JP4474542B2 - Constitutive expression promoter - Google Patents
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Description
本発明は、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター及びその使用に関するものである。 The present invention relates to a promoter for constitutively expressing a target gene in a plant and use thereof.
植物細胞内で機能可能なプロモーターの下流に発現させたい目的タンパク質をコードする遺伝子を連結させた融合遺伝子を植物細胞に導入し、得られた植物細胞を通常の植物組織培養技術により再生させる方法によって、所望の形質を有する改良植物体を作出することが行われている。 By introducing a fusion gene in which a gene encoding a target protein to be expressed downstream of a promoter capable of functioning in a plant cell is linked to the plant cell, and regenerating the obtained plant cell by a normal plant tissue culture technique An improved plant having a desired character has been produced.
プロモーターの種類としては、構成的、誘導的、組織・器官特異的、時期特異的プロモーターがある。プロモーターは、遺伝子発現の目的に応じて選択され、例えば、特定の刺激に応答して目的遺伝子を発現させる場合は誘導的プロモーター、必要な時期に特定の組織・器官に目的遺伝子の発現を局所化させたい場合は、組織・器官特異的又は時期特異的プロモーターが用いられる。しかしながら、そのような特異性が高くなく、全ての組織において常時目的遺伝子を発現させるプロモーター、すなわち、構成的プロモーターは植物遺伝子工学において最も汎用されており、ニーズも多い。
構成的プロモーターには、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S RNA遺伝子のプロモーター（非特許文献１）、アグロバクテリウムTiプラスミド由来ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos)（非特許文献２）、トウモロコシ由来ユビキチン遺伝子のプロモーター（非特許文献３）、イネ由来のアクチン遺伝子のプロモーター（非特許文献４）等が報告されている。
Types of promoters include constitutive, inducible, tissue / organ-specific, and time-specific promoters. The promoter is selected according to the purpose of gene expression. For example, in the case of expressing the target gene in response to a specific stimulus, the promoter is localized. When necessary, the expression of the target gene is localized in a specific tissue or organ. If desired, a tissue / organ-specific or time-specific promoter is used. However, such a specificity is not high, and a promoter that always expresses a target gene in all tissues, that is, a constitutive promoter is most widely used in plant genetic engineering and has many needs.
Constitutive promoters include, for example, the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S RNA gene promoter (Non-patent Document 1), the Agrobacterium Ti plasmid-derived nopaline synthase gene promoter (Pnos) (Non-patent Document 2), and maize origin. Ubiquitin gene promoters (Non-patent Document 3), rice-derived actin gene promoters (Non-patent Document 4), and the like have been reported.
従って、本発明の目的は、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA、該DNAを含有する遺伝子を植物体内で構成的に発現させることを可能にした組換えプラスミド、該組換えベクターを導入した形質転換植物体を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a DNA having a promoter activity that constitutively expresses a target gene in a plant, a recombinant plasmid that enables a gene containing the DNA to be constitutively expressed in a plant, It aims at providing the transformed plant body which introduce | transduced the recombinant vector.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、イネゲノム配列情報、イネESTの出現頻度情報、イネ完全長cDNA配列情報等（http://www.dna.affrc.go.jp/）を参考にしつつ鋭意研究を重ねた結果、種々の組織に特異的な発現パターンを有すると期待されるイネ遺伝子を約100種選定し、選定された各遺伝子の５’上流域をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅した断片の中から、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA断片を得ることに成功し、本発明を完成させるに至った。 In order to solve the above problems, the present inventors refer to rice genome sequence information, rice EST appearance frequency information, rice full-length cDNA sequence information, etc. (http://www.dna.affrc.go.jp/). As a result of extensive research, we selected about 100 rice genes that are expected to have expression patterns specific to various tissues, and polymerase chain reaction (PCR) was performed on the 5 'upstream region of each selected gene. From the amplified fragments, the present inventors have succeeded in obtaining a DNA fragment having a promoter activity that constitutively expresses a target gene in a plant body, and completed the present invention.
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示す、プロモーターとして機能しうるDNA。
（ａ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA
（ｃ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA
(2) (1)に記載のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA。
(3) (1)又は(2)に記載のDNAを含有する組換えベクター。
(4) (1)又は(2)に記載のDNAと目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
(5) (3)又は(4)に記載の組換えベクターを導入した形質転換植物体。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) DNA which can function as a promoter, as shown in the following (a), (b) or (c).
(A) DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 in the sequence listing
(B) a nucleotide sequence having one or several bases deleted, substituted or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 in the sequence listing, and the target gene is a plant DNA with promoter activity that is constitutively expressed in the body
(C) DNA comprising a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 in the sequence listing and having promoter activity for constitutively expressing the target gene in the plant body
(2) A DNA having a promoter activity that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA according to (1) under stringent conditions and constitutively expresses a target gene in a plant body.
(3) A recombinant vector containing the DNA according to (1) or (2).
(4) A recombinant vector containing the DNA according to (1) or (2) and a gene encoding a target protein.
(5) A transformed plant into which the recombinant vector according to (3) or (4) has been introduced.
本発明によれば、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNAが提供される。このプロモーター活性を有するDNAを利用すれば、特定の組織・器官（葉、茎、根、花、雌蕊、雄蕊、カルスなど）、時期（生育初期、中期、後期）、刺激誘導（光、病害、環境ストレスなど）などに限定されることなく、植物の多様な組織・器官、かつ生育の多様な時期において目的遺伝子を発現させることができる。 According to the present invention, DNA having a promoter activity that constitutively expresses a target gene in a plant body is provided. Using DNA with this promoter activity, specific tissues / organs (leaves, stems, roots, flowers, pistils, stamens, callus, etc.), timing (early growth, middle, late), stimulation induction (light, disease, The target gene can be expressed in various tissues and organs of plants and in various stages of growth without being limited to environmental stress.
従って、本発明は、植物における有用物質の生産性向上、植物の生長制御、耐病性遺伝子の発現による耐病性付与、環境ストレス抵抗性遺伝子の発現による環境ストレス抵抗性の付与、植物における物質（水、栄養塩、糖など）輸送・分配の制御等に有用である。 Therefore, the present invention improves the productivity of useful substances in plants, controls plant growth, imparts disease resistance by expressing disease resistance genes, imparts environmental stress resistance by expressing environmental stress resistance genes, substances in plants (water It is useful for the control of transport and distribution.
１．プロモーター及びその単離
本発明に係るプロモーターとして機能しうるDNA（以下、「プロモーター」という）は、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAである。
1. Promoter and Isolation thereof DNA capable of functioning as a promoter according to the present invention (hereinafter referred to as “promoter”) is a DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16.
本発明のDNAは、目的タンパク質をコードする遺伝子（以下、「目的遺伝子」という）の翻訳開始点の５’側に挿入することにより、該目的遺伝子の植物体における構成的発現を誘導し、又は該目的遺伝子を植物体の各組織・器官において高レベルで発現させることができる。 The DNA of the present invention induces constitutive expression of a target gene in a plant by inserting it into the 5 ′ side of the translation start point of a gene encoding the target protein (hereinafter referred to as “target gene”), or The target gene can be expressed at a high level in each tissue / organ of a plant.
また、本発明のDNAには、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNAも含まれる。ここで、置換、欠失、付加又は挿入されてもよい塩基の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数個である。例えば、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が欠失してもよく、配列番号１、４、７、１０、又は１３に示す塩基配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が付加してもよく、あるいは、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が他の塩基に置換してもよい。 Further, the DNA of the present invention comprises a nucleotide sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16, and the target gene DNA having a promoter activity that constitutively expresses in a plant body is also included. Here, the number of bases that may be substituted, deleted, added or inserted is not particularly limited, but is preferably 1 to several. For example, 1 to 10, preferably 1 to 5 bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 may be deleted. Or 1 to 10, preferably 1 to 5 bases may be added to the base sequence shown in FIG. 13, or 1 to 1 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16. Ten, preferably 1 to 5 bases may be substituted with other bases.
さらに、本発明のDNAには、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNAも含まれる。
配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAにおけるプロモーター活性に必須な部分は、該DNAの様々な欠失体、例えば、５’上流側から様々な長さに欠損させたDNA断片をベータグルクロニダーゼ（GUS）遺伝子等のリポーター遺伝子を融合させたプラスミドを宿主に導入し、プロモーター活性を測定することによって特定でき、そのような活性部分の特定のための手法は、当業者には公知である。
Furthermore, the DNA of the present invention comprises a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 and has a promoter activity that constitutively expresses the target gene in the plant body. Also included is the DNA it has.
