JP4430234B2 - Method for producing water-soluble crosslinked product - Google Patents

Abstract

The preparation of a new water-soluble cross-linked conjugates and cross-linked conjugate complexes improves the detection ability of immunochemical assays, including lateral flow devices, and relies on a "salting-out" process in which a reversible precipitate is formed at lyotropic salt concentrations greater than 1 M and coincides with a cross-linking of the backbone of the water-soluble intermediate conjugate. The backbone which consists of polysaccharides, including dextrans, is linked to a signal component, such as a dye, that produces a colour, via a bifunctional linker component, such as epichlorohydrin or divinyl sulfone, and optionally through a protein spacer component such as ovalbumin (OA) or bovine serum albumin (BSA). The cross-linking of the dextrans occurs via the linker component, during the "salting-out" process to give, in the presence of suitable targets such as antibodies or antigens, water-soluble cross-linked conjugates and cross-linked conjugate complexes. <IMAGE>

Description

（ここで、R₁は水素又はC_1-4 アルキルであり、nは1-4の範囲の整数、すなわち、1,2,3又は4であり，そしてXは脱離基、例えばトシル、メシル、又はハロゲン例えばフッ素、塩素、臭素又は沃素など、好ましくは塩素、である）
で表わされるエポキシドである。
本明細書で、用語"C_1-4 アルキル"は、1乃至4個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐した飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、n−プロピル、n−ブチル、イソプロピル、イソブチル等である。
【００２６】
ここで提供される実施例から明らかとなるように、非常に有望なエポキシドから誘導された架橋成分は、エピクロロヒドリン(EPCH)、すなわち、上の一般式1で、R₁が水素であり、nが1であり，そして脱離基が塩素である化合物である。
好ましくは、架橋成分は水性環境で安定であるべきであり、したがって、架橋成分EPCHが、架橋成分DVSと共に、現在のところ本発明の方法に用いるのに最も好ましい架橋成分である。
【００２７】
第一のステップ、すなわち、水溶性の中間前駆物質が形成されるステップI)、は、pHが7より高い、例えば8.5を超える、特に9より高い、例えば10を超える、例えばpHがほぼ10，10.5，11，又は11.5，の水溶液中で好適に実行される。最も一般的な形として、反応は0〜60℃の範囲の温度で行うことができるが、例えばここで与えられる実施例において、デキストランなどのキャリアー成分の場合に示されるように、20〜25℃という範囲の温度が多くの場合に極めて適切である。本発明のある好ましい実施形態では、反応が行われるpHは、一般に約10〜11.5の範囲内にある。これは、たいていのタイプのキャリアー成分の反応性官能基が、今好ましいとされた架橋成分DVS及びEPCHに対して反応するようになるpH範囲である。
【００２８】
水溶液中のキャリアー成分の濃度に関していうと、それは一般に0.1〜20％w/v の範囲にあり、しばしば0.5〜10％w/v の範囲に、例えば0.5〜5％w/v の範囲に、特に0.5〜2％w/v の範囲にあり、例えば約0.5％w/v、約1％w/v、約1.5％w/v、又は約2％w/v、である。水溶液中の架橋成分の濃度は、実際に用いる架橋成分によるが、一般に0.1〜35％v/vの範囲にある。今好ましいとしている架橋成分、すなわち、DVS及びEPCH、の水溶液中の濃度は、普通、DVSの場合、0.1〜15％v/v の範囲にあり、しばしば1〜10％v/v の範囲にある。EPCHの場合、濃度は普通、1〜30％v/v の範囲にあり、しばしば3〜20％v/v の範囲にある。架橋成分の調製のための反応剤が固体である場合、濃度は一般に0.1〜10％w/v の範囲になると考えられる。
【００２９】
水溶液中での架橋成分とキャリアー成分との反応をどれだけの時間そのまま進行させるべきかに関する一般的な指針はない。何故なら、それは、例えば反応が起こる温度やpHによって、反応混合物中のキャリアー成分の濃度及び架橋成分の濃度によって、キャリアー成分の性質及び／又は分子量及び架橋成分の性質によって、及び例えばゲル化又は沈澱が起こる危険が生ずるまでにキャリアーの架橋が（例えばDVSとの反応によって）どの程度進行するかによって、かなり異なるからである。
【００３０】
しかし、問題の反応時間は普通5分から10時間までの範囲にあるだろう。ここで提供される実施例から明らかとなるように、DVSを架橋成分として用いた場合に必要になる反応時間は、普通5乃至120分の範囲にあり、例えば15乃至60分の範囲 、例えば約30分、であるのに対して、EPCHによるキャリアー成分の活性化には、一般にもっと長い反応時間が必要で、普通1乃至10時間の範囲にあり、例えば3乃至7時間の範囲で、例えば約5時間、である。
【００３１】
すでに述べたように、水溶性中間前駆物質のキャリアー成分は、二官能基架橋成分から誘導された一つ以上部分がそれに共有結合で付着しており、それら部分の各々は二官能基を持つ架橋成分の二つの官能基の一つとキャリアー成分の反応性官能基との間に形成される共有結合によって付着している。了解されるように、二官能基を持つ架橋成分の残りの官能基は自由になり（"ぶらさがり"）、したがって、例えば一次標的化成分、スペーサー成分及び／又はシグナル成分、と適当な条件の下で反応することができる（以下を見よ）。
【００３２】
"負荷"(road)、すなわち、[ステップI)でキャリアー成分に付着した架橋基の数は普通、キャリアー成分1グラムあたり約1乃至約5,000マイクロモル（μmoles）の架橋成分という範囲にあり、例えば次のサブレンジのいずれかにある（キャリアー成分1グラムあたりの、架橋成分のμmolesで表して）：約1乃至約50；約50乃至約300；約300乃至約1,000；又は約1,000乃至約5,000。キャリアー成分に付着した架橋基(linking group)の数は、それ自体は例えばPorath et al. (1975) J. Chromatogr. 103, 49, に記述されているチオ硫酸滴定法などによって知られる滴定法で決定することができる。
【００３３】
ここで提供される実施例で明らかなように、架橋基(linker)の"負荷"は、普通、キャリアー1グラムあたりの架橋基のマイクロモル数（μmoles）で表して、ほぼ300から2,000超までにわたる。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、キャリアー成分1グラムあたりの架橋基のマイクロモル数（μmoles）で約1乃至約5,000μmolesというこの範囲は、特に200乃至3000、好ましくは500乃至2500、とすべきである。
【００３４】
所望により行われる精製ステップ（ステップII）は、例えば、透析などのプロセス（過剰な反応剤又は他の低分子量の分子種を除去するため）又はこの目的に適した、例えばゲル濾過などの何らかのクロマトグラフィー法を用いることができる。しかし、上記の精製方法は単に例としてあげただけであり、熟練した技術者であれば、個々の場合について、結合ステップで用いられる実際の条件、および結合ステップで用いられる実際の成分ならびに生産現場で利用できる設備に応じて最も適当な精製方法を選択することができるであろう。
【００３５】
本発明の方法で用いるのに適したキャリアー成分（それが、上で説明したように、結合体の"バックボーン"を構成する）は、最初は架橋していないもので、本発明の応用分野に関わりがあるpH値で本質的にゼロ電荷であることが好ましい。
【００３６】
結合の性質からして、本発明の方法で用いられる化学、すなわち、DVSやEPCHなどの二官能度分子から誘導された共有結合で結合された反応性部分をキャリアー成分上に確立するためには、一般に、キャリアー成分に反応性の官能基が、好ましくは求核性の官能基が、存在することが必要であろう。したがって、適当なキャリアー成分は、例えば、次のような官能基をもつポリマー・キャリアー成分となる：
【００３７】
−O^-（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のチロシン残基の脱プロトン化された芳香族ヒドロキシ基などの脱プロトン化フェノール・ヒドロキシ基）、−S^-（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のシステイン残基の脱プロトン化されたチオール基などの芳香族環の脱プロトン化チオール基又は脂肪族基）、−OH（例えば、グルコース又はその他のオリゴ糖又は多糖の単糖環など、糖リングの脂肪族ヒドロキシ基；又は、ポリビニルアルコールなど、ポリオルのアルコール・ヒドロキシ基；又は、セリン又はスレオノン残基など、ポリペプチド又はタンパク質のいくつかのアミノ酸残基のヒドロキシ基）、−SH（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のシステイン残基のチオール基）、一次アミノ基（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のリジン又はオルニチン残基；又は、キトサンなど、いくつかの多糖又はその誘導体のアミノ置換糖環）、又は二級アミノ基（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のヒスチジン残基における）。
【００３８】
上記の官能基がプロトン化された状態にあるか、脱プロトン化された状態にあるかという問題は、もちろん、反応混合物のpHなどの選択された反応条件に依存するということは熟練した技術者には理解されるであろう。
同様な理由により、本発明の中での標的化成分及びスペーサー成分（後記を参照のこと）における問題の官能基も、また、通常は求核性官能基、例えば上述のタイプのいずれかの求核性官能基、になる。
【００３９】
第二の水溶性中間前駆物質
本発明の方法のステップIII i)で、スペーサー成分が、架橋成分との反応によって、水溶性中間前駆物質に共有結合し第二の水溶性中間前駆物質を形成する。
上述のように、"スペーサー成分"は、架橋基を介して、キャリアー成分に共有結合で付着する。すなわち、本発明で用いる用語"スペーサー成分"は、染料などのシグナル成分の共有結合に利用できる複数の部位を有するタンパク質又はポリペプチドを意味することを意図している（後記を参照のこと）。
【００４０】
スペーサー成分を取り入れた一つの目的は、特にシグナル成分の付着に利用できる複数の部位を有するスペーサー成分の場合、この方法が、結合体に付着させることができるシグナル成分の数(すなわち、水溶性中間結合体におけるシグナル成分の"負荷"、前記を参照のこと）を増やし、いろいろな分析、例えば、ここで記述される免疫化学分析及び横流れ装置、に用いるときのこの結合体の感度を高める適切な手段になるということである（後記を参照のこと）。シグナル成分（例えば、染料分子）の結合が直接架橋成分と（スペーサー成分によってではなく）行われる実施形態では、（少なくとも原理的には）結合体に存在する架橋成分の一分子あたりシグナル分子は一つしか付着しないことになるということは理解されるであろう。
【００４１】
第二の水溶性前駆物質を調製したいくつかの実施形態で、スタートにおけるデキストラン1モルあたりのスペーサーのモル数は（スペーサーの"負荷"は）、1乃至500の範囲、特に2乃至100、最も多くの場合5乃至75、の範囲、にある。また、この明細書の実施例3Aで詳しく説明するように、第二の水溶性中間物質（したがって、ステップIII i)で行われる反応の効率）は、例えば、キャリアー成分1モルあたり付着するスペーサー成分の（モル）数によって表現することができる。
【００４２】
前に述べたように、水溶性中間物質の架橋成分の反応性部分のうちほんの一部だけがスペーサー成分と反応する。スペーサー成分及び架橋成分によるが、スペーサー成分との反応の後、架橋成分の未反応の反応性部分の1〜99％、好ましくは20〜99％、特に30〜99％、例えば40〜99％、特に50〜99％、が反応しないままで残される。これはすなわち、ある実施例で、ある条件の下では、未反応の架橋分子の1〜49％がスペーサー成分と反応したと言うことである。
【００４３】
好ましくは、スペーサー成分は、BSA、オバルブミン、グロブリン、等のタンパク質、又はホモポリペプチドなどのポリペプチド、例えばポリリジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、である。しかし、スペーサー成分の選択は、用いられるシグナル成分（例えば、ある特定の結合体で用いられる実際の染料）ならびに用いられる架橋成分に依存することは、当業者には明らかであろう。
【００４４】
スペーサー成分、例えばタンパク質、の分子量は、好ましくは少なくとも10,000Da、であり、好ましくは10,000〜2,000,000の範囲,例えば20,000〜500,000の範囲、にある。導入されるスペーサー成分の特徴の一つは、シグナル成分の導入のために利用できる位置の数を増やすことにあるので、シグナル成分の付着のために利用できる官能基の数がスペーサー成分の1分子あたり少なくとも5個、好ましくは10〜1,000、特に10〜500,であることが好ましい。
【００４５】
あるいはまた、スペーサー成分は多糖又はポリ核酸であっても良い。水溶性中間結合体の調製の前にこれらのポリマーを化学的に変性することが必要になることがある。
【００４６】
前に述べたように、スペーサー成分の結合化学の性質からして（第二の水溶性中間前駆物質の形成においては架橋成分との結合、又はあとでの水溶性中間結合体の形成ではシグナル成分との結合、後記を参照のこと）、反応性の官能基、例えば求核性の官能基、がスペーサー成分に存在する。したがって、適当なスペーサー成分は、例えば、次のような求核性の官能基を有するものになる：
【００４７】
−O^-（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のチロシン残基の脱プロトン化された芳香族ヒドロキシ基など、脱プロトン化フェノール・ヒドロキシ基）、−S^-（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のシステイン残基の脱プロトン化されたチオール基など、芳香族環の脱プロトン化チオール基又は脂肪族基）、−OH（例えば、セリン又はスレオノン残基など、ポリペプチド又はタンパク質のいくつかのアミノ酸残基に存在する脂肪族ヒドロキシ基）、−SH（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のシステイン残基のチオール基）、一次アミノ基（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のリジン又はオルニチン残基）、又は二級アミノ基（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のヒスチジン残基における）。
【００４８】
上記の官能基がプロトン化された状態にあるか、脱プロトン化された状態にあるかという問題は、もちろん、反応混合物のpHなどの選択された反応条件に依存するということは熟練した技術者には理解されるであろう。
【００４９】
本発明の方法のステップIII i)では、第二の水溶性中間前駆物質が形成されるが、このステップはpHが7より高い水溶液、例えば8を超える、特に9より高い、例えば10を超える、例えば10〜11までの、例えば10〜10.5までの、区間のpHで、好適に実行される。普通、この反応は0〜60℃の範囲の温度で行えば極めて十分であるが、最適温度は、とりわけ、実際に用いるpHに依存する。たいていの場合、特に反応が9よりも高いpHで行われる場合、そして特に反応が10よりも高いpHで行われる場合には、20〜40℃の範囲の温度、例えば30℃程度の温度、がしばしば極めて好適である。
【００５０】
反応時間に関しては、いくつかのパラメータが必要な反応時間に影響を及ぼすということを理解しておくべきである。すなわち、用いるpH、反応温度、ペプチド又はポリペプチドのスペーサー成分の濃度及び水溶性中間前駆物質の濃度、などに依存して反応時間は広い限界の中で変わる。しかし、適当な反応時間は、一般に1時間乃至48時間の範囲にあると考えられ、ここに提供される実施例から理解されるように、実施例3A及び3Bで開示される特定の反応条件の組を用いると、10〜30時間の範囲の反応時間、例えば15〜25時間の範囲にある、例えば約18時間という、反応時間が極めて適切である。
【００５１】
前に述べたように、水溶性中間物質の架橋成分の未反応の反応性部分のうち、ほんの一部だけしかスペーサー成分と反応しない。ということは、第二の水溶性中間物質はまだ相当な量の未反応の反応性部分を持っているということである。得られた第二の水溶性中間前駆物質は、精製ステップII)に関連して、すなわち、水溶性中間前駆物質の精製に関連して、すでに述べた方法によって精製することができる。ここで提供される実施例から明らかになるように、得られた第二の水溶性中間前駆物質を精製するのに適当な方法はゲル濾過である。
【００５２】
水溶性中間結合体の形成
ステップIII iii)において、シグナル成分が、スペーサー成分との反応によって、第二の水溶性中間前駆物質に共有結合で付着して、水溶性中間結合体を形成する。
ここで用いる場合、"シグナル成分"という用語は、直接物理的に検出できる成分、又は直接物理的に検出できる成分の前駆物質である成分、をカバーするように意図している。
【００５３】
言い換えると、シグナル成分は、当業者には公知の何らかの物理的方法によって、例えば分光測光、蛍光、ルミネッセンス、燐光、その他の方法、例えば、"Instrumental Method of Chemical Analysis （化学分析の計測方法）", G. W. Ewing, 5th Ed., McGraw-Hill Book Company, New York, 1988, に記述されているような方法、などの光学的方法という手段によって、容易に測定できるラベル又はマーカーとして機能しなければならない。あるいはまた、シグナル成分は−上で述べたように−このような物理的に検出できる成分の前駆物質であっても良い。このような前駆物質の典型的な例は、適当な基体への作用によって分子種を、好ましくは色があって、それを一つ以上の上記の物理的方法で検出できる分子種を、発生することができる酵素である。
【００５４】
上述の議論に照らしてみれば、シグナル成分は次のような物質から選ぶことができるということは熟練した技術者には明らかであろう、すなわち、染料；蛍光、ルミネッセント、燐光及びその他の発光物質；金属キレート物質、例えばイミノ二酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、及びデスフェリオキサミンB；放射性同位元素で標識された物質；重原子で標識された物質；及びそれらの混合物。
【００５５】
さらにいくつかの例をあげると、蛍光物質は、例えば、フルオレセイン（適当な形はフルオレセイン・イソチオシアネート、FITC）、フルオレセインアミン、1−ナフトール、2−ナフトール、エオシン、エリスロシン、モリン、O−フェニレンジアミン、ロダミン及び8−アニリノ−1−ナフタリン・スルホン酸、から選ぶことができる。関連ある放射性同位元素は、例えば、水素の同位元素（すなわち、トリチウム、³H）、炭素（¹⁴Cなど）、リン（³²P）、イオウ（³⁵S）、ヨウ素（¹³¹I）、ビスマス（²¹²Bi）、イットリウム（⁹⁰Y）、テクネチウム（^99mTc）、パラジウム（¹⁰⁹Pd）、及びサマリウム（¹⁵³Sm）、から選ぶことができる。関連ある重い原子は、例えば、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、In、Ag、Au、Hg、I、Bi、Y、La、Ce、Eu、及びGd。金（Au）は、多くの場合に特に有用な重い原子である。
【００５６】
特に興味あると考えられるシグナル成分は、染料である。この明細書では、"染料"という用語は分光測光的に検出できる染料分子又はその誘導体を意味するように意図している。本発明の方法によって調製される結合体に取り入れるのに好ましい染料は、可視染料、燐光染料、蛍光染料、レーザー染料、赤外染料、及びランタニド・キレート、から導出される。
【００５７】
特に興味ある染料は、可視染料で、可溶可視染料を含み、溶剤染料、色素、バット染料、イオウ染料、媒染染料、ロイコバット染料、及びフルオレセイン、ロダミン及びそれらの誘導体（スルホロダミン、ロダミン−ハイドライド及びロダミン−ヒドラジッド）などの分子、ならびにオキサジン染料、シアニン染料、及びアゾル染料、などである。適当な染料の具体的な例としては、例えば、テキサスレッドヒドラジン、コンゴーレッド、トリパンブルー、レマゾールブラック、レマゾールブリリアントレッド、ロダミンBイソチオシアネート、Cy5-Osuモノファンクショナル・リアクティブ染料、リアクティブ・オレンジ16，ユニブルーA、等がある。
【００５８】
上記の染料は、本発明の目的でシグナル成分として有用なものであるが、全て当業者には周知のものであり、熟練した技術者には他の染料も本発明の目的でシグナル成分として使用できるということは明らかであろう。シグナル成分として用いられる染料のその他の例は、例えば、"Dyeing and Chemical Technology of Textile Fibers（繊維の染色および化学技術）", Trotman, 34th Ed., C. Griffin & Co., London 及び "The Chemistry of Synthetic Dye（合成染料の化学）", Vankataramon (Ed.), Academic Press, New York, 1979, であげられているような染料であり、この内容は参照することによってこの明細書に取り入れられる。
