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JP4439567B2 - 形態を変化させた遺伝子導入植物およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）から単離したエンド１，４−β−グルカナーゼ遺伝子、プロモーターおよびタンパク - Google Patents

形態を変化させた遺伝子導入植物およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）から単離したエンド１，４−β−グルカナーゼ遺伝子、プロモーターおよびタンパク Download PDF

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Description

本出願は１９９７年７月２７日に提出されたイスラエル特許出願第１２１４０４号に優先権を請求し、また、両者とも１９９８年１月１３日に提出された米国特許出願Ｎｏｓ０９／００６，６３２号および０９／００６，６３６号の一部継続出願である。開示されているものはすべてそのままここでは参考として取り入れられる。
本発明は、変更した構造や形態を示すように遺伝子工学的な処理を施した植物に一般的に関係している。変更した構造や形態はたとえば、生物量、収量、あるいは生育、あるいはより大きな植物あるいはより小さな植物などに関連するものである。さらに特に本発明は、細胞壁調節導入遺伝子あるいは変更した構造や形態を持っている遺伝子導入植物を生じるような遺伝子作成物を発現している遺伝子導入植物に関係している。細胞壁調節導入遺伝子は、セルロース結合タンパク、セルロース結合ドメインあるいは細胞壁修飾タンパクあるいは酵素をコードしている遺伝子である。発明はさらに、エンド−キシログルカン トランスフェラーゼ、キシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ、セルロースシンターゼ、あるいは新規に単離されたエンド−１，４−β−グルカナーゼをコードする遺伝子のような導入遺伝子を発現している変更された構造や形態を持つ遺伝子導入植物に関係している。発明はまた、構成的な、あるいは組織特異的なプロモーターによって制御されている細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドとともに分泌シグナルペプチドをコードしている遺伝子作成物を含む遺伝子導入植物にも関係している。１つの実施例では、組織特異的なプロモーターは、Arabidopsis thalianaにおける新規の伸長している組織に特異的なプロモーターで、すなわちｃｅｌ１プロモーターである。発明はまた、新規に単離されたエンドグルカナーゼ、すなわち、Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼ遺伝子（ｃｅｌ１）、そのプロモーター（ｃｅｌ１プロモーター）およびそれがコードされたポリペプチド（Ｃｅｌ１）および分泌シグナルペプチド配列の存在下あるいは非存在下でおよび/あるいはｃｅｌ１プロモーターｃｅｌ１遺伝子を含む組換えベクターにも関係している。
２．１植物の伸長と生育
植物細胞の伸長は植物−組織の発生において主要な重要性を持った基本的な過程である。細胞の伸長ではまず強固な細胞壁の弛緩が求められる（Carpita and Gibeaut, 1993, Plant J. 3:1-30; Cosgrove, 1993, Plant
Physiol. 102:1-6; Fry, 1988, 生育している植物細胞壁の化学と代謝分析、Lonoman
Scientific & Technical, New York; Roberts, 1994, Curr. Opin. Cell Biol.
6:688-694)。 この弛緩についてはエンド−キシログルカン トランスフェラーゼ（Nishitani
and Tominaga, 1992, J. Biol. Chem. 267:21058-21064)、キシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ（Fry at al., 1992, Biochem J. 282:821-828)およびエクスパンシン(McQueen-Mason and Cosgrove, 1995, Plant Physiol. 107:87-100)の活性化を含むいくつかのメカニズムが提案されている。エンド−１，４−β−グルカナーゼ（下文ではＥＧａｓｅ）は伸長過程で重要な役割を担っていることが示唆されている（Shoseyov and Dekel-Reichenbach, 1992, Acta Hort. 329:225-227; Verma
et al., 1975, J. Biol. Chem. 250:1019-1026)。
１、３−１、４−β−グルカン特異的酵素が細胞の伸長に関わっているという実質的な証明は単子葉植物に見られた(Hatfield and Nevins, 1987, Plant Physiol. 83:203-207; Hoson and Nevins,
1989, Plant Physiol. 90:1353-1358 1989; Inouhe and Nevins, 1991, Plant Physiol.
96:426-431)。ＥＧａｓｅは植物が生育する間および果実が成熟する間にキシログルカンの分解に関わっている（Hayashi, 1989, Ann. Rev. Plant Physiol. 40:139-168; Hayashi et al.,
1984, Plant Physiol. 25:605-610)。この酵素の活性は、たとえば植物の発生と細胞の伸長に含まれているシグナル分子であるオリゴサッカリンの生成に影響を与える（Darvill et al., 1992, Glycobiology 2:181-198の概説参照）。
現在までに単離されたＥＧａｓｅ遺伝子のほとんどは果実の成熟(Cass et al.,
1990, Mol. Gen. Genet. 223:76-86; Fischer and Bennett, 1991, Ann. Rev. Plant
Physiol. Plant Mol. Biol. 42:675-703; Lashbrook et al., 1994, Plant Cell
6:1485-1493; Tucker et al., 1987, Plant Mol. Biol. 9:197-203)および器官脱離層(Kemmerer and Tucker, 1994, Plant Phyisiol. 104:557-562; Tucker and
Milligan, 1991, Plant Physiol. 95:928-933; Tucker et al., 1988, Plant Physiol.
88:1257-1262)との関わりで研究されてきた。
ごく最近、Wu et al.（1996、Plant Physiol. 110:163-170)はエンドウ豆からＥＧａｓｅをクローニングし、伸長している上胚軸においてオーキシンによってその発現が誘導されることを示した。
細胞の伸長における内因性の調節は細胞壁のメカニズムによって支配されていると思われる。この過程は、内部の膨圧と細胞壁の機械的な強さとの相互作用による結果である（Steer and Steer, 1989, New Phytol. 111:323-358で概説されている）。ほとんどの植物細胞とは異なって、花粉管と根毛の生育は先端層に限局している（Cresti and Tiezzi, 1992, “花粉管の放射機構と先端生育”植物の性的繁殖の中で ｐｐ89-97、Cresti and Tiezzi編、Springer-Verlag, Berlinで概説されている）。花粉管の生育領域は完熟した場合、２つの異なった層からなっている。内層はほとんどカロース−関連分子からなり、外層はペクチン、キシログルカン（ＸＧ）、セルロース（結晶性は低いかほとんど無い）およびそのほかの多糖類を含んでいる(Steer and Steer, 1989, New Phytol. 111:323-358で概説されている）。
キシログルカン（ＸＧ）はβ−（１−４）−Ｄ−グルカンの直鎖であり、セルロースとは異なって、それらは直鎖におけるグルコシル単位の０−６部位に対して規則的な位置に付加されたキシロシル単位を数多く持っている（Carpita and Gibeaut, 1993, Plant J. 3:1-30で概説されている）。ＸＧはアルカリ処理で抽出することができ、in vitro で再びセルロースに結合することができる（Hayashi et
al.,1994, Plant Cell Physiol. 35:1199-1205)。
ＸＧはすべての双子葉植物、および一部の単子葉植物の細胞壁におけるセルロース微小繊維に結合している(Roberts, 1994, Curr. Opin. Cell Biol. 6:688-694に概説されている）。 セルロース微小繊維に結合しているＸＧは細胞壁枠組みに架橋している。
伸長を含めて植物細胞の増殖には、局所細胞壁が緩むことと新しい細胞壁素材の制御された沈着が統合することが求められる。Fry et al.(1992, Biochem J. 282:821-828)およびNishitani
and Tominaga(1992, J. Biol. Chem. 267:21058-21064)はそれぞれキシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）およびエンド−キシログルカン トランスフェラーゼ（ＥＸＴ）を精製した。これら２つの酵素は１つの断片からもう１つのＸＧ分子へと微小繊維間のＸＧを運搬する役目を担っており、細胞壁弛緩酵素であることが示唆された。
しかしながら、McQueen-Mason et al.(1993, Planta
190:327-331)は、キュウリの胚軸におけるin vitro の細胞壁拡張にはＸＥＴの活性は関与していないことを示した。
生育している組織におけるＸＧの効果は広く研究されている。β−（１−４）−Ｄ−グルカナーゼによる部分分解によって作成されたＸＧオリゴ糖類は、植物細胞の成長を変更する“オリゴサッカリン”と呼ぶ(Aldington and Fry, 1993, 植物研究の進歩 19:1-101で概説されている）。そのようなオリゴサッカリンの１つである、ＸＸＦＧ（ＸＧ９）は約１ｎＭの濃度で、オーキシン２，４Ｄによって、エンドウ豆の葉柄断片に誘導された生長促進に対して拮抗する(York et al., 1984, Plant Physiol. 75:295-297; McDougall and Fry,
1988, Planta 175:412-416)。その一方で、高い濃度(e.g.,100μｍ)ではオリゴサッカリンは軟白化したエンドウ豆の葉柄断片の伸長を促進する(McDougall
and Fry,1990, Plant Physiol. 93:1042-1048)。オリゴサッカリンの作用様式は未だに判っていない。
“エクスパンシン”と名付けられたもう１つの細胞壁弛緩タンパクはMcQueen-Mason
et al.によって単離された（1992, The Plant Cell 4:1425-1433)。 エクスパンシンは細胞壁成分のいずれとも加水分解活性は示さない。それはセルロース微小繊維と多糖類マトリックスとの界面で結合しており、この重合体ネットワークの中で非共有結合を可逆的に破壊することによって細胞壁の拡大を誘導すると示唆されている(McQueen-Mason and Cosgrove, 1995, Plant Physiol. 107:87-100)。
セルロースに結合している有機物質の中にはｉｎ ｖｉｖｏで細胞の生育およびセルロース−微小繊維の会合を変更するものがある。直接染料、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および蛍光光沢剤（ＦＢＡ，たとえばカルコフロー白色ＳＴ）は、Acetobacter xylinumの微小繊維の結晶化を妨げ、それによって重合を高めている。このような分子は細胞表面から突出した直後、多糖類と結合し、微小繊維と細胞壁の正常な会合を妨げる（Haigler, 1991, “微小繊維の生物発生における重合と結晶化の関係”セルロースの生合成と生物分解の中pp99-124, Haigler and Weimer 編、Marcel Dekker
Inc. New York)。Haiglerはセルロースに結合する染料や蛍光光沢剤はｉｎ ｖｉｖｏでセルロース微小繊維の会合を変更すると議論している。紅藻(Waaland and Waaland , 1975, Planta 126:127-138)および根端(Hughes and McCully, 1975, 染色技術50:319-329)を染料の存在下で生育させると細胞の形に変形が観察された。今では、このような分子が原核細胞や真核細胞の細胞表面からの突出直後にセルロース鎖に結合し（Haigler and Brown, 1979 Science 210:903-906; Benziman et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6678-6682; Haigler et al., 1980,
Science 210:903-906; Brown et al., 1982, Science 218:1141-1142)、結晶構造の形成を妨げる(Haigler and Chanzy, 1988, J. Ultrastruct. Mol. Struct. Res.
98:299-311)のは明らかである。さらに、セルロースの重合速度は染料の存在下では上昇することが判った(Benziman
et al., 1980)。結晶化はこのような連結した反応のボトルネックであり、それを妨害することはセルロースシンターゼ活性の増進を招くことになると提案された。
２．２セルロース結合タンパクとドメイン
多くのセルラーゼやヘミセルラーゼ（たとえば、キシラナーゼおよびマンナーゼ）はその基質に結合する能力を持っている。このような酵素は一般的に基質を加水分解するための活性部位を含む触媒ドメインおよび不溶性のセルロース化合物マトリックスあるいはヘミセルロース化合物マトリックスを結合するための炭水化物結合ドメインあるいはセルロース結合ドメイン（ここでは一般に“ＣＢＤ”と表す）を持っている。
現在までに１２０を越えるセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）がＩ−Ｘと表される１０のファミリーに分類されている（Tomme et al., 1995, “セルロース結合ドメイン：分類と特性”ＡＣＳシンポジウム、シリーズ６１８酵素性分解と不溶性炭水化物、pp142-161, Saddler and Penner 編、全米化学会，ワシントンＤＣ）（ここでは参考として取り入れられる）。ほとんどのＣＢＤはセルラーゼおよびキシラナーゼから同定されているが、中には多糖類や非触媒タンパクから同定されたものもある。これまでに同定されたＣＢＤは、真菌、細菌および粘菌からのものである。
ＣＢＤの１０ファミリーは以下のとおりである：ファミリーＩ ＣＢＤはすべて真菌のβ−１，４−グルカナーゼに由来している；ファミリーＩＩ ＣＢＤは細菌の加水分解酵素の中で見い出されている；ファミリーＩＩＩ ＣＢＤはβ−１，４−グルカナーゼの中で見い出されている；ファミリーＩＶ ＣＢＤは元々２つの保存的なシステイン残基を持っているものである；ファミリーＶはErwini a chysanthemiに由来するＣＢＤを表している；ファミリーＶＩ ＣＢＤは元々キシラナーゼ由来のものであり、ほとんどすべてタンパクのＣ末端に位置している；ファミリーＶＩＩはClostridium thermocellumのＣＢＤを表している；ファミリーＶＩＩＩはDictyostelium discoidum のＣＢＤを表している；ファミリーＩＸ ＣＢＤは熱安定性のキシラナーゼのＣ末端における直列反復として存在することが知られている；およびファミリーＸはPseudomonas fluorescensのｓｐｐ．セルローザに由来するキシラナーゼＥである。本発明で有用なＣＢＤファミリーおよび個々のＣＢＤに関する詳細な記載については、ここで参考として取り入れられるTomme et al.の表ＩＩを参照されたい。
ShoseyovとDoi(1990,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2192-2195)は、セルロース分解性細菌、Clostridium
cellulovoransのセルラーゼ“複合体”から独特のセルロース結合タンパク（ｃｂｐＡ）を単離した。セルラーゼ複合体の主なサブユニットはセルロースに結合することが判明したが、加水分解活性は持たず、結晶セルロースの分解に必須であった。
ｃｂｐＡ遺伝子がクローニングされ、配列決定された（Shoseyov et al.,
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3483-3487)。ｃｂｐＡのセルロース結合ドメイン（ここではこの特殊なＣＢＤを“ｃｂｄ”と呼ぶ）に隣接したＰＣＲプライマーを用いて、これを過剰発現ベクターにうまくクローニングしてEscherichia coli(大腸菌）でおよそ１７ｋＤａのｃｂｄを過剰生産することができた。組換えｃｂｄはセルロースに対して極めて強い親和性を示した(米国特許第５，４９６，９３４号；Goldstein et al.,1993, J.
