JP4510766B2

JP4510766B2 - 細胞外電極

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Publication number: JP4510766B2
Application number: JP2006022328A
Authority: JP
Inventors: ナイベルヒトビアス; 明佳島田; 奈保子河西; 慶一鳥光
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2006-01-31
Publication date: 2010-07-28
Anticipated expiration: 2026-01-31
Also published as: JP2007205756A

Description

本発明は、神経細胞の電気的活動の記録、および、神経細胞に対して電気的刺激あるいは薬理学的刺激を加えるために、電気生理学および医療分野にて有効な細胞外電極に関する。

生体の神経系は、神経細胞から構成される信号伝達経路を有している。この神経細胞は、情報を伝達する際に活動電位と呼ばれる信号を発する。この活動電位の発生は、神経細胞の細胞膜におけるイオン透過性の変化に伴う電位の変化に起因する。このような活動電位の発生に伴って生じる神経細胞近傍の電位、すなわち、細胞外電位を、神経細胞の電気的活動として測定するために、細胞外電極が用いられている。

細胞外電極としては、例えば、導電性物質からなる複数の微小電極と、配線を形成する多点電極とからなるものが挙げられる（例えば、非特許文献１参照。）。多点電極は、電極上に神経細胞あるいは組織を培養することにより、長時間安定した状態で細胞外電位を記録したり、神経細胞に対して電気的刺激を加えることができる。

また、細胞外電極のインピーダンス−周波数特性を向上させるために、細胞外電極の表面に白金黒めっき処理を施したり（例えば、特許文献１参照。）、細胞外電極の表面を無機化合物からなる多孔質導電材料により被覆したりすることが行われている。このような細胞外電極を、図６に例示する。
図６に示す細胞外電極１００は、絶縁基材１０１と、その一面１０１ａに設けられた導電回路１０２と、この導電回路１０２と電気的に接続され、導電回路１０２上に設けられた電極１０３と、導電回路１０２を覆うように設けられた絶縁層１０４とから構成されている。
この細胞外電極１００において、電極１０３は、導電回路１０２が設けられた絶縁基材１０１の一面１０１ａに白金黒の多孔性めっき処理を施すことにより形成される。そして、この電極１０３は、細胞外電極１００のインピーダンスを５０ｋΩ以下に抑制する役割を果たす。
また、電極１０３をなす材料としては、白金黒の代わりに、金、窒化チタン、酸化銀、タングステンなどの無機物からなる導電性多孔質材料も用いられる。

また、神経細胞同士は、グルタミン酸やγ―アミノ酪酸などの神経細胞が分泌する化学物質を伝達物質として、情報の伝達を行っている。これらの化学物質は、神経細胞の細胞膜を構成するタンパク質の化学構造を変化させる。このタンパク質の化学構造の変化によって、神経細胞内外のイオンの細胞膜に対する透過性が変化する。このタンパク質の化学構造の変化を制御するには、アゴニストあるいはアンタゴニストと呼ばれる有機化合物または無機化合物が用いられている。
アゴニストは、神経細胞の細胞膜を構成するタンパク質の受容体と相互作用して、イオン透過性を上昇させる。一方、アンタゴニストは、アゴニストと拮抗的に作用して、イオン透過性を減少させる。電気生理学に関する研究分野では、これらの物質は、通常ガラス微小電極や培養液の灌流装置を介して、神経細胞に投与される。

上記のように、白金黒の多孔性めっきや、無機物質の導電性多孔質材料からなる電極を形成することにより、細胞外電極のインピーダンスが低下し、細胞外電極は電気的な外部雑音に対するＳ／Ｎ比が向上する。その結果、この細胞外電極を用いることにより、神経細胞に対して、より微小な細胞外電位を計測することが可能となる。
Ｊｉｍｂｏ，Ｙ．ａｎｄＫａｗａｎａ，Ａ．，Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｎｅｕｒａｌｃｅｌｌｓｂｙｐｌａｎａｒｅｌｅｃｔｒｏｄｅａｒｒａｙ，ＡｎｕｕａｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆｔｈｅＩＥＥＥＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙＴｏｋｙｏ，（１９９０），ｐｐ．１７４１−１７４２（Ｆｉｇ．１）．特許第３１９３４７１号公報