【００５９】
好ましくは、シグナル成分は、BSAなどのタンパク質と反応することができるものであり、及び／又は、以下で記述される他の実施形態では、架橋成分の未反応の反応性部分と反応できるものでなければならない。）さらに、シグナル成分は、スペーサー成分と反応又は結合したとき、得られた水溶性の中間結合体に望ましくない性質を付与しないことが好ましい、すなわち、シグナル成分は、制御できない非特異的結合を強めたり、結合体に結合した標的化成分（例えば、抗体）の活性を阻害したりしないことが好ましい。さらに、シグナル成分は、結合体の水への溶解度を著しく減少させないことが好ましい。
【００６０】
出発スタートのデキストランのサイズ、用いるシグナル成分のタイプ、そして特にスペーサーの"負荷"に依存して、シグナル成分の"負荷"は明らかに変化する。前に述べたように、各スペーサーは、いくつかのシグナル成分を収容することができる。好ましい実施形態では、スペーサー成分あたりのシグナル成分の数は、各成分のモルで表して、1〜100にわたっている。特に興味深いのは、このモル比が2〜80、特に2〜75までの範囲にある実施形態である。
【００６１】
前に述べたように、第二の水溶性中間物質の架橋成分のうち、水溶性の中間結合体を形成する際にシグナル成分と反応するのはほんの小さな一部だけである。シグナル成分、スペーサー成分に、そして架橋成分に依存して、シグナル成分と反応した後、第二の水溶性中間前駆物質にある未反応の反応性架橋成分の量と比較して、架橋成分の未反応の反応性部分の50乃至100％、好ましくは60〜100％、特に70〜100％、例えば80〜100％の範囲の、特に90〜100％、が反応しないまま残される（注意、第二の水溶性中間前駆物質に比較してである）。
【００６２】
個々の染料に依存して、本発明の方法によって調製された結合体は、可視範囲、UV範囲、あるいは近赤外範囲で、好ましくは可視範囲で、光子を吸収又は放出する。ロダミンなどの可視染料を使用すると、本発明の結合体は可視領域（例えば、ブルー）で光子を吸収するようになり、補色（例えば、赤）の波長の光を観測者へ透過させる。あるいはまた、蛍光染料を使用すると、本発明の結合体は、（照射されたとき）電子が基底状態に戻ることによって特定波長の光子を放出するようになる。
【００６３】
本発明の方法のステップIII iii)では水溶性の中間結合体が形成されるが、これはpHが7より高い水溶液中で、例えば8より高い、特に約8から約11までの範囲、例えば約8.5〜10.5の範囲、のpHの水溶液中で好適に実行される。実際に用いるシグナル成分によるが、水性の反応混合物は、0〜60％v/vの有機捕溶剤(cosolvent)を含むことがある。
【００６４】
すなわち、どちらかというと疎水性のシグナル成分（例えば、ある種の染料分子）を溶解させるために、いろいろな量の水と混合可能な有機捕溶剤、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)、エタノール、ジメチルホルムアミド(DMF)等、を水性の反応混合物に加えることが、用いたシグナル成分の十分な溶解を確保するために必要になることがある。すでに結合しているスペーサー成分（それは普通、ポリペプチド又はタンパク質である）の変性を回避するために、反応混合物中のこの有機捕溶剤の濃度はできるだけ低いことが好ましい。
【００６５】
水溶性中間前駆物質の形成及び第二の水溶性中間前駆物質の形成に関するステップに関連して上述したと同様に、このステップにおいても、0〜60℃の範囲の温度、例えば20〜40℃の範囲の、例えば約30℃などの温度、で反応を行えば十分である。
【００６６】
ここで提供される実施例から明らかになるように、反応時間は広い限界内で変わる。すなわち、反応時間は、例えばキャリアー成分へのスペーサー成分の"負荷"、ならびに通常の反応パラメータ、例えばpH、温度、及び反応物の性質や濃度、に依存する。しかし、一般に、反応時間は、1〜48時間の範囲にある。好ましくは、反応時間はできるだけ短い方が良い、すなわち、1〜24時間の範囲に、特に1〜12時間の範囲に、例えば1〜5時間の範囲に、あるようにする。
【００６７】
上述したと同様な仕方で、得られた中間結合体は、熟練技術者には公知のいろいろな異なる方法によって精製することができる。さらに、得られた中間結合体は、例えば、凍結乾燥又は溶剤の蒸発などの手段によって、固体の形で単離することができる。後者の場合、蒸発は、普通、減圧下で、例えば、（真空）乾燥器によって、行われる。
【００６８】
得られた中間結合体は、いろいろな仕方で特性を表すことができる。例えば、用いたシグナル成分が可視染料である場合、その吸収率を読み取って、中間結合体を（したがって、結合ステップIII iii)の効率を）、例えば、この明細書の実施例4Aで記述されているように、スペーサー成分1mgあたり中間結合体に存在する吸光単位(EU)の数で表すことが出きる。もちろん、熟練技術者なら、得られた中間結合体の特性を他のいくつかの仕方で表すことができるであろう。
【００６９】
これまで述べてきた本発明の方法では、スペーサー成分がキャリアー成分に架橋成分を介して結合され、その後でシグナル成分がスペーサー成分に付着されるということに注意すべきである。したがって、シグナル成分（染料など）がスペーサー成分に結合されるときには、スペーサー成分はすでにキャリアー成分に（架橋成分を介して）付着している。
【００７０】
水溶性中間結合体の形成に代わる仕方
前に述べたように、そしてこの明細書で示される実施例からも理解されるように、新合成分が共有結合で架橋成分に付着し、架橋成分がさらにキャリアー成分に付着する、すなわち、タンパク質やポリペプチドのスペーサー成分が結合体に組み込まれないという方法も、水溶性架橋結合体の調製に適する（後者を参照のこと）。
【００７１】
このような場合、もちろん、シグナル成分は、上記のシグナル成分の他に、フェリチン、フィコエリトリン、フィコシアニン、及びフィコビリンなどのタンパク質；ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、及びウレアーゼ、などの酵素；及びそれらの混合物、などの物質からも選択することができる。
【００７２】
当業者には明らかなように、シグナル成分はまた、スペーサー成分をキャリアー成分に（架橋成分を介して）結合する前に、スペーサー成分に共有結合で付着させることもできる。
【００７３】
ある好ましい実施形態では、ある条件の下で、水溶性中間物質の架橋成分の反応性部分のうちでほんの一部だけがシグナル成分と反応する。架橋成分に依るが、架橋成分の未反応の反応性部分のうち、シグナル成分との反応後、1〜99％が、好ましくは1〜89％が、特に1〜69％、例えば1〜59％の範囲、特に1〜49％が、反応しないで残る。すなわち、好ましい実施形態では、反応性部分の50〜99％がシグナル成分と反応したということである。
【００７４】
したがって、別の興味ある実施形態では、水溶性中間結合体は：
I) 少なくとも1つの水溶性キャリアー成分をpHが7より高い水溶液中で1より多くの架橋成分と反応させて、架橋成分に由来する反応性部分が共有結合したキャリアー成分の水溶性部分を含む水溶性中間前駆物質を含む水溶液を形成し；
II) 所望により、この水溶性中間前駆物質を精製し；
III) 所望により精製されていてもよい水溶性中間前駆物質を、前記反応性部分の反応を介して、少なくとも1つのシグナル成分が共有結合した少なくとも1つのスペーサー成分と、反応性部分のうち一部分だけが少なくとも1つのシグナル成分が共有結合したスペーサー成分と反応するという条件の下で、pHが7より高い水溶液中で反応させて、水溶性の中間結合体を形成し；そして
IV) 所望により、ステップIII)で得られた水溶性中間結合体を精製する；
ことを含む方法によって調製することができる。
【００７５】
精製／単離プロセスは、水溶性中間前駆物質の所望により行われる精製に関連してすでに論じた方法によることができる。
【００７６】
水溶性架橋結合体の形成
次に沈澱ステップの詳細な議論に目を向けると、本発明の方法の"キー・ステップ"は、可逆的沈殿物を生ずる反応条件の下で、一次標的化成分を中間結合体に付着させるステップa)であるということは、当業者には理解されるであろう。この明細書で、"可逆的沈殿物"という用語は、生じた沈殿物が25℃で水によって希釈されるときに再溶解できるということを意味することを意図する。
【００７７】
ここで用いられる用語、"一次標的化成分"は、分子特に生物起源の分子であって、生物起源の物質の相補的な分子又は相補的な構造領域に選択的に結合、又は選択的に反応することができる分子を表そうと意図している。該当する一次標的化成分の例は、例えば、次のようなものである、抗原；ハプテン；モノクローナル及びポリクローナル抗体；遺伝子プローブ；天然及び合成オリゴ−及びポリヌクレオチド；天然及び合成モノ−、オリゴ−及びポリサッカライド；レクチン；アビジン；ストレプトアビジン；ビオチン；成長因子；ホルモン；レセプタ分子；タンパク質A及びタンパク質G；及びそれらの混合物。
【００７８】
本発明の目的に特に有益であると考えられる一次標的化成分の例は、例えば、次のようなものである、抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン（抗hCG)、家兎抗ヒトCRP、ストレプトアビジン、アビジン、抗HIV、抗C型肝炎、抗クラミジア、抗ヘルペス、抗甲状腺刺激ホルモン（抗TSH）、抗リステリア、及び抗サルモネラ。
該当する一次標的化成分で、ホルモンであるものは、例えば、ステロイド・ホルモン（例えば、エストロゲン、プロジェステロン、又はコルチゾン）、アミノ酸ホルモン（例えば、チロキシン）、及びペプチド及びタンパク質ホルモン（例えば、バソプレッシン、ボムベシン、ガストリン、又はインシュリン）、である。
【００７９】
欧州特許第0 594 772 号は、12ページ、20−38行で、分子種（抗体など）をキャリアー（デキストランなど）に付着させるとき、その有効性はいわゆる"塩析"効果を利用して高めることができると述べ、適当な濃度は0.5〜5の範囲のイオン強度に対応する濃度であろうと述べている。欧州特許第0 594 772 号に開示された例は、実際、塩の濃度をあるレベルまで高めるとキャリアーに結合されるいろいろな分子種の量に関してプラスの効果が得られたということを示している。しかし、塩濃度を約1Mにまで高めると不可逆的な沈殿物が形成された。
【００８０】
すでに述べたように、本発明者は、このたび驚くべきことに、反応混合物中のリオトロピック塩の濃度をさらに高めることによって、可逆的な沈殿物が形成され、そこには"大きな"結合体が含まれ、その結合体は：i)広範に架橋していると考えられ、ii)水溶性であり、かつiii)ここで開示されるような横流れ装置などのいろいろな分析に使用した場合に高い感度を有する（標的化成分の"高い"負荷及び／又はシグナル成分の"高い"負荷によって）（後記を参照のこと）、ということを見出した。ここで記述される方法によって得られる水溶性架橋結合体の利点を以下で詳しく論ずる。
【００８１】
特定の理論に拘束されるわけではないが、反応混合物中の塩の存在が中間結合体の活性係数を増加させ、それにより中間結合体の溶解度を減少させると現在考えられている。同様に、一次標的化成分（例えば、抗体）の活性係数が増加し、それによって一次標的化成分の溶解度が減少する。すなわち、一つの仮説は、中間結合体ならびに一次標的化成分が（多分、共に析出する水と一緒に）沈澱するときに、二つの反応物は非常に近づいて化学反応が起こる確率が高まる、すなわち、一次標的化成分が架橋成分のそれまで未反応であった反応性部分と反応する確率が高まる、ということであろう。
【００８２】
しかし、正確なメカニズムは現在まだ詳しく解明されていないということを強調しておかなければならない。、原理的には、一次標的化成分の広範な架橋／付着が溶液中で起こり、その後で架橋した結合体が沈澱したのかもしれない、あるいは、反応は沈澱が起こるときに行われるのかもしれない、あるいは、反応は（上で述べたように）沈澱が起こった後で行われるのかもしれない。しかし、一次標的化成分の広範な架橋／付着が起こる実際のメカニズムに関わりなく、本発明の方法を用いたときに得られる可逆的沈殿物は−欧州特許第0 594 772 号に開示された教説と反対に−不可逆的沈殿物に見られるような性質を有する結合体になる、と結論できるということを強調しておかなければならない。
【００８３】
特定の理論に限定されるわけではないが、現在、沈澱ステップに関連して形成される架橋は、少なくともある程度、二官能基を持つ架橋成分によって構成される、すなわち、架橋成分の第一の反応性部分がキャリアー成分の第一部分にある反応性の官能基に共有結合で付着し、架橋成分の第二の反応性部分がキャリアー成分の第二部分にある反応性の官能基に共有結合で付着する、と考えられている。分かり易い例として、例えば、DVSを架橋成分として用い、デキストランをキャリアー成分としたときの架橋の形成は次のようになるであろう：
デキストラン-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-O-デキストラン
【００８４】
しかし、沈澱ステップでの個々のキャリアー成分の架橋は一次標的化成分によって助けられることもあると考えられ、したがって、例えば、DVSを架橋成分として用いた場合の二つのデキストラン・キャリアー成分の間の架橋は次のような構造になることもある：
デキストラン-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-"一次標的化成分"−
-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-O-デキストラン
又は
デキストラン-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-"一次標的化成分"−
-O-デキストラン
【００８５】
多分、いくつかの架橋には二つ以上の一次標的化成分が組み込まれているだろうし、その一次標的化成分は第三又は第四の架橋成分とさえ反応してキャリアー成分の二つより多く部分の間に架橋を形成するだろう。実際、一次標的化成分は、それが有する反応性の部位の数だけの架橋成分と反応することが、少なくとも原理的には、可能である。
【００８６】
架橋度は、"塩析"プロセスの際に反応に利用できる架橋成分の未反応の反応性部分の量と直接関係していると考えられる。好ましい実施形態におけるスペーサー結合（第二の水溶性中間前駆物質の形成）後に残る未反応の反応性部分の量は、50〜99％の範囲にあり、その後のシグナル成分の結合（水溶性中間結合体の形成）後は、好ましい実施形態では、未反応の反応性部分の量は変化せず、50〜99％の範囲にあり、したがって、架橋に利用できる反応性部分の量、すなわち、高度の架橋の可能性、は大である。明らかに、（二つのデキストランの間で、スペーサーあるいは一次標的を介して、一つ以上の架橋成分による）架橋が広範であるほど、結合体の分子量は大きくなる。架橋度は、また、可逆的沈澱ステップに用いる方法とも関係していることは明らかである。
【００８７】
本発明の方法における沈澱ステップa)は、pHが6〜11の範囲の、好ましくは6〜10の範囲の、例えば8〜10の範囲の、特に8〜9の範囲の、水溶液中で好適に実行される。
反応時間及び反応温度に関して言うと、これらのパラメータは、用いる反応物の濃度及び／又は性質によって変わる。しかし、本発明者は、適当な反応温度は2〜30℃の範囲にあり、例えば4〜16℃の範囲、好ましくは4〜10℃の範囲、特に4〜6℃にある、ということを見出した。
反応時間は、1から36時間の間で変わるが、通常は6から24時間の間、例えば15から21時間の間、約18時間などである。
【００８８】
本発明の興味ある実施形態では、溶液中の最初の（すなわち、沈澱が起こる前の）中間結合体と一次標的化成分とのモル比は、1：1から1：50までの範囲にあり、例えば1：1から1：25までの範囲、例えば1：1から1：10までの範囲、好ましくは1：1から1：5までの範囲、特に1：2.5から1：5までの範囲、にある。
【００８９】
好ましくは、可逆的沈澱は、反応混合物にリオトロピック塩を加えるという手段で好適に得られる塩析によって行われる。適当なリオトロピック塩の例は、例えば、リチウム、ナトリウム、カルシウム、カリウム、又はアンモニウムの硫酸塩、燐酸塩、クエン酸塩、又は酒石酸塩、又はそれらの混合物、である。その他のリオトロピック塩の例は、参照してここに組み入れられる、"Purification Tool for Monoclonal antibodies（モノクローナル抗体の精製手段）"、Gagnon, P., Validated Biosystems, 1996, に示されている。
塩析プロセスの現在好ましいとされている実施形態では、リオトロピック塩として燐酸カルシウム及び硫酸アンモニウムが特に効果的である。
【００９０】
リオトロピック塩の濃度は、可逆的沈澱プロセスで架橋結合体が確実に生ずるのに十分でなければならない。望ましい効果を実現するために必要な塩の濃度は、リオトロピック塩の陽イオンと陰イオンの両方の性質に依存する。前に述べたように、1Mまでの塩濃度は、不可逆的な沈殿物を形成するという結果になり（欧州特許第0 594 772 号）、望ましい効果を実現しなかった。しかし、1Mを超える塩濃度、例えば1.25〜3Mまでの範囲の濃度、は所望の架橋結合体を生ずる。前述のように、ある特定の可逆的沈澱のための塩濃度は、用いる塩の選択によって変わる。
【００９１】
さらに、ある特定の可逆的沈澱のための塩濃度は成分の各々の負荷と性質によって変わる。架橋成分、スペーサー成分及びシグナル成分の負荷と選択が、（選ばれたある特定の塩の）精密な塩濃度に影響する。好ましい実施形態では、リオトロピック塩の濃度は1.25〜2.75Mの範囲にあり、例えば、少なくとも1.25M、又は少なくとも1.5M、又は少なくとも1.75M、又は少なくとも2M、又は少なくとも2.25M、又は少なくとも2.5M、又は少なくとも2.75Mである。
【００９２】
リオトロピック塩(lyotropic solt)は可逆的な沈殿物が確実に形成されるに十分な濃度で存在しなければならない、すなわち、リオトロピック塩、すなわち燐酸カルシウム又は硫酸アンモニウム、の濃度は、好ましくは1.25〜2.75の範囲、好ましくは1.75〜2.50Mの範囲、にある。
【００９３】
上で説明したように、塩沈澱ステップは一次標的化成分を非常に効率的に結合させるけれども、残っている架橋成分から誘導された自由な"ぶら下がり"グループは、可逆的沈殿物を含む水溶液に低分子量の不活性化分子を加えて不活性化することができる。適当な不活性化分子種の例は、例えば、エタノルアミン、メルカプトエタノール、又はいくつかのアミノ酸、すなわち、システイン、グリシン、アラニン、又はバリンなど、である。
【００９４】
可逆的塩沈澱ステップに続いて、（可逆的に）沈澱した結合体が水性媒質、好ましくは水、に再溶解される。ここに開示された方法にしたがって得られた結合体は、室温で水などの水性媒質に良く溶け、好ましくは水に対する溶解度が、25℃の水1mlあたり乾燥結合体で少なくとも0.1mgであり、好ましくは少なくとも1mg，例えば少なくとも10mg，さらに好ましくは少なくとも50mg，例えば少なくとも100mg，特に200mg、である。
【００９５】
明らかに、そして熟練技術者にははっきりと分かるように、得られた水溶性架橋結合体は、さらに精製及び／又は単離して、例えば、凍結乾燥などの手段によって固体の形にすることができる。精製／単離プロセスは、水溶性中間前駆物質のオプションとしての精製に関連してすでに述べた方法に依っても良い。
【００９６】
沈澱ステップは、好ましくは、反応混合物にリオトロピック塩を加えることによって行われるが、一次標的化成分の架橋／付着が起こるこのステップは、塩沈澱とは別の方法によって行うこともできると考えられる。上記の塩沈澱に代わる方法の一例は、反応を凍結した水溶液中で、すなわち、約−20℃から0℃までの温度で、行うことである。このような凍結溶液中には、水の小さな"ポケット"が生じ、その中では反応物が非常に高濃度で存在し、その結果化学反応が起こる確率が高くなっている、すなわち、一次標的化成分が架橋成分のそれまで未反応の反応性部分と反応する確率が高くなっている。
【００９７】
本発明の方法で有用であると考えられる方法のさらに別の例としては、例えば、溶媒沈澱、すなわち、水性の反応混合物に水と混合できる有機溶媒を加えるもの；ポリマー沈澱、すなわち、水性の反応混合物に一種類以上の不活性ポリマーを加えるもの；いろいろな濃縮手法、例えば、蒸発、好ましくは減圧下での蒸発、等がある。上記の方法全てに共通する特徴は、反応物の接近度を高めて、一次標的化成分が架橋成分のそれまで未反応の反応性部分と反応する確率を高めているということである。
【００９８】
水溶性の架橋結合体を凍結乾燥によって精製する実施形態で、残っている架橋成分の未反応の反応性部分が（不活性化分子によって）不活性化されない場合、架橋度は凍結乾燥プロセスで高められる可能性がある。架橋結合体が形成されるメカニズムに関する上述の仮説が反応物の接近に基づいていることを考えると、凍結乾燥はある程度、塩沈澱プロセスを一つ以上の側面でシミュレートしているかもしれない。すなわち、この実施形態では、架橋度、したがって、平均分子量が精製プロセスの前と比べて増加している楕ろう。逆に、別の実施形態では、架橋成分の未反応の反応性部分が、所望により行われる精製プロセスの前に前記の方法によって不活性化される。
【００９９】
すでに述べたように、ここで開示された方法で調製される水溶性架橋結合体の重要性は、現在のところ主として、以下で詳しく述べる横流れ装置における利用に関連して見られる。したがって、本発明者は、熟練技術者が本発明の方法で調製される効果的かつ好ましい水溶性架橋結合体を選ぶことを可能にする適当な横流れ装置分析を提供した。
【０１００】
すなわち、実施例7Aは、ここに開示された方法で調製される水溶性架橋結合体の感度のテストを開示している。このテストは、正確にここで述べているように用いる場合、シグナル成分が可視染料であり、一次標的化成分が家兎抗ヒトCRPである結合体に対してしか適切でないということを注意しておかなければならない。しかし、熟練技術者なら、このテストをどのように拡張して、他のシグナル成分を、そしてもっと重要であるが、他の一次標的化成分をも包含するようにできるか、分かるであろう。
【０１０１】
当業者には認められるように、そしてここに提供される実施例から明らかになるように、ここで開示された方法は、必ずしも"唯一つのタイプ"の結合体を生み出すのではなく、ある分子量分布を有する結合体を生み出すものである。上記のテストから、得られた水溶性架橋結合体がその目的に適当と判断されるか、あるいは、さらに精製／分画が望ましいか、を評価することができる。
【０１０２】
本発明者は、本発明の非常に興味ある実施形態では、沈澱ステップa)で得られた水溶性架橋結合体がゲル濾過によってさらに精製／分画されるということを見出した。すなわち、例えば横流れ装置システムでの使用に非常に適した水溶性架橋結合体は、水性媒質に再溶解した後、例えばゲル材料Sephacryl（商標）HR S-500 又はSephacryl（商標）HR S-1000 を用いて（ここに開示された実施例に指定された条件を用いて）ゲル濾過を行ったときに間隙容積に溶出するような結合体である。