Bacteriol. 175:5762-5768; ＰＣＴ国際出願 ＷＯ９４／２４１５８号、すべてここでは完全に述べているかのように参考として取り入れる）。
最近、数種のＣＢＤが別の原材料から単離されている。これらのほとんどは、別の触媒領域、すなわちセルラーゼおよびセルロース結合ドメインを持っているタンパクから単離されているが、２つだけは明らかな加水分解活性はないがセルロース結合活性は持っているようなタンパクから単離されている（Goldstein et al., 1993, J. Bacteriol. 175:5762-5768; Morag et al.,
1995, Appl. Environ. Microbiol. 61-1980-1986)。
２．３ Clostridium cellulovoransのＣＢＤは苗と花粉管の伸長に影響を与える
培養で生育させた場合、Clostridium cellulovoransのｃｂｄを外から加えることによって花粉管や苗の伸長が調節されることが判った。ＰＣＴ国際出願 ＷＯ９４／２４１５８ ７３〜７７ページを参照されたい。
C. cellulovoransのｃｂｄは、液体培養で生育しているモモの花粉粒の花粉管生育を促進した。５０μｇ/ｍｌのｃｂｄにさらした花粉粒は、５０μｇ/ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）処理した花粉粒に比べて約２倍の大きさの花粉管を作った。
C. cellulovoransのｃｂｄの存在下、蒸留水中で発芽させたArabidopsis thalianaの種子はｃｂｄの高い濃度と低い濃度によって別々に反応した。高い濃度のｃｂｄ（１〜１００μｇ/ｍｌ）では根の長さを劇的に減らした。低い濃度のｃｂｄ（１ｘ１０−６から１ｘ１０−４μｇ/ｍｌ）では根の伸長を促進したが、ＢＳＡ処理では効果はなかった。苗の長さにおける効果も似たような傾向を示したが、処理による差異は根ほど劇的ではなく、統計的には差はなかった。
花粉管の細胞壁は先端層でセルロース小繊維に曝されていることが明らかにされている（Steer
and Steer, 1989, New Phytol. 111:323-358で概説されている）。 花粉管の伸長は先端で起きることが知られている（Cresti and Tiezzi, 1992 “花粉管の突出、機構および先端生育”、植物の性的繁殖pp89-97, Cresti and Tiezzi編、Springer-Verlag,
ベルリン で概説されている）。ｃｂｄのゴールド−免疫標識によってｃｂｄは主として先端層に存在していたことが示された。さらに、ｃｂｄ処理した花粉管の先端層でカルコフロー染色されないということは結晶構造がないことを示していた。ＰＣＴ国際出願 ＷＯ９４/２４１５８を参照されたい。
細胞壁においてＸＧ鎖がセルロース化合物ネットワークと架橋していることはすでに判っていることである（Roberts, 1995, Curr. Opin. Cell Biol. 6:688-691)。細胞の伸長に必須の条件は、Inouhe and Nevins (1991. Plant Physiol. 96:426-431)により示されたように加水分解によって、あるいはグリコシド交換(Fry et al., 1992, Biochem. J. 828:821-828; Nishitani and Tominaga,
1992, J. Biol. Chem. 267:21058-21064)、あるいはＸＧ−セルロース結合と相互作用するエクスパンシン(McQueen-Mason et al., 1992, The Plant Cell 4:1425-1433)によって、架橋しているセルロースネットワークを緩めることであるということは受け入れられている。ｉｎ ｖｉｔｒｏの競合試験によって、ｃｂｄはセルロースとの結合でＸＧと競合することが判った。４時間後に達成されるＸＧのセルロースへの結合(Hayashi et al., 1987, Plant Physiol. 83:384-389)に比べて、セルロースへのｃｂｄの結合最大値は１時間後に得られる(Goldstein et al. 1993, J. Bacteriol. 175:5762-5768)。伸長過程の間で、セルロース微小繊維は露出され、ｃｂｄは露出したセルロース微小繊維との結合でＸＧと競合することが示唆されている。従って、この競合によって細胞壁の一時的な緩みが生じ、その結果、伸長を高めるという可能性がある。
根の伸長におけるｃｂｄの抑制効果は、強固なセルロース小繊維のネットワークを緩めることを介して細胞の伸長を調節する酵素やタンパクがアクセスできないような過剰量のｃｂｄによって、セルロース小繊維が立体障害を受けるということで説明することができる。この仮説は、抗−β−Ｄ−グルカン抗体（Hoson and Nevins, 1989, Plant Physiol. 90:1353-1358)あるいは細胞壁グルカナーゼに特異的な抗体(Inouhe and Nevins, 1991, Plant Physiol. 96:426-431)によりオーキシンで誘導した伸長を阻害したNevinsによって支持されている。
C. cellulovoransにおけるＣｂｐＡタンパクのｃｂｄは細菌タンパクである。細胞壁の伸長の調節におけるその作用様式は自然の過程とは異なっている可能性がある。
（発明の要約）
本発明は、出来上がった植物が構造や形態を変えることができるように、植物細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドの組換え核酸あるいは導入遺伝子、組換え核酸作成物あるいは導入遺伝子作成物を発現するような遺伝子導入植物の生産を提供する。本発明は特に、セルロース結合タンパク、セルロース結合ドメインあるいは細胞壁修飾酵素に限定するものではないが、そのような植物の細胞壁を調節するタンパクやポリペプチドを発現することにより変更された構造や形態を提供する。特別に好ましい実施例では、細胞壁を調節するタンパクはセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）である。
本発明の１つの実施例に基づいて、変更された構造や形態を持つ望ましい植物を完成することには、適切なプロモーターの調節の下で植物の細胞壁を調節するタンパクやポリペプチドの発現が必要である。この実施例の１つの様式では、プロモーターは、植物プロモーターで、組織特異的あるいは発生段階特異的なものである。適切なプロモーターには、たとえば伸長している組織に特異的なプロモーター（たとえば、ｃｅｌ１プロモーター）、カルコンシンターゼ・プロモーター（ＣＨＳ）、およびトマトに由来するＰＡＴＡＴＩＮプロモーターなどが含まれる。この実施例の別の様式では、プロモーターは植物の全組織において、全生活環を通して構成的で活性のあるものである（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーター）。しかしながら、細胞壁を調節するタンパクやポリペプチドをコードする組換え核酸とプロモーターのどのような組合せも発明に基づいて有用である。
また、発明に基づいて、何らかの適切な分泌シグナルペプチドに融合した細胞壁を調節するタンパクやポリペプチドを持つことによって完成される、発現している植物細胞から、細胞壁を調節する組換え核酸や導入遺伝子が分泌される可能性もある。
発明はさらに、遺伝子導入植物の種子を提供し、その種子は植物の細胞壁を調節する組換え核酸、導入遺伝子、組換え核酸作成物あるいは導入遺伝子作成物を持っている。発明はまた、植物の細胞壁を調節する組換え核酸、導入遺伝子、組換え核酸作成物あるいは導入遺伝子作成物を持っている遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株あるいは細胞を含んでいる。
発明のもう１つの特徴に基づいて、Arabidopsis thalianaに由来する新規のエンド−β−１，４−グルカナーゼ（ＥＧａｓｅ）遺伝子（ｃｅｌ１）とタンパク（Ｃｅｌ１）を提供する。 また、A. thalianaのＥＧａｓｅ遺伝子の伸長している組織に特異的なプロモーター（ｃｅｌ１プロモーター）あるいはその機能的断片を提供する。
本発明のさらにもう１つの特徴に基づいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というArabidopsis ｃｅｌ１あるいはその変異体のアミノ酸配列をもつタンパクあるいはポリペプチドをコードしている単離された核酸分子を提供する。特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２という配列を持っている単離された核酸分子を提供する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９という配列を持つArabidopsis エンド−１，４−β−グルカナーゼ遺伝子のゲノムクローンを備える単離された核酸分子を提供する。
特別の実施例によって例示されたさらにもう１つの特徴に基づいて、Arabidopsis
thaliana ｃｅｌ１遺伝子と同様に遺伝子および種の変異体、および自然に起きる、あるいは人工的なその機能的変異体に相当するアミノ酸配列を含むようなポリペプチドを提供する。本発明はまた、Arabidopsis ｃｅｌ１ポリペプチドの誘導体あるいは類縁体も提供する。
さらに、本発明は上記ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドベクターおよび組換え核酸ベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらにもう１つの特徴に基づいて、Arabidopsis エンド−１，４−β−グルカナーゼ（ｃｅｌ１）遺伝子、遺伝子および種の変異体、および自然に起きる、あるいは人工的なその機能的変異体に相当するアミノ酸配列を備えるポリペプチド、その誘導体および類縁体を提供する。 さらに、エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性あるいはセルロースあるいはヘミセルロースに結合する能力を持っているタンパクは天然に生じるアミノ酸配列ではない可能性がある。後者をコードする核酸配列は、たとえばスクリーニング物質としてセルロースを用いたランダムディスプレイライブラリに由来する可能性がある。
本発明はさらに、分泌シグナルペプチドをコードする第１の核酸配列および細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドをコードする第２の核酸配列を備える組換え核酸ベクターに関係している。さらに特別な実施例では、細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドは、セルロース結合タンパク、セルロース結合ドメインおよび細胞壁修飾酵素から選ばれる。
発明は部分的には数多くの予期しない驚くべき発見に基づいている。その１つが、遺伝子導入植物においてセルロース結合タンパクあるいはセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を発現するということは、変更された構造的形態を持った遺伝子導入植物を生じるという発見である。そのほかには、遺伝子導入植物においてArabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を発現するということは、変更された構造的形態を持った遺伝子導入植物を生じるという知見である。このような知見はともに遺伝子導入植物において細胞壁を調節するような導入遺伝子を発現するということが、変更された構造や形態を持った植物を生じるということを示している。
植物の形態を変えるためには、たとえば、生育を刺激したり阻害したりするためには、遺伝子導入植物においていかなるＣＢＤでも発現するということが発明の目的である。１つの実施例では、ｃｅｌ１プロモーターの制御下で、ｃｅｌ１シグナルペプチドとともにＣＢＤが細胞壁を標的として、いかなるＣＢＤでも発現させて、組織特異的な生育の調節を生じさせることも発明の目的である。
発明は変更された構造や形態を持った植物を生産することに有用性を持っている。そのように変更された構造や形態によって、生育率の改善された、生物量がさらに大きいあるいは小さい植物、生物分解への抵抗性がさらに大きいあるいは小さい植物、反芻動物にとって消化率がさらに優れたあるいは劣る植物、修飾された繊維を持つ植物あるいはセルロース含有量が変わった植物が提供される。
発明のｃｅｌ１遺伝子は、構造や形態を変更するために遺伝子導入植物において細胞壁を調節するようなタンパクおよびポリペプチドをコードする導入遺伝子としての有用性を持っている。本発明のｃｅｌ１プロモーターは、遺伝子導入植物において組織特異的な様式で、関心のあるタンパク、ポリペプチドあるいはペプチドを発現するために伸長している組織に特異的な植物プロモーターとして利用される可能性がある。発明のArabidopsis thaliana Ｃｅｌ１タンパクは生化学的な応用にも利用できる可能性がある。発明のＣｅｌ１分泌ペプチドは関心のあるタンパク、ポリペプチドあるいはペプチドの細胞性の分泌を促進するために利用される可能性がある。
３．１定義
ここで用いられている“変更された構造あるいは形態”という用語は、同一の条件下で栽培された祖先植物と比較した場合の遺伝子導入植物の構造と形態における微視的あるいは巨視的変化について言う。変更された構造あるいは形態は、同じ種の非遺伝子導入植物と比較して、たとえば、変更された生物量、生育、収量、生物分解の対する抵抗性の大小、反芻動物の消化率の良し悪し、変更されたセルロース含有量、さらに大きい葉/正常な胚軸あるいはさらに小さい葉/さらに長い胚軸、デンプン生産量および/あるいは含有量、修飾された繊維、開花期などと関連付けることができる。
“タンパク”、“ポリペプチド”および“ペプチド”という用語は明細書および請求項を通して相互に変換できるように用いる。このような用語はグリコシル化されたタンパク、すなわち糖タンパクも含んでいる。
ここで用いられている“細胞壁を調節すること”という用語は植物の正常な生育パターンから変更されたいかなるものについても言う。従って、本発明に基づいて、細胞壁を調節するようなタンパクあるいはポリペプチドの導入遺伝子発現は結果として植物の構造や形態を変更することになる。
“セルロース結合タンパク”という用語は、セルロースあるいはヘミセルロースに特異的に結合する、糖タンパクを含むいかなるタンパク、ポリペプチドあるいはペプチドも言う。セルロース結合タンパクはセルロースあるいはセルロース分解活性を持っていてもいなくてもよい。“セルロース結合ドメイン”（ＣＢＤ）という用語は、セルロースあるいはヘミセルロースに特異的に結合する、さらに大きなタンパクの領域や部分である、糖タンパクを含むいかなるタンパク、ポリペプチドあるいはペプチド、前記領域あるいは部分を言う。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）は、セルラーゼ、キシラナーゼあるいは、たとえばチチナーゼなど、マルトース結合タンパクのような糖結合タンパクなど、あるいは非触媒性多糖類結合タンパクのような、そのほかのポリサッカリダーゼの一部である可能性がある。
現在までに１２０を越えるセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）がＩ〜ＸＩＩＩと名付けられた少なくとも１３のファミリーに分類されている（Tomme et al., 1995, “セルロース結合ドメイン：分類と特性”ＡＣＳシンポジウム、シリーズ６１８酵素性分解と不溶性炭水化物、pp142-161, Saddler and Penner 編、全米化学会，ワシントンＤＣ;Tomme et al., 1995, Adv. Microb. Physiol. 37:1; Smant et al.,
1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4906-4911)(ここでは参考として取り入れる）。Tommeで記載されたＣＢＤあるいはその変異体、現在知られているほかのＣＢＤあるいは同定される可能性のある新しいＣＢＤはいかなるものも本発明において用いることができる。さらに、ＣＢＤはファージディスプレイペプチドライブラリあるいはペプチド様ライブラリから、ランダムにそうでなければスクリーニング物質としてセルロースを用いて選択してもよい。（Smith, 1985, Science 228:1315-1317 およびLam,
1991, Nature 354:82-84を参照されたい。） さらに、ＣＢＤは、キチンに特異的に結合するキチナーゼあるいはマルトース結合タンパクのような糖結合タンパクのようなセルロース（ヘミセルロース）以外の多糖類に結合して、セルロースに結合できるような前記部分を持っているような、糖タンパクを含むタンパク、ポリペプチドあるいはペプチドのある部分の突然変異に由来してもよい。どのような事象においても、ＣＢＤはセルロースあるいはヘミセルロースと結合する。
（発明の詳細な説明）
本発明は、出来上がった植物が構造や形態を変えることができるように、植物細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドの組換え核酸あるいは導入遺伝子、組換え核酸作成物あるいは導入遺伝子作成物を発現するような遺伝子導入植物の生産を提供する。本発明は特に、セルロース結合タンパク、セルロース結合ドメインあるいは細胞壁修飾酵素に限定するものではないが、そのような植物の細胞壁を調節するタンパクやポリペプチドを発現することにより変更された構造や形態を提供する。特別に好ましい実施例では、遺伝子導入植物はセルロース結合ドメインを発現している。いかなるセルロース結合ドメインもこの好ましい実施例では有利に用いられる。
特別のメカニズムに限定するという意図はなく、発明者は、遺伝子操作の対象が植物細胞壁におけるセルロースの合成および/あるいは再配列および/あるいは分解に含まれるタンパクや酵素をコードしている組換え核酸や遺伝子であることに注意している。
タンパク、ポリペプチドあるいは酵素を発現させて望ましい特性で植物を操作することができる。遺伝子操作は、プロモーターや分泌シグナルペプチドも備える可能性のある、ここで記載されている核酸作成物で植物を形質転換することによって成し遂げられる。望ましいタンパク、ポリペプチドあるいは酵素を発現している植物について、形質転換した植物あるいはその子孫はをスクリーニングする。
望ましい、変更した構造や形態を示すように遺伝子操作された植物は植物育種あるいは農業生産や工業的な応用に直接利用することができる。酵素、タンパク、あるいはポリペプチドの１つを変更した植物は、親や祖先植物と比べてさらに著しく構造的形態の特徴を変えた系列を作るために、生育を調節する酵素、タンパクあるいはポリペプチドで変更するように遺伝子操作されたほかの変更植物と交配することができる。
もう１つの態様では、本発明は、Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−βグルカナーゼ（ｃｅｌ１）、ｃｅｌ１プロモーターおよびＣｅｌ１タンパクをコードする単離された核酸を提供する。発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９というヌクレオチド配列によってコードされているArabidopsis thalianaのｃｅｌ１遺伝子のゲノム配列を備えている単離された核酸分子を提供する。 本発明はさらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というA. thalianaのＣｅｌ１およびその変異体、誘導体あるいは類縁体のアミノ酸配列を持っているタンパクあるいはポリペプチドをコードしている核酸分子を提供する。発明はさらに、記載されている核酸分子を含んでいる核酸ベクターおよび組換え核酸ベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。A. thaliana ｃｅｌ１核酸およびＣｅｌ１アミノ酸の配列の利用法も提供する。
単に説明を容易にするために、発明の説明は以下のように区分する：（Ａ）細胞壁を調節するタンパクを発現している遺伝子導入植物；（Ｂ）遺伝子導入植物を作成する方法、それには（ｉ）核酸作成物の最適な発現を含む核酸作成物の調製；（ｉｉ）植物および植物細胞の形質転換；（ｉｉｉ）形質転換した植物および植物細胞の選択および同定；（Ｃ）遺伝子導入した植物における細胞壁を調節するタンパクの発現に有用なA. thalianaの新規エンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子の同定および単離、および（Ｄ）遺伝子導入した植物およびA. thalianaの新規エンド−１，４−βグルカナーゼｃｅｌ１遺伝子、ｃｅｌ１シグナル配列、ｃｅｌ１プロモーターおよびＣｅｌ１タンパクおよびそのポリペプチド同等物の応用と利用法。A. thalianaの新規エンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子の説明には、コードされているタンパク、ｃｅｌ１シグナル配列およびそれ自体発明の遺伝子導入植物のための伸長している組織に特異的なプロモーターとしても有用なｃｅｌ１プロモーターに関する説明も含まれる。
５．１遺伝子導入植物
本発明は、細胞調節タンパクあるいはポリペプチドを発現するようにしむけた組換え核酸あるいは導入遺伝子を備えている遺伝子導入植物含み、組換え核酸あるいは導入遺伝子を含んでいない祖先植物と遺伝子導入植物を似たようなあるいは同等の生育条件下で栽培し、比べた場合、遺伝子導入植物は変更された構造や形態を示す。細胞壁を調節する組換え核酸あるいは導入遺伝子はセルロース結合タンパク、セルロース結合ドメインあるいは細胞壁修飾酵素をコードしている核酸である。好ましい実施例に基づけば、細胞壁を調節する組換え核酸あるいは導入遺伝子はセルロース結合ドメインをコードしている核酸である。ここで定めるようにいかなるセルロース結合ドメインも用いることができる。決して限定する例ではないが、実例としてセルロース結合ドメインは細菌、真菌、あるいは粘菌のタンパクあるいはポリペプチドから入手することができる。さらに特別な実例については、セルロース結合ドメインはClostridium cellulovorans、Clostridium thermocellumあるいはCellulomonas fimi（たとえばＣｅｎＡ，ＣｅｎＢ、ＣｅｎＤ、ＣｅｎＸ）から入手することができる。セルロース結合ドメインを発現している遺伝子導入植物で機能している実例は、ここではあとで区分１３、１５および１８に提示する。
用いる細胞壁調節タンパクはどのような型のものでもよい。 たとえば、タンパクは、それに限定するものではないが、エンド−１，４−βグルカナーゼ（ＥＧａｓｅ）、エンドキシログルカン トランスフェラーゼ、キシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ、セルロースシンターゼおよびエクスパンシンのような植物の生育伸長に関連することが知られている高等植物のタンパクでもよい。特別な実施例では、ＥＧａｓｅは新規ＥＧａｓｅ、すなわちＣｅｌ１である。ほかの特別な実施例では、ＥＧａｓｅはトマトあるいはアボガドから入手することができる。
しかしながら、代わりにタンパクは細菌、真菌あるいは粘菌の、植物の生育を調節するようなタンパクでもよい。
Clostridium cellulovoransのＣＢＤを発現している遺伝子導入植物がその遺伝子型（すなわち、ホモ接合体あるいはヘテロ接合体）と強く相関して生育を調節されているということが、ここでは機能している実例で示されている。
組換え核酸あるいは導入遺伝子は植物のある組織あるいはある発生段階に選択的に発現してもよいし、あるいは組換え核酸あるいは導入遺伝子は実質的に植物のあらゆる組織、実質的に植物の全生活環を通して発現していてもよい。 しかしながら、組合せた発現様式も適用することができる。
もう１つの特別な実施例では、遺伝子導入植物は、エンド−１，４−βグルカナーゼであるような細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドを備えている。さらに特別な実施例では、ＥＧａｓｅはArabidopsis thalianaから入手することができる（下の区分５．３を参照）。
本発明はまた、細胞壁を調節するポリペプチドが遺伝子導入植物で発現されるようにプロモーターに操作可能に連結した、細胞壁を調節するポリペプチドをコードしている組換え核酸あるいは導入遺伝子を備える組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を持っている遺伝子導入植物を含み、遺伝子導入植物は組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を含まない祖先植物と遺伝子導入植物を同様の条件下で栽培した場合、祖先植物と比べて変更した構造あるいは形態を示す。
特別な実施例では、プロモーターは構成的な植物プロモーターである。さらに特別な実施例では、植物プロモーターは伸長している組織に特異的なｃｅｌ１プロモーターである（下の区分５．３参照）。
もう１つの実施例では、植物プロモーターは、種子特異的、果実特異的、成熟特異的、開花特異的などのような発生段階特異的なプロモーターである。
好ましい実施例では、遺伝子導入植物は、ｃｅｌ１プロモーターおよびＣｅｌ１をコードしている核酸の組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を備えている。
もう１つの好ましい実施例では、遺伝子導入植物は、ｃｅｌ１プロモーターおよびＣＢＤをコードしている核酸の組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を備えている。
さらにもう１つの好ましい実施例では、遺伝子導入植物は、分泌シグナルペプチド、さらに特別にはｃｅｌ１の分泌シグナルペプチドをさらに含むような核酸の組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を含んでいる。
本発明はまた、上述した遺伝子導入植物の種子を含み、その種子は組換え核酸、導入遺伝子、組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を持っている。
本発明はさらに、上述した遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株あるいは細胞を含み、その子孫、クローン、細胞株あるいは細胞は組換え核酸、導入遺伝子、組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を持っている。
５．２ 遺伝子導入植物の作成
５．２．１ 核酸作成物
核酸配列の特性は、多様な可能性のある宿主植物細胞の遺伝的構造のように様々である。本発明における模範的な実施例に関するこの説明は、熟練者が絶対的に必須ではないけれども明らかに有利であるとして認識するような数多くの特徴を含んでいる。これらには、組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物の単離、合成、あるいは構築の方法、植物細胞に導入すべき遺伝子作成物の操作、遺伝子作成物のある種の特徴、および遺伝子作成物に関連しているベクターのある種の特徴を含んでいる。
さらに本発明の遺伝子作成物は、ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子にコードされてもよい。本発明に基づいて、外部から導入された核酸作成物、特に組換えＤＮＡ作成物をゲノムに統合することを介して、対象植物の望ましい、安定な遺伝子型への変化が影響を受けるのが好ましい。にもかかわらず、本発明に基づいて、そのような遺伝子型の変化は自己複製し、体細胞的にも、胚の時期にも安定であるようなエピソーム（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）の導入によって影響を受けこともある。導入される核酸作成物がＲＮＡを備えている場合、このような作成物からの植物の形質転換あるいは遺伝子発現は、逆転写によって作られるＤＮＡ中間体を介して先に進んでもよい。
ここで説明されている核酸作成物は当業者に良く知られた方法によって作ることができる。作成物自体を作るのと同様に、作成物の成分を分離し、特徴を調べ、操作するために用いることができる組換えＤＮＡ法を教えてくれるものとして、熟練者は、Sambrook et al., 1989, 分子クローニング：実験室マニュアル、Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを引用する。望ましい成分の核酸配列が判っているような場合では、生物原料から単離するよりも合成した方が有利かもしれない。そのような場合、熟練者はCaruthers et al., 1980, Nuc Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233およびChow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9:2807-2817のような参考文献の教えを引用することができる。ほかの場合では、望ましい成分はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって有利に作成されるかもしれない。 ＰＣＲ技術については、熟練者は、Gelfand, 1989, ＤＮＡ増幅のためのＰＣＴ技術、原理および応用、H. A.