The portion essential for the promoter activity in the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 has various lengths from various deletions of the DNA, for example, 5 ′ upstream side. A plasmid in which a deficient DNA fragment is fused with a reporter gene such as a beta glucuronidase (GUS) gene is introduced into a host, and the promoter activity can be determined. A technique for identifying such an active portion is as follows: It is known to those skilled in the art.
このような変異体DNAは、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性（以下、「構成的発現プロモーター活性」という）を有していればよく、その活性の大きさは特に限定されないが、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAの構成的発現プロモーター活性を実質的に保持することが好ましい。「配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAの構成的発現プロモーター活性を実質的に保持する」とは、該プロモーター活性を利用した実際の使用態様において、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAと、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいう。 Such a mutant DNA may have a promoter activity (hereinafter referred to as “constitutive expression promoter activity”) for constitutively expressing the target gene in the plant body, and the magnitude of the activity is not particularly limited. However, it is preferable that the constitutive expression promoter activity of DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 is substantially retained. “Substantially retains the constitutive expression promoter activity of DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16” means that in the actual usage mode utilizing the promoter activity, the sequence It means that the activity is maintained to the extent that it can be used in substantially the same conditions as the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in Nos. 1, 4, 7, 10, 13 or 16.
本発明において「構成的発現プロモーター活性」とは、目的遺伝子を植物体の多様な組織・器官において、生育時期（あるいは生育ステージ）に限定されることなく高度に発現させる活性をいう。
全ての組織・器官とは、葉、花（雌蕊、雄蕊）、茎、根、維管束（根などの植物体地下部組織の維管束系、茎や葉脈などの地上部組織（シュート）の維管束系）、カルスなどを含む。
In the present invention, “constitutive expression promoter activity” refers to an activity in which a target gene is highly expressed in various tissues and organs of a plant body without being limited to the growth time (or growth stage).
All tissues / organs include leaves, flowers (female, stamens), stems, roots, vascular bundles (vascular systems of plant subsurface tissues such as roots, and terrestrial tissues (shoots) such as stems and veins. Tube bundle system) and callus.
上記のような変異体DNAを取得するための遺伝子変異導入は、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法によって行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを利用することができる。 The introduction of gene mutation for obtaining mutant DNA as described above can be carried out by a known technique such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method analogous thereto, for example, mutation using site-directed mutagenesis. Kits for introduction (for example, Mutant-K (manufactured by TAKARA) or Mutant-G (manufactured by TAKARA)) and LA PCR in vitro Mutagenesis series kits by TAKARA can be used.
さらに、当業者であれば、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の全部又は一部からなるDNAを用いて、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAと同様の機能、すなわち、構成的発現プロモーター活性を有する他の塩基配列からなるDNAを種々の生物から新たに取得し、利用することも容易である。このような他の塩基配列からなるDNAの取得は、例えば、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の全部又は一部からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション、該塩基配列の一部をプライマーとして用いるPCR等によって行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列と90％以上、好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が10〜300mM、好ましくは15〜75mMであり、温度が25℃〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう。 Furthermore, those skilled in the art can use DNA consisting of all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 to have SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 It is also easy to newly obtain and use DNAs composed of other base sequences having the same function as that of DNAs composed of the base sequences shown in the following, that is, constitutive expression promoter activity from various organisms. Acquisition of DNA consisting of such other base sequences is, for example, DNA consisting of a base sequence complementary to DNA consisting of all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16. And hybridization under stringent conditions, PCR using a part of the base sequence as a primer, and the like. Here, stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, a nucleic acid having high homology, that is, a complementary strand of DNA consisting of a base sequence having a homology of 90% or more, preferably 95% or more, with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 Examples include a condition in which a complementary strand of a nucleic acid that hybridizes and has a lower homology does not hybridize. More specifically, the sodium concentration is 10 to 300 mM, preferably 15 to 75 mM, and the temperature is 25 ° C to 70 ° C, preferably 42 ° C to 55 ° C.
上記のように取得した変異体DNAやハイブリダイゼーションにより得られるホモログがプロモーターとしての活性を有するか否かは、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ（LUC）、Green fluorescent protein（GFP）、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ベータガラクトシダーゼ（LacZ）、ノパリン合成酵素（NOS）、オクトピン合成酵素（OCS）等の遺伝子を上記プロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、該ベクターを用いて従来から周知慣用されている種々の形質転換法（後述）により植物細胞のゲノムに挿入した後、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認できる。
Whether the mutant DNA obtained as described above or the homolog obtained by hybridization has activity as a promoter depends on various reporter genes such as beta glucuronidase (GUS), luciferase (LUC), green fluorescent protein (GFP ),
A vector in which genes such as chloramphenicol acetyltransferase (CAT), beta galactosidase (LacZ), nopaline synthase (NOS), octopine synthase (OCS), etc. are linked to the downstream region of the above promoter is prepared, It can be confirmed by measuring the expression of the reporter gene after insertion into the genome of a plant cell by various transformation methods (to be described later) that have been well known and conventionally used.
例えば、レポーター遺伝子がGUSの場合には、宿主細胞内でのプロモーター活性は、(ｉ)ヒストケミカルなGUS染色による方法（EMBO J. 6, 3901-3907 (1987）)により、及び／又は(ii)蛍光基質を用いるCastle＆Morrisの方法（Plant Molecular Biology Manual, B5, 1-16 (1994); S.B.Gelvin & R.A.Schilperoort, Kluwer Academic Publishers）に従ってGUS活性を測定し、さらにBradfordの方法（Anal. Biochem. 72, 248-254（1976)）に従ってタンパク質量を測定して、GUS活性をタンパク量当たりに換算する（nmole 4-MU/min/mg proteinとして算出する）ことにより、それぞれ確認することができる。 For example, when the reporter gene is GUS, the promoter activity in the host cell is determined by (i) a method by histochemical GUS staining (EMBO J. 6, 3901-3907 (1987)) and / or (ii) ) GUS activity was measured according to the Castle & Morris method (Plant Molecular Biology Manual, B5, 1-16 (1994); SBGelvin & RASchilperoort, Kluwer Academic Publishers) using a fluorescent substrate, and Bradford's method (Anal. Biochem. 72). , 248-254 (1976)), and the GUS activity can be confirmed by converting the GUS activity per protein amount (calculated as nmole 4-MU / min / mg protein).
本発明のプロモーターは、以下の(i)〜(vi)のいずれかのイネ遺伝子の５’上流ゲノム領域（あるいは配列）を単離することによって取得できる。
(i)イネSEC13遺伝子
イネ（日本晴）の第7番染色体ゲノム上に存在し、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するSEC13タンパク質をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK111786〕（塩基配列：配列番号２）
(ii)イネRPL5遺伝子
イネ（日本晴）の第1番染色体ゲノム上に存在し、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する5S リボソームRNA結合タンパク質L5（RPL5）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK065268〕（塩基配列：配列番号５）
（iii)イネHMG1遺伝子
イネ（日本晴）の第6番染色体ゲノム上に存在し、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するDNA結合タンパク質（High mobility group protein：HMG1）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK068898〕（塩基配列：配列番号８）
The promoter of the present invention can be obtained by isolating the 5 ′ upstream genomic region (or sequence) of any one of the following rice genes (i) to (vi).