しかしながら、神経細胞の細胞外電位は、通常、数ｋＨｚから数十ｋＨｚ程度のサンプリング周波数で記録されるが、この範囲におけるインピーダンス−周波数特性は、非線形的である。そのため、従来、細胞外電位の波形を正確に記録するのは困難であった。
また、このような細胞外電極を用いて神経細胞の細胞外電位を計測しながら、神経細胞に薬物を投与する場合、ガラス微小電極を用いて神経細胞の外部から内部へ薬物を投与したり、灌流装置により神経細胞の周囲全体の溶液を交換して、神経細胞の内部へ薬物を投与する必要があった。

本発明は、前記事情に鑑みてなされたもので、インピーダンス−周波数特性が、神経細胞を容易に電気的に刺激することができ、電気的信号の記録を行うのに十分な特性を有し、溶液中で帯電する有機化合物または無機化合物を電極に含有可能な導電性多孔質高分子を主とする細胞外電極を提供することを目的とする。

本発明の細胞外電極は、絶縁基材と、該絶縁基材の一面に設けられた導電回路と、前記絶縁基材の一面側に、前記導電回路の少なくとも接続部に重なるように設けられた電極と、前記導電回路の前記電極が重なっていない領域を覆うように設けられた絶縁層とを備えた細胞外電極であって、前記電極はエチレンジオキシチオフェンと、ポリ（エチレンジオキシチオフェン）−ポリ（スチレン・スルフォン酸）とからなる混合物から構成される導電性多孔質高分子を主とすることを特徴とする。

前記電極は、溶液中にて帯電する有機化合物または無機化合物を含有することもできる。

本発明の細胞外電極は、絶縁基材と、該絶縁基材の一面に設けられた導電回路と、前記絶縁基材の一面側に、前記導電回路の少なくとも接続部に重なるように設けられた複数の電極と、前記導電回路の前記複数の電極が重なっていない領域を覆うように設けられた絶縁層とを備えた細胞外電極であって、前記複数の電極はエチレンジオキシチオフェンと、ポリ（エチレンジオキシチオフェン）−ポリ（スチレン・スルフォン酸）とからなる混合物から構成される導電性多孔質高分子を主とすることを特徴とする。

本発明の細胞外電極は、絶縁基材と、該絶縁基材の一面に設けられた導電回路と、前記絶縁基材の一面側に、前記導電回路の少なくとも接続部に重なるように設けられた電極と、前記導電回路の前記電極が重なっていない領域を覆うように設けられた絶縁層とを備えた細胞外電極であって、前記電極はエチレンジオキシチオフェンと、ポリ（エチレンジオキシチオフェン）−ポリ（スチレン・スルフォン酸）とから構成される導電性多孔質高分子を主とするので、神経細胞に接触させることにより、神経細胞の電気的活動を計測することができるとともに、神経細胞に対して電気的刺激として電圧を印加することができる。
また、本発明の細胞外電極を構成する電極が、溶液中にて帯電する有機化合物または無機化合物を含有すれば、これらの有機化合物または無機化合物を、細胞外電極に通電することにより、有機化合物または無機化合物の溶液中への溶出を制御できる。したがって、本発明の細胞外電極は、細胞外電極に接触あるいは近接した神経細胞に薬物の投与を行うことができる。