Erlich 編 Stockton Press, New York, 1988, 分子生物学の現代プロトコール２巻１５章 Ausebel et al編 John Wiley & Sonのような参考文献を引用することができる。
５．２．１．１． 発現作成物
本発明に基づいて、細胞壁を調節するポリペプチドを発現する能力を持った遺伝子導入植物は、細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドをコードしている配列を備える遺伝子作成物で植物細胞を形質転換することによって遺伝子操作される可能性がある。 １つの実施例では、植物プロモーターは植物細胞壁を調節する望ましいタンパクあるいはポリペプチドに、操作できるように結合されている（“操作できるように結合された”あるいは“操作できるように連結された”ということはここでは、“結合された”あるいは“操作できるように連結された”プロモーターによって制御された転写により、その翻訳産物がポリペプチドであるような機能的メッセンジャーＲＮＡが作られるということを意味するために用いられている）。発明の好ましい実施例では、結合されたプロモーターは、強力な、組織特異的でも発生段階特異的でもない、植物プロモーターである（たとえば、多数の、あるいはすべての植物組織型で強く発現しているようなプロモーター）。そのような強力な、“構成的な”プロモーターには、それに限定されるものではないが、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、Ｔ−ＤＮＡマンノパイン シンセターゼ プロモーター、およびそれらの様々な誘導体が含まれる。
本発明のもう１つの実施例では、組織特異的あるいは発生段階特異的なプロモーターで操作できるように結合された細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドをコードしている配列を備える遺伝子作成物で植物を操作することが有利かもしれない。そのようなプロモーターには、それに限定されるものではないが、ｃｅｌ１プロモーター、ＣＨＳプロモーター、ＰＡＴＡＴＩＮプロモーターなどがある。たとえば、伸長している組織や器官での発現が望ましい場合、ｃｅｌ１プロモーターのようなプロモーターを用いる可能性がある。
本発明のさらに別の実施例では、変更した、あるいは人工的なプロモーターで操作できるように連結された細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドをコードしている配列を備える遺伝子作成物で植物を形質転換することが有利かもしれない。通常は、そのようなプロモーターは別々のプロモーターの構造的要素を再結合することによって構築され、天然のプロモーターには見られない独特の発現パターンおよび/あるいはレベルを持っている。プロモーターコアとシス調節要素の再結合で構築された人工プロモーターの例については、Salina et al.,
1992, Plant Cell 4:1485-1493を参照されたい。
本発明のさらに別の実施例では、細胞壁を調節する遺伝子の発現は望ましいタンパクあるいはポリペプチドをコードしている遺伝子のコピー数を増やすことによって操作する可能性がある。望ましい遺伝子のコピー数を増やした植物細胞を作る方法の１つは遺伝子を複数コピー含んでいる核酸作成物で形質転換することである。別の方法としては、望ましいポリペプチドをコードしている遺伝子を、グルタミン シンセターゼ（ＧＳ）あるいはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のような増幅−選択可能マーカー（ＡＳＭ）遺伝子を含む核酸構造物に入れることができる。そのような作成物で形質転換した細胞は、ＡＳＭ遺伝子のコピー数が増加することによって細胞株を選抜するという培養法の対象となる。ＧＳ遺伝子の増幅したコピーを含んでいる植物細胞株を分離するために用いられる選抜プロトコールについては、Donn et al., 1984, J. Mol. Appl. Genet. 2:549-562を参照されたい。望ましい遺伝子がＡＳＭ遺伝子に密接に連関しているので、ＡＳＭを増幅した細胞株は生育を調節する望ましいポリペプチドをコードしている遺伝子も増幅することになるのである。
本発明のさらにもう１つの実施例では、細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドの発現は調節遺伝子をコードしている核酸作成物で植物細胞を形質転換することにより操作される可能性があり、調節遺伝子は内因性の遺伝子あるいは望ましいポリペプチドをコードしている導入遺伝子の発現を制御し、導入された調節遺伝子は変更され、望ましい組織や発生段階においてポリペプチドを強く発現できるようにする。
５．２．１．２．組換え核酸作成物のそのほかの特徴
本発明の組換え作成物は作成物を増殖させるために選択できるマーカーを含んでいる可能性がある。たとえば、細菌の中で増殖させるような作成物は、好ましくは、カナマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシンあるいはクロラムフェニコールに抵抗性を示すもののような抗生物質抵抗性遺伝子を含んでいる。作成物を増殖させるために適切なベクターは、ほんの数例しかないが、プラスミド、コスミドあるいはウイルスが含まれる。
さらに、組換え作成物は、このような作成物で形質転換された植物細胞を分離し、同定し、あるいは追跡するために、植物で発現できる、選択可能な、スクリーニングできるようなマーカー遺伝子を含んでいる可能性がある。選択可能なマーカーには、それに限定されるものではないが、抗生物質抵抗性（たとえば、カナマイシンあるいはハイグロマイシン抵抗性）を示す遺伝子、あるいは除草剤抵抗性（たとえば、スルホニル尿素、ホスフィノスリシン、グリフォセート抵抗性）を示す遺伝子が含まれる。スクリーニングできるマーカーには、それに限定されるものではないが、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Rep. 5:387-405)、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（Ow et al., 1986, Science 234:856-859)、およびアントシアニン色素産物を調節するＢおよびＣ１遺伝子産物（Goff et al., 1990, EMBO J 6:2517-2522)が含まれる。
植物を形質転換するためにAgrobacterium （アグロバクテリウム属）系を利用する、本発明の実施例では、組換えＤＮＡ作成物はさらに、植物細胞で形質転換すべきＤＮＡ配列に隣接して少なくとも右側Ｔ−ＤＮＡ境界配列を備える。好ましい実施例では、移入されるべき配列には右側および左側Ｔ−ＤＮＡ境界配列が隣接する。形質転換ベクターに基づいたそのようなＴ−ＤＮＡの設計と構築は当業者には良く知られている。
５．２．２．植物および植物細胞の形質転換
本発明に基づいて、望ましい植物は、ここで説明されている核酸作成物で植物細胞を形質転換することによって得られる可能性がある。ある場合には数種の別々の遺伝子作成物で植物あるいは植物細胞を操作するのが望ましい可能性がある。そのような操作は、望ましい遺伝子作成物すべてで同時に植物および植物細胞を形質転換することによって達成される。別の方法としては、操作は順次行われる可能性がある。換言すれば、遺伝子操作は、１つの遺伝子作成物で形質転換し、選抜とスクリーニングを経て望ましい形質転換体を手に入れ、形質転換体を次の遺伝子作成物で形質転換し、以下同様にすることによって達成する。ある実施例では、各遺伝子作成物は別々の選択可能な、あるいはスクリーニングできるマーカー遺伝子と連関していて、複数の遺伝子挿入を含んでいる植物形質転換体の同定を円滑にできるようにしている。別の実施例では、各遺伝子について操作された親株と交配することによって、数種の別々の遺伝子を１つの植物に取り入れる可能性がある。
本発明の実施例では、遺伝子作成物を植物に導入するためにアグロバクテリウム属を採用する。そのような形質転換では２つのアグロバクテリウム属Ｔ−ＤＮＡベクター（Bevan, 1984, Nuc. Acid Res. 12:8711-8721)および共培養法(Horsch et al., 1985, Science 227:1229-1231)を用いる。一般に、アグロバクテリウム属の形質転換系は双子葉植物の遺伝子操作に用いられる（Bevan et al., 1982, Ann. Rev. Genet. 16:357-384; Rogers et al.,
1986, Methods Enzymol. 118:627-641)。アグロバクテリウム属の形質転換系は単子葉植物および植物細胞への遺伝子移入および形質転換にも用いられる（Hernalsteen et al., 1984, ENBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren
et al., 1974, Nature 311:763-764; Grimsley et al., 1987, Nature 325:1677-179;
Boulton et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12:31-40; およびGould
et al., 1991, Plant Physiol. 95:426-434を参照されたい）。
ほかの実施例では、組換え核酸作成物を植物および植物細胞に導入するために様々な代替方法を利用してもよい。このようなほかの方法は対象が単子葉植物あるいは植物細胞である場合、特に有用である。代わりの遺伝子移入および形質転換法には、それに限定するものではないが、カルシウム−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介したプロトプラスト形質転換、あるいはエレクトロポレーションによるむき出しＤＮＡの取りこみ（Paszkowski et al., 1984, ENBO J 3:2717-2722, Potrykus et al., 1985,
Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 5824-5828; およびShimamoto, 1989, Nature 338: 274-276を参照されたい）および植物組織のエレクトロポレーション(D'Halluin et al., 1992, Plant Cell 4:1495-1505)が含まれる。植物細胞の形質転換のための別の方法には微量注入法、シリコン炭化カルシウムによるＤＮＡの取りこみ(Kaeppler et al., 1990, Plant Cell Reporter 9:415-418)、および微粒子銃（Klein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; およびGordon-Kamm et al., 1990, Plant Cell 2:603-618を参照されたい）が含まれる。
本発明に基づいて、多種多様な植物および植物細胞系が、本発明の核酸作成物および上述した様々な形質転換法を用いて、ここで説明されている望ましい生理学的なおよび農学的な特徴のために操作される可能性がある。 好ましい実施例では、遺伝子操作のための対象植物および植物細胞には、それに限定するものではないが、穀類（たとえば、小麦、トウモロコシ、米、雑穀、大麦）、果実類（たとえば、トマト、リンゴ、西洋ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（たとえば、アルファルファ）、根菜類（たとえば、ニンジン、ジャガイモ、砂糖大根、山芋）、葉菜類（たとえば、レタス、ほうれん草）のような作物；顕花植物（たとえば、ペチュニア、バラ、菊）、針葉樹および松の木（たとえば松 モミ、エゾマツ）；環境浄化に用いる植物（たとえば、重金属が蓄積しつつある植物）；油料作物（たとえばヒマワリ、菜種）および実験目的で用いられる植物（たとえば、Arabidopsis)のような単子葉および双子葉植物が含まれる。
５．２．３ 形質転換した植物および植物細胞の選抜および同定
本発明に基づいて、それに限定されるものではないが、プロトプラスト、組織培養細胞、組織および器官の外植体、花粉、胚および植物全体を含むような様々な植物細胞の中で１つか複数の開示されている遺伝子作成物を操作することにより、望ましい植物が得られる可能性がある。本発明の実施例では、以下に説明するアプローチや方法のあとで、形質転換体（導入された遺伝子作成物を取りこんでいるあるいは統合しているようなもの）について遺伝子操作された植物材料を選抜し、スクリーニングする。形質転換体は植物の中で再生してもよい。別の方法としては、マーカー遺伝子の追跡のために由来した植物や未熟植物を選抜やスクリーニングの対象とする前に、遺伝子操作された植物材料を植物や未熟植物の中で再生する可能性がある。植物細胞、組織あるいは器官から植物を再生するための方法は、選抜やスクリーニングの前であれ、後であれ、当業者には良く知られている。
形質転換された植物細胞、カルス、組織あるいは植物は、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子にコードされている追跡のために操作された植物材料を選抜し、スクリーニングすることによって同定し、分離してもよい。たとえば、形質転換遺伝子作成物が抵抗性を示すような抗生物質あるいは除草剤を阻害量含んだ培地上で遺伝子操作された植物材料が増殖することによって、選抜を行ってもよい。さらに、本発明の組換え核酸作成物上に存在する可能性のある目に見えるマーカー遺伝子（たとえばβ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢあるいはＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによって形質転換された植物および植物細胞を同定してもよい。そのような選抜とスクリーニングの方法論は当業者には良く知られている。
本発明の遺伝子作成物を含んでいる植物あるいは植物細胞形質転換体を同定するためには物理的および生化学的な方法を用いてもよい。このような方法には、それらに限定されるものではないが：１）組換えＤＮＡの挿入の構造を検出し、決定するためのサザン分析あるいはＰＣＲ増幅；２）遺伝子作成物のＲＮＡ転写物を検出し、調べるためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮエース プロテクション、プラーマ−延長あるいは逆転写酵素−ＰＣＲ増幅；３）そのような遺伝子が遺伝子作成物にコードされている場合、酵素活性あるいはリボザイム活性のための酵素アッセイ；４）遺伝子作成物の産物がタンパクの場合、タンパクのゲル電気泳動、ウエスタンブロット技術、免疫沈降、あるいは酵素結合イムノアッセイ、が含まれる。植物の特異的な組織や器官における組換え作成物の存在あるいは発現を検出するために、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成、酵素染色および免疫染色のような別の方法を用いてもよい。このようなアッセイについてはすべて、それを行うための方法は当業者によく知られている。
５．３．Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼ
５．３．１．ｃｅｌ１遺伝子、プロモーターおよび組換えベクター
もう１つの態様では、本発明は、Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼ（Ｃｅｌ１）ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む新規に単離した核酸分子を提供する。１つの実施例では、ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というアミノ酸配列を持っている。
特別の実施例では、単離された核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２というヌクレオチド配列を持っている。
もう１つの特別の実施例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というアミノ酸配列をもっているポリペプチドをコードしている単離された核酸分子は、遺伝子変異体、種の変異体、自然に起きる変異体、人工的なあるいは誘導された変異体のような変異体である。核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というポリペプチドの誘導体あるいは類縁体をコードしてもよい。
実施例やあとで示すように、ｃｅｌ１遺伝子の単離は、アボガドとトマトのＥＧａｓｅで保存されているアミノ酸配列に従って設計された同義性プラーマ−を用いて２６０塩基対断片のＰＣＲ増幅によって行い、その後A. thalianaのゲノムライブラリをスクリーニングするのに用いた。
２６０塩基対のＰＣＲ断片とハイブリッドを形成した７．５ｋｂのＳＡｌＩ断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を単離し、分析した。A. thalianaのｃｅｌ１遺伝子は６つのイントロンで分断された７つのエクソンを含んでいることが判った。
本発明はまた、Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼのゲノムクローンであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９というヌクレオチド配列を持っている単離された核酸分子を提供する。
エクソンの核酸配列を利用して、伸長している組織におけるｃｅｌ１のｍＲＮＡの存在を調べるためにおよびｃｅｌ１のオープンリーディングフレームを含むｃｅｌ１のｃＤＮＡを単離するためにＲＴ−ＰＣＲを用いた。ｃｅｌ１の１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片がうまくクローニングされ、配列決定された（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。ｃＤＮＡの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９から推定されたように、組合せたエクソンのＤＮＡ配列に完全に一致していた。
１４７６塩基対のｃｅｌ１オープンリーディングフレームは推定分子量５４キロダルトンで４２９個のアミノ酸からなるポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をコードしていることが判った。
あとで、機能している実施例で示すように、７６８塩基対のｃｅｌ１ｃＤＮＡ断片をプローブとしてｃｅｌ１のノーザンブロット分析を行った。開花している葉柄の基底節間部と同様に完全に伸びきった葉ではＲＮＡ転写物は検出されなかった。しかしながら、正常な植物における開花している葉柄の伸長している層では強い転写シグナルが検出された。
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポーター遺伝子（ｇｕｓ）と結合したｃｅｌ１の推定プロモーター領域で形質転換した遺伝子導入タバコで組織特異的な発現を調べた。
８つの別々の遺伝子導入植物から生じた１６本の苗木で充分なＧＵＳ活性が認められた。活性は苗条および根両方の伸長している層で見られた。
発明のｃｅｌ１核酸分子には：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＤＮＡ配列；（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列；（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるｃＤＮＡを補完してハイブリッド形成する、および機能的に同等な産物をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列をコードし、機能的に同等な産物をコードしているヌクレオチド配列；および（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるエンド−１，４−β−グルカナーゼのアミノ酸配列を含む植物タンパクをコードしているヌクレオチド配列が含まれる。ｃｅｌ１の機能的な同等物には、ほかの植物種の中で自然に生じた植物のｃｅｌ１、および自然に生じているあるいは人為的に操作された突然変異ｃｅｌ１が含まれる。発明はまた、配列（ａ）から（ｅ）までの同義性変異体も含んでいる。
発明はまた、先行する段落における（ａ）から（ｅ）のヌクレオチド配列とハイブリッドを形成する、従って相補性を持つ核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列を含んでいる。そのようなハイブリッド形成条件は以下に説明するように、厳密性が高いか、さほど高くなくてもよい。 核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（“オリゴ”）であるような場合では、厳密性の高い条件は、たとえば、３７℃（１４塩基のオリゴについて）、４８℃（１７塩基のオリゴについて）、５５℃（２０塩基のオリゴについて）および６０℃（２３塩基のオリゴについて）にて６ｘＳＳＣ/０．０５％ピロリン酸ナトリウム中で洗浄することを参考にする。
もう１つの特別な実施例では、発明は相同性のある配列を持つヌクレオチド配列を提供する。たとえば相同性のある配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と同一の大きさのヌクレオチド配列で、あるいは技術的に知られているコンピュータ相同性プログラムによって配置された配列と比べた場合、あるいはその配列の核酸が高い、中程度の、あるいは低い厳密性の条件下でｃｅｌ１コード配列とハイブリッドを形成することができるようなヌクレオチド配列で、６０％あるいは７０％あるいは８０％あるいは９０％あるいは９５％の相同性あるいは同一性を分かち合っているような配列である。
限定するものではなく、一例として低い厳密性の条件を用いる方法は以下のとおりである（Shilo
and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792を参照されたい）：３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％フィコール、１％ＢＳＡおよび５００μｇ/ｍｌサケの精子の変性ＤＮＡを含む溶液で、ＤＮＡを含むフィルターを４０℃にて６時間前処理する。以下の変更を伴った同じ溶液でハイブリッド形成を行う：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ/ｍｌサケの精子のＤＮＡ、１０％（重量/容積）硫酸デキストラン、および５〜２０ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐを標識したプローブを用いる。フィルターはハイブリッド形成用混合物中で４０℃にて１８〜２０時間インキュベートし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中で５５℃にて１．５時間洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液に取替え、６０℃にてさらに１．５時間インキュベートする。ブロットしたフィルターを乾燥し、オートラジオグラフィを行う。必要であれば、フィルターは６５〜６８℃にて３回目の洗浄を行い、フィルムに再び露出する。用いられる可能性のある厳密性の低いほかの条件は技術的によく知られている。
限定ではなく１つの例として、厳密性の高い条件で用いられる方法は以下のとおりである：ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションは、６ｘＳＣＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌサケの精子の変性ＤＮＡで構成される緩衝液中で、６５℃にて８時間から一晩かけて行う。１００μｇ／ｍｌのサケ精子の変性ＤＮＡ、および５〜２０ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐを標識したプローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中で６５℃にて４８時間はハイブリッド形成を行う。２ｘＳＣＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％フィコールおよび０．０１％ＢＳＡを含む溶液中で３７℃にて１時間フィルターの洗浄を行う。その後オートラジオグラフィの前に０．１ｘＳＣＣ中で５０℃にて４５分間洗浄する。用いられる可能性のある厳密性の高いほかの条件は技術的によく知られている。
限定ではなく１つの例として、厳密性の適度に高い条件で用いられる方法は以下のとおりである：６ｘＳＳＣ、５ｘデンハート、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡで構成される緩衝液中で５５℃にて６時間から一晩前処理した。ハイブリッド形成は５〜２０ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐで標識したプローブを加えた同じ溶液中で行い、５５℃にて８〜４８時間インキュベートした。フィルターの洗浄は、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０℃にて、３０分後に２回交換することによって行った。適度に高い厳密性のスクリーニングに対するほかの条件は技術的によく知られている。ハイブリッド形成の条件に関するなお一層の指針については、たとえば、Sambrook et al., 1989, 分子クローニング、実験室マニュアル、Cold
Spring Harbor Press, New York;およびAusubel et al., 1989, 分子生物学における現代プロトコール、Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。
上述した植物のｃｅｌ１ヌクレオチド配列に加えて、同じ種に存在する完全長のｃｅｌ１ｃＤＮＡあるいは遺伝子および/あるいは別の植物種に存在するｃｅｌ１遺伝子のホモログは、技術的によく知られた分子生物学の技術を用いて、過度の実験操作なしで同定でき、容易に単離することができる。関連した種においてｃｅｌ１遺伝子のホモログを同定するということは、以下の過程を陽性にも陰性にも変更する：つまり植物の形態を大きくしたり、小さくしたりするように植物におけるｃｅｌ１を変更するための、植物ｃｅｌ１の作用物質あるいは拮抗物質を発見するという目的で植物のモデル系を開発するのに役立てることができる。別の方法としては、そのようなｃＤＮＡライブラリあるいは関心のある生物に由来するゲノムライブラリについて、ここで説明しているヌクレオチドをハイブリッド形成プローブあるいは増幅プローブとして用いてハイブリッド形成法によってスクリーニングすることができる。さらにゲノム中の別の遺伝子座における遺伝子で、ｃｅｌ１遺伝子産物の１つか複数のドメインと広範囲にわたる相同性を持つタンパクをコードするものも同様の技術を介して同定することができる。ｃＤＮＡライブラリの場合は、そのようなスクリーニング技術によって、同一の種あるいは別の種において代わりにスプライシングを受けた転写物に由来するクローンを同定することができる。
スクリーニングは２つ組のフィルターを用いたフィルターハイブリッド形成による可能性がある。標識されたプローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に見られるようにｃｅｌ１ヌクレオチド配列の少なくとも１５〜３０塩基対を含むことができる。ｃＤＮＡライブラリが、標識された配列が由来する生物の型とは別の生物に由来する場合、用いるハイブリッド形成の洗浄条件は上述したように厳密性を低くすべきである。
