中で揺らぐことが出来るため、前記電解液中に含まれるヒドロゲナーゼの活性部位と容易に結合し、酸化反応の結果生じた電子の伝達を容易に行うことが出来るようになる。尚、前記メチルビオロゲン化合物として、Ｎ−ｍｅｔｈｙ−Ｎ’−（ｍｅｒｃａｐｔｏｏｃｔｙｌ）−４，４’ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍを用いると、チオール基が容易に金電極と反応し、固定化される。
【００５０】
前記ビオロゲン化合物以外に、硫酸還元菌中においてヒドロゲナーゼから電子を受け取り細胞内に運び込み、ヒドロゲナーゼの電子伝達体としての機能を有し、乾燥状態でも電子伝達活性が保持されているシトクロムｃ3を使用しても同様の効果が得られることが判る。
【００５１】
〔実施例３〕
また、実施例１で用いた水素発生測定用装置の構成を採用し、前記作用電極１０３の水素酸化活性層として、ヒドロゲナーゼとメディエータとの混合膜とすることも可能である。この時、図５に示したように、前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極１０３に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。
【００５２】
前記作用電極１０３の材料として酸化スズを用い、前記メディエータとしては、ビオロゲン化合物に含まれるビオロゲンポリマーであるポリブチルビオロゲン（ＰＢＶ）、ポリオクチルビオロゲン（ＰＯＶ）等を使用するのが好ましい。ここで、前記ビオロゲンポリマーは化２の一般式で表わすことができる。
【００５３】
【化２】
この一般式において、ｎ＝４がＰＢＶ、ｎ＝８がＰＯＶである。
【００５５】
前記ビオロゲンポリマーは水溶性であり、混合膜である混合ＬＢ膜作製時に下層水である１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）に溶解させた。ＫＳＶミニトラフにて前記混合ＬＢ膜を作製した。０．２９ｍｇ／ｍｌのヒドロゲナーゼ１００μＬを水面上に展開し、圧縮を行うことで、気液界面上にヒドロゲナーゼ分子膜の作製を行った。前記ヒドロゲナーゼ分子膜は３０ｍＮ／ｍの表面圧に維持し、前記酸化スズ電極基板を１回垂直方向に浸漬する方法で累積し、ビオロゲンポリマーとヒドロゲナーゼとの混合ＬＢ膜を作製した。
【００５６】
前記ビオロゲンポリマーは前記ヒドロゲナーゼと複合体を形成し安定な分子膜を形成しているものと考えられる。そのため、前記ビオロゲンポリマーは電子伝達のメディエータとして機能するだけでなく、安定した水素酸化活性層を有する作用電極を提供することが出来る。
【００５７】
さらに、ヒドロゲナーゼ膜安定化材として前記混合膜の構成に、前記ＰＥＧＤＧＥを加えてもよい。前記ＰＥＧＤＧＥは、化３に示した構造式で表わすことができる。
【００５８】
【化３】
前記ＰＥＧＤＧＥを前記水素酸化活性層に添加した場合、前記水素酸化活性層は安定性を増すことが期待される。
例えば、グラスカーボン電極の表面上に設けられたヒドロゲナーゼとＰＢＶを含有する水素酸化活性層に前記ＰＥＧＤＧＥを添加することにより形成したキャスト膜の安定性を増大させることができる。
【００６０】
また、前記水素発生用測定装置において、通気する水素濃度を種々変化させた場合の出力を測定した所、図１１（ａ）に示す結果が得られた。この時、（１）ヒドロゲナーゼとＰＢＶの混合膜に安定化材としてＰＥＧＤＧＥを添加した水素酸化活性層を設けた電極、（２）グラスカーボンのみの電極、（３）ヒドロゲナーゼの単分子膜にＰＥＧＤＧＥを添加した水素酸化活性層を設けた電極とを用いた。つまり、（１）の電極を用いて経時的に水素濃度を変化させた場合においては、通気した被検知ガスが１００％水素である場合の出力は約１．０μＡ、５０％水素である場合の出力は約０．６μＡ、３０％水素である場合の出力は約０．３μＡ、１０％水素である場合の出力は約０．０５μＡであった。また、（２）の電極を用いて経時的に水素濃度を変化させた場合においては、いずれの水素濃度においても出力は得られなかった。さらに、（３）の電極を用いて経時的に水素濃度を変化させた場合においては、水素濃度５０〜１００％付近で出力は得られたものの、水素濃度５０％以下では出力は得られなかった。尚、（３）の電極を持ちいて得られた出力は微弱であったので、出力値を５倍して表示してある。
【００６１】
これらの結果より、ヒドロゲナーゼとメディエータであるＰＢＶとが存在することにより、良好に出力が得られることが判った。さらに、この出力は、水素濃度に対応したものであることが判った。
【００６２】
また、（１）の電極を用いて得られた水素濃度と得られた出力値との関係を明確にするためにグラフにプロットした所、図１１（ｂ）に示したように、ほぼ直線状のグラフが得られた。つまり、通気する水素濃度を種々変化させた場合に得られる出力は、水素濃度に正比例することが判明した。これにより、得られた電流出力より、容易に水素濃度を求められることが可能となるのである。
【００６３】
〔実施例４〕
前述の実施例１〜３において、前記水素酸化活性層が、前記ヒドロゲナーゼや前記メディエータを担持した活性炭粉末を塗着して形成された構成とすることも可能である。
つまり、実施例１の構成においては、前記ヒドロゲナーゼを前記活性炭粉末に担持させて前記作用電極１０３に塗着させる。実施例２の構成においては、前記メディエータを前記活性炭粉末に担持させて前記作用電極１０３に塗着させる。実施例３の構成においては、前記ヒドロゲナーゼと前記メディエータを前記活性炭粉末に担持させて前記作用電極１０３に塗着させるのである。このように構成することにより、前述のように単分子膜やＬＢ膜を作製して前記作用電極上に固定する必要が無いため、簡便に水素に高い選択性を有する作用電極を作製することができ、その結果、簡便に水素に高い選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
【００６４】
〔別実施例〕
本発明の定電位電解式水素センサは、図２に示したような周知の定電位電解式ガスセンサにおいても実施可能である。
つまり、電解液１０１を収容する電解槽１０２を形成するケーシングを設け、前記電解槽１０２に収容した前記電解液１０１と接触自在になるように被検知ガスを化学反応させる作用電極１０３、前記作用電極に対する対極１０４、前記作用電極の電位を制御する参照電極１０５を設けて構成してある。前記作用電極１０３、前記対極１０４及び前記参照電極１０５は、ガス透過性の多孔質テフロン膜１０７の表面に、白金や金、パラジウム等の貴金属触媒を塗布焼結して形成したものである。ガス導入部より導入された被検知ガスは、前記多孔質テフロン膜１０７を通過した後、触媒（固相）、電解液（液相）、ガス（気相）の三相界面において電気化学反応を行うのである。
【００６５】
ここで、前記作用電極１０３の表面上に水素酸化に特異的な酵素活性を有するヒドロゲナーゼを含有した水素酸化活性層を設けることにより前記作用電極１０３は水素に高い選択性を有することになるのである。この時、電子の授受を仲介するメディエータを前記電解液１０１中に含有させることにより、前記作用電極１０３付近で酸化分解された前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極１０３に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。この時、前記電解液１０１中に含有させる前記メディエータとしては、ビオロゲン化合物であるメチルビオロゲン（ＭＶ）を使用するのが好ましい。
【００６６】
また、この定電位電解式ガスセンサの構成において、前記作用電極１０３をヒドロゲナーゼとの間の電子の授受を仲介するメディエータを含んだ水素酸化活性層を設けた電極とし、前記電解液１０１としてヒドロゲナーゼを添加した溶液を用いることも可能である。さらに、この定電位電解式ガスセンサの構成において、前記作用電極１０３の水素酸化活性層をヒドロゲナーゼとメディエータとの混合膜とすることも可能である。
【００６７】
前記メディエータは、前記メチルビオロゲン（ＭＶ）の他に、ビオロゲン化合物に含まれるビオロゲンポリマーであるポリブチルビオロゲン（ＰＢＶ）、ポリオクチルビオロゲン（ＰＯＶ）等が使用可能であり、前記ビオロゲン化合物に含まれるメチルビオロゲン化合物にチオール基を付し、これを自己集合単分子膜 （ＳＡＭ膜）として前記作用電極１０３表面上に固定することも可能である。さらに、前記作用電極１０３の水素酸化活性層を前記混合膜とした場合、膜の安定化材としてＰｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ（ＰＥＧＤＧＥ）を加えてもよい。
