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JP4486893B2 - タンパク質アレイ - Google Patents

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JP4486893B2
JP4486893B2 JP2004562576A JP2004562576A JP4486893B2 JP 4486893 B2 JP4486893 B2 JP 4486893B2 JP 2004562576 A JP2004562576 A JP 2004562576A JP 2004562576 A JP2004562576 A JP 2004562576A JP 4486893 B2 JP4486893 B2 JP 4486893B2
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Description

関連出願の相互参照
本発明は、２００２年１２月２２日に出願され、その内容の全体が参照することにより本明細書に援用される、米国仮特許出願第６０／４３５，８２１号明細書の優先権および利点を請求する。
連邦政府後援研究に関する陳述
本発明は、米国エネルギー省によって授与された助成金ＤＥ−ＦＧ０３−００ＥＲ４５８１２の下、および国立衛生研究所によって授与された助成金ＧＭ６２１５９による政府の支援により行われた。政府は本発明における一定の権利を有しうる。
本発明は、固体支持体上に固定化された非天然アミノ酸を含んで成るポリペプチドの分野に関し、およびかかる固定化ポリペプチドをアッセイにおいて、かつバイオセンサーとして使用する方法に関する。
ゲノミクスにおける最近の進歩は、ヒトを含む一部の生物の全ゲノムのシークエンシングに至った。しかし、ゲノミクスのみでは、疾患、発達、および他の生物現象に関与する細胞過程の完全な理解を得ることはできない。なぜならば、かかる過程はポリペプチドによって仲介されるためである。膨大な数のポリペプチドが生物のゲノムによってコード化されることを考えてみると、ポリペプチドを分析するハイスループット技術の開発が最重要となる。
ポリペプチドのハイスループット、高度平行分析を可能にしうる１つの重要な技術は、タンパク質アレイ（マイクロアレイとも呼ばれる）である。タンパク質マイクロアレイは通常、その各々が固体支持体に付着している多くのポリペプチドから成る。マイクロアレイ中のポリペプチドは、他の分子と接触し、例えば、分子がアレイ中の１つもしくはそれ以上のポリペプチドに結合し、またはこれと相互作用するかどうかを決定することができる。例えば、当該リガンドの従来未知の受容体を、ポリペプチドアレイをリガンドと接触させ、アレイ中のどのポリペプチドがリガンドを結合するかを判定することによって確認しうる。他の例としては、タンパク質アレイをキナーゼと接触させ、リン酸化するそのポリペプチドを検出することによって特定のキナーゼによってリン酸化されるすべてのポリペプチドを迅速に確認することができる。タンパク質アレイのさらに他の用途は、ポリペプチドの酵素または結合活性を変化させる小分子および他の部分を検出することである。
多くの用途のために、アレイ中の各ポリペプチドが一定の配向で固体支持体に付着されることが望ましい。そのアミノ末端またはそのカルボキル末端において、またはその近くでアレイ中のすべてのポリペプチドの付着は、例えば、各ポリペプチドの活性部位または諸部位が潜在的に相互作用分子に接近しやすく確実にする助けとなりうる。さらに、ポリペプチドの付着は、特に固定化ポリペプチドの活性を検出することが望まれる場合には、ポリペプチドの構造を混乱させることはない。したがって、改善されたタンパク質アレイ、およびその調製のための方法の必要性が存在する。本発明は、これらの必要性、および他の必要性を満たすものである。
本発明は、固体支持体上のポリペプチドのアレイであるタンパク質アレイ、およびそれを製造するための方法に関する。本発明の方法およびシステムにより、ポリペプチドの機能を保存するようなやり方で固体支持体にポリペプチドを結合することを可能にする。共有または非共有付着は一般に、ポリペプチドの構造、機能、または生物活性に実質的に影響を及ぼすことはない。本発明のアレイ中に使用されるポリペプチドは少なくとも１つの非天然アミノ酸を組込み、かつアミノ酸の側鎖は、ポリペプチドを適切な固体支持体に結合するために使用されうる反応基を有する。このアレイは多種多様の用途において使用される。
本発明は、ポリペプチドが固体支持体に付着し、かつポリペプチドが少なくとも１つの非天然アミノ酸を組込むとともに、ポリペプチドが、非天然アミノ酸の側鎖上にある第１の反応基と固体支持体に付着している第２の反応基との間の反応生成物から形成される化学結合によって固体支持体に付着しているタンパク質アレイを提供する。このアレイでは、第１の反応基は求電子剤、例えば、ケトまたはアルデヒド部分であり、かつ第２の反応基は求核部分でありうる。あるいは、第１の反応基が求核部分であり、かつ前記第２の反応基は求電子剤、ケトまたはアルデヒド部分でありうる。
反応基において使用される求核部分が、−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲＩ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、および−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）を含むがこれらに限定されない適切な求核でありうるが、ここで各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立してＨ、または１−６個の炭素を有するアルキルである。一般に、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、およびカルボニルヒドラジドはすべて適切な求核部分である。求核および求電子剤の反応生成物は、オキシム、アミド、ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、またはチオセミカルバゾンでありうる。一部の実施形態においては、反応生成物は還元ヒドラゾンである。
一部の実施形態においては、タンパク質アレイ上の１つもしくはそれ以上の付着ポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸の長さであり、他の実施形態においては、１つもしくはそれ以上の付着ポリペプチドは、少なくとも１００アミノ酸の長さである。さらに具体的には、少なくとも５０％の付着ポリペプチドは少なくとも５０アミノ酸の長さであり、または少なくとも５０％の付着ポリペプチドは少なくとも１００アミノ酸の長さでありうる。他の実施形態では、少なくとも１の付着ポリペプチドは全長ポリペプチドであるが、他の実施形態では、少なくとも１つの付着ポリペプチドは全長ポリペプチドのフラグメントまたはその一部分である。
タンパク質アレイにおいて使用される固体支持体は、制限なしの組成または構成でありうる。１つの実施形態では、アレイは論理的アレイである。他の実施形態では、タンパク質アレイではマイクロウェルプレートが使用される。さらに他の実施形態では、アレイで使用される固体支持体は、ポリペプチドが付着されるビードである。
一部の実施形態においては、本発明のタンパク質アレイは、複数の異なるポリペプチドを有する。例えば、タンパク質アレイは少なくとも１０種類のポリペプチド、少なくとも１００種類のポリペプチド、または少なくとも１０００種類のポリペプチドを有しうる。
一部の実施形態においては、アレイ上のポリペプチドは翻訳後プロセッシングからの修飾を有する。これらの修飾は、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリストイル化、プレニル化、またはタンパク質分解プロセッシングを含みうるが、これらに限定されない。他の実施形態においては、タンパク質アレイ上のポリペプチドは天然ポリペプチドと相同性である。
タンパク質アレイ上で使用される非天然アミノ酸を有するポリペプチド源は特に制限されることは意図されていない。ポリペプチドはインビボで生成され、または合成的に生成されうる。特定の実施形態においては、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するポリペプチドは、選択コドンを有するヌクレオチド配列、選択コドンに相補的なアンチコドンループを有する直交サプレッサーｔＲＮＡ、および非アミノ酸を有するｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化し、かつ非天然アミノ酸が選択コドンの部位でポリペプチドへ組込まれるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いる翻訳システムを用いて生成される。
他の実施形態においては、本発明は、ポリペプチドを固体支持体に付着させ、それによってタンパク質アレイを生成する方法を提供する。１つの態様では、本発明は、少なくとも１つのポリペプチドを固体支持体に付着させる方法を提供するが、この方法では、第１の反応基を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸をポリペプチドへ組込み、次いで固体支持体に付着している第２の反応基と第１の反応基を反応させ、それによって共有結合を形成させ、かつポリペプチドを固体支持体に付着させるステップが使用される。この方法では、第１の反応基は求電子剤、例えば、ケトまたはアルデヒド部分であり、第２の反応基は求核部分であり、あるいは、第１の反応基は求核部分であり、第２の反応基は求電子剤、例えば、ケトまたはアルデヒド部分でありうる。この方法の変形形態においては、第１の反応基、第２の反応基、またはその両方は、化学的に保護された部分を含んで成り、かつこの方法は、反応ステップ前に脱保護ステップをさらに組込みうる。保護／脱保護システムは感光システム（例えば、光脱保護）でありうる。
この方法で使用されるポリペプチドは、インビボ翻訳システムで生成され、または合成的に生成されうる。ポリペプチドは、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリストイル化、プレニル化、またはタンパク質分解プロセッシングを含むがこれらに限定されない翻訳後プロセッシングにかけられうる。この方法で使用されるポリペプチドは、全長ポリペプチドであり、あるいは、全長ポリペプチドのフラグメントまたはその一部でありうる。
ポリペプチドを固体支持体に付着させる方法においては、適切な求核反応基を使用することができる。適切な求核部分は、−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲＩ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、および−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）を含みうるが、ここで各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立してＨ、または１−６個の炭素を有するアルキルである。求核部分は、適切な求核、例えば、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、またはカルボニルヒドラジドを含みうる。一部の方法においては、第２の反応基は、固体支持体に付着されるリンカーを含む。そのリンカーは、第１の反応基が第２の反応基と反応した後に固体支持体に付着されうる。他の実施形態では、第１の反応基は、ポリペプチドに付着されるリンカーを含む。
ポリペプチドを固体支持体に付着させる方法においては、制限なしに任意の組成または構成の任意の適切な固体支持体を使用することができる。１つの実施形態では、アレイを形成する固体支持体は論理的アレイを形成する。他の実施形態においては、固体支持体はマイクロウェルプレートを使用する。さらに他の実施形態においては、アレイで使用される固体支持体は、ポリペプチドが付着しているビードである。
ポリペプチドを固体支持体に付着させる方法においては、場合により、複数のポリペプチドを固体支持体に付着させることができる。この場合、各々ポリペプチドが固体支持体の個別領域に付着され、タンパク質アレイを形成する。これらの方法で使用されるポリペプチドのサイズが制限されることは意図されていない。種々の実施形態においては、１つもしくはそれ以上の付着ポリペプチドは少なくとも５０アミノ酸の長さであり、または少なくとも１００アミノ酸の長さでありうる。他の実施形態においては、少なくとも５０％の付着ポリペプチドは少なくとも５０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも５０％の付着ポリペプチドは少なくとも１００アミノ酸の長さである。
本発明は、上述されているタンパク質アレイを用いるバイオセンサーも提供する。１つの実施形態においては、本発明は、ポリペプチドへ組込まれた非天然アミノ酸の側鎖上にある第１の反応基と固体支持体に付着している第２の反応基との間の反応生成物に由来する化学結合によって固体支持体に付着されているポリペプチドを用いるバイオセンサーを提供する。１つの実施形態においては、バイオセンサーで用いられるポリペプチドは抗体である。
本発明は、タンパク質アレイを製造する方法を提供し、ここでポリペプチドと固体支持体との間の付着は共有結合に限定されない。この方法では、１つもしくはそれ以上の結合または反応性部分を有する固体支持体を提供するステップと、１つもしくはそれ以上の非天然アミノ酸を組込む当該ポリペプチドを提供するステップと、当該ポリペプチドを結合または反応性部分に接触させ、ここで結合または反応性部分が当該ポリペプチドに結合、またはこれと反応するステップとが使用される。この方法の一実施形態では、非天然アミノ酸は、反応性部分と反応し、当該タンパク質を固体支持体に結合する。他の実施形態では、非天然アミノ酸は、結合部分に結合するリンカーに結合、またはこれを使用し、当該タンパク質を固体支持体に結合する。例えば、リンカーはビオチンを含みうるとともに、結合部分はアビジンを組込みうる。
本発明は、共有結合に依拠することなく、ポリペプチドと固体支持体との付着が得られるタンパク質アレイをも提供する。これらのアレイは、固体支持体に付着したポリペプチドを組込み、ポリペプチドは少なくとも１つの非天然アミノ酸を組込み、ポリペプチドは、非天然アミノ酸の側鎖上の化学部分と固体支持体に付着している第２の化学部分との間の非共有相互作用を用いる結合によって固体支持体に付着している。非共有相互作用は、イオン相互作用またはファンデルワールス相互作用でありうる。
本発明は、少なくとも１つのポリペプチドを固体支持体に付着させる方法も提供し、この方法は、第１の化学部分を有する側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸をポリペプチドへ組込むステップと、第２の化学部分を有する固体支持体を提供するステップと、リンカーを提供するステップであって、このリンカーが第３および第４の化学部分を有するステップと、ポリペプチド、リンカー、および固体支持体を、ポリペプチド上の第１の化学部分がリンカー上の第３の化学部分に付着し、固体支持体上の第２の化学部分がリンカー上の第４の化学部分に付着し、それによってポリペプチドと固体支持体との間のブリッジを形成し、ポリペプチドを固体支持体に付着させる条件下に結合させるステップとを含む。
この方法の一部の実施形態においては、リンカーは、固体支持体との反応前にポリペプチドと反応し、あるいは、ポリペプチドとの反応前に固体支持体と反応する。ポリペプチド上の第１の化学成分とリンカー上の第３の化学部分との間の付着は、共有または非共有でありうる。第１の化学部分と第３の化学部分との間の付着が非共有である場合、アビジンおよびビオチンなど同種の部分を結合のために使用できる。
他の実施形態においては、固体支持体上の第２の化学部分とリンカー上の第４の化学部分との間の付着は、共有または非共有でありうる。非共有である場合、アビジン−ビオチン結合を用いることができる。
本発明の種々の実施形態を示す概略図である。各パネルは、固体支持体に付着したポリペプチドの異なる構成を示し、ここでポリペプチド（１）は白色で示され、ポリペプチド内の非天然アミノ酸（２）は斜交平行模様で示され、反応基は星印で示され、固体支持体（３）は格子縞模様で示され、共有付着は真黒の棒で示され（４）、リンカー部分（５）は斑点模様で示され、正電荷および負電荷部分は丸で囲んだ＋または−（それぞれ、６および７）を用いて示され、他の部分は追加の参照番号で示されている。
定義
本発明を詳細に述べる前に、本発明は特定の生物系に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを述べる目的のためであり、限定することを目的としていない。本明細書および添付の請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が別段に明示していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、例えば、２つもしくはそれ以上の細胞を含み、「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」への言及は、場合により単一の細菌細胞などに加えて細菌の培養物を含む。
この定義、かつ以下の明細書で規定されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。別段に規定されていない限り、本明細書で使用される技術および学術用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、本発明の実施において使用されうる本明細書に記載されたものと同様または同等の多くの材料および方法を理解するであろう。本発明は、本明細書に記載された材料および方法には決して限定されない。本発明の目的のために、次の用語が以下に規定されている。
ポリペプチド：ポリペプチドは、通常、共有ペプチド結合によって独占的に結合されない、任意の長さのアミノ酸（天然もしくは非天然、またはその組合せ）のオリゴマーである。ポリペプチドは、すべての供給源、例えば、天然ポリペプチド、組換え分子遺伝子工学によって生成されるポリペプチド、細胞もしくは翻訳システムからのポリペプチド、または無細胞合成手段によって生成されるポリペプチドでありうる。ポリペプチドは、そのアミノ酸配列、例えば、その成分アミノ酸の一次構造によって特徴付けられる。本明細書で用いられるポリペプチドのアミノ酸配列は、全長配列に限定されず、部分的または完全配列でありうる。さらに、ポリペプチドが特定の生物活性の保有または非保有によって限定されることは意図されていない。本明細書で用いられる「タンパク質」なる用語は、ポリペプチドと同義である。一般に、「ペプチド」なる用語は、小さなポリペプチド、通常、２〜２５アミノ酸の長さを指す。
天然ポリペプチド：本明細書で用いられる天然ポリペプチドは、自然界に見られるポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）のものと同一のアミノ酸残留物の配列を有するポリペプチドである。天然ポリペプチドは切断されておらず（切断形態が天然に生成されない限り）、また天然配列に対してアミノ酸欠失または置換を含有することもない。天然ポリペプチドはその天然源、例えば、動物細胞から単離され、または組換え遺伝子工学を用いて生成されうる。本明細書で用いられる「全長ポリペプチド」なる用語は、天然ポリペプチドと同じ長さを有するポリペプチドである。天然ポリペプチドは、天然源から単離された対応する野生型ポリペプチドに見られる翻訳後修飾を含有してもしなくてもよい。
ポリペプチドフラグメントまたはポリペプチド部分：本明細書で用いられるこれら同義の用語は、全長ポリペプチドアミノ酸配列の隣接サブセットを指す。ポリペプチドフラグメントまたは部分は、ポリペプチドの任意のドメインから単離されうるとともに、約４アミノ酸から全長ポリペプチド配列までの任意の長さを有しする。
翻訳後修飾：本明細書で用いられる翻訳後修飾は、同時翻訳またはポリペプチドが完全に翻訳された後のいずれかの通常、細胞内で発生するポリペプチドの修飾である。翻訳後修飾は、インビボで自然発生しうるとともに、多くの場合、天然ポリペプチドが生物学的に活性であるために必要とされる。多種多様な翻訳後修飾が、例えば、グリコシル化および／またはリン酸化を含めてインビボで存在することが知られており、通常、細胞タンパク質など内因性細胞成分によって調節される。ポリペプチドは、多種類の翻訳後修飾にかけられ、かつ修飾はポリペプチド分子内のどこにもありうる。
既知の翻訳後修飾としては、限定されることなく、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有付着、ヘム部分の共有付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有付着、脂質または脂質誘導体の共有付着、ホスファチジルイノシトールの共有付着、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ仲介添加、およびユビキチン化が挙げられる。かかる修飾は当業者には公知であり、例えば、クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ），Ｔ．Ｅ．、タンパク質−−構造および分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、第２版、Ｗ．Ｈ．フリーマン アンド カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９３年）、ワルド（Ｗｏｌｄ），Ｆ．、「翻訳後タンパク質修飾：展望と考察（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」、タンパク質の翻訳後共有修飾（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）収載、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ），Ｂ．Ｃ．編、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８３年）、ｐｐ．１−１２、ザイフター（Ｓｅｉｆｔｅｒ）ら「タンパク質修飾および非タンパク質補因子の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ）」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８２、ｐｐ．６２６−６４６（１９９０年）、およびラタン（Ｒａｔｔａｎ）ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６３、ｐｐ．４８−６２（１９９２年）などの科学学術文献において詳細に記載されている。
インビトロおよびインビボ：「インビトロ」なる用語は、人工的環境、および人工的環境内で生じる過程または反応を指す。「インビボ」なる用語は、天然環境（例えば、動物または細胞内）、および天然環境内（例えば、細胞内、その細胞が生物内に存在するか、細胞培養内に存在するかに関係なく）で生じる過程または反応を指す。インビトロおよびインビボの定義は、互いに対するものであり、特に当該システムに対するものである。本明細書で用いられる「インビボ生成ポリペプチド」なる用語は、通常、細胞内で、あるいは、細胞から調製された抽出物（未精製、濃縮、または精製分画）を含有する無細胞システムを用いて、酵素的に合成（例えば、翻訳）されているポリペプチドを指す。対照的に、本明細書中の「インビトロ生成ポリペプチド」は、酵素活性なしに生成（例えば、化学的に合成）されているポリペプチドである。
非天然アミノ酸：本明細書で用いられる「非天然アミノ酸」なる用語は、２０の天然アミノ酸、または天然インビボ翻訳システムによってポリペプチドへ組込まれることが周知である修飾アミノ酸、アミノ酸類似体、セレノシステイン、またはピロリジンを含む２０のアミノ酸の天然変形物の１つではないアミノ酸である。
固体支持体：本明細書で用いられる「固体支持体」なる用語は、直接的または間接的に、ポリペプチドの合成、付着、または固定化を可能にするように機能的にされうる実質的に固定された配置の材料の基質を指す。「固体支持体」なる用語は、「樹脂」または「固相」などの用語も包含する。固体支持体は、ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、ポリアクリルアミドのほか、コポリマーおよびそのグラフトなど有機ポリマーから成る。固体支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、細孔性ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または適切な金属など無機でもありうる。本明細書で記載されているものに加えて、「固体支持体」なる用語は、任意の種類のコーティングまたは任意の他の種類の二次処理、例えば、ラングミュア−ブロジェット膜、自己組織化単層膜（ＳＡＭ）、ゾル−ゲルなどを受けた任意の固体支持体を含むことも意図されている。
アレイ：本明細書で用いられる「アレイ」または「マイクロアレイ」は、例えば、固体支持体上および／または管の配列に存在する要素（例えば、ポリペプチド）の配列である。アレイは最も多くの場合、特定の空間的物理的関係を有する物理的要素と考えられているが、本発明は、直接的な空間的組織化を有することがない「論理的アレイ」も使用されうる。例えば、コンピュータシステムを用いて、物理的に異種の成分内またはその上に位置している１つもしくはいくつかの当該成分の位置を追跡することができる。コンピュータシステムは、アレイメンバーの物理的位置の「ルックアップ」テーブルを提供することによって論理的アレイを作成する。したがって、動作中の成分でも、アレイのメンバーが特定され、位置付けられる限り、論理的アレイの一部でありうる。これは、例えば、本発明のアレイが流動微小規模で存在する場合、または１つもしくはそれ以上のマイクロタイタートレイに存在する場合に重要である。
一部のアレイ構成は時々、「チップ」または「バイオチップ」と呼ばれる。アレイは、低密度数のアドレス可能位置、例えば、２から約１０、中密度、例えば、約１００もしくはそれ以上の位置、または高密度数、例えば、１０００もしくはそれ以上を含んで成る。通常、チップアレイ構成は、製造、取扱い、配置、スタッキング、試薬導入、検出、および貯蔵の促進を可能にする幾何学的に規則的な形状である。しかし、これは不規則的でもありうる。１つの標準的な構成においては、アレイは、行と列の構成で構成され、アレイ状のメンバーセットの各位置間には規則的な間隔を有する。あるいは、それらの位置は、均等化処理またはサンプリングのために束ねられ、混合され、または均一的にブレンドされうる。アレイは、各位置が試薬のハイスループット処理、ロボット送達、マスキング、またはサンプリング用に空間的にアドレス可能であるように構成された複数のアドレス可能な位置を含みうる。アレイは、レーザー照射、共焦点または偏向集光、ＣＣＤ検出、および化学ルミネセンスによる走査を含むがこれらに限定されない特定の手段によって検出または定量化を促進するようにも構成されうる。「アレイ」構成は、本明細書で開示されているように、アレイ（すなわち、多重チップのアレイ）、マイクロチップ、マイクロアレイ、単一チップ上に取付けられたマイクロアレイ、マイクロウェルプレートに付着した生体分子のアレイ、または当該システムで使用するために適切な他の構成を含むがこれらに限定されない。
翻訳システム：「翻訳システム」は、少なくとも１つのアミノ酸を成長ポリペプチド鎖へ酵素的に組込むのに必要な成分を指す。翻訳システムの成分としては、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ｍＲＮＡなどが挙げられうる。翻訳システムは、原核、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、または真核、例えば、酵母、哺乳動物、植物、もしくは昆虫細胞のいずれかの細胞であり、またはこれを含みうる。あるいは、翻訳システムは、酵素ポリペプチド合成に必要な成分が細胞から調製された抽出物中、または１つもしくはそれ以上の細胞抽出物由来である精製または濃縮形態中に供給される場合に無細胞システムでありうる。細胞ベースの翻訳システムは、インビボシステムとみなしうる。本発明のタンパク質アレイで使用される非天然アミノ酸を含んで成るポリペプチドは、任意のインビボ方法によって生成されうる。その一方、ポリペプチドは非酵素インビトロシステムを用いて化学的にも合成されうる。
抗体：本明細書で用いられる「抗体」なる用語は、検体（抗原）に特異的に結合し、かつこれを認識する１つの免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、またはそのフラグメントによって実質的にコード化されるポリペプチドを含むがこれに限定されない。例としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、および一本鎖抗体などが挙げられる。Ｆａｂフラグメント、およびファージディスプレイを含む発現ライブラリーによって生成されるフラグメントを含む免疫グロブリンのフラグメントも本明細書で用いられる「抗体」に含まれる。例えば、抗体の構造および用語については、ポール（Ｐａｕｌ）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、１９９９年、レイブン プレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。
共有結合：本明細書で用いられる共有結合は、原子間の共有電子を含んで成る結合である。共有結合は、「化学結合」と同義である。非共有結合は、共有結合ではない結合である。１つのタイプの非共有結合はイオン結合である。イオン結合は、逆方向に荷電された化学部分間の呼び合いである。イオン結合では、電子は共有されておらず、むしろ、不均等に転移されており、結果として不均衡な電荷分布および正／負電荷の呼び合いが生じる。
相同性：タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらが、通常の祖先タンパク質またはタンパク質配列から天然または人工的に由来する場合に「相同性」である。同様に、核酸および／または核酸配列は、それらが、通常の祖先核酸または核酸配列から天然または人工的に由来する場合に「相同性」である。例えば、天然の核酸は、１つもしくはそれ以上の選択コドンを含む任意の利用可能な変異誘発方法によって修飾されうる。発現されると、この突然変異核酸は、１つもしくはそれ以上の非天然アミノ酸を含んで成るポリペプチドをコード化する。変異過程は、もちろん、追加的に１つもしくはそれ以上の標準コドンを変化させ、それによって、結果として生じる変異体タンパク質においても１つもしくはそれ以上の標準アミノ酸を変更する。相同は一般に、２つもしくはそれ以上の核酸またはタンパク質（またはその配列）間の配列類似性から推論される。相同の確立に有用である配列間の類似性の正確は比率は、問題の核酸とタンパク質によってばらつきがあるが、２５％ほどの配列類似性が通常、相同を確立するために使用されている。高レベルの配列相同性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％もしくはそれ以上も相同を確立するために使用されうる。配列の類似性の比率を判定する方法（例えば、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）が本明細書では記載されており、一般に利用可能である。
直交：本明細書で用いられる「直交」は、細胞または翻訳システムに対して内因性である対応する分子と比べ減少した効率の細胞の内因性成分と機能し、または細胞の内因性成分との機能を欠く分子（例えば、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および／または直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ））を指す。ｔＲＮＡおよびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素との関連で、直交は、内因性ｔＲＮＡ合成酵素と機能する内因性ｔＲＮＡの能力と比べて内因性ｔＲＮＡ合成酵素と機能する直交ｔＲＮＡ、または内因性ｔＲＮＡと機能する内因性ｔＲＮＡ合成酵素の能力と比べて内因性ｔＲＮＡと機能する直交アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の無効、または効率の減少、例えば２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、または１％の未満の効率を指す。直交分子は、細胞における機能的な内因性補体分子を欠く。例えば、細胞における直交ｔＲＮＡは、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比べた場合、減少または検出不可能な効率の細胞の内因性ＲＳによってアミノアシル化される。別の例では、直交ＲＳが、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比べ、減少または検出不可能な効率の当該細胞の任意の内因性ｔＲＮＡをアミノアシル化する。第２の直交分子は、第１の直交分子と機能する細胞へ導入されうる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳのペアは、対照、例えば、対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内因性ペア、または活性直交ペア（例えば、チロシン直交ｔＲＮＡ／ＲＳペア）に対して効率（例えば、４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、または９９％もしくはそれ以上の効率）を有する細胞内で機能する導入された補体成分を含む。
同種：「同種」なる用語は、例えば、直交ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する直交ｔＲＮＡおよび直交アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素といっしょに機能する成分を指す。これらの成分は、「相補的」であるとも言及されうる。