【０１０３】
前に述べたように、この水溶性架橋結合体は公知の結合体に比べて"大きい"。熟練技術者には理解されるように、そして上で述べたように、ここに開示された方法によって調製される結合体は、一様な、単一の重量の結合体を生ずるのではなく、得られる結合体はある分子量分布を持つものとなる。このような不均一な結合体の、異なる種類の平均分子量は、熟練技術者には公知であるいくつかの可能な方法を用いて決定することができる。しかし、非常に適切な方法は、例えば、超遠心分析であり、特に、光散乱法である。
【０１０４】
こうして、本発明の興味ある実施形態において、ここに開示された方法で得られる結合体の質量平均分子量は、少なくとも2×10⁶ 、少なくとも3×10⁶ 、少なくとも4×10⁶ 、少なくとも5×10⁶ 、少なくとも6×10⁶ 、少なくとも7×10⁶ 、少なくとも8×10⁶ 、少なくとも9×10⁶ 、少なくとも10⁷ 、少なくとも2×10⁷ 、少なくとも3×10⁷ 、少なくとも4×10⁷ 、少なくとも5×10⁷ 、少なくとも6×10⁷ 、少なくとも7×10⁷ 、少なくとも8×10⁷ 、少なくとも9×10⁷ 、少なくとも 10⁸ 、少なくとも2×10⁸ 、少なくとも3×10⁸ 、少なくとも4×10⁸ 、少なくとも5×10⁸ 、少なくとも6×10⁸ 、少なくとも7×10⁸ 、少なくとも8×10⁸ 、少なくとも9×10⁸ 、少なくとも10⁹ 、少なくとも2×10⁹ 、少なくとも3×10⁹ 、少なくとも4×10⁹ 、少なくとも5×10⁹ 、
【０１０５】
少なくとも6×10⁹ 、少なくとも7×10⁹ 、少なくとも8×10⁹ 、少なくとも9×10⁹ 、少なくとも10¹⁰ 、少なくとも2×10¹⁰ 、少なくとも3×10¹⁰ 、少なくとも4×10¹⁰ 、少なくとも5×10¹⁰ 、少なくとも6×10¹⁰ 、少なくとも7×10¹⁰ 、少なくとも8×10¹⁰ 、少なくとも9×10¹⁰ 、少なくとも10¹¹ 、少なくとも2×10¹¹ 、少なくとも3×10¹¹ 、少なくとも4×10¹¹ 、少なくとも5×10¹¹ 、少なくとも6×10¹¹ 、少なくとも7×10¹¹ 、少なくとも8×10¹¹ 、少なくとも9×10¹¹ 、少なくとも10¹² 、少なくとも2×10¹² 、少なくとも3×10¹² 、少なくとも4×10¹² 、少なくとも5×10¹² 、少なくとも6×10¹² 、少なくとも7×10¹² 、少なくとも8×10¹² 、少なくとも9×10¹² 、又は、少なくとも10¹³ g／mol である。
【０１０６】
結合体はできるだけ大きいことが好ましいが、横流れ装置で使用される固体支持物質（例えば、ニトロセルローズ）の孔サイズよりも大きくないことが好ましい。何故なら、結合体は前記孔の中を流れることができなければならないからである。本発明の特に興味ある実施形態では、ここに開示される方法で得られる結合体は質量平均分子量が約10⁶ 〜約10¹⁰ Daの範囲にあり、好ましくは10⁶ 〜約10⁸ Daの範囲に、例えば約10⁶ 〜約10⁸ Daの範囲にある。
【０１０７】
質量平均分子量を用いる場合、個々の結合体はサンプルにおけるその質量比率、mi／m、に従って荷重される。すなわち、この文脈において、"質量平均分子量"という用語は下の式IIを参照して定義される：
<M>＝(1／m)ΣimiMi (II)
ここで、<M>は質量平均分子量、mはサンプルの全質量（すなわち、結合体の全質量）、そしてmiは分子量がMiである分子（すなわち、結合体）の全質量である。
【０１０８】
ゲル濾過プロフィール（図3a−3f）は、高イオン強度で調製された結合体の分子量（3a,c,e ）が、低イオン強度で調製された結合体の分子量（3b,d,f）よりも大きいことをはっきりと示している。すなわち、本発明の重要な特徴は、本発明の方法によって調製された結合体が、欧州特許第0 594 772 号に記述された方法によって調製されたポリマーをベースとする水溶性結合体に調製されたものと顕著に異なっているということにある。本発明の方法から得られる構造的な差異（架橋の度合及び性質）も一部働いて、分子量の差及びその他の特徴と合わせて、ポリマーをベースとする水溶性結合体に関して従来記述されていないような活動作用を付与している。
【０１０９】
前に"シグナル成分"という用語の定義に関連して言及したように、ここに開示された方法は、また、何もスペーサー成分がない、すなわち、酵素あるいは染料分子などのシグナル成分が架橋成分によって直接キャリアー成分に付着している水溶性架橋結合体の調製にも適している（水溶性中間結合体の形成に代わる仕方で述べたように）。
【０１１０】
すなわち、別の態様では、本発明は、少なくとも一つのキャリアー成分部分、一種類より多くの架橋成分部分、少なくとも一つのシグナル成分部分、及び少なくとも一つの一次標的化成分部分を含み、シグナル成分は架橋成分を介して共有結合でキャリアー成分に付着している水溶性の架橋結合体を調製する方法であって：
a) 少なくとも一つのキャリアー成分部分、1より多くの架橋成分部分、及び少なくとも一つのシグナル成分部分を含んで成り、前記シグナル成分が架橋成分を介して共有結合でスペーサー成分に付着している水溶性の中間結合体を、
水溶液中で、少なくとも1つの一次標的化成分と、架橋成分に由来する未反応の反応性部分の反応を介して、可逆的沈殿物が形成される条件の下で、反応させ；
b) 水溶性架橋結合体を含む可逆的沈殿物を、水性媒体中に再溶解させ；そして
c) 所望により、水溶性架橋結合体を精製する；
ことを含む前記方法に関する。
【０１１１】
同様に、上述の水溶性架橋結合体の調製に用いられる水溶性中間結合体は：
I) 少なくとも1つの水溶性キャリアー成分を、pHが7より高い水溶液中で、1より多くの架橋成分と反応させて、架橋成分に由来する反応性部分が共有結合で付着したキャリアー成分の水溶性部分を含む水溶性中間前駆物質を含む水溶液を形成し；
II) 所望により、この水溶性中間前駆物質を精製し；
III) 所望により精製されていてもよい水溶性中間前駆物質を、前記反応性部分の反応によって、少なくとも1つのシグナル成分と、反応性部分のうち一部分だけがシグナル成分と反応する条件の下で、pHが7より高い水溶液中で反応させ、水溶性中間結合体を形成し；そして
IV) 所望により、ステップIII)で得られた水溶性中間結合体を精製する；
ことを含む方法によって調製することができる。
【０１１２】
見られるように、ステップIII)における水溶性中間結合体の形成は、前に述べた水溶性中間結合体の調製方法と異なるステップである。一般に、上記のステップIII)は、シグナル成分のスペーサー成分への付着に関して以前に述べたものと非常に類似した条件の下で行うことができる。すなわち、上に開示された方法の、水溶性中間結合体が形成されるステップIII)は、pHが7より高い水溶液中で、例えば、pHが約8〜12の範囲、好ましくは約9〜12の範囲、特に10〜12の範囲、又は11〜12の範囲の水溶液中で、好適に実行される。
【０１１３】
実際に用いられるシグナル成分によっては、水性反応混合物は0〜60％v/vの有機捕溶剤を含むことがある。すなわち、かなり疎水性のシグナル成分（例えば、ある種の染料分子）を溶解させるために、いろいろな量の、水と混合可能な有機捕溶剤、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エタノール、ジメチルホルムアミド(DMF)等を水性反応混合物に加えて、用いるシグナル成分が十分確実に溶解できるようにする必要があるかも知れない。反応は0〜60℃の範囲の温度で、例えば15〜40℃の範囲、すなわち、20〜25℃の範囲、などの温度で行えば、通常、十分である。
【０１１４】
一般に、反応時間は1乃至48時間の範囲にある。しかし、好ましくは、反応時間はできるだけ短く、すなわち、1〜24時間の範囲、特に1〜12時間の範囲、例えば1〜5時間の範囲にあることが好ましい。
特に好ましい実施形態では、ピーク分子量が500,000のデキストランを使用し、活性化度が20〜30％の架橋成分DVSを使用し、スペーサー成分BSAを使用し、シグナル成分ロダミンBイソチオシアネートを使用し、一次標的化成分ストレプトアビジン又はモノクローナル又はポリクローナル抗体のどちらかを使用するというのが、キー可逆沈澱ステップに存在する成分である。
【０１１５】
前に述べたように、ここで記述される方法の"キー・ステップ"は、一次標的化成分が中間結合体に付着させられるステップa)であり、反応は可逆的沈殿物が形成されるようなものである。通常、ここで記述される結合体を調製するのに用いられる最も高価な反応物質は、一次標的化成分（抗体や抗原など）であり、同時に、可逆的な塩沈澱ステップは結合体の調製における最も時間がかかるステップの一つである。
【０１１６】
さらに、一次標的は実際に検出しようとする標的化成分によって変わるので、本発明の非常に興味ある一つの側面は、水溶性中間結合体（好ましくは、固体の形の）を含み、可逆的な塩沈澱ステップ、その後の可逆的沈殿物の再溶解、及びそれで形成された水溶性の架橋結合体の最終的精製（例えば、ゲル濾過による）、を実行するための指示が付けられたテスト・キットに関する。このキットのいろいろな変型も、例えば、食品産業や病院などで診断／分析によく用いられる一次標的化成分のセットを含めるなども、本発明の範囲内にある。もちろん、このキットに、ここで記述される横流れ装置における調製された結合体の使用に関する指示を付けることもできる。
【０１１７】
水溶性架橋結合体複合体の形成
別の興味ある態様では、本発明は、ここで開示された方法のいずれかによって調製された結合体、リガンドおよび二次標的化成分を含んでない、前記リガンドが共有結合で二次標的化成分と結合しており、そしてリガンドが結合体の一次標的化成分と非共有結合によって結合している水溶性架橋結合体複合体を調製する方法であって：
I) ここに開示された方法に従って水溶性結合体を調製し；
II) 所望により精製されていてもよい水溶性架橋結合体を、二次標的化成分に共有結合で結合しているリガンドと、水溶液中で反応させ；
III) 反応を終止させ；
IV) 所望により、水溶性架橋結合体複合体を精製する；
ことを含む前記方法に関する。
【０１１８】
この文脈において、"二次標的化成分"という用語は、分子特に生物起源の分子であって、生物起源の物質の相補的な分子又は相補的な構造領域と、選択的に結合、又は選択的に反応することができる分子を表す。したがって、二次標的化成分は、"一次標的化成分"という用語と関連して上述したのと同じクラスの分子から選ぶことができる、すなわち、興味深い二次標的化成分の例は、例えば次のようなものである：
【０１１９】
抗原；ハプテン；モノクローナル及びポリクローナル抗体；遺伝子プローブ；天然及び合成オリゴ−及びポリヌクレオチド；天然及び合成モノ−、オリゴ−及びポリサッカライド；レクチン；アビジン；ストレプトアビジン；ビオチン；成長因子；ホルモン；レセプタ分子；タンパク質A及びタンパク質G；及びそれらの混合物。本発明の特に好ましい実施形態では、二次標的化成分は抗hCGである。
【０１２０】
ここで用いる場合、"リガンド"という用語は、実際に用いられる一次標的化成分に高い親和性を有し、水溶性架橋結合体に存在する一次標的化成分とリガンドの間で熱力学的に安定な非共有結合が確立されるような分子を意味することを意図している。したがって、本発明のある好ましい実施形態では、リガンド／一次標的化成分は、結合体の一次標的化成分とリガンドの間の結合定数が少なくとも10⁶ 、好ましくは少なくとも10⁸ 、例えば、少なくとも10¹⁰ 、さらに好ましくは少なくとも10¹¹ 、例えば少なくとも10¹² 、特に少なくとも10¹³ 、例えば少なくとも10¹⁴ 、すなわち、少なくとも10¹⁵ l／mol、であるように選ばれる。
【０１２１】
上述したように、リガンドの選択は、もちろん、実際に用いる一次標的化成分に依存する。適当なリガンドの具体的な例は、例えば、ビオチン、抗ジニトロフェノール、又は抗ジオキシゲニン、特にビオチン、である。
【０１２２】
本発明のの非常に興味ある実施形態では、用いるリガンド／一次標的化成分は、"ビオチン／ストレプトアビジン・システム"又は"ビオチン／アビジン・システム"である、すなわち、リガンドがビオチンであり、一次標的化成分がストレプトアビジン又はアビジンである。上述のように、用いられるリガンドは、二次標的化成分に共有結合で結合しなければならないので、熟練技術者にはよく分かるように、ビオチン付加した化合物、例えばビオチン付加した抗体、が容易に利用できる。
【０１２３】
それは、例えば、Kendall et al., Journal of Immunological Methods (1993), 56, 329-339, に記述されているように調製することができる。したがって、ここで開示された方法で水溶性架橋結合体を調製することによって、興味があるビオチン付加した二次標的化成分を付着させることができる有用な"テンプレート"が得られる。しかし、"ハプテン／抗体システム"も、用いる抗体と用いるハプテンの間の結合定数が上に示した条件を満たすならば、リガンド／一次標的化成分として有用である可能性があるということは理解されるであろう。
【０１２４】
上記の反応ステップII)は、通常、室温で行われ、その後、反応は、例えば、反応混合物のpHを変える、及び／又は、過剰な自由リガンド、例えばビオチン、を加えることによって終止される[ステップIII)]。
熟練技術者には理解されるように、水溶性架橋結合体複合体は、前に水溶性架橋結合体の精製に関連して述べたものと同じ方法によって精製することが出きる。それに加えて、結合体複合体は、もちろん、前に結合体に関連して述べたと同様な仕方で固体の形で単離することができるということを注意しておかなければならない。
【０１２５】
水溶性架橋結合体と水溶性架橋結合体複合体は新しいクラスの化合物なので、本発明の別の態様は、少なくとも一つのキャリアー成分部分と、一種類より多くの架橋成分部分と、少なくとも一つのスペーサー成分部分と、少なくとも一つのシグナル成分部分と、少なくとも一つの一次標的化成分部分を含み、シグナル成分はスペーサー成分に共有結合で付着し、スペーサー成分はキャリアー成分に、架橋成分を介して共有結合で付着している水溶性架橋結合体であって、
【０１２６】
シグナル成分が、染料、タンパク質（フェリチン、フィコエリトリン、フィコシアニン、及びフィコビリンなど）、酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、及びウレアーゼ、など）、蛍光、ルミネッセント、燐光及びその他の発光物質；金属キレート物質（例えばイミノ二酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、及びデスフェリオキサミンB)、放射性同位元素で標識された物質、重原子で標識された物質、及びそれらの混合物から成るグループから選ばれ；そして
スペーサー成分は、タンパク質及びポリペプチドから成るグループから選ばれることを特徴とする前記水溶性架橋結合体に関する。
【０１２７】
本発明のさらに別の態様は、ここで定義された水溶性架橋結合体と、リガンドと、二次標的化成分とを含み、リガンドが共有結合で二次標的化成分と結合し、リガンドが非共有結合によって結合体の一次標的化成分と結合していることを特徴とする水溶性架橋結合体複合体に関する。
【０１２８】
理解されるように、本発明の水溶性架橋結合体ならびに水溶性架橋結合体複合体の性質及び構成分に関する詳細は、上記の方法態様に関連して述べた水溶性架橋結合体ならびに水溶性架橋結合体複合体の性質及び構成分に関する詳細と同じ、又は類似している。このことは、該当する場合はいつでも、方法態様に関連してなされた言明は、必要な変更を加えて、そのようなものとして、結合体及び結合体複合体にもあてはまるということを意味する。
【０１２９】
結合体及び結合体複合体の装置及び利用
本発明は、また、液体サンプル中の少なくとも一つの標的化成分の存在又は不在を決定する横流れ装置に関し、前記横流れ装置は：
I) 適用部、堆積部、及び検出部を有し、液体試料が適用部から堆積部を通って検出部へ流れることができるように配置された試験片；
II) 試験片の堆積部に配置する、少なくとも1つのここで定義された結合体の乾燥堆積物、又は少なくとも1つのここで定義された結合体複合体の乾燥堆積物、又はそれらの混合物；並びに
III) 液体試料中に存在する1または複数の標的化成分と選択的に結合又は選択的に反応できる少なくとも一つの標的化成分であって、試験片の検出部に固定されている前記標的化成分；
を有する。
【０１３０】
別の興味ある態様では、本発明は、液体サンプル中の少なくとも一つの標的化成分の存在又は不在を決定する方法であって：
I) ここで定義されるような横流れ装置の適用部に液体試料を加え；
II) 所望により、横流れ装置の適用部に洗浄緩衝液を加え；
III) 加えられた液体、及び該当する場合洗浄緩衝液、が適用部から堆積部を通って検出部へ流れるに十分な時間放置し；そして
IV) 検出部でシグナルの存在又は不在を決定する；
ことを含む前記方法に関する。
【０１３１】
本発明の結合体及び／又は結合体複合体は、テスト・ストリップのデポジット部に、濡れた場合はその結合体及び／又は結合体複合体は毛管力によってテスト・ストリップの検出部へ（溶解した状態で）輸送されることができるように、（ドライ・デポジットとして）支持される。
【０１３２】
テスト・ストリップの検出部に支持される標的化成分は、標的化成分が不動でとどまり、したがって、毛管力によって輸送されることができないような仕方で支持される。したがって、標的化成分は、テスト・ストリップに、例えば、吸着、共有結合、等によって支持できる。抗体や抗原などの標的化成分を、支持物質上で不動にする手段は、当業者には一般に公知である。
本発明のある実施形態では、いわゆる"サンドイッチ"法が、当業者には公知のあらゆるバリエーションで、テスト分析に用いられる。
【０１３３】
当業者には理解されるように、テスト・ストリップのいわゆる"アプリケーション"部、すなわち、検出されるべき標的化成分（すなわち、分析物）を含むサンプルで濡らされることになるテスト・ストリップの部分、はデポジット部と同一であっても良い。したがって、本発明のある興味ある実施形態では、検出されるべき標的化成分を含むサンプルが結合体及び／又は結合体複合体を含むテスト・ストリップの部分に直接適用（apply）される。
【０１３４】
テスト・ストリップは、適用されたサンプルから標的化成分を吸収できるようなものであり、濡れたとき、毛管引力による標的化成分の流れを、アプリケーション部からデポジット部を通って（その際、結合体及び／又は結合体複合体のドライ・デポジットを溶かし、それが標的化成分に結合して一緒に運ばれる）検出部まで可能にする。
【０１３５】
用いられるテスト・ストリップは、本発明の結合体及び／又は結合体複合体、ならびに抗体及び／又は抗原などの標的化成分を支持できる材料から作られる。テスト・ストリップが作られる適当な材料の例としては、例えば、グラスファイバー、セルローズ、ナイロン、架橋デキストラン、いろいろなクロマトグラフィー・ペーパー、ニトロセルローズなどのセルローズ・エステル、等がある。現在、最も好ましい材料はニトロセルローズである。
【０１３６】
"試験片"と呼ばれ、その中で同じ平面内に、標的化成分を含む液体が毛管引力によってアプリケーション部から、デポジット部を通って、検出部まで流れることができるようにいろいろな部分が配置されているのであるが、支持物質は、もちろん、いろいろな部分と流動可能性に関する必要条件が満たされている限りどんな形であっても良い。
検出されるべき標的化成分を含む液体は、たいていの場合(必ずという訳ではないが）血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、尿サンプル、精液サンプル、又はそれらの混合物、などの生物起源のものである。
【０１３７】
ここで記述される横流れ装置は、少量のいろいろな標的化成分、例えば、抗原；ハプテン；モノクローナル及びポリクローナル抗体；遺伝子プローブ；天然及び合成オリゴ−及びポリヌクレオチド；天然及び合成モノ−、オリゴ−及びポリサッカライド；成長因子；ホルモン；レセプタ分子；及びそれらの混合物。標的化成分の具体的な例は、例えば、次のようなものである、hCG、家兎ヒトCRP、HIV、C型肝炎、クラミジア、ヘルペス、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、リステリア、サルモネラ、及びそれらの混合物。
【０１３８】
本発明のある特に好ましい実施形態では、用いられた水溶性架橋結合体及び／又は結合体複合体のシグナル成分は、肉眼で直接検出できる線量である。したがって、ここで開示される横流れ装置にこのような結合体／結合体複合体が用いられた場合、適用された液体サンプルにおける標的化成分の有無を視覚的に判定することが可能になる。しかし、本発明の別の実施形態はここで記述されるような結合体／結合体複合体を用いるものであるが、シグナル成分は、個々で開示された横流れ装置に応用したとき、検出部に反応剤を加えた後で肉眼で検出できるようになるというものである。
【０１３９】
前に述べたように、本発明の結合体は従来技術で開示された結合体に比べてかなり"大きい"。本発明による結合体の正確な構造を明らかにすることは困難かもしれないが、広範な架橋が起こっており、それが結合体のサイズ（したがって、質量平均分子量）を大きくする原因になっていると現在考えられている。この中で開示される実施例から明らかになるように、分子量が大きいほど、実施例7Aに記述されている"標準横流れ性能テスト"でテストして良い性能（すなわち、高い感度）が得られるというのが一般則であるように思われる。
【０１４０】
欧州特許公開第0 291 194 A 号で開示されている横流れ装置は、本発明の水溶性架橋結合体及び／又は結合体複合体を取り入れることができる適当な横流れ装置の一例であるということに注意してかなければならない。欧州特許公開第0 291 194 号の内容は、参照することによってここに取り込まれる。
【０１４１】
さらに別の態様では、本発明は、また、ここで定義されたような水溶性架橋結合体の、及びここで定義されたような水溶性架橋結合体複合体の、免疫化学的分析手法における利用に関する、すなわち、ELISAなどの酵素免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、比濁及び濁度免疫分析、免疫組織化学手法、細胞化学手法、フローサイトメトリー、in situハイブリダイゼーション法、膜ハイブリダイゼーション法、サザン及びノーザン・ブロッティング法、バイオセンサ、横流れ装置、又はレクチン／炭水化物相互作用に基づく方法、など。
【０１４２】
本発明は、以下に記述される実施例によってさらに詳しく説明される。
実験
実施例 1 ：水溶性中間前駆物質の形成
実施例 1A．ピーク MW が 500,000 及び 2,000,000 であるデキストランの DVS 活性化
同じ量のデキストラン(Pharmacia, Sweden から入手）と、異なる濃度のDVS、及び0.25mgのナトリウム・ボロハイドライド／mlを含む別々の5つの溶液（A,B,C,D,及びE）が、0.25M燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム（pH11.5）の中で調製されて次の最終濃度が得られるようにした：
【０１４３】
【表１】