【００６８】
また、前記メディエータは、前記ビオロゲン化合物以外にも、硫酸還元菌中においてヒドロゲナーゼから電子を受け取り細胞内に運び込み、ヒドロゲナーゼの電子伝達体としての機能を有し、乾燥状態でも電子伝達活性が保持されているシトクロムｃ3を使用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の定電位電解式水素センサの実施例の概略図
【図２】本発明の定電位電解式水素センサの別実施例の概略図
【図３】作用電極にヒドロゲナーゼを含有した水素酸化活性層を設け、電解液にメディエータを添加した溶液を用いた定電位電解式水素センサにおける、ヒドロゲナーゼとメディエータと作用電極との間の電子伝達の概略図
【図４】作用電極にメディエータを含有した水素酸化活性層を設け、電解液にヒドロゲナーゼを添加した溶液を用いた定電位電解式水素センサにおける、ヒドロゲナーゼとメディエータと作用電極との間の電子伝達の概略図
【図５】作用電極にヒドロゲナーゼとメディエータを含有した水素酸化活性層を設けた定電位電解式水素センサにおける、ヒドロゲナーゼとメディエータと作用電極との間の電子伝達の概略図
【図６】作用電極に自己集合単分子膜（ＳＡＭ膜）を固定した図
【図７】メチルビオロゲン（ＭＶ）をメディエータとして用いた場合の作用電極表面における電子伝達の概略図
【図８】ヒドロゲナーゼの精製法の概略図
【図９】ＬＢ膜中のヒドロゲナーゼの熱安定性について評価を行ったグラフ
【図１０】水素通気による電流応答のグラフ
【図１１】通気する水素濃度を種々変化させた場合の電流応答のグラフ
（ａ）経時的に水素濃度を変化させた場合の出力
（ｂ）水素濃度と得られた出力値との関係
【符号の説明】
１０１ 電解液
１０２ 電解槽
１０３ 作用電極
１０４ 対極
１０５ 参照電極
１０７ 多孔質テフロン膜
１１１ ガス導入部[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention provides a working electrode for chemically reacting a gas to be detected as a gas electrode for detecting a gas, a counter electrode for the working electrode, and a reference electrode for controlling the potential of the working electrode. The present invention relates to a constant potential electrolytic hydrogen sensor provided with a gas introducing portion for leading a gas to be detected to the working electrode and electrically connecting an output circuit for obtaining a gas detection output to each electrode.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, as a hydrogen gas sensor for hydrogen detection, a gas thermal conductivity type that utilizes the difference in gas thermal conductivity between hydrogen and other gases, a catalytic combustion type that utilizes an increase in element temperature due to catalytic combustion of hydrogen, and hydrogen A semiconductor type that uses an increase in free electrons (decrease in resistance value) of a semiconductor element accompanying consumption of oxygen adsorbed on the surface of semiconductor particles is used. Further, an electrochemical formula (constant potential electrolytic formula) for measuring a current value associated with the electrochemical oxidation of hydrogen is used, and a wet type using an electrolytic solution and a dry type using a solid electrolyte are known. Each of these hydrogen gas sensors has a concentration range and installation conditions that are good at each, and is used properly according to the application. These hydrogen gas sensors are widely used as means for detecting hydrogen gas leakage because they can recognize hydrogen with high sensitivity by greatly improving the sensitivity ratio of hydrogen to other combustible gases through various devices. ing.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The above-mentioned conventional hydrogen gas sensor is designed to detect hydrogen with high sensitivity by greatly improving the sensitivity ratio of hydrogen to other combustible gases, and in principle has sensitivity only to hydrogen. is not. For this reason, there is a limit to increasing the sensitivity to hydrogen, and furthermore, the possibility of detecting flammable gases other than hydrogen cannot be denied, so the alarm from the hydrogen gas sensor may contain false alarms. It was necessary to use it after always considering the problem.