選択的にアミノアシル化する：「選択的にアミノアシル化する」なる用語は、Ｏ−ＲＳが、Ｏ−ｔＲＮＡを生成するために使用される天然のｔＲＮＡまたは出発原料と比べ非天然アミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する、例えば、約７０％の効率、約７５％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、または約９９％もしくはそれ以上の効率の効率を指す。次いで、非天然アミノ酸は、高い忠実度で、例えば、所定の選択コドンに対して約７５％よりも高い効率で、所定の選択コドンに対して約８０％よりも高い効率で、所定の選択コドンに対して約９０％よりも高い効率で、所定の選択コドンに対して約９５％よりも高い効率で、または所定の選択コドンに対して約９９％もしくはそれ以上の効率で、成長ポリペプチド鎖へ組込まれる。
選択コドン：「選択コドン」なる用語は、翻訳過程におけるＯ−ｔＲＮＡによって認識され、かつ内因性ｔＲＮＡによって認識されないコドンを指す。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループは、ｍＲＮＡ上の選択コドンを認識し、そのアミノ酸、例えば、非天然アミノ酸をポリペプチドにおけるこの部位で組込む。選択コドンは、例えば、停止コドン、例えば、アンバーコドン、オーカーコドン、およびオパールコドンなどのナンセンスコドン、４もしくはそれ以上の塩基コドン、天然または非天然塩基対など由来のコドンを含みうる。所定のシステムでは、選択コドンは、天然の３塩基コドンの１つも含みうるとともに、内因性システムは、前記天然の３塩基コドン、例えば、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠いているシステム、または天然の３塩基コドンがレアコドンであるシステムを使用することはない。
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは、所定の翻訳システムにおけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のリーディングを変化させるｔＲＮＡである。サプレッサーｔＲＮＡは、例えば、停止コドンを通じて、４塩基コドン、またはレアコドンをリーディングすることができる。
ポリペプチドを固体支持体上に固定化するためのシステム、および結果として生じるポリペプチドを含有する固体支持体、例えばタンパク質アレイが提供される。このシステムは、付着されるとポリペプチドの機能を保存し、またはその機能性を回復するようなやり方でポリペプチドを固体支持体に共有または非共有的に付着させることを可能にする。共有または非共有付着が一般に、ポリペプチドの構造、機能、または活性（例えば、触媒活性、他のポリペプチドを結合する能力、核酸を結合する能力、小分子を結合する能力、３Ｄ構造など）に実質的に影響を及ぼすことがない。本発明のタンパク質アレイは用途が広く、種々のタンパク質分析フォーマットの適用されうる。このアレイは、多種類のスクリーニングプロトコール、およびハイスループット平行分析が望ましい任意のタンパク質分析を含む多種多様な用途で使用される。
タンパク質アレイのための用途
単一のポリペプチド種を含有する本発明のタンパク質アレイ、および多重ポリペプチドまたはポリペプチドライブラリーを有するアレイが使用されうる。例えば、支持体−結合アレイを用いて、タンパク質−タンパク質相互作用を分析することができる。これは、例えば、オーファン受容体またはオーファンリガンドをその対応結合タンパク質にマッチさせるために特に有用である。２つもしくはそれ以上のポリペプチド間の相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する分子も本発明のタンパク質アレイを用いて同定されうる。
ポリペプチドと相互作用する小分子の同定は、本発明のタンパク質アレイのための他の用途である。この用途は、小分子のターゲットの同定、およびタンパク質活性の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストの同定のために特に有用である。本発明のタンパク質アレイは、被験化合物の大ライブラリーのハイスループットスクリーニングを可能にする。
タンパク質アレイを用いて当該酵素（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、プロテアーゼなど）の基質を同定することもできる。例えば、本発明に従い製造されたポリペプチドのアレイをＡＴＰの存在下に精製キナーゼでインキュベートし、アレイ中のポリペプチドのリン酸化を検出することによってキナーゼの基質を同定することができる。
上記のアッセイにおいては、タンパク質アレイ上の相互作用または活性について試験される各分子が、一部の実施形態では、アレイ全体が覆われるが、隣接したアレイに適用される被験反応混合物は二次汚染されないように、反応混合物中でアレイ上へスポットされる。これはアレイ用の固体支持体として、または固体アレイ支持体用のホルダーとしてマイクロウェルプレートを用いて有利に実施されうるが、アレイ成分はプレートのウェルに固定され、またはウェルに配置されたビードなどの支持体に固定される。
本発明の方法は、抗体、または抗体フラグメントを固体支持体に付着させるためにも特に有用である。抗体および抗体フラグメントを固体支持体に付着させると同時に特異的結合活性を保持することは、以前は困難であった。本発明の方法を用いて支持に付着することができる抗体フラグメントおよび他の結合部分としては、例えば、抗原−結合フラグメント（Ｆａｂｓ）、Ｆａｂフラグメント、ペプシンフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、ｄｓＦｖｓ、Ｆｄフラグメント、および二重特異性抗体のほか、全長ポリクローナルまたはモノクローナル抗体が挙げられる。他の結合分子、例えば、修飾フィブロネクチン、ＣＴＬ−Ａ４、およびＴ細胞受容体も使用されうる。抗体のアレイは、抗体または抗体フラグメントによって認識される特異的抗原決定基を有する分子のスクリーニングに有用である。
固体支持体−結合ポリペプチドの結合または酵素活性を検出する試薬が当業者に周知である。例えば、特異的に被験分子に結合する抗体または他の結合分子とアレイを接触させることによって特定の被験分子に結合するアレイメンバーを同定することができる。検出分子は一般に検出可能な標識で標識される。適切な検出可能な標識としては、分光学、光化学、生化学、免疫化学、電気的、光学、化学、または他の手段によって検出可能である部分が挙げられる。例えば、適切な標識としては、標識ストレプトアビジン共役で染色するためのビオチン、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光ポリペプチドなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および他のＥＬＩＳＡで通常使用されているもの）、およびコロイド金もしくは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビードなど比色標識が挙げられる。かかる標識の使用を記載した特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，９３９，３５０号明細書、同第３，９９６，３４５号明細書、同第４，２７７，４３７号明細書、同第４，２７５，１４９号明細書、および同第４，３６６，２４１号明細書が挙げられる。蛍光プローブおよび研究化学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（例えば、第９版、モレキュラー プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））も参照。かかる標識を検出する手段は当業者には公知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンタを用いて検出され、蛍光マーカーは放射光を検出する光検出器を用いて検出されうる。比色標識は着色標識を簡単に視覚化することによって検出される。
支持体−結合ポリペプチドの酵素活性は、アレイを基質と接触させ、基質上の酵素の作用によって生成される反応生成物を検出することによって検出されうる。
タンパク質アレイの調製
タンパク質アレイは、第１の反応基を含んで成る少なくとも１つの非天然アミノ酸をポリペプチドへ組込み、固体支持体に付着されている第２の反応基と第１の反応基を反応させ、それによって共有結合を形成し、ポリペプチドを固体支持体へ付着させることによって調製されうる。非天然アミノ酸が、固体支持体に結合（共有または非共有）されるリンカーに結合される他の配置も本発明の特徴である。
多種多様な適切な反応基が当業者には公知である。かかる適切な反応基としては、例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシレート、アルデヒド、エステル、エーテル（例えば、チオ−エーテル）、アミド、アミン、ニトリル、ビニル、スルフィド、スルホニル、ホスホリル、または同様の化学反応基が挙げられうるが、これらに限定されない。追加の適切な反応基としては、マレイミド、Ｎヒドロキシスクシンイミド、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトリロ三酢酸、活性化ヒドロキシル、ハロアセチル（例えば、ブロモアセチル、ヨードアセチル）、活性化カルボキシル、ヒドラジド、エポキシ、アジリジン、スルホニルクロライド、トリフルオロメチルジアジリジン、ピリジルジスルフィド、Ｎ−アシル−イミダゾール、イミダゾールカルバメート、ビニルスルホン、スクシンイミジルカーボネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、アリールアジド、無水物、ジアゾ酢酸塩、ベンゾフェノン、イソチオシアン酸塩、イソシアン酸塩、イミドエステル、フルオロベンゼンが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態においては、反応基の１つは求電子部分であり、かつ第２の反応基は求核部分である。求核部分または求電子部分のいずれかは、非天然アミノ酸の側鎖に付着されうる。次いで、その反応基は、ポリペプチドを固体支持体に結合させる反応において使用される。求核部分と反応し、共有結合を形成する適切な求電子部分は当業者に周知である。かかる求電子部分としては、例えば、カルボニル基、スルホニル基、アルデヒド基、ケトン基、ヒンダードエステル基、チオエステル基、安定イミン基、エポキシド基、アジリジン基などが挙げられるが、これらに限定されない。
求核と求電子剤との間の反応の生成物は通常、例えば、求核部分に最初に存在する原子を組込む。一部の実施形態においては、求電子剤は、使用される求核部分、およびその求核部分と反応する求電子部分（例えば、アルデヒド、ケトン、および／または同様のもの）によって、オキシム、アミド、ヒドラゾン、還元ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、または同様の機能などの反応生成物を含む求核部分を有するアルデヒドまたはケトンである。カルボン酸との結合は通常、カルボヒドラジドまたはヒドロキサム酸と呼ばれる。スルホン酸との結合は通常、スルホニルヒドラジドまたはＮ−スルホニルヒドロキシルアミンと呼ばれる。結果として生じる結合はその後に化学還元によって安定化されうる。
一部の実施形態においては、反応基の１つは求電子剤、例えば、アルデヒドまたはケトンであり、かつ第２の反応基は求核部分である。求核部分または求電子部分のいずれかは、非天然アミノ酸の側鎖に付着されうるとともに、次いで、残りの反応基は、固体支持体に付着される。アルデヒドおよびケトンと反応し、共有結合を形成しうる適切な求核部分は当業者に周知である。かかる求核部分としては、例えば、エチレンジアミンなど脂肪族アミンまたは芳香族アミンが挙げられる。他の実施形態においては、反応基は、−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲＩ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、または−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）であり、ここで各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立してＨ、または１−６個の炭素を有するアルキルであり、好ましくは、Ｈである。本発明の一態様においては、反応基は、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、カルボヒドラジド、またはスルホニルヒドラジドである。
当業者は、本発明で使用される反応基化学反応結果が上記のものに限定されないことを理解する。一例として、他の実施形態においては、第１の反応基と第２の反応基との間の反応は両性剤（ｄｉｐｏｌａｒｏｐｈｉｌｅ）反応によって進行されうる。例えば、第１の反応基はアジドであり、第２の反応基はアルキンでありうる。あるいは、第１の反応基はアルキンであり、第２の反応基はアジドでありうる。アジドおよびアルキン官能基の独自の反応性は、それらをポリペプチドのアレイおよび他の固体支持体への選択的結合のためのきわめて有用な反応物質にする。有機アジド、特に脂肪族アジド、およびアルキンは一般に通常の反応性化学条件に対して安定である。フイスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）付加環化反応は、求核置換ではなく選択的付加環化反応を含むため（例えば、フイスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）、１，３−ＤＩＰＯＬＡＲ ＣＹＣＬＯＡＤＤＩＴＩＯＮ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（パドワ（Ｐａｄｗａ），Ａ．編、１９８４年）、ｐｐ．１−１７６を参照）、アジドおよびアルキン含有側鎖を有する非天然コード化アミノ酸の組込みは、結果として生じるポリペプチドがきわめて高い選択性で修飾されることを可能にする。特に、アジドおよびアルキン官能基の両方は、天然のポリペプチドで見られる２０の通常のアミノ酸に対して不活性である。しかし、近接近に至ると、アジド基およびアルキン基の「バネ荷重」性質が示され、それらはフイスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）［３ ２］付加環化反応によって選択的かつ有効に反応し、対応するトリアゾールを生成する。例えば、チン（Ｃｈｉｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３０１、ｐｐ．９６４−９６７（２００３年）、ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５、ｐｐ．３１９２−３１９３（２００３年）、チン（Ｃｈｉｎ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４、ｐｐ．９０２６−９０２７（２００２年）を参照。アジドまたはアルキン含有ポリペプチドを含む付加環化反応は、現位置、触媒量で、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤の存在下、Ｃｕ（ＩＩ）（例えば、ＣｕＳＯ４の触媒の形で）の添加によって水性条件下、室温で実施されうる。例えば、ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５、ｐｐ．３１９２−３１９３（２００３年）、トルノエ（Ｔｏｒｎｏｅ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６７、ｐｐ．３０５７−３０６４（２００２年）、ロストフチェフ（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４１、ｐｐ．２５９６−２５９９（２００２年）を参照。好ましい還元剤としては、アスコルビン酸塩、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２、Ｃｏ２、および応用電位が挙げられる。
さらに、シュタウディンガーライゲーションおよびオレフィンメタセシス化学反応を含むがこれに限定されない他の反応性化学反応も本発明で使用される（例えば、マハル（Ｍａｈａｌ）ら、（１９９７年）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２７６、ｐｐ．１１２５−１１２８を参照）。
一部の実施形態においては、非天然アミノ酸含有ポリペプチドと固体支持体との間の付着は非共有付着である。この場合、ポリペプチドへ組込まれる非天然アミノ酸は、意図的に選択され、固体支持体上の官能基と強力な非共有相互作用、例えば、イオン相互作用を提供することができる。例えば、適切な酸性基を有する非天然アミノ酸側鎖は、ヒドロキシルまたは他の負電荷基を有する固体支持体との強力な結合を形成する。このシステムの他の変形においては、互いに対する強力な親和性を有する他の種類の部分が非天然アミノ酸側鎖および固体支持体上の反応基へ組込まれうる。例えば、非天然アミノ酸側鎖が適切な反応基を通じてビオチンと結合されうるが、固体支持体がアビジンでコーティングされ、結果として非天然アミノ酸および固体支持体を含有するポリペプチド間にきわめて強力な非共有結合が生じる。
本発明による特定の使用が見出されるポリペプチドと固相との間の非共有相互作用の他の例は、特異的抗体の使用である。この実施形態においては、抗体が非天然アミノ酸側鎖に対して生じうる。その非天然アミノ酸がポリペプチドへ組込まれる場合、かつその抗体が、例えば、マイクロウェルプレートアレイにおける固相に固定される場合は、抗体はポリペプチドを固相に結合するアミノ酸特異的鎖としての機能を果たす。
当業者は、本発明による使用が見出される別の非共有結合システムを即座に認識するであろう。本発明が一例としてのみここで記載された非共有結合に限定されることは意図されていない。
固体支持体
本発明による使用に適切な固体支持体（例えば、アレイ）は、当業者に広く周知である。本発明が特定の種類の固体支持体材料またはアレイ構成に限定されることは意図されていない。当業者は、本発明のタンパク質アレイにおける使用に選択される固体支持体用の材料および構成が、多くの可能性を有するアレイの使用目的に依存することを理解する。
固体支持体は、平坦または平面であり、または実質的に異なる構造を有しうる。例えば、固体支持体は粒子、ビード、ストランド、沈殿物、ゲル、ゾル−ゲル、シート、チュービング、球、容器、毛管、パッド、薄片、フィルム、プレート、ディップスティック、スライドなどとして存在しうる。磁気ビードまたは粒子、例えば、磁気ラテックスビードおよび酸化鉄粒子が、本発明の方法において使用されうる固体基質の例である。磁気粒子は、例えば、米国特許第４，６７２，０４２号明細書に記載されており、例えば、パーセプティブ バイオシステムズ社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）（マサチューセッツ州フラミンガム（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ））、チバ コーニング（Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（マサチューセッツ州メドフィールド（Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，ＭＡ））、バングス ラボラトリーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（インディアナ州カーメル（Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ））、およびバイオクエスト社（ＢｉｏＱｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．）（ニューハンプシャー州アトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ＮＨ））から市販されている。固体支持体は、洗浄の簡便性および費用のために、信号対雑音比を最大限にし、主に背景結合を最小限にするように選択される。また、ビードなど一部の固体支持体は、マイクロウェルプレートなど従来の流体処理システムにおいて容易に使用されうる。かかる従来の流体処理システムによって達成されうる材料の分離を用いて、本発明によるアレイを構成し、例えば、異なる非天然アミノ酸含有ポリペプチドを含んで成るビードを提供し、または異なる試薬と接触させることができ、もしくは両方を行うことができる。
典型的な固体支持体としては、ガラスまたは他のセラミック、プラスチック、ポリマー、金属、半金属、合金、複合材、有機物などが挙げられる。例えば、固体支持体は、シリコン、シリカ、石英、ガラス、細孔性ガラス、炭素、アルミナ、チタニア、酸化タンタル、ゲルマニウム、窒化シリコン、ゼオライト、およびガリウムヒ素より成る群から選択される材料を含んで成る。金、プラチナ、アルミニウム、銅、チタン、およびその合金など多くの金属も固体支持体としての使用に対する選択肢である。さらに、多くのセラミックおよびポリマーも固体支持体として使用されうる。固体支持体として使用されうるポリマーとしては、以下のものを挙げることができるがこれに限定されない。すなわち、ポリスチレン、ポリ（テトラ）−フルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンジフルオリド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ（エーテルエーテル）ケトン、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリビニルフェノール、ポリラクチド、ポリメタクリルイミド（ＰＭＩ）、ポリアトケンスルホン（ＰＡＳ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ポリジメチル−シロキサン、ポリアクリルアミド、ポリイミド、およびブロック−コポリマー。アレイ用の好ましい基質としては、シリコン、シリカ、ガラス、およびポリマーが挙げられる。固体支持体は、単一の材料（例えば、ガラス）、材料の混合物（例えば、コ−ポリマー）、または異なる材料の多重層（例えば、小分子の単層膜でコーティングされた金属、ＢＳＡでコーティングされたガラスなど）から成る。
固体支持体の構成は任意の適切な形態であり、例えば、ビード、球、粒子、顆粒、ゲル、ゾル−ゲル、自己組織化単層膜（ＳＡＭ）または表面（平坦である、または成形特性を有しうる）を含んで成りうる。「固体支持体」なる用語は半固体支持体を含む。固体支持体の表面は平面、実質的に平面、または非平面でありうる。固体支持体は多孔性または非多孔性でありうるとともに、膨潤特性または非膨潤特性を有しうる。固体支持体は、ウェル、凹み、または他の容器、管の形、特徴または位置で構成されうる。複数の固体支持体が、試薬のロボット送達にアドレス可能な種々の位置で、またはレーザーもしくは他の照射およびＣＣＤ、共焦点または偏向集光による走査を含む検出手段によってアレイにおいて構成されうる。
例えば、１つの実施形態において固体支持体はスライドの形でありうる。一般に、当技術分野で使用されているように、スライドは通常、小さく、最も一般的にはプラスチックまたはガラス基質を有する任意の材料で製造されうる。スライドは、化合物の固相沈殿物（例えば、ポリペプチド）を支持するために使用され、時々、きわめて多数のアドレス可能な位置、例えば、何千もの位置を含有するように調製される。スライド上に分析用の化合物を配置する工程は、しばしば「プリンティング」と呼ばれる。スライドシステムは通常、相互作用の検出用に蛍光染料標識を使用し、きわめて小さなスポットを蒸着し、それらを互いにきわめて正確に接近させて配置する自動機械を用いて作成される。例えば、スポットの直径は１００ミクロンの範囲であり、標準の１インチ×３インチのガラススライド上に１０，０００〜３０，０００のスポットを配置することが可能である。スライドアレイは、多数のきわめて高密度のアドレス可能な配位を有する傾向がある。
１つの実施形態においては、スライドまたは他の固体支持体は、表面界面でＳＡＭの親和性相互作用および／または共有結合の結果として形成されうる自己組織化単層膜（ＳＡＭ）を含みうる。ＳＡＭは、シャボン玉または細胞膜の二層構造と同様に集合するが、単一の分子層が固体界面で形成される。ＳＡＭは、末端基に結合された界面結合基を有する分子から集合されうる。ＳＡＭを製造するための方法および分子は、当技術分野で公知である。ＳＡＭは、例えば、アルカンチオール、シラン、脂肪酸、またはホスホン酸塩などの分子の集合でありうる。ＳＡＭの集合のための推進力は、表面上の基との界面結合基の親和性相互作用でありうる。表面上の分子の極性配置は、さらに外部環境との末端基の相互作用によって強化されうる。集合を推進する相互作用は、例えば、疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン誘引、キレート化などでありうる。
他の実施形態においては、固体支持体は、例えば、液相アレイシステム（時々ビードアレイと呼ばれる）で使用されるビード（粒子と同義）の形である。これらのシステムは通常、液体体積を保持する任意の数のウェルを有するマイクロウェルプレート（時々「マイクロタイタートレイ」と呼ばれる）を使用する。通常のマイクロウェル構成としては、どこにでも存在する９６穴プレートが挙げられるが、３８４および１５３６穴プレートも常用される。各ウェルは、平行分析で使用されている特定の成分、例えば、ビードを保持しうる。ビードは、生物、非生物、有機物、無機物、ポリマー、金属、またはこれらのいずれかの組合せを含む基質材料で製造されうる。ビードの表面が化学的に修飾されうるとともに、任意の種類の処理すなわちコーティング、例えば、本発明のポリペプチドとの結合相互作用を可能にする反応基を含有するコーティングにかけられる。
一部の実施形態においては、ビードは、その迅速な単離および／または精製を促進するやり方で生成されうる。例えば、磁気ビードは、磁場を適用し、プレートウェル内の液相からビードを迅速に単離することによって操作されうる。
他の実施形態においては、固体支持体は、ゾル−ゲルを含んで成り、またはこれから成る。ゾル−ゲル技術は公知であり、例えば、カーク・オスマー工業化学百科事典（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第３版および第４版、特に第２０巻、マーチン グレイソン（Ｍａｒｔｉｎ Ｇｒａｙｓｏｎ）、編集主幹、ワイリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ジョン ワイリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）（ニューヨーク州（ＮＹ）、例えば、第２２巻、およびその中の引例。ゾルは、水などの液体、または溶媒中のコロイド粒子（通常、ナノスケールの成分）の分散である。ゾル粒子は通常、十分に小さく、例えば、ブラウン運動によって液体中に懸濁されたままである。ゲルは、サブマイクロメーター規模の相互接続孔を有する粘弾性の物体である。ゾル−ゲルは、ゾルを調製し、ゾルをゲル化し、そしてゾルを懸濁する液体を除去することによってガラス、セラミック、複合材、プラスチックなどの調製において使用される。この工程は、繊維、フィルム、エーロゲルなど（そのいずれかは本発明における固体支持体でありうる）の構成のために多くの比較的低温の工程で使用される。ゾル−ゲルを製造するための３つの一般的な工程が通常、使用される。第１には、コロイド粒子の分散のゼラチン化が行われる。第２には、アルコキシドまたは金属塩前駆体の加水分解および重縮合が行われる。第３には、アルコキシド前駆体の加水分解および重縮合の後、室温下で熟成および乾燥が行われる。さらに詳細については、カーク・オスマーの上掲書を参照。
一般に、固体支持体の表面を調製し、リンカーを付着させ、または直接的に非天然アミノ酸を含んで成るポリペプチドを付着させる適切な反応基を生成することができる。機械的、物理的、電気的、または化学的な手段によって基質上へ上記のものなどの反応基を配置する方法は当技術分野で公知である（例えば、米国特許第４，６８１，８７０号明細書を参照）。
タンパク質（例えば、非天然アミノ酸）および固体支持体上の直接に反応する化学部分に加えて、本発明のアレイにタンパク質を接続するための他の係留機構も使用されうる。かかる係留方法としては、化学的係留、ビオチン仲介結合、固体支持体基質への架橋（例えば、ＵＶ、または蛍光活性架橋）、およびＥｔＯＨまたは他の溶媒によって沈殿され、結合材料を回収しうるＰＥＧなどの「可溶性」基質の使用が挙げられる（ウェントワース（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ），Ｐ．、１９９９年、ＴＩＤＴＥＣＨ、１７、ｐｐ．４４８−４５２も参照）。
リンカー
リンカーは、２つの異種の構造物を結合、延長、または接合する化学部分である。リンカーが本発明でさまざまに使用される。本明細書で用いられるリンカーなる用語は、さまざまな異なる構造物および化学組成物を含む。さらに、本発明のリンカーは、さまざまな異なる目的のために、かつ本発明のタンパク質アレイを有するさまざまな異なる構成において使用されうる。本発明は特定のリンカーの構成または化学組成物に限定されることは意図されていない。リンカーの使用は、当技術分野で広く周知であり、当業者は本発明で使用されうるリンカーの種類の範囲を理解するであろう。
本発明は特定のリンカー構造または構成に限定されることは意図されていない。１つの態様においては、リンカー部分はポリペプチドにおける非天然アミノ酸側鎖上の反応基に結合される。他の態様においては、リンカーは固体支持体反応基と結合されうる。他の態様では、リンカーは、ポリペプチドと固体支持体との間の共有および／または非共有相互作用を用いてブリッジを形成しうる。一部の態様では、リンカーは「スペーサー」としての機能を果たすが、スペーサーの組込みは、付着に使用される化学部分上に回転の自由を加え、かつ立体制限を減少させるために望ましい。
１つの態様においては、リンカーは、非天然アミノ酸側鎖上の反応基によってポリペプチドを固体支持体に付着させるために使用される。他の実施形態では、リンカーは、固体支持体上の反応基を非天然アミノ酸上の反応基と共有結合する化学部分である。適切なリンカーは当業者には周知であり、適切なクラスの化合物からのものを含む。有機酸、アルデヒド、アルコール、チオール、アミンなどのポリマーまたはコポリマーが適切なリンカーの例である。例えば、グリコール酸、乳酸、セバシン酸、またはサルコシンなどのヒドロキシ−、アミノ−、またはジ−カルボン酸のポリマーまたはコポリマーが使用されうる。あるいは、エチレングリコール、プロピレングリコール、糖類などの飽和または不飽和炭化水素のポリマーまたはコポリマーを使用しうる。好ましくは、リンカーは、付着ポリペプチドが同じ溶液中で分子と自由に相互作用することを可能にする適切な長さでなければならない。
１つの実施形態においては、リンカーは、すでに固体支持体上の反応基と反応するリンカー上の適切な官能基によって固体支持体の表面に付着される。例えば、ヒドロキシル基を有する固体支持体では、ヒドロキシル基をリンカーのトリクロロシリルまたはトリサルコキシ基と反応させることによってシロキサン結合を形成しうる。他の適切な結合、およびそれらを形成するように反応されうる官能基としては、チオエーテル（チオールのマレイミドまたはアクリルアミドとの反応物）、ジスルフィド（チオールとともに活性化ジスルフィド）、ヒドラゾン（ヒドラジンまたはヒドラジドとともにアルデヒドまたはケトン）、セミカルバゾン（セミカルバジドとともにアルデヒドまたはケトン）、オキシム（アミノオキシアセチルとともにアルデヒドまたはケトン）、チオセミカルバゾン（チオセミカルバジドとともにアルデヒドまたはケトン）、およびチアゾリジン（アルデヒドおよびシステイン）が挙げられる。リンカーは、固体支持体に非共有付着もされうる。例えば、支持体またはリンカーのいずれかはビオチン部分に接合されうるが、これはアビジンを示す共役パートナーに強い非共有結合を形成する。ヒドラジン誘導化リンカーは、例えば、キルヒホフ（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ）ら（２００１年）、Ｊ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍ．、３、ｐｐ．７１−７７に記載されている。
ポリペプチドと固体支持体との間の結合は、種々の構成でリンカーを組込む。例えば、リンカーは、ポリペプチドに付着される反応基に不可欠であり、固体支持体に付着される反応基に不可欠であり、または２つの別個のリンカーは、一方が非天然アミノ酸反応基に結合し、他方が固体支持体反応基に結合するシステムに存在しうる。リンカーは、他方と反応する前にポリペプチドまたは固体支持体のいずれかと反応しうる。例えば、リンカーが固体支持体の一部を形成する場合、ポリペプチドは、リンカーが固体支持体に付着する前後にリンカー上の反応基と反応しうる。あるいは、リンカーは、ポリペプチドおよび固体支持体上の反応基と無関係であり、その反応基と反応し、ポリペプチドと固体支持体との間にリンカーブリッジを形成しうる。
ポリペプチドを固体支持体と結合するために使用されるリンカーが共有結合に限定されることは意図されていない。リンカーは、適切な官能基を提供し、ポリペプチドと固体支持体との間に非共有、例えば、イオン相互作用を形成しうる。例えば、固体支持体へのリンカー結合はビオチニル化されるが、ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の側鎖は反応基を通じてアビジン部分と結合されうる（逆もまた同様）。
本発明の種々の実施形態が、特にポリペプチド内の非天然アミノ酸環側鎖と固相との間の付着におけるリンカーの組込みための種々の構成に関して図１Ａ〜１Ｉに示されている。図面の各パネルは、固体支持体に付着したポリペプチドの異なる構成を示す。本発明が図１に示された構成に限定されることは意図されていない。これらの図において、非天然アミノ酸（２−斜交平行模様）がポリペプチド内の末端位置で示されている（１）。しかし、非天然アミノ酸がこの位置に限定されることは意図されておらず、非天然アミノ酸はポリペプチド内のどこでも位置付けられうる。同様に、固体支持体（３−格子縞模様）は、ウェル、例えば、マイクロウェルプレートとして示されている。本発明がこの種類の固体支持体に限定されることは意図されておらず、他の多くの種類の固体支持体（例えば、ビード）も本明細書で論じられるように本発明で使用される。図１Ａ〜１Ｉでは、ポリペプチド内（１）の非天然アミノ酸（２）の側鎖上および固体支持体上（３）の反応基が星印で示されている。星印は反応基のすべてを示すために使用されているが、反応に関与する２つの反応基が「および通常、２つの反応基が直接互いと反応する実施形態においては」別個の化学的に異なる部分を示しうることが理解される。