(i) Rice SEC13 gene A rice gene [DDBJ (http: //www.ddbj.nig.) encoding the SEC13 protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is present on the chromosome 7 genome of rice (Nipponbare). ac.jp): accession number AK111786] (base sequence: SEQ ID NO: 2)
(ii) Rice RPL5 gene Rice gene [DDBJ (http: /) which exists on the chromosome 1 genome of rice (Nipponbare) and encodes 5S ribosomal RNA binding protein L5 (RPL5) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. /www.ddbj.nig.ac.jp): accession number AK065268] (base sequence: SEQ ID NO: 5)
(Iii) Rice HMG1 Gene A rice gene [DDBJ (http://www.dbj.org) that encodes a DNA binding protein (High mobility group protein: HMG1) present on the chromosome 6 genome of rice (Nipponbare) and having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9. : //www.ddbj.nig.ac.jp): accession number AK068898] (base sequence: SEQ ID NO: 8)
(iv)イネOLP1遺伝子
イネ（日本晴）の第1番染色体ゲノム上に存在し、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するオスモチン様タンパク質（osmotin-like protein：OLP1）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK060655〕（塩基配列：配列番号１１）
(v)イネGF14b遺伝子
イネ（日本晴）の第4番染色体ゲノム上に存在し、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有する14-3-3タンパク質（GF14ｂ）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK071822〕（塩基配列：配列番号１４）
(vi)イネGAPDH遺伝子
イネ（日本晴）の第2番染色体ゲノム上に存在し、配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK099086〕（塩基配列：配列番号１７）
(iv) Rice OLP1 gene A rice gene [DDBJ (http) that encodes an osmotin-like protein (OLP1) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and present on the chromosome 1 genome of rice (Nipponbare). : //www.ddbj.nig.ac.jp): accession number AK060655] (base sequence: SEQ ID NO: 11)
(v) Rice GF14b gene Rice gene [DDBJ (http: /) which is present on the chromosome 4 genome of rice (Nipponbare) and encodes 14-3-3 protein (GF14b) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15. /www.ddbj.nig.ac.jp): accession number AK071822] (base sequence: SEQ ID NO: 14)
(vi) Rice GAPDH gene
A rice gene [DDBJ (http: //) that encodes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 and present on the chromosome 2 chromosome of rice (Nipponbare). www.ddbj.nig.ac.jp): accession number AK099086] (base sequence: SEQ ID NO: 17)
プロモーター領域を単離する方法としては、特に限定されないが、例えば、インバースPCR、ゲノムDNAライブラリーから単離する方法等を例示することができる。 The method for isolating the promoter region is not particularly limited, and examples thereof include inverse PCR, a method for isolating from a genomic DNA library, and the like.
インバースPCRによる場合は、上記の（i)〜(vi）のイネ遺伝子（以下、「イネ遺伝子」という）の塩基配列情報に基づいて一対のプライマーを合成し、これら一対のプライマーと所定の制限酵素で処理した後にセルフライゲーションさせたゲノムDNA断片とを用いてPCRを行うことによって、イネ遺伝子の上流領域を増幅することができる。その後、イネ遺伝子の上流領域をクローニングし塩基配列を決定することによって、イネ遺伝子のプロモーター領域の単離、及び塩基配列（配列番号１、４、７、１０、１３又は１６）の決定を行うことができる。 In the case of inverse PCR, a pair of primers is synthesized based on the nucleotide sequence information of the rice genes (i) to (vi) (hereinafter referred to as “rice gene”), and the pair of primers and a predetermined restriction enzyme are synthesized. The upstream region of the rice gene can be amplified by performing PCR using the genomic DNA fragment that has been self-ligated after the treatment with. Then, by cloning the upstream region of the rice gene and determining the base sequence, the promoter region of the rice gene is isolated and the base sequence (SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16) is determined. Can do.
また、ゲノムDNAライブラリーから単離する場合には、イネ遺伝子を含むcDNAをプローブとして、定法に従って調製したゲノムDNAライブラリーからイネ遺伝子を含むゲノムDNAをスクリーニングする。その後、スクリーニングしたゲノムDNAの塩基配列を決定することによってイネ遺伝子の上流領域に存在するプロモーター領域を特定することができ、さらに、該プロモーター領域のみをPCR等によって増幅してクローニングすることによって単離することができる。 In the case of isolation from a genomic DNA library, genomic DNA containing a rice gene is screened from a genomic DNA library prepared according to a conventional method using cDNA containing the rice gene as a probe. Then, by determining the base sequence of the screened genomic DNA, the promoter region existing in the upstream region of the rice gene can be identified, and further, only the promoter region is isolated by amplification and cloning using PCR or the like. can do.
いったん本発明のプロモーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、あるいはその塩基配列の一部からなるDNAをプライマーとして合成し、イネの全DNAを鋳型として用いて、該プライマーを用いるPCRによって容易に得ることができる。 Once the base sequence of the promoter of the present invention has been determined, the subsequent synthesis is carried out by chemical synthesis or by using a DNA consisting of a part of the base sequence as a primer, and using the rice total DNA as a template. It can be easily obtained by PCR.
さらに、単離したプロモーター領域（配列番号１、４、７、１０、１３又は１６）の一部を用いてプロモーター活性を測定することによって、単離したプロモーター領域（配列番号１、４、７、１０、１３又は１６）において、プロモーター活性に寄与している領域を特定することができる。プロモーター領域の一部は、該プロモーター領域の一部をPCRによって増幅する方法、プロモーター領域を所定の制限酵素で処理して断片化する方法等を適宜使用して得ることができる。 Furthermore, by measuring the promoter activity using a part of the isolated promoter region (SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16), the isolated promoter region (SEQ ID NO: 1, 4, 7, In 10, 13, or 16), a region contributing to promoter activity can be identified. A part of the promoter region can be obtained by appropriately using a method in which a part of the promoter region is amplified by PCR, a method in which the promoter region is treated with a predetermined restriction enzyme, and fragmented.
得られたプロモーター領域の一部は、発現量を定量できる遺伝子の上流に組み込み、該遺伝子の発現量を定量することによってプロモーター活性を測定することができる。すなわち、得られたプロモーター領域の一部及び所定の遺伝子を組み込んでなる組換えベクターを構築し、該組換えベクターを用いて形質転換した細胞における該遺伝子の発現量を定量することによって、得られたプロモーター領域の一部におけるプロモーター活性を測定することができる。 A part of the obtained promoter region can be incorporated upstream of a gene whose expression level can be quantified, and the promoter activity can be measured by quantifying the expression level of the gene. That is, it can be obtained by constructing a recombinant vector incorporating a part of the obtained promoter region and a predetermined gene, and quantifying the expression level of the gene in cells transformed with the recombinant vector. Promoter activity in a part of the promoter region can be measured.
２. 組換えベクター
本発明の組換えベクターは、上記１．のプロモーターに目的遺伝子を連結した遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、pBI系、pPZP系（Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P.: The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation., Plant Mol Biol., 25: 989-94, 1994）、pCAMBIA系（http://www.cambia.org/main/r_et_camvec.htm）、pSMA系のベクターなどが好適に用いられる。特にpBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Escherichia coli）及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるLB配列とRB配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のDNAを植物核DNAに組み込むことが可能である（EMBO Journal, 10(3), 697-704 (1991)）。一方、pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV)、インゲンマメモザイクウイルス（BGMV)、タバコモザイクウイルス（TMV）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
2. Recombinant vector The recombinant vector of the present invention comprises the above-mentioned 1. The gene can be constructed by introducing a gene in which the target gene is linked to the above promoter into an appropriate vector. Here, as a vector, a target gene can be introduced into a plant via Agrobacterium, pBI system, pPZP system (Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P .: The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation., Plant Mol Biol., 25: 989-94, 1994), pCAMBIA (http://www.cambia.org/main/r_et_camvec.htm), pSMA vectors, and the like are preferably used. In particular, pBI binary vectors or intermediate vector systems are preferably used, and examples thereof include pBI121, pBI101, pBI101.2, pBI101.3 and the like. A binary vector is a shuttle vector that can replicate in Escherichia coli and Agrobacterium. When a plant is infected with Agrobacterium that holds the binary vector, it is a border sequence consisting of LB and RB sequences on the vector. It is possible to incorporate the enclosed DNA into plant nuclear DNA (EMBO Journal, 10 (3), 697-704 (1991)). On the other hand, a pUC vector can directly introduce a gene into a plant, and examples thereof include pUC18, pUC19, and pUC9. Plant virus vectors such as cauliflower mosaic virus (CaMV), kidney bean mosaic virus (BGMV), and tobacco mosaic virus (TMV) can also be used.
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。 In order to insert a target gene into a vector, first, a method in which the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate vector DNA restriction enzyme site or a multicloning site, and then ligated to the vector is employed. The
目的遺伝子としては、対象となる植物における内因性遺伝子、または外来遺伝子であって、その遺伝子産物の発現が植物体内の各組織・器官において所望される任意の遺伝子をいう。かかる遺伝子としては、有用物質（医薬、色素、芳香成分など）生産遺伝子、植物生長制御（促進/抑制）遺伝子、耐病虫害性〔昆虫食害抵抗性、カビ（菌類）及び細菌病抵抗性、ウイルス（病）抵抗性など〕遺伝子、環境ストレス（低温、高温、乾燥、光障害、紫外線）抵抗性遺伝子、糖代謝関連遺伝子、糖、窒素源、イオンなどのトランスポーター遺伝子等が挙げられるが、これらに限定はされない。 The target gene refers to any gene that is an endogenous gene in a target plant or a foreign gene, and expression of the gene product is desired in each tissue / organ in the plant body. Such genes include useful substance (pharmaceuticals, pigments, aromatic components, etc.) production genes, plant growth control (promotion / suppression) genes, insect and insect resistance (insect food resistance, fungi) and bacterial disease resistance, viruses ( Diseases) Resistance etc.] Genes, environmental stress (low temperature, high temperature, dryness, light damage, UV) resistance genes, sugar metabolism related genes, sugar, nitrogen sources, transporter genes such as ions, etc. There is no limitation.