[0004]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a constant potential electrolytic hydrogen sensor having high hydrogen selectivity.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In recent years, research on hydrogenases known as proteins that specifically catalyze the oxidation-reduction reaction between hydrogen and protons has progressed, and hydrogenases having sufficient stability against heat and oxygen have been discovered. Furthermore, techniques for culturing hydrogenase-producing bacteria and techniques for separating and purifying hydrogenases have been established. In addition, techniques for immobilizing hydrogenases on electrodes have been studied. As described above, attempts have been made to detect hydrogen or to generate hydrogen electrochemically or photochemically by using hydrogenase as a catalyst by immobilizing hydrogenase on an electrode. In hydrogenase, the active site that acts on the redox of hydrogen is considered to be localized, and it is considered difficult to exchange electrons directly between the electrode and hydrogenase. A mediator that mediates the transfer of electrons between the enzyme and the hydrogenase is essential. In other words, a polymer with chemically bonded mediator as an electron carrier is immobilized on the surface of the electrode, and a zinc complex that detects hydrogenase hydrogen peroxide oxidation in a buffer solution and releases electrons by photoexcitation is used. Thus, hydrogen is generated photochemically.
[0006]
In this reaction, as shown in the positive reaction of Chemical Formula 1, hydrogen is generated by reducing protons in the buffer solution using hydrogenase as a catalyst.
[0007]
[Chemical 1]
Since the hydrogenase is a protein that specifically catalyzes the oxidation-reduction reaction of hydrogen and proton, the reverse reaction of the normal reaction shown in Chemical Formula 1 can be caused on the electrode in the buffer solution. I thought it was possible. Furthermore, in order to achieve the above object, protons and electrons are generated by oxidation of hydrogen using hydrogenase immobilized on an electrode as a catalyst, and the generated electrons are detected by an output circuit, thereby being highly selective for hydrogen. The present invention was conceived because it could be used as a hydrogen gas sensor having
[0009]
Here, as described above, the reaction of fixing hydrogenase to the electrode and generating hydrogen by transferring electrons between the hydrogenase and the electrode using a mediator is a well-known technique, but hydrogen is selected with high sensitivity. To date, no technology has been proposed that uses hydrogenase as an electrochemical sensor that functions as a hydrogen gas sensor. That is, the present invention has been experimentally confirmed after many experiments based on the above-mentioned knowledge of the present inventors, and has been completed.
[0010]
[Configuration 1]
The characteristic configuration of the present invention to achieve this object is as described in
A working electrode that chemically reacts with a gas to be detected as a gas electrode that detects gas, a counter electrode with respect to the working electrode, and a reference electrode that controls the potential of the working electrode, facing an electrolytic solution containing portion of an electrolytic cell containing the electrolytic solution A constant potential electrolytic hydrogen sensor in which a gas introduction part for introducing a gas to be detected is provided to the working electrode, and an output circuit for obtaining a gas detection output is electrically connected to each electrode;
Provided as the working electrode is a hydrogen oxidation active layer containing a first hydrogen oxidation active substance having an activity specific to hydrogen oxidation, the first hydrogen oxidation active substance contains hydrogenase as an active ingredient,
The electrolytic solution contains a second hydrogen oxidation active substance having a function as a mediator for electron transfer.
[0011]
Further, the characteristic configuration of the present invention for achieving this object is as described in
The hydrogen oxidation active layer is a hydrogenase monomolecular film, LB film, or cast film using poly-L-lysine (PLL) as a modifying material.