【０１４４】
デキストランは室温（20〜25℃）で水に溶かされた。この溶液に、同量の0.5M燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム（pH11.5）と0.25mgボロハイドライド／mlを加えた。ナトリウム・ボロハイドライドが溶解した後、反応混合物は良く換気されるフードに移され、DVS(Merck Cat. No. 821215)が加えられた。磁気攪拌機によって30分間ゆっくりと攪拌された。活性化の後、反応混合物のpHが25％(v/v)塩酸によってpH7に調整された。
5つのサンプルはすべて水に対して十分に透析され、過剰な反応剤が除去された。透析後、各溶液の体積を測定し、最終的なデキストランの濃度が計算された。
【０１４５】
遊離の反応性のビニル基の量は、大きく過剰なチオ硫酸ナトリウムと反応させ、続いて、生じた水酸化イオンを標準化された塩酸で滴定して決定された。自由ビニル基とチオ硫酸塩との反応は、次の反応図式にしたがって起こる(Porath et al. (1975) J. Chromatogr. 103, 49)：
(基質)-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH=CH₂ + S₂O₃ ^2- + H₂O→
(基質)-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂ -S₂O₃ ^- + OH^-
【０１４６】
タイトレーションの結果は（下の表を参照のこと）、デキストラン1グラムあたりのビニル基のμモル数、及び／又は、デキストラン1モルあたりのビニル基のモル数、で好適に表される。活性化されたグルコース・ユニットの平均数がデキストラン分子におけるグルコース・ユニットの総量のパーセントで計算された（ピークMWが500,000のデキストランは、平均で2,778グルコース・ユニット／デキストラン分子を有し、ピークMWが2,000,000のデキストランは、平均で11,112グルコース・ユニット／デキストラン分子を有する）：
【０１４７】
【表２】