図１Ａはポリペプチド（１）内の非天然アミノ酸（２）の側鎖を含んで成り、またはこれに結合される反応基と固体支持体（３）との間の相互作用を示し、ここで適切な反応基が非天然アミノ酸側鎖および固体支持体上に存在する。図１Ａに示されているように、これらの反応基が直接的に反応し、ポリペプチドと固体支持体との間の共有結合（４−充実バー）を形成する。
図１Ｂは、非天然アミノ酸（２）の側鎖上の反応基と固体支持体（３）との間の相互作用を示し、ここで固体支持体（３）と結合された反応基は、固体支持体に付着しているリンカー（５−斑点模様）で示されている。反応基の反応は、結果として、組入れられたリンカー部分（５）の添加によりポリペプチド（１）と固体支持体（３）との間の共有付着が生じる。図１Ｃは、反応基を含有するリンカー（５）が、固相の代わりにポリペプチドにおける非天然アミノ酸（２）の側鎖と結合していることを除き、図１Ｂと同様の構成を示す。
図１Ｄは、ポリペプチド（１）が、ブリッジとして作用するリンカー（５）によって固体支持体（３）に結合される構成を示す。この配置においては、リンカー（５）は２つの反応基を有し、ここで反応基の１つは非天然アミノ酸（２）の側鎖上の反応基と反応し、リンカー（５）上の他の反応基が同時に固体支持体と反応する。
図１Ｅおよび１Ｆは、図１Ｄのシナリオの変形を示すが、ここでリンカーブリッジの形成が段階的に生じる。例えば、図１Ｅに示されているように、自由なリンカー部分（５）は最初に固体支持体との反応の前に非天然アミノ酸（２）の側鎖と反応しうる。あるいは、図１Ｆに示されているように、リンカー（５）は、ポリペプチド上の反応基との反応前に固相と反応しうる。
本発明は、ポリペプチドと固相との間の付着が共有付着であるタンパク質アレイに限定されない。例えば、図１Ｇに示されているように、ポリペプチド（１）における非天然アミノ酸（２）は、固体支持体上に存在する適切な負電荷部分（７−丸で囲んだ−で表示）とイオン相互作用を形成しうる正電荷（６−丸で囲んだ＋で表示）を有しうる。
本発明は、ポリペプチド（１）と固体支持体（３）との間の非共有結合が適切な相互作用部分のペア（８と９）との間の強い相互作用によって仲介されるタンパク質アレイシステムも提供する。例えば、非共有相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用であり、またはポリペプチドと小分子、例えば、ビオチン−アビジンのペアもしくは受容体または抗体と同種のリガンドとの間の相互作用でありうる。この状況は、図１Ｈおよび１Ｉに示されている。図１Ｈは、適切なパートナー（９）と相互作用する結合部分（８）を示し、ここで結合部分８はポリペプチド（１）上の非天然アミノ酸側鎖（２）の不可欠な部分である。図１Ｉは、結合部分８（例えば、ビオチン分子）が固体支持体、例えば、ストレプトアビジンポリペプチド上の結合部分（９）との反応前の反応ステップにおいて非天然アミノ酸（２）の側鎖に付着することを除き、図１Ｈと同様の状況を示す。
アレイ構成およびポリペプチドスポッティング
本発明は、状況に応じて適切なパターンで固体支持体と固体支持体に適用されるポリペプチドとを含んで成るタンパク質アレイを提供する。パターン化されたアレイでポリペプチドを有すると、明白なアドレス可能な位置に各ポリペプチドを配置することによってハイスループット平行分析が促進され、ここでアレイ上の特定の位置に適用された試薬は、アレイ上の他のアドレス可能な位置に適用された試薬と異なりうる。１つの実施形態においては、ポリペプチドは、その支持体上でその位置からポリペプチドの識別を可能にするやり方で固体支持体上にスポッティングされる。各ポリペプチドは、他のポリペプチドとは別に、支持体上の個別位置でスポッティングされる。１つの実施形態においては、同じポリペプチドがアレイの各アドレス可能な位置に適用される。他の実施形態においては、異なるポリペプチドがアレイの異なる位置に適用される。あるいは、２つもしくはそれ以上のポリペプチドの混合物がアレイ上の個別領域に付着されうる。さらに他の実施形態においては、固体支持体はアレイに配置され、例えば、固体支持体は非天然アミノ酸を含有するタンパク質に結合されたビードでありうるが、ここでビードは利用しやすいパターンで（例えば、１つもしくはそれ以上のマイクロウェルプレートのウェルで）配置される。
アレイは、任意の数のアドレス可能位置および任意の数の独自のポリペプチド種を含有しうる。本発明のタンパク質アレイ上のすべての位置は、ポリペプチドで占有される必要はなく、例えば、位置またはウェルはアレイ上で非占有のままでありうる。１つの実施形態においては、タンパク質アレイは、アレイ上の複数の位置にスポッティングされた単一（もしくはそれ以上の）ポリペプチド種を含んで成る。他の実施形態においては、タンパク質アレイは少なくとも約１０個のポリペプチド種を含んで成る。他の実施形態においては、アレイは少なくとも約５０個のポリペプチド種、少なくとも約１００個のポリペプチド種、または少なくとも約１０００個のポリペプチド種を含んで成る。さらにハイスループット用途の他の実施形態においては、ポリペプチドのアレイは、１０４個、１０５個、または１０６個もしくはそれ以上のポリペプチド種を含んで成りうる。
本発明によって提供されるタンパク質アレイ上のポリペプチドスポットの密度は、制限なしに変動しうる。密度は、例えば、ｃｍ２当り少なくとも１０００個のポリペプチドスポットでありえ、他の実施形態においては、ｃｍ２当り少なくとも１５００個のポリペプチドスポットでありうる。他の態様においては、本発明は、ポリペプチドまたはポリペプチドの混合物で均一にコーティングされる固体支持体を提供する。これらのポリペプチドコーティングされた固体支持体は、例えば、バイオセンサーとして、かつ支持体−結合ポリペプチドの個別領域が異なるアッセイ試薬と接触する（例えば、各領域がタンパク質活性の異なる推定上のモジュレーターと接触しうる）アッセイを実施するために有用である。
単一の固体支持体は、２個以上のポリペプチドのアレイを含みうる。かかる場合、特定のポリペプチドが一般に固体支持体上の複数の場所、少なくとも複数のアレイのそれぞれの１つの領域に付着される。好ましくは、特定のポリペプチドは、各アレイの他のアレイ化ポリペプチドに対して同じ位置に付着される。
一部の実施形態においては、ポリペプチドは、スポット間の間隔が、市販のマイクロウェルプレート（例えば、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６、または他のマイクロウェルプレート構成）のウェル間の間隔に適合または対応するようにスポッティングされる。他の実施形態においては、ポリペプチドは、各アレイの位置がマイクロウェルプレートのウェル間の間隔に適合または対応するように複数のアレイでスポッティングされる。これによりポリペプチドに全アレイに対する多数の化合物または他の被験薬のハイスループットアッセイを実施する手段が提供される。
例えば、単一または多重チャネルピペットマン、注射器、キャピラリーチューブなどを用いて、ポリペプチドを固体支持体上へ手動でスポッティングすることができる。一部の実施形態においては、ポリペプチドは、当技術分野で周知のものなどの機械またはロボットによって支持体上へスポッティングされる。適切な高精度、コンタクト−プリンティングロボットの一例は、ＧＭＳ４１７アレイヤー（Ａｒｒａｙｅｒ）（アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、カリフォルニア州サンタクララ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））である。ピンツールもポリペプチドを固体支持体上へスポッティングするために適切である。ポリペプチドスポッティングのための適切な方法の他の例は、フラワー（Ｆｌｏｗｅｒｓ）らによって１９９９年７月２２日に公開された「基質上の沈殿液状検体、結果として得られる秩序アレイ、沈殿アレイの分析法（ＤＥＰＯＳＩＴＩＮＧ ＦＬＵＩＤ ＳＰＥＣＩＭＥＮＳ ＯＮ ＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳ，ＲＥＳＵＬＴＩＮＧ ＯＲＤＥＲＥＤ ＡＲＲＡＹＳ，ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＦＯＲ ＡＬＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＤＥＰＯＳＩＴＥＤ ＡＲＲＡＹＳ）」と称する国際公開第９９／３６７６０号パンフレットに記載されている。ロボットを用いてナノリットルスケール体積のポリペプチドサンプルを固体支持体に送達し、直径約１５０〜２００μｍ（平方センチメートル当り１６００個のスポット）のスポットを得ることができる。
１つの実施形態においては、ポリペプチドは、非天然アミノ酸側鎖上の反応基と固体支持体に付着した反応基との間の必要な反応に適切である反応混合物において提供される。アルデヒドまたはケトンとヒドラジン誘導体など求核部分との間の求核反応では、わずかに酸性のｐＨが一般に好ましく、感知できるほどごく少量のカルボニル基がプロトン化されるのに十分に酸性であるが、遊離窒素化合物の濃度が低すぎるほど酸性でないことが好ましい。一部の実施形態においては、ポリペプチドは、調製、貯蔵、およびポリペプチドの変性を予防するアレイのアッセイの全体を通じて水和したままである。したがって、グリセロール、ポリエチレングリコール、グリセリン、マルチトール、ポリデキストロース、ソルビトール、セチルアルコール、脂肪アルコール、プロピレングリコールなどの保湿剤またはポリマーを用いてナノドロップの蒸発を予防することができる。有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ）中または部分的水溶液（例えば、水中１０％ＤＭＳＯ）中にポリペプチドを提供することもできる。
任意の長さのポリペプチドを本発明のタンパク質アレイにより使用される。アレイで使用されるポリペプチドの長さがいかなる点でも制限されることは意図されていない。１つの実施形態においては、タンパク質アレイは全長ポリペプチドを含んで成る。他の実施形態においては、アレイは天然ポリペプチドのフラグメントまたは一部分を含んで成る。一部の実施形態においては、タンパク質アレイは、天然ポリペプチドと相同性である少なくとも１つのポリペプチドを含んで成る。
一部の実施形態においては、固体支持体に付着した少なくとも１つのポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸の長さである。他の実施形態においては、本発明は、固体支持体に付着した少なくとも１つのポリペプチドが１００アミノ酸もしくはそれ以上の長さであるアレイを提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、付着ポリペプチドの少なくとも１０％、５０％、８０％、９０％、または１００％が少なくとも５０アミノ酸の長さ、もしくは少なくとも１００アミノ酸の長さであるタンパク質アレイを提供する。
多くのアレイ化方法がポリペプチドのアレイ化のために公知である。一般的な方法としては、材料のスポッティング、チップ−マスキング光合成法、およびその他多くが挙げられる。オーズべル（Ａｕｓｂｅｌ）におけるものに加えて、タンパク質ベースのアレイの例としては、種々の高性能免疫アレイ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ａｒｒａｙｉｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｅｉｎ−ａｒｒａｙｓ／、ホルト（Ｈｏｌｔ）ら（２０００年）「バイパス選択：タンパク質アレイを用いる抗体−抗原相互作用の直接スクリーニング（Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ｄｉｒｅｃｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｒａｙｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（１５）Ｅ７２−ｅ７２を参照）、超タンパク質アレイ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｅｒａｔｏ／ｐｒｏｊｅｃｔ／ｎｔｓ＿Ｐ／ｎｔｓ＿Ｐ．ｈｔｍｌを参照）、酵母２および他の「ｎ」ハイブリッドアレイシステム（ウエツ（Ｕｅｔｚ）ら（２０００年）「サッカロマイセス・セレヴィシエにおけるタンパク質−タンパク質相互作用の包括的分析（Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ４０３、ｐｐ．６２３−６２７、およびビダール（Ｖｉｄａｌ）とレグレイン（Ｌｅｇｒａｉｎ）（１９９９年）「Ｙｅａｓｔ ｆｏｗａｒｄ ａｎｄ ｒｆｅｖｅｒｓ‘ｎ’−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７（４）、ｐｐ．９１９−９２９を参照）、ユニバーサルタンパク質アレイまたは「ＵＰＡ」システム（ゲー（Ｇｅ）ら（２０００年）、「タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡ、およびタンパク質−リガンド相互作用の量的検出のためのＵＰＡ、ユニバーサルアレイシステム（ＵＰＡ，ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ，ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ，ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８（２）、Ｅ３−ｅ３）などが挙げられる。
アレイ構造に関する詳細は、フォトリトグラフィ／マスキング法を含めて、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号明細書、国際公開第９８／５６９５６号パンフレット、フォドー（Ｆｏｄｏｒ）ら、国際公開第９２／１００９２号パンフレット、およびハベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）米国特許第５，５７１，６３９号明細書において確認される。
種々の形態のタンパク質アレイを用いるプロテオミクス法は、多くの研究者によって利用されており、当技術分野で公知である。例えば、ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら（２０００年）「バイオセンサーチップ質量分析：チップベースのプロテオミクス法（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ａ ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１（６）、ｐｐ．１１５５−６３（イントリンシック バイオプローブス社（Ｉｎｓｔｒｉｎｓｉｃ Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（アリゾナ州テンペ（Ｔｅｍｐｅ，ＡＺ））、ｉｂｉ＠ｉｎｆｉｃａｄ．ｃｏｍも参照）は、２つの一般的な装置のインターフェイス、表面プラスモン共鳴−生体分子相互作用分析（ＳＰＲ−ＢＩＡ）、およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を、タンパク質の機能的および構造的特徴における使用の単一の協調方法へ記載している。また、生体分子相互作用分析−質量分析（ＢＩＡ−ＭＳ）が、タンパク質およびタンパク質−タンパク質相互作用の詳細な特徴、およびチップベースのプロテオミクス法としてのバイオセンサーチップ質量分析（ＢＣＭＳ）の開発について記載されている。この方法は、適切なタンパク質アレイを構成し、ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）らによって言及された方法に従うことによって本発明に適用されうる。
液相アレイに加えて、本明細書で言及された用途の一部において好ましい構成要素を固相アレイに保存または固定されうる。これらのアレイは、空間的にアクセス可能な模様（例えば、行と列の格子）で膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）、ポリマーまたはセラミック表面、ガラス表面、金属表面などの固体基質上へ材料を固定する。構成要素は、例えば、局所再水和（例えば、ピペットまたは他の流体処理要素）および流体移送によって、もしくはアレイのスクレーピングまたはアレイ上の当該部位の切除によってアクセスされうる。
マイクロウェルプレートアレイ
さまざまなアレイ構成のいずれかを本明細書のシステムにおいて使用されうる。本明細書の方法およびシステムで使用される１つの一般的アレイ形式は、マイクロタイタープレートアレイであり、ここでアレイはマイクロタイタートレイのウェル内に（例えば、アレイ構成要素をプレートに固定することによって、または構成要素を、その後にプレートのウェルに配置し、アレイを提供するビードなどの固相材料に固定することによって）設けられる。かかるトレイは市販されており、トレイ当りさまざまなウェルサイズおよびウェル数のほか、アッセイのまたはアッセイ構成要素の結合のためのさまざまな機能化表面のいずれかとともに注文されうる。一般的なトレイとしては、どこにでも存在する９６穴プレートが上げられるが、３８４および１５３６穴プレートも一般に使用されている。
したがって、１つの代表的な実施形態においては、アレイはマイクロウェルプレート内またはその上に構成され、自動液体処理のために提供される。例えば、ポリペプチドはビードに結合されうるが、これはその後に従来の流体処理方法を用いて流体処理およびサンプルプロセッシングのためのマイクロウェルプレートに送達されうる。マイクロウェルプレートを処理する多くの自動システムが市販されている。例えば、さまざまな自動化システムが、ザイマーク社（Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ザイマーク センター（Ｚｙｍａｒｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、マサチューセッツ州ホプキントン（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ））から市販されているが、さまざまなザイマーク（Ｚｙｍａｒｋ）システム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍａｒｋ．ｃｏｍ／も参照）が利用されており、一般的に挙げられるのは、例えば、ロボットおよび流体処理モジュールである。同様に、例えば、マイクロタイタートレイ操作のためにさまざまな実験室系で使用されるコモンＯＲＣＡ（登録商標）も、例えば、ベックマン コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））から市販されている。
同様に、本発明により製造される粒子のアレイを微小規模の微小流体システムに配置され、ここで分析されうる。本発明のアレイを含んで成る微小流体システムが製造されうるが、ここで粒子は微小規模のシステムに制御可能に流され、または固定され、構成要素のアレイを提供し、次いでこれらは従来の微小流体システムによって評価される。微小流体システムにおいては、自動流体処理および他のサンプル操作が微小規模のレベルで制御される。かかるシステムは現在、市販されており、以下で詳細に述べられている。
バイオセンサー
一部の実施形態においては、本発明は、ａ）固体支持体に付着しているリンカーに付着した求核部分と、ｂ）ポリペプチドへ組込まれている非天然アミノ酸の側鎖に付着したケトまたはアルデヒド部分との間の求核添加反応の反応生成物を含んで成る結合によって固体支持体に化学的に付着した１つもしくはそれ以上のポリペプチドから成るバイオセンサーを提供する。
一般的な種類のバイオセンサーは、電流またはインピーダンス測定要素と結合した電極表面から成る。これらのバイオセンサーは、リガンド−受容体結合事象の存在に反応して電流またはインピーダンスの変化を検出する（例えば、米国特許第５，５６７，３０１号明細書参照）。
他の種類のバイオセンサーは重力測定バイオセンサーである。これらは、その周波数、波長、および／または共鳴状態が結晶表面上の表面質量の変化に感受性である表面音波を生成する圧電性結晶を使用する。したがって、音波特性の変動は、例えば、リガンド−受容体結合事象による表面質量の変化を示す。重量測定バイオセンサーは、例えば、米国特許第５，４７８，７５６号明細書、および同第４，７８９，８０４号明細書に記載されている。
表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）効果もバイオセンサーにおいて使用されうる。例えば、米国特許第５，４８５，２７７号明細書、および同第６，４９２，８４０号明細書を参照。これらの装置は、擾乱、例えば、ＳＰＲ界面での結合事象とともに生じるＳＰＲ表面反射角の変動を使用する。バイオセンサー表面での光学特性の変化を使用するバイオセンサー（例えば、米国特許第５，２６８，３０５号明細書を参照）も本発明の方法を用いて製造されうる。
本発明のバイオセンサーは、１つもしくはそれ以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドを、本明細書で記載されているように、適切な反応基を示すバイオセンサー表面に対して反応させることによって調製される。一部の実施形態においては、固定化ポリペプチドは、リガンドに特異的に結合する抗体または他のポリペプチドである。
保護／脱保護
非天然アミノ酸含有ポリペプチドおよび／または固体支持体上に存在する官能基（特に反応性部分）が、保護形態で提供され、その後に接合または他の化学反応前に脱保護されうる。化学保護／脱保護ステップの使用は化学反応において広く使用されており、保護／脱保護のための試薬が当業者には広く周知である。
１つの実施形態においては、化学基の保護／脱保護が、例えば、適切に保護された化学反応性部分で均一にコーティングされている固体支持体の特異的パターンで光脱保護を用いることによって、固体支持体上にパターン形成を提供する基礎として使用されうる。均一にコーティングされた表面上の種々パターンをマスキングすることによって固体支持体（例えば、アレイ）上のポリペプチドのパターンを形成する光反応性化学反応の使用は、当技術分野で周知であり、種々の情報源、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号明細書、および同第５，５７１，６３９号明細書に記載されている。
種々の保護基が本発明のタンパク質アレイにおいて使用され、これらは保護されるべき特定の官能基および合成において使用される方法に基づき選択される。本明細書で用いられる「保護基」なる用語は、分子中の１つの反応性部位を遮断すると同時に化学反応が他の反応性部位で行われ、または固体支持体の１つもしくはそれ以上の領域を遮断すると同時に反応が固体支持体の異なる領域で行われるように設計されている基のいずれかを指す。適切な保護基としては、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら「有機化学における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２版、ジョン ワイリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）、１９９１年に記載されているものが挙げられる。一部の実施形態においては、ＮＶＯＣ、ＭｅＮＰＯなどの感光保護基が使用される。他の実施形態においては、ＦＭＯＣ、ＤＭＴなどの化学方法、および当業者に周知の他の方法によって除去可能である保護基が使用される。また、保護／脱保護反応は、本発明のタンパク質アレイで使用されるリンカーまたはスペーサーで見られる化学基とともに使用されうる。
システムおよびキット
本発明のシステムは、本発明のアレイまたはバイオセンサーを、通常、アレイへまたはアレイから試薬を送達するためのアレイリーダーおよび／または流体処理構成要素と組み合せて含みうる。
アレイリーダー
多くのアレイ／バイオセンサーリーダーが市販されており、本発明のアレイとともに使用され、本発明のシステムを提供することができる。これらにはマイクロプレートリーダー、チップリーダーなどが含まれる。かかるリーダーは通常、光学検波器、かつ、しばしば、レーザー、ダイオードなどを含み、アレイのメンバーを励起する（例えば、アレイが蛍光または発光部分を含んで成る場合）。別のリーダー構成は、放射能検出器（１つもしくはそれ以上のアレイの特徴が放射性である場合）、電位差計、ｐＨ検出器、などを含みうる。市販のアレイリーダーは、アフィメトリック（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）（カリフォルニア州（ＣＡ）、サンタクララ）およびその他多くか入手可能である。
アレイリーダーは、顕微鏡またはＣＣＤおよびアレイから生成された情報を確認または記録するための適切なソフトウェアを有するコンピュータを含みうる。本明細書で言及された種々の製品の製造者の多くからの製品の製造者の情報に加えて、検出プロトコールおよびシステムが公知である。例えば、例えば検出方法を記載する、基本的な生物ルミネセンス法および検出方法は、ラロッサ（ＬａＲｏｓｓａ）編、（１９９８年）、生物ルミネセンス法およびプロトコール：分子生物学における方法（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１０２巻、ヒューマナ プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）（ニュージャージー州トワタ（Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ））を含む。デジタル画像処理を含む基本的な光学顕微鏡検査法は、例えば、ショットン（Ｓｈｏｔｔｏｎ）（編）（１９９３年）、電子光学顕微鏡：最新バイオメディカル顕微鏡検査（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ワイリー・リス社（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）（ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ））に記載されている。蛍光顕微鏡検査法は、例えば、ヘルグマン（Ｈｅｒｇｍａｎ）（１９９８年）、蛍光顕微鏡検査（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、バイオス サイエンティフィック パブリッシャーズ（Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）（英国、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ））に記載されている。特殊なイメージング装置および多数の画像をスクリーニングする方法も記載されており、例えば、「突然変異酵素を発現する細胞をスクリーニングするための微小コロニー撮像装置（ＭＩＣＲＯＣＯＬＯＮＹ ＩＭＡＧＥＲ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ ＦＯＲ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＣＥＬＬＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＭＵＴＡＧＥＮＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥＳ）」、ブイリーナ（Ｂｙｌｉｎａ）らへの米国特許第５，９１４，２４５号明細書、「高解像顕微鏡検査のための吸収スペクトル判定法．．．（ＡＢＳＯＲＢＴＩＯＮ ＳＰＥＣＴＲＡ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＨＩＧＨ ＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ ＩＭＡＧＩＮＧ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＥ．．．」、ヤング（Ｙａｎｇ）への米国特許第５，８５９，７００号明細書、「顕微鏡検査における蛍光共鳴エネルギーの検定．．．（ＣＡＬＩＢＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ ＥＮＥＲＧＹ ＩＮ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ．．．）」、国際公開第９８５５０２６号パンフレット（ブイリーナ（Ｂｙｌｉｎａ）ら）、「可変光学フィルターを有する光学装置（ＯＰＴＩＣＡＬ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ ＨＡＶＩＮＧ Ａ ＶＡＲＩＡＢＬＥ ＯＰＴＩＣＡＬ ＦＩＬＴＥＲ）」、ヤング（Ｙａｎｇ）とユーバン（Ｙｏｕｖａｎ）、米国特許第５，８５２，４９８号明細書、ユーバン（Ｙｏｕｖａｎ）（１９９９年）、「画像分光法および固相スクリーニング（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」、ＩＢＣ世界酵素技術会議（ＩＢＣ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｉｒｏｓ．ｃｏｍ／である。これらのシステムからのリーダーを本発明へ組込み、実質的に実際的な形成で本発明のアレイを読むために適切であるシステムを提供することができる。
さらに、非標準アレイ形式が使用される場合、または非標準アッセイがアレイリーダーによって検出される場合、一般的な検出器構成要素を用いて適切なアレイリーダーを形成することができる。例えば、一般的な検出器としては、例えば、分光光度計、蛍光検出器、顕微鏡（例えば、蛍光顕微鏡検査用）、ＣＣＤアレイ、シンチレーション計数装置、ｐＨ検出器、熱量検出器、光ダイオード、カメラ、フィルムなどのほか、その組合せが挙げられる。適切な検出器の例は、当業者には周知のさまざまな商業的供給源から広く入手可能である。
シグナルは、好ましくは、アレイリーダーによって、例えば、光学検出システムを用いてモニタリングされる。例えば、蛍光ベースシグナルは通常、例えば、システム内の蛍光インジケーターを作動するための適切な波長でレーザーまたはＬＥＤ光源を使用するレーザーまたはＬＥＤ活性化蛍光検出システムにおいて用いることによってモニタリングされる。次いで、適切な検出器要素、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）、ＣＣＤ、顕微鏡などを用いて蛍光が検出される。同様に、比色シグナルを使用するスクリーンのために、サンプルでの光源を検出する分光光度検出システムが使用され、サンプルの吸光度または透過率の測定値が得られる。光学構成要素の一般的な供給源については、Ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１、２、３、４巻（ラウリン パブリッシング社（Ｌａｕｒｉｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）（Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ Ｃｏｍｍｏｎ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１１４６、マサチューセッツ州ピッツフィールド（Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ））によって毎年出版）も参照。
別の態様においては、アレイリーダーは、システムの特定の特徴を検出する非光学検出器またはセンサを含んで成る。かかるセンサは場合により温度センサ（例えば、アレイの生成物、またはアレイ構成要素の反応が反応物中の熱を発生し、または吸収する場合、または反応がＰＣＲまたはＬＣＲにおけるように熱の循環を含む場合に有用）、伝導性、電位差計（ｐＨ、イオン）、アンペロメトリー（酸化または還元されうる化合物、例えば、Ｏ２、Ｈ２Ｏ２、Ｉ２、酸化可能／還元可能有機化合物などのために）、質量（質量分析）、プラスモン共鳴（ＳＰＲ／ＢＩＡＣＯＲＥ）クロマトグラフィー検出器（例えば、ＧＣ）などを含む。例えば、受容体−リガンド結合のｐＨ効果を示すｐＨ指示薬をアレイリーダーへ組込むことができ、ここで結合によるわずかなｐＨの変化が検出されうる。ウェーバー（Ｗｅａｖｅｒ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８年）６、ｐｐ．１０８４−１０８９も参照。
１つの従来のシステムは、アレイがＣＣＤカメラに取付けられている試料フィールドからの光を有する。ＣＣＤカメラ一連のピクチャーエレメント（ピクセル）のアレイを含む。試料からの光はＣＣＤ上で撮像される。基質の領域に対応する特定のピクセルがサンプリングされ、各位置の光度の数値を得る。多数の位置が平行に処理され、各位置からの光の強度について調べるために必要な時間が削減される。他の多くの検出システムは当業者には周知である。
アレイリーダーによって得られた（かつ場合により記録された）データは通常、例えば、画像データをコンピュータシステムでデジタル化し、その画像を保存および分析することによって処理される。さまざまな市販の周辺機器およびソフトウェアが、シグナルまたは画像をデジタル化、保存、および分析するために利用可能である。検出装置からのシグナルを配列情報、反応率などに変換するためにコンピュータが一般的に使用される。反応率を測定し、またはアレイ化構成要素からの生成物の形成をモニタリングするためのソフトウェアが利用可能であり、もしくはビジュアルベーシック（Ｖｉｓｕａｌｂａｓｉｃ）、フォートラン（Ｆｏｒｔｒａｎ）、ベーシック（Ｂａｓｉｃ）、ジャバ（Ｊａｖａ）など標準のプログラミング言語を用いて当業者によって容易に構成され、あるいはエクセル（Ｅｘｃｅｌ）またはアクセス（Ａｃｃｅｓｓ）などシンプルなエンドユーザー用アプリケーションへプログラム化することもできる。リーダーに結合されたコントローラまたはコンピュータは場合により、陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ装置、フラットパネルディスプレイ装置（例えば、アクティブマトリクス液晶ディスプレイ装置、液晶ディスプレイ装置）、その他である場合が多いモニターを含む。コンピュータ回路は多くの場合、例えばマイクロプロセッサ、メモリー、インターフェイス回路など多くの集積回路チップを含むボックスに配置されている。このボックスも場合により、ハードディスクドライブ、フロッピーディスクドライブ、高容量リムーバブルドライブ、および他の要素を含む。キーボード、マウス、またはタッチスクリーンなどの入力装置は場合により、ユーザーからシステムへの入力に備えられる。