[0012]
[Operation effect 1]
In other words, the working electrode that chemically reacts the gas to be detected as the gas electrode that detects the gas, the counter electrode to the working electrode, and the reference electrode that controls the potential of the working electrode are provided in the electrolytic solution storage portion of the electrolytic cell that stores the electrolytic solution. Since the gas introduction part for introducing the detected gas to the working electrode is provided, the detected gas can be guided to the working electrode from the gas introducing part, and the guided detected gas is supplied to the working electrode. An oxidation current flows due to an oxidation reaction on the electrode. Further, an oxygen reduction reaction occurs on the counter electrode, and a reduction current equivalent to the oxidation current generated on the working electrode flows. The amount of current flowing along with this reaction is proportional to the concentration of the gas to be detected that has reacted on the working electrode, and this amount of current is measured by an output circuit that obtains a gas detection output that is electrically connected to each electrode. Thus, the concentration of the gas to be detected can be measured.
Further, since the use of the fact that the oxidation-reduction potential varies depending on the gas type, the gas can be selectively detected depending on the set potential of the circuit. Further, by changing the catalyst used for the gas electrode, it is possible to have high selectivity with respect to the target gas.
[0013]
Further, the working electrode is provided with a hydrogen oxidation active layer containing a first hydrogen oxidation active substance having an activity specific to hydrogen oxidation, and the first hydrogen oxidation active substance contains hydrogenase as an active ingredient, thereby The catalyst used for the working electrode can be a hydrogen specific catalyst. In other words, since the hydrogenase is a protein that specifically oxidizes and reduces hydrogen, the working electrode has high selectivity for hydrogen when the hydrogenase is contained in the hydrogen oxidation active layer.
[0014]
Here, the hydrogenase is a hydrophilic protein, and it is considered that the active site that acts on the redox of hydrogen is localized, and it is difficult to directly transfer electrons between the electrode and the hydrogenase. As such, mediators that mediate the transfer of electrons between the electrode and the hydrogenase are essential. For this reason, as shown in FIG. 3, by containing the second hydrogen oxidation active substance having a function as an electron transfer mediator in the electrolyte, the oxidation reaction of hydrogen oxidatively decomposed in the vicinity of the working electrode. The mediator mediates the electrons generated as a result of the above, and the electrons are smoothly transmitted to the working electrode.
[0015]
As described above, since the electrons can be smoothly transferred to the working electrode having high selectivity for hydrogen via the mediator, a constant potential electrolytic hydrogen sensor having high selectivity for hydrogen is provided. Is possible.
In addition, if hydrogen gas sensors that do not show sensitivity to hydrogen, such as methanol, methane, or carbon monoxide, but have high sensitivity to hydrogen can be provided, they will be very useful for future hydrogen energy system maintenance and safety measures. It is expected.
[0016]
Here, as a thin film for enabling high-efficiency electron transfer, there are a monomolecular film, an LB film created by the LB (Langmuir Broadget) method, and a cast film created by the casting method. It is known that the molecules used for the production of these films are preferably present in the molecule with their hydrophobicity and hydrophilicity polarized. In addition, since most of the hydrogenases are hydrophilic, for example, by using a modifier such as PLL described in Example 1 described later, hydrophobicity can be imparted without changing the activity of the hydrogenase. In other words, if a hydrogenase monomolecular film or LB film using PLL as a modifier is used as the hydrogen oxidation active layer, the hydrophilic group and the hydrophobic group can be aligned and highly efficient electron transfer can be realized. is there.
[0017]
[Configuration 2]
The characteristic configuration of the present invention to achieve this object is as described in
A working electrode that chemically reacts with a gas to be detected as a gas electrode that detects gas, a counter electrode with respect to the working electrode, and a reference electrode that controls the potential of the working electrode, facing an electrolytic solution containing portion of an electrolytic cell containing the electrolytic solution A constant potential electrolytic hydrogen sensor in which a gas introduction part for introducing a gas to be detected is provided to the working electrode, and an output circuit for obtaining a gas detection output is electrically connected to each electrode;
As the electrolytic solution, a solution to which hydrogenase is added as a first hydrogen oxidation active substance having activity specific to hydrogen oxidation is used.
An electrode provided with a hydrogen oxidation active layer containing a second hydrogen oxidation active substance having a function as a mediator for electron transfer is used as the working electrode.
[0018]
[Operation effect 2]
In other words, the working electrode that chemically reacts the gas to be detected as the gas electrode that detects the gas, the counter electrode to the working electrode, and the reference electrode that controls the potential of the working electrode are provided in the electrolytic solution storage portion of the electrolytic cell that stores the electrolytic solution. 2. The constant potential electrolytic hydrogen sensor according to
[0019]
Further, by using a solution to which hydrogenase is added as a first hydrogen oxidation active substance having an activity specific to hydrogen oxidation as the electrolyte, hydrogen is specifically oxidized by the hydrogenase contained in the electrolyte. Can be disassembled. Furthermore, by using an electrode provided with a hydrogen oxidation active layer containing a second hydrogen oxidation active substance having a function as an electron transfer mediator as the working electrode, as shown in FIG. The mediator mediates the electrons generated as a result of the oxidation reaction of the hydrogen that has been oxidatively decomposed in the step, and the electrons are smoothly transferred to the working electrode.
Further, since hydrogenase is used as a catalyst for the oxidation reaction, a constant potential electrolytic hydrogen sensor having high selectivity for hydrogen can be provided.