上記の目的遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、目的遺伝子の上流、内部、あるいは下流に、本発明のプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリA付加シグナル、5'-UTR配列、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。 The target gene described above needs to be incorporated into a vector so that the function of the gene is exhibited. Therefore, the promoter, enhancer, intron, poly A addition signal, 5′-UTR sequence, selectable marker gene and the like of the present invention can be linked to the vector upstream, inside, or downstream of the target gene.
エンハンサーとしては、例えば、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域などが挙げられる。 Examples of the enhancer include an enhancer region that is used to increase the expression efficiency of the target gene and includes an upstream sequence in the CaMV35S promoter.
ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（NOS)遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素(OCS)遺伝子のターミネーター、CaMV 35S RNA遺伝子のターミネーター等が挙げられる。 The terminator may be any sequence that can terminate the transcription of the gene transcribed by the promoter. Etc.
選抜マーカー遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子、アセト乳酸合成酵素（Acetolactate synthase）遺伝子などが挙げられる。
また、選抜マーカー遺伝子は、上記のように目的遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選抜マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、目的遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。
Examples of the selection marker gene include a hygromycin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a bialaphos resistance gene, a blasticidin S resistance gene, an acetolactate synthase gene, and the like.
Alternatively, the selection marker gene may be prepared by ligating the same gene together with the target gene as described above to prepare a recombinant vector, or alternatively, a recombinant vector obtained by linking the selection marker gene to a plasmid, A recombinant vector obtained by ligating the target gene to a plasmid may be prepared separately. When prepared separately, each vector is co-transfected (co-introduced) into the host.
３．形質転換植物体
上記２．で調製した組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換し、形質転換植物体を調製することができる。
形質転換植物体を調製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、及び植物体そのものを用いる場合（in planta法）がある。プロトプラストを用いる場合は、Tiプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルスに感染させる等により行うことができる。また種子あるいは植物体を用いるin planta法を適用する場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。
3. Transformed plant body 2. Using the recombinant vector prepared in Step 1, a target plant can be transformed to prepare a transformed plant body.
In preparing a transformed plant body, various methods already reported and established can be used as appropriate. Preferred examples thereof include the Agrobacterium method, the PEG-calcium phosphate method, the electroporation method, Examples include the liposome method, particle gun method, and microinjection method. When the Agrobacterium method is used, there are a case where a protoplast is used, a case where a tissue piece is used, and a case where a plant body itself is used (in planta method). When using protoplasts, co-culture with Agrobacterium with Ti plasmid, fusing with spheroplasted Agrobacterium (spheroplast method), and when using tissue fragments, aseptic culture of the target plant It can be performed by infecting leaf pieces (leaf discs) or infecting callus. In addition, when the in planta method using seeds or plants is applied, that is, in systems that do not involve tissue culture with the addition of plant hormones, for direct treatment of Agrobacterium to water-absorbing seeds, seedlings (plant seedlings), potted plants, etc. Can be implemented.
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。 Whether or not a gene has been incorporated into a plant can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, Western blotting, or the like. For example, DNA is prepared from a transformed plant, PCR is performed by designing a DNA-specific primer. After PCR, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a single band. By doing so, it can confirm that it transformed. Moreover, PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product. Furthermore, the amplification product may be bound to a solid phase such as a microplate, and the amplification product may be confirmed by fluorescence or enzymatic reaction.
本発明において形質転換に用いられる植物としては、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物などの植物が挙げられ、特に限定はされない。好ましくは、本発明のDNAが単離されたイネ科の植物、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、及びヒエなどの植物が挙げられる。 Plants used for transformation in the present invention include monocotyledonous plants such as rice, wheat, corn, leek, lily, orchid, soybean, rapeseed, tomato, potato, chrysanthemum, rose, carnation, petunia, gypsophila, cyclamen and the like. Plants such as dicotyledonous plants can be mentioned, and are not particularly limited. Preferably, plants of the family Gramineae from which the DNA of the present invention has been isolated, for example, plants such as rice, barley, wheat, corn, sugarcane, buckwheat, sorghum, millet and millet.
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂（植物の芽の先端の生長点）、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、それを酵素処置して細胞壁を除いたプロプラスト等の植物培養細胞が挙げられる。またin planta法適用の場合、吸水種子や植物体全体を利用し得る。 In the present invention, examples of plant materials to be transformed include roots, stems, leaves, seeds, embryos, ovules, ovaries, shoot tips (growth points at the tips of plant buds), buds, pollen and the like. Examples thereof include plant tissue cells and slices thereof, undifferentiated callus, and plant cultured cells such as proplasts obtained by removing the cell wall by enzyme treatment. In the case of applying the in planta method, water-absorbing seeds or the entire plant body can be used.
また、本発明において形質転換植物体とは、植物体全体、植物器官（例えば根、茎、葉、花弁、種子、種子、実等）、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)、植物培養細胞のいずれをも意味するものである。 In the present invention, the transformed plant body means the whole plant body, plant organ (eg, root, stem, leaf, petal, seed, seed, fruit, etc.), plant tissue (eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem). And vascular bundles) and plant cultured cells.
植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、以下のように行うことができる。 When plant cultured cells are targeted, in order to regenerate a transformant from the obtained transformed cells, an organ or an individual may be regenerated by a known tissue culture method. Such an operation can be easily performed by those skilled in the art by a method generally known as a method for regenerating plant cells from plant cells. Regeneration from plant cells to plants can be performed, for example, as follows.
まず、形質転換の対象とする植物材料して植物組織又はプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。 First, when plant materials or protoplasts are used as plant materials to be transformed, these are inorganic elements, vitamins, carbon sources, sugars as energy sources, plant growth regulators (plant hormones such as auxin and cytokinin) And so on, and cultured in a sterilized callus formation medium to form dedifferentiated callus that grows irregularly (hereinafter referred to as “callus induction”). The callus thus formed is transferred to a new medium containing a plant growth regulator such as auxin, and further grown (subcultured).
カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞及び組織等）で貯蔵等を行ってもよい。 When callus induction is performed in a solid medium such as agar and subculture is performed in, for example, liquid culture, each culture can be performed efficiently and in large quantities. Next, callus grown by the above subculture is cultured under appropriate conditions to induce organ redifferentiation (hereinafter referred to as “redifferentiation induction”), and finally regenerates a complete plant body. . Redifferentiation induction can be performed by appropriately setting the types and amounts of various components such as plant growth regulators such as auxin and cytokinin, carbon sources, and the like, light, temperature and the like in the medium. By such redifferentiation induction, somatic embryos, adventitious roots, adventitious shoots, adventitious foliage, etc. are formed and further grown into complete plants. Alternatively, storage or the like may be performed in a state before becoming a complete plant body (for example, encapsulated artificial seeds, dried embryos, freeze-dried cells and tissues).
本発明の形質転換植物体は、形質転換処理を施した再分化当代である「T1世代」のほか、その植物の種子から得られた後代である「T2世代」、薬剤選抜あるいはサザン法等による解析によりトランスジェニックであることが判明した「T2世代」植物の花を自家受粉して得られる次世代（T3世代）などの後代植物をも含む。 The transformed plant body of the present invention is not only the “T1 generation” which is the regenerated generation after the transformation treatment, but also the “T2 generation” which is a progeny obtained from the seed of the plant, the drug selection or the Southern method, etc. This includes progeny plants such as the next generation (T3 generation) obtained by self-pollination of "T2 generation" plants that have been found to be transgenic by analysis.
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but these examples do not limit the present invention.