アレイメンバーによって製造され、これに結合され、またはこれによって修飾されうる分子を検出または精製するために任意の利用可能なシステムをシステムへ組込むことができる。一般的な生成物同定または精製要素としては、ゲルおよび毛管ベースのポリマー溶液のほか、親和性マトリクス、リポソーム、マイクロエマルジョン、微小液滴、プラスモン共鳴検出器（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）、ＧＣ検出器、共焦点蛍光検出器、蛍光検出器、蛍光アレイ、ＣＣＤ、光学センサ（例えば、紫外線または可視光センサ）、ＦＡＣＳ検出器、温度センサ、質量分析計、立体特異性生成物検出器、結合Ｈ２Ｏ２検出システム、酵素、酵素基質、ＥＬＩＳＡ試薬もしくは他の抗体仲介性検出要素（例えば、抗体または抗原）、質量分析などのサイズ／チャージベースの電気泳動ユニットが挙げられる。使用される特定のシステムは、使用されるアレイ、所望の処理量、および利用可能な設備によって決まる。
アレイからの二次生成物の形成は、過酸化物の形成、熱、エントロピー、質量の変化、電荷、蛍光、ルミネセンス、共焦点蛍光、吸光度を検出することによって、もしくは一次生成物との関連で既述されている他の技術または基質と生成物との間の接触から生じる生成物活性の検出によってモニタリングされうる。一般に、生成物検出器／アレイリーダーはタンパク質検出器となり、システム精製機構は、一般に生成物精製について言及されたものなどタンパク質精製手段を含むことになる。しかし、核酸（例えば、アレイの開裂または合成生成物）もアレイの生成物でありうるとともに、同様に検出されうる。
アレイメンバーは、生成物同定モジュールの近くに移動させることができ、またはその逆もありうる。例えば、このシステムでは、リーダーまたはアレイのいずれかのｘｙｚ移動を（例えば、本明細書に記載されている従来のロボット工学によって）行い、それによってリーダーをアレイの近くに移動させることができる。同様に、アレイメンバーは、生成物同定モジュールの近くへ流されうる。インラインまたはオフライン精製システムでは、反応生成物またはアレイメンバーを結合材料から精製することができる。
流体処理器
自動システム構成要素では通常、例えば、さまざまな自動実験法のための基本的な構成要素として使用されているマイクロタイタートレイなど試薬貯蔵システムへ、またはこのシステムから材料を移すための反復流体処理操作（例えば、分注）が行われる。同様に、このシステムにより、例えば、マイクロタイタートレイが操作され、温度、光もしくは空気への曝露などのさまざまな環境的条件が制御される。これらの流体処理器を用い、流体を移動させてアレイと接触させ、または、例えば、アレイがマイクロウェルプレートなど標準の形式にある場合、本発明のアレイを操作することができる。マイクロタイタープレートへ、またはプレートからの流体移動を含む一般的な配置の生成のために、流体処理ステーションが使用される。かかる移動を行うために「すぐに入手可能な」いくつかの流体処理ステーションが市販されている。例えば、すでに言及されているように、さまざまな自動システムがザイマーク社（Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（現在、キャリパー テクノロジーズ社（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ）が所有）から入手可能であるが、これらには通常、例えば、ロボットおよび流体処理モジュールが含まれる。同様に、例えば、マイクロタイタートレイ操作のために、さまざまな実験室系において使用されているコモンＯＲＣＡ（登録商標）ロボットも、例えば、ベックマン コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））から市販されている。微小流体システムも現在、市販されている。例えば、ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）（アジレント テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰ２１００バイオアナライザーでは、キャリパー テクノロジーズ社（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ、マサチューセッツ州（ＭＡ））によるラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）（商標）技術が使用され、きわめて小さなサンプル量を操作する。この「実験室チップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」システムでは、サンプルの調製、流体処理、および生化学分析ステップがマイクロチップの領域内で実施される。チップは、例えば、ガラスで製造されたマイクロチャンネルを有し、液タンクと経路の相互接続ネットワークを提供する。本発明のアレイは、かかる装置のチャンネル内、例えば、チャンネルの壁、または装置内に配置されたビード上に製造されうる。キャリパー テクノロジーズのハイスループットスクリーニングシステム（キャリパー テクノロジーズ社（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ、マサチューセッツ州（ＭＡ））によっても標準のマイクロウェルライブラリー形式と微小流体チップ技術との間の利用可能なインターフェイスが提供される（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｌｉｐｅｒｔｅｃｈ．ｃｏｍを参照）。さらに、特許および技術文献には、流体処理用のマイクロウェルプレートと直接連動しうる微小流体システムの多くの例が含まれている。
キット
本発明のキットは通常、関連包装材（アレイを包装するための材料）教材（例えば、アレイと相互作用する１つもしくはそれ以上の試薬またはサンプルを検出するためのアレイの使用説明書）、対照試薬（アレイに適用される既知の活性を有する試薬）、サンプルなど追加のキット機構とともに本発明のアレイを含む。
非天然アミノ酸を有するポリペプチドの調製
本発明は、固体支持体に付着している第２の反応基と反応すると結合（共有または非共有）を形成しうる適切な反応基が付着している１つもしくはそれ以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドの製造を含む。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸は、アルデヒドまたはケト誘導化アミノ酸などの求電子部分を含んで成り、かつアルデヒドまたはケト部分は求核部分と反応し、ポリペプチドを固体支持体に付着させる。非天然アミノ酸含有ポリペプチドは、ポリペプチド生合成機構が変化して、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）ペアを用いて追加の遺伝的にコード化されたアミノ酸に適合する細胞によって選択的に合成される。特に、これらの細胞は、選択コドン（例えば、停止コドン、４塩基コドンなど）を認識する直交ｔＲＮＡ、およびアルデヒドまたはケト誘導化アミノ酸を直交ｔＲＮＡに付着しうる直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を含む。天然アミノ酸において通常見られない求電子基、例えばケト基を含有する非天然アミノ酸システムは、本発明のシステムとともに特に適切である。ケト基を有する非天然アミノ酸を含有するポリペプチドの産生は当技術分野で周知であり、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５７６号パンフレットを参照。
本発明のタンパク質アレイとともに使用されるポリペプチドの細胞ベースの産生は、種々の利点を提供する。主に、細胞産生を用いることにより、細胞内因性翻訳後プロセッシング装置を用いる発現ポリペプチドの翻訳後プロセッシングが提供され、大量の非天然アミノ酸を含有するタンパク質の産生を可能にする。本発明により使用される非天然アミノ酸を含有するタンパク質は、例えば、非酵素反応を用いる化学合成によっても合成されうる。
非天然アミノ酸を含有するタンパク質の細胞産生は、インビボでポリペプチドへの直接の非天然アミノ酸の部位特異的組込みを可能にする。重要なことには、非天然アミノ酸は、共通の２０アミノ酸の１つの代替ではなく、遺伝子レパートリーに添加される。さらに、非天然アミノ酸はポリペプチドの所望の位置に配置されうる。固体支持体への付着のために、多くの場合、単一の付着点のみを有することが望ましい。これらの実施形態においては、場合により、非天然アミノ酸の１つのみが各ポリペプチドへ組込まれる。ポリペプチドを誘導化するための初期の方法とは異なり、直交ｔＲＮＡ／直交ＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）ペアの使用により、必要に応じて、特定のアミノ酸がポリペプチド内で生じる各場所での特定のアミノ酸を誘導化するのではなく、特定のアミノ酸がポリペプチド内で生じる場所の１つのみで非天然アミノ酸を有するポリペプチドを製造することが可能である。アミノまたはカルボキシ末端のいずれか近く、および／またはポリペプチドの１つもしくはそれ以上の内部の場所で付着点を有しうる。タンパク質アレイの目的のために、この技術により、ポリペプチドの同じ相対的位置で付着されるアレイにおいてそれぞれ潜在的に数百または数千のポリペプチドを得ることが可能である。
本発明のためのタンパク質アレイで使用されるポリペプチドは、一定の位置で２つ以上の非天然アミノ酸を組込むこともできる。これは、例えば、非天然アミノ酸の１つが固体支持体への付着を形成するために使用されると同時に、第２の非天然アミノ酸が第２のポリペプチドまたはスクリーニング可能な部分（例えば、マーカー）の付着点として役立ちうる場合に追加の利点を提供する。
非天然アミノ酸を含むポリペプチドを製造するために、直交ｔＲＮＡ／ＲＳペアによって非天然アミノ酸のインビボ組込みに適合される宿主細胞および生物を使用することができる。宿主細胞は、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡ合成酵素を発現する１つもしくはそれ以上のベクター、および誘導化されるポリペプチドをコード化するベクターで遺伝子組換え（例えば、形質転換、変換、またはトランスフェクション）される。これらの構成要素のそれぞれは同じベクター上にあり、またはそれぞれは別個のベクター上にあり、２つの構成要素は１つのベクター上にあり、かつ第３の構成要素は第２のベクター上にありうる。ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、または共役ポリヌクレオチドの形でありうる。
直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡ合成酵素、および誘導化されるポリペプチドのコード領域は、所望の宿主細胞において機能的である遺伝子発現制御要素に操作性に結合される。代表的なベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、および特定のターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。ベクターは場合により、少なくとも１つの独立したターミネーター配列を含有する遺伝子発現カセット、真核生物、もしくは原核生物、またはその両方におけるカセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクター）、および原核生物系と真核生物系の両方の選択マーカーを含んで成る。ベクターは、原核生物、真核細胞、または好ましくはその両方における複製および／または統合に適切である。ジリマン（Ｇｉｌｉｍａｎ）とスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｇｅｎｅ（１９７９年）、８、ｐ．８１、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８７年）、３２８、ｐ．７３１、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ），Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．（１９９５年）、６４３５、ｐ．１０、オーサベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）（すべて上掲）を参照。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣによる、例えば、ＡＴＣＣによって出版された「ＡＴＣＣ細菌およびバクテリオファージカタログ（Ｔｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）」（１９９２年）、ゲルナ（Ｇｈｅｒｎａ）ら（編）によって示されている。シークエンシング、クローニング、および分子生物学の他の態様の追加の基本的手順、および基礎を成す理論上の考察は、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら（１９９２年）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ（ニューヨーク州（ＮＹ））においても記載されている。
クローニング、変異、細胞培養など本発明に応用できる分子生物学的方法を記載する一般的な教科書としては、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）とキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、分子クローニング技術ガイド、酵素学における方法（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１５２巻、アカデミック プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ））、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング−実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版）、第１−３巻、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド スプリング ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、２０００年（「サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」）、および分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｆ．Ｍ．オーサベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、グリーン パブリッシング アソシエーツ社（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）とジョン ワイリー アンド サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）との共同事業（２００２年中に補完）（「オーサベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）」）が挙げられる。例えば、細胞単離および培養（例えば、その後の核酸単離用）に有用な他の文献としては、フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）（１９９４年）、動物細胞の培養、基本技術マニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第３版、ワイリー・リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびその引例、ペイン（Ｐａｙｎｅ）ら（１９９２年）、液体系における植物細胞および組織培養（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ジョン ワイリー アンド サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）とフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）（編）（１９９５年）、植物細胞、組織、および器官培養（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ）、基本的方法シュプリンガー実験室マニュアル（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ）、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）（ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ） ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ） ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））、およびアトラス（Ａｔｌａｓ）とパークス（Ｐａｒｋｓ）（編）、微生物培地ハンドブック（Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ）（１９９３年）、ＣＲＣプレス（Ｐｒｅｓｓ）、フロリダ州ボーカラトーン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）が挙げられる。
また、実質的にすべての核酸（および標準または非標準に関係なく実質的にすべての標識核酸）が、ミッドランド認定試薬カンパニー（Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、グレート アメリカン ジーン カンパニー（Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、エクスプレスジェン社（ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ，Ｉｎｃ．）、オペロン テクノロジーズ社（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））、その他多数、などさまざまな商業的供給源のいずれかにより特別注文または標準注文されうる。
１つの実施形態においては、本発明は、それぞれそのアミノ酸側鎖において反応基を有する、少なくとも２つの非天然アミノ酸を含んで成るポリペプチドを使用し、さらに、そのポリペプチドが糖類などの糖質部分を含んで成る、すなわち、そのポリペプチドが糖タンパク質である、タンパク質アレイを提供する。この実施形態においては、糖質部分は反応基部位の１つでポリペプチドに付着されているが、残りの反応基はポリペプチドを固体支持体に付着するために使用される。あるいは、糖質部分は、そのポリペプチドへの組込み前の非天然アミノ酸構造の一部でありうる。
かかる糖タンパク質は、本発明のアレイにより使用されるが、それは特にグリコシル化ポリペプチドがアレイ上の生物活性を得るために、またはポリペプチドが他のポリペプチドと相互作用するために望ましい場合である。糖質部分のポリペプチドへのこの人工的な添加は、グリコシル化が、ポリペプチドが産生する特定のシステム生じなかった場合の天然の翻訳後グリコシル化事象の代わりとなりうる。グリコシル化ポリペプチドを生成する非天然アミノ酸上の反応基の使用は、２００３年１０月１５日出願の米国特許出願第１０／６８６，９４４号明細書に記載されている。
直交ｔＲＮＡおよび直交アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素ペア
１つもしくはそれ以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドを製造するために適切であり、かつ本発明のアレイにおいて使用される翻訳システム、および非天然アミノ酸を組込む追加のシステムを作る（すなわち、選択および単離）システムは当技術分野で周知であり、例えば、国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、２００３年１０月１５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５７６号パンフレット、２００３年１０月１５日出願の係属米国出願第１０／６８６，９４４号明細書を含む種々の情報源に記載されており、さらに、ワン（Ｗａｎｇ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２９２、ｐｐ．４９８−５００（２００１年）、ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１００、ｐｐ．５６−６１（２００３年）、およびチャン（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２、ｐｐ．６７３５−６７４６（２００３年）に記載されている。特に重要なのは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５７６号パンフレットであり、これには非天然ケトアミノ酸のポリペプチドへのインビボ組込みが開示されている。これら出願のそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組込まれている。かかる翻訳システムは一般に、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）、および非天然アミノ酸（例えば、アルデヒドまたはケト誘導体化アミノ酸）を含む細胞を含んで成り、ここでＯ−ＲＳは非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する。この細胞を、構成要素を用いて、非天然アミノ酸を成長ポリペプチド鎖へ組込む。
直交ペアは、Ｏ−ｔＲＮＡ、例えば、サプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡなど、およびＯ−ＲＳから成る。Ｏ−ｔＲＮＡは、内因性合成酵素によってアシル化されず、上述されているように、選択コドンをデコーディングする能力がある。Ｏ−ＲＳは、例えば、拡張アンチコドンループを有するＯ−ｔＲＮＡを認識し、かつ選択的に非天然アミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する。複数の直交ｔＲＮＡ／合成酵素ペアの開発は、異なるコドンを用いる複数の非天然アミノ酸の同時組込みを可能にしうる。
Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳは天然であり、またはさまざまな生物からの天然ｔＲＮＡおよび／またはＲＳの変異体によって得られうるが、これらは供給源および宿主下に記載されている。種々の実施形態においては、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳは少なくとも１の生物に由来する。他の実施形態においては、Ｏ−ｔＲＮＡは天然または第１の生物からの変異天然ｔＲＮＡ由来であり、かつＯ−ＲＳは天然または第２の生物からの変異天延天然ＲＳ由来である。
これらの方法は、（ａ）第１の生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ由来のｔＲＮＡのライブラリーを生成するステップと、（ｂ）第１の生物からのＲＳの非存在下に第２の生物からのアミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）によってアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーを負に選択し、それによってｔＲＮＡのプールを提供するステップと、（ｃ）導入された直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化されるメンバーのｔＲＮＡのプールを選択し、それによって少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを提供するステップとを含む。組換えＯ−ｔＲＮＡは、選択コドンを認識し、第２の生物からのＲＳによっては有効に認識されず、Ｏ−ＲＳによって選択的にアミノアシル化される。この方法は場合により、（ｄ）第３の生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）由来の変異ＲＳのライブラリーを生成するステップと、（ｅ）非天然アミノ酸および天然アミノ酸の存在下に組換えＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化するメンバーのＲＳのライブラリーを選択し、それによって活性ＲＳのプールを提供するステップと、（ｆ）非天然アミノ酸の非存在下に少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する活性ＲＳのプールを負に選択し、それによって特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを提供し、ここで特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアが、非天然アミノ酸および組換えＯ−ｔＲＮＡに対して特異的である少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを含んで成るステップを含む。
直交ペアを生成するための１つの方法は、Ｏ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳをスクリーニングおよび／または選択する変異ライブラリーを生成するステップを含む。
直交ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを生成するための第２の方法は、異種ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを、例えば、他の、例えば、起源成分からのペアを宿主細胞へ取込むステップを含む。異種合成構成候補の特性としては、例えば、それが宿主細胞のｔＲＮＡを変化させることがないことが挙げられ、かつ異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば、それが宿主細胞の合成酵素によってアシル化されないことが挙げられる。また、異種ｔＲＮＡ由来の異種ｔＲＮＡは、すべての宿主細胞の合成酵素に対して直交である。
直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）の製造
Ｏ−ＲＳを製造するための方法は、野生型合成酵素のフレームワークから変異合成酵素のプールを生成し、次いで共通の２０アミノ酸に対するアルデヒドまたはケト部分など求電子剤を有する非天然アミノ酸に対するその特異性に基づく変異ＲＳを選択するステップに基づく。かかる合成酵素を単離するには、本発明の選択方法は、（ｉ）初期段階からの所望の合成酵素の活性が低く、集団が小さくありうるため高感度であり、（ｉｉ）異なる選択段階で選択の厳密性を変化させることが望ましいため「調節可能」であり、かつ（ｉｉｉ）異なる非天然アミノ酸に使用されうるように一般的である。
直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を生成する方法は、例えば、合成酵素の活性部位で、合成酵素の編集機構部位、合成酵素の異なるドメインなどを組合わせることによって異なる部位で合成酵素を突然変異させ、かつ選択工程を適用するステップを含む。正の選択の後の負の選択の組合わせに基づく方法が使用される。正の選択においては、正のマーカーの非必須位置で導入された選択コドンの抑制により、細胞が正の選択の圧力下に生存が可能となる。したがって、天然アミノ酸および非天然アミノ酸の存在下に、生存細胞は、天然または非天然アミノ酸のいずれかで直交サプレッサーｔＲＮＡをチャージする活性合成酵素をコード化する。負の選択においては、負のマーカーの非必須で導入された選択コドンの抑制により、天然アミノ酸特異性を有する合成酵素が除去される。負および正の選択生存細胞は、非アミノ酸のみを有する直交サプレッサーｔＲＮＡをアミノアシル化（変化させる）合成酵素をコード化する。次いで、これらの合成酵素はさらなる変異誘発、例えば、ＤＮＡシャフリング、または他の再帰的変異誘発方法にかけられうる。
変異ＲＳのライブラリーは、当技術分野で周知の種々の変異誘発法を用いて生成されうる。例えば、変異ＲＳは、部位特異的変異、ランダム点変異、相同性組換え、キメラ構成などによって生成されうる。
正の選択ステップは、例えば、正の選択マーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子など、および変異ＲＳのライブラリーを複数の細胞へ導入し、ここで正の選択マーカーは少なくとも１つの選択コドン、例えば、アンバーコドンを含んで成り、選択剤の存在下に複数の細胞を成長させ、正の選択マーカーにおける少なくとも１つの選択コドンを抑制することによって、選択剤の存在下に生存する細胞を選択し、それによって、活性ＲＳのプールを含有する正に選択された細胞のサブセットを提供するステップを含みうる。場合により、選択剤の濃度は変化されうる。
負の選択は、例えば、正の選択からの活性変異ＲＳのプールを有する負の選択マーカーを第２の生物の複数の細胞へ導入し、ここで負の選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子、例えば、少なくとも１つの選択コドンを含んで成るクロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子であり、かつ、非天然アミノ酸を補充した第１の培地で生存するが、非天然アミノ酸および選択剤で補充されていない第２の培地では生存しない細胞を選択し、それによって、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを有する生存細胞を提供するステップを含みうる。場合により、選択剤の濃度は変化される。
正の選択は、選択コドン、例えば、選択マーカー遺伝子におけるアンバー停止コドンを含んで成る正の選択マーカーにおける選択コドンの抑制に基づく。抗生物質または他の選択剤は、正の選択圧力として適用されうる。また、選択マーカーは、非天然アミノ酸の存在および非存在下に本明細書で述べられている正のマーカーおよび負のマーカーとして使用されうる。場合により、選択コドンを含んで成る選択マーカー遺伝子は正の選択に使用され、負の選択マーカー、例えば、少なくとも１つもしくはそれ以上の選択コドンを含んで成る雄性不稔遺伝子など毒性マーカーが負の選択に使用される。
正の選択は、細胞にアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子における非必須位置での選択コドンの抑制に基づき、かつリボヌクレアーゼ雄性不稔を負のマーカーとして使用される。ぺリプラズムに分泌されるβ−ラクタマーゼとは対照的に、ＣＡＴは細胞質に局在し、さらに、アンピシリンは殺菌性であると同時に、クロラムフェニコールは静菌性である。
組換えＯ−ＲＳはさらに変異および選択されうる。１つの実施形態においては、少なくとも１つの組換え直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を製造するための方法はさらに、（ｄ）少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを単離し、（ｅ）少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳ由来の変異Ｏ−ＲＳ第２のセットを生成し、（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する能力を含んで成る変異Ｏ−ＲＳが得られるまで、ステップ（ｂ）および（ｃ）を反復するステップを含んで成りうる。場合により、ステップ（ｄ）〜（ｆ）は、例えば、少なくとも約２回反復される。１つの態様においては、変異Ｏ−ＲＳの第２のセットは、変異誘発、例えば、ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、組換え、またはその組合わせによって生成されうる。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の製造
組換え直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を製造するための方法、および本発明により使用される追加のＯ−ｔＲＮＡ種システムを作る（すなわち、選択および単離）方法は、例えば、国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、２００３年１０月１５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５７６号パンフレット、２００３年１０月１５日出願の係属米国出願第１０／６８６，９４４号明細書を含む種々の情報源に記載されており、さらに、ワン（Ｗａｎｇ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２９２、ｐｐ．４９８−５００（２００１年）、ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１００、ｐｐ．５６−６１（２００３年）、およびチャン（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２、ｐｐ．６７３５−６７４６（２００３年）に記載されている。
組換えＯ−ｔＲＮＡを製造するこれらの方法は、（ａ）第１の生物からの少なくとも１のｔＲＮＡ、例えば、サプレッサーｔＲＮＡ由来の変異ｔＲＮＡのライブラリーを生成するステップと、（ｂ）第１の生物からのＲＳの非存在下に第２の生物からのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）によってアミノアシル化される変異ｔＲＮＡのライブラリー負に選択し、それによって変異ｔＲＮＡのプールを提供するステップと、（ｃ）導入された直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化されるメンバーの変異ｔＲＮＡのプールを選択し、それによって少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを提供するステップとを含みうるが、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡが選択コドンを認識し、第２の生物からのＲＳによっては有効に認識されず、Ｏ−ＲＳによって選択的にアミノアシル化される。１つの実施形態においては、組換えＯ−ｔＲＮＡは直交性の改善を有する。