別の方法としては、関心のある生物に由来するゲノムライブラリをスクリーニングするために、再び適切に厳密な条件を用いて、標識したｃｅｌ１のヌクレオチドプローブを用いてもよい。植物ゲノムのクローンを同定し、特徴付けることは植物の構造的形態を調節するために遺伝子導入植物を利用するのに役立つ。たとえば、植物遺伝子のイントロン/エクソン境界域に隣接する領域に由来する配列は、エクソン、イントロン、スプライス部位における（たとえばスプライス・アクセプターおよび/あるいはドナー部位）突然変異を検知するために増幅アッセイで用いる際にプライマーを設計するのに役に立つことができる。
さらに、ｃｅｌ１遺伝子ホモログは、ここで開示されている植物のｃｅｌ１遺伝子産物の中にあるアミノ酸配列に基づいて設計された２つのオリゴヌクレオチドプラーマープールを用いてＰＣＲを行うことによって関心のある生物の核酸から単離してもよい。反応の鋳型は、たとえばｃｅｌ１遺伝子の発現が判っているあるいは推測されている植物の細胞株あるいは組織から調製したｍＲＮＡの逆転写のよって得たｃＤＮＡであってもよい。
ＰＣＲ産物はサブクローニングし、増幅した配列が植物のｃｅｌ１遺伝子の配列を示すことを確認するために配列決定を行ってもよい。様々な方法によって完全長のｃＤＮＡクローンを単離するために、それからＰＣＲ断片を用いてもよい。たとえば、増幅した断片は、植物ｃＤＮＡライブラリのようなｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために、標識して用いてもよい。別の方法としては、ゲノムライブラリのスクリーニングを介してゲノムクローンを単離するために、標識した断片を用いてもよい。
ＰＣＲ技術は完全長のｃＤＮＡ配列を単離するために利用してもよい。たとえば、常法に従って適切な細胞材料あるいは組織（すなわち、植物のｃｅｌ１遺伝子の発現が判っているもの、あるいは推測されているもの）からＲＮＡを単離してもよい。最初の鎖合成の開始に対して増幅される断片の最５’末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡ上で逆転写反応を行ってもよい。 出来上がったＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは通常のターミナルトランスフェラーゼを用いてグアニンの“尾を付加し”ハイブリッドをＲＮエースＨで分解し、ポリＣプライマーで２番目の鎖合成を開始してもよい。このようにして、増幅された断片の上流のＤＮＡ配列は容易に単離してもよい。用いる可能性があるクローニング戦略の概説については、たとえばSambrook et al., 1989 上記を参照されたい。
ｃｅｌ１遺伝子はさらに突然変異を起したｃｅｌ１遺伝子を単離するために用いてもよい。植物の形態の変更に寄与するような遺伝子型を持っていることが判っている、あるいは持っていると提案されている植物種から、そのような突然変異遺伝子が単離される可能性がある。さらに、そのような植物のｃｅｌ１遺伝子配列は、植物の生育に影響を与えるような、植物のｃｅｌ１遺伝子の調節（たとえばプロモーターあるいはプロモーター/エンハンサー）欠失を検知するために用いることができる。
植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子のｃＤＮＡはたとえば、当業者にはよく知られた技術である、ＰＣＲを用いて単離してもよい。推定上、植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子を持っている植物種において発現が判っている、あるいは推測される組織から単離したｍＲＮＡに対してオリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドでハイブリッド形成し、逆転写酵素によって新しい鎖を延長することによって最初のｃＤＮＡ鎖を合成してもよい。ｃＤＮＡの２番目の鎖はそれから、正常遺伝子の５’末端に特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを用いて合成する。このような２つのプライマーを用いて、産物をＰＣＲで増幅し、適切なベクターでクローニングして、当業者にはよく知られた方法によってＤＮＡの配列解析を行う。正常な植物ｃｅｌ１遺伝子のＤＮＡ配列と植物ｃｅｌ１の突然変異遺伝子のＤＮＡ配列を比べることによって、植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子の産物の機能を欠損している、あるいは変更しているような突然変異を突きとめることができる。
別の方法として、植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子を持っていることが推測される、あるいは判っている植物種から得たＤＮＡを用いて、ゲノムライブラリを構築することができる、あるいは植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子を発現していることが推測される、あるいは判っている組織から得たＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリを構築することができる。正常な植物ｃｅｌ１遺伝子あるいはその適切な断片を標識し、プローブとして用いて、そのようなライブラリにおいて相当する植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子を同定してもよい。当業者にはよく知られている方法に従って、植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子の配列を含んでいるクローンを精製し、配列解析を行う。
さらに、たとえば、そのような突然変異遺伝子を持っていることが推測される、あるいは判っている植物種において、植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子を発現していることが推測される、あるいは判っている組織から単離したＲＮＡをから合成したｃＤＮＡを利用することによって、発現ライブラリを構築することができる。こんな具合で推定上の突然変異体組織で作られた遺伝子産物は発現され、 区分５．３で、下に説明するように、正常の植物ｃｅｌ１遺伝子産物に対して作成した抗体と組合せた通常の抗体スクリーニング技術を用いてスクリーニングしてもよい。（スクリーニング技術については、たとえば、Harlow, E. and Lane編、1988, 抗体：実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring harborを参照されたい。）さらに、スクリーニングは、標識したＣｅｌ１融合タンパクでスクリーニングすることによって達成される。植物Ｃｅｌ１の突然変異によって別の機能を持った遺伝子産物が発現するような場合（たとえばミスセンスやフレームシフト突然変異の結果として）、植物ｃｅｌ１に対する一連のポリクローナル抗体は、突然変異植物ｃｅｌ１遺伝子産物との間でおそらく交叉反応をするはずである。当業者にはよく知られている方法に従って、そのような標識した抗体との反応を介して検出されたライブラリ・クローンを精製し、配列解析を行うことができる。
発明はまた、突然変異植物ｃｅｌ１をコードしているヌクレオチド配列、植物Ｃｅｌ１のペプチド断片、切断された植物Ｃｅｌ１および植物Ｃｅｌ１融合タンパクを含んでいる。これらには、それに限定するものではないが、ここで説明されている突然変異植物Ｃｅｌ１をコードしているヌクレオチド配列が含まれる。融合タンパクをコードしているヌクレオチドには、限定はされないが、完全長の植物Ｃｅｌ１、切断された植物Ｃｅｌ１あるいは、たとえば分泌シグナルペプチドのような、関係のないタンパクあるいはペプチドに融合された植物Ｃｅｌ１のペプチド断片が含まれてもよい。
発明はまた、エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を伴った分子を提供するような置換、付加あるいは欠失によりｃｅｌ１配列を変更することによるＣｅｌ１誘導体あるいは類縁体に関係している、従って、Ｃｅｌ１誘導体は、変更された配列を含むＣｅｌ１アミノ酸配列の全部あるいは一部をアミノ酸の１次配列として含むようなポリペプチドを含めている。変更された配列とは、機能的に同等なアミノ酸残基が配列の中で機能的に活性のあるポリペプチドを生じるような残基で置換されているものである。たとえば、配列の中の１つか複数のアミノ酸残基は、機能的に同等に作用し、結果的には表現として現れないような変更となる、似たような極性を持った別のアミノ酸で置換することができる。配列の中のアミノ酸に対する保存的な置換については、アミノ酸が属しているクラスの別のメンバーから選択してもよい。たとえば、非極性（疎水性）のアミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。中性極性アミノ酸には、グリシン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽性に荷電している（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。陰性に荷電している（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。そのようなＣｅｌ１誘導体は、ペプチドの化学合成によって、あるいは核酸を変化させたＣｅｌ１をコードしている核酸を用いた組換え生成によって作成することができる。限定するものではないが、化学的突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特定突然変異誘発(Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551)、ＴＡＢリンカーの利用、突然変異を含んだプライマーを用いたＰＣＲなどを含む技術的に知られている突然変異誘発のどのような技術も用いることができる。
さらに、望めば非古典的アミノ酸あるいは化学的なアミノ酸類縁体を置換あるいは付加として、Ｃｅｌ１タンパク、誘導体あるいは類縁体に導入することができる。非古典的アミノ酸には、限定するものではないが、普通のアミノ酸のＤ型異性体、２，４−ジアミノブチル酸、α−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、サイクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、およびβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸のような設計したアミノ酸、および一般のアミノ酸類縁体が含まれる。さらに、アミノ酸はＤ型（右旋性）であってもＬ型（左旋性）であってもよい。
発明はまた、ｃｅｌ１プロモーターのヌクレオチド配列を備えた、単離した核酸分子に関係している。
特別の実施例では、単離された核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１あるいはその機能的断片のヌクレオチド配列を備える、あるいはそれらからなる。
発明はまた、（ａ）前述の植物ｃｅｌ１コード配列および／あるいはその相補物（すなわちアンチセンス）のいずれかを含むような組換え核酸ベクター；（ｂ）コード配列の発現を行うような調節要素に操作できるように結合した前述の植物ｃｅｌ１コード配列のいずれかを含むような組換え核酸発現ベクター；および（ｃ）宿主細胞においてコード配列の発現を行うような調節要素に操作できるように結合した前述の植物ｃｅｌ１コード配列のいずれかを含むような遺伝子操作された宿主細胞、を含んでいる。ここで用いられるように、調節要素は、誘発性および非誘発性のプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を行い、調節するような、当業者には知られているそのほかの要素を含むが、これに限るものではない。そのような調節要素は、植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえば、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットに対するプロモーター；葉緑素ａ／ｂ結合タンパクに対するプロモーター）あるいは植物ウイルスに由来するプロモーター（たとえば、ＣａＭＶの３５５ＲＮＡプロモーター；タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のコートタンパクプロモーター、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ即時型遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期あるいは後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ファージＡのオペレーターおよびプロモーター主領域、ｆｄコートタンパクの制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母α−接合因子）を含むが、それに限定されるものではない。
本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というアミノ酸配列を持つタンパクあるいはポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；（ｂ）遺伝子変異体、種変異体、および自然に起きるあるいは人工的なそれらの変異体であるような、ヌクレオチド配列ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４の変異体；（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＣｅｌ１ポリペプチド誘導体あるいは類縁体をコードしている核酸分子；あるいは（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２というヌチド配列、を備えている核酸分子を備える組換え核酸ベクターを含んでいる。
発明はまた、上述の組換え核酸ベクターを含んでいる宿主細胞に関係している。
本発明はさらに、分泌シグナルペプチドをコードしている第1の核酸配列および細胞壁を調節するポリペプチドをコードしている第２の核酸配列を備えている組換え核酸ベクターに関係している。
もう１つの特別な実施例では、分泌シグナルペプチドはArabidopsis
thalianaから入手できる、ｃｅｌ１に由来する。
特別な実施例では、組換え核酸ベクターは、ここで上に定めたようにセルロース結合ドメインであるような細胞壁を調節するタンパクポリペプチドを持っている。
５．３．２．ｃｅｌ１タンパクおよびポリペプチド
本発明は、Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ｃｅｌ１）遺伝子、遺伝子および種変異体、および自然に起きるおよび人工的な機能的変異体、およびそれらの誘導体および類縁体に相当するアミノ酸配列を備えているポリペプチドを含んでいる。
特別な実施例では、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というアミノ酸配列を持つポリペプチドを提供する。
発明はまた、エンド−１，４−β−グルカナーゼに限定するものではないが、それを含む数多くの基準のいずれかによって判断される、上の区分５．３．１で説明されているような核酸配列によりコードされているｃｅｌ１に機能的に同等であるようなタンパクを含んでいる。そのような機能的に同等なＣｅｌ１タンパクは、表現に現れない変化を生じるので、機能的に同等な遺伝子産物を生産する、区分５．３．１において上で説明されている植物ｃｅｌ１ヌクレオチド配列によりコードされているアミノ酸配列に中におけるアミノ酸残基の付加あるいは置換に限定されるものではないが、それを含んでいる。アミノ酸の置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／あるいは両親媒性の性質における類似性に基づいて行ってもよい。たとえば、非極性（疎水性）のアミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。中性極性アミノ酸には、グリシン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽性に荷電している（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。陰性に荷電している（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
ｃｅｌ１ＤＮＡにランダム突然変異を起こし（当業者にはよく知られているランダム突発技術を用いて）、生じた突然変異体の活性を調べる一方で、ｃｅｌ１コード配列の部位特異的突然変異（当業者にはよく知られている部位特異的突然変異誘発技術を用いて）を操作して機能を高めた変異体植物細胞を作成する。
ｃｅｌ１コード配列に対するそのほかの突然変異は、選択した宿主細胞における発現や規模拡大などにさらにふさわしいＣｅｌ１タンパクを生成するために行うことができる。たとえば、ジスルフィド結合を除くためにシステイン残基を削除したり、ほかのアミノ酸に置換したりすることができる；たとえば、超グリコシル化Ｎ−連鎖部位で知られている酵母宿主から容易に回収され、精製される同質産物の発現を達成するために、Ｎ−連鎖グリコシル化部位を変更したり、削除したりすることができる。
Ｃｅｌ１ポリペプチドおよびペプチドは化学的に合成することができるけれども（たとえば、Creighton,
1983, タンパク：構造と分子の本質、W. H. Freeman & Co, New Yorkを参照されたい）、Ｃｅｌ１に由来する大きなポリペプチドおよび完全長のＣｅｌ１自体は、植物Ｃｅｌ１遺伝子配列および/あるいはコード配列を含んでいる核酸を発現するために技術的によく知られている組換えＤＮＡ技術によって有利に作成してもよい。そのような方法は、区分５．１に説明したｃｅｌ１ヌクレオチド配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含んでいる発現ベクターを構築するために用いることができる。このような方法にはたとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝的組換えが含まれる。たとえば、Sambrook et al., 1989, 上記およびAusubel et al.,
1989, 上記に記載されている技術を参照されたい。別の方法としては、ｃｅｌ１ヌクレオチド配列をコードすることができるＲＮＡをたとえばシンセザイザーを用いて化学的に合成してもよい。たとえば、ここでは全体を参考として取り入れている1984, Gait M. J.編、IRL Press Oxfordの、オリゴヌクレオチドの合成の中に記載されている技術を参照されたい。
たとえば知られている保護基/阻害基のビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、ペギル化、誘導体化、タンパク分解性の開裂、抗体分子あるいはほかの細胞性リガンドなど、合成の間あるいは後で区別して修飾されるようなＣｅｌ１タンパク、誘導体および類縁体もまた、発明の範囲に含まれる。特別な実施例では、ＤＣタンパク、誘導体あるいは類縁体はＮ末端でアセチル化され、および/あるいはＣ末端でアミド化される。数多くの化学修飾のいかなるものも、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下での代謝的合成などに限定されるものではないが、これらを含む知られている技術によって行ってもよい。このような修飾は、発明のペプチドの性、生体利用性および/あるいは阻害作用を高めるよう働く可能性がある。
上で説明したＣｅｌ１タンパク、誘導体あるいは類縁体のいかなるものも、そのアミノ末端および/あるいはカルボキシ末端に共有結合した非ペプチド巨大分子の担体基を持ってもよい。そのような巨大分子の担体基にはたとえば、脂質−脂肪酸結合あるいは炭水化物を含めてもよい。
エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性および/あるいはＣｅｌ１タンパクあるいはその誘導体（タンパク断片およびキメラタンパク）あるいはその類縁体のセルロースへの結合能は、以下の区分５．４および６で説明されている方法、あるいは当業者に知られている方法のいずれかによって測定することができる。
発明の植物ｃｅｌ１ヌクレオチド配列を発現させるために多様な宿主発現ベクター系を利用してもよい。
植物ｃｅｌ１コード配列および適切な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために、当業者にはよく知られている方法を用いてもよい。このような方法にはたとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝的組換えが含まれる。たとえば、Sambrook et al., 1989, 分子クローニング実験室マニュアル、Cold
Spring Harbor Laboratory, New YorkおよびAusubel et al.,
1989, 分子生物学における現代プロトコール、Greene Publishing Associates
and Wiley Interscience, New York に記載されている技術を参照されたい。
ｃｅｌ１コード配列を発現するために多様な宿主−発現ベクター系を利用してもよい。これらには、限定されるものではないが、以下のようなものが含まれる：植物ＧｌｕＲコード配列を含んでいる組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡあるいはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物；植物ＧｌｕＲコード配列を含んでいる組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ｃｅｌ１コード配列を含んでいる組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ｃｅｌ１コード配列を含んでいる組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、あるいは組換えプラスミド発現ベクターで形質転換した植物細胞系；あるいは、二重微小染色体で安定的に増幅した（ＣＨＯ/ｄｈｆｒ）あるいは不安定に増幅した（たとえばマウスの細胞株）複数コピーのｃｅｌ１を含むように操作した細胞株を含んでいる組換えウイルス発現ベクター（たとえばアデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染させた動物細胞系。
このような系における発現要素の強さや特異性は様々である。利用する宿主/ベクター系によって、構成的な、誘発性のプロモーターを含む数多くの適切な転写および翻訳要素のいかなるものも発現ベクターにおいて用いてもよい。たとえば、細菌系でクローニングする場合、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等を用いてもよい；昆虫系でクローニングする場合、バキュロウイルス・ポリヘドリンプロモーターのようなプロモーターを用いてもよい；植物系でクローニングする場合、植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえば、ｃｅｌ１プロモーター、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットに対するプロモーター； 葉緑素ａ／ｂ結合タンパクに対するプロモーター）、あるいは植物ウイルスに由来するプロモーター（たとえば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパクプロモーター）を用いてもよい； 哺乳類細胞系でクローニングする場合、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえば、メタロチオネイン プロモーター）あるいは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（たとえば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を用いてもよい；複数コピーのｃｅｌ１ＤＮＡを含む細胞株を作成する場合、ＳＶ４０−，ＢＰＶ−およびＥＢＶ−に基づいたベクターを適切な選択を行えるマーカーとともに用いてもよい。
細菌系では、発現されたＣｅｌ１に対して目的とする用途によって、数多くの発現ベクターを有利に選択してもよい。たとえば、抗体を作成するために、あるいはペプチドライブラリをスクリーニングするために、大量のＣｅｌ１を生産すべき場合は、容易に精製される融合タンパク産物を高レベルで発現するようなベクターが望ましいかもしれない。そのようなベクターには、限定されるものではないが、以下のようなものがある：ベクターにおいてｃｅｌ１コード配列がｌａｃＺコード領域とフレーム内で連結しているのでＣｅｌ１とｌａｃＺのハイブリッドタンパクが生産されるようなE. coli発現ベクターｐＵＲ２７８(Ruther at al., 1983,
EMBO J. 2:1791)；我々がすでにウサギからの抗体を作成し、精製するのに用いているように、ノバゲン(Madison,
Wisconsin)から入手したE. coli発現ベクターｐＥＴ３ｄ；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acid Res. 13:3101-3109; Van heeke
& Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509)など。
酵母では、構成的な、あるいは誘発性の数多くのプロモーターを用いてもよい。 概説のためには以下を参照されたい：分子生物学の現代プロトコール、第２巻、1988, Ausubel, et al.編、Green Publish. Assoc．Wiley Interscience, ch12; Grant et al., 1978, 酵母のための発現および分泌ベクター、「酵素学の方法」の中でWu & Grossman編、1987, Acad. Press, N.Y.,
Vol 153, pp516-544; Glover, 1986, ＤＮＡクローニングVol. II. IRL
Press, Wash. D.C. ch,3; およびBitter, 1987, “酵母におけるヘテロ接合体遺伝子の発現”酵素学の方法、Berger & Kimmel編、Acad. Press, N.Y., Vol
152, pp673-684; および、酵母サッカロミセスの分子生物学、1982, Strathern et
al.編、Cold Spring Harbor Press, Volおよび I II）。
植物の発現ベクターを用いる場合、数多くのプロモーターのどのようなものでｃｅｌ１コード配列の発現を操作してもよい。たとえば、ＣａＭＶの３５ｓＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター（Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514)、あるいはＴＭＶののコートタンパクプロモーター(Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311)のようなウイルスプロモーターを用いてもよい；別の方法としては、ｃｅｌ１プロモーターあるいはその機能的断片、ＲＩＢＩＳＣＯの小サブユニット(Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984,
Science 224:838-834)のような植物プロモーター；たとえば大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅあるいはｈｓｐ１７．３−Ｂ(Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565)のような熱ショックプロモーターを用いてもよい。このような作成物はＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、ＤＮＡの直接的な形質転換、微量注入、エレクトロポレーションなどによって植物細胞に注入することができる。そのような技術の概説については、たとえば、Weissbach & Weissbach, 1988, 植物の分子生物学のための方法、Academic Press NY, Section VIII, pp421-463; およびGrierson & Corey, 1988, 植物の分子生物学、2nd