[0020]
[Configuration 3]
The characteristic configuration of the present invention for achieving this object is as described in claim 4.
A working electrode that chemically reacts with a gas to be detected as a gas electrode that detects gas, a counter electrode with respect to the working electrode, and a reference electrode that controls the potential of the working electrode, facing an electrolytic solution containing portion of an electrolytic cell containing the electrolytic solution A constant potential electrolytic hydrogen sensor in which a gas introduction part for introducing a gas to be detected is provided to the working electrode, and an output circuit for obtaining a gas detection output is electrically connected to each electrode;
As the working electrode, a hydrogen oxidation active layer including hydrogenase, which is a first hydrogen oxidation active substance having an activity specific to hydrogen oxidation, and a second hydrogen oxidation active substance having a function as a mediator of electron transfer is provided. That is.
[0021]
[Operation effect 3]
In other words, the working electrode that chemically reacts the gas to be detected as the gas electrode that detects the gas, the counter electrode to the working electrode, and the reference electrode that controls the potential of the working electrode are provided in the electrolytic solution storage portion of the electrolytic cell that stores the electrolytic solution. 2. The constant potential electrolytic hydrogen sensor according to
[0022]
In addition, a hydrogen oxidation active layer containing hydrogenase, which is a first hydrogen oxidation active substance having an activity specific to hydrogen oxidation, and a second hydrogen oxidation active substance having a function as an electron transfer mediator as the working electrode Thus, hydrogen can be specifically oxidatively decomposed by the hydrogenase, and as shown in FIG. 5, the mediator mediates the electrons generated as a result of the oxidation reaction of the hydrogen, and the action The electrons are smoothly transmitted to the electrodes.
[0023]
Further, since hydrogenase is used as a catalyst for the oxidation reaction, a constant potential electrolytic hydrogen sensor having high selectivity for hydrogen can be provided.
[0024]
[Configuration 4]
Moreover, the characteristic configuration of the present invention to achieve this object is as follows.
The second hydrogen oxidation active substance is a viologen compound or cytochrome c. Three Is included.
[0025]
Further, as described in claim 6, the viologen compound is preferably methyl viologen (MV), polybutyl viologen (PBV), or polyoctyl viologen (POV).
[0026]
Further, the characteristic configuration of the present invention for achieving this object is as described in claim 7, in the invention of any one of
The hydrogen oxidation active layer containing hydrogenase contains PEGDGE.
[0027]
[Operation effect 4]
That is, a viologen compound or cytochrome c as a mediator contained in the second hydrogen oxidation active substance. Three Is preferably used.
[0028]
Examples of the viologen compound include viologen polymers such as MV, PBV, and POV. FIG. 7 shows the state of electron transfer on the surface of the working electrode when the MV is used as a mediator. That is, hydrogen is oxidized by hydrogenase, and electrons generated at this time are transferred to MV, and the MV becomes reduced MV. The reduced MV is rapidly oxidized, but at this time, electrons are transferred to the working electrode.
In addition, the viologen compound is expected to be a versatile mediator because it is easy to synthesize and can be easily fixed on the electrode surface.
[0029]
Further, when the viologen compound is used, the viologen compound is considered to form a complex with the hydrogenase to form a stable molecular film, so that the viologen compound only functions as a mediator of electron transfer. Thus, a working electrode having a stable hydrogen oxidation active layer can be provided.
[0030]
Cytochrome c Three Has a function as an electron carrier of hydrogenase that receives electrons from hydrogenase and carries them into cells in sulfate-reducing bacteria, and retains electron transfer activity even in a dry state. In particular, since the solid film has high electrical conductivity, when the hydrogen oxidation active layer of the working electrode is contained as the second hydrogen oxidation active material, the transfer of electrons generated as a result of the oxidation reaction is prevented. It can be easily done. On the other hand, since the electron transfer activity is maintained even when it is contained as the second hydrogen oxidation active substance in the electrolytic solution, the electron generated as a result of the oxidation reaction can be easily transmitted.
[0031]
Moreover, you may add Poly (Ethyleneglycol) glycidyl ether (PEGDGE) as a hydrogenase film | membrane stabilizer to the said hydrogen-oxidation active layer containing hydrogenase. When the PEGDGE is added to the hydrogen oxidation active layer, the hydrogen oxidation active layer is expected to increase stability.
[0032]
[Configuration 5]
Moreover, the characteristic configuration of the present invention to achieve this object is as follows.
The hydrogen oxidation active layer is formed by applying activated carbon powder carrying the first hydrogen oxidation active substance and the second hydrogen oxidation active substance.
[0033]
[Operation effect 5]
That is, if the hydrogen oxidation active layer is formed by applying activated carbon powder carrying the hydrogenase as the first hydrogen oxidation active substance or the mediator as the second hydrogen oxidation active substance, the monomolecular film as described above. In addition, since it is not necessary to prepare an LB film and fix it on the working electrode, it is possible to easily produce a working electrode having high selectivity for hydrogen. A potential electrolysis hydrogen sensor can be provided. Therefore, it is possible to provide a constant potential electrolytic hydrogen sensor that is inexpensive to manufacture.
[0034]
Further, carbon such as the activated carbon powder is also used as a working electrode material, and has high conductivity, so that electrons are easily transmitted to the working electrode.