例えば、その所望のＲＳへの親和性を保存しながらｔＲＮＡの直交性を改善するために、本方法は場合により、それぞれ、同種の合成酵素の非存在および存在下に変異サプレッサーｔＲＮＡライブラリーと負および正の選択の組合せを含む。負の選択においては、選択コドンがマーカー遺伝子、例えば、非必須位置での雄性不稔など毒性遺伝子に導入される。例えば、メタン生成菌（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来の変異ｔＲＮＡライブラリーのメンバーが内因性宿主、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）合成酵素によってアミノアシル化されると（すなわち、これは宿主、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対して直交ではない）、選択コドンは、例えば、アンバーコドンが抑制され、産生される毒性遺伝子生成物は細胞死に至る。直交ｔＲＮＡまたは非機能的ｔＲＮＡを有する細胞が生存する。次いで、生存細胞は、選択コドン、例えば、アンバーコドンが正のマーカー遺伝子、例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子など薬剤耐性遺伝子に位置している正の選択にさらされる。これらの細胞は、同種のＲＳを有する発現ベクターをも含有する。これらの細胞は、選択剤、例えば、アンピシリンの存在下に成長する。次いで、ｔＲＮＡは、同時発現された同種の合成酵素によってアミノアシル化され、この選択コドンに反応してアミノ酸を挿入するその能力のために選択される。非機能的ｔＲＮＡ、または当該の合成酵素によって認識されえないｔＲＮＡを有する細胞は、抗生物質に対して感受性である。したがって、（ｉ）内因性宿主、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、合成酵素の基質ではなく、（ｉｉ）当該合成酵素によってアミノアシル化されうる、かつ（ｉｉｉ）翻訳において機能的であるｔＲＮＡは両方の選択を生き延びる。
変異ｔＲＮＡのライブラリーが構成される。変異は、特異的位置、例えば、非保存性位置、または保存性位置、ランダム化位置、またはｔＲＮＡの所望のループ、例えば、アンチコードループ、（Ｄアーム、Ｖループ、ＴＰＣアーム）、または各ループの組合せ、または全ループで両方の組合せで導入されうる。ｔＲＮＡのキメラライブラリーも本発明には含まれている。注目すべきは、天然の多様性を含んで成るライブラリーなど種々の生物（例えば、真正細菌または古細菌などの微生物）からのｔＲＮＡ合成酵素のライブラリー（例えば、ショート（Ｓｈｏｒｔ）らへの米国特許第６，２３８，８８４号明細書、シャレンベルガー（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ）らへの米国特許第５，７５６，３１６号明細書、ペーターセン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）らへの米国特許第．５，７８３，４３１号明細書、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）らへの米国特許第．５，８２４，４８５号明細書、ショート（Ｓｈｏｒｔ）らへの米国特許第．５，９５８，６７２号明細書を参照）が場合により構成され、直交ペアについてスクリーニングされる。
例えば、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によってアミノアシル化される変異ｔＲＮＡのライブラリーの負の選択としては、毒性マーカー遺伝子の導入を含みうるが、この毒性マーカー遺伝子は少なくとも１つの選択コドンおよび第２の生物から複数の細胞への変異ｔＲＮＡのライブラリーを含んで成り、かつ生存細胞を含みうるが、この生存細胞は、少なくとも１つの直交ｔＲＮＡまたは非機能的ｔＲＮＡを含んで成る変異ｔＲＮＡのプールを含有する。例えば、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼ雄性不稔遺伝子であり、ここでリボヌクレアーゼ雄性不稔遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含みうる。場合により、リボヌクレアーゼ雄性不稔遺伝子は、２つもしくはそれ以上のアンバーコドンを含みうる。生存細胞は、例えば、比較比率（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｒａｔｉｏ）細胞密度アッセイを用いることによって選択されうる。
別の実施例においては、導入直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化されるメンバーの変異ｔＲＮＡのプールの選択は、正の選択マーカー遺伝子の導入を含みうるが、正の選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、例えば、少なくとも１つの選択コドンを含んで成るβ−ラクタマーゼ遺伝子、例えば、少なくとも１つのアンバー停止コドンを含んで成るβ−ラクタマーゼ遺伝子、Ｏ−ＲＳ、および第２の生物から複数の細胞への変異ｔＲＮＡのプールを含んで成り、かつ選択剤、例えば、抗生物質の存在下に成長した生存細胞を選択し、それによって少なくとも１つの組換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを提供するステップを含みうるが、組換えｔＲＮＡはＯ−ＲＳによってアミノアシル化され、少なくとも１つの選択コドンに反応して、正のマーカー遺伝子によってコード化される翻訳生成物へアミノ酸を挿入する。別の実施形態においては、選択剤の濃度は変化される。これらの方法によって生成される組換えＯ−ｔＲＮＡは本発明に包含される。
上述された方法における選択ステップ、例えば、正の選択ステップ、負の選択ステップ、または正と負の両方のステップにおける厳密性は場合により、選択厳密性の変化を含む。例えば、雄性不稔はきわめて毒性のポリペプチドであるため、負の選択の厳密性は、異なる数の選択コドンを雄性不稔遺伝子へ導入することによって制御されうる。本発明の１つの態様においては、厳密性は所望の活性が初期段階中に低くありうるため変化する。したがって、初期段階では低い厳密性の選択基準が適用され、その後の選択段階でより厳密な基準が適用される。
例えば、Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、およびＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを生成するために他の種類の選択を本発明で使用することができる。例えば、正の選択ステップ、負の選択ステップ、または正と負の両方の選択ステップは、レポーターの使用を含みうるが、このレポーターは蛍光活性細胞分離法（ＦＡＣＳ）によって検出される。例えば、正の選択は最初に正の選択マーカー、例えば、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子で行われうるが、ここでＣＡＴ遺伝子は、選択コドン、例えば、アンバー停止コドンを含んで成り、ＣＡＴ遺伝子においては、選択コドン、例えば、２つもしくはそれ以上を負のマーカー、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、抑制ができないことに基づく負の選択の篩い分けがその後に続く。１つの実施形態においては、正の選択マーカーおよび負の選択マーカーは、同じベクター、例えば、プラスミドで見出されうる。負のマーカーの発現は、レポーター、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を促進する。選択および篩い分けの厳密性を変化させることができ、例えば、レポーターを蛍光する必要がある光の強度は変化されうる。別の実施形態においては、正の選択を正の選択マーカーとしてのレポーターで行うことができ、これはＦＡＣでの篩い分けであり、その後、選択コドン、例えば、２つもしくはそれ以上を負のマーカーを、例えば、雄性不稔遺伝子内の位置で抑制ができないことに基づく負の選択の篩い分けによって行われうる。
場合により、レポーターは細胞表面、ファージディスプレイなどでディスプレイされる。細胞表面は、例えば、ＯｍｐＡベースの細胞表面ディスプレイシステムをディスプレイし、特定のエピトープ、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞の表面上で外膜ポリンＯｍｐＡに融合したポリオウイルスＣ３ペプチドの発現に依拠する。エピトープは、ポリペプチドメッセージにおける選択コドンが翻訳中に抑制される場合にのみ細胞表面上にディスプレイされる。次いで、ディスプレイされたペプチドは、ライブラリーにおける変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の１つによって認識されるアミノ酸を含有し、対応する合成酵素遺伝子を含有する細胞は、特異的非天然アミノ酸を含有するペプチドに対して生じた抗体とともに単離されうる。ＯｍｐＡベースの細胞表面ディスプレイシステムは、ファージディスプレイの代替として、ジョルジョ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ）らによって開発され、最適化された。フランシスコ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），Ｊ．Ａ．、キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ），Ｒ．、イベルソン（Ｉｖｅｒｓｏｎ），Ｂ．Ｌ．、およびジョルジョ（Ｇｅｏｒｇｏｉｕ），Ｇ．、外表面上で機能的抗体フラグメントを発現する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の産生および蛍光活性細胞分離（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、９０、ｐｐ．１０４４４−８ （１９９３年）を参照。
選択ステップは、インビトロでも実行されうる。次いで、選択構成要素、例えば、合成酵素および／またはｔＲＮＡは、非天然アミノ酸のインビボ組込みにおける使用のために細胞へ導入されうる。
供給源および宿主生物
例えば、同一または異なりうる、少なくとも第１の、例えば、起源動物または少なくとも２つの起源生物由来の直交ｔＲＮＡ−ＲＳペアは、さまざまな宿主生物、例えば、第２の生物において使用されうる。本発明の方法の第１および第２の生物は、同一または異なりうる。１つの実施形態においては、第１の生物は原核生物、例えば、メタン生成菌（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタン細菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、高度好塩菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、超好熱古細菌（Ａ． ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、高度好塩菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｐ．フリオサス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニックス（ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．テルモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などである。あるいは、第１の生物は、真核生物、例えば、植物（例えば、単子葉植物、または双子葉植物など複合植物）、藻、原生植物、菌類（例えば、酵母など）、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、節足動物など）などである。別の実施形態においては、第２の生物は原核生物、メタン生成菌（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタン細菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、高度好塩菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、超好熱古細菌（Ａ． ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、高度好塩菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｐ．フリオサス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニックス（ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．テルモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などである。あるいは、第２の生物は、真核生物、例えば、植物、菌類、動物などである。
上述されているように、個別のペアの構成要素は、同一または異なる生物由来でありうる。例えば、ｔＲＮＡは、原核生物、例えば、メタン生成菌（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）および高度好塩菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＲＣ−１など古細菌、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）など真正細菌由来でありうるが、合成酵素は同一または別の原核生物、例えば、メタン生成菌（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、超好熱古細菌（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタン細菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、Ｐ．フリオサス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニックス（ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．テルモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、高度好塩菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）など由来でありうる。真核源として、例えば、植物（例えば、単子葉植物、または双子葉植物など複合植物）、藻、原生植物、菌類（例えば、酵母など）、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、節足動物など）なども使用されうる。
選択コドン
本発明の選択コドンは、ポリペプチド生合成機構の遺伝子コドンフレームワークを拡大する。例えば、選択コドンは、例えば、独自の３塩基コドン、停止コドン、例えば、アンバーコドン、またはオパールコドンなどのナンセンスコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基コドンなどを含む。多くの選択コドンは、所望の遺伝子、例えば、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、４つ以上などへ導入されうる。
６４遺伝子コドンが２０アミノ酸および３つの停止コドンをコード化する。１つの停止コドンのみが翻訳停止には必要であるため、他の２つは原理上、非タンパク質アミノ酸をコードするために使用されうる。アンバー停止コドン、ＵＡＧは、インビトロ生合成系およびアフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）において、非天然アミノ酸の組込みを方向付けるように有効に使用されている。３つの停止コドンのうち、ＵＡＧが最も少なく使用されている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中の停止コドンである。一部の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は、ＵＡＧを認識し、天然アミノ酸を挿入する天然サプレッサーｔＲＮＡを含有する。また、これらのアンバーサプレッサーｔＲＮＡは、従来のタンパク質変異誘発において使用されている。
１つの実施形態においては、これらの方法は、インビボでの非天然アミノ酸の組込みのための停止コドンである選択コドンの使用を含む。例えば、停止コドン、例えば、ＵＡＧを認識するＯ−ｔＲＮＡが生成され、所望の非天然アミノ酸を有するＯ−ＲＳによってアミノアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素によって認識されない。従来の部位特異的変異誘発を用いて、停止コドン、例えば、ＴＡＧを当該部位でポリペプチド遺伝子へ導入するために使用されうる。例えば、セイヤーズ（Ｓａｙｅｒｓ），Ｊ．Ｒ．、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ），Ｗ．、エックシュタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ），Ｆ．、ホスホロチオネートベースのオリゴヌクレオチド・ディレクテッド突然変異誘発における５’，３’エクソヌクレアーゼ（５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、ｐｐ．７９１−８０２（１９８８年）を参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、および変異遺伝子はインビボで結合され、非天然アミノ酸はＵＡＧコドンに反応して組込まれ、特定の位置で非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを生じる。
インビボでの非天然アミノ酸の組込みは、宿主、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の顕著な擾乱なしに行われうる。例えば、ＵＡＧコドンの抑制効果は、Ｏ−ｔＲＮＡ、例えば、アンバーサプレッサーｔＲＮＡと放出因子１（ＲＦ１）（ＵＡＧコドンに結合し、リボソームから成長ペプチドの放出を開始する）との間の競合に依存するため、抑制効果は、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ、例えば、サプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを増大させ、またはＲＦ１欠損株を用いることによって調節されうる。
非天然アミノ酸は、レアコドンでもコード化されうる。例えば、インビトロポリペプチド合成反応におけるアルギニン濃度が減少する場合、レアアルギニンコドン、ＡＧＧは、アラニンによってアシル化される合成ｔＲＮＡによってＡｌａの挿入に有効であることがわかった。例えば、マ（Ｍａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２、ｐｐ．７９３９（１９９３年）を参照。この場合、合成ｔＲＮＡは天然ｔＲＮＡ Ａｒｇと競合するが、これは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における重要でない種として存在する。一部の生物は、すべてのトリプレットコドンを使用することはない。ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）における割り当てられていないコドンＡＧＡが、インビトロ転写／翻訳抽出におけるアミノ酸の挿入のために使用されている。例えば、コワール（Ｋｏｗａｌ）とオリバー（Ｏｌｉｖｅｒ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、２５、ｐｐ．４６８５（１９９７年）を参照。本発明の構成要素は、これらのレアコドンをインビボで使用するために生成されうる。
選択コドンは追加としてまたは代替として、４、５、６個、もしくはそれ以上の塩基コドンなど、４もしくはそれ以上の塩基コドンを含みうる。４塩基コドンの例としては、例えば、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられる。５塩基コドンの例としては、例えば、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられる。例えば、変異Ｏ−ｔＲＮＡ、例えば、アンチコドンループとともに、例えば、少なくとも８−１０個のヌクレオチドアンチコドンループとともに特殊なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡの存在下に、４またはそれ以上の塩基コドンが単一アミノ酸として読まれる。他の実施形態においては、アンチコドンループは、例えば、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドンもしくはそれ以上をデコードしうる。２５６種類の可能な４塩基コドンがあるため、複数の非天然アミノ酸を４もしくはそれ以上の塩基コドンを用いて同じ細胞でコード化されうる。アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、コドンおよびアンチコドンサイズの限界調査（Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９巻、ｐｐ．２３７−２４４（２００２年）、マグリレイ（Ｍａｇｌｉｅｒｙ）、遺伝子コードの拡大：大腸菌におけるライブラリー法による「シフティー」４塩基コドンの有効なサプレッサーの選択（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ： Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ“Ｓｈｉｆｔｙ”Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３０７、ｐｐ．７５５−７６９（２００１年）を参照。
本発明の方法は、フレームシフト抑制に基づく拡大コドンを使用するステップを含む。４もしくはそれ以上の塩基コドンは、例えば、１つもしくは複数の非天然アミノ酸を同じポリペプチドへ挿入することができる。例えば、４塩基コドンが、インビトロ生合成法を用いてポリペプチドへ非天然アミノ酸を組込むために使用されている。例えば、マ（Ｍａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２、ｐｐ．７９３９（１９９３年）、およびホーサカ（Ｈｏｈｓａｋａ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２１、ｐ．３４（１９９９年）を参照。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵが、２−ナフチルアラニンおよびリジンのＮＢＤ誘導体を２つの化学アシル化フレームシフトサプレッサーｔＲＮＡとともにインビトロでストレプトアビジンへ同時に組込むために使用された。例えば、ホーサカ（Ｈｏｈｓａｋａ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２１、ｐ．１２１９４（１９９９年）を参照。インビボ試験においては、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）らが、ＮＣＵＡアンチコドンによるｔＲＮＡＬｅｕ誘導体のＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ、またはＣでありうる）を抑制する能力を検査し、０または−１フレームでほとんどデコードがなく、１３〜２６％の効率でＵＣＵＡアンチコドンとともにｔＲＮＡＬｅｕによって四つ組のＵＡＧＡが検出されうることを見出した。ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９８、ｐ．１９５（２０００年）を参照。１つの実施形態においては、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく拡大コドンが、他の望ましくない部位でミスセンスリードスルーおよびフレームシフト抑制を減少させうる本発明において使用されうる。
翻訳バイパスシステムも非天然アミノ酸を所望のポリペプチドへ組込むために使用されうる。翻訳バイパスシステムにおいては、大きな配列が遺伝子へ挿入されるが、ポリペプチドへ翻訳されない。この配列は、リボソームが配列を乗り越え、挿入の下流で翻訳を再開させる合図として使用される構造を含有する。
あるいは、またはポリペプチドへ非天然アミノ酸を組込む上述された他の方法とともに、トランス翻訳システムを用いることができる。このシステムは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に存在するｔｍＲＮＡと呼ばれる分子を含む。このＲＮＡ分子は構造上、アラニルｔＲＮＡと関係し、アラニル合成酵素によってアミノアシル化される。ｔｍＲＮＡとｔＲＮＡとの差は、アンチコドンループが特殊な大きな配列によって置換されている点である。この配列は、テンプレートとしてｔｍＲＮＡ内でコード化されたオープンリーディングフレームを用いて行き詰まった配列上でリボソームが翻訳を再開することを可能にする。本発明においては、直交合成酵素で選択的にアミノアシル化され、非天然アミノ酸がロードされた直交ｔｍＲＮＡが生成されうる。このシステムを用いて遺伝子を転写することによって、リボソームは特異的部位で行き詰まり、非天然アミノ酸はその部位で導入され、次いで、直交ｔｍＲＮＡ内でコード化された配列を用いることによって翻訳を再開する。
選択コドンは場合により、非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は、さらに既存の遺伝子アルファベットを拡大する。１つの余分な塩基対がトリプレットコドンの数を６４から１２５に増大させる。第３の塩基対の特性として、安定および選択的塩基ペアリング、ポリメラーゼによる忠実度が高いＤＮＡへの効率的な酵素組込み、および発生期非天然塩基対の合成後の効率的な継続的プライマー拡大が挙げられる。方法および組成物に適用されうる非天然塩基対の説明としては、例えば、ヒラノ（Ｈｉｒａｎｏ）ら、ポリペプチドへアミノ酸類似体を組込むための非天然塩基対（Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０、ｐｐ．１７７−１８２（２００２年）が挙げられる。他の関連刊行物は以下に示されている。
インビボ用法では、非天然ヌクレオチドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。また、増大した遺伝子情報は安定であり、細胞酵素によって破壊されない。べナー（Ｂｅｎｎｅｒ）およびその他による以前の努力は、標準的なワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）ペアにおけるものと異なる水素結合パターンを巧みに利用したものであり、そのうち最も注目に値する例は、イソ−Ｃ：イソ−Ｇペアである。例えば、スイッツアー（Ｓｗｉｔｚｅｒ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１、ｐ．８３２２（１９８９年）、およびピッチリーリ（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９０年、３４３、ｐ．３３（１９９０年）、クール（Ｋｏｏｌ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４、ｐ．６０２（２０００年）を参照。これらの塩基は一般に、ある程度、天然塩基と誤対合であり、酵素的に複製されえない。クール（Ｋｏｏｌ）らは、塩基間の疎水性パッキング相互作用が水素結合を置換し、塩基対の形成を促進しうることを明らかにした。クール（Ｋｏｏｌ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４、ｐ．６０２（２０００年）、およびグッキアン（Ｇｕｃｋｉａｎ）とクール（Ｋｏｏｌ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３６、ｐ．２８２５（１９９８年）を参照。上記の要件をすべて満たす非天然塩基対を開発する努力において、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）、ロームスベルグ（Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ）らは、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己ペアが、天然塩基対よりも安定であることがわかり、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＫＦ）のクレノウフラグメントによってＤＮＡへ効率的に組込みうる。例えば、マクミン（ＭｃＭｉｎｎ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２１、ｐ．１１５８６（１９９９年）、およびオガワ（Ｏｇａｗａ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２、ｐ．３２７４（２０００年）を参照。３ＭＮ：３ＭＮ自己ペアは、生物機能に十分な効率および選択性を有するＫＦによって合成されうる。例えば、オガワ（Ｏｇａｗａ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２、ｐ．８８０３（２０００年）を参照。しかし、両方の塩基は、その後の複製のためのチェーンターミネーターとして作用する。ＰＩＣＳ自己ペアを複製するために使用されうる変異ＤＮＡポリメラーゼが最近、進化されている。また、７ＡＩ自己ペアが複製されうる。例えば、テウ（Ｔａｅ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３、ｐ．７４３９（２００１年）。新規金属塩基対、Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙが開発されており、これは結合Ｃｕ（ＩＩ）上に安定ペアを形成する。メガース（Ｍｅｇｇｅｒｓ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２、ｐ．１０７１４（２０００年）。拡大コドンおよび非天然コドンは天然コドンに対して本質的に直交であるため、本発明の方法は、この特性を巧みに利用してそれらのために直交ｔＲＮＡを生成する。
非天然アミノ酸
本明細書で用いられる非天然アミノ酸は、アミノ酸、修飾アミノ酸、またはセレノシステインおよび以下の２０個の遺伝子コード化されたアルファ−アミノ酸以外のアミノ酸類似体を指す。すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン。アルファ−アミノ酸の遺伝子構造は式Ｉによって示されている。
非天然アミノ酸は通常、式Ｉを有する構造であり、式中、Ｒ基が２０天然アミノ酸で使用されるもの以外の置換基である。２０天然アミノ酸の構造については、例えば、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｌ．ストライヤー（Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ）、第３版、１９８８年、フリーマン アンド カンパニー（Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））を参照。留意すべきは、本発明の非天然アミノ酸は、上記の２０アルファ−アミノ酸以外の天然化合物でありうる。
本発明の非天然アミノ酸は通常、側鎖のみで天然アミノ酸と異なるため、非天然アミノ酸は他のアミノ酸、例えば、それらが天然ポリペプチドで形成されているのと同じようにして天然または非天然で他のアミノ酸と結合する。しかし、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸とそれらを区別する側鎖基を有する。
本発明のタンパク質アレイを製造するために特に興味深いのは、式ＩのＲが固体支持体−結合反応基またはリンカーと反応し、固体支持体への非天然アミノ酸を含むポリペプチドを結合しうる部分を含む非天然アミノ酸である。適切なＲ基としては、例えば、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ホウ酸塩、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフイン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミンなど、またはその任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸は、ポリペプチドを固体支持体へ結合するために使用される光活性可能な架橋剤を有する。
新規側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、非天然アミノ酸は場合により、例えば、式ＩＩおよびＩＩＩの構造によって示されているような修飾骨格構造も含んで成る。
式中、Ｚは通常、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’、またはＳ−Ｒ’、ＸおよびＹを含んで成り、これらは同一または異なりうるが、通常、ＳまたはＯ、ならびにＲおよびＲ’を含んで成り、これらは場合により同一または異なり、通常、式Ｉおよび水素を有する非天然アミノ酸について上述されたＲ基の成分の同一リストから選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により、式ＩＩおよびＩＩＩによって示されたアミノまたはカルボキシル基における置換基を含んで成る。この種類の非天然アミノ酸としては、例えば、共通の２０天然アミノ酸に対応する側鎖または非天然側鎖を有するα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられるが、これらに限定されない。また、α−炭素での置換基は場合により、Ｄ−グルタミン酸塩、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸などのＬ、Ｄ、または、α−α−２基置換アミノ酸を含む。他の構造的代替物としては、プロリン類似体および３員、４員、６員、７員、８員、および９員環プロリン類似体など環状アミノ酸、および置換β−アラニンおよびγ−アミノ酪酸などのβおよびγアミノ酸が挙げられる。