（実施例１） イネ遺伝子プロモーター配列の単離及び形質転換用ベクターへの導入
（１）プロモーターの単離
(i)イネSEC13遺伝子プロモーター
配列番号２に示す塩基配列を有するイネSEC13遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK111786）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP003821）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーSEC13-5［5’- ATGCAAGCTTCGACGGATAGTAGCATCATC -3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号１９］とSEC13-3 [5’- ATGCCCTAGGTTCAAAGCTATAGTGTGCC -3’（下線部は、AvrII制限酵素認識部位）：配列番号２０]をプライマーとして用い、PCRを行った。mRNAの情報から予測される開始コドンATGのAの位置を+1、一つ前の塩基の位置を-1とすると、プライマーは、SEC13遺伝子の-1787位から-1位までに位置する1787塩基対［配列番号１において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から1794位（1794-1799位はAvrII認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。なお、この1787塩基対の配列中、配列番号１において818位-1750位の933塩基対の配列は転写後、イントロンとして除去されることがゲノム配列とmRNAの情報の比較から予測される配列である。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（SEC13-5）及び3’末端（SEC13-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びAvrII制限酵素認識部位を導入した。
(Example 1) Isolation of rice gene promoter sequence and introduction into transformation vector (1) Isolation of promoter
(i) Rice SEC13 gene promoter Located in the 5 ′ upstream region of the rice SEC13 gene (DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp): Accession No. AK111786) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Isolation of the promoter sequence was performed by genomic PCR. DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp: Accession number) Using genomic DNA extracted from green leaves of rice (variety: Nipponbare) plantlets using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) as a template AP003821) Primer SEC13-5 [5'-ATGC AAGCTT CGACGGATAGTAGCATCATC-3 '(underlined part is HindIII restriction enzyme recognition site) designed from rice genome sequence information: SEQ ID NO: 19] and SEC13-3 [5' -PCR was performed using ATGC CCTAGG TTCAAAGCTATAGTGTGCC-3 '(underlined part is AvrII restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 20] as a primer. Assuming that the position of A in the start codon ATG predicted from mRNA information is +1 and the position of the previous base is -1, the primer is 1787 bases located from position -1787 to position -1 of the SEC13 gene. It was designed to amplify a pair [corresponding to the base from position 7 in SEQ ID NO: 1 (position 1-6 is a HindIII recognition sequence) to position 1794 (position 1794-1799 is an AvrII recognition sequence)]. In this sequence of 1787 base pairs, the sequence of 933 base pairs from positions 818 to 1750 in SEQ ID NO: 1 is predicted to be removed as an intron after transcription from the comparison of information on the genome sequence and mRNA. is there. In order to facilitate the cloning of the amplified fragment, a unique HindIII and AvrII restriction enzyme recognition site was introduced at the 5 ′ end (SEC13-5) and 3 ′ end (SEC13-3) of the amplified fragment, respectively.
PCR後、増幅断片（約1.8kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１にその塩基配列を示す。なお、配列番号１の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、1794位〜1799位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1869位以降の塩基配列が転写領域である。
After PCR, the amplified fragment (approx. 1.8kb) is treated with Ex Taq polymerase (Takara) in the presence of dATP at 72 ° C for 5 minutes to add A to the end, and using Promega pGEM-T easy vector system And cloned into the pGEM-T easy vector.
After cloning, the base sequence of the insert was decoded and confirmed to be the same as the above registered rice genome sequence information. SEQ ID NO: 1 shows the base sequence. In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence from position 1 to position 6, the nucleotide sequence from position 1794 to position 1799 is the restriction enzyme site used for cloning, and the nucleotide sequence from position 1869 is the transcription region. .
(ii)イネRPL5遺伝子
配列番号５に示す塩基配列を有するイネRPL5遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK065268）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP003349）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーRPL5-5［5’- ATGCAAGCTTACCGCAACTAGAAGGGAGTC -3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２１］とRPL5-3 [5’- ATGCCCATGGCTCCCTGGAGAGACATTATC -3’（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）：配列番号２２]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、-1949位から+690位までに位置する2639塩基対［配列番号４において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から2645位（2646-2651位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。なお、この2639塩基対の配列中、配列番号４において1959位-2641位の683塩基対の配列は転写後、イントロンとして除去されることがゲノム配列とmRNAの情報の比較から予測される配列である。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（RPL5-5）及び3’末端（RPL5-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
(ii) Rice RPL5 gene Promoter located in the 5 'upstream region of rice RPL5 gene (DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp): Accession No. AK065268) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 Sequence isolation was performed by genomic PCR. DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp: Accession number) Using genomic DNA extracted from green leaves of rice (variety: Nipponbare) plantlets using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) as a template AP003349) Primer RPL5-5 [5′-ATGC AAGCTT ACCGCAACTAGAAGGGAGTC -3 ′ (underlined part is HindIII restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 21] and RPL5-3 [5 ′ -PCR was performed using ATGC CCATGG CTCCCTGGAGAGACATTATC -3 '(underlined is the NcoI restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 22] as a primer. Primers are 2639 base pairs from position -1949 to +690 (from 7th base in SEQ ID NO: 4 (1-6 is HindIII recognition sequence) to 2645 position (2646-2651 is NcoI recognition sequence) It was designed to amplify the sequence of [corresponding to the base of]. Of the 2639 base pair sequences, the 683 base pair sequence from positions 1959 to 2641 in SEQ ID NO: 4 is a sequence that is predicted to be removed as an intron after transcription, based on a comparison of genomic and mRNA information. is there. In addition, in order to facilitate cloning of the amplified fragment, a unique HindIII and NcoI restriction enzyme recognition site was introduced into the 5 ′ end (RPL5-5) and 3 ′ end (RPL5-3) of the amplified fragment, respectively.
PCR後、増幅断片（約2.6kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号４にその塩基配列を示す。なお、配列番号４の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、2646位〜2651位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1869位以降の塩基配列が転写領域である。
After PCR, the amplified fragment (approx. 2.6 kb) was treated with Ex Taq polymerase (Takara) in the presence of dATP at 72 ° C for 5 minutes to add A to the end, and Promega pGEM-T easy vector system was used. And cloned into the pGEM-T easy vector.
After cloning, the base sequence of the insert was decoded and confirmed to be the same as the above registered rice genome sequence information. SEQ ID NO: 4 shows the base sequence. In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, the nucleotide sequence from position 1 to position 6, the nucleotide sequence from position 2646 to position 2651 is the restriction enzyme site used for cloning, and the nucleotide sequence from position 1869 is the transcription region. .
(iii)イネHMG1遺伝子
配列番号８に示す塩基配列を有するイネHMG1遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK068898）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP004685）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーHMG1-5［5’- ATGCAAGCTTTAATATTGGGCCTAGTAGCC -3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２３］とHMG1-3 [5’- ATGCTCTAGATGGCTGAATCCTGCGAGAAG -3’（下線部は、AvrII制限酵素認識部位）：配列番号２４]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、HMG1遺伝子の-1593位から+2位までに位置する1595塩基対［配列番号７において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から1601位（うち1601位はXbaI 認識配列TCTAGAの一部）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（HMG1-5）及び3’末端（HMG1-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びXbaI制限酵素認識部位を導入した。
(iii) Rice HMG1 Gene A promoter located in the 5 ′ upstream region of the rice HMG1 gene (DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp): accession number AK068898) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 Sequence isolation was performed by genomic PCR. DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp: Accession number) Using genomic DNA extracted from green leaves of rice (variety: Nipponbare) plantlets using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) as a template AP004685) Primer HMG1-5 [5'-ATGC AAGCTT TAATATTGGGCCTAGTAGCC -3 '(underlined portion is HindIII restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 23] and HMG1-3 [5' -PCR was performed using ATGC TCTAGA TGGCTGAATCCTGCGAGAAG -3 '(underlined part is AvrII restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 24] as a primer. The primer is 1515 base pairs located from position -1593 to +2 of the HMG1 gene [position 7 in SEQ ID NO: 7 (positions 1-6 are HindIII recognition sequences), position 1601 (of which 1601 is the XbaI recognition sequence) It was designed to amplify the sequence of [corresponding to bases up to a part of TCTAGA]. In addition, in order to facilitate cloning of the amplified fragment, a unique HindIII and XbaI restriction enzyme recognition site was introduced at the 5 ′ end (HMG1-5) and 3 ′ end (HMG1-3) of the amplified fragment, respectively.
PCR後、増幅断片（約1.6kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号７にその塩基配列を示す。なお、配列番号７の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、1601位〜1606位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1364位以降の塩基配列が転写領域である。
After PCR, the amplified fragment (about 1.6 kb) is treated with Ex Taq polymerase (Takara) in the presence of dATP at 72 ° C for 5 minutes to add A to the end, and using Promega's pGEM-T easy vector system And cloned into the pGEM-T easy vector.
After cloning, the base sequence of the insert was decoded and confirmed to be the same as the above registered rice genome sequence information. SEQ ID NO: 7 shows the base sequence. In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, the nucleotide sequence from position 1 to position 6, the nucleotide sequence from position 1601 to 1606 is the restriction enzyme site used for cloning, and the nucleotide sequence from position 1364 is the transcription region. .