Ed., Blackie, London, ch 7-9を参照されたい。
組換えタンパクを長期にわたって高い収量で生産するためには、安定的な発現が好ましい。たとえば、植物Ｃｅｌ１タンパクを安定的に発現している細胞株を操作してもよい。ウイルス由来の複製物を含むような発現ベクターを用いるのではなくて、適切な発現制御要素（たとえば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結区、ポリアデニル化部位など）と選択可能なマーカーによって制御されるｃｅｌ１ＤＮＡで、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、栄養に富んだ培地で１〜２日増殖させ、選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーによって選択に対し抵抗性を示し、細胞は安定的にプラスミドを染色体に取りこむことができ、増殖巣を形成し、順にクローン化され、細胞株になっていくことができる。
様々な選択系を用いてもよく、以下に限定されるものではないが、以下のようなものを含んでいる：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler, et al., 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalska, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA45:2026)、およびアデノシン ホスフォリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., 1980, Cell 22:817)遺伝子がそれぞれｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-あるいはａｐｒｔ-細胞で用いることができる。また、抗代謝物抵抗性も選択の基礎に用いることができ、ｄｈｆｒはメソトレキセート抵抗性があり（Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA77:3567; O'Hare et al.,
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527)；ｇｐｔはフェノール酸抵抗性であり（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)；ｎｅｏはアミノグリコシドＧ−４１８に抵抗性であり(Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1)；およびｈｙｇｒｏはハイグロマイシン抵抗性(Santerre, et al., 1984, Gene 30:147)である。最近、追加の選択可能な遺伝子が説明された、すなわち、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにし；ｈｉｓＤはヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにし(Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047)；およびＯＤＣ（オルニチン デカルボキシラーゼ）はオルニチン デカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯ抵抗性（McConlogue L., 1987, 分子生物学における現在のコミュニケーションの中、Cold Spring Harbor Laboratory編）である。発明はまた、（ａ）前述のコード配列および/あるいはその相補物（すなわちアンチセンス）を含むようなＤＮＡベクター；（ｂ）コード配列の発現に向けた調節要素と操作できるように結合した前述のコード配列を含むようなＤＮＡ発現ベクター；および（ｃ）宿主細胞におけるコード配列の発現に向けた調節要素と操作できるように結合した前述のコード配列を含むような遺伝的に操作された宿主細胞および/あるいは植物、を含んでいる。ここで用いられている調節要素は、誘発性あるいは非誘発性の、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび当業者には知られている、発現を操作し、調節するような、そのほかの要素に限定されるものではないが、それらを含んでいる。
５．３．３．Ｃｅｌ１タンパク、誘導体および類縁体の調製
エンド−１，４−β−グルカナーゼ（Ｃｅｌ１）、およびその誘導体あるいはその類似体は、技術的に知られている組換えあるいは合成技術によって作成された生物組織あるいは細胞培養から精製することができる。
未処置のＣｅｌ１は様々な材料から得ることができる。望ましいエンド−１，４−β−グルカナーゼ（Ｃｅｌ１）を含む、あるいは産生することが判っているどのような材料からでも、たとえば、Ｃｅｌ１は植物組織のような材料から単離してもよい、通常のタンパク精製方法を用いて、エンド−１，４−β−グルカナーゼを単離し、および精製し、あるいは部分精製してもよい。そのような通常のタンパク精製技術は、限定されるわけではないが、以下のものを含んでいる：クロマトグラフィ（たとえば、イオン交換、アフィニティ、ゲル濾過/分子排除クロマトグラフィおよび逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ））、遠心分離、差次的溶解性、および電気泳動（タンパク精製技術の概説については、 Scopes, 1987, タンパク精製；原理と方法、第２版 C. R. Cantor編、Springer Verlag, New York, New York, およびParvez
et al., 1985, ＨＰＬＣの進歩 Vol.1, Science Press, Utrecht, The Netherlands を参照されたい）。
発明のＣｅｌ１タンパク、誘導体および類似体を得るために組換え発現技術を応用することができる（たとえばSambrook et al., 1989, 分子クローニング、実験室マニュアル、Cold
Spring Harbor Laboratory, 2d Ed, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. 編、1985, ＤＮＡクローニング：実用的方法、MRL Press, LTD., Oxford, U.K., Vol I, IIを参照されたい）。ｃｅｌ１のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されている。ライブラリのスクリーニング、化学合成あるいはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるような、技術的によく知られている技術を用いて、ｃｅｌ１クローンを単離することができる。クローニングされたｃｅｌ１遺伝子の配列は、技術的に知られている数多くの方法のいずれかによって修飾することができる。
組換えＣｅｌ１タンパク、誘導体あるいは類似体を作成するために、Ｃｅｌ１タンパク、誘導体あるいは類似体が前記配列から生産されるように、Ｃｅｌ１タンパク、誘導体あるいは類似体をコードしている核酸配列を操作できるようにプロモーターにつなぐ。たとえば、ベクターを細胞に導入し、その細胞の中でベクターあるいはその一部が発現され、Ｃｅｌ１あるいはその一部を生産する。好ましい実施例では、ＲＮＡポリメラーゼの材料がＤＮＡに向けられたＲＮＡポリメラーゼである場合、核酸はＤＮＡである。しかし、ＲＮＡポリメラーゼの材料がＲＮＡに向けられたＲＮＡポリメラーゼである場合、あるいは逆転写酵素が細胞に存在した場合、あるいはＲＮＡからＤＮＡを作るために提供された場合も、核酸はＲＮＡである。そのようなベクターは、望ましいＲＮＡを作るために転写
されている限り、エピソームにとどまる、あるいは染色体に統合されて行く。そのようなベクターは、当該技術において標準であるような組換えＤＮＡ技術の方法によって構築することができる。
Ｃｅｌ１を生産する方法は：（ａ）組換え発現ベクターを含んでいる宿主細胞を培養すること、Ｃｅｌ１が細胞によって発現されるような条件下でＣｅｌ１をコードしているヌクレオチド配列を備えている前記ベクター；および（ｂ）細胞によって発現されたＣｅｌ１を回収することを、備えている。
タンパク−コード配列を発現するために、多様な宿主−ベクター系を利用してもよい。限定するものではないが、これらには、ウイルスを感染させた哺乳類細胞系（たとえば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）；ウイルス（たとえばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含んでいる酵母、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡあるいはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌のような微生物が含まれている。ベクターの発現要素の強さや特異性は宿主−ベクター系によって異なっており、数多くの転写および翻訳要素のいずれか１つを用いてもよい。
Ｃｅｌ１タンパク、誘導体、あるいは類似体は当技術分野で知られているプロモーター/エンハンサー要素のどのようなもので制御してもよい。そのようなプロモーターは限定するものではないが、以下のようなものを含んでいる：ＳＶ４０初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれているプロモーター(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797)、ＨＳＶ−１（１型単純性ヘルペスウイルス）、チミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42)；β−ラクラマーゼプロモーター(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75:3727-3731)、」あるいはｔａｃプロモーター(DeBoer et al., 1983, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25)のような原核細胞の発現ベクター；Scientific
American 1980, 242:74-94の“組換え細菌由来の有用なタンパク”を参照；ｃｅｌ１プロモーターあるいはその機能的断片、ノパリンシンセターゼプロモーター領域(Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213)あるいはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター(Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871)、および光合成酵素リブロースニリン酸カルボキシラーゼのプロモーター (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120)を備えている植物の発現ベクター；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスフォグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターのような酵母あるいはそのほかの真菌由来のプロモーター要素、および以下のような動物の転写制御領域で、組織特異性を示し、遺伝子導入動物で利用されているもの：膵臓の腺房細胞で活性のあるエラスターゼＩ遺伝子制御領域(Swift et al.,1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hematology
7:425-515)；膵臓のβ細胞で活性のあるインスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985,
Nature 315:115-122)、リンパ系細胞で活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域
(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature
318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、精巣、乳腺、リンパ系および肥満細胞で活性のあるマウス乳腺癌ウイルス制御領域 (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495)、肝臓で活性のあるアルブミン遺伝子制御領域 (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel.1:268-276)、肝臓で活性のあるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域 (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et
al., 1987, Science 235:53-58)、 肝臓で活性のあるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kalsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171)、骨髄細胞で活性のあるβ−グロビン遺伝子制御領域 (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986,
Cell 46:89-94）、脳の乏突起膠細胞で活性のあるミエリン塩基性タンパク遺伝子制御領域
(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712);骨格細胞で活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域 (Sani, 1985, Nature 314:283-286)、および視床下部で活性のある性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)。Ｃｅｌ１タンパク、誘導体、あるいは類縁体をコードしている核酸に操作できるように連結しているプロモーター要素はまた、バクテリオファージプロモーターである可能性もある。そのプロモーターは、別のプラスミドのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子から発現されたバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼに由来している。たとえば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている別のプラスミドによってＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと操作できるように連結されたケモカイン、誘導体あるいは類似体をコードしている核酸。
さらに、挿入された配列を調節したり、あるいは望ましい特異的な様式で遺伝子産物を変更したり、処理したりするような宿主細胞を選択してもよい。特定の誘導物質の存在下で特定のプロモーターからの発現を上昇させることができる；このようにして遺伝的に操作されたケモカイン、誘導体あるいは類似体の発現を制御することができる。さらに、別の宿主細胞は、翻訳や翻訳後のプロセッシングや修飾について特徴的なおよび特異的なメカニズムを持っている（たとえば、グリコシル化、タンパクのリン酸化）。発現された外来タンパクの望ましい修飾やプロセッシングを確実なものにするために適切な細胞株や宿主系を選ぶことができる。たとえば、グリコシル化されないコアタンパク産物を作るためには細菌系での発現を用いることができる。酵母や昆虫細胞における発現はグリコシル化された産物を作ることになる。哺乳類細胞あるいは植物細胞における発現は異種構造タンパクの“天然の”グリコシル化を保証するために用いられる。さらに、いろいろなベクター/宿主発現システムは、いろいろな程度でプロセッシング反応に影響する可能性がある。
Ｃｅｌ１をコードしている核酸配列は、翻訳開始および/あるいは翻訳停止配列を創るおよび/あるいは破壊するために、あるいはコード領域に変異を創るために、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏで変化させることができる。当分野で知られている突然変異誘発に関するどのような技術も、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発(Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551)、ＴＡＢリンカー（ファルマシア）の利用、突然変異を含んだＰＣＲプライマーなどに限定するわけではないが、これらを含めて用いることができる。
突然変異誘発に含まれる実験は主として部位特異的突然変異誘発からなり、その後変更した遺伝子産物の表現型を調べる。さらに一般的に用いられている部位特異的突然変異誘発プロトコールは必要に応じて２本鎖ＤＮＡ同様に１本鎖ＤＮＡを提供するベクターをうまく利用している。一般に、そのようなベクターを用いる突然変異誘発プロトコールは以下のようなものである。変異誘発性プライマー、すなわち、変えられるべき、しかし１つか少数の変更された、付加された、あるいは欠失した塩基を含む配列に相補的なプライマーを合成する。ＤＮＡポリメラーゼによってｉｎ ｖｉｔｒｏでプラーマーを延長し、いくつかの操作を経たのち、２本鎖ＤＮＡを細菌細胞に形質移入する。次に様々な方法によって、望ましい変異を持ったＤＮＡを同定し、変異を持った配列を含むクローンから望ましいタンパクを精製する。さらに長い配列については、そのようなベクターでは長い挿入（２キロベースよりも長い）は不安定なので、追加のクローニングステップが求められる。プロトコールは当業者に知られており、部位特異的突然変異誘発に関するキットはバイオテクノロジー関係の供給会社、たとえばアマシャムライフサイエンス社（アーリントンハイツ、ＩＬ）およびストラタジーンクローニングシステム（ラホヤ、ＣＡ）から広く入手することができる。
そのほかの特別な実施例では、Ｃｅｌ１誘導体あるいは類縁体は、融合タンパクあるいはキメラタンパク産物として発現されてもよい（異質構造タンパクの配列（別のタンパクの）に結合したペプチドを介して連結されたタンパク、断片、類縁体あるいは誘導体を備える）。そのようなキメラ産物は、望ましいアミノ酸配列をコードしている然るべき核酸配列を適切なコードフレーム中で技術的に知られている方法で連結し、一般に技術的に知られている方法によってキメラ産物を発現させることによって作ることができる。
さらに、Ｃｅｌ１タンパク、誘導体（断片およびキメラタンパクを含む）、および類縁体は化学的に合成することができる。Clark-Lewis et al., 1991, Biochem. 30:3128-3135およびMerrifield, 1963, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156を参照されたい。たとえば、Ｃｅｌ１、誘導体および類縁体は固相技術によって合成し、樹脂から外し、調製用高速液体クロマトグラフィによって精製する（たとえば、Creighton, 1983, タンパク、構造と分子の本質、W. H. Freeman
and Co., N. Y. pp50-60を参照されたい）。タンパクであるようなＣｅｌ１、誘導体および類縁体はペプチド合成機を用いて合成することもできる。合成ペプチドの組成はアミノ酸分析あるいは配列決定によって確認してもよい（たとえば、エドマン分解法；Creighton, 1983, タンパク、構造と分子の本質、W. H. Freeman
and Co., N. Y. pp34-49を参照されたい）。
発明のＣｅｌ１タンパク、誘導体および類縁体は、アミノ酸残基の連続的付加によって、あるいは別の方法としては、たとえば断片縮合として技術的にはよく知られている技術を用いて組み合わせられた断片サブコンポーネントとして全体を合成してもよい（Shin et al., 1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56:404-408; Nyfeler et
al., 1992, Peptides, Proc. 12th Amer. Pep. Soc., Smith and River 編、Leiden, pp 661-663; Nokihara et al., 1990, タンパク研究財団、Yanaihara 編、大阪 pp315-320）。
さほど好ましくない実施例としては、Ｃｅｌ１誘導体をタンパクのタンパク分解によって得、その後上述のような常法を用いて精製する（たとえば免疫アフィニティ精製）。
５．４．応用
本発明は、以下に掲げるようなものに限定されるわけではないが、それらを含む様々な応用にその用途がある。
第１に本発明は、成長し続けるパルプおよび製紙業のために早く成長する遺伝子移入林木を提供するために用いることができる。それによって熱帯雨林の枯渇に関連した生態荒廃効果を軽減する。
第２に本発明は、変更された異なった特性を有する細胞壁を持っている遺伝子導入植物を提供するために用いることができる。異なった特性とは以下のようなものをいうが、それに限定するわけではない。さらに長いあるいはさらに短い繊維を持つ植物；生物分解への抵抗性がさらに高いかさらに低い植物；反芻動物において消化率がさらに良いか悪い植物；および昆虫、真菌、ウイルスおよび細菌のような害毒に対する抵抗性がさらに高いかさらに低い植物。
第３に本発明は、綿や亜麻などのような有用な繊維を持った遺伝子導入植物を提供するために用いることができる。それらは、さらに長いあるいは短い繊維を持ち；化学的に変更されたセルロースの“外観”、吸収性、強度およびレオロジーのような変更された特性を持っている変更された繊維を高い収量で生産する。
第４に本発明は、デンプンの生産量および/あるいは含有量の高い遺伝子導入植物を提供するために用いることができる。
第５に本発明は、熱抵抗性を高めた遺伝子導入植物を提供するために用いることができる。
本発明はさらに、トマトなどのような果実をつける遺伝子導入植物を提供するために用いることができる。それによってセルロース量の高い、糖含有量の高い果実が得られ、ケチャップやトマトピューレ業界で用いることができる。本発明はまた、早く成長する天蓋と短いライフサイクルで植えてから収穫までの期間を短くし、および/あるいは高い塊茎収量が得られるような遺伝子導入ジャガイモを提供するために用いることができる。本発明はさらに、普通より長いか短い葉柄、普通より大きいか小さい花弁などを持った花の咲く遺伝子導入植物を提供するために用いることができる。 さらに、発明は水から早く出現するような従って残存率や収率が高くなるような成長の早い米を提供するために用いることができる。さらに本発明は、普通より大きいか小さい葉を特徴とするようなレタスを提供するために用いることができる。そして最後に、発明は生物量の高い、反芻動物における消化率を変更した、アルファルファやクローバなどのような飼料作物を提供するために用いることができる。
本発明のさらなる有用性は、天然に起きている金属や毒素を過剰に吸収する植物の生育率を改善してその生物量を高め、それによって植物による環境浄化の速度と程度を改善することである（Glass, October 1, 1997, Genetic Engineering News, p8, 41-43を参照されたい）。
発明のｃｅｌ１遺伝子は、植物の構造や形態を変更するために遺伝子導入植物の中で細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドをコードする導入遺伝子としての有用性を持っている。ｃｅｌ１遺伝子はまた、Ｃｅｌ１タンパクを発現するように宿主細胞に挿入される組換えベクターの中でＣｅｌ１タンパクをコードすることに関する有用性を持っている。さらに、発明のｃｅｌ１遺伝子は、 （１）その他のエンド−１，４−β−グルカナーゼあるいはその変異体を同定するために核酸ライブラリをスクリーニングする核酸プローブとして；（２）Ｃｅｌ１タンパク変異体あるいは誘導体を作るために変えられるべきあるいは変更されるべき核酸配列として；（３）Ｃｅｌ１分泌シグナルペプチドをコードしている核酸配列の単離で；および（４）当業者に一般的に知られている分子生物学上の技術あるいは産業上の応用においてエンド−１，４−β−グルカナーゼをコードしている核酸として利用される可能性がある。
ｃｅｌ１核酸分子はたとえば植物のｃｅｌ１遺伝子の調節に有用な植物のｃｅｌ１アンチセンス分子として、あるいは植物ｃｅｌ１遺伝子の核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして用いられる可能性がある。植物ｃｅｌ１遺伝子の調節に関しては、そのような技術はたとえば、植物の生育、発生あるいは遺伝子発現を調節するために用いることができる。さらに、そのような配列は、ｃｅｌ１遺伝子調節にも有用なリボザイムおよび/あるいは三重螺旋配列の一部として用いられる可能性がある。
本発明のｃｅｌ１プロモーターは、遺伝子導入植物において組織特異的な様式で、関心のあるタンパク、ポリペプチドあるいはペプチドを発現するために伸長している組織に特異的な植物プロモーターとして利用される可能性がある。 特に、ｃｅｌ１プロモーターは、変更された構造を持つ遺伝子導入植物を作るために伸長している組織に特異的な様式で、細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドを発現するために用いられる可能性がある。さらに、ｃｅｌ１プロモーターは、変更された構造を持つ植物を作るために遺伝子導入植物の伸長している組織においてＣＢＤを発現するために用いられる可能性がある。
発明のArabidopsis thaliana のＣｅｌ１タンパクは、エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性が望ましいような生化学的な応用（実験的なあるいは工業的な）に用いることができる。たとえば、多糖類の消化、セルロースの修飾、伸長している植物の構造の変更、および当業者に知られている実験的あるいは工業的な生化学的応用があるが、これらに限定されるものではない。
発明のＣｅｌ１分泌シグナルペプチドは、関心のあるタンパクをコードしている配列に融合したＣｅｌ１分泌シグナルペプチドをコードする組換え核酸を構築し、組換えタンパクを発現することによって関心のあるタンパク、ポリペプチドあるいはペプチドの細胞における分泌を促進するために利用される可能性がある。
以下の実施例は例証だけを目的として提示するものであって、どのような方法であれ、発明の範囲に制限を加えようと意図するものではない。
６．実施例における実験的プロトコール
以下のプロトコールおよび実験材料が以下に続く実施例の中で用いられた。
６．１．植物材料および生育条件
Arabidopsis thaliana cv. Columbiaおよび Nicotiana tabaccum-SR1（タバコ）は２４〜２５℃にて、冷白色蛍光灯（５０〜６０μＥｍ-2Ｓ-1）を用いて１６時間明期で生育させた。矮性A. thalianaは、種を撒く前に鉢植え用混合物を２５０ｐｐｂのユニコナゾール[（Ｅ）−１−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチル−２−(１，２，４−トリアゾール−１−いる）１ペンタン−３−オル]（Agan Chemicals Inc.,イスラエル）、ジベレリン生合成阻害剤で処理することによって作成した(Henry, 1985, Bull Plant Growth Regul. Soc. Am. 13:9-11)。
６．２．植物組織からの植物核酸の単離
Doyle and Doyle (1987, Phytochem Bull
19:11-15)によって記載されているようにArabidopsis thaliana cv.