以下、本発明を実施した細胞外電極について、図面を参照して詳細に説明する。

図１は、本発明に係る細胞外電極の一実施形態を示す概略断面図である。
この実施形態の細胞外電極１０は、絶縁基材１１と、絶縁基材１１の一面１１ａに設けられた導電回路１２と、絶縁基材１１の一面１１ａ側に、導電回路１２の接続部１２ａに重なるように設けられた電極１３と、導電回路１２の電極１３が重なっていない領域を覆うように設けられた絶縁層１４とから概略構成されている。また、この細胞外電極１０では、電極１３が導電回路１２と電気的に接続されている。
そして、電極１２は、エチレンジオキシチオフェン（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ、以下、「ＥＤＯＴ」と略記する。）と、ポリ（エチレンジオキシチオフェン）（ｐｏｌｙ（３，４−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、以下、「ＰＥＤＯＴ」と略記する。）−ポリ（スチレン・スルフォン酸）（ｐｏｌｙ（ｓｔｙｒｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、以下、「ＰＳＳ」と略記する。）からなる混合物から構成される導電性多孔質高分子を主とするものである。
ＥＤＯＴの化学式を下記の式（１）に、ＰＥＤＯＴの化学式を下記の式（２）に、ＰＳＳの化学式を下記の式（３）にそれぞれ示す。

また、電極１３は、溶液中にて帯電する有機化合物または無機化合物を含有させることもできる。
この実施形態において、溶液としては、例えば、一般的な細胞培養液などが挙げられる。

また、上記の溶液中にて帯電する有機化合物としては、神経細胞の神経伝達物質であるアミノ酸などが挙げられ、具体的にはグルタミン酸やガンマアミノ酪酸、グリシンなどが挙げられる。

また、上記の溶液中にて帯電する無機化合物としては、無機化合物としては、塩などが挙げられ、具体的にはナトリウムやカリウムなどの塩化物が挙げられる。

絶縁基材１１としては、細胞外電極１０を神経細胞に接触させた状態で、この神経細胞を観察する必要があるため透明な材質のものが好ましく用いられ、例えば、石英ガラス、鉛ガラス、ホウ珪酸ガラスなどのガラス、もしくは石英などの無機物質、または、ポリメタクリル酸メチルまたはその共重合体、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリプロピレン、尿素樹脂、メラミン樹脂などの透明性の有機物質などが挙げられる。機械的強度と透明性に優れることから、無機物質が好ましい。

導電回路１２をなす材料としては、例えば、スズ添加酸化インジウム（ＩｎｄｉｕｍＴｉｎＯｘｉｄｅ、以下「ＩＴＯ」と略記する。）、酸化スズ、クロム（Ｃｒ）、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、ニッケル（Ｎｉ）、アルミニウム（Ａｌ）などが用いられる。これらの中でも、導電回路１２が透明なものとなり、神経細胞を観察するために好適である点から、ＩＴＯまたは酸化スズが好ましく用いられ、導電性が高い点からＩＴＯがより好ましく用いられる。

また、導電回路１２の厚みは、特に限定されるものではなく、電極１３の厚みや形状などに応じて適宜設定される。

電極１３の形状および配置は、特に限定されるものではなく、対象となる神経細胞の大きさや数などに応じて適宜設定される。

絶縁層１４をなす絶縁材料としては、細胞外電極１０を、神経細胞を培養下で観察する必要があるため透明な樹脂が用いられ、例えば、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、アクリレート樹脂、ポリエステル樹脂、ポリアミド樹脂などが挙げられる。

次に、図１および図２を参照して、この実施形態の細胞外電極１０の製造方法を説明する。
まず、その一面１１ａに、導電回路１２が設けられた絶縁基材１１を用意する。
次いで、導電回路１２を覆い、所定の厚みおよび形状をなすように、上記の透明な樹脂からなる絶縁層１４を設ける。この際、導電回路１２の絶縁層１４と接する側の面１２ｂ（以下、導電回路１２の「一面１２ｂ」と言う。）における所定の領域、すなわち、電極１３と電気的に接続する領域が露出するように絶縁層１４を設ける。これにより、絶縁層１４には、図２に示すように、電極１３を設けるための開口部１４ａが形成される。

次いで、空気プラズマなどのプラズマ処理により、絶縁層１４の開口部１４ａ内に露出している導電回路１２の一面１２ｂ（接続部１２ａ）を洗浄する。
次いで、ＥＤＯＴとＰＥＤＯＴ−ＰＳＳに、導電回路１２および絶縁層１４が設けられた絶縁基材１１を浸漬する。