(iv)イネOLP1遺伝子
配列番号１１に示す塩基配列を有するイネOLP1遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK060655）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP003241）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーOLP1-5［5’-ATGCAAGCTTATATCCGCAGGTTGTTTCC-3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２５］とOLP1-3 [5’-ATGCCCTAGGGAGCTGACCAGGTCTCGAGC-3’（下線部は、AvrII制限酵素認識部位）：配列番号２６]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、OLP1遺伝子の-2060位から-7位までに位置する2054塩基対［配列番号１０において6位（6位はHindIII認識配列AAGCTTの一部）の塩基から2059位（2060-2065位はAvrII認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（OLP1-5）及び3’末端（OLP1-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びAvrII制限酵素認識部位を導入した。
(iv) Rice OLP1 gene Promoter located in the 5 'upstream region of rice OLP1 gene (DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp): Accession No. AK060655) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 Sequence isolation was performed by genomic PCR. DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp: Accession number) Using genomic DNA extracted from green leaves of rice (variety: Nipponbare) plantlets using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) as a template AP003241) Primer OLP1-5 [5'-ATGC AAGCTT ATATCCGCAGGTTGTTTCC-3 '(underlined part is HindIII restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 25] and OLP1-3 [5' PCR was performed using -ATGC CCTAGG GAGCTGACCAGGTCTCGAGC-3 '(underlined is the AvrII restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 26] as a primer. The primer is 2054 base pairs from position 2060 to position -7 of the OLP1 gene [position 6 of SEQ ID NO: 10 (position 6 is part of the HindIII recognition sequence AAGCTT), position 2059 (positions 2060-2065 are It was designed to amplify the sequence of [corresponding to bases up to AvrII recognition sequence). In addition, in order to facilitate cloning of the amplified fragment, a unique HindIII and AvrII restriction enzyme recognition site was introduced at the 5 ′ end (OLP1-5) and 3 ′ end (OLP1-3) of the amplified fragment, respectively.
PCR後、増幅断片（約2.1kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１０にその塩基配列を示す。なお、配列番号１０の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、2060位〜2065位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、2002位以降の塩基配列が転写領域である。
After PCR, the amplified fragment (about 2.1 kb) is treated with Ex Taq polymerase (Takara) in the presence of dATP at 72 ° C for 5 minutes to add A to the end, and using Promega pGEM-T easy vector system And cloned into the pGEM-T easy vector.
After cloning, the base sequence of the insert was decoded and confirmed to be the same as the above registered rice genome sequence information. SEQ ID NO: 10 shows the base sequence. In the base sequence of SEQ ID NO: 10, the base sequence from the 1st to 6th positions, the base sequence from the 2060th to 2065th positions are restriction enzyme sites used for cloning, and the base sequence from the 2002th position is the transcription region. .
(v)イネGF14b遺伝子
配列番号１４に示す塩基配列を有するイネGF14ｂ遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK071822）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AL606460）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーGF14b-5［5’-ATGCAAGCTTGAATGACATCACGGAAGATG-3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２７］とGF14b-3 [5’-ATGCCCATGGTTGCTATCTATAAATCTAAAAACTCTACAAATGCCAAGTCTGCA-3’（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）：配列番号２８]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、HMG1遺伝子の-2124位から-3位までに位置する2122塩基対［配列番号１３において8位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から2129位（2130-2135位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（GF14b-5）及び3’末端（GF14b-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
(v) Rice GF14b gene Promoter located in the 5 'upstream region of rice GF14b gene (DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp): Accession No. AK071822) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 Sequence isolation was performed by genomic PCR. DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp: Accession number) Using genomic DNA extracted from green leaves of rice (variety: Nipponbare) plantlets using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) as a template AL606460) Primer GF14b-5 [5'-ATGC AAGCTT GAATGACATCACGGAAGATG-3 '(underlined part is HindIII restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 27] and GF14b-3 [5' PCR was performed using -ATGC CCATGG TTGCTATCTATAAATCTAAAAACTCTACAAATGCCAAGTCTGCA-3 '(underlined is the NcoI restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 28] as a primer. The primer is 2122 base pairs from position -2124 to position -3 of the HMG1 gene [SEQ ID NO: 13 from position 8 (position 1-6 is HindIII recognition sequence) to position 2129 (positions 2130-2135 are NcoI recognition) It was designed to amplify the sequence of [corresponding to bases up to (sequence)]. In addition, in order to facilitate cloning of the amplified fragment, a unique HindIII and NcoI restriction enzyme recognition site was introduced into the 5 ′ end (GF14b-5) and 3 ′ end (GF14b-3) of the amplified fragment, respectively.
PCR後、増幅断片（約2.1kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１３にその塩基配列を示す。なお、配列番号１３の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、2130位〜2135位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1321位以降の塩基配列が転写領域である。
After PCR, the amplified fragment (about 2.1 kb) is treated with Ex Taq polymerase (Takara) in the presence of dATP at 72 ° C for 5 minutes to add A to the end, and using Promega pGEM-T easy vector system And cloned into the pGEM-T easy vector.
After cloning, the base sequence of the insert was decoded and confirmed to be the same as the above registered rice genome sequence information. SEQ ID NO: 13 shows the nucleotide sequence. In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, the nucleotide sequence from position 1 to position 6, the nucleotide sequence from position 2130 to position 2135 is the restriction enzyme site used for cloning, and the nucleotide sequence from position 1321 is the transcription region. .
(vi)イネGAPDH遺伝子
配列番号１７に示す塩基配列を有するイネGAPDH遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK099086）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP005385）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーGAPDH5-5［5’-ATGCAAGCTTTTGCGTTGACAACAATTGGC-3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２９］とGAPDH5-3 [5’-ATGCCCATGGGTGAAAGAGAGGCGGAGC-3’（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）：配列番号３０]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、-967位から-3位までに位置する969塩基対［配列番号１６において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から975位（976-981位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（GAPDH5-5）及び3’末端（GAPDH5-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
(vi) Rice GAPDH gene Promoter located in the 5 'upstream region of rice GAPDH gene (DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp): Accession No. AK099086) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 Sequence isolation was performed by genomic PCR. DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp: Accession number) Using genomic DNA extracted from green leaves of rice (variety: Nipponbare) plantlets using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) as a template AP005385) Primer GAPDH5-5 [5'-ATGC AAGCTT TTGCGTTGACAACAATTGGC-3 '(underlined part is HindIII restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 29] and GAPDH5-3 [5' PCR was performed using -ATGC CCATGG GTGAAAGAGAGGCGGAGC-3 '(underlined is the NcoI restriction enzyme recognition site): SEQ ID NO: 30] as a primer. Primers are from 969 base pairs located from -967 to -3 (from 7th base in SEQ ID NO: 16 (1-6 is HindIII recognition sequence) to 975 position (976-981 is NcoI recognition sequence)) It was designed to amplify the sequence of [corresponding to the base of]. In addition, in order to facilitate cloning of the amplified fragment, a unique HindIII and NcoI restriction enzyme recognition site was introduced into the 5 ′ end (GAPDH5-5) and 3 ′ end (GAPDH5-3) of the amplified fragment, respectively.
PCR後、増幅断片（約1.0kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１６にその塩基配列を示す。なお、配列番号１６の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、976位〜981位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、761位以降の塩基配列が転写領域である。
以上のイネ遺伝子プロモーター配列のクローニング手順を図１に示す。
After PCR, the amplified fragment (approx. 1.0 kb) was treated with Ex Taq polymerase (Takara) in the presence of dATP at 72 ° C for 5 minutes to add A to the end, and Promega pGEM-T easy vector system was used. And cloned into the pGEM-T easy vector.
After cloning, the base sequence of the insert was decoded and confirmed to be the same as the above registered rice genome sequence information. SEQ ID NO: 16 shows the base sequence. In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, the nucleotide sequence from position 1 to position 6, the nucleotide sequence from position 976 to position 981 are the restriction enzyme sites used for cloning, and the nucleotide sequence from position 761 is the transcription region. .
The cloning procedure of the rice gene promoter sequence described above is shown in FIG.