【０１４８】
実施例 1B．ピーク MW が 500,000 であるデキストランのエピクロロハイドリン活性 化
同量のピークMWが500,000のデキストランを含む三つの別々の溶液（A,B,及びC）が、次の最終濃度となるように調製された：
【０１４９】
【表３】

【０１５０】
デキストランは、室温（20〜25℃）で水に溶解された。この溶液に水酸化ナトリウムが加えられ、混合物は良く換気されるフードに移され、エピクロロハイドリン（Merck Cat. No. 903296）が加えられた。磁気攪拌機で5時間ゆっくりと攪拌された。活性化の後、反応混合物のpHは、25％(v/v)塩酸でpH7に調整された。
【０１５１】
3つのサンプルはすべて水に対して十分に透析され、過剰な反応剤が除去された。透析後、各溶液の体積を測定し、最終的なデキストランの濃度が計算された。
遊離の反応性のエポキシ基の量は、実施例1Aで述べたように、大きく過剰なチオ硫酸ナトリウムと反応させ、続いて、生じた水酸化イオンを標準化された塩酸で滴定して決定された。
【０１５２】
得られた結果は次の通りであった：
【表４】

与えられた実施例では、DVSもEPCHも高及び低分子量のデキストランに対する活性化剤として十分に役立つことが分かる。
【０１５３】
実施例 2 ：第二の水溶性中間前駆物質の形成
実施例 2A．ピーク MW が 500,000 及び 2,000,000 の DVS 活性化されたデキストランへのウシ血清アルブミン (BSA) の結合
DVS−活性化されたデキストランの5つの溶液（A,B,C,D,及びE）がBSAに結合された。BSAをDVS−活性化されたデキストランに結合する手順は次の通りであった：
【０１５４】
溶液 A：60mgのDVS−活性化されたデキストラン（ピークMW500,000、実施例1Aの"溶液A"で述べたように調製された）と200mgのBSAが燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4，に溶解された。
溶液 B：30mgのDVS−活性化されたデキストラン（ピークMW500,000、実施例1Aの"溶液A"で述べたように調製された）と200mgのBSAが燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4，に溶解された。
【０１５５】
溶液 C：152mgのDVS−活性化されたデキストラン（ピークMW2,000,000、実施例1Aの"溶液C"で述べたように調製された）と500mgのBSAが燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4，に溶解された。
溶液 D：152mgのDVS−活性化されたデキストラン（ピークMW2,000,000、実施例1Aの"溶液D"で述べたように調製された）と500mgのBSAが燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4，に溶解された。
溶液 E：152mgのDVS−活性化されたデキストラン（ピークMW2,000,000、実施例1Aの"溶液E"で述べたように調製された）と500mgのBSAが燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4，に溶解された。
【０１５６】
BSAが溶けた後、緩衝液を加えて次の最終濃度になるようにした：
17mg BSA／ml
5.2mg DVS−活性化されたデキストラン／ml
10mM 燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4
結合は30℃で18時間行われ、その後1M塩酸を加えて溶液のpHをpH6-7に調整することによって反応をストップさせた。
【０１５７】
結合したBSAの量はSephacryl HR S-300(Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0599-01）でゲル濾過によって決定された。すべてのゲル濾過は、FPLC(Pharmacia, Sweden)によって、直径2.7cm、ベッド体積230mlのSephacryl HR S-300 によるPharmacia カラム(Cat. No.XK26/40)を用いて行われた。ゲル濾過は、100mM塩化ナトリウム中で、3ml／分の流量、最大サンプル負荷20mlで行われた。分画はUVモニター(Pharmacia, Sweden, Cat. No. 19-2448-01/18-0601-01)とペンレコーダー(Pharmacia, Sweden, Cat. No.19-8004-01)を用いてモニターされた。
【０１５８】
Sephacryl HR S-300 での分離は、二つの別々の分画で集められた二つのピークを生じた。
ゲル濾過法を用いる場合、ゲルのいわゆる"排除リミット"を超える大きな分子はポア（孔）に入ることができず、したがって、このような大きな分子は、カラムからいわゆる"空隙容積"に溶出する、すなわち、空隙容積は個々のビーズの間の容積である。通常、空隙容積はカラムの全容積の約1／3である。
OD280nmが、集められた分画の両方について測定され、得られた結果は、デキストランのピークMWに対応する平均MWのデキストラン一分子に付着したBSA分子の数として表された。得られた結果は下にまとめられている。
【０１５９】
【表５】

【０１６０】
上の値は、以下に述べるようにして計算できる：
30mgのデキストラン（ピークMW500,000）と200mgBSA（すなわち、溶液中のモル比はデキストラン：BSA＝1：25である）によって行われる結合は次のように計算できる：
A＝OD280nm、1cmキュベット、Sephacryl S-300 からのピーク1；
B＝OD280nm、1cmキュベット、Sephacryl S-300 からのピーク2；
C＝ピーク1の体積（単位ml）
D＝ピーク2の体積（単位ml）
ε(BSA、280nm、1cm、1mg／ml)＝0.65；
【０１６１】
ピーク1のmgBSA ＝(A×C)／0.65＝YmgBSA；
ピーク2のmgBSA ＝(B×D)／0.65＝ZmgBSA；
結合したBSAのパーセント＝(Y×100)／(Y+Z)；
結合したBSAのモル数／1モルのデキストラン＝（比デキストラン：BSA×結合したBSAの％)／100；
デキストランに結合したBSAを含む最初のピーク（すなわち、Sephacryl HR S-300の空隙容積で得られるピーク）は以下では"Dex-BSA"結合体と呼ぶ。
【０１６２】
"Dex-BSA"結合体が、Sephacryl HR S-500(Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0613-01)で測定された。すべてのゲル濾過はFPLC(Pharmacia, Sweden)によって、ベッド体積25mlのSephacryl HR S-500によるFPLCカラム(Cat. No. HR 10/30, Pharmacia, Sweden)を用いて行われた。ゲル濾過は、100mMの塩化ナトリウム中で流量1ml／分及び最大サンプル負荷（各ランで）100-500μlで行われた。
【０１６３】
Sephacryl HR S-500 での分離によって二つの部分的に融合したピークが得られた。第一のピーク（ピーク1）は"空隙容積"における8mlの後に溶出した(25mlのSephacryl HR S-500の空隙容積は8mlである）。
Sephacryl HR S-500での測定は、プロフィールの最初のピークにある"Dex-BSA"結合体（以下で"空隙容積に溶出した結合体"と呼ぶ）のパーセントで表された。画分のサイズの計算により、画分はピークのスタートからマーク5.25（すなわち、ゲル濾過のスタートから10.5ml）まで測定された。得られた結果は次の通りであった：
【０１６４】
【表６】

【０１６５】
実施例 2B．ピーク MW が 500,000 のエピクロロハイドリン - 活性化されたデキストランとウシ血清アルブミン (BSA) の結合
エピクロロハイドリン活性化されたデキストランの3種の溶液（A,B,及びC）がBSA(Boehringer Mannheim Cat. No. 100 350)に結合された。BSAをDVS-活性化されたデキストランに結合する手順は次の通りであった：
溶液 A：90mgのエピクロロハイドリン活性化されたデキストラン（ピークMW500,000。実施例1Bの"溶液A"で記述したように調製された）と300mgのBSAが、燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4、に溶解された。
【０１６６】
溶液 B：90mgのエピクロロハイドリン活性化されたデキストラン（ピークMW500,000。実施例1Bの"溶液B"で記述したように調製された）と300mgのBSAが、燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4、に溶解された。
溶液 C：90mgのエピクロロハイドリン活性化されたデキストラン（ピークMW500,000。実施例1Bの"溶液C"で記述したように調製された）と300mgのBSAが、燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4、に溶解された。
【０１６７】
BSAが溶解した後、緩衝液を加えて次の最終濃度にした：
18mg BSA／ml
5.5mg エピクロロハイドリン活性化されたデキストラン／ml
10mM 燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4
結合は30℃で18時間行われ、その後1M塩酸を加えて溶液のpHをpH6-7に調整することによって反応をストップさせた。
結合したBSAの量は実施例2Aで述べたようにSephacryl HR S-300 でのゲル濾過によって決定された。
【０１６８】
得られた結果は次の通りであった：
【表７】

【０１６９】
次に、実施例3Aで述べるように"Dex-BSA"結合体がSephacryl HR S-500で測定された。Sephacryl での分離は二つのピークを生じたが、空隙容積画分では"Dex-BSA"結合体のピークは何も観測されなかった。
与えられた実施例から、二つの異なるタイプのデキストラン活性化が、BSAをスペーサー成分に用いて満足すべき結合収率を与えるということが導かれる。
【０１７０】
実施例 3 ：水溶性中間結合体の形成
実施例 3A．DVS 活性化されたデキストラン− BSA 結合体へのロダミン染料の結合
二つの異なるピークMWのデキストラン（ピークMWが、それぞれ、500,000及び2,000,000)による"Dex-BSA"の3種の溶液（A,B,及びC）が、ロダミンBイソチオシアネート(Sigma, Cat. No. R 1755, Rhodamine ITC)と結合された。
【０１７１】
溶液 A：ピークMW500,000の"Dex-BSA"が17moles BSA／mole デキストランに、実施例2Aの"溶液A"に関して述べたように結合された。
溶液 B：ピークMW500,000の"Dex-BSA"が17moles BSA／mole デキストランに、実施例2Aの"溶液A"に関して述べたように結合された。
溶液 C：ピークMW2,000,000の"Dex-BSA"が48moles BSA／mole デキストランに、実施例2Aの"溶液C"に関して述べたように結合された。
【０１７２】
3種の別々の溶液が20mgのBSA("Dex-BSA"として）及びロダミンITC（5mgロダミンITC／mlDMSOの溶液ストックから）を緩衝液と混合して次の最終濃度にした：
溶液A： 400μgロダミンITC／mlと2mgBSA／ml
溶液B+C：200μgロダミンITC／mlと2mgBSA／ml
三つの溶液はすべて30％DMSO及び0.2M炭酸水素ナトリウムを含み、pH8.6であった。
【０１７３】
結合は、30℃で3時間行われ、その後、溶液は10mM燐酸カリウム、pH7.2，に対して十分透析されて反応剤が除去された。
透析後、各溶液の体積を測定して、ロダミンITCに結合した"Dex-BSA"（以後"Dex-BSA-ロダミン"結合体と呼ぶ）の量を計算した。すべてのサンプルについて558nmでの光学的濃度（1cmキュベット）を測定し、各サンプルについて吸光単位(EU)が計算された。得られた結果は次の通りであった：
【０１７４】
【表８】

【０１７５】
上の表に見られるように、結合したロダミンITCの量はOD558EU／mgBSAで表される。この値は次のように計算される：
A＝透析後の"Dex-BSA-ロダミン"溶液の体積
B＝結合に用いられたmgBSA
結合したOD558EU／mgBSA＝(A×OD558)／B
この"Dex-BSA-ロダミン"結合体の特性がSephacryl HR S-500 (Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0613-01)及びSephacryl S-300 (Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0599-01)で測定された。
【０１７６】
すべてのゲル濾過は、S-500ゲル濾過に関して実施例2Aで述べたように、FPLC(Pharmacia, Sweden)によって25mlSephacryl HR S-300 、又は25mlSephacryl HR S-500 というベッド体積のFPLCカラム(Cat. No. HR 10／30, Pharmacia, Sweden)で行われた。ゲル濾過は、50mMトリス0.1M塩化ナトリウム、1％v/v Tween20を1M塩酸でpH9に調製、において行われた。流量は1ml／分であり、サンプルの負荷は、濃度によるが、（各ランで）100-500μlであった。得られた結果は次の通りであった：
【０１７７】
【表９】

【０１７８】
実施例 3B．ローダミン染料と EPCH 活性化デキストラン BSA 結合体とのカップリング
ピーク分子量500,000の「Dex-BSA」の3つの溶液（A、BおよびC）をローダミンBイソチオシアネート(Sigma、カタログ番号R1755,ローダミンITC）と結合させた。
【０１７９】
溶液 A：実施例2Bの「溶液A」と同様の4モルBSA／1モルデキストランと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA」。
溶液 B：実施例2Bの「溶液B」と同様の5モルBSA／1モルデキストランと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA」。
溶液 C：実施例2Bの「溶液C」と同様の6モルBSA／1モルデキストランと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA」。
【０１８０】
6mgのBSA(「Dex-BSA」として）およびローダミンITC(5 mgのローダミンITC／1mlのDMSOのストック溶液から）を含有する3つの別々の溶液を緩衝液と混合して、以下の最終濃度を得た：
200μgのローダミンITC／ml
0.5 mgのBSA／ml
30％のジメチルスルホキシド
0.2Mの炭酸水素ナトリウム、pH8.6
実施例3Aと同様に、カップリングおよびその後の透析を実施した。
透析後、558 nm(1 cmキュベット）での光学密度を全試料に関して測定し、吸光単位(EU)を各試料に関して算出した。得られた結果を以下に示す：
【０１８１】
【表１０】

【０１８２】
Dex-BSA-ローダミン複合体を、実施例4Aで記載するように、セファクリルHR S-500およびセファクリルS-300に関して特性化した。唯一の差は、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％v/vトゥイーン-20を含有する溶離剤であった。得られた結果を以下に示す：
【０１８３】
【表１１】

【０１８４】
実施例 3C．Cy5 染料と DVS 活性化デキストラン BSA 結合体とのカップリング
ピーク分子量500,000の「Dex-BSA」の2つの溶液（AおよびB）をCy5-OSuモノ機能性反応染料(Amersham Pharmacia Biotec UK、カタログ番号PA 15102)と結合させた。
溶液 A および B：実施例2Aの「溶液A」と同様の17モルBSA／1モルデキストランと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA」。
BSA(「Dex-BSA」として）およびCy5（8 mgのC強い／1 mlのDMSOのストック溶液から）を含有する2つの別々の溶液を緩衝液と混合して、以下の最終濃度を得た：
【０１８５】
溶液 A：2 mgのBSA／ml、4000μgのCy5／ml、50％DMSO、0.05 Mの炭酸水素ナトリウム、pH8.6。
溶液 B：1 mgのBSA／ml、4000μgのCy5／ml、50％DMSO、0.05 Mの炭酸水素ナトリウム、pH8.6。
実施例3Aと同様に、カップリングおよびその後の透析を実施した。唯一の差は反応時間を2時間に低減したことであった。
透析後、655 nm(1 cmキュベット）での光学密度を全試料に関して測定し、吸光単位(EU)を各試料に関して算出した。得られた結果を以下に示す：
【０１８６】
【表１２】

【０１８７】
実施例 3D．反応オレンジ染料と DVS 活性化デキストラン BSA 結合体とのカップリング
実施例2Aの「溶液A」と同様の17モルのBSA／1モルのデキストランと結合した、ピーク分子量500,000の「Dex-BSA」の溶液を、反応オレンジ16(Aldrich、カタログ番号30.650-9)と結合させた。
【０１８８】
10 mgのBSA(「Dex-BSA」として）および反応オレンジ16（5 mgの反応オレンジ16／1 mlのDMSOのストック溶液から）を含有する溶液を緩衝液と混合して、以下の最終濃度を得た：
5 mgのBSA／ml
250μgの反応オレンジ16／ml
5 ％DMSO
0.4 Mのリン酸カリウム、pH10.4
実施例3Aと同様に、カップリングおよびその後の透析を実施した。唯一の差は、反応時間を18時間に増大したことであった。
透析後、493 nm(1 cmキュベット）での光学密度を全試料に関して測定し、吸光単位(EU)を各試料に関して算出した。得られた結果を以下に示す：
【０１８９】
【表１３】

【０１９０】
「Dex-BSA-反応オレンジ16」複合体を、実施例3Aと同様に、セファクリルHR S-500およびセファクリルHR S-300に関して特性化した。唯一の差は、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％v/vトゥイーン-20を含有する溶離剤であった。得られた結果を以下に示す：
【０１９１】
【表１４】

【０１９２】
実施例 3E．ユニブルー A 染料と DVS 活性化デキストラン BSA 結合体とのカップリング
実施例2Aの「溶液A」と同様の17モルのBSA／1モルのデキストランと結合した、ピーク分子量500,000の「Dex-BSA」の溶液を、ユニブルーA(Sigme、カタログ番号29.840-9)と結合させた。
【０１９３】
10 mgのBSA(「Dex-BSA」として）およびユニブルーA（5 mgのユニブルーA／1 mlのDMSOのストック溶液から）を含有する溶液を緩衝液と混合して、以下の最終濃度を得た：
5 mgのBSA／ml
500μgのユニブルーA／ml
10 ％DMSO
0.4 Mのリン酸カリウム、pH10.4
実施例3Aと同様に、カップリングおよびその後の透析を実施した。
透析後、595 nm(1 cmキュベット）での光学密度を全試料に関して測定し、吸光単位(EU)を各試料に関して算出した。得られた結果を以下に示す：
【０１９４】
【表１５】

【０１９５】
「Dex-BSA-ユニブルーA」複合体を、実施例3Aと同様に、セファクリルHR S-500およびセファクリルHR S-300に関して特性化した。唯一の差は、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％v/vトゥイーン-20を含有する溶離剤であった。得られた結果を以下に示す：
【表１６】

【０１９６】
所定の実施例から、DVSまたはEPCHで活性化されていたDex-BSA中間体に効率的に結合された多数の異なる染料が得られる。
【０１９７】
実施例 4：水溶性中間複合体の生成
実施例 4A．高イオン強度でのウサギ抗ヒト CRP と DVS 活性化「 Dex-BSA- ローダミン」結合体のカップリング
「Dex-BSA-ローダミン」複合体の5つの溶液（A、B、C、DおよびE）を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン分画（DAKO, Denmark、カタログ番号Q 0329）と結合させた。
溶液 A および D：実施例3Aの「溶液A」と同様の29 OD 558単位／1mgのBSAと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ローダミン」。
溶液 B 、 C および E：実施例3Aの「溶液B」と同様の13 OD 558単位／1mgのBSAと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ローダミン」。
【０１９８】
抗体および「Dex-BSA-ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：
溶液 A および B：0.0016μmolの抗体および0.000645μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
1.75 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.24 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／2.5

【０１９９】
溶液 C：0.007742μmolの抗体および0.001548μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.21 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／5

【０２００】
溶液 D：0.003226μmolの抗体および0.00129μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.13 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／2.5