例えば、多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどの天然アミノ酸に基づく。チロシン類似体としては、パラ−置換チロシン、オルト−置換チロシン、およびメタ置換チロシンが挙げられる。置換チロシンは、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖または分岐炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基などが挙げられる。また、多重置換置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。例としてのフェニルアラニン類似体としては、メタ−置換フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されず、ここで置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、もしくはケト基などを含んで成る。非天然アミノ酸の具体例としては、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧＩｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、およびイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。さまざまな非天然アミノ酸の構造は、例えば、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図１７、１８、１９、２６、および２９に示されている。
非天然アミノ酸の化学合成
上記の非天然アミノ酸の多くは、例えば、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（米国）またはアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（米国、ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から市販されている。市販されていないものは場合により、以下の実施例に示されているように、または当業者に周知の標準方法を用いて合成される。有機合成法については、例えば、フェセンドン（Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ）とフェセンドン（Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ）による有機化学（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９８２年、第２版、ウィラード グラント プレス（Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ）、マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、マーチ（Ｍａｒｃｈ）による先端有機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（第３版、１９８５年、ワイリー アンド サンズ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））、およびカレイ（Ｃａｒｅｙ）とサンドベルグ（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ）による先端有機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（第３版、パートＡおよびＢ、１９９０年、プレナム プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））を参照。
例えば、メタ−置換フェニルアラニンは、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図１４に概略が示されている手順によって合成される。通常、ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンイミド）がメタ−置換メチルベンゼン化合物に添加され、メタ−置換臭化ベンジルを得るが、これは次いでマロネート化合物と反応され、メタ置換フェニルアラニンを得る。メタ位置に使用される代表的な置換基としては、ケトン、メトキシ基、アルキル、アセチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、３−アセチル−フェニルアラニンは、３−メチルアセトフェノンの溶液とＮＢＳを反応させることによって製造される。詳細については、以下の実施例を参照。同様の合成が、３−メトキシフェニルアラニンを得るために使用される。その場合の臭化ベンジルのメタ位置上のＲ基は、−ＯＣＨ３である。例えば、マツォウカス（Ｍａｔｓｏｕｋａｓ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９５年、３８、ｐｐ．４６６０−４６６９を参照。
一部の実施形態においては、非天然アミノ酸のデザインは、合成酵素、例えば、直交ｔＲＮＡをアミノアシル化するために使用される直交ｔＲＮＡ合成酵素の活性部位に関する既知の情報によって偏りが生じる。例えば、アミドの窒素で置換された誘導体（１）、γ位置でのメチル基（２）、およびＮ−Ｃγ環状誘導体（３）を含む３つのクラスのグルタミン類似体が提供される。重要な結合部位残基が酵母ＧＩｎＲＳと相同性である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＩｎＲＳのＸ線結晶構造に基づき、類似体は、グルタミンの側鎖の１０Åシェル内に残基の側鎖変異のアレイを補完するようにデザインされ、例えば、小さな疎水性アミノ酸への活性部位Ｐｈｅ２３３の突然変異が、ＧｌｎのＣγ位置で立体の体積増大によって補完されうる。
例えば、Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミン１，５無水物（国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図２３における化合物番号４）は場合により、アミドの窒素での置換基でグルタミン類似体を合成するために使用される。例えば、キング（Ｋｉｎｇ），Ｆ．Ｅ．とキッド（Ｋｉｄｄ）、Ｄ．Ａ．Ａ．Ａ フチル化中間体からのグルタミン酸のグルタミンおよびγ−ジペプチドの新しい合成（Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、ｐｐ．３３１５−３３１９（１９４９年）、フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ），Ｏ．Ｍ．とシャッテルジ（Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ），Ｒ．、抗腫瘍剤用のモデル物質としてのグルタミンの誘導体の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１、ｐｐ．３７５０−３７５２（１９５９年）、クレイグ（Ｃｒａｉｇ），Ｊ．Ｃ．ら、７−クロロ−４−［［４−（ジエチルアミノ）−ｌ−メチルブチル］アミノ］キノリン（クロロキン）の鏡象異性体の絶対的構成（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−ｌ−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ））、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３、ｐｐ．１１６７−１１７０（１９８８年）、およびアゾウレイ（Ａｚｏｕｌａｙ），Ｍ．、ビルモント（Ｖｉｌｍｏｎｔ），Ｍ．とフラピール（Ｆｒａｐｐｉｅｒ），Ｆ．、潜在的抗マラリア剤としてのグルタミン類似体（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６、ｐｐ．２０１−５（１９９１年）を参照。無水物は通常、フタルイミドとしてアミンの第１の保護の後、酢酸中で還流することによってグルタミン酸から調製される。次いで、無水物は多くのアミンで開放され、結果としてアミドで一連の置換基が生じる。ヒドラジンによるフタロイル基の脱保護は、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図２３に示されている。
γ位置での置換は通常、グルタミン酸のアルキル化によって行われる。例えば、コスキネン（Ｋｏｓｋｉｎｅｎ），Ａ．Ｍ．Ｐ．とラポポート（Ｒａｐｏｐｏｒｔ），Ｈ．、配座拘束アミノ酸類似体としての４−置換プロリンの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４、ｐｐ．１８５９−１８６６（１９８９年）を参照。例えば、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図２４における化合物番号５によって示されている保護アミノ酸は場合により、９−ブロモ−９−フェニルフルオレン（ＰｈｆｌＢｒ）によるアミノ部分の第１のアルキル化（例えば、クリスティー（Ｃｈｒｉｓｔｉｅ），Ｂ．Ｄ．とラポポルと（Ｒａｐｏｐｏｒｔ），Ｈ．、Ｌ−アルパラギンからの光学的に純粋なピペコリン酸塩の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、アミノ酸脱カルボニル反応およびイミニウムイオン環化による（＋）−アポビカミンの全合成への適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）− Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９年、ｐｐ．１８５９−１８６６（１９８５年）を参照）およびＯ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルイソウレアを用いて酸部分のエステル化によって調製される。ＫＮ（Ｓｉ（ＣＨ３）３）２の領域選択的添加によりメチルエステルのα−位置で脱プロトン化され、エノラートを形成し、これは次いで場合により一連のヨウ化アルキルでアルキル化される。ｔ−ブチルエステルおよびＰｈｆｌの加水分解により、所望のγ−メチルグルタミン類似体（国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図２４における化合物番号２）。
国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図２５における化合物番号３によって示されているＮ−Ｃγ環状類似体は場合により、以前に記載されているＢｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔ−Ｂｕによる４つのステップで調製される。例えば、バルトン（Ｂａｒｔｏｎ）ら、ラジカル化学を用いる新規なａ−アミノ酸および誘導体の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）： Ｌ−およびＤ−ａ−アミノ−アジピン酸、Ｌ−ａ−アミノピメリン酸、および適切不飽和誘導体（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ−ａｎｄ Ｄ−ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｌ−ａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４３、ｐｐ．４２９７−４３０８ （１９８７年） 、およびスバシンゲ（Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅ）ら、キスカル酸類似体：ベータ−複素環２−アミノプロパン酸誘導体およびその新規なキスカレート感作部位での活性（Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２− ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ）、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．３５、ｐｐ．４６０２−７（１９９２年）を参照。Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ピロリジノン、ピロリジノン、またはオキサゾリドンのアニオンの生成後、図２５に示されている化合物７の添加によって、マイケル付加生成物が生じる。次いで、ＴＦＡによる脱保護により遊離アミノ酸が生じる。
上記の非天然アミノ酸に加えて、チロシン類似体のライブラリーもデザインされている。その活性部位がＭ．ヤナシ（ｊａｎｎａｓｈｉｉ）合成酵素ときわめて相同性であるＢ．ステアロテルトノフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴｙｒＲａの結晶構造に基づき、チロシンの芳香族側鎖の１０Åシェル内の残基を突然変異させた（Ｙ３２、Ｇ３４、Ｌ６５、Ｑ１５５、Ｄ１５８、Ａ１６７、Ｙ３２、およびＤ１５８）。国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図２６に示されているチロシン類似体のライブラリーは、これら活性部位のアミノ酸への置換基のアレイを補完するようにデザインされている。これらはさまざまなフェニル置換パターンを含み、これらは異なる疎水性および水素結合特性を提供する。チロシン類似体は場合により、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図２７によって示されている一般的な方法によって調製される。例えば、ジエチルアセトアミドマロネートのエノラートは場合によりナトリウムエトキシドを用いて生成される。次いで、所望のチロシン類似体が、適切な臭化ベンジルを添加した後、加水分解によって調製されうる。
非天然アミノ酸の細胞取込み
非天然アミノ酸取込みは、例えば、ポリペプチドへの組込みのために、非天然アミノ酸をデザインし、選択する場合に通常、考慮される１つの問題である。例えば、α−アミノ酸の高い電荷密度は、これらの化合物は細胞浸透性ではありえないことを示す。天然アミノ酸は、アミノ酸特異性の程度の変化を示すポリペプチドベースの輸送系の収集によって細菌へ取入れられる。したがって、本発明は、必要であれば、どの非天然アミノ酸が細胞によって取入れられるか評価するための迅速な篩い分けが得られる。
例えば、さまざまな非天然アミノ酸は場合により、細胞に対する毒性のために最小の培地でスクリーニングされる。毒性は通常、５つのグループに分けられる。すなわち、（１）非毒性、倍増時間に顕著な変化なし、（２）低毒性、倍増時間が約１０％未満増大、（３）中等度毒性、倍増時間が約１０％〜５０％増大、（４）高毒性、倍増時間が約５０％〜約１００％増大、および（５）極度毒性、倍増時間が約１００％超増大。例えば、リュー（Ｌｉｕ），Ｄ．Ｒ．とシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ），Ｐ．Ｇ．、拡大遺伝子コードを有する生物の進化への進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ）、米国科学アカデミーの議事録（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）９６、ｐｐ．４７８０−４７８５（１９９９年）を参照。高度または極度に毒性を示すアミノ酸の毒性は通常、ＩＣ５０値を得るその濃度の関数として測定される。一般に、天然アミノ酸の類似体にきわめて近く、または反応性機能を示すアミノ酸は、きわめて高い毒性を示す。前者の傾向は、これら非天然アミノ酸に対する毒性の機序が、ポリペプチドへの組込み、または天然アミノ酸を有する必須酵素の抑制でありうる。
毒性アミノ酸の考えうる取込み経路を確認するために、毒性アッセイは場合によりＩＣ５０レベルで、例えば、過剰な構造的に同様の天然アミノ酸を補充した倍地中で反復される。毒性アミノ酸については、過剰な天然アミノ酸の存在は通常、おそらく天然アミノ酸が効率的に毒性の細胞取込みまたは必須酵素への結合に対して競合するため、毒素の存在下に細胞が成長する能力を救う。これらの場合、毒性アミノ酸は場合により可能な取込み経路が割り当てられ、その相補性が細胞生存に必要である「致死対立遺伝子」と標識される。これら致死対立遺伝子は、細胞の非毒性非天然アミノ酸の取込み能を評価するためにきわめて有用である。細胞成長の回復によって証明される毒性対立遺伝子の相補性は、非毒性アミノ酸が細胞によって、おそらく致死対立遺伝子に割り当てられたものと同じ取込み経路によって取入れられることを示す。相補性の欠如は決定的ではない。例えば、試験および結論は以下に示された実施例により確認される。
得られた結果は、例えば、以下の実施例に記載されているように、致死的非天然アミノ酸対立遺伝子の相補性は、アミノ酸取込みを定性的に評価するための有効な方法である。この方法は通常、多数の化合物を放射標識するよりも少ない労力で済み、したがって、当該非天然アミノ酸を分析するためのより有利な方法である。この一般的な方法は場合により、核酸塩基類似体、糖質類似体、またはペプチド類似体など広範囲の分子の細胞取込みを迅速に評価するために使用される。例えば、この方法は場合により、本明細書で示された非天然アミノ酸の細胞取込みを評価するために使用される。
本発明は、すべてのアミノ酸取込み経路から独立している非天然アミノ酸を送達するための一般的な方法も提供する。この一般的な方法は、ジペプチドおよびトリペプチドを細胞質膜にわたって輸送するペプチド透過酵素による取込みに依拠する。ペプチド透過酵素はきわめて側鎖特異的ではなく、その基質に対するＫＤ値はアミノ酸透過酵素のＫＤ値と同等であり、例えば、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭである。例えば、ニキテンコ（Ｎｉｃｋｉｔｅｎｋｏ）ら、ＤｐｐＡ、ぺリプラスムデペプチド輸送／化学感覚受容体（Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤｐｐＡ，ａ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｄｅｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ／ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４、ｐｐ．１６５８５−１６５９５（１９９５年）、およびダンテン（Ｄｕｎｔｅｎ），Ｐ．、モウブレイ（Ｍｏｗｂｒａｙ），Ｓ．Ｌ．、能動輸送および走化性に関与する大腸菌からのポリペプチドを結合するジペプチドの結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４、ｐｐ．２３２７−３４（１９９５年）を参照。次いで、非天然アミノ酸は、リジンなど天然アミノ酸の共役として取入れられ、内因性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペプチダーゼの１つによってジペプチドの加水分解と同時に細胞質へ放出される。この方法を試験するために、固相による一部のＵｎｎ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ｕｎｎジペプチドによって合成され、これらジペプチドの存在および非存在下にリジン最小培地上でリジン生合成にかけた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の成長が試験された。これらの細胞に利用可能なリジンの唯一の供給源は非天然アミノ酸を含有するジペプチドである。ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ペンタフルオロフェニルアラニン、およびケージドセリンの取込みがこのようにして分析されている。４つのすべての場合に、１０ｍＭ以上のジペプチド濃度で成長が確認された。取込みは本明細書で示された方法で容易に分析されるが、細胞取込み経路に従う非天然アミノ酸のデザインの代案は、インビボでアミノ酸を作り出す生合成経路を提供することである。
非天然アミノ酸の生合成
多くの生合成経路はすでにアミノ酸および他の化合物の産生のための細胞に存在する。特定の非天然アミノ酸のための生合成法は天然、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には存在しえないが、本発明はかかる方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸のための生合成経路は場合により、新しい酵素を添加し、既存の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）経路を変更することによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において生成される。追加の新しい酵素は場合により天然または人工的に進化した酵素である。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成（国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの実施例に提示）は、他の生物からの既知の酵素の組合せの添加に依拠する。これらの酵素の遺伝子は、遺伝子を含んで成るプラスミドで細胞を形質転換することによって細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へ導入されうる。遺伝子は、細胞で発現されると、所望の化合物を合成する酵素経路を提供する。場合により添加される酵素の種類の例は、以下の実施例に示されている。追加の酵素配列は、例えば、ジェンバンクにおいて確認される。人工的に進化した酵素も場合により同じようにして細胞へ添加される。このようにして、細胞機構および細胞の資源は操作され、非天然アミノ酸を得る。
生合成経路における使用、または既存の経路の進化のための新規酵素を製造するさまざまな方法が利用可能である。例えば、マキシジェン社（Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．）（ワールドワイドウェブ上ではｗｗｗ．ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍ）によって開発された、例えば、反復組換えは場合により、新規酵素および経路を開発するために使用される。例えば、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、１９９４年、「ＤＮＡシャフリングによるインビトロの迅速進化（Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） 第３７０巻、第４号、ｐｐ．３８９−３９１、およびステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、１９９４年、「ランダムフラグメント化によるＤＮＡシャフリング：分子進化のためのインビトロ組換え（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ： Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、第９１巻、ｐｐ．１０７４７−１０７５１を参照。同様に、ジェネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）（ワールドワイドウェブ上ではｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍ）によって開発されたデザインパス（ＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ）（商標）は場合により、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＯ−メチル−Ｌ−トロシンを作り出す経路を設計する代謝経路エンジニアリングのために使用される。この技術により、例えば、機能的ゲノミクスにより同定される新しい遺伝子の組合せ、および分子進化とデザインを用いて宿主生物における既存の経路が再構成される。ダイバーサ社（Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ワールドワイドウェブ上ではｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍ）も、例えば、新しい経路を作り出す遺伝子および遺伝子経路のライブラリーを迅速にスクリーニングするための技術を提供する。
通常、本発明の生合成方法、例えば、コリスミ酸塩からｐ−アミノフェニルアラニン（ｐＡＦ）を作り出す経路は、細胞で産生される他のアミノ酸の濃度に影響を及ぼすことはない。例えば、コリスミ酸塩からｐＡＦを産生するために使用される経路は、細胞にｐＡＦを産生すると同時に、コリスミ酸塩から通常産生される他の芳香族アミノ酸の濃度は実質的に影響を受けない。通常、本発明の改変生合成経路により産生された非天然アミノ酸は、有効なポリペプチド生合成、例えば、天然細胞量に十分であるが、他のアミノ酸の濃度に影響を与え、または細胞資源を使い果たすような程度でない濃度で産生される。このようにしてインビボで産生される通常の濃度は、約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特異的経路に所望の酵素を製造するために遺伝子を含有するプラスミドで細菌が形質転換され、かつ２０の第１のアミノ酸、例えば、ｐＡＦ、ドーパ、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンなどが生成されると、リボソームポリペプチド合成と細胞成長の両方の非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために、場合によりインビボ選択が用いられる。
アルデヒド−またはケト−誘導体化アミノ酸を有するポリペプチドのライブラリーの発現
ポリペプチドのライブラリーを製造するために、その各々が１つもしくはそれ以上の、例えば、求電子、例えば、アルデヒドまたはケト誘導体化非天然アミノ酸を含み、発現ベクターへｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーを導入することができる。一部の実施形態においては、核酸ライブラリーによってコード化された各ポリペプチドの識別は、誘導化ポリペプチドが固体支持体に付着される前に既知である。他の実施形態においては、ライブラリーによってコード化される各ポリペプチドの識別は未知である。
適切である発現ベクターとしては、操作性の結合において、プロモーター、翻訳開始コドンとその後の選択コドン（翻訳開始コドンの直後または追加の「リーダー（ｌｅａｄｅｒ）」アミノ酸のためのコドンによって分離）、および発現されるポリペプチドをコード化するＤＮＡを導入しうる制限部位を有するものが挙げられる。この種類のベクターにより、個別のポリペプチドのそれぞれをコード化し、ポリヌクレオチドへ選択コドンを組込むポリヌクレオチドを突然変異させる必要なく、その各々が非天然アミノ酸を含む、多くの異なるポリペプチドを製造することが可能となる。この実施形態においては、ポリペプチドはアミノ末端の近くの誘導体化アミノ酸、おそらく、当該ポリペプチドが融合する「リーダー（ｌｅａｄｅｒ）」配列とともに発現される。他の実施形態においては、選択コドンは、細胞からポリペプチドの分泌を方向付けるシグナルペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列の下流に配置される。
あるいは、発現ベクターは、ポリペプチドコード化ＤＮＡが挿入されるべき制限酵素の下流に選択コドンを有しうる。選択コドンは、コード領域の端、または、「トレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）」アミノ酸の１つもしくはそれ以上のコドンによって停止コドンから分離された、上流でありうる。このベクターを用いて発現される誘導体化ポリペプチドは、ポリペプチドのカルボキシル末端またはその近くに非天然アミノ酸を有する。
もちろん、これらの構成には、挿入ＤＮＡおよびその選択コドンが同じリーディングフレームにあることが必要とされる。特徴付けられていないｃＤＮＡフラグメントの発現ベクターへの機能的転写を生成する可能性を改善するために、本発明は、クローニングで使用され、それぞれがクローニング制限部位に対して異なるリーディングフレームレジスタに選択コドンを有する一連の３つの発現ベクターを提供する。次いで、ＤＮＡ分子のライブラリーが、一連の発現ベクターの３つのメンバーすべてにクローン化され（別々に、または組合わせて）、発現のために細胞へ導入されうる。次いで、所望の長さであり、それらを必要に応じて固体支持体に付着させるポリペプチドを精製することができる。
本発明とともに使用されるベクターは、その使用のために必要であり、またはその使用を促進する種々の配列構成を含んで成りうる。例えば、発現ベクターは好ましくは、適切な終結シグナルを含む。一部の実施形態においては、ベクターは、ポリペプチドコード化ＤＮＡの導入に有用なエンドヌクレアーゼ制限部位のクラスターを含有するポリリンカーを含有する。発現ベクターは、発現融合ポリペプチドの精製を促進する分子タグ（例えば、ポリヒスチジンなど）のためのコドンも含みうる。
ターゲット核酸を細菌細胞へ導入する一部の公知の方法が利用可能であり、そのうちいずれかを本発明において使用することができる。これらに含まれるのは、ＤＮＡを含有する細菌の原形質体とレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、入射衝撃（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、およびウイルスベクターによる感染などである。細菌細胞を用いて、本発明のＤＮＡ構築物を含有するプラスミドの数を増幅することができる。細菌は、対数増殖期に増殖し、細菌内のプラスミドは当技術分野で周知のさまざまな方法によって単離されうる（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）を参照）。また、細菌からのプラスミドの精製のための多量のキットが市販されている（例えば、いずれもファルマシア バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）製のＥａｓｙＰｒｅｐ（商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商標）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製のＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（商標）、およびキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）製のＱＩＡｐｒｅｐ（商標）を参照）。次いで、単離され精製されたプラスミドはさらに操作され、細胞を形質転換し、または関連ベクターへ組込み、生物に感染させるために使用される他のプラスミドを生成する。
改変された宿主細胞は、例えば、スクリーニングステップ、プロモーターの活性化、または形質転換体の選択などの活動のために適切に修正された従来の培養液で培養されうる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物へ摂取されうる。
例えば、細胞の単離および培養（例えば、その後の核酸単離）のために他の有用な文献としては、フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）（１９９４年）、動物細胞の培養、基本技術マニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第３版、ワイリー・リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク州（ＮＹ）、およびその引例、ペイン（Ｐａｙｎｅ）ら（１９９２年）、液体系における植物細胞および組織培養（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ジョン ワイリー アンド サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）とフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）（編）（１９９５年）、植物細胞、組織、および器官培養（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ）、基本的方法シュプリンガー実験室マニュアル（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ）、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）（ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ） ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ） ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））、およびアトラス（Ａｔｌａｓ）とパークス（Ｐａｒｋｓ）（編）、微生物培地ハンドブック（Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ）（１９９３年）、ＣＲＣプレス（Ｐｒｅｓｓ）、フロリダ州ボーカラトーン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）が挙げられる。