（２）植物形質転換用バイナリーTiプラスミドベクターの構築
上記のプロモーター配列をイネに導入するために、植物形質転換用バイナリーTiプラスミドベクターpSMAHdN627-M2GUSを構築した（図２）。図２に示すように、本バイナリーベクターには、T-DNA上に植物用選抜マーカー遺伝子として、アグロバクテリウムTiプラスミド由来Nos（ノパリン合成酵素遺伝子）プロモーター：：大腸菌由来HPT（ハイグロマシン耐性）遺伝子のコード領域：：Tiプラスミド由来TiaaM（トリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子）ターミネーターを配置し、形質転換された植物体がハイグロマイシンB耐性を示すようにした。また、その隣接部位にベータグルクロニダーゼ（GUS）遺伝子のコード領域：：Tiプラスミド由来Nosターミネーターから構成されるキメラ遺伝子を配置し、GUS遺伝子の5’上流側にプロモーター配列を挿入できるようにマルチクローニング部位を設けた。また、left border（LB）配列とright border（RB）の配列の外側には、微生物細胞で機能し得るスペクチノマイシン耐性（SpR）遺伝子、大腸菌で機能するpBR322由来（ColE1型）複製開始領域、アグロバクテリウム細胞内においてプラスミドが安定に保持されるための配列Sta、及び複製開始領域Repを設けた。
(2) Construction of Binary Ti Plasmid Vector for Plant Transformation In order to introduce the above promoter sequence into rice, a binary Ti plasmid vector pSMAHdN627-M2GUS for plant transformation was constructed (FIG. 2). As shown in FIG. 2, this binary vector has an Agrobacterium Ti plasmid-derived Nos (nopaline synthase gene) promoter :: E. coli-derived HPT (hygromachine resistance) gene as a plant selection marker gene on T-DNA. The coding region of :: Ti plasmid-derived TiaaM (tryptophan monooxygenase gene) terminator was placed so that the transformed plant body was resistant to hygromycin B. In addition, a chimeric gene composed of a beta glucuronidase (GUS) gene coding region :: Ti plasmid-derived Nos terminator is placed in the adjacent site, and a multicloning site is inserted so that a promoter sequence can be inserted 5 'upstream of the GUS gene. Was provided. Also, outside of the left border (LB) and right border (RB) sequences, a spectinomycin resistance (Sp R ) gene that can function in microbial cells, a pBR322-derived (ColE1 type) replication initiation region that functions in E. coli The sequence Sta for stably maintaining the plasmid in Agrobacterium cells and the replication initiation region Rep were provided.
（３）バイナリーベクターへのプロモーター配列の導入
pGEM-T easyベクターをHindIII及びNcoIで二重消化することにより、イネSEC13遺伝子、イネRPL5遺伝子、イネHMG1遺伝子、イネOLP1遺伝子、イネGF14b遺伝子、イネGAPDH遺伝子の各プロモーター断片をそれぞれ切り出し、（２）で構築したpSMAHdN627-M2GUSベクターの対応する部位にクローニングした。得られたプラスミドをpSMAHdN627-SEC13GUS、pSMAHdN627-RPL5GUS、pSMAHdN627-HMG1GUS、pSMAHdN627-OLP1GUS、pSMAHdN627-GF14bGUS、pSMAHdN627-GAPDHGUSとそれぞれ命名し、バイオラッド社のE. coliパルサーを用いたエレクトロポレーション法（0.2 cmキュベット、パルス条件：2.4kV/cm、25μF、200Ω）により、アグロバクテリウムEHA105系統に導入した。
(3) Introduction of promoter sequence into binary vector
By double digesting pGEM-T easy vector with HindIII and NcoI, the promoter fragments of rice SEC13 gene, rice RPL5 gene, rice HMG1 gene, rice OLP1 gene, rice GF14b gene, and rice GAPDH gene were excised, respectively (2 And cloned into the corresponding site of the pSMAHdN627-M2GUS vector. The resulting plasmids were named pSMAHdN627-SEC13GUS, pSMAHdN627-RPL5GUS, pSMAHdN627-HMG1GUS, pSMAHdN627-OLP1GUS, pSMAHdN627-GF14bGUS, and pSMAHdN627-GAPDHGUS (using the E. coli pulsar method of Biorad). cm cuvette, pulse conditions: 2.4 kV / cm, 25 μF, 200Ω), and introduced into Agrobacterium EHA105 strain.
（実施例２） イネ形質転換
イネの形質転換は超迅速形質転換法（WO 01/06844 A1 (2001)参照）により行った。イネ（品種：日本晴）種子を、70 ％エタノール、続いて次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、滅菌蒸留水ですすいで水を切った後、胚が上向きになるようN6D寒天培地〔N6 salts 及びvitamins (Chu C.C., C.S.Wang, C.C.Sun, C. Hsu, K.C. Yin, C.Y. Chu, Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources, Sci. Sinica, 18, 659-668 (1975))、30 g/L ショ糖、 0.3 g/L カザミノ酸、2.8 g/L プロリン、2 mg/L 2,4-D, 2 g/L ゲルライト、pH5.7〕に置床し、30℃かつ明条件下で5日間培養した。
(Example 2) Rice transformation Rice was transformed by an ultra-rapid transformation method (see WO 01/06844 A1 (2001)). Rice (variety: Nipponbare) seeds are sterilized with 70% ethanol followed by sodium hypochlorite, rinsed with sterile distilled water, drained, and N6D agar medium [N6 salts and vitamins so that the embryos face up (Chu CC, CSWang, CCSun, C. Hsu, KC Yin, CY Chu, Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources, Sci. Sinica, 18, 659-668 (1975)), 30 g / L sucrose, 0.3 g / L casamino acid, 2.8 g / L proline, 2 mg / L 2,4-D, 2 g / L gellite, pH 5.7) at 30 ° C under bright conditions For 5 days.
一方、イネSEC13遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-SEC13GUS、イネRPL5遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-RPL5GUS、イネHMG1遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-HMG1GUS、イネOLP1遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-OLP1GUS、イネGF14b遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-GF14bGUS、イネGAPDH遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-GAPDHGUSをそれぞれ保持するアグロバクテリウムEHA105系統を、25 mg/Lクロラムフェニコール、25 mg/Lリファンピシン、及び100 mg/Lスペクチノマイシンを含むLB寒天培地にて28 ℃で3日間培養した。続いて増殖した菌体をミクロスパーテルで少量かきとり、20 mg/Lアセトシリンゴンを含むAAM液体培地 〔Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T., Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J., 6, 271-282 (1994)〕に懸濁した。このアグロバクテリウム懸濁液に、N6D培地で5日間培養したイネ発芽種子を浸し、菌液をよく切ったあと、20 mg/Lアセトシリンゴンを含むAAM寒天培地に置床し、25℃の暗条件下で3日間培養した（共存培養）。共存培養後のイネ発芽種子を滅菌水、続いて500 mg/Lカルベニシリンを含む滅菌水で洗浄し、滅菌ろ紙上で余分な水分を切った後にシュート基部を四分割し、500 mg/Lカルベニシリン及び30 mg/LハイグロマイシンBを含むN6D寒天培地に置床し、30℃の明条件下で14日間培養した。その後、成長してきたシュート基部を、組換え体再分化及び選択培地〔植物体再分化培地：MS salts及びvitamins (Murashige, T., Skoog, F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant, 15, 473-497 (1962))、 30 g/l ショ糖、30 g/l ソルビトール、2 g/l カザミノ酸、0.02 mg/l NAA、2 mg/l カイネチン、2 g/l ゲルライト、pH 5.8〕に、300 mg/Lカルベニシリン + 30 mg/LハイグロマイシンBを添加したもの； Toki, S., 1997, Rapid and Efficient Agrobacterium-mediated transfomation of rice, Plant Mol Biol. Rep., 15: 16-21参照〕に移し、30℃かつ明条件下で14日間培養し、さらにこの操作をもう一度繰り返し、ハイグロマイシン耐性を有する植物体を再分化させた。このようにして得られた再分化個体をMSホルモンフリー寒天培地〔MS salts 及びvitamins（Murashige, T.ら、前掲）、30g/l ショ糖、4 g/l ゲルライト、pH5.8〕に移植し、30℃、明条件下で1〜2週間生育させ、シュート（地上部）の伸長、及び発根とその伸長を促した。シャーレ（直径9 cm）内で形質転換体のシュート及び根の長さが約10 cmあるいはそれ以上の長さに到達した際、培養土に移植し、遺伝子組換え体育成用グロースチャンバーにて明期14時間（30℃）- 暗期10時間（25℃）のサイクルでさらに生育させた。 On the other hand, plasmid pSMAHdN627-SEC13GUS inserted with rice SEC13 gene promoter fragment, plasmid pSMAHdN627-RPL5GUS inserted with rice RPL5 gene promoter fragment, plasmid pSMAHdN627-HMG1GUS inserted with rice HLP1 gene promoter fragment, plasmid inserted with rice OLP1 gene promoter fragment pSMAHdN627-OLP1GUS, plasmid pSMAHdN627-GF14bGUS inserted with rice GF14b gene promoter fragment, and plasmid pSMAHdN627-GAPDHGUS inserted with rice GAPDH gene promoter fragment, respectively, Agrobacterium EHA105 strain, 25 mg / L chloramphenicol, 25 The cells were cultured at 28 ° C. for 3 days in an LB agar medium containing mg / L rifampicin and 100 mg / L spectinomycin. Subsequently, the grown cells are scraped in a small amount with microspatel, and AAM liquid medium containing 20 mg / L acetosyringone [Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T., Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J., 6, 271-282 (1994)]. Rice seeds cultured for 5 days in N6D medium were immersed in this