【０２０１】
溶液 E：0.0016μmolの抗体および0.000645μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.15 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／2.5

【０２０２】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、抗体のカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液C、DおよびE中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。5つの溶液すべてを10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有する沈殿物（ペレット）を脱イオン水中に溶解した。
【０２０３】
溶液AおよびBからのペレットを400μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を1％v/vとした。
溶液Cからのペレットを700μlの脱イオン水中に溶解した後、1 M塩酸を用いてpH7.2に調整した50 mMトリスおよび0.1 M塩化ナトリウムに対して1時間透析した。透析後、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.5％v/vとした。
溶液DおよびCからのペレットを500μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.5％v/vとした。
【０２０４】
試料中の遊離抗体および「Dex-BSA-ローダミン」-結合抗体を、セファクリルHR S-300(Pharmacia, Sweden、カタログ番号17-0599-01)上でのゲル濾過により分離した。ゲル濾過はすべて、直径1 cmおよび床容積25 mlセファクリルHR S-300のPharmaciaカラム（カタログ番号HR 10/30）を用いて、FPLC(Pharmacia, Sweden）上で実施した。1 M塩酸でpH9に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、1％v/vトゥイーン20中で、溶液AおよびBのゲル濾過を実施した。溶液C、DおよびEのゲル濾過は、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、トゥイーン20中で実施した（溶液CおよびDのトゥイーン20の濃度：0.5％v/v。溶液Eのトゥイーン20の濃度：0.1％v/v)。ゲル濾過はすべて、1 ml／分の流量で実施した。
【０２０５】
セファクリルHR S-300上での分離は、2つのピークを生じた。「Dex-BSA-ローダミンITC」に結合したウサギ抗ヒトCRPを含有するセファクリルHR S-300からのピーク1を、以後、「Dex-BSA-ローダミン／a-CRP」複合体と呼ぶ。
「Dex-BSA-ローダミン／a-CRP」複合体（「溶液B」から得られる）を、8〜10.5 mlから（図1に示したプロフィールでのマーク4〜5.25から）の一分画として収集した。
【０２０６】
「Dex-BSA-ローダミン／a-CRP」複合体に関してOD558を測定し、次に、複合体をセファクリルHR S-500( Pharmacia, Sweden、カタログ番号17-0613-01）上で特性化した。ゲル濾過はすべて、25 mlセファクリルHR S-500の床容積を有するFPLCカラム（カタログ番号HR 10-30、Pharmacia, Sweden)を用いるFPLC(Pharmacia, Sweden)により実施した。1 M塩酸でpH9に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、1％v/vトゥイーン20中で、溶液AおよびBのゲル濾過を実施した。溶液CおよびEは、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、トゥイーン20中でゲル濾過を実施した（溶液Cのトゥイーン20の濃度：0.5％v/v。溶液Eのトゥイーン20の濃度：0.1％v/v）。ゲル濾過はすべて、1 ml／分の流量で実施した。
【０２０７】
セファクリルHR S-500上での分離（「溶液B」）は、図2に示したように7 ml後に溶離される一主ピークを生じた。しかしながら、溶液Cからの複合体のゲル濾過により、2つのピークを収集した。分画1は7〜10.5 mlから収集し、分画2は10.5〜18 mlから収集した。
セファクリルHR S-500上での特性化を、プロフィールの最初のピークに位置する「Dex-BSA-ローダミン／a-CRP」複合体の％で表し、以後、「空隙容量中の溶離複合体」と呼ぶ。分画のサイズは、ピーク1の開始から、ゲル濾過の開始から10.5 mlまでであった。得られた結果を以下に示す：
【０２０８】
【表１７】

【０２０９】
実施例 4B．高イオン強度でのウサギ抗ヒト CRP と EPCH 活性化「 Dex-BSA- ローダミン」結合体のカップリング
「Dex-BSA-ローダミン」結合体の溶液を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン分画(DAKO, Denmark、カタログ番号Q 0329）と結合させた。
実施例3Bの「溶液C」と同様の25 OD 558単位／1mgのBSAと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ローダミン」。
【０２１０】
抗体および「Dex-BSA-ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：
0.003226μmolの抗体および0.00129μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.1 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／2.5

【０２１１】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、抗体のカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。溶液を10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有するペレットを500μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.5％w/vとした。
【０２１２】
試料中の遊離抗体および「Dex-BSA-ローダミン」-結合抗体を、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％トゥイーン20中のセファクリルHR S-300上でのゲル濾過により分離し、セファクリルHR S-300からのピーク1を、実施例4Aと同様に、セファクリルHR S-500上で特性化した。セファクリルHR S-500上でのその後の分離（実施例4Aと同様）は、2つの重複ピークを生じた。最初のピークであるピーク1を、7 ml後に溶離した。得られた結果を以下に示す：
【０２１３】
【表１８】

【０２１４】
実施例 4C．高イオン強度での抗 hCG モノクローナル抗体と DVS 活性化「 Dex-BSA- ローダミン」結合体のカップリング
「Dex-BSA-ローダミン」複合体の溶液を、抗hCGモノクローナル抗体Mab(Genzyme MIH、バッチ番号M21452）と結合させた。
実施例3Aの「溶液A」と同様の29 OD 558単位／1mgのBSAと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ローダミン」。
【０２１５】
抗体および「Dex-BSA-ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：
0.0016μmolの抗体および0.00064μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.06 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／2.5

【０２１６】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、抗体のカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。溶液を10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有するペレットを500μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.5％w/vとした。
【０２１７】
試料中の遊離抗体および「Dex-BSA-ローダミン」-結合抗体を、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％トゥイーン20中のセファクリルHR S-300上でのゲル濾過により分離し、セファクリルHR S-300からのピーク1を、実施例4Aと同様に、セファクリルHR S-500上で特性化した。セファクリルHR S-500上でのその後の分離（実施例4Aと同様）は、2つの重複ピークを生じた。最初のピークであるピーク1を、7 ml後に溶離した。得られた結果を以下に示す：
【０２１８】
【表１９】

【０２１９】
実施例 4D．高イオン強度でのウサギ抗ヒト CRP と DVSH 活性化「 Dex-BSA- 反応オレンジ 16 」結合体のカップリング
「Dex-BSA-反応オレンジ16」複合体の溶液を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン分画（DAKO, Denmark、カタログ番号Q 0329）と結合させた。
実施例3Dと同様の1.4 OD 493単位／1mgのBSAと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-反応オレンジ16」。
【０２２０】
抗体および「Dex-BSA-反応オレンジ16」を含有する以下の溶液を調製した：
0.00323μmolの抗体および0.00129μmolのデキストラン(「Dex-BSA-反応オレンジ16」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.23 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-反応オレンジ16」／抗体：1／2.5

【０２２１】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、抗体のカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。溶液を10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有するペレットを500μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.5％w/vとした。
【０２２２】
試料中の遊離抗体および「Dex-BSA-反応オレンジ16」-結合抗体を、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％トゥイーン20中のセファクリルHR S-300上でのゲル濾過により分離し、セファクリルHR S-300からのピーク1を、実施例4Aと同様に、セファクリルHR S-500上で特性化した。セファクリルHR S-500上でのその後の分離（実施例4Aと同様）は、2つの重複ピークを生じた。最初のピークであるピーク1を、7 ml後に溶離した。得られた結果を以下に示す：
【０２２３】
【表２０】

【０２２４】
実施例 4E．高イオン強度でのウサギ抗ヒト CRP と DVS 活性化「 Dex-BSA- ユニブルー A 」結合体のカップリング
「Dex-BSA-ユニブルーA」結合体の2つの溶液（AおよびB）を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン分画(DAKO, Denmark、カタログ番号Q 0329）と結合させた。
実施例3Eと同様に3OD595単位／1 mgのBSAに結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ユニブルーA」。
【０２２５】
抗体および「Dex-BSA-ユニブルーA」を含有する以下の溶液を調製した：
溶液 A：0.0015μmolの抗体および0.0015μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ユニブルーA」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.09 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ユニブルーA」／抗体：1／1

【０２２６】
溶液 B：0.0030μmolの抗体および0.0015μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ユニブルーA」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.2 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ユニブルーA」／抗体：1／2

【０２２７】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、抗体のカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。両溶液を10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有するペレットを500μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を5％w/vとした。
【０２２８】
試料中の遊離抗体および「Dex-BSA-ユニブルーA」−結合抗体を、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％トゥイーン20中のセファクリルHR S-300上でのゲル濾過により分離し、セファクリルHR S-300からのピーク1を、実施例4Aと同様に、セファクリルHR S-500上で特性化した。セファクリルHR S-500上でのその後の分離（実施例4Aと同様）は、2つの重複ピークを生じた。最初のピークであるピーク1を、7 ml後に溶離した。得られた結果を以下に示す：
【０２２９】
【表２１】

【０２３０】
実施例 4F．高および低イオン強度でのウサギ抗ヒト CRP と DVS 活性化「 Dex-BSA- ローダミン」結合体のカップリングの比較
「Dex-BSA-ローダミン」結合体の2つの溶液（AおよびB）を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン分画(DAKO, Denmark、カタログ番号Q 0329）と結合させた。
【０２３１】
溶液 A および B：実施例3Aの「溶液B」と同様に13OD558単位／1 mgのBSAに結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ローダミン」。
抗体および「Dex-BSA-ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：
溶液 A：0.01548μmolの抗体および0.003097μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.21 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ユニブルーA」／抗体：1／5

【０２３２】
溶液 B：0.00645μmolの抗体および0.00129μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8、および水と混合して、以下の最終濃度を得た：
0.1 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.54 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／5

【０２３３】
混合後、沈殿物が溶液A中に観察された。両カップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液A中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。次に溶液Aを10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有する沈殿物（ペレット）を1 mlの脱イオン水中に溶解した。再溶解沈殿物（溶液Aから得られる）および溶液B（沈澱を伴わない透明液）を、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウムに対して、1時間透析した。
【０２３４】
ゲル濾過による特性化：
セファクリルHR S-300上でのゲル濾過から得られたピーク1を、実施例4Aと同様に、セファクリルHR S-500およびセファクリルHR S-1000上で特性化した。
セファクリルHR S-300、HR S-500およびHR S-1000上でのゲル濾過から得られたプロフィールを、図3a〜3fに示す。
【０２３５】
実施例 4G．高イオン強度でのストレプタビジンの DVS 活性化「 Dex-BSA- ローダミン」結合体のカップリング
「Dex-BSA-ローダミン」結合体の5つの溶液（A、B、C、DおよびE）を、ストレプタビジン（KEM-EN-TEC, Denmark、カタログ番号4610H）と結合させた。実施例3Bの「溶液A」と同様の25 OD 558単位／1mgのBSAと結合させた全試料。
【０２３６】
抗体および「Dex-BSA-ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：
溶液 A：0.00833μmolのストレプタビジンおよび0.004165μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9
0.05 mgのストレプタビジン／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／ストレプタビジン：1／2

【０２３７】
溶液 B：0.00833μmolのストレプタビジンおよび0.001667μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9
0.11 mgのストレプタビジン／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／ストレプタビジン：1／5

【０２３８】
溶液 C：0.00833μmolのストレプタビジンおよび0.000833μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9
0.22 mgのストレプタビジン／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／ストレプタビジン：1／10

【０２３９】
溶液 D：0.00833μmolのストレプタビジンおよび0.0004165μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9
0.42 mgのストレプタビジン／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／ストレプタビジン：1／20

【０２４０】
溶液 E：0.00833μmolのストレプタビジンおよび0.000208μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9
0.71 mgのストレプタビジン／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／ストレプタビジン：1／40

【０２４１】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、ストレプタビジンのカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、全溶液中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。5つの溶液すべてを10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離ストレプタビジンおよび結合ストレプタビジンを含有する沈殿物（ペレット）を脱イオン水中に溶解した。
【０２４２】
全溶液からのペレットを1 mlの脱イオン水中に溶解した。1 M塩酸でpH7.2に調整した0.1 M塩化ナトリウムおよび50 mMトリスに対して1時間透析した。透析後、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.1％v/vとし、溶液を1,000 rpmで5分間回転させて、上清（試料）を注意深くピペットで吸引したが、一方、残りの複合体（ペレット）は用いなかった。
【０２４３】
試料中の遊離ストレプタビジンおよび「Dex-BSA-ローダミン」-結合ストレプタビジンを、セファクリルHR S-300(Pharmacia, Sweden、カタログ番号17-0599-01）上でのゲル濾過により分離した。ゲル濾過はすべて、直径1 cmおよび床容積25 mlのセファクリルHR S-300のPharmaciaカラム（カタログ番号HR 10/30）を用いて、FPLC(Pharmacia, Sweden)上で実施した。1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.1％v/vトゥイーン20中で、1 ml／分の流量を用いて、全ゲル濾過を実施した。
【０２４４】
セファクリルHR S-300上での分離は、2つのピークを生じた。「Dex-BSA-ローダミンITC」に結合したストレプタビジンを含有するセファクリルHR S-300からのピーク1を、以後、「Dex-BSA-ローダミン／ストレプタビジン」複合体と呼ぶ。
「Dex-BSA-ローダミン／ストレプタビジン」複合体を、8〜10.5 ml後の一分画として収集した。
【０２４５】
「Dex-BSA-ローダミン／ストレプタビジン」複合体に関してOD558を測定し、次に、複合体をセファクリルHR S-500（ Pharmacia, Sweden、カタログ番号17-0613-01）上で特性化した。ゲル濾過はすべて、25 mlセファクリルHR S-500の床容積を有するFPLCカラム（カタログ番号HR 10-30、Pharmacia, Sweden)を用いるFPLC(Pharmacia, Sweden)により実施した。1 M塩酸でpH9に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、1％v/vトゥイーン20中で、1 ml／分の流速を用いて、全溶液のゲル濾過を実施した。
【０２４６】
セファクリルHR S-500上での分離は、7 ml後に溶離される一主ピークを生じた。
セファクリルHR S-500上での特性化を、プロフィールの最初のピークに位置する「Dex-BSA-ローダミン／ストレプタビジン」複合体の％で表し、以後、「空隙容量中の溶離複合体」と呼ぶ。得られた結果を以下に示す：
【０２４７】
【表２２】

【０２４８】
所定の実施例から、抗体または特異的結合分子である多数の異なる主要標的構成成分を、好ましくは高イオン強度で、スペーサー仔構成成分および染料を保有する活性化デキストランに結合させ得る、と推論される。
【０２４９】
実施例 5：水溶性複合体の生成の代替法
実施例 5A．染料とピーク分子量 2,000,000 を有する DVS 活性化デキストランとのカップリング
デキストラン（ピーク分子量2,000,000)を、実施例1Aの「溶液C」と同様に（即ち、1％(w/v)のデキストランおよび3％(v/v)のDVSを用いて）、DVSで活性化した。活性化デキストランは、1 gのデキストラン当たり554μmolの反応ビニル基という含量を有した。DVS活性化デキストランの最終濃度は、8.3 mg活性化デキストラン／mlであった。
【０２５０】
同一濃度のDVS活性化デキストランを含有する4つの別々の世液（A、B、CおよびD)を調製した。リン酸水素二カリウム／水酸化ナトリウムの最終濃度が0.25 Mで、塩化ナトリウムの最終濃度が0.50 Mで、溶液のpHが11.5となるように、緩衝液を付加した。
0.45μmフィルターを通して濾過後に、染料（レマゾール-ブラックBグラン、DE HA 725, Hoechst)の濃縮液を付加した。DVS活性化デキストランおよび染料の最終濃度を以下に示す：
【０２５１】
【表２３】

【０２５２】
溶液A、B、CおよびDを、室温（20〜25℃）で3時間インキュベートした。カップリング後、反応混合物のpHを、1 M塩酸でpH8に調整した。全試料を、50 mM塩化ナトリウムに対して十分に透析して、未結合染料を除去した。透析後、各溶液の容量を測定し、デキストランの最終濃度を算出した。
透析後、各試料をOD 600 nm（1 cmキュベット）で測定し、結合されたOD 600単位／1 mgデキストランの数値により特性化した。カップリング反応の結果を以下に列挙する：
【０２５３】
【表２４】

【０２５４】
結合OD 600単位／1 mgデキストランの数値を、次式により算出した：
(AxB)／C＝結合OD 600単位／1mgデキストラン
（式中、Aは透析終結後に測定した場合のOD 600であり、Bは透析終結後に得られた溶液の容量であり、そしてCは実験に用いたDVS活性化デキストランの量(mg)である）。
【０２５５】
実施例 5B．染料とピーク分子量 2,000,000 を有する DVS 活性化デキストランとのカップリング
デキストラン（ピーク分子量2,000,000）を、実施例1Aの「溶液C」と同様に（即ち、1％(w/v)のデキストランおよび3％(v/v)のDVSを用いて）、DVSで活性化した。活性化デキストランは、1 gのデキストラン当たり554μmolの反応ビニル基という含量を有した。DVS活性化デキストランの最終濃度は、8.3 mg活性化デキストラン／mlであった。
【０２５６】
同一濃度のDVS活性化デキストランを含有する2つの別々の世液（AおよびB）を調製した。リン酸水素二カリウム／水酸化ナトリウムの最終濃度が0.25 Mで、塩化ナトリウムの最終濃度が0.50 Mで、溶液のpHが11.5となるように、緩衝液を付加した。
【０２５７】
0.45μmフィルターを通して濾過後に、染料（レマゾール-ブリリアントレッドF3B、DE BE 305, Hoechst）の濃縮液を付加した。DVS活性化デキストランおよび染料の最終濃度を以下に示す：
【０２５８】
【表２５】