[0035]
[Configuration 6]
Moreover, the characteristic configuration of the present invention for achieving this object is as described in claim 9, in the inventions of
The hydrogenase is derived from a Thiocapsalosepersicinina BBS strain.
[0036]
[Operation effect 6]
That is, hydrogenase purified from the BBS strain of Thiocapsa roseopericina (hereinafter referred to as T. rosepersicinina) has sufficient stability against heat and oxygen, and exhibits optimal enzyme activity at around 70 ° C. Furthermore, the enzyme activity is well maintained at 30-70 ° C. in the LB film (see FIG. 9). For this reason, even if the temperature of the electrolytic solution or the LB film in the constant potential electrolytic hydrogen sensor is increased to around 70 ° C. for hydrogen detection, By using a hydrogenase derived from rosepersicina's BBS strain, it is possible to provide a highly stable constant potential electrolytic hydrogen sensor without deactivating the enzyme activity.
[0037]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings, but the present invention is not limited thereto.
[Example 1]
The constant potential electrolytic hydrogen sensor of the present invention can be implemented by using a hydrogen generation measuring apparatus as shown in FIG. 1 modified to detect hydrogen. In other words, a container for forming the
[0038]
Connected to a gas detection circuit including a
[0039]
By providing a hydrogen oxidation active layer containing a hydrogenase having an enzyme activity specific to hydrogen oxidation on the surface of the working
[0040]
The hydrogenase is a red sulfur bacterium, T. pylori. Rosepersicina strain BBS (see Biochemistry (Moscow) 60, 379-384 (1995)) was cultured under anaerobic conditions by improving the method of Pfening and purified according to the method of Zorin et al. (see FIG. 8). .
[0041]
Further, the hydrogen oxidation active layer on the surface of the working
The molecule used in the LB method needs to be present in the molecule with its hydrophobicity and hydrophilicity polarized. Hydrophobic and hydrophilic sites are present in a mosaic pattern on the surface of protein molecules, and there is little polarization like lipid molecules. In addition, many molecules as a whole are hydrophilic, and cannot be developed at the gas-liquid interface, and often dissolve in water. Many of the hydrogenases are hydrophilic. The same applies to hydrogenase purified from the BBS strain of rosepersicina. Therefore, what is important in producing an LB film of a water-soluble protein is to impart hydrophobicity to the water-soluble protein without denaturing the molecule. For this purpose, an LB film of hydrogenase can be produced by using PLL as a modifying material.
Here, the role of PLL in LB film production is that PLL and hydrogenase form a complex by electrostatic interaction, the surface charge of hydrogenase is canceled, and the hydrophilicity of the protein decreases. Furthermore, the PLL crosslinks between the hydrogenases, and the protein developed at the interface becomes difficult to dissolve in the lower layer water, and a monomolecular film or an LB film is formed at the gas-liquid interface.
[0042]
A 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) was used as the lower layer water. A molecular film was formed on the gas-liquid interface by dropping 20 μl of a 1.1 mg / ml hydrogenase solution into the Tris-HCl buffer and developing the solution by the well-known glass rod method. PLL adds 0.5 mM at a lysine monomer concentration in the lower layer water. When the PLL is a 20-residue peptide, 25 μM is added.
The molecular film developed on the gas-liquid interface is laminated on the ITO substrate (4 × 30 × 1 mm) which is the working
[0043]
That is, by using PLL, hydrophobicity can be imparted without changing the activity of hydrogenase. That is, hydrogenase can be arranged in the hydrogen oxidation active layer as a monomolecular film or LB film, so that highly efficient electron transfer is realized.
[0044]
The thermal stability of the hydrogenase in the LB film thus produced was evaluated by the activity of hydrogen generation after heating. Hydrogen generation was performed by a well-known method using the above-described well-known hydrogen generation measuring apparatus. The LB film was heated (30-100 ° C.) for 10 minutes using a heating wire oven. The LB film used for the measurement was a film (0.39 mg / cm 3) accumulated on a quartz substrate. 2 ) Was used. As a comparative control, hydrogenase in a solution state was used. A buffer solution (50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) containing the same amount of hydrogenase as in the LB membrane was heated (30-100 ° C.) in a hot water bath, and then activity measurement was performed.
FIG. 9 shows the results of evaluating the thermal stability of the hydrogenase in the LB film. The hydrogenase activity of hydrogenase in the LB film was maintained at 30-70 ° C. Complete inactivation was 100 ° C. for both the hydrogenase in the buffer and the hydrogenase in the LB membrane.
The T.A. Since the optimal temperature of the activity of hydrogenase purified from the rosebsicina strain BBS is 70 ° C., it has been found that the hydrogenase has sufficient stability for use in a potentiostatic hydrogen sensor.
[0045]
Further, as a thin film for enabling highly efficient electron transfer, there is a cast film manufactured by a casting method. This cast membrane was obtained by adding a 6 μL protein solution consisting of 2 μL of hydrogenase (13 mg / mL), 2 μL of polyviologen (10 mg / mL), and 2 μL of poly (ethyleneglycol) diglycylyl ether (PEGDGE) (10 mg / mL) to about 7 mm. 2 The cast surface formed by coating on the surface of a carbon electrode having a surface area of 2 mm was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours, and then coated with a dialysis membrane and fixed with an O-ring. It is what is done.