Columbia の葉柄と葉からＤＮＡを抽出した。ＲＮＡは“ＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴＴＭ”（Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH)を用いて製造者の指示書に従って、伸長している葉柄から抽出した。
６．３．染色体ＤＮＡから得たＥＧａｓｅＤＮＡプローブのＰＣＲ増幅同義性プライマー（Compton,
1990, “ＤＮＡ増幅のための同義性プラーマ−”は ＰＣＲプロトコール：方法と応用への指針の中、Innis,
Gelfand, Sninsky, and White編、Academic Press , San
Diego, CA)は、アボガドとトマトのセルラーゼアミノ酸配列からの保存的な領域、ＧＧＹＹＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）およびＣＷＥＲＰＥＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）に基づいて合成した。
プライマー＃１ＧＧＹＹＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＧＡ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）ＧＧＡ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）ＴＡＴ（Ｃ）ＴＡＴ（Ｃ）ＧＡＣ（Ｔ）ＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。プライマー＃２ＣＷＥＲＰＥＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：５’ＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡ（Ｇ）ＴＣＴ（Ｃ）ＴＣＡ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＧＧＡ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）ＣＧＴ（Ｃ）ＴＣＣＡＡ（Ｇ）ＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）。
ＰＣＲ混合物には、２μｌの染色体ＤＮＡ（０．５μｇ/μｌ）、２．５ｍｌ １０ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）、１μｌのｄＮＴＰ混合物(１０ｍＭ）、１．５μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５μｌの（２５μＭ）の各プライマー、１ユニットのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）が含まれ、さらに二重に蒸留したＨ２Ｏ（ｄｄＨ２Ｏ）で最終用量を２５μｌにした。蒸発を防ぐために鉱油（２５μｌ）を加えた。ＰＣＲプログラムはCompton（1990, “ＤＮＡ増幅のための同義性プラーマ−”は ＰＣＲプロトコール：方法と応用への指針の中、Innis, Gelfand, Sninsky, and White編、Academic
Press , San Diego, カリフォルニア)が記載しているように行った。
ＰＣＲ反応で増幅した２６０ｂｐの断片はSambrook et al.,(1989,分子クローニング：実験室マニュアル Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)による記載どおりに２％（ｗ/ｖ）アガロース/ＴＢＥゲル上で精製し、図１に示す。単離した２６０ｂｐ断片は、ＥｃｏＲＩで消化し、Ｍ１３ＲＦＤＮＡｍｐ１８ベクター（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)のＥｃｏＲＩクローニング部位にクローニングした。
６．４．A. thalianaのゲノムＥＧａｓｅ遺伝子のクローニング
ＥＧａｓｅのゲノムクローンは、ＥＭＢＬ３ベクター（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）に詰めこまれたA. thalianaのゲノムライブラリを用いて単離した。ライブラリは、ＳａｕＡ３で部分的に消化したA. thalianaのゲノムＤＮＡから構築し、ＥＭＢＬ３ベクターのＢａｍＨＩクローニング部位にクローニングした。Sambrook et al.(1989)に従ってＰＣＲに由来したＤＮＡ ＥＧａｓｅプローブ（２６０塩基対断片、図１）を用いて、合計で２．５ｘ１０５のプラークをスクリーニングした。ハイブリッド形成する組換えファージを１つ検出し、精製して均質にした。λゲノムクローンあるいはその後のｐＵＣ１８（New England Biolabs Beverly Massachusetts) プラスミドサブクローンの中にあるＥＧａｓｅ遺伝子を含む断片はサザンブロット分析によって突きとめた(Southern, 1975 J. Mol. Biol. 98:503-517)。図２に示した遺伝子作成物模式図に見られるように、サブクローンをＥｘｏＩＩＩで消化することによって、ゲノムのサブクローンで重複連続欠失を作った。ArabidopsisのＥＧａｓｅ配列（ｃｅｌ１）は、ＥＭＢＬヌクレオチド配列サブミッション、欧州生体情報研究所（European Bioinformation Institute、Hinxton
Hall, Hinxton, Cambridgeでは開示されていないものとされ、受入番号＃９８５４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を取得した。
６．５．ｃｅｌ１ＤＮＡのクローニング
A. thalianaの伸長している葉柄から抽出したＲＮＡを逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲキット、ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア）の鋳型として用いた。全ｃＤＮＡをＰＣＲ反応に用いた。末端のエクソン配列に従って２つの特異的なプライマーを設計した。プライマー＃３：５’−ＡＴＧＧＣＧＣＧＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）また（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の中のヌクレオチド１６６６〜１６８５）；およびプライマー＃４：５’−ＴＣＡＴＣＧＣＣＡＡＧＴＡＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）または（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の中のヌクレオチド５２５８〜５２７３）。出来上がった１．５ｋｂのＰＣＲ断片(図３）をｐＧＥＭ−Ｔベクター系（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）でクローニングし、配列決定した。この配列はＥＭＢＬヌクレオチド配列サブミッション、欧州生体情報研究所、Hinxton Hall, Hinxton, Cambridgeでは開示されていないものとされ、受入番号＃９８５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を取得した。
６．６．ヌクレオチド配列の決定
自動シーケンサー３７３型（パーキンエルマー、カリフォルニア、ＵＳＡ）を用い、製造者の指示書に従って、ヌクレオチド配列を決定した。
ノーザンブロット分析
ｃｅｌ１ｃＤＮＡクローン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）から作成した７６８ｂｐのＤＮＡプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド３９９から開始）をノーザンブロット分析に用いた。各実験では以下の組織から全ＲＮＡを抽出するために４０〜５０のA. thalianaを用いた:完全に開いた葉、開花している葉柄の基底節間部、正常植物の開花している葉柄における伸長層および矮性植物の開花している葉柄における伸長層（上述したようにユニコナゾールで処理した）。
全ＲＮＡ（１０μｇ）を１．６％アガロースゲル上で分画し、“ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ”膜（アマシャム、英国）に移した。“ＲＥＤＩ ＰＲＩＭＥ”キット（ランダムプライム標識キット、アマシャム、英国）によってＤＮＡプローブを３２Ｐで標識した。膜を５５℃にて１６時間ハイブリッド形成させた。最終洗浄は、０．５ｘＳＳＣ、０．１％（ｗ・ｖ）ＳＤＳ中で６０℃にて１０分間行った。１８ＳｒＲＮＡを内部標準として用いた。ＲＮＡのレベルはデンシトメーターを用いて測定した。
６．８．ｃｅｌ１プロモーター−ｇｕｓニ成分ベクターの構築
A. thalianaエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ｃｅｌ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１あるいは９のヌクレオチド５〜１６１８）のｃｅｌ１プロモーター領域のＤＮＡ断片をｐＵＣ１８（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)でクローニングした。手短に言えば、以下のプライマーを用いてＰＣＲ断片を作成し：プライマー＃５（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＡＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）およびプライマー＃１０（ＳａｌＩ）：５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＧＧＡＣＣＡＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化し、ｐＵＣ１８（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)のＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩクローニング部位にクローニングした。１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片を上の作成物から切りだし、ｇｕｓ遺伝子の５’末端で(Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)ニ成分ベクターｐＢＩ１０１（クロノテック、パロアルト、カリフォルニア）のＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩクローニング部位にサブクローニングし、ｐＰＣＧＵＳと命名した。
６．９．構築/ｃｅｌ１プロモーター−ｇｕｓ融合を発現している遺伝子導入植物
上述の作成物、すなわちｐＰＣＧＵＳは、三親交配により（An, 1987, Meth
Enzymol. 153:292-305)、安全化したＬＢ４４０４Agrobacterium
tumefaciensに移行させた。以前報告されたように(DeBlock et al., 1984, EMBO
J. 3:1681)、Nicotiana tabaccum-SR1で葉−花盤形質転換を行った。再生された遺伝子導入植物はカナマイシンで選抜した。作成物で別々に形質転換された８株から得たＦ１種子を機能的アッセイに用いた。
推定ｃｅｌ１プロモーター領域の存在についてサザンブロットにより植物を分析した。タバコにおけるＧＵＳ活性の基礎レベルに関する対照として、プロモーターのないｐＢＩ１０１で植物を形質転換した。遺伝子導入植物は２５℃の温室にて１６時間明期で生育した。
６．１０．遺伝子導入植物の組織学的ＧＵＳ染色
ＧＵＳの染色は以前記載されたように(Jefferson et al., 1987,
Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)Ｘ−Ｇｌｕｃを用いて行った。１０日令の苗をＸ−Ｇｌｕｃとともに３７℃にて一晩インキュベートしたのち、７０％エタノール溶液に入れた。写真を撮影する前に、植物を９０℃で９０％の乳酸中で２，３分インキュベートし、２時間かけて室温に冷ました。
６．１１．ｃｅｌ１プロモーター−ｃｅｌ１シグナル−ｃｂｄニ成分ベクター （ｐＣＣ１）の構築
ｃｅｌ１プロモーター領域を含み、ｃｅｌ１シグナルペプチドをコードしているＤＮＡ断片、すなわち、A. thalianaエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ｃｅｌ１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１あるいは９のヌクレオチド５〜１７７０）の一部をｐＵＣ１８（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)でクローニングした。手短に言えば、以下のプライマーを用いてＰＣＲ断片を作成し：プライマー＃５（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＡＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）およびプライマー＃６（ＳａｌＩ）：５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化し、ｐＵＣ１８（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)のＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩクローニング部位にクローニングした。
Clostridium cellulovorans（前記セルロース結合ドメイン、ここでは“ｃｂｄ”と呼ぶ）（特許第５，４９６，９３４号参照）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のヌクレオチド３〜４９４）のｃｂｐＡタンパク断片をコードしているヌクレオチド配列を含んでいるセルロース結合ドメインＤＮＡ断片は、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅により作成し：プライマー”７（ＳａｌＩ）５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）およびプライマー＃８（ＢａｍＨＩ）５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、それはＳａｌＩとＢａｍＨＩの制限部位を含んでいた。
ＳａｌＩとＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化に続いて、ｃｂｄをコードしているＤＮＡ断片を上述の変更したｐＵＣ１８ベクターのＳａｌＩとＢａｍＨＩ部位にクローニングし、インフレームでｃｅｌ１のシグナルペプチドと融合した。
ｃｂｄ遺伝子のＣ末端に対するプライマーは停止コドンを含んでいた。２つの断片間のＳａｌＩ部位はインフレームで２つのアミノ酸：バリンとアスパラギンを付加し、それらはｃｅｌ１シグナルペプチドとｃｂｄコード領域の間に存在していることになる。
ｃｅｌ１プロモーター領域、ｃｅｌ１シグナルペプチドおよび融合したｃｂｄがこの順番で含まれているＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで事前に消化したニ成分ベクターｐＢＩ１０１（クロノテック、パロアルト、カリフォルニア）でサブクローニングした。このベクターをｐＣＣ１と命名した。
６．１２．ＣａＭＶ３５Ｓ Ω プロモーター−ｃｅｌ１シグナル−ｃｂｄニ成分ベクター（ｐ３５ＳＣ１）の構築
ｃｅｌ１シグナル配列およびｃｂｄ配列に融合したＣａＭＶ３５Ｓ Ω プロモーターを含むベクターは以下のように構築した。ｃｅｌ１シグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド１〜１０５）をコードしているＤＮＡ断片をｐＵＣ１８（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)でクローニングした。手短に言えば、以下のプライマーを用いてｃｅｌ１のＰＣＲ断片を作成し：プライマー＃９（ＳｐｈＩ）５’−ＡＡＡＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＡＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）およびプライマー＃６（ＳａｌＩ）５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩとＳａｌＩで消化し、ｐＵＣ１８のＳｐｈＩとＳａｌＩのクローニング部位でクローニングした。ＳｐｈＩ制限部位の含有物は、開始部位後の最初のアミノ酸をアラニンからプロリンに置き換えていた。さらに、ｃｂｄ遺伝子のＣ末端に対するプライマーは、停止コドンを含んでいた。２つの断片間のＳａｌＩ部位はインフレームで２つのアミノ酸：バリンとアスパラギンを付加し、それはｃｅｌ１シグナルペプチドおよびｃｂｄコード領域の間に存在することになる。
ｃｂｄをコードしているＤＮＡ断片は（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のヌクレオチド３〜４９４）は、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって作成し：＃７（ＳａｌＩ）５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）および＃１０（ＥｃｏＲＩ）５’−ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、それはＳａｌＩとＥｃｏＲＩの制限部位を含んでいた。
ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化したのち、ｃｂｄをコードしているＤＮＡ断片は上記の変更したｐＵＣ１８ベクターのＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｃｅｌ１のシグナルペプチドとインフレームで融合した。
ｃｅｌ１シグナル−ｃｂｄ融合物を含むＤＮＡは、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩクローニング部位を用いてｐＣｄクローニングカセット（Broido et al., 1993, Physiologia Plantarum 88:259-266)にクローニングした。ｐＣｄカッセットは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(Guilley et al., 1982, Cell 30:763-773)およびタバコモザイクウイルスのコートタンパク遺伝子に由来するΩＤＮＡ配列（Gallie et al., 1987, Nucl. Acid Res. 15:3257-3273)の下流にポリリンカーを含んでいる。ＣａＭＶ３５ＳΩ ｃｅｌ１−シグナルペプチド−ｃｂｄおよびオクトピン ポリアデニル化部位を含んでいるＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＳａｃＩを用いて切り出し、ニ成分ベクターｐＢＩ１０１のＢａｍＨＩとＳａｃＩクローニング部位にサブクローニングした（クロノテック、パロアルト、カリフォルニア）。出来上がったベクターをｐ３５ＳＣ１と命名した。
６．１３．ｃｂｄ遺伝子導入植物の構築
ニ成分ベクター（ｐ３５ＳＣ１、ｐＣＣ１およびｐＢＩ１０１、対照として）は、安全化したＬＢ４４０４ Agrobacterium tumefaciensに三親交配によって移した(An,
1987, Meth Enzymol. 153:292-305)。以前記載されたように（DeBlock et
al., 1984, EMBO J. 3:1681)、葉−花盤形質転換はNicotiana
tabaccum-SR1で行った。再生された遺伝子導入植物はカナマイシンで選抜した。各ベクターで別々に形質転換した植物からＦ１種子を回収した。植物はサザンブロット（Sambrook et al., 1989, 分子クローニング：実験室マニュアル、Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York; Southern, 1975, J. Mol. Biol.
98:503-517)およびプライマー＃７と＃８（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８と１９）を用いたＰＣＲによって分析した。遺伝子導入植物は２５℃の温室にて１６時間の明期で生育した。
６．１４．ｃｂｄの転写に関する分析
ｃｂｄ導入遺伝子の転写物を定めるために、伸長している葉柄および若葉から抽出したＲＮＡを逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲキット）の鋳型として用いた（ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア）。プライマー＃７と＃８（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８と１９）を用いたＰＣＲ増幅には全ｃＤＮＡを用いた。
７．実施例：Arabidopsis thaliana ＥＧＡＳＥのＤＮＡプローブのクローニング
ＥＧＡＳＥ遺伝子、すなわちA. thalianaのｃｅｌ１を単離した。様々な植物から得た様々なＥＧａｓｅ遺伝子の間にはかなりの相同性がある（Lashbrook et al., 1994, Plant Cell 6:1485-1493; Tucker and Milligan,
1991 Plant Physiol. 95:928-933; Wu et al., 1996, Plant Physiol. 110:163-170)。アボガドとタバコのセルラーゼのアミノ酸配列に由来する２つの保存的領域に基づいて、同義性プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２と１３）を合成し(Lashbrook et al., 1994, Plant Cell 6:1485-1493; Tucker and