次いで、上記の絶縁基材１１を混合溶液に浸漬した状態で、所定の電圧および電流にて、この混合溶液に通電すると、図２に示すように、開口部１４ａ内の導電回路１２の一面１２ｂ上に、ＥＤＯＴの分子１５とＰＥＤＯＴ−ＰＳＳの分子１６とが次第に堆積して、導電性多孔質高分子１７が形成される。
そして、この導電性多孔質高分子１７が所定の厚みとなったところで通電を終了すると、図１に示すように、導電性多孔質高分子１７を主とする電極１３が設けられた細胞外電極１０を得る。
なお、電極１３の厚みを、混合溶液への通電時間によって、適宜制御することができる。

この実施形態の細胞外電極１０は、絶縁基材１１と、絶縁基材１１の一面１１ａに設けられた導電回路１２と、絶縁基材１１の一面１１ａ側に、導電回路１２に重なるように設けられた電極１３と、導電回路１２を覆うように設けられた絶縁層１４とから概略構成され、電極１３が、ＥＤＯＴと、ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳとから構成される導電性多孔質高分子を主とするものであるから、周波数が１００Ｈｚから１００ｋＨｚの範囲において、インピーダンスがほとんど変化せず、また、位相のずれも小さいから、ＩＴＯ電極などとよりもインピーダンスが小さく、かつ、インピーダンス−周波数特性が優れている。

また、この細胞外電極１０を用いて神経細胞の電気的活動（細胞外電位）を測定すると、同じ電圧の電気信号を神経細胞に印加した場合、ＩＴＯ電極を用いたときよりも、数多くの神経細胞の電気的活動を励起することができる。さらに、同じ電圧の電気信号を神経細胞に印加した場合、ＩＴＯ電極を用いたときよりも、細胞外電極１０には、より大きな電流が流れる。これは、細胞外電極１０に接続された神経細胞において、広範な領域の細胞が励起されるからであると考えられる。

また、ＥＤＯＴとＰＥＤＯＴ−ＰＳＳを溶解した混合溶液に、上記の溶液中にて帯電する有機化合物または無機化合物を混合してもよい。このようにすれば、上記の溶液への通電によって形成された導電性多孔質高分子１７を主とする電極１３は、溶液中にて帯電する有機化合物または無機化合物を含有したものとなる。

これにより、電極１３に、溶液中にて帯電する有機化合物または無機化合物を含有させれば、電極１３に印加する電圧に応じて、この有機化合物または無機化合物が電極１３から溶出し、細胞外電極１０に接続された神経細胞の電気的活動を活性化あるいは抑制することができる。例えば、溶液中にて負に帯電する有機化合物または無機化合物を電極１３に含有させて、溶液中にて電極１３が陰極となるように、細胞外電極１０に電圧を印加することにより、電極１３に接している神経細胞および電極１３の近傍の神経細胞に対して、有機化合物または無機化合物の投与、すなわち、薬理学的刺激の印加を行うことができる。

また、この実施形態では、絶縁基材１１の一面１１ａに１つの電極１３が設けられてなる細胞外電極１０を例示したが、本発明の細胞外電極はこれに限定されない。本発明の細胞外電極は、絶縁基材の一面に、所定の配置かつ所定の形状で、ＥＤＯＴと、ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳとから構成される導電性多孔質高分子を主とする複数（２個以上）の電極が設けられたものであってもよい。
このように複数の電極を備えた細胞外電極は、同時に、より多数の神経細胞の電気的活動を励起することができる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
図１に示すような、一面１１ａにＩＴＯからなる導電回路１２が設けられた絶縁基材１１（５０μｍ×５０μｍ）を用意した。
次いで、導電回路１２を覆い、所定の厚みをなし、かつ、所定の位置に開口部１４ａが形成された、透明な樹脂からなる絶縁層１４を設けた。
次いで、空気プラズマ処理により、絶縁層１４の開口部１４ａ内に露出している導電回路１２の一面１２ａを洗浄した。
次いで、ＥＤＯＴとＰＥＤＯＴ−ＰＳＳを、塩化ナトリウム水溶液に溶解して調製した混合溶液に、導電回路１２および絶縁層１４が設けられた絶縁基材１１を浸漬した。
次いで、上記の絶縁基材１１を混合溶液に浸漬した状態で、所定の電圧および電流にて、この混合溶液に通電し、ＥＤＯＴと、ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳとから構成される導電性多孔質高分子を主とする電極１３を形成し、細胞外電極１０を得た。