Agrobacterium suspension, and the bacterial solution was thoroughly cut off, then placed on an AAM agar medium containing 20 mg / L acetosyringone and darkened at 25 ° C. Cultivation was performed under conditions for 3 days (co-culture). Wash the rice germinated seeds after co-cultivation with sterilized water, followed by sterilized water containing 500 mg / L carbenicillin. It was placed on an N6D agar medium containing 30 mg / L hygromycin B and cultured for 14 days under light conditions at 30 ° C. Thereafter, the grown shoot base was transformed into a recombinant redifferentiation and selective medium [plant regeneration medium: MS salts and vitamins (Murashige, T., Skoog, F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue. cultures, Physiol. Plant, 15, 473-497 (1962)), 30 g / l sucrose, 30 g / l sorbitol, 2 g / l casamino acid, 0.02 mg / l NAA, 2 mg / l kinetin, 2 g / l Gelrite, pH 5.8] with 300 mg / L carbenicillin + 30 mg / L hygromycin B added; Toki, S., 1997, Rapid and Efficient Agrobacterium-mediated transformation of rice, Plant Mol Biol. Rep. , 15: 16-21], and cultured for 14 days at 30 ° C. and in light conditions, and this operation was repeated once more to redifferentiate plants having hygromycin resistance. The redifferentiated individuals thus obtained were transplanted to MS hormone-free agar medium [MS salts and vitamins (Murashige, T. et al., Supra), 30 g / l sucrose, 4 g / l gellite, pH 5.8]. It was grown for 1 to 2 weeks at 30 ° C. under light conditions to promote the elongation of the shoot (aboveground part) and the rooting and elongation. When the length of the shoots and roots of the transformants reached about 10 cm or more in a petri dish (9 cm in diameter), they were transplanted to the culture soil and clarified in the growth chamber for growing the recombinants. Further growth was carried out in a cycle of 14 hours (30 ° C.)-dark 10 hours (25 ° C.).
（実施例３） 植物組織切片の作製とGUS染色による導入遺伝子の発現の観察
イネに導入したイネSEC13、RPL5、HMG1、OLP1、GF14b、GAPDH遺伝子プロモーターの活性を観察するため、GUS酵素活性の組織化学的染色を実施した。実験に用いた植物組織材料のうち、カルス、花器官、根についてはイネ個体あるいはカルス（培養細胞）から切り取った材料をそのまま反応液に浸漬した。葉身については展開葉を5〜10 mmの幅で切り取り５％の寒天に包埋し、マイクロスライサー（堂阪イーエム、DTK1000）を用いて80μmの厚さの切片を作製した〔植物細胞工学 第4巻281-285頁(1992)〕。稈基部については、根を切り取った稈（かん：イネ科植物の茎を表す用語）の根元から5-10 mmの組織を切り取り、また茎頂については前出の稈基部の直上部分を10 mmほど切り取り、葉身と同様の方法で80μmの厚さの切片を作製した。こうして作製した植物材料をGUS活性測定用の反応液〔50 mMリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)、1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)、5%(v/v) メタノール、10μg/mlシクロヘキシミド、1 mMジチオスレイトール〕に浸漬し、37℃で穏やかに振盪しながら24時間置いた。その後、100％エタノールで反応液を置換して反応を停止し、さらに24時間静置することにより緑色組織の細胞より葉緑素を除去した。次にエタノールを純水で置換した後、実体顕微鏡あるいは光学顕微鏡で染色パターンを観察した。
(Example 3) Preparation of plant tissue section and observation of transgene expression by GUS staining To observe the activity of rice SEC13, RPL5, HMG1, OLP1, GF14b, GAPDH gene promoter introduced into rice, tissue of GUS enzyme activity Chemical staining was performed. Of the plant tissue materials used in the experiment, callus, flower organs, and roots were directly immersed in the reaction solution after being cut from rice individuals or callus (cultured cells). For leaf blades, the developed leaves were cut to a width of 5-10 mm, embedded in 5% agar, and 80 μm-thick sections were prepared using a microslicer (Dosaka EM, DTK1000). 4 281-285 (1992)]. For the heel base, cut 5-10 mm of tissue from the root of the cut potato (cane: a term representing the stem of the grass family), and for the shoot apex, the portion immediately above the heel base is 10 mm. A section having a thickness of 80 μm was prepared in the same manner as the blade. The plant material thus prepared was used as a reaction solution for measuring GUS activity (50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc), 5% (v / v) methanol, 10 μg / ml cycloheximide, 1 mM dithiothreitol] and placed at 37 ° C. with gentle shaking for 24 hours. Thereafter, the reaction solution was replaced with 100% ethanol to stop the reaction, and the mixture was further allowed to stand for 24 hours to remove chlorophyll from the cells of the green tissue. Next, after replacing ethanol with pure water, the staining pattern was observed with a stereomicroscope or an optical microscope.
その結果、イネSEC13遺伝子プロモーターを導入した場合、茎頂付近、稈基部、葉身、頴花、根、カルスで発現が認められた。頴花では特に花粉で発現が見られた（図３）。
イネRPL5遺伝子プロモーターを導入した場合は、稈基部、茎頂付近、葉身、根、カルスで発現が認められた。特に、根原基、根の先端で発現が著しかった（図４）。
イネHMG1遺伝子プロモーターを導入した場合は、根、葉身、稈基部、頴花、カルスで発現が認められた。頴花においては雄蕊、雌蕊、外頴、内頴ともに発現が見られた（図５）。
イネOLP1遺伝子プロモーターを導入した場合は、根、葉身、茎頂付近、稈基部、頴花、カルスで発現が認められた。特に根端部で非常に強い発現が見られた（図６）。
イネGF14b遺伝子プロモーターを導入した場合は、根、稈基部、葉身、カルスで発現が認められた。側根分裂組織では発現されなかった（図７）。
イネGAPDH遺伝子プロモーターを導入した場合は、稈基部、葉身、根、頴花、再分化個体（T1世代）を育成して得られたT2後代種子及びT2種子由来カルスで発現が検出された。根では先端部分で強い発現が見られた（図８）。
As a result, when the rice SEC13 gene promoter was introduced, expression was observed in the vicinity of the shoot apex, the heel base, leaf blades, spikelets, roots, and callus. In the spikelet, the expression was particularly observed in the pollen (FIG. 3).
When the rice RPL5 gene promoter was introduced, expression was observed in the heel base, near the shoot apex, leaf blade, root, and callus. In particular, the expression was remarkable at the root primordia and root tips (FIG. 4).
When the rice HMG1 gene promoter was introduced, expression was observed in roots, leaf blades, bud bases, spikelets and callus. In the cocoon flower, expression was observed in both male and female wings, outer wings and inner wings (FIG. 5).
When the rice OLP1 gene promoter was introduced, expression was observed in the roots, leaf blades, near the shoot apex, bud base, spikelets and callus. In particular, very strong expression was observed at the root tip (FIG. 6).
When the rice GF14b gene promoter was introduced, expression was observed in roots, roots, leaf blades and callus. It was not expressed in the lateral root meristem (FIG. 7).
When the rice GAPDH gene promoter was introduced, expression was detected in T2 progeny seeds and callus derived from T2 seeds obtained by growing cocoon bases, leaf blades, roots, spikelets, and redifferentiated individuals (T1 generation). In roots, strong expression was observed at the tip (FIG. 8).
Claims (4)
（ａ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列において、１若
しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるDNA A promoter comprising the DNA shown in the following (a) or (b) for constitutively expressing a target gene in a plant body.
(A) DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 or 16 in the sequence listing
(B) in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,4,7,10,13, or 16 in the sequence listing, one or several bases are deleted, ing substituted or added in the nucleotide sequence DNA
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