Milligan, 1991 Plant Physiol. 95:928-933)、A. thalianaのゲノムｃｅｌ１をクローニングするためのプローブとして働くような２６０ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。このようなプライマーは、緑豆でＥＧａｓｅ遺伝子をコードしているいくつかのＤＮＡ断片を単離するのに使われ、うまくいったことがある（Shoseyov, L., 1992, “切断緑豆の不定根形成におけるエンド−１，４−β−グルカナーゼ遺伝子の発現”修士論文、エルサレムのヘブライ大学）。
鋳型としての染色体ＤＮＡおよびアボガドとトマトのＥＧａｓｅにおける保存的アミノ酸配列に従って設計された２つの同義性プライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った(Lashbrook et al., 1994, The Plant Cell 6:1485-1493; Tucker and
Milligan, 1991 Plant Physiol. 95:928-933)。ＰＣＲ増幅によって約２６０ｂｐおよび３７０ｂｐの２つのＤＮＡ断片が得られた(図１）。単離された２６０ｂｐの断片はＭ１３ｍｐ１８でクローニングした。その後１本鎖ＤＮＡを配列分析に用いた。２６０ｂｐ断片の推定アミノ酸配列はアボガドＥＧａｓｅと６２％の相同性を示した。
８．実施例：ＥＧａｓｅゲノムクローンの単離と特性評価
A thalianaのｃｅｌ１ゲノム遺伝子とアボガドｃｅｌ１との比較によれば、アボガド遺伝子のエクソン２とエクソン３の間には大きなイントロンが介在している。このイントロンはA thalianaのｃｅｌ１にはない。A thaliana ｃｅｌ１のｃＤＮＡ遺伝子は５４−ｋＤａのタンパクをコードしていた。アボガドＥＧａｓｅとの配列の比較は５６％の配列が同一であることを示していた(図４）。さらに、タンパク間で、システイン残基の数と位置に高い保存性が見られたということは、立体構造が保存されていることを示唆している。A thalianaのｃｅｌ１とアボガドＥＧａｓｅ（Ｃｅｌ１）のカイト−ドリトル疎水性親水性指標分析を比べることによっても、このことは支持されている（図５）。ｃｅｌ１の推定アミノ酸配列はグリコシル化の可能性のある部位を１つ含んでいた。Ｃｅｌ１をＥファミリーのグリコシダーゼに分類する、１７個のアミノ酸モチーフも検出された
（グリコシダーゼについては一般にGilkes et al., 1991,
Microbiol. Rev. 55:303-315を参照されたい）。Ｎ末端における最初の２５個のアミノ酸は疎水性であり、典型的なシグナル−ペプチド配列で予想されるような、Ｎ末端間近に陽性に荷電したアルギニンが含まれていた（Von Heijne et al., 1983, Eur. J. Biochem. 133:17-21)。
ゲノムのｃｅｌ１遺伝子を単離するために、A thalianaのゲノムライブラリをスクリーニングした。２６０ｂｐのＰＣＲ断片（図１）をプローブとして用い、合計２．５ｘ１０５の組換えプラーク形成ユニットから１つの陽性クローンを単離した。陽性クローンをＳａｌＩで消化した後、サザンブロットを行ったところ、７．５ｋｂの断片であることが判った。ＳａｌＩ ＤＮＡ断片の制限地図を図２に示す。図２にさらに示すように、３つの別のサブクローンをｐＵＣ１８で構築した。ＥｘｏＩＩＩ欠失のあとの配列分析で完全長のｃｅｌ１遺伝子の１次ＤＮＡ配列が明らかにされた。図２に示すように、遺伝子は６つのイントロンで区切られた７つのエクソンからなっている。
９．実施例：ｃｅｌ１ ｃＤＮＡの単離と特性評価
伸長している組織におけるｃｅｌ１ ｍＲＮＡの存在を調べるために、および完全長のｃＤＮＡを単離するためにＲＴ−ＰＣＲを用いた。１．５−ｋｂのｃｅｌ１ ｃＤＮＡ断片(図３）をうまくクローニングし、配列を決定した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。ｃＤＮＡ配列はエクソン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド１６６６〜１８７５、１９５９〜２３６６、２７４７〜２３８６、２９３６〜３０９７、４３８３〜４４９３、４６６１〜４８２５および４９４１〜５２７０）を繋ぎ合わせたＤＮＡ配列に完全に一致していた。２６０−ｂｐＤＮＡプローブとｃｅｌ１ ｃＤＮＡとの間には配列の矛盾もいくつか認められた。この時点では、このような変化は別の遺伝子を示しているのか、単にＰＣＲによる変異なのかは決めなかった。１４７６塩基対のオープンリーディングフレーム（読み取り枠）（ヌクレオチド１〜１４７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２および３）は４９２個のアミノ酸のポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をコードし、その推定分子量は５４ｋＤａであることが判明した。アボガドＥＧａｓｅとの配列を比較すると５６％の同一性が見られた(図４）。A. thaliana Ｃｅｌ１とアボガドＥＧａｓｅ（Ｃｅｌ１）におけるカイト−ドリトル疎水性親水性指標分析（Kyte and Doolittle, 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132)の比較を図５に示す。
１０．実施例：Arabidopsisの様々な組織におけるｃｅｌ１ＲＮＡの転写レベル
７６８−ｂｐのｃｅｌ１ ｃＤＮＡ断片をプローブとしてｃｅｌ１のノーザンブロット分析を行った(図６）。正常なA. thalianaの開花している葉柄の基底節間部と同様に、完全に開いた葉ではＲＮＡ転写物は検出されなかった。しかしながら、正常植物の開花している葉柄の伸長層では強い転写シグナルが検出された。ユニコナゾールで処理したA. thalianaは矮性植物となった。矮性植物で開花している葉柄の伸長層におけるｃｅｌ１ ＲＮＡの転写レベルは、正常植物のそれよも有意に低かった（図６）。３つの別々に行ったノーザンブロットのデンシトメーター分析では、矮性植物に対する正常植物の転写レベルは２〜５倍異なっていることを示していた。
１１．実施例：遺伝子導入植物の組織学的ＧＵＳ染色分析
ｐＢＩ１０１ニ成分発現ベクター（クロノテック、パロアルト、カリフォルニア）に入れたｇｕｓリポーター遺伝子に融合した推定上のｃｅｌ１プロモーター領域（ヌクレオチド５〜１６１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で形質転換した遺伝子導入タバコについて、組織特異的な発現について調べた。８株の別々の遺伝子導入植物から作った１６本の苗で充分なＧＵＳ活性が認められた。苗条および根の伸長層は両方とも染色された（図７Ａ〜Ｃ）。 若葉も程度は低かったが染色された（データは示さず）。推定上のｃｅｌ１プロモーター領域を含まない同じ作成物を導入した対照遺伝子導入植物ではＧＵＳ染色は見られなかった。
１２．実施例：ｃｂｄ遺伝子導入タバコの構築
１５から２０の別々の遺伝子導入植物（Ｆ０ 親世代）をｐＣＣ１、ｐ３５ＳＣＩおよびｐＢＩ１０１の各ベクターから作成した。ｐＢＩ１０１はｃｂｄをコードしていないので陰性対照として働く。導入遺伝子の存在確認は、ＰＣＲ分析（たとえば図９を参照）、サザンブロット分析（示していない）およびカナマイシン耐性によって行った。結果はＦ０世代ではｐＣＣ１およびｐ３５ＳＣ１作成物に対してｃｂｄ作成物が１コピー存在すること、および対照植物ではｐＢＩ１０１が少なくとも２コピー存在することを示していた。ｐＣＣ１およびｐ３５ＳＣ１両遺伝子導入植物におけるｃｂｄの転写物はＲＴ−ＰＣＲによって確認した（たとえば図１０を参照）
ｐＣＣ１およびｐ３５ＳＣ１で形質転換したＦ１世代の遺伝子導入植物（後者は図１１Ｂに示す）は大きさに大きな変異を示した。図１１Ａに示すように、ｐＢＩ１０１で形質移入したＦ１対照植物は極めて適度な変異を示した。後の例ではカナマイシン感受性の植物が見られなかったということは、導入遺伝子の活性のあるコピーが複数存在し、各コピーは独立して分離していることを示している。
ｐＣＣＩあるいはｐ３５ＳＣ１の単一コピーで形質転換された親のＦ１形質移入植物は３つの異なった表現型に分離した。約４分の１の植物がカナマイシン感受性であるということは導入遺伝子が存在していないことを示している。別の４分の１の植物は小型の表現型を示し、半分は大型の表現型を示した。後者の２つに分離したものはさらに表現型の変異を示した。小型植物の中には発芽の初期の段階で曲がった胚軸を示すものがあった。大型植物の中では変異は普通の大きさ（カナマイシンの中で生育しているｐＢＩ１０１対照遺伝子導入植物に比べて）から巨大な大きさまでであった。まとめてみると、これらの結果は、カナマイシン感受性の植物は導入遺伝子を持たないホモ接合体であり、大型植物はヘテロ接合体であり、小型植物は導入遺伝子の活性のあるコピーを２つ含んでいることを示している。この結果は、高い濃度のｃｂｄタンパクは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで植物の生育を阻害し、適度な濃度では植物の生育を促進するという報告（ＰＣＴ出版物ＷＯ９４/２４１５８）に極めてよく相関している。カナマイシンなしで生育させると、ｐＣＣ１あるいはｐ３５ＳＣ１で形質転換させたＦ１遺伝子導入タバコは、大型と小型の表現型に分離した。このような生育条件下では、カナマイシン感受性植物は、大型表現型のヘテロ接合体正常サイズの集団とは区別することができなかった。このような結果は、ｃｂｄ遺伝子型は観察された表現型に対応している、すなわち、遺伝子導入植物におけるｃｂｄの発現は、その生育を調節しているということを確認していることになる。
表現型上区別できるグループ（大型および小型）間におけるサイズの差異は、成熟後も維持されていた（図１２）。
さらに、植物として増殖している遺伝子導入植物は植物としての発生の後期段階（図１４）と同様に幼若な間（図１３）もその表現型を維持していた。このような結果は、変更された生育表現型を示しているｃｂｄ遺伝子導入植物は、植物として増殖している場合でも、変更された表現型を維持していることを示している。
１３．実施例：ｃｂｄを発現している遺伝子導入植物の生物量生産
ｐ３５ＳＣ１のＦ１タバコ（３５Ｓプロモーターの下でｃｂｄを発現する）およびｐＢＩ１０１（クロノテック社、パロアルト、カリフォルニア）で形質転換した対照植物をプレート上で発芽させ、４週間生育した。ｃｂｄを発現している導入遺伝子によって生じた２つの特異的な表現型（大きな葉/正常の胚軸および小さな葉/長い胚軸）および対照植物の大きなおよび小さな苗を選択し、新しい培地に移して、さらに室内で３〜４週間生育して、それから３〜４週間温室に移した。植物の葉積、生重量および乾燥重量を測定した。結果は、対照植物に比べてｃｂｄ−遺伝子導入植物は有意に多くの生物量を生産することを示している(図１５）。ｐＣＣ１で形質転換したＦ１タバコ（ｃｅｌ１プロモータによって制御されるＣＢＤ発現）でも同様の結果が得られた（図１６）。
１４．実施例：ポプラ(Populus tremula)におけるｃｅｌ１プロモーターの発現
１４．１．材料と方法
１４．１．１．ｃｅｌ１プロモーター−ｇｕｓ融合を発現している遺伝子導入植物の構築
１．６ｋｂのｃｅｌ１プロモーター領域（受入番号＃９８５４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）のヌクレオチド５〜１６１８）をニ成分ベクターｐＢＩ１０１で、β−グルクロニダーゼｇｕｓ遺伝子の５’にクローニングした。作成物は三親交配で安全化したＥＨＡ１０１Agrobacterium tumefaciensに移した（An, 1987,
Meth. Enzymol. 153:292-305)。形質転換はPopulus tremulaの葉柄の外植で行った(Tzfira et al., 1997, Physiologia Plantarum 99:554-561)。再生した遺伝子導入植物はカナマイシンで選抜した。別々に作成物で形質転換した１１株の植物を調べた。植物はサザンブロット分析によってｃｅｌ１プロモーター領域の存在について分析した。遺伝子導入ポプラは成長用実験槽で２５℃にて１６時間の明期で生育させた。
１４．１．２．遺伝子導入植物の組織学的ＧＵＳ染色分析
ＧＵＳ染色は以前記載されたように(Jefferson et al., 1987,
EMBO J. 6:3901-3907)Ｘ−Ｇｌｕｃで行った。３０日令の苗をＸ−Ｇｌｕｃとともに３７℃にて一晩インキュベートし、写真撮影の前に７０％エタノール溶液に入れた。
１４．２．結果
図１７および１８に見られるように、ＧＵＳの染色は、若葉や葉柄の伸長層のような早く成長している組織にｃｅｌ１プロモーターが特異的に発現していることを示していた。図１９に示すように、青い染色パターンは、発育している葉における細胞の自然の生育パターンに相関していた。
このような結果は実施例１１および実施例１７と合わせて、ポプラやタバコ（上記実施例１１参照）やArabidopsis（下記実施例１７参照）のような様々な遺伝子導入植物の成長している器官において、ｃｅｌ１プロモーターはＧＵＳの組織特異的な発現を調節していることを示している。
１５．実施例：ポプラにおけるｃｂｄの発現
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｃｂｄを発現しているポプラは区別できる表現型を示した（図２０）。対照に比べて樹高が短く、葉が大きかった（図２１）。根は充分に厚く、対照よりも密度が高く、長い、多くの根毛で覆われていた（図２２〜２４）。カルコフロー染色によって、このような植物は多くの根毛の先端層でセルロースを蓄積していることが示されたということは、ｃｂｄはセルロースの合成率を高めていることを示している（図２５〜２８）。このような観察結果は、図３０で見られるようにｃｂｄはセルロースの合成率を促進するということを示したｉｎ ｖｉｔｒｏの実験と一致している。
１６．ｃｅｌ１を発現している遺伝子導入ポプラ
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｃｂｄを発現している別々の遺伝子導入ポプラ６株（１０株のうち）で異なった表現型が見られた(図２９）。このような植物は対照植物（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｇｕｓを含むベクターで形質転換した）に比べて大きく見えた。
１７．実施例：Arabidopsisにおけるｃｅｌ１の発現
ｃｅｌ１のｃＤＮＡは大腸菌の発現ベクターｐＥＴ３ｄ（ノバゲン、マジソン、ウィスコンシン）でクローニングした。ウサギでポリクローナル抗体を作成するために組換えタンパクを用いた。特異抗体は６５ｋＤのタンパクと反応した。このタンパクは、早く生育している器官にのみ検出され、古いあるいは完全に発育した組織には見られなかった（図３０）。
１８．実施例：Acetobacter xylinumにおけるセルロース合成に対するＣＢＤの影響
１８．１．はじめに
セルロースの微小繊維合成が細胞壁形成から分離できるので、グラム陰性細菌Acetobacter
xylinumは長い間、セルロース合成のモデルと見なされてきている(Ross et al., 1991,
Microbiological Reviews 55:35-58)。A. xylinumのセルロース合成では重合化と結晶化が連結した過程なので、結晶化を妨害することは重合化を進めることになる(Benziman et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6678-6682)。セルロース結合性の有機物質の中には、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞の生育やセルロース−微小繊維の会合を変更するものもある。たとえば、直接染料やカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および蛍光光沢剤（ＦＢＡ、たとえばカルコフローホワイトＳＴ）は、細胞表面からの突出直後、多糖類の鎖に結合して微小繊維と細胞壁の正常な会合を妨害する。このような分子は結晶化を妨げ、従って重合化を高める(Haigler, 1991, “微小繊維の生物発生における重合化と結晶化の関係”はセルロースの生合成と生体分解の中、pp99-124, Haigler and P. J. Weimer編、Marcel
Dekker Inc., New York)。
この実験はセルロース合成におけるｃｂｄ発現の影響を調べるために行った。
１８．２．材料と方法
Acetobacter xylinum株はＡＴＣＣ２３７６９を用いた。０．５％バクトペプトン、０．５％酵母抽出物、２％グルコースおよび０．３％Ｋ２ＨＰＯ４ ｐＨ ６、および１．５ユニット/ｍｌのTrichoderma virideセルラーゼ（Fluka, Buchs, スイス）からなる培地中で３０℃にて連続的に撹拌しながら、細胞を２４時間増殖させた。遠心分離によって細胞を回収し、事前に冷却しておいたリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ６）で２回洗浄した。乾燥重量２ｍｇ/ｍｌ（２．５ Ｏ．Ｄ６００＝１ｍｇ/ｍｌ）の濃度で細菌をリン酸緩衝液に再浮遊した。各反応混合物を１ｍｌずつ、０．８ｍｇの細胞/ｍｌリン酸緩衝液を含んだ２０ｍｌのシンチレーションバイアルに入れた。セルロース合成は、４０ｍＭのグルコース（比活性４０，０００ｃｐｍ/ｍｏｌのＤ−［Ｕ１４Ｃ」グルコース（アマシャム、イングランド））を加えることによって開始し、連続的に撹拌しながら３０℃にて１〜２時間合成を続けた。形成された１４ＣＯ２は、反応バイアルの中に置いた、０．２ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨを含む蓋のないエッペンドルフ管に回収した。細菌懸濁液に０．５ＭのＨＣｌを０．１ｍｌ加えることにより反応を停止し、１５分間インキュベートした。 回収した１４ＣＯ２を含むＮａＯＨ溶液を１５０μｌシンチレーション管に移した。細胞とセルロースは１．５ｍｌのエッペンドルフ管に移し、遠心して、水にて３回洗浄した。０．２ＮのＮａＯＨ、１％のＳＤＳとともに混合することにより細胞を溶解した。セルロースはＧＦ/Ａフィルター（ワットマン、Shrewbury, MA)上で回収し、１５ｍｌの水で洗浄して、６０℃のオーブンで乾燥した。フィルターおよび回収した１４ＣＯ２を含むＮａＯＨは、グルコースの取り込み（セルロースシンターゼ活性）と呼吸を測定するために、“ＯＰＴＩ−ＦＬＵＯＲ”（パッカード）シンチレーション液を用いてシンチレーションカウンターにて計測した。
室温で銅製のグリッドの上に然るべき溶液を１滴のせることによって電子顕微鏡観察を行った。セルロース合成反応は、３００μｇ/ｍｌの濃度のＣＢＤ存在下あるいは非存在下で、４０ｍＭのグルコース、乾燥重量０．５ｍｇ／ｍｌでリン酸緩衝液に入っている細胞を含んでいた。 反応は３０分インキュベートした後２．５％のグルタールジアルデヒド（メルク、ローウェー、ニュージャージー）を３０分間加えることによって停止し、水で３回洗浄して乾燥した。１．５％のリンタングステン酸にてグリッドを陰性染色し、８０ｋｖで操作するＪｅｏｌ １００ＣＸ電子顕微鏡にて調べた。
１８．３．結果
Acetobacter xylinumの休止状態の細胞は、放射性グルコースおよび様々な濃度のｃｂｄあるいはカルコフロー（陽性対照として）およびＢＳＡ（陰性対照として）を含むリン酸緩衝液中で１時間、あるいは示された時間、セルロース合成を行うことができた。セルロースシンターゼ活性は取り込まれたグルコースの量によって定めた。図３０は、１ｍＭのカルコフローおよび１００μｇ/ｍｌのＢＳＡ（１．５μＭ）と比較した、様々な濃度（１０〜５００μｇ/ｍｌ、０．６〜３０μＭ）におけるｃｂｄの影響を示している。ｃｂｄは、５００μｇ/ｍｌで濃度依存性にグルコースの取り込みを５倍まで高めた。カルコフローは２倍に高め、ＢＳＡは影響しなかった。グルコースのＣＯ２への酸化率はわずかに影響を受けただけだった。従ってグルコースの取り込みはセルロース合成によるもの
と考えられた。
A. xylinumによって作られたセルロースリボンの電子顕微鏡観察によれば、図３１に示されるように、対照における薄くて均一なリボンに比べて、ＣＢＤ処理によって個々の原繊維サブユニットで構成された、広がったリボンを生じていることが判った。
この実施例では、モデル系(Acetobacter xylinum)を用いて、蛍光光沢剤、カルコフローの効果に比べて、ｃｂｄはセルロースシンターゼ活性を高めることを示している。セルロースシンターゼ活性におけるｃｂｄの効果は、濃度依存性反応であり、至適反応はおよそ１０ｍｇ/ｍｌで得られた。
１８．４．考察
Acetobacter xylinum細菌におけるセルロース合成では重合化と結晶化が連結した反応であることは明らかである(Benziman et al., 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6678-6682)。培養液にｃｂｄを加えることによってA. xylinumにおける放射性グルコースの取り込みが高められた。何か特別なセルロース合成の作用機序に限定するつもりはないが、本発明者は、ｃｂｄが結晶化過程を妨害することにより放射性グルコースの取り込みを高めたと信じている。我々の仮説は、セルロースに結合する染料や蛍光光沢剤はｉｎ ｖｉｖｏにおいてセルロースの微小繊維の会合を変化させるということを示したHaiglerの概説（1991、“微小繊維の生物発生における重合化と結晶化の関係”はセルロースの生合成と生物分解の中pp.99-124, Haigler and Weimer 編、Marcel
Dekker, Inc., New York)に支持されている。紅藻(Waaland and Waaland,
1975, Planta 126:127-138)や根端(Hughes and McCully, 1975,
EMBO J. 6:3901-3907)を染料の存在下で生育させると、細胞の形状に変形が観察された。今では、このような分子は、原核細胞および真核細胞の細胞表面から突出直後にセルロース鎖に結合でき(Haigler and Brown, 1979, J. Cell Biol. 82, 70a;Benziman et al.,
1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6678-6682; Haigler et al., 1980, Science
210:903-906; Brown et al., 1982, Science 218:1141-1142)、結晶形成を妨害する（Haigler and Chanzy, 1988, J. Ultrastruct. Mol. Struct. Res.