[0046]
On the contrary, when hydrogen was passed through the measuring device for hydrogen generation and how the output from each electrode was obtained, it was as shown in FIG. Aeration was controlled by 100% hydrogen and 100% argon (Ar).
According to FIG. 10, it is understood that a current output is gradually obtained from the electrodes when hydrogen is passed through the hydrogen generation measuring apparatus. Further, it can be read that this current value is proportional to the hydrogen concentration in the electrolytic solution because the current value increases with the passage of hydrogen. It can also be seen that the current output decreases when the hydrogen concentration in the electrolyte decreases due to the ventilation of argon, and the current output increases with good reproducibility when the hydrogen is vented again. Thus, by knowing the steady current output intensity when the detection gas containing hydrogen is vented or the rate of increase in current output intensity (rate of increase in hydrogen concentration in the electrolyte), the detection target gas is detected. It can be seen that the hydrogen concentration inside can be known.
[0047]
[Example 2]
Further, the configuration of the apparatus for measuring hydrogen generation used in Example 1 is adopted, a solution to which hydrogenase is added is used as the
[0048]
As the
[0049]
As the working
[0050]
In addition to the viologen compound, cytochrome c which receives electrons from hydrogenase in sulfate-reducing bacteria and carries them into cells, functions as an electron carrier for hydrogenase, and retains electron transfer activity even in a dry state. Three It can be seen that the same effect can be obtained even if is used.
[0051]
Example 3
In addition, the configuration of the hydrogen generation measurement apparatus used in Example 1 can be adopted, and the hydrogen oxidation active layer of the working
[0052]
It is preferable to use tin oxide as the material of the working
[0053]
[Chemical 2]
In this general formula, n = 4 is PBV and n = 8 is POV.
[0055]
The viologen polymer is water-soluble, and was dissolved in 10 mM Tris buffer (pH 7.4), which is the lower layer water, when the mixed LB film, which is a mixed film, was prepared. The mixed LB film was prepared with a KSV mini-trough. By developing 100 μL of 0.29 mg / ml hydrogenase on the water surface and performing compression, a hydrogenase molecular film was produced on the gas-liquid interface. The hydrogenase molecular film was maintained at a surface pressure of 30 mN / m and accumulated by a method in which the tin oxide electrode substrate was immersed once in the vertical direction to produce a mixed LB film of a viologen polymer and a hydrogenase.
[0056]
The viologen polymer is considered to form a complex molecular structure with the hydrogenase to form a stable molecular film. Therefore, the viologen polymer not only functions as an electron transfer mediator, but can provide a working electrode having a stable hydrogen oxidation active layer.
[0057]
Furthermore, you may add the said PEGDGE to the structure of the said mixed film as a hydrogenase film stabilizer. The PEGDGE can be represented by the structural formula shown in
[0058]
[Chemical 3]
When the PEGDGE is added to the hydrogen oxidation active layer, the hydrogen oxidation active layer is expected to increase stability.
For example, the stability of the cast film formed by adding the PEGDGE to the hydrogen oxidation active layer containing hydrogenase and PBV provided on the surface of the glass carbon electrode can be increased.
[0060]
In addition, when the hydrogen generation measuring apparatus was used to measure the output when the aerated hydrogen concentration was variously changed, the result shown in FIG. 11A was obtained. At this time, (1) an electrode provided with a hydrogen oxidation active layer obtained by adding PEGDGE as a stabilizing material to a mixed film of hydrogenase and PBV, (2) an electrode made of glass carbon alone, and (3) PEGDGE on a monomolecular film of hydrogenase The electrode provided with the added hydrogen oxidation active layer was used. That is, when the hydrogen concentration is changed over time using the electrode of (1), the output when the gas to be detected is 100% hydrogen is about 1.0 μA and 50% hydrogen. The output when the output was about 0.6 μA and 30% hydrogen was about 0.3 μA, and the output when the output was 10% hydrogen was about 0.05 μA. Further, when the hydrogen concentration was changed over time using the electrode (2), no output was obtained at any hydrogen concentration. Furthermore, when the hydrogen concentration was changed over time using the electrode of (3), an output was obtained at a hydrogen concentration of 50 to 100%, but no output was obtained at a hydrogen concentration of 50% or less. . Since the output obtained with the electrode (3) was weak, the output value is displayed by multiplying it by 5.
[0061]
From these results, it was found that the output can be obtained satisfactorily by the presence of hydrogenase and mediator PBV. Furthermore, this output was found to correspond to the hydrogen concentration.
[0062]
Further, when plotted on a graph in order to clarify the relationship between the hydrogen concentration obtained using the electrode of (1) and the obtained output value, as shown in FIG. The graph of was obtained. In other words, it has been found that the output obtained when the hydrogen concentration to be ventilated is variously changed is directly proportional to the hydrogen concentration. As a result, the hydrogen concentration can be easily obtained from the obtained current output.
[0063]
Example 4
In the above-described Examples 1 to 3, the hydrogen oxidation active layer may be formed by applying activated carbon powder carrying the hydrogenase or the mediator.
That is, in the configuration of Example 1, the hydrogenase is supported on the activated carbon powder and applied to the working
[0064]
[Another Example]
The constant potential electrolysis hydrogen sensor of the present invention can also be implemented in a known constant potential electrolysis gas sensor as shown in FIG.