（細胞外電極の電気的特性）
以下に示す条件にて、実施例１で得られた細胞外電極１０の電気的特性を測定した。
細胞外電極１０を０．１５Ｍの塩化ナトリウム溶液中に浸漬し、この状態で細胞外電極１０に｜０．１｜Ｖ〜｜０．５｜Ｖの双極パルス電圧（パルス幅１００μｓ）を印加し、１Ｈｚから１００ｋＨｚまでの周波数における細胞外電極１０のインピーダンスと位相の応答を測定した。この測定を１０回繰り返し、図３に、この１０回の測定値の平均値をボード線図として示す。なお、図３において、（ａ）はＩＴＯ電極のインピーダンス、（ｂ）はＩＴＯ電極の位相差、（ｃ）は細胞外電極１０のインピーダンス、（ｄ）は細胞外電極１０の位相差をそれぞれ表す。また、図３において、右側の縦軸は位相、左側の縦軸はゲイン、横軸は周波数をそれぞれ表す。
図３の結果から、周波数が１００Ｈｚから１００ｋＨｚの範囲において、細胞外電極１０のインピーダンスはほとんど変化せず、また、位相のずれも小さくなっていることが確認された。したがって、細胞外電極１０は、ＩＴＯ電極と比較して、インピーダンス−電気的特性が向上していることが分かった。

（細胞外電位の測定１）
以下に示す条件にて、実施例１で得られた細胞外電極１０を用いて、神経細胞の細胞外電位を測定した。
ラット（胎齢８日）の大脳皮質から単離した神経細胞を、細胞外電極１０上、前記細胞培養液中で培養した。また、比較のために、同じラット由来の大脳皮質から単離した神経細胞を、ＩＴＯ電極上で培養した。
次に、神経細胞の自発的な細胞外電位を測定した。その結果を図４（ａ）に示す。
なお、図４（ａ）、（ｂ）において、縦軸は電位、横軸は時間をそれぞれ表す。
図４（ａ）、（ｂ）の結果から、細胞外電極１０は、ＩＴＯ電極と同様に、神経細胞の細胞外電位を測定できることが確認された。

（細胞外電位の測定２）
上述の細胞外電位の測定１で用いた神経細胞を培養した細胞外電極１０に対して、｜０．５｜Ｖの双極パルス（パルス幅２００μｓ）を印加して、細胞外電位の数を測定した。
また、同様にして、上述の細胞外電位の測定１で用いたＩＴＯ電極に対して、｜０．５｜Ｖの双極パルス（パルス幅２００μｓ）を印加して、細胞外電位の数を測定した。
細胞外電位の数は、刺激後１０ｍｓから３１５ｍｓで観測された細胞外電位において、個々の細胞外電位の振幅と時間幅の分布が一定の範囲内にあるときは、同一細胞由来の信号であるとするクラスター・カッティング法を用いて計測した。
その結果を図５に示す。
図５の結果から、細胞外電極１０は、同じ電圧の電気信号を印加した場合、ＩＴＯ電極よりも数多くの神経細胞の電気的活動を励起していることが分かった。これは、同じ大きさの電圧を印加した場合、細胞外電極１０には、より大きな電流が流れ、広範囲な領域に存在する神経細胞を励起することができるためであると考えられる。