【０２５９】
溶液AおよびBを、室温（20〜25℃）で4時間インキュベートした。カップリング後、反応混合物のpHを、1 M塩酸でpH7に調整した。全試料を、50 mM塩化ナトリウムに対して十分に透析して、未結合染料を除去した。透析後、各溶液の容量を測定し、デキストランの最終濃度を算出した。
透析後、各試料をOD 530 nm（1 cmキュベット）で測定し、結合されたOD 530単位／1 mgデキストランの数値により特性化した。カップリング反応の結果を以下に列挙する：
【０２６０】
【表２６】

結合OD 530単位／1 mgデキストランの数値を、実施例5Aと同様に算出した：
所定の実施例から、2つの異なる染料（黒または赤）は、ほぼ同量のODと結合した、と推論し得る。
【０２６１】
実施例 6：水溶性架橋結合体の形成の代替法
実施例 6A．高イオン強度での DVS- 活性化「 Dex-Remazol Black 」結合体へのウサギ抗ヒト CRP の結合
「Dex-Remazol Black」結合体の5つの溶液（A、B、C、DおよびE）を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン画分（ダコ(DAKO)、デンマーク、カタログ番号Q0329）と結合させた。
【０２６２】
溶液 A および E：実施例5A中の「溶液A」について説明したように、最大分子量2,000,000の「Dex-Remazol Black」が結合した11OD600単位／mgデキストラン
溶液 B：実施例5A中の「溶液B」について説明したように、最大分子量2,000,000の「Dex-Remazol Black」が結合した8OD600単位／mgデキストラン
溶液 C：実施例5A中の「溶液C」について説明したように、最大分子量2,000,000の「Dex-Remazol Black」が結合した4OD600単位／mgデキストラン
溶液 D：実施例5A中の「溶液D」について説明したように、最大分子量2,000,000の「Dex-Remazol Black」が結合した2OD600単位／mgデキストラン
【０２６３】
溶液A、B、C、およびD：0.003226μmol抗体と0.000645μmolデキストラン(「Dex-Remazol Black」として）を、3.5Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.8)と混合して、以下の最終濃度を得た：
1.75Mリン酸カリウム緩衝液
pH8.6
0.6mg抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-Remazol Black」／抗体：1／5

【０２６４】
溶液 E：0.000645μmol抗体と0.00129μmolデキストラン(「Dex-Remazol Black」として）を、3.5Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.8)と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2Mリン酸カリウム緩衝液
pH8.6
0.22mg抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-Remazol Black」／抗体：1／5

【０２６５】
混合後、溶液中に沈殿物が観察され、抗体の結合を4〜6℃で18時間続けた。結合後、システイン（メルク(Merck)、カタログ番号1.02838）を、最終濃度0.01Mシステインになるように試料に加えた。溶液A、B、C、およびDを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH9)に対して、1時間透析した。透析後、ツイーン20を、最終濃度0.5％v/vになるように加えた。
溶液E中のリン酸緩衝液の濃度を、溶液に脱イオン水を加えて1.75Mに調整した。結合体を10,000rpmで5分遠心分離し、上清をピペットで注意深く吸引した。沈殿物（ペレット）を1mlの脱イオン水に溶解し、ツイーン20を、最終濃度0.5％v/vになるように加えた。
【０２６６】
試料中の遊離抗体と「Dex-Remazol Black」結合抗体を、セファクリルHR S-300（ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン、カタログ番号17-0599-01）でゲルろ過して分離した。すべてのゲルろ過は、直径1cmでベッド容量25mlのセファクリルHR S-300を有するファルマシア(Pharmacia)カラム（カタログ番号HR 10/30)を使用して、FPLC（ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン）で行った。溶液A、B、C、およびDについて、ゲルろ過は、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH9)、0.5％v/vツイーン20で行った。溶液Eは、50mMトリス、0.1M塩化ナトリウム、0.5％ツイーン（1M塩酸でpH7.2に調整した）中でゲルろ過した。すべてのゲルろ過は、流速1ml／分で行った。
【０２６７】
セファクリルHR S-300での分離により、2つのピークが得られた。「Dex-Remazol Black」に結合したウサギ抗ヒトHRPを含有するセファクリルHR S-300からのピーク1を、以後「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体と呼ぶ。
【０２６８】
「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体を、8mlから1つの画分として採取した。「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体についてOD600を測定し、次に溶液A、B、C、およびDからの結合体を、セファクリルHR S-500（ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン、カタログ番号17-0613-01）で性状解析した。すべてのゲルろ過は、ベッド容量25ml セファクリルHR S-500を有するFPLCカラム（カタログ番号HR10/30、ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン）を使用して、FPLC（ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン）で行った。ゲルろ過は、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH9)、0.5％v/vツイーン20中で、流速1ml／分で行った。
【０２６９】
セファクリルHR S-500での分離により、2つの重複ピークが得られた。最初のピーク（ピーク1）を7ml後に溶出した。
セファクリルHR S-500による性状解析は、プロフィールの第1のピーク中に位置する「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体のパーセント（以後、「ボイド容量で溶出した結合体」）として表した。結果は以下の通りである：
【０２７０】
【表２７】

【０２７１】
実施例 6B．高イオン強度での DVS- 活性化「 Dex-Remazol Brillant Red 」結合体へのウサギ抗ヒト CRP の結合
「Dex-Remazol Brillant Red」結合体の溶液を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン画分（ダコ(DAKO)、デンマーク、カタログ番号Q0329）と結合させた。
実施例5B中の「溶液A」について説明したように、最大分子量2,000,000の「Dex-Remazol Brillant Red」が結合した7OD530単位／mgデキストラン。
【０２７２】
抗体と「Dex-Remazol Brillant Red」を含有する以下の溶液を調製した：
0.000645μmol抗体と0.00129μmolデキストラン(「Dex-Remazol Brillant Red」として）を、3.5Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.8)と混合して、以下の最終濃度を得た：
1.75Mリン酸カリウム緩衝液
pH8.6
0.57mg抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-Remazol Brillant Red」／抗体：1／5

【０２７３】
混合後、溶液中に沈殿物が観察され、抗体の結合を4〜6℃
で18時間続けた。結合後、システイン（メルク(Merck)、カタログ番号1.02838）を、最終濃度0.01Mシステインになるように試料に加えた。結合体を、0.1M塩化ナトリウム、50mMトリス（1M塩酸でpH9に調整した）に対して、1時間透析した。透析後、ツイーン20を最終濃度1％v/vになるように加えた。
試料中の遊離の抗体と「Dex-Remazol Brillant Red」結合抗体を、セファクリルHR S-300で、50mMトリス、0.1M塩化ナトリウム、1％ツイーン20（1M塩酸でpH9に調整した）でゲルろ過して分離した。流速は1ml／分であった。
【０２７４】
セファクリルHR S-300での分離により、2つのピークが得られた。「Dex-Remazol Brillant Red」に結合したウサギ抗ヒトHRPを含有するセファクリルHR S-300からのピーク1を、以後「Dex-Remazol Brillant Red/a-CRP」結合体と呼ぶ。Dex-Remazol Brillant Red結合体は、8mlから1つの画分として採取し、OD530を測定した：
セファクリルHR S-300でゲルろ過後に得られたピーク1のOD558
1.67
上記実施例から、1次標的化成分は、2つの色素を有するDVS活性化デキストランに結合することができることがわかる。
【０２７５】
実施例 7：架橋結合体と架橋結合体複合体の装置と使用
実施例 7A．「標準的横流れ性能試験」
以下の「標準的横流れ性能試験」は、再現性のある標準条件と市販の抗原のセットを使用して、着色結合体を試験する目的で計画する。
【０２７６】
材料：
ニトロセルロースペーパー：ミリポア(Millipore)SRHF、25×300mm、カタログ番号SRHF02020
グラスファーバーペーパー：結合剤を有するワットマングラスファーバーペーパー、20×300mm、カタログ番号9699-9432
吸収性パッド：ワットマン、20×300mm、セルロースペーパー、3mm、カタログ番号3030-9433
プラスチック裏張り：0.01白。アドヒーシブズリサーチ社(Adhesives Research Inc.)、P.O. Box 100, Glen Rock, Pennsylvania, 17327, USA

【０２７７】
抗原：ヒト血清交差反応性タンパク質(CRP) ダコ(DAKO)ヒト血清カリブレーター、カタログ番号X0925
抗体：ウサギ抗ヒトCRP、ダコ(DAKO)、カタログ番号Q0329
コーティング緩衝液：0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)
抗原緩衝液：50mmトリス／HCl+0.1M NaCl+0.5％ツイーン20(pH8.6)
ブロッキング緩衝液：50mmトリス／HCl+0.1M NaCl+0.5％ツイーン20(pH8.6)

【０２７８】
洗浄緩衝液：50mmトリス／HCl+0.1M NaCl+0.5％ツイーン20(pH8.6)
結合体緩衝液：50mmトリス／HCl+0.1M NaCl+0.5％ツイーン20(pH8.6)
結合体I：本特許に従って調製した1.49 OD558の「Dex-BSA-Rhodamine／aCRP」結合体：実施例4Aと同様に調製した
結合体II：WO93／01498に従って調製した1.74 OD558の「Dex-BSA-Rhodamine／aCRP」結合体
【０２７９】
方法：
横流れ試験ストリップの調製：
乾燥ニトロセルロースペーパーを、ストリップ（幅6mm、長さ6mm）に切断し、プラスチック裏張り（幅5mm、長さ6mm）にのせた。グラスファイーバーパッド（幅5mm、長さ20mm）を、ニトロセルロースストリップの一端にのせた。吸収性パッド（幅5mm、長さ20mm）を、ニトロセルロースストリップの他端にのせた。
【０２８０】
抗体溶液の調製：
ウサギ抗ヒトCRPを最終濃度0.125mg免疫グロブリン／mlコーティング緩衝液に希釈する。
抗原溶液の調製：
DAKOヒト血清カリブレーターを抗原緩衝液で希釈して、以下の抗原溶液を調製する（カリブレーター中のCRPの特定の濃度で血清カリブレーターを希釈する）：
A：250 ng CRP/ml
B：125 ng CRP/ml
C：63 ng CRP/ml
D：31 ng CRP/ml
E：16 ng CRP/ml
F：8 ng CRP/ml
G：0 ng CRP/ml

【０２８１】
結合体溶液の調製：
試験すべき結合体IとIIの希釈物を結合体緩衝液で調製する：
結合体：「Dex-BSA-Rhodamine/a-cCRP」結合体（実施例4Aの溶液Dから）「Dex-BSA-Black/a-cCRP」結合体（実施例6Aの溶液Eから）
希釈：吸収スペクトルの可視領域（すなわち、約450nm〜約650nmの範囲内）で1cmの光路を使用して、結合体の実際の吸収極大で測定した時、0.7の吸収を有する最終濃度に、結合体を希釈する。
【０２８２】
試験の実施：
1）A1、B1、C1、D1、E1、F1およびG1と名付けた7つの横向き流れ試験ストリップのそれぞれに、横向き流れ試験ストリップの中央のスポットとして、3μlのウサギ抗ヒトCRP（0.125mg免疫グロブリン／ml）を添加する。
2）各ストリップ上のグラスファイバーパッドの上端に25μlのブロッキング緩衝液を添加して、試験ストリップの残存するタンパク質結合能をブロックする。
3）緩衝液が毛細管流により、試験ストリップの他端の吸収性パッドに達するまで、約10分待つ。
【０２８３】
4）グラスファイバーパッドの上端で、各試験ストリップに25μlの抗原溶液を添加する。A1の試験ストリップには抗原溶液A（250ng CRP/ml）を添加し、B1の試験ストリップには抗原溶液Bを添加するなど、陰性対照である抗原溶液Gを添加したG1の試験ストリップまで行う。抗原溶液は、グラスファイバーパッドから「こぼれる」のを避けるために、徐々に加える。
5）抗原溶液が、試験ストリップの他端の吸収性パッドに流れるまで、10分待つ。
6）各試験ストリップのグラスファイバーパッドの下端に25μlの洗浄緩衝液を添加する。10分待ち、各試験ストリップのグラスファイバーパッドの下端に25μlの洗浄緩衝液を再度添加する。
【０２８４】
7）30分待つ。
8）各試験ストリップ上のグラスファイバーパッドの下端に50μlの結合体I希釈物を加える。
9）10分待つ。
10）各試験ストリップ上のグラスファイバーパッドの下端に25μlの洗浄緩衝液を添加する。10分待ち、各試験ストリップのグラスファイバーパッドの下端に25μlの洗浄緩衝液を再度添加する。
【０２８５】
A2、B2、C2、D2、E2およびF2と名付けた新しいセットの横向き流れ試験ストリップを用いて、工程1を繰り返し、G2は、工程8の結合体II希釈物を使用して、工程2〜10を行う。
試験結果の評価：
試験ストリップ上に現れるスポットの色強度を、スコアリング試験により評価する。以下の数を使用して、現れるスポットの強度を解析する：
5：非常に強く着色したスポット
4：中程度に着色したスポット
3：弱く着色したスポット
2：スポットがかすかに見える
1：スポットは検出できない
【０２８６】
スポット試験の読み値：
【表２８】

【０２８７】
実施例 7B．異なる「 Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP 」結合体による標準的横流れ性能試験
異なる「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体を、標準的横流れ性能試験で試験した。すべての試験は、実施例7Aに記載したように行った。
試験中の抗原濃度(CRP)と「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体濃度は、試験毎に異なり、従って各試験について別々に記載する。
すべての試験で抗体は、各スポットについて0.1mg抗体／mlと1μlの濃度でニトロセルロースストリップ上にスポットした。
【０２８８】
試験番号 1
実施例4A、溶液Cからの「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体を用いて、横向き流れ性能試験を行った。
横向き流れ性能試験は、以下の結合体画分を使用して行った：
I：セファクリルロースHR S-300からのピーク1 濃度：OD558＝0.1
II：セファクリルロースHR S-500からのピーク1 濃度：OD558＝0.1
III：セファクリルロースHR S-500からのピーク2 濃度：OD558＝0.1

【０２８９】
試験ストリップ上に現れるスポットの色強度を、AGFAのフラットベッドスキャナーARUSIIを使用して、以下の設定条件で測定した：
原稿：反射性
モード：グレイスケール
入力：240 dpi
スケール：100％
範囲：ヒストグラム 最少＝130、最大＝254
トーン曲線：無し
シャープネス：無し
デスクリーン：無し
サイズ：A4ポートレイート
【０２９０】
強度単位で与えられた結果の計算のために、ウインドウズ用のソフトウェアCREAM(1-D, Kem-En-Tec A/S, コペンハーゲン、デンマーク、カタログ番号990012)を使用した。
結果：
【０２９１】
【表２９】

【０２９２】
結論：
セファクリルHR S-500からの画分1（7〜10.5mlから採取した）中で採取した結合体は、画分2（10.5〜18mlから採取した）中で採取した結合体より有意に優れた応答を与える。セファクリルHR S-500からの2つの画分を含むセファクリルHR S-300からのピーク1の試験は、セファクリルHR S-500から得られた画分2とほとんど同じ応答を与える。上記試験結果は、水溶性高分子量結合体（すなわち、セファクリルHR S-500カラム上でゲルろ過した時、容量から完全にまたはほとんど排除される結合体）を使用することの利点を例示している。
【０２９３】
試験番号 2
実施例4Bからの「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体を用いて、横向き流れ性能試験を行った。
上記結合体の性能を、実施例4A、溶液Eからの参照結合体（DVS活性化デキストランで調製）「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」と比較した。
I：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」、実施例4B
II：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」、実施例4A、溶液E（参照）
結合体濃度：OD＝0.5
結果：
【０２９４】
【表３０】

【０２９５】
結論：
上記試験結果は、DVS活性化担体残基に基づく結合体と同様かまたはそれ以上の性能を有する高分子量結合体の基礎として、EPCH活性化担体残基を使用することの可能性を証明している。
【０２９６】
試験番号 3
横流れ性能試験を実施例4Fの「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体（高イオン強度（溶液A）および低イオン強度（溶液B）でそれぞれ調製）を用いて実施した。Sephacryl HR S-1000でのゲル濾過から集められたさまざまな画分および実施例4Aの参照結合体溶液Eも試験した。
【０２９７】
I：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」、実施例4F、溶液A OD558=0.35
II：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」、実施例4F、溶液B OD558=0.5
III：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」、実施例4A、溶液E（参照） OD558=0.5
IV：画分1(Sephacryl HR S-1000、溶液Aより、8〜10mlから集めたもの
V：画分2(Sephacryl HR S-1000、溶液Aより、10〜12mlから集めたもの
VI：画分3(Sephacryl HR S-1000、溶液Aより、14〜16mlから集めたもの
VII：画分4(Sephacryl HR S-1000、溶液Aより、18〜20mlから集めたもの
画分IV〜VIIは、OD558＝0.35の濃度を用いて試験した。
結果
【０２９８】
【表３１】