That is, a working
[0065]
Here, by providing a hydrogen oxidation active layer containing a hydrogenase having an enzyme activity specific to hydrogen oxidation on the surface of the working
[0066]
Further, in this configuration of the constant potential electrolytic gas sensor, the working
[0067]
As the mediator, in addition to the methyl viologen (MV), polybutyl viologen (PBV), polyoctyl viologen (POV), etc., which are viologen polymers contained in the viologen compound, can be used, and methyl contained in the viologen compound. It is also possible to attach a thiol group to the viologen compound and fix it on the surface of the working
[0068]
In addition to the viologen compound, the mediator receives electrons from hydrogenase in sulfate-reducing bacteria and transports them into the cell, functions as an electron carrier for hydrogenase, and retains electron transfer activity even in a dry state. Cytochrome c Three Can also be used.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic view of an embodiment of a constant potential electrolytic hydrogen sensor of the present invention.
FIG. 2 is a schematic view of another embodiment of the constant potential electrolytic hydrogen sensor of the present invention.
FIG. 3 shows an electron transfer between a hydrogenase, a mediator, and a working electrode in a constant potential electrolytic hydrogen sensor using a solution in which a hydrogenase-containing active layer containing hydrogenase is provided on a working electrode and a mediator is added to an electrolytic solution. Schematic
FIG. 4 shows an electron transfer between a hydrogenase, a mediator, and a working electrode in a potentiostatic hydrogen sensor using a solution in which a hydrogenation active layer containing a mediator is provided on a working electrode and hydrogenase is added to an electrolytic solution. Schematic
FIG. 5 is a schematic diagram of electron transfer between a hydrogenase, a mediator, and a working electrode in a constant potential electrolytic hydrogen sensor provided with a hydrogen oxidation active layer containing hydrogenase and a mediator on the working electrode.
FIG. 6 shows a self-assembled monolayer (SAM film) fixed to the working electrode.
FIG. 7 is a schematic diagram of electron transfer on the surface of the working electrode when methyl viologen (MV) is used as a mediator.
FIG. 8 is a schematic diagram of a method for purifying hydrogenase.
FIG. 9 is a graph showing an evaluation of the thermal stability of hydrogenase in an LB film.
FIG. 10 is a graph of current response by hydrogen aeration.
FIG. 11 is a graph of current response when the hydrogen concentration to be ventilated is changed variously.
(A) Output when the hydrogen concentration is changed over time
(B) Relationship between the hydrogen concentration and the obtained output value
[Explanation of symbols]
101 electrolyte
102 Electrolysis tank
103 working electrode
104 counter electrode
105 Reference electrode
107 porous teflon membrane
111 Gas introduction part
Claims (9)
前記作用電極として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設け、前記第１水素酸化活性物質が有効成分としてヒドロゲナーゼを含有し、
前記電解液として、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含有する定電位電解式水素センサ。A working electrode that chemically reacts with a gas to be detected as a gas electrode that detects gas, a counter electrode with respect to the working electrode, and a reference electrode that controls the potential of the working electrode, facing an electrolytic solution containing portion of an electrolytic cell containing the electrolytic solution A constant potential electrolytic hydrogen sensor in which a gas introduction part for introducing a gas to be detected is provided to the working electrode, and an output circuit for obtaining a gas detection output is electrically connected to each electrode;
Provided as the working electrode is a hydrogen oxidation active layer containing a first hydrogen oxidation active substance having an activity specific to hydrogen oxidation, the first hydrogen oxidation active substance contains hydrogenase as an active ingredient,
A constant potential electrolytic hydrogen sensor comprising a second hydrogen oxidation active substance having a function as a mediator for electron transfer as the electrolytic solution.
前記電解液として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質としてヒドロゲナーゼが添加された溶液を用い、
前記作用電極として、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設けてある電極を用いる定電位電解式水素センサ。A working electrode that chemically reacts with a gas to be detected as a gas electrode that detects gas, a counter electrode with respect to the working electrode, and a reference electrode that controls the potential of the working electrode, facing an electrolytic solution containing portion of an electrolytic cell containing the electrolytic solution A constant potential electrolytic hydrogen sensor in which a gas introduction part for introducing a gas to be detected is provided to the working electrode, and an output circuit for obtaining a gas detection output is electrically connected to each electrode;
As the electrolytic solution, a solution to which hydrogenase is added as a first hydrogen oxidation active substance having activity specific to hydrogen oxidation is used.
A constant potential electrolytic hydrogen sensor using an electrode provided with a hydrogen oxidation active layer containing a second hydrogen oxidation active substance having a function as an electron transfer mediator as the working electrode.
前記作用電極として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質であるヒドロゲナーゼと、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質とを含んだ水素酸化活性層を設けてある定電位電解式水素センサ。A working electrode that chemically reacts with a gas to be detected as a gas electrode that detects gas, a counter electrode with respect to the working electrode, and a reference electrode that controls the potential of the working electrode, facing an electrolytic solution containing portion of an electrolytic cell containing the electrolytic solution A constant potential electrolytic hydrogen sensor in which a gas introduction part for introducing a gas to be detected is provided to the working electrode, and an output circuit for obtaining a gas detection output is electrically connected to each electrode;
As the working electrode, a hydrogen oxidation active layer including hydrogenase, which is a first hydrogen oxidation active substance having an activity specific to hydrogen oxidation, and a second hydrogen oxidation active substance having a function as a mediator of electron transfer is provided. A constant potential electrolytic hydrogen sensor.
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