（実施例２）
ＥＤＯＴとＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ混合溶液に、導電回路１２および絶縁層１４が設けられた絶縁基材１１を浸漬して、上記の絶縁基材１１を混合溶液に浸漬した状態で、所定の電圧および電流にて、この混合溶液に通電し、ＥＤＯＴと、ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳとから構成され、グルタミン酸を含有する導電性多孔質高分子を主とする電極１３を形成した以外は実施例１と同様にして、細胞外電極１０を得た。

（神経細胞への有機化合物の投与）
以下に示す条件にて、実施例２で得られた細胞外電極１０を用いて、電極１３に直接、接している神経細胞、および、電極１３の近傍の神経細胞に、グルタミン酸を投与した。
ラット（胎齢８日）の大脳皮質から単離した神経細胞を、細胞外電極１０上で培養した。
次に、細胞外電極１０上に培養された神経細胞の自発的活動を測定した。
その結果、上述の神経細胞の細胞外電位を測定できることが確認された。
次に、神経細胞と接触させた細胞外電極１０に対して、神経細胞の電気的活動が励起されない程度の負のパルス電圧（パルス幅５００ｍｓ）を１秒おきに１０回印加した前後１分間において、神経細胞の自発的な電気的活動の変化を、細胞外電位の数として測定した。
その結果、パルス電圧を印加した後に、神経細胞の細胞外電位の数に変化が見られなかった。したがって、電極１３に含有させたグルタミン酸が塩化ナトリウム水溶液中に溶出し、神経細胞の電気的活動を励起したものと考えられる。

以上の結果から、本実施例の細胞外電極によれば、低いインピーダンスで、同じ電圧を印加した場合、ＩＴＯ電極を用いた場合よりも、より多くの神経細胞の電気的活動を励起することができることが確認された。
また、本実施例の細胞外電極によれば、神経細胞と接触させた細胞外電極を溶液中に浸漬し、この細胞外電極に対して電圧を印加することにより、電極に直接、接している神経細胞、および、電極の近傍の神経細胞に対して、特別な器具を用いずに、局所的に薬物の投与をすることができることが確認された。

本発明の細胞外電極は、医療分野における薬物投与にも適用できる。

本発明に係る細胞外電極の一実施形態を示す概略断面図である。本発明に係る細胞外電極の製造方法を示す概略断面図である。本発明の実施例において、細胞外電極のインピーダンスと位相の応答を測定した結果を示すグラフである。本発明の実施例において、神経細胞の細胞外電位を測定したを示すグラフである。本発明の実施例において、細胞外電位の数を測定した結果を示すグラフである。従来の細胞外電極を示す概略断面図である。

符号の説明

１０・・・細胞外電極、１１・・・絶縁基材、１２・・・導電回路、１３・・・電極、１４・・・絶縁層。

Claims

絶縁基材と、該絶縁基材の一面に設けられた導電回路と、前記絶縁基材の一面側に、前記導電回路の少なくとも接続部に重なるように設けられた電極と、前記導電回路の前記電極が重なっていない領域を覆うように設けられた絶縁層とを備えた細胞外電極であって、
前記電極はエチレンジオキシチオフェンと、ポリ（エチレンジオキシチオフェン）−ポリ（スチレン・スルフォン酸）とからなる混合物から構成される導電性多孔質高分子を主とすることを特徴とする細胞外電極。
前記電極は、溶液中にて帯電する有機化合物または無機化合物を含有することを特徴とする請求項１に記載の細胞外電極。
絶縁基材と、該絶縁基材の一面に設けられた導電回路と、前記絶縁基材の一面側に、前記導電回路の少なくとも接続部に重なるように設けられた複数の電極と、前記導電回路の前記複数の電極が重なっていない領域を覆うように設けられた絶縁層とを備えた細胞外電極であって、
前記複数の電極はエチレンジオキシチオフェンと、ポリ（エチレンジオキシチオフェン）−ポリ（スチレン・スルフォン酸）とからなる混合物から構成される導電性多孔質高分子を主とすることを特徴とする細胞外電極。