98:299-311)のは明らかである。さらに、染料の存在下では重合化の速度は４倍に上昇することが示された(Benziman
et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6678-6682)。結晶化はこの連結反応のボトルネックであり、それを妨害することは重合化を促進するということが提案された。電子顕微鏡で観察されたように、ｃｂｄの効果はカルコフローの効果よりもむしろＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）の効果に、両方の場合でセルロースリボンが広がるという点で、匹敵する（Haigler、1991、“微小繊維の生物発生における重合化と結晶化の関係”はセルロースの生合成と生物分解の中pp.99-124, Haigler and Weimer 編、Marcel
Dekker, Inc., New York)。セルロースシンターゼ活性におけるｃｂｄの効果は、ＣＭＣよりも高く、カルコフローに匹敵するか、高いくらいである（図３１）。ｃｂｄ，ＣＭＣおよびカルコフローの効果が異なるのは、分子量やセルロースに対する親和性の差異によるものであると考えることができる。ＣＭＣ（９０ｋＤａ）は大きな原繊維サブユニットの正常な会合を妨害するにすぎず、従って結晶化を変えることはほとんどない。しかし、小さな分子であるカルコフローは開始直後のグルカン鎖会合を妨害する。ｃｂｄの大きさはカルコフローとＣＭＣの中間くらいである。一方でカルコフローで見られるような極めて小さな繊維の会合を妨げるほど小さくなく、他方で、セルロースへの親和性が高いのでセルロース挿入剤として充分に作用し、セルロース合成の速度を５倍まで高めている。
上に示した結果に基づけば、ｃｂｄを含むしかしそれには限定しないが、たとえばＣＢＤを発現しているアルファルファのような遺伝子導入植物は、生物量のレベルが高くなるだけではなく、反芻動物による分解を受け易いセルロースを持っているので、遺伝子導入をしていない普通の植物よりも高い栄養価を持っている。
１９．実施例：ｃｂｄを発現している遺伝子導入植物における植物細胞壁の変更と機械的な強さ
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｃｂｄを発現しているポプラと対照植物（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下で（ｃｂｄの代わりに）ｇｕｓを含むベクターで形質転換した）の葉柄をパラフィン包埋した。横断切片をＣｌＺｎＩで染色した（図３３Ａ〜Ｄ）．ｃｂｄを発現している植物の葉柄のほうが厚い細胞壁を持っていると思われた。 葉柄はその構造を維持するものとして物理的に強かったが、同じ切断過程では対照の葉柄は粉砕された。
根のカルコフロー染色によれば（図３４Ａ〜Ｂ）、ｃｂｄを発現している植物の根の細胞壁は厚く見えることが示された。根はその構造を維持するものとして物理的に強かったが、同じ切断過程では対照の根は粉砕された。
このような結果は、植物におけるｃｂｄの発現によって物理的および環境的な生物および無生物ストレスに耐えるような植物の能力を改善できることを示している。
２０．実施例：ｃｂｄを発現している植物における植物多糖類の変更
ｃｂｄを発現しているポプラの細胞が、対照植物にはほとんどないか全くないような黒っぽい顆粒を蓄積していることに気付いた。葉柄の細胞については図３３のＡおよびＣに対してＢとＤを、根の細胞については図３５Ｂに対してＡを参照されたい。ｃｂｄを発現しているポプラおよび対照植物（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｇｕｓを含むベクターで形質転換した）の葉柄を特異的にデンプンを染めるＩＫＩで染色した（図３６ＡおよびＢ）。ジャガイモの塊茎も陽性対照としてＩＫＩで染色した。結果は黒っぽい顆粒はデンプンであることを示していた。
ｃｂｄを発現している植物においてデンプンが蓄積するというメカニズムに対する可能性のある説明は、決して本発明に制限を加えるものではないが、植物細胞壁の生合成で運搬された糖および主な代謝産物としてサッカロースが提案されているということである。サッカロースシンターゼはサッカロースとＵＤＰを利用してＵＤＰ−グルコースとフルクトースを作る。ＵＤＰ−グルコースはセルロースシンターゼの基質として作用する。蓄積したフルクトースはいくつかの段階を経てデンプン利用物に変換される可能性がある。たとえば、フルクトキナーゼはフルクトース６リン酸を作り、グルコースリン酸イソメラーゼはグルコース６リン酸を作り、リン酸グルコムターゼはグルコース１リン酸を作り、ＡＤＰＧ−ピロホスフォリラーゼはＡＤＰ−グルコースを作り、それはデンプンシンターゼの基質となる。植物におけるｃｂｄの発現は一般的な多糖類の分布にも影響を与えるので、別の作物の栄養価にも影響を与える。
２１．実施例：生育への刺激
２つのプロモーター（ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとA. thalianaのｃｅｌ１プロモーター）を用いて、タバコにおけるｃｂｄの発現を調べた。どちらのプロモーターの下でもｃｂｄを発現している植物は、対照植物よりも早く生育し、有意に早く開花した（図３７）。植物におけるｃｂｄの発現は作物の収穫を早めると思われる。
２２．実施例：Ｃｅｌ１を発現している遺伝子導入植物は樹高および繊維の長さに影響を与える。
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｃｅｌ１を発現している遺伝子導入ポプラの個体をｉｎ ｖｉｔｒｏで微細繁殖させ、生育した。植物は対照植物（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｇｕｓを含むベクターで形質転換した）に比べて樹高が高くなった。ｃｅｌ１を発現している植物の節間部の平均長は対照よりも有意に高かった（図３８）。
ｃｅｌ１を発現している２つの遺伝子導入植物（Ｃｅｌ１．５およびＣｅｌ１．１８）における繊維細胞の平均長を野生型と比較した（図３９）。遺伝子導入植物の繊維細胞の長さは有意に高かった。
繊維細胞の長さはＣｅｌ１を発現している遺伝子導入植物の機械的な特性に影響を与える可能性がある。
２３．実施例：遺伝子導入ポプラのノーザンブロット解析
この実施例では対照植物および遺伝子導入植物から得たＲＮＡのノーザンブロット解析の結果を示し、ｃｂｄ遺伝子の発現を確認している（図４０、レーン１は対照の野生型を、レーン２は遺伝子導入植物を示している）。ノーザンブロットは実施例６および７に記載したように行った。
２４．実施例：熱抵抗性が改善された遺伝子導入植物
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｃｂｄを発現している遺伝子導入ポプラ；対照植物（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下で（ｃｂｄの代わりに）ｇｕｓと組合せたベクターで形質転換した）；および野生型植物を２５℃に維持され、環境的に制御された栽培室から温度が３２〜３８℃の範囲にある温室に移した。次の日健全なままの植物、衰弱したものあるいは枯れた植物の比率をスコア化した。表１に表したデータは、ｃｂｄ遺伝子導入植物は、野生型および対照植物に比べて熱に対する抵抗性が改善されていることを示している。
Figure 0004439567
２５．プラスミドの供託
以下のプラスミドは１９９８年１月１２日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ユニバシティ通り、マナッサス市、ＶＡに供託し、以下の受入番号を割り振られた：
プラスミド 受入番号
ｐＰＳ ２０９５７７
ｐＣＥＬ１ ２０９５７６
発明はその特別な実施例に関して詳細を説明しているけれども、機能的に同等であるような変異は本発明の範囲内にあることは理解されるであろう。実際、ここで示し、説明したものに加えて発明の様々な変更が、前述の説明および添付してある図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変更は添付した請求項の範囲内に収まることを意図している。
ここでは様々な出版物を引用し、公開されているものは全体を参考として取り入れる。
アガロースゲル上で展開したＰＣＲ産物を示す。レーンＡ：ＰＣＲ産物。２６０塩基対の断片を用いてさらに調べた。Ｍ：ラダーＤＮＡのサイズマーカーｘ１２３塩基対（ｂｐ）（ギブコＢＲＬ） Arabidopsis thaliana のｃｅｌ１ゲノム遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の模式図でそのＤＮＡ構造と制限部位を示している。ＥｃｏＲＩ−ＲＩ，ＥｃｏＲＶ−Ｒ， ＮｃｏＩ−Ｎ， ＳａＩＩ−Ｓ， ＳｐｈＩ−Ｓｐ， ＸｈｏＩ−Ｘ。翻訳領域は四角で囲んだ。エクソン−縞模様の四角、イントロン−白抜きの四角、５’および３’非翻訳領域−陰をつけた四角。マップの下の３つの線はＥｘｏＩＩＩ欠失のためのサブクローンを示している。数字はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９におけるヌクレオチドを表している。５’および３’非翻訳領域の範囲は決めなかったので、疑問符で示した。 完全長の逆転写したA．thaliana ｃｅｌ１のｃＤＮＡ（ヌクレオチド１−１４７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＰＣＲ増幅を示す。レーンＡ：ｃＤＮＡ断片。レーンＢ：対照、逆転写酵素で事前処理していない全ｍＲＮＡで行ったＰＣＲ。Ｍ：１ｋｂのラダーＤＮＡサイズマーカー（ギブコＢＲＬ） A． thaliana ｃｅｌ１（上、アミノ酸２〜４９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＮＯ：４）およびアボガドｃｅｌ１（下、アミノ酸５〜４９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）にコードされている推定アミノ酸配列の最適配置を示す。並べられたシステイン残基は下線で示した。グリコシル化の可能性のある部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を四角で囲んだ。グリコシル加水分解酵素モチーフは上と下に線を引いた。 アボガドのＥＧａｓｅ（Ｃｅｌ１、下）と比較したA． thaliana Ｃｅｌ１タンパク（上）のカイト−ドリトル疎水性親水性指標分析を示す。 ｃｅｌ１のノーザンブロット分析を示す。レーン１：完全に広がった葉；レーン２：開花している茎の基底節間部； レーン３：正常植物の開花している茎における伸長層；レーン４：矮性植物の開花している茎における伸長層（ユニコナゾール処理）。下のレーンは内部標準としてのｒＲＮＡを示す。 ｇｕｓリポーター遺伝子に結合したｃｅｌ１プロモーター領域（核酸５〜１６１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で形質転換した遺伝子導入タバコの組織学的グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）染色を示す。 図７Ａ：矢印は苗条および根における青く染まった伸長層を指している。図７Ｂ：拡大した苗条頂点。 図７Ｃ：拡大した根の先端。 ｃｅｌ１のA． thalianaプロモーター領域（ヌクレオチド１〜１７７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の核酸配列を示す。保存的プロモーターモチーフＴＡＴＡ、ＣＡＴ（ｘ２）およびＧＣ、および翻訳開始ＡＵＧコドンは下線で示す。 遺伝子導入植物のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。５００ｂｐのバンドはｃｂｄ導入遺伝子の存在を示している。レーン１およびレーン２：ｐ３５ＳＣ１．１およびｐ３５ＳＣ１．２遺伝子導入植物クローン。レーン３およびレーン４：ｐＣＣ１．２およびｐＣＣ１．２遺伝子導入植物クローン。レーン５およびレーン６：ｐＢＩ１１０.１およびｐＢＩ１１０.２遺伝子導入植物クローン。レーン７：非遺伝子導入植物。レーン８：陽性対照−ｐ３５ＳＣ１ＤＮＡ。Ｍ：１ｋｂのラダーＤＮＡサイズマーカー（ギブコＢＲＬ）。 遺伝子導入植物から得た逆転写したｃＤＮＡのＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）を（陰性的に）示す。５００ｂｐのバンドはｃｂｄ導入遺伝子の発現を示している。レーン１：陽性対照−ｐ３５ＳＣ１ＤＮＡ。レーン２：逆転写なしの陰性対照。レーン３：ｐＢＩ１１０.１遺伝子導入植物クローン。レーン４および５：ｐ３５ＳＣ１．１（小さい表現型）およびｐ３５ＳＣ１．２（大きい表現型）遺伝子導入植物クローン。Ｍ：１ｋｂのラダー（ギブコＢＲＬ） １４日目の発芽プレートの写真である。（Ａ）ｐＢＩ１０１遺伝子導入植物クローンを自家受粉することによって得たＦ１種子に由来したタバコ；および（Ｂ）Ｐ３５ＳＣ１遺伝子導入植物クローンを自家受粉することによって得たＦ１種子に由来したタバコ。 大型（左）と小型（右）表現型を示している８週令のＦ１ｐ３５ＳＣ１タバコの上からと横からの写真である。植物は発芽４週間後、発芽プレートから移した。 大型（Ａ）および小型（Ｂ）表現型のＦ１Ｐ３５ＳＣ１遺伝子導入植物クローンを植物として増殖させた４週間後の発芽プレートの写真である。 大型（右）および小型（左）表現型を示しているＦ１Ｐ３５ＳＣ１タバコを植物として増殖させた１０週令の上からと横からの写真である。 大型表現型（大きな葉／正常な胚軸）（図１５Ａ〜Ｃ）あるいは小型表現型（小さな葉／長い胚軸）（図１５Ｄ〜Ｆ）のどちらかを持っているプラスミド（ｐＢＩ１２１）で形質転換した対照植物と比較した、プラスミド（ｐ３５ＳＣ１）で形質転換した遺伝子導入タバコ草木の生物量生産の比較をグラフで示す。測定は生重量（図１５ＡとＤ）、乾燥重量（図１５ＢとＥ）および葉積（図１５ＣとＦ）で行った。 野生型タバコ（野生型）とプラスミドｐＣＣ１（ｐＣＣ１５．５）においてｃｅｌ１プロモーターの下でｃｂｄを発現している遺伝子導入タバコの生物量生産を比較してグラフで示す。重量（１６Ａ）および葉積（１６Ｂ）を測定した。 ポプラにおけるｃｅｌ１−ｇｕｓの発現を示す。 ポプラの苗条におけるｃｅｌ１−ｇｕｓの発現を示す。 形質転換したポプラの葉におけるｃｅｌ１プロモーター−ｇｕｓの発現を示す。 形質転換していない対照ポプラ（左）に比べて、 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラ（右）の構造的形態が変化していることを示す。 対照ポプラの葉（上）と比較した、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラの葉（下）を示す。 対照ポプラの根（左）と比較した、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラの根（右）を示す。 対照ポプラの根端の写真である（４０倍に拡大したもの）。 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラの根端の写真である（４０倍に拡大したもの）。 形質転換していない対照ポプラの根をカルコフロー染色した写真である（４００倍に拡大したもの）。 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラの根をカルコフロー染色した写真である（４００倍に拡大したもの）。 形質転換していない対照ポプラの根毛をカルコフロー染色した写真である（４００倍に拡大したもの）。 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラの根毛をカルコフロー染色した写真である（４００倍に拡大したもの）。 対照ポプラ（左）およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｅｌ１遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラ（右）の写真である。 ArabidopsisにおけるＣＥＬ１タンパクのウエスタンブロット分析の写真である。古い葉（ＯＬ）、若い葉（ＹＬ）、低い茎（ＬＳ）、中間の茎（ＭＳ）、上方の茎（ＵＳ）、古い実／さや（ＯＦ）、若い実／さや（ＹＦ）、花（ＦＬ）。 Acetobacter xylinumのグルコースの取り込み量（ｎｍ）を測定することによるセルロースシンターゼ活性におけるｃｂｄ濃度の影響を示すグラフである。対照（ＢＳＡ）およびカルコフローと比較した。ｃｂｄの濃度は、０，１０，１００および５００ｍｇ／ｍｌであった。縦棒は標準誤差を表す。 ｃｂｄを含まない対照（Ｂ）あるいはｃｂｄを含んだAcetobacterxylinumにより生産されたセルロースリボンの型におけるｃｂｄの影響に関する電子顕微鏡検査の写真である。 ポプラの茎に発現したｃｂｄ（ＢおよびＤ）の植物細胞壁の厚さに対する影響を対照ポプラ（ＡおよびＣ）と比較した光学顕微鏡写真である。 遺伝子導入ポプラの根（Ａ）におけるｃｂｄ発現の影響を対照ポプラの根（Ｂ）と比較してカルコフロー染色によって示した光学顕微鏡写真である。 根の細胞（Ａ）におけるｃｂｄ発現の影響を対照の根の細胞（Ｂ）と比較してＣｌＺｎＩ染色によって示した光学顕微鏡写真である。 ポプラの茎（Ａ）におけるｃｂｄ発現によるデンプン顆粒蓄積への影響を対照植物（Ｂ）と比較してＩＫＩ染色によって示した光学顕微鏡写真である。図３６Ｃは、比較のために提供したジャガイモの結節におけるデンプン顆粒をＩＫＩ染色して光学顕微鏡で調べた写真である。 ポプラの開花日について、対照ポプラと比較して、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターあるいはｃｅｌ１プロモーターの制御の下でｃｂｄ遺伝子発現の影響を示したグラフである。ＰＢＩ１０１（（クロノテック、パロアルト、カリフォルニア）は、組換え核酸のコード配列あるいは導入遺伝子の挿入がない、ニ成分ベクターのみである。 個別遺伝子導入植物のポプラの葉柄におけるｃｂｄを発現している節間部の平均長を野生型と比較して示したグラフである。 ｃｅｌ１を発現している植物（遺伝子導入株ｃｅｌ１．５およびｃｅｌ１．８）から得た繊維細胞の長さにおける影響を、野生型ポプラと比較して示した図である。 ｃｂｄ遺伝子発現のノーザンブロット分析を示す。レーン１：対照の野生型ポプラ；およびレーン２：ＣＢＤをコードしている核酸を発現している遺伝子導入ポプラ。
（配列リスト）
（１）一般情報
（ｉ）出願者
エルサレムのヘブライ大学、Ｙｉｓｓｕｍ研究開発会社
Ｓｈｏｓｅｙｏｖ、 Ｏｄｅｄ
Ｓｈａｎｉ、 Ｚｉｖ
Ｓｈｐｉｇｅｌ、Ｅｔａｉ
（ｉｉ）発明の名称 ：形態を変化させた遺伝子導入植物およびArabidopsis
thaliana（シロイヌナズナ）から単離したエンド１，４−β−グルカナーゼ遺伝子、プロモーターおよびタンパク
（ｉｉｉ）配列の数：２１
（ｉｖ）通信住所
（Ａ）受取り人：ドクター・マーク・フリードマン社
（Ｂ）通り：Ｈａｏｍａｎｉｍ通り７番地
（Ｃ）都市：テルアビブ
（Ｄ）国：イスラエル
（Ｅ）郵便番号：６７８９７
（ｖ）コンピューター読み出し形式
（Ａ）媒体タイプ：ディスケット
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ対応
（Ｃ）操作システム：ＣＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：ＦａｓｔＳＥＱバージョン２．０
（ｖｉ）現出願データ
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）提出日：
（Ｃ）分類
（ｖｉｉｉ）代理人/代理業者情報
（Ａ）氏名：フリードマン、マーク
（Ｂ）登録番号：
（Ｃ）参考/整理番号
（ｉｘ）通信情報
（Ａ）電話：９７２−３−５６２５５５３
（Ｂ）ファックス：９７２−３−５６２５５５４
（Ｃ）テレックス：
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（配列番号１）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１７７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：二本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１
Figure 0004439567
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（配列番号２）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１４７９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：二本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号２
Figure 0004439567
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（配列番号３）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１４７９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：二本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称/鍵：コード配列
（Ｂ）位置：１・・・１４７６
（Ｃ）そのほかの情報
（ｘｉ）配列の説明：配列番号３
Figure 0004439567
Figure 0004439567
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（配列番号４）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４９２個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：タンパク
（ｘｉ）配列の説明：配列番号４
Figure 0004439567
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（配列番号５）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４９９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：二本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号５
Figure 0004439567
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（配列番号６）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号６
ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣ ＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡ ＧＧＡＣＣＡＡＣ
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（配列番号７）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１６３個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の説明：配列番号７
Figure 0004439567
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（配列番号８）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４９４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の説明：配列番号８
Figure 0004439567
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（配列番号９）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：６０００塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：ニ本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号９
Figure 0004439567
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（配列番号１０）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１０
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｌａ
１ ５
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（配列番号１１）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ペプチド
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１１
Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ
１ ５
（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（配列番号１２）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１２
ＧＡＡＴＴＣＧＧＮＧ ＧＮＴＡＮＴＡＮＧＡ ＮＧＣ
（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（配列番号１３）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１３
ＧＡＡＴＴＣＣＡＴＮ ＴＣＮＴＣＮＧＧＮＣ ＧＮＴＣＣＡＮＣＡ
（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（配列番号１４）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１４
ＡＴＧＧＣＧＣＧＡＡ ＡＡＴＣＣＣＴＡＡＴ
（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（配列番号１５）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１５
ＴＣＡＴＣＧＣＣＡＡ ＧＴＡＧＡＡ
（１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（配列番号１６）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１６
ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴ ＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴ ＣＡＡＣＧＧ
（１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（配列番号１７）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１７
ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣ ＴＴＴＡＣＧＧＡＧＡ ＧＣＧＴＣＧＣ
（１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８（配列番号１８）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１８
ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣ ＡＴＧＧＣＡＧＣＧＡ ＣＡＴＣＡＴＣＡＡ
（２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（配列番号１９）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号１９
ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣ ＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴ ＧＴＡＣＣＡＡＧ
（２１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（配列番号２０）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号２０
ＡＡＡＡＧＣＡＴＧＣ ＣＧＣＧＡＡＡＡＴＣ ＣＣＴＡＡＴＴＴ
（２２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１（配列番号２１）に関する情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状：一本鎖
（Ｄ）位相：線形
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ
（ｘｉ）配列の説明：配列番号２１
ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣ ＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴ ＧＴＡＣＣＡＡＧ

Claims (19)

  1. 配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有し、エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む、単離した核酸分子。
  2. 前記配列は、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１記載の単離した核酸分子。
  3. 前記配列は配列番号２のヌクレオチド配列である、請求項１記載の単離した核酸分子。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換え核酸ベクター。
  5. 請求項４に記載の組換え核酸ベクターを含む宿主細胞。
  6. 配列番号９で表されるヌクレオチド配列を有する単離した核酸分子。
  7. 請求項１記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、単離したポリペプチド。
  8. 請求項２記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、単離したポリペプチド。
  9. 請求項３記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、単離したポリペプチド。
  10. 配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
  11. Arabidopsis thalianaのｃｅｌ１の機能的プロモーターを含み、前記ｃｅｌ１の機能的プロモーターは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の機能的断片からなる、単離した核酸分子。
  12. Arabidopsis thalianaのｃｅｌ１の分泌シグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列とタンパクまたはポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む組換え核酸ベクター。
  13. 第１のヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド１〜１０５である、請求項１２記載の組換え核酸ベクター。
  14. タンパクまたはポリペプチドは、細胞壁調節タンパクまたはポリペプチドである請求項１３に記載の組換え核酸ベクター。
  15. 細胞壁調節ポリペプチドは、エンド−１，４−β−グルカナーゼである請求項１４に記載の組換え核酸ベクター。
  16. 細胞壁調節タンパクまたはポリペプチドは、セルロース結合ドメインまたは細胞壁修飾酵素である請求項１４に記載の組換え核酸ベクター。
  17. 細胞壁調節タンパクまたはポリペプチドは、セルロース結合ドメインを含む請求項１４に記載の組換え核酸ベクター。
  18. セルロース結合ドメインは、細菌、真菌または粘菌から入手できる請求項１７に記載の組換え核酸ベクター。
  19. 細胞壁調節タンパクまたはポリペプチドは、Clostridium cellulovorans ｃｂｐＡ遺伝子、Clostridium thermocellum ｃｉｐＡ遺伝子あるいはCellulomonas fimi セルラーゼ遺伝子によってコードされるタンパクまたはポリペプチドからなる群より選択される請求項１４に記載の組換え核酸ベクター。

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