分子生物学的方法を記載する一般的な教科書としては、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）とキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、分子クローニング技術ガイド、酵素学における方法（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１５２巻、アカデミック プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ））、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング−実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版）、第１−３巻、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド スプリング ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、２００１年（「サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」）、および分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、オーサベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、グリーン パブリッシング アソシエーツ社（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）とジョン ワイリー アンド サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）との共同事業（１９９９年中に補完）（「オーサベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）」）が挙げられる。これらの教科書には、突然変異誘発、ベクター、プロモーターの使用、およびその他多くの、例えば、非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交合成酵素、およびそのペアを含むポリペプチドの生成用の選択コドンを含む遺伝子の生成と関係した関連トピックが記載されている。
上記の文献に加えて、さまざまな精製／タンパク質折り畳み法が当技術分野で公知であり、例えば、アレイへのタンパク質のその後の結合のための、本発明におけるタンパク質の精製に適用されうるが、これらは、例えば、スコープス（Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ）、タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）（１９８２年）、ドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１８２巻：タンパク質精製ガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、アカデミック プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）（１９９０年）、サンダナ（Ｓａｎｄａｎａ）（１９９７年）タンパク質のバイオセパレーション（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）アカデミック プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ボラーグ（Ｂｏｌｌａｇ）ら（１９９６年）、タンパク質法、第２版（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ワイリー・リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク州（ＮＹ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）（１９９６年）、タンパク質プロトコールハンドブック（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、ヒューマナ プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）とアンガル（Ａｎｇａｌ）（１９９０年）、タンパク質精製の応用：実践的方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、英国、オックスフォード州オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ）、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）とアンガル（Ａｎｇａｌ）、タンパク質精製方法：実践的方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、英国、オックスフォード州オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ）、スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）（１９９３年）タンパク質精製：原理および実践、第３版（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク州（ＮＹ）、ジャンソン（Ｊａｎｓｏｎ）とライデン（Ｒｙｄｅｎ）（１９９８年）、タンパク質精製：原理、高分解能法、および応用、第２版（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）−ＶＣＨ、ニューヨーク州（ＮＹ）、およびウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）（１９９８年）、タンパク質プロトコール、ＣＤ−ＲＯＭ版（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ）、ヒューマナ プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、およびその引例に記載されているものを含む。タンパク質折り畳み法および他のインビトロタンパク質生合成に関する追加の詳細については、マースザル（Ｍａｒｓｚａｌ）らにおける米国特許第６，０３３，８６８号明細書（２０００年３月７日）に記載されている。
以下の実施例は、本発明の一部の実施形態および態様をさらに説明するために示されている。これらの実施例は、本発明の態様の範囲を制限することは意図されていない。特定の反応条件および試薬が記載されているが、当業者には、本発明の範囲から逸脱しない別のまたは同等の条件も本発明により使用されることを理解するであろう。
以下の実施例は、例示のために示されており、本発明を限定するためには示されていない。これらの実施例では、ケト−誘導化アミノ酸をポリペプチドへ導入する２つのシステムが記載されている。これらのシステムを用いて製造されるポリペプチドは、本明細書で記載されたタンパク質アレイにおける使用に適切である。
実施例１
ｐ−アセチル−ｌ−フェニルアラニンをポリペプチドへ組込むシステム
この実施例では、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを調製し、この非天然アミノ酸をポリペプチドへ組込むシステムが記載される。この非天然アミノ酸が組込まれるポリペプチドは、本発明の方法による固体支持体への付着に適切である。追加の実験の詳細については、例えば、国際公開第０２／０８６０７５号パンフレットを参照されたい。
最も知られた生物の遺伝子コードは、ポリペプチドの生体合成の構成単位として同じ共通の２０アミノ酸をコード化する。わずかにまれなケースでは、セレノシステイン（１）またはピロリジン（２、３）が添加される。共通アミノ酸の側鎖は、意外にも限られた数の官能基―窒素塩基、カルボン酸およびアミド、アルコール、およびチオール基を含んで成り、残りは、単純なアルカンまたは疎水基である。一般的にコード化されたアミノ酸を新しいアミノ酸、例えば、金属キレート、蛍光、レドックス活性、光活性、またはスピン標識側鎖を有するアミノ酸で補強する能力は、ポリペプチドおよびおそらく生物それ自身の構造および機能を操作する本発明者らの能力を顕著に増強するであろう。最近、本発明者らは、新しい成分を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の翻訳機構に添加することによって、高い忠実度で多くの非天然アミノ酸（４−６）をインビボでポリペプチドへ部位特異的に組込みうることを報告した。この実施例は、この方法がケト含有アミノ酸を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子コードに添加するように拡大されうること、およびケト基の独自の反応性を用いて、多種多様な薬剤によりインビトロでポリペプチドを選択的に修飾できることを示している。
ケト基は有機化学において遍在的であり、付加反応からアルドール縮合まで多数の反応に関与する。さらに、ケト基の独自の反応は、他のアミノ酸側鎖（７−９）の存在下のヒドラジドおよびヒドロキシルアミン誘導体により選択的に修飾されることを可能にする。補因子（１０）、代謝物（１１）中、およびポリペプチドへの翻訳後修飾（１２）として存在するが、この重要な官能基は共通アミノ酸の側鎖には存在していない。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの形で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてこの官能基を遺伝的にコード化するために、このアミノ酸を部位特異的にアンバーナンセンスコドンに反応して（かつ反応してのみ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のポリペプチドへ挿入することが可能であるｔＲＮＡ合成酵素のペアが展開された。重要なことには、このｔＲＮＡ合成酵素のペアは、共通の２０アミノ酸のその対応物に対して直交であり、すなわち、直交合成酵素（かつこの合成酵素のみ）が、非天然アミノ酸によってのみ直交ｔＲＮＡ（かつこのｔＲＮＡのみ）をアミノアシル化し、その結果として生じるアシル化ｔＲＮＡがアンバーコドンに反応してのみ非天然アミノ酸を挿入する。
材料と方法
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの調製
Ｆｍｏｃ−４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを、ＲＳＰアミノ アシド アナログ社（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｉｎｃ．）（マサチューセッツ州ウースター（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ））から購入した。この化合物（１．０ｇ、２．３ｍｍｏｌ）をピペリジン４ｍＬ（ＤＭＦ中２０％）で２時間、室温下に攪拌した。溶媒を蒸発させ、白色粉末を得た。次いで固体を１０ｍＬの冷水（０．１％ＴＦＡ）中に再懸濁し、ろ過によって上清を収集した。分取逆相ＨＰＬＣ（マイクロソルブ（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ）Ｃ１８、ライニン インスツルメント社（Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）（マサチューセッツ州ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ））を用いて、反応混合物から所望の生成物を分離した（３０分間にわたり０．１％ＴＦＡとともにＨ２Ｏ中５〜３０％ＣＨ３ＣＮ）。溶離液（ｔＲ＝１２分）を凍結乾燥し、白色固体（０．４５ｇ、８８％）を得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚＤ２Ｏ）：δ７．８５−７．２８（ｍ，４Ｈ）、４．２３（ｄｄ，１Ｈ，５．４Ｈｚ）、３．２（ｍ，２Ｈ）、２．７（ｓ，３Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：［Ｍ＋１］＋Ｃ１１Ｈ１３ＮＯ３２０８．０９で計算、実測値２０８．４７。
ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニン（１３）の合成
ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンイミド）を使用前に再結晶化した。ＮＢＳ（１８．５ｇ、１０５ｍｍｏｌ）を４００ｍＬの四塩化炭素中４−メチルアセトフォン（１３．４ｇ、１００ｍｍｏｌ）び攪拌溶液に添加した後、ＡＩＢＮ（２’，２’−アゾビシオスブチロニトリル）（０．４３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、反応混合物を加熱し、４時間還流した。反応（ＴＬＣ：８：１／へキサン：ＥｔＯＡｃ）の終了後、水（１×１００ｍＬ）、１Ｍ水性ＨＣｌ（３×１００ｍＬ）０．５％水性ＮａＨＣ３（３×１００ｍＬ）、および塩水（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を収集し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させ黄色固体を得、これはヘキサンで再結晶化され、所望の１−（４−ブロモエチル−フェニル）タノンを固体（１６．８ｇ、７８％）として得た。乾燥エタノール（５０ｍｌ）をペンタン洗浄ナトリウム片（２．３ｇ、０．１ｍｏｌ）にアルゴン雰囲気下、１５分間にわたって滴下し、溶液をさらに１５分間攪拌した。次いで、固体アセトアミドマロン酸ジエチル（２．７ｇ、１０ｍｍｏｌ）を攪拌しながら３０分間添加した後、１−（４−ブロモエチル−フェニル）タノン（２．１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥エタノール中、９０分間にわたって滴下した。混合液を加熱して一夜還流して冷却した後、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）および水（１００ｍＬ）を溶液に添加した。有機層を分離し、０．５％ＮａＨＣ３（３×１００ｍＬ）、および塩水（１×１００ｍＬ）で連続的に洗浄した。無水ＭｇＳＯ４で乾燥後、真空下に溶媒を除去し、褐色ゴム状固体を得た。ヘキサン−ジクロロメタン（４：１）を残留物に添加し、不溶性材料をろ過して除去し、ジクロロメタン−ベンゼン１０：１で徹底的に洗浄し、２−アセチルアミノ−２−（４−アセチル−ベンジル）マロン酸ジエチルエステルを黄色固体（３．３ｇ、９５％粗収率）として得た。この化合物をジオキサン中４Ｍ ＨＣｌで一夜攪拌した。次いで、混合物を蒸発させて乾燥し、水で再結晶化し、ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニン（１３．２ｇ、６４％全体的収率）を白色固体として得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ０）：δ７．８５−７．２８（ｍ，４Ｈ）、４．２７（ｄｄ，１Ｈ，５．４ＨＺ）、３．３０（ｍ，２Ｈ）、２．６８（ｓ，３Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ０）：δ１９５．８、１７４．３、１４５．９、１３３．１、１２８．９、１２７．８、６０．２、３８．３、２６．５。ＭＳ（ＥＳＩ）：［Ｍ＋１］＋Ｃ１１Ｈ１３ＮＯ３２０８．０９で計算、実測値２０８．０７。
変異合成酵素の進化
正の選択においては、プラスミドｐＹＣ−Ｊ１７を用いて、ｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）遺伝子およびクロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子をＡｓｐ１１２におけるＴＡＧ停止コドンとともに発現した（４）。ライブラリーをコード化するＴｙｒＲｓスーパーコイル状のＤＮＡをｐＹＣ−Ｊ１７を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞へ形質転換した。次いで、１％グリセロールおよび０．３ｍＭロイシン（ＧＭＭＬ）を１７μｇ／ｍＬテトラサイクリン、２５μｇ／ｍＬカナマイシン、６０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および１ｍＭ ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンとともに含有する最小培地プレート上に細胞をプレーティングした。３７℃下に４０時間のインキュベーション後、コロニーをプールし、プラスミドを単離した。変異合成酵素をコード化する（ｐＢＫプラスミド）を、ゲル電気泳動を用いてｐＹＣ−Ｊ１７から分離し、負の選択のためにｐＬＷＪ１７Ｂ３を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞へ形質転換した。プラスミドｐＬＷＪ１７Ｂ３は、ｌｐｐプロモーターおよびｒｒｎＣターミネーターの制御下にｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）遺伝子を発現し、かつアラビノースプロモーターの制御下にＧｌｎ２、Ａｓｐ４４、およびＧｌｙ６５における３つのアンバーコドンとともにバルナーゼ遺伝子を発現する。形質転換細胞を０．２％アラビノース、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および３５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有ＬＢ（ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ））プレート上で成長させた。８時間後、細胞をプレートから除去し、ｐＢＫプラスミドをその後の一連の選択のために精製した。第２回および第３回の正の選択においては、クロラムフェニコールの濃度をそれぞれ、８０および１００μｇ／ｍＬに増大させた。３つの正の選択を２つの負の選択を交互に行った後、インビボＣＡＴアッセイにおいて、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの非存在下クロラムフェニコール９μｇ／ｍｌおよびｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの存在下クロラムフェニコール１２０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値を示す１１個の変異ＴｙｒＲＳが確認された（１４）。これらの変異ＴｙｒＲＳのポリペプチド配列は３つの独立したクローンＬＷ１、ＬＷ５、およびＬＷ６上に集中したが、各ＴｙｒＲＳのコドンの用法は異なる。
ポリペプチドの発現および精製
プラスミドｐＬＥＩＺを用いて、バクテリオファージＴ５プロモーターおよびｔ０ターミネーターの制御下に第７位におけるアンバーコドンおよびＣＯＯＨ−末端Ｈｉｓ６ｔａｇとともにＺドメインイ遺伝子、およびｌｐｐプロモーターおよびｒｒｎＣターミネーターの制御下にｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）遺伝子を発現した。クローンＬＷ１（ＬＷ１ＲＳ）から単離された変異合成酵素遺伝子を、構成性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＩｎＲＳプロモーターおよびターミネーターの制御下にプラスミドｐＢＫ−ＬＷ１ＲＳでコード化された。ｐＬＥＩＺおよびｐＢＫ−ＬＷ１ＲＳと同時形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを、１％グリセロールおよび０．３ｍＭロイシン（ＧＭＭＬ培地）を、２５μｇ／ｍＬカナマイシン、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および１．０ｍＭ ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニンとともに含有する最小培地で成長させた。細胞が０．５のＯＤ６００に達した場合、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）を添加し、ポリペプチドの発現を誘発した。５時間後、細胞をペレット化し、メーカーのプロトコール（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））に従い変性状態下にＮｉ２＋親和性クロマトグラフィーによってポリペプチドを精製した。次いで、ポリペプチドをＰＤ−１０カラム（アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））で脱塩、水中に溶出した。ポリペプチドの収量をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（ＢＣＡキット、バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））。ポリペプチドのアリコートをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および質量分析のために使用した。
フルオレセインヒドラジドおよびビオチンヒドラジドによるインビトロポリペプチド修飾
精製野生型（ｗｔ）および変異Ｚドメインポリペプチドをリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ緩衝液、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．５、０．５Ｍ塩化ナトリウム）へ透析によって交換した。フルオレセインヒドラジド１（モレキュラー プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））またはビオチンヒドラジド２（モレキュラー プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））をＤＭＦ中に溶解し、シラン化エッペンドルフ管中の各ポリペプチド０．０７μｍｏｌへ添加し、最終濃度を１ｍＭにした。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を添加し、最終体積を０．５ｍｌにした。反応混合物を２５℃下に１８時間維持した。未反応染料またはビオチンをＰＤ−１０カラム（アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用いてポリペプチドから回収し、ポリペプチドをＰＢＳ緩衝液で溶出した。次いで、標識効率を判定するために、溶出ポリペプチドサンプルを逆相ＨＰＬＣ（アジレント ゾルバックス（Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ）ＳＢ−Ｃ１８、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、流量１．０ｍＬ／分、水性５０ｍＭ酢酸トリエチルアミン緩衝液中１０→４０％ＣＨ３ＣＮ、ｐＨ７．０、７０分間）によって分析した。標識なしの変異Ｚドメインの滞留時間（ｔＲ）は３９．３分であり、フルオレセインヒドラジド標識変異ＺドメインのｔＲは４０．７分であり、ビオチンヒドラジド標識変異ＺドメインのｔＲは４０．９分であった。
蛍光スペクトルの測定
全蛍光放射スペクトルをフルオロマックス（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ）−２分光蛍光光度計（インスツルメンツＳ．Ａ．社（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州エディソン（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））を用いて、励起４９０ｎｍ、励起および放射帯域４ｎｍ、光電子増倍管電圧９５０Ｖ、および走査速度１ｎｍ／秒で記録した。１０ｎｍｏｌの各標識ポリペプチドを使用した。報告スペクトルは、３つの走査の平均を表す。
結果と考察
ケトアミノ酸
ケト基は、カルボニル基または酸性Ｃα位置のいずれかを含む付加反応に関与するその能力により共通の２０アミノ酸に存在しない独自の反応性を示す。この基は、多種多様の化学試薬によるポリペプチドの選択的修飾のための天然アミノ酸システインに代わるものも提供する。システインの反応性チオール基は、種々の生物物理学的プローブをポリペプチドに付着させるために広く使用されている（１５−２２）。残念ながら、単一システイン残基の標識はしばしば、ポリペプチドにおける２個以上の反応性残基の存在、およびジスルフィド結合が使用される場合に遊離チオール存在下の交換反応によって複雑化する。したがって、直交反応性を有する非タンパク質性アミノ酸の利用可能性は、単一システインが選択的に標識されえない場合、かつ２つの異なる標識が必要である場合にポリペプチドの選択的修飾を可能にする。ケト基は、水溶液中のマイルドな条件下にヒドラジド、ヒドロキシルアミン、およびセミカルバジドと容易に反応し、それぞれ生理的条件下に安定であり、ヒドラゾン、オキシム、およびセミカルバゾン結合を形成する（２３、２４）。
一部の方法は、カルボニル基をペプチドおよび小ポリペプチドへ選択的に組込むために開発されている。当初、アルデヒドは、Ｎ末端セリンまたはトレオニンを過ヨウ素酸塩で酸性化することによってペプチドのＮ末端に導入された。アルデヒド基は、ビオチンおよび蛍光受容体に結合され（８）、またはヒドラゾン結合を通じてＣＯＯＨ末端ヒドラジドを含有するポリペプチドフラグメントに結合された（２５）。この方法によって導入されるカルボニル基はＮ末端に制限され、ポリペプチドは酸化に対して安定である必要がある。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）はその後、ヒドラジドまたはヒドロキシルアミンのいずれかを含有するペプチドセグメントの調製に使用され、これらはその後に分岐アルデヒドコアマトリックスと反応し、ペプチドデンドリマーを形成し（２４、２６）、またはペプチドセグメントを含有するケトと反応し、合成ポリペプチドを形成する（２７）。ＳＰＰＳはケト基がポリペプチドを通じて組込まれることを可能にするが、大きなペプチドまたはポリペプチドの合成と関連した固有の障害を受ける。このサイズ制限は、場合によっては、合成ペプチドが組換えポリペプチドのＣＯＯＨ末端に化学的にライゲートされる発現タンパク質ライゲーション（ＥＰＬ）によって克服されうる（２８）。ペプチドを含有するケトン基はＳＰＰＳによって調製され、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）タンパク質チロシンキナーゼのＳｒｃ相同３ドメインにライゲートされた（２９）。
ケト基をポリペプチドへ組込むためにインビドロ生合成も使用されている（７）。この方法では、ケト基を含有する非天然アミノ酸が化学的にアンバーサプレッサーｔＲＮＡにアシル化される。アシル化ｔＲＮＡおよび変異遺伝子が、ポリペプチド生合成を支持する能力があるインビドロ抽出物において結合される場合、非天然アミノ酸はＵＡＧコドンに反応して選択的に組込まれる。この方法は、インビトロで非天然アミノ酸により化学的にアミノアシル化されるサプレッサーｔＲＮＡを必要とし、アシル化ｔＲＮＡは翻訳中に化学量論的試薬として消費され、再生されえず、結果として低いポリペプチド収量となる。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンに対する特異性により直交ｔＲＮＡ合成酵素ペアを進化させることによって、生きた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において直接ＵＡＧコドンに反応してケトアミノ酸をポリペプチドへ組込むことが可能となる。それが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されうる限り、ターゲットポリペプチド上にはサイズ制限はありえず、大量の変異ポリペプチドを発現することが可能となる。さらに、標準試薬が細胞浸透性かつ非毒性である限り、全細胞に標識を選択に導入することが可能とみられる。
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンに対する特異性による変異合成酵素の進化
メタン生成菌（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）チロシン−ｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）および変異チロシンアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ））を直交ｔＲＮＡ合成酵素ペアの発生の開始点として用いた。以前、このペアは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において直交であることが示された（１４、３０）。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンをチャージし、共通の２０アミノ酸のいずれもチャージしないようにＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を変更するために、メタン生成菌（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＴｙｒＲＳ変異のライブラリーを発生させ、スクリーニングした。相同性バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴｙｒＲＳの結晶構造（３１）を用いて、結合チロシンのアリール環のパラ配位の６．５Å内である残基を確認した。メタン生成菌（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＴｙｒＲＳの活性部位における５つの対応する残基（Ｔｙｒ３２、Ｇｌｕ１０７、ＡｓｐＩ５８、Ｉｌｅ１５９ａ、およびＬｅｕ１６２）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって無作為に変異させ、サイズが１．６×１０９のライブラリーを発生させた（４）。このＴｙｒＲＳ変異ライブラリーは最初に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドｐＹＣ−Ｊ１７（４）でコード化されたクロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子における不必要な残基（Ａｓｐ１１２）でのアンバー停止コドンの抑制に基づく１ｍＭ ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの存在下に正の選択を通過した。クロラムフェニコール中に生存する細胞は、１つもしくは複数の共通アミノ酸またはｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのいずれにかによりｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）をアミノアシル化する変異合成酵素をコード化する必要がある。次いで、変異合成酵素をコード化するＤＮＡを単離し、許容部位（プラスミドｐＬＷＪ１７Ｂ３でコード化）での３つのアンバーコドンを含有する毒性ポリペプチドの遺伝子、雄性不稔を発現する負の選択の株へ形質変換した。天然アミノ酸とともにｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）をチャージする変異合成酵素をコード化する細胞は、雄性不稔を産生して死ぬ。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンは負の選択における成長培地に添加されなかったため、生存細胞は非天然アミノ酸に対する特異性で合成酵素をコード化する必要がある。２回の負の選択と交互に行うクロラムフェニコールの濃度を上昇させる３回の正の選択の後、クロラムフェニコールにおけるその生存がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの添加に依存する多くのクローンが出現した。これらのＴｙｒＲＳは、ＣＡＴ遺伝子におけるＡｓｐ１１２ＴＡＧコドンの抑制に基づくインビボアッセイを用いて特徴付けられた（１４）。１１個のＴｙｒＲＳ変異が確認された。選択合成酵素およびｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）を発現する細胞は、１％グリセロールおよび０．３ｍＭロイシンを含有する最小培地プレート（ＧＭＭＬプレート）上の９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールでｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの非存在下に生存し、非天然アミノ酸の存在下に、細胞はＧＭＭＬプレート上の１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール中で生存した。この結果は、選択変異合成酵素が、天然アミノ酸に対してよりもｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンに対して高い活性を有することを示す。これら変異のＤＮＡのシークエンシングは、それらがポリペプチドレベル（ＬＷ１、ＬＷ５、およびＬＷ６）で３つの独立した変異に集中するが、アミノ酸に対する異なるコドン用法を有することを示した。変異合成酵素の活性部位変異は表１に示されている。バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの相同性ＴｙｒＲＳの結晶構造に基づき、メタン生成菌（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）Ｔｙｒ３２およびＡｓｐ１５８は、基質チロシンのヒドロキシル基との水素結合を形成する可能性がある。変異合成酵素においては、Ｔｙｒ３２がＬｅｕまたはＡｌａのいずれかに変異され、Ａｓｐ１５８はＧｌｙ１５８に変異される。これらの変異はチロシンの結合を嫌い、かつ同時にｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのメチル基に適合する余分の空間を作り出しうる。本発明者らは、これら変異の正確な役割を理解するために、変異の結晶構造を解く過程にある。
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含有する変異ポリペプチドの特性
進化合成酵素およびｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）のｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンをポリペプチドへ組込む能力を試験するために、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）タンパク質ＡのＺドメインに対する遺伝子における許可部位（Ｌｙｓ７）（３２）でＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ６ｔａｇと置換した。Ｚドメインは約７．９ｋＤの分子量を有し、その質量はイオンサイクロトン共鳴質量分析を用いてきわめて高い精度で測定されうる。ｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）、ＬＷ１ＲＳ、およびＺドメイン遺伝子（Ｌｙｓ７ＴＡＧ）で形質転換された細胞を１ｍＭ ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニンの存在下に成長させた。非天然アミノ酸の添加は、細胞の成長速度に影響を及ぼすことはなかった。最小培地中の全体的な単離収量３．６ｍｇ／ＬでＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーによって変異ポリペプチドを精製した。ちなみに、Ｚドメインの収量は、変異ＴｙｒＲＳを野生型（ｗｔ）ＴｙｒＲＳと置換すると最小倍中９．２ｍｇ／Ｌであった。ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニン、ｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）、またはＬＷ１ＲＳのいずれかの非存在下にＺドメインは得られず、この部位では非天然アミノ酸の組込みにおけるきわめて高い忠実度を示した。本発明者らは、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンをＣｄｃ４２など他のタンパク質への組込みにも成功している。
ｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）／ｗｔＴｙｒＲＳによって発現されたｗｔＺドメインタンパク質とｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）／ＬＷ１ＲＳによって発現されたＺドメインポリペプチドの両方をエレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ ＭＳ）によって分析した。ｗｔＺドメインタンパク質については、完全タンパク質、第１のメチオニンを含まないタンパク質、および第１のメチオニンを含まないタンパク質のアセチル化形態に対応する質量で３つのピークが確認された（Ｎ末端トリプシン消化ペプチドフラグメントのタンデム質量分析によって確認された）。変異Ｚドメインタンパク質については、完全タンパク質の実験的モノアイソトピック質量は７９４９．８９３Ｄａであったが、これは７９４９．８７４Ｄａの理論的質量２．２ｐｐｍ内である。２つの他のピークはそれぞれ、第１のメチオニンを含まないタンパク質（Ｍ実験的＝７８１８．８３８Ｄａ、Ｍ理論的＝７８１８．８３３Ｄａ）およびそのアセチル化形態（Ｍ実験的＝７８６０．８４３Ｄａ、Ｍ理論的＝７８６０．８４４Ｄａ）に対応する。アンバーコドン位置で他のアミノ酸を含む変異タンパク質に対応するピークはスペクトル中では確認されなかった。完全タンパク質の質量スペクトル中で確認された１５００超の信号対雑音比は、９９．８％超のｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの組込みに対する忠実度に変換する。トリプシン消化の液体クロマトグラフィータンデム質量分析を行い、ＮＨ２末端ぺプチドの配列を確認した。ＮＨ２末端トリプシンペプチドＭＴＳＶＤＮＹ＊ＩＮＫの二重電荷分子イオンに対応する６０６．２３Ｄａでの前駆イオンを単離し、イオントラップ質量分析計（ＩＴＭＳ）でフラグメント化した。フラグメントイオン質量は明らかに割り当てられうるが、これによりｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの部位特異的組込みが確認される。これらの結果は、ｍｕｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）とともに進化合成酵素が、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンをアンバーコドンによってコード化された位置へ組込み、いかなる天然アミノ酸をも他の位置へは組込まないことを明らかに示す。
フルオレセインヒドラジドによる部位特異的ポリペプチド修飾
本発明者らは次に、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのケト基が、インビトロでポリペプチドの部位特異的修飾の化学ハンドルとして機能を果たしうるかどうかを判定した。精製変異ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンＺドメインポリペプチド（変異Ｚドメイン）およびｗｔＺドメインポリペプチドを１ｍＭフルオレセインヒドラジド（スキーム１）で２５℃下１８時間、リン酸緩衝液中で処理した。反応後、ポリペプチドをサイズ排除クロマトグラフィーによって過剰なフルオレセインヒドラジドから分離し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。ゲルを最初にフルオロイメージングシステムで撮像し、次いで銀染色した。変異Ｚドメインのバンドは蛍光シグナルを示すが、ｗｔＺドメインバンドからの蛍光は検出されえない。これら２つのポリペプチドのアリコートを用いて、励起４９０ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含有するＺドメインポリペプチドのみが、フルオレセインのものと同様の蛍光スペクトルを示す。ｗｔＺドメインの蛍光シグナルは検出されなかったが、これはヒドラジドとケトンとの間でのみ標識反応が生じ、ｗｔポリペプチドの既存の官能基では生じないことを示す。標識生成物を四極飛行時間型質量分析（ＱＴＯＦ ＭＳ）で分析した。８４２５．１６０Ｄａの実験的モノアイソトピック質量（Ｍ理論的＝８４２４．９５８Ｄａ）を得たが、これによりフルオレセインヒドラジドがモル比１：１で変異Ｚドメインポリペプチドと反応したことが確認される。標識の程度を判定するために、反応混合物を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離した。非標識Ｚドメインのものに対する標識Ｚドメインのピーク面積の比率は９０±５％であった。
ビオチンヒドラジドによる部位特異的ポリペプチド修飾
この方法の一般性を証明するために、本発明者らはＺドメインをビオチンヒドラジド誘導体（式ＩＶ）でも標識した。精製変異およびｗｔＺドメインを１ｍＭビオチンヒドラジドでリン酸緩衝液中２５℃下に１８時間処理した。リン酸緩衝液に対する透析により過剰なビオチンヒドラジドを除去した後、ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。分離ポリペプチドをニトロセルロース膜に移し、ビオチン特異的アビジンＨＲＰ共役でプローブした。予想どおり、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含有する変異Ｚドメインのみが検出され、これがビオチンヒドラジドで標識されたことを示した。ｗｔＺドメインの蛍光シグナルは検出されなかった。標識効率は、フルオレセイン標識実験において記載されたＨＰＬＣ分析によって測定されるように、８０±１０％であった。標識ポリペプチドは、ＱＴＯＦ ＭＳ（Ｍ実験的＝８４１６．２３６、Ｍ理論的＝８４１６．１４６Ｄａ）によって、ビオチンヒドラジドの１つの分子と変異Ｚドメインの１つの分子との間に形成された生成物であることが確認された。これらの実験は、ポリペプチドのインビトロ修飾に対するケトンハンドルの優れた特異性を示す。このハンドルを用いて、固体支持体（または、次いで固体支持体結合部分を結合または反応しうるリンカー）上の対応する基と結合または反応し、本発明のアレイを形成しうる。
ｐ−アセチルフェニルアラニンの固体支持体への付着
ｐ−アセチルフェニルアラニン組込みＤＨＦＲタンパク質を、ヒドラジン誘導化リンカーが付着している固体支持体と接触させる。カルボニル基は迅速に水溶液中のヒドラジドと接触し、生理的条件下に安定であるヒドラゾンを形成する（シャオ（Ｓｈａｏ），Ｊ．、タム（Ｔａｍ），Ｊ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５年（１１７）、ｐｐ．３８９３−３８９９）。この化学反応は、フルオレセインヒドラジドによる精製Ｔ４リゾチームを含有するケトンを特異的に標識することにシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）らによって使用されている（コルニッシュ（Ｃｏｒｎｉｓｈ），Ｖ．Ｗ．、ハーン（Ｈａｈｎ），Ｋ． Ｍ．、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ），Ｐ．、Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１８、ｐｐ．８１５０−８１５１（１９９６年））。
精製ｐ−アセチルフェニルアラニン組込みＤＨＦＲタンパク質は、水性緩衝液中にヒドラジン誘導化リンカーで処理される。同時の対照として、精製ｐ−メトキシフェニルアラニン組込みＤＨＦＲタンパク質が同じ反応条件にかけられる。反応後、精製ｐ−アセチルフェニルアラニン組込みＤＨＦＲは固体支持体に付着されるが、ｐ−メトキシフェニルアラニンは付着されない。
結論
要約すれば、本発明者らは、新規な化学官能基、ケト基をポリペプチドへインビボで組込んだ。この官能基は、ケト基とヒドラジド誘導体との間の特異的化学反応によってインビトロでフルオレセインおよびビオチンで選択的かつ有効に標識されうる。この方法は、増強された触媒または治療特性を有するタンパク質を生成するタンパク質構造および機能のプローブとして、または固定化または溶性ポリペプチドを用いるバイオアッセイの開発のために、多種多様な他のヒドラジドまたはヒドロキシルアミン誘導体（糖、スピンラベル、金属キレート剤、架橋剤、ポリエーテル、脂肪酸、および毒素を含む）でポリペプチドを選択的に標識することを可能にする。生細胞において直接的に独自の化学ハンドルを部位特異的に組込む能力は、タンパク質の局在、タンパク質の運動、および分子的解析でのタンパク質における立体構造変化のインビボ撮像のための小分子フルオロフォアによるポリペプチドのインビボ修飾を可能にする。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含有するポリペプチドの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるフルオロフォアでのインビボ標識もこの方法によって可能となる。
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実施例２
メタ−チロシン類似体のインビボ組込み
メタ−チロシン類似体によるｍｔＲＮＡ（Ｔｙｒ／ＣＵＡ）のアミノアシル化（国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの実施例１に記載）のために直交ＴｒｙＲＳを生成した。
変異ＴｙｒＲＳライブラリープラスミドの調製。一般に国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの実施例１に記載された方法に従いメタ置換チロシン誘導体で方向づけられた変異メタン生成菌（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＴｒｙＲＳをコード化するプラスミドのライブラリーを構成した。手短に言えば、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴｙｒＲＳの結晶構造における結合チロシンのアリール環のメタ位置の６．９Åであるメタン生成菌（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＴｒｙＲＳの活性部位における６つの残留物（Ｔｙｒ３２、Ａｌａ６７、Ｈｉｓ７０、Ｇｌｎ１５５、Ａｓｐ１５８、Ａｌａ１６７）を、上記実施例１に記載されているＮＮＫコドンスキームを用いてＤＮＡレベルですべて２０アミノ酸に変異させた。構成されたプラスミドライブラリーｐＢＫ−ｌｉｂは、約１×１０９の独立クローンを含有した。
ｍ−アセチルフェニルアラニンの組込みのための直交ｔＲＮＡ合成酵素ペアの展開。３回の正の選択および２回の負の選択の後、そのクロラムフェニコール中の生存が非天然アミノ酸の添加に依存した５つの候補クローン（国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの配列番号：１７−２１）が出現した。ｍ−アセチルフェニルアラニンの非存在下、３つの変異ＴｒｙＲＳプラスミドの１つを持つ細胞のクロラムフェニコールに対する耐性のＩＣ５０は２０μｇ／ｍｌである。ｍ−アセチルフェニルアラニンの存在下、同じ細胞のクロラムフェニコールに対する耐性のＩＣ５０は１００μｇ／ｍｌである。これら２つの数字間の大きな差は、細胞における天然アミノ酸上のｍ−アセチルフェニルアラニンの組込みを特定する選択合成酵素の能力を反映する。ｍ−メトキシフェニルアラニンのデータは同様であった。すなわち、５つのクローンが単離された（国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの配列番号：２２−２６）。
ＤＨＦＲを組込んだ非天然アミノ酸のポリペプチド発現。上記選択されたｍ−メトキシフェニルアラニンおよびｍ−アセチルフェニルアラニン合成酵素を用いて、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの実施例１に既述されたＤＨＦＲにおけるアンバーコドンに応じて関連非天然アミノ酸を組込んだ。陰性対照として、直交ペアのｔＲＮＡ合成酵素とＤＨＦＲをコード化するアンバー変異ベクターの両方を含有する細胞が非天然アミノ酸の非存在下に成長した。ポリペプチド発現の結果は、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの図１０に示されている。これらの結果は、非天然ｍ−メトキシフェニルアラニンとｍ−アセチルフェニルアラニンを組込むｔＲＮＡ合成酵素の直交ペアの特異性を明らかに示した。発現ＤＨＦＲタンパク質の収量は、両方の場合の培養株の約０．５ｍｇ／Ｌである。
メタアセチルフェニルアラニンを用いてポリペプチドを固体支持体に付着させる。ｍ−アセチルフェニルアラニン組込みＤＨＦＲタンパク質を、ヒドラジン誘導化リンカーが付着している固体支持体と接触させる。カルボニル基は迅速に水溶液中のヒドラジドと接触し、生理的条件下に安定であるヒドラゾンを形成する（シャオ（Ｓｈａｏ），Ｊ．、タム（Ｔａｍ），Ｊ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５年（１１７）、ｐｐ．３８９３−３８９９）。この化学反応は、フルオレセインヒドラジドによる精製Ｔ４リゾチームを含有するケトンを特異的に標識することにシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）らによって使用されている（コルニッシュ（Ｃｏｒｎｉｓｈ），Ｖ．Ｗ．、ハーン（Ｈａｈｎ），Ｋ． Ｍ．、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ），Ｐ．、Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１８、ｐｐ．８１５０−８１５１（１９９６年））。
精製ｍ−アセチルフェニルアラニン組込みＤＨＦＲタンパク質は、水性緩衝液中にヒドラジン誘導化リンカーで処理される。同時の対照として、精製ｍ−メトキシフェニルアラニン組込みＤＨＦＲタンパク質が同じ反応条件にかけられる。反応後、精製ｍ−アセチルフェニルアラニン組込みＤＨＦＲは固体支持体に付着されるが、ｍ−メトキシフェニルアラニンは付着されない。
これらの実験は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するポリペプチドの有用性の一例を示す。他の化合物を用いて、ポリペプチドを少なくとも１つの非天然アミノ酸でインビボ標識することができる。例としては、例えば、ビオチン、ヒドラジド、および他のヒドラジド誘導体が挙げられる。
本明細書に記載された実施例および実施形態は、例示目的に限定されており、それを踏まえて種々の修正または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内ならびに添付請求項の範囲内に含まれることが理解される。本発明は種々の具体的な実施形態に関連して記載されているが、請求される発明はかかる具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないと理解するべきである。実際には、当業者に認識される発明を実施する記載された態様の種々の修正が、請求項の範囲内で意図されている。
本明細書中で引用された刊行物、特許、および特許出願はすべて、すべての目的のためにその全体が参照することにより本明細書に援用される。
種々の実施形態を示す概略図である。各パネルは、固体支持体に付着したポリペプチドの異なる構成を示し、ここでポリペプチド（１）は白色で示され、ポリペプチド内の非天然アミノ酸（２）は斜交平行模様で示され、反応基は星印で示され、固体支持体（３）は格子縞模様で示され、共有付着は真黒の棒で示され（４）、リンカー部分（５）は斑点模様で示され、正電荷および負電荷部分は丸で囲んだ＋または−（それぞれ、６および７）を用いて示され、他の部分は追加の参照番号で示されている。 種々の実施形態を示す概略図である。各パネルは、固体支持体に付着したポリペプチドの異なる構成を示し、ここでポリペプチド（１）は白色で示され、ポリペプチド内の非天然アミノ酸（２）は斜交平行模様で示され、反応基は星印で示され、固体支持体（３）は格子縞模様で示され、共有付着は真黒の棒で示され（４）、リンカー部分（５）は斑点模様で示され、正電荷および負電荷部分は丸で囲んだ＋または−（それぞれ、６および７）を用いて示され、他の部分は追加の参照番号で示されている。

Claims (66)

  1. 固体支持体に付着したポリペプチドを含んで成るタンパク質アレイであって、前記ポリペプチドが（ａ）反応基を含む第１の側鎖を含んだ少なくとも第１の反応性非天然アミノ酸と、（ｂ）第１の側鎖とは異なる第２の側鎖を含んだ第２の非天然アミノ酸とを含み、
    第１の側鎖と第２の側鎖とを含んだポリペプチドが、固体支持体への付着の前に細胞内で産生され、かつ前記ポリペプチドが、第１の反応基と固体支持体に付着した第２の反応基とを反応させることにより生成される共有化学結合によって前記固体支持体に付着し、
    ポリペプチド内の第２の非天然アミノ酸が、固体支持体の第２の反応基と反応しないタンパク質アレイ。
  2. 前記第１の反応基が、求電子剤、ケトまたはアルデヒド部分を含んで成り、かつ前記第２の反応基が求核部分であり、あるいは、前記第１の反応基が求核部分であり、かつ前記第２の反応基が求電子剤、ケトまたはアルデヒド部分を含んで成る、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  3. 前記求核部分が、−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲＩ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、または−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）より成る群から選択され、ここで各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立してＨ、または１−６個の炭素を有するアルキルである、請求項２に記載のタンパク質アレイ。
  4. 前記求核部分が、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、およびカルボニルヒドラジドより成る群から選択される、請求項３に記載のタンパク質アレイ。
  5. 前記反応生成物が、オキシム、アミド、ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、またはチオセミカルバゾンである、請求項２に記載のタンパク質アレイ。
  6. 前記反応生成物が還元ヒドラゾンを含んで成る、請求項５に記載のタンパク質アレイ。
  7. 前記反応生成物が両性剤（ｄｉｐｏｌａｒｏｐｈｉｌｅ）反応の生成物である、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  8. １つもしくはそれ以上の付着ポリペプチドが、少なくとも５０アミノ酸の長さである、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  9. １つもしくはそれ以上の付着ポリペプチドが、少なくとも１００アミノ酸の長さである、請求項８に記載のタンパク質アレイ。
  10. 少なくとも５０％の付着ポリペプチドが、少なくとも５０アミノ酸の長さである、請求項８に記載のタンパク質アレイ。
  11. 少なくとも５０％の付着ポリペプチドが、少なくとも１００アミノ酸の長さである、請求項１０に記載のタンパク質アレイ。
  12. 少なくとも１つの付着ポリペプチドが全長ポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  13. 少なくとも１つの付着ポリペプチドが、全長ポリペプチドのフラグメントまたは一部分である、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  14. 前記アレイが複数の異なるポリペプチドを含んで成る、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  15. 前記アレイが少なくとも１０種類のポリペプチドを含んで成る、請求項１４に記載のタンパク質アレイ。
  16. 前記アレイが少なくとも１００種類のポリペプチドを含んで成る、請求項１５に記載のタンパク質アレイ。
  17. 前記アレイが少なくとも１０００種類のポリペプチドを含んで成る、請求項１６に記載のタンパク質アレイ。
  18. 前記タンパク質アレイが論理的アレイである、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  19. 前記タンパク質アレイがマイクロウェルプレートを含んで成る、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  20. 前記ポリペプチドが、固体支持体を含んで成るビードに添加されている、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  21. 少なくとも１つの付着ポリペプチドが翻訳後プロセッシングにかけられる、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  22. 前記翻訳後プロセッシングが、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリストイル化、プレニル化、またはタンパク質分解プロセッシングを含んで成る、請求項２に記載のタンパク質アレイ。
  23. 前記ポリペプチドが天然ポリペプチドと相同性である、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  24. 少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んで成る前記ポリペプチドがインビボで生成される、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  25. 少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んで成る前記ポリペプチドが合成的に生成される、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  26. 少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んで成る前記ポリペプチドが、選択コドンと、前記選択コドンに相補的なアンチコドンループを含んで成る直交サプレッサーｔＲＮＡと、非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素とを含んで成るヌクレオチドアレイを含んで成る翻訳システムを用いて生成され、かつ前記非天然アミノ酸が前記選択コドンの部位で前記ポリペプチドへ組込まれている、請求項１に記載のタンパク質アレイ。
  27. 少なくとも１つのポリペプチドを固体支持体に付着させるための方法であって、前記方法が、
    第１の側鎖反応基を含んで成る少なくとも第１の非天然アミノ酸を前記ポリペプチドへ組込み、第１の側鎖の構造とは異なる構造の第２の側鎖を含む第２の非天然アミノ酸を組込むステップと、
    前記固体支持体に付着している第２の反応基と前記第１の反応基を反応させ、それによって共有結合を形成し、かつ前記ポリペプチドを前記固体支持体に付着させるステップと
    を含み、
    前記ポリペプチド内の第２の非天然アミノ酸が、固体支持体の第２の反応基と反応しない、前記方法。
  28. 前記第１の反応基が、求電子剤、ケトまたはアルデヒド部分を含んで成り、かつ第２の反応基が求核部分を含んで成り、あるいは、前記第１の反応基が求核部分を含んで成り、かつ前記第２の反応基が求電子剤、ケトまたはアルデヒド部分を含んで成る、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記第１の反応基、前記第２の反応基、または両方が化学保護部分を含んで成り、かつ前記方法が反応ステップ前に保護反応基を脱保護するステップをさらに含んで成る、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記脱保護ステップが光脱保護を含んで成る、請求項２９の記載の方法。
  31. 前記ポリペプチドがインビボ翻訳システムで生成される、請求項２７に記載の方法。
  32. 前記ポリペプチドが合成的に生成される、請求項２７に記載の方法。
  33. 少なくとも１つの付着ポリペプチドが翻訳後プロセッシングにかけられる、請求項２７に記載の方法。
  34. 前記翻訳後プロセッシングが、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリストイル化、プレニル化、またはタンパク質分解プロセッシングを含んで成る、請求項３３に記載の方法。
  35. 少なくとも１つの付着ポリペプチドが全長ポリペプチドである、請求項２７に記載の方法。
  36. 少なくとも１つの付着ポリペプチドが全長ポリペプチドのフラグメントまたは一部である、請求項２７に記載の方法。
  37. 求核部分が、−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲＩ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、または−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）より成る群から選択され、ここで各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立してＨ、または１−６個の炭素を有するアルキルである、請求項２８に記載の方法。
  38. 前記求核部分が、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、およびカルボニルヒドラジドよりなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記第２の反応基が、前記固体支持体に付着しているリンカーを含んで成る、請求項２７に記載の方法。
  40. 前記リンカーが、前記第１の反応基が前記第２の反応基と反応した後の前記固体支持体に付着している、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記第１の反応基が、前記ポリペプチドに付着しているリンカーを含んで成る、請求項２７に記載の方法。
  42. 前記タンパク質アレイが論理的アレイである、請求項２７に記載の方法。
  43. 前記タンパク質アレイがマイクロウェルプレートを含んで成る、請求項２７に記載の方法。
  44. 前記ポリペプチドが、固体支持体を含んで成るビードに添加されている、請求項２７に記載の方法。
  45. 複数のポリペプチドを前記固体支持体に付着させるステップをさらに含んで成る、請求項２７に記載の方法。
  46. 前記ポリペプチドの各々が、前記固体支持体の個別領域に付着し、タンパク質アレイを形成する、請求項４５に記載の方法。
  47. １つもしくはそれ以上の付着ポリペプチドが、少なくとも５０アミノ酸の長さである、請求項２７に記載の方法。
  48. １つもしくはそれ以上の付着ポリペプチドが、少なくとも１００アミノ酸の長さである、請求項４７に記載の方法。
  49. 少なくとも５０％の付着ポリペプチドが、少なくとも５０アミノ酸の長さである、請求項４７に記載の方法。
  50. 少なくとも５０％の付着ポリペプチドが少なくとも１００アミノ酸の長さである、請求項４９に記載の方法。
  51. 固体支持体に付着したポリペプチドを含んで成るバイオセンサーであって、前記ポリペプチドが、
    前記ポリペプチドへ組込まれている第１の非天然アミノ酸の第１の側鎖上の第１の反応基と、
    前記固体支持体に付着している第２の反応基と
    の間の反応の反応生成物を含んで成る化学結合によって前記固体支持体に付着し、
    前記ポリペプチドが、第１の側鎖とは異なる第２の側鎖を含んだ第２の非天然アミノ酸を更に含み、第２の側鎖が固体支持体の反応基と反応しない、バイオセンサー。
  52. 前記ポリペプチドが抗体である、請求項５１に記載のバイオセンサー。
  53. タンパク質アレイを製造する方法であって、前記方法が、
    １つもしくはそれ以上の結合または反応性部分を含んで成る固体支持体を提供するステップと、
    第１の側鎖を含んだ１つもしくはそれ以上の第１の非天然アミノ酸を含んで成り、かつ第２の側鎖を含んだ第２の非天然アミノ酸を含んで成る当該ポリペプチドを提供するステップと、
    前記当該ポリペプチドを前記結合または反応性部分に接触させ、それによって前記結合または反応性部分が第１の側鎖を介して前記当該ポリペプチドに結合、またはこれと反応するステップと
    を含み、
    第２の非天然アミノ酸側鎖が固体支持体部分と反応しない、方法。
  54. 前記非天然アミノ酸が前記反応性部分と反応し、当該タンパク質を前記固体支持体に共有結合させる、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記第１の非天然アミノ酸が、前記結合部分に結合し、当該タンパク質を前記固体支持体に結合するリンカーに結合し、またはこれを含んで成る、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記リンカーがビオチンを含んで成り、かつ前記結合部分がアビジンを含んで成る、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記固体支持体が、１つもしくはそれ以上の結合または反応性部分のパターンを含んで成り、前記パターンがマスキングおよび光脱保護によって生成される、請求項５３に記載の方法。
  58. 固体支持体に付着したポリペプチドを含んで成るタンパク質アレイであって、前記ポリペプチドが少なくとも第１の非天然アミノ酸を組込み、第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸を組込み、かつ前記ポリペプチドが、
    前記非天然アミノ酸の側鎖上の第１の化学部分と、
    固体支持体に付着している第２の化学部分と
    の間の非共有相互作用を含んで成る結合によって前記固体支持体に付着し、
    第２の非天然アミノ酸が固体支持体の化学部分と相互作用しない、タンパク質アレイ。
  59. 前記非共有相互作用が、イオン相互作用またはファンデルワールス相互作用である、請求項５８に記載のタンパク質アレイ。
  60. 少なくとも１つのポリペプチドを固体支持体に付着させる方法であって、前記方法が、
    第１の化学部分を有する側鎖を含んで成る少なくとも第１の非天然アミノ酸を前記ポリペプチドへ組込み、第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸を組込むステップと、
    第２の化学部分を含んで成る固体支持体を提供するステップと、
    リンカーを提供するステップであって、前記リンカーが第３および第４の化学部分を含んで成るステップと、
    前記ポリペプチド、前記リンカー、および前記固体支持体を、前記ポリペプチド上の前記第１の化学部分が前記リンカー上の前記第３の化学部分に付着し、前記固体支持体上の前記第２の化学部分が前記リンカー上の前記第４の化学部分に付着し、それによって前記ポリペプチドと前記固体支持体との間のブリッジを形成し、前記ポリペプチドを前記固体支持体に付着させる条件下に結合させるステップと
    を含み、第２の非天然アミノ酸が、リンカーの第３又は第４の化学部分に付着した化学部分を含まない、方法。
  61. 前記リンカーが、前記固体支持体との反応前に前記ポリペプチドと反応する、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記リンカーが、前記ポリペプチドとの反応前に前記固体支持体と反応する、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記ポリペプチド上の前記第１の化学成分と前記リンカー上の前記第３の化学部分との間の付着が、共有付着または非共有付着である、請求項６０に記載の方法。
  64. 前記第１の化学部分と前記第３の化学部分との前記付着が非共有であり、かつアビジン−ビオチン結合を含んで成る、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記固体支持体上の前記第２の化学部分と前記リンカー上の前記第４の化学部分との間の付着が、共有付着または非共有付着である、請求項６０に記載の方法。
  66. 前記第２の化学部分と前記第４の化学部分との前記付着が非共有であり、かつアビジン−ビオチン結合を含んで成る、請求項６５に記載の方法。
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