Sephacryl HR S-1000から集めた画分の試験。
【０２９９】
【表３２】

【０３００】
結論
この試験結果は、低イオン強度、すなわち反応物を（可逆的）沈殿させないで抗体のカップリングにより作られた結合体（結合体B）は、可逆的沈殿条件下で抗体のカップリングが行われた場合の結合体（結合体A）に比較して非常に劣った性能を与えることを示している。これらの結果は、結合体Bは結合体Aよりも分子量が著しく低い事実とも一致している。さらに、結合体が分子量の低い試料に分別されるとき、試料の性能は分子量とともに低下する、すなわち高分子量結合体がより高い性能を与えることも分かる。
【０３０１】
実施例 7C．異なる「 Dex-BSA-Dye-/a-CRP 」および「 Dex-Dye-/a-CRP 」結合体による標準横流れ性能試験
異なる「Dex-BSA-Dye/a-CRP」および「Dex-Dye/a-CRP」結合体を、標準横流れ性能試験により試験した。全ての試験は、実施例7Aに記載のとおり行った。
ドットに用いた抗体濃度、ニトロセルロースストリップ上のスポッティングに用いた抗体の体積（μl）、抗原濃度(CRP)および結合体濃度は試験により異なるので、各試験毎に別々に記載する。
【０３０２】
試験番号 1
実施例6A、溶液A、BおよびCの「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体を用いて横流れ性能試験を行った。
結合体の性能を、実施例4A溶液Eの参照結合体である「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」と比較した。
以下の条件で横流れ性能試験を行った。
「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体を試験する際には濃度1mg／mlの抗体3μlをスポットに用い、「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」参照結合体を試験するときには濃度0.1mg／mlの抗体1μlを用いた。
【０３０３】
I：「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体A OD600＝0.6
II：「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体B OD600＝0.6
III：「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体C OD600＝0.6
IV：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」実施例4A、溶液E（参照） OD558＝0.5
結果
【０３０４】
【表３３】

この試験は、Remazol Blackをシグナル成分として使用できる可能性を示している。
【０３０５】
試験番号 2
実施例4E、溶液AおよびBの「Dex-BSA-UniblueA/a-CRP」結合体を用いて横流れ性能試験を行った。
結合体の性能を、実施例4A溶液Eの参照結合体である「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」と比較した。
以下の条件で横流れ性能試験を行った。
【０３０６】
「Dex-BSA-UniblueA/a-CRP」結合体および「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」参照結合体を試験する際には濃度0.1mg／mlの抗体1μlをスポットに用いた。
I：「Dex-BSA-UniblueA/a-CRP」結合体A OD595＝0.5
II：「Dex-BSA-UniblueA/a-CRP」結合体B OD595＝0.5
III：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」実施例4A、溶液E（参照） OD558＝0.5
結果
【０３０７】
【表３４】

この試験は、Uniblue Aをシグナル成分として使用できる可能性を示している。
【０３０８】
試験番号 3
実施例6Bの「Dex-Remazol Brilliant Red/a-CRP」結合体を用いて横流れ性能試験を行った。
結合体の性能を、実施例4A溶液Eの参照結合体である「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」と比較した。
以下の条件で横流れ性能試験を行った。
【０３０９】
「Dex-Brilliant Red/a-CRP」結合体を使用する際には濃度1mg／mlの抗体3μlをスポットに用い、「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」参照結合体を試験する際には濃度0.1mg／mlの抗体1μlを用いた。
I：「Dex-Remazol Brilliant Red/a-CRP」 OD530＝1.0
II：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」実施例5A、溶液E（参照） OD558＝0.5
結果
【０３１０】
【表３５】

この試験は、Remazol Brilliant Redをシグナル成分として使用できる可能性を示している。
与えられた実施例から、可逆的沈殿条件は、スペーサー成分の有無に関わらず、可逆的沈殿条件なしに調製された結合体よりも横流れ試験片において高い性能を示す、抗体と染料が結合した結合体を与えるという結論が導かれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図 1 ： Dex-BSA- ロダミン／ a-CRP 結合体の精製
高イオン強度（1.75M燐酸カリウム緩衝液）で家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（実施例5A“溶液B”、ゲル濾過はSephacryl ^TM S-300 で行った）。メインピーク、(1)、は水溶性架橋“Dex-BSA-ロダミン”結合体を含む。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。同図は、自由な、束縛されない抗体、ピーク(2)、が結合体から分離できることを示している。
【図２】 図 2 ：特性カーブ。 Dex-BSA- ロダミン”結合体
高イオン強度（1.75M燐酸カリウム緩衝液）で家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（実施例5A“溶液B”、ゲル濾過はSephacryl ^TM S-300 で行った）。メイン画分、(1)、は水溶性架橋“Dex-BSA-ロダミン”結合体を含む。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。同図は、結合体が高い一定の分子量を有し、早い溶出と鋭いピークを生ずることを示している。
【図３ａ】 図 3a ：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl ^TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl ^TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl ^TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図３ｂ】 図 3b ：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl ^TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl ^TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl ^TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図３ｃ】 図 3c ：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl ^TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl ^TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl ^TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図３ｄ】 図 3d ：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl ^TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl ^TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl ^TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図３ｅ】 図 3e ：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl ^TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl ^TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl ^TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図３ｆ】 図 3f ：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl ^TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl ^TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl ^TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図４ａ】 図 4 ：水溶性架橋結合体複合体を調製するプロセスの概略
本文で言及された成分と前駆物質の調製のある実施形態の概略図が図4に示されている。同図は、読者がこの方法で述べられた手順の一般的アウトラインをたどるのを助けるために、ある実施形態の中の挿話的な例を示したものであるから、単に説明のためにのみ用いるべきである。
【図４ｂ】 図 4 ：水溶性架橋結合体複合体を調製するプロセスの概略
本文で言及された成分と前駆物質の調製のある実施形態の概略図が図4に示されている。同図は、読者がこの方法で述べられた手順の一般的アウトラインをたどるのを助けるために、ある実施形態の中の挿話的な例を示したものであるから、単に説明のためにのみ用いるべきである。[0001]
Field of Invention
The present invention relates to a novel method for preparing water-soluble cross-linked conjugates and conjugate complexes, as well as new water-soluble cross-linked conjugates and conjugate conjugates themselves. Conjugates and conjugate complexes allow for improved sensitivity in immunochemical analysis, especially when used in lateral flow devices and determine the presence of small amounts of active ingredients present in liquid samples It is possible to improve the sensitivity when used in the method.
[0002]
Background of the Invention
Great research efforts have been devoted to date to devise methods to improve the reliability and sensitivity of immunochemical analysis, such as its reliability and sensitivity in home pregnancy and fertility tests, and therefore There is a continuing need for new and improved methods of preparing conjugates that exhibit high sensitivity and specificity when used in such immunochemical analyses. When developing new conjugates for use in sensitive immunochemical analyses, the number of “active” components present in the conjugate, such as the number of antibodies and antigens, and the number of “detectable units”, eg, dye molecules, is extremely high. Clearly it will be important.
[0003]
Various strategies to improve the sensitivity and reliability of immunochemical analysis are reviewed by L.J. Kricka (1994) Clin. Chem. 40, 347-357.
[0004]
EP 0 594 772 relates to a polymer-based water-soluble conjugate comprising moieties derived from divinyl sulfone. EP 0 594 772 describes the possibility of enhancing the attachment of molecular species such as antibodies and antigens to water-soluble carrier molecules using the so-called “salting out” effect. However, it has been found that increasing the salt concentration to about 1M forms an irreversible precipitate.
[0005]
This time, surprisingly, by further increasing the concentration of salt in the reaction mixture, a reversible (ie, re-dissolvable) precipitate is formed, in which various immunochemical analyzes such as cross-flow devices are formed. It has been found that it contains "large" water-soluble conjugates that are useful in immunochemical analysis in such as.
[0006]
Description of the invention
The first aspect of the invention comprises at least one carrier component portion, more than one cross-linking component portion, at least one spacer component portion, at least one signal component portion, and at least one primary targeting component portion. Wherein the signal component is covalently bonded to a spacer component, and the spacer component is covalently bonded to a carrier component via a linking component, comprising:
[0007]
a) comprising at least one carrier component part, more than one cross-linking component part, at least one spacer component part, and at least one signal component part, said signal component being covalently bound to the spacer component; and A water-soluble intermediate conjugate in which the spacer component is covalently bonded to the carrier component via a linking component;
Reacting with at least one primary targeting component via reaction of unreacted reactive moieties derived from the linking component in aqueous solution under conditions where a reversible precipitate is formed;
b) redissolving the reversible precipitate comprising the water-soluble cross-linker in an aqueous medium; and
c) purify water-soluble cross-linked conjugates as desired;
The method comprising:
[0008]
In this specification, the term “water-soluble” when used in connection with a crosslinked conjugate means that the conjugate obtained according to the methods disclosed herein is soluble in aqueous media such as water at room temperature. It means that the conjugate obtained by the method disclosed herein produces a substantially clear and homogeneous solution as determined by visual inspection of the sample.
[0009]
In one preferred embodiment of the invention, the conjugate obtained by the method disclosed herein is at least 0.1 mg, preferably at least 1 mg, such as at least 10 mg, more preferably at least 1 mg dry conjugate per ml of water at 25 ° C. It has a solubility in water of at least 50 mg, for example 100 mg, in particular at least 200 mg.
[0010]
Before proceeding to the detailed discussion of the precipitation step above, it should be noted that: That is, this water-soluble intermediate conjugate is
I) At least one water-soluble carrier component is reacted with more than one cross-linking component in an aqueous solution with a pH higher than 7, and the water-soluble portion of the carrier component shares a reactive portion derived from the cross-linking component. Forming an aqueous solution comprising a water-soluble intermediate precursor attached by bonding;
II) If desired, purify this water-soluble intermediate precursor;
III) A water-soluble intermediate precursor, which may optionally be purified, is reacted with the reactive moiety,
i) react with at least one spacer component in an aqueous solution with a pH greater than 7 under the condition that only a proportion of the reactive moiety reacts with the spacer component leaving a significant amount of unreacted reactive moiety, Forming two water-soluble intermediate precursors,
ii) purifying this second water-soluble intermediate precursor, if desired,
iii) The second water-soluble intermediate precursor, which may be optionally purified, is converted into at least one signal component in an aqueous solution having a pH higher than 7 by the reaction of the spacer component, and most of the signal component is a crosslinking component. Rather, it reacts with the spacer component to react with the condition that a significant amount of the reactive portion of the unreacted cross-linking component remains unreacted to form a water-soluble intermediate conjugate (ie, a small signal component). Only a proportion reacts with the reactive part of the crosslinking component); and
IV) If desired, purify the water-soluble intermediate conjugate obtained in step III);
Can be prepared by a method comprising:
[0011]
The method outlined above in steps I-IV in general form and the components mentioned therein are shown schematically in FIG. This figure is only taken as an instructive example of one embodiment and should be used for illustrative purposes only. The various stages of intermediates and precursors that form part of the method are outlined in order to help the reader follow the procedure.
[0012]
Water-soluble carrier component
The term “carrier component” in the context of the present invention is used to denote the “backbone” of the conjugate, ie the carrier component functions as a backbone to which various molecules can be attached.
[0013]
Water-soluble polymers that serve as carrier components in the conjugate preparation method can be selected from a wide variety of types of polymers, such as:
[0014]
Natural and synthetic polysaccharides and their derivatives, such as dextran and dextran derivatives, starch and starch derivatives, cellulose derivatives, amylose and pectin, and some natural gums and their derivatives, such as gum arabic and arginate;
[0015]
Homopoly (amino acids) with suitable reactive functional groups, such as polylysine, polyhistidine, or polyornithine;
Natural and synthetic polypeptides and proteins, such as bovine serum albumin and other mammalian albumins; and
Synthetic polymers having nucleophilic functional groups such as polyvinyl alcohol, polyallyl alcohol, polyethylene glycol, and substituted polyacrylates.
[0016]
Very suitable polymers for the purposes of the present invention are polysaccharides and their derivatives: dextran, carboxymethyl-dextran, hydroxyethyl- and hydroxypropyl-starch, glycogen, agarose derivatives, and hydroxyethyl- and hydroxypropyl-cellulose. is there. As is apparent from the examples herein (see below), dextran, among other things, is a particularly suitable polymer for the present invention, which is currently the most preferred carrier component.
[0017]
As already mentioned, it is often desirable that the conjugate has no or substantially no net charge, especially for immunochemical applications of the conjugate. Because in such cases, the net positive or negative charge can lead to an undesirable situation in which the conjugate binds non-specifically to substances and / or materials other than those of interest, among others. Because. In many cases, this condition is met by simply ensuring that the carrier component of the polymer itself has no net charge if no charged molecular species are introduced.
[0018]
That is, the preferred carrier component used in the method of the present invention, in its free state, is substantially linear and substantially uncharged at a pH in the range of about 4 to about 10. The latter pH interval is the interval that is actually relevant in the majority of immunochemical techniques, hybridization techniques, and other conjugate applications. Various polymers that meet this criteria include, for example, many polysaccharides and their derivatives, such as dextran and hydroxyethyl- and hydroxypropyl-cellulose.
[0019]
Depending on the application for which the conjugate is used, the conjugate is based on a water soluble polymer carrier component having a range of molecular weights. In some embodiments of the invention, the polymer carrier component has a peak molecular weight in the range of about 40,000 to 40,000,000 (reacting or resulting from reacting the water soluble polymer carrier component with a crosslinking agent such as DVS or EPCH). Before reacting the water-soluble intermediate precursor with the spacer component or signal component to finally form the cross-linked conjugate and cross-linked conjugate complex).
[0020]
Peak molecular weights of considerable interest are peak molecular weights in the range of 100,000 to 10,000,000, for example in the range of 500,000 to 8,000,000, preferably in the range of 500,000 to 4,000,000, for example in the range of 500,000 to 2,000,000. Particularly interesting peak molecular weights, particularly for dextran as the polymer carrier component, are peak molecular weights of about 500,000, about 1,000,000, about 1,500,000, about 2,000,000, 2,500,000, about 3,000,000, about 3,500,000 and about 4,000,000.
[0021]
More specifically, dextran with a molecular weight range of 20,000 to 2,000,000 is preferred as the starting carrier component. Most preferably, 20,000 Da dextran is preferred for, but not limited to, conjugates and / or conjugate complexes using streptavidin as the primary or secondary target. Furthermore, 500,000 Da dextran is preferred but not limited to conjugates and / or conjugate complexes that use several dyes, enzymes as primary or secondary targets with certain binding molecules. In addition, 2,000,000 Da dextran is preferred with some other dyes, but is not so limited.
[0022]
The term “peak molecular weight” as used in connection with the carrier component in this specification and claims refers to the molecular weight having the greatest abundance, i.e. the largest number in a sample or batch of polymers of a certain molecular weight distribution. The molecular weight of the molecule. It is very common to characterize many types of polymers in this way, as it is difficult (especially for the highest molecular weights) to determine or create polymer fractions when the molecular weight distribution is very narrow. It is.
[0023]
For a number of commercially available carrier components of interest in connection with the present invention, the manufacturer or distributor can provide reliable peak molecular weight data (eg determined by gel permeation chromatography), which Based on the above, it is possible to select a polymer / carrier component of an appropriate fraction.
[0024]
Here, the peak molecular weight value quoted in this specification and claims (when used in connection with the carrier component) refers to the peak molecular weight of the free polymer in question, for example, the crosslinked polymer unit is bound, for example, It should be mentioned that the method for the preparation of the body does not take into account any possibility of being formed as a result of the cross-linking of two or more polymer molecules by reaction with cross-linking components such as DVS and EPCH. Such cross-linked units will on average have a molecular weight greater than the individual free polymer molecules that form them.
[0025]
Formation of water-soluble intermediate precursors
In this specification, the term “crosslinking component” is intended to denote a divalent molecule capable of creating a covalent link with other—usually larger—molecules. Examples of crosslinking components suitable for the process according to the invention are molecules having a divalent reactive group such as glutaraldehyde, carbodiimide, N, N′-phenylene dimaleimide, N-succinimidyl 3- (2-Pyridylthio) propionate, p-benzoquinone, bisoxirane, divinylsulfone (DVS) and epoxide derivatives such as the following general formula 1:
[Chemical 1]

(Where R₁Is hydrogen or C_1-4 Alkyl, n is an integer in the range 1-4, ie 1, 2, 3 or 4, and X is a leaving group such as tosyl, mesyl, or halogen such as fluorine, chlorine, bromine or iodine, etc. Preferably chlorine)
It is an epoxide represented by
In this specification, the term "C_1-4 "Alkyl" is a straight or branched saturated hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, isopropyl, isobutyl, and the like.
[0026]
As will be apparent from the examples provided herein, a very promising crosslinking component derived from an epoxide is epichlorohydrin (EPCH), i.e.₁Is a compound in which n is 1, n and the leaving group is chlorine.
Preferably, the cross-linking component should be stable in an aqueous environment, and thus cross-linking component EPCH, together with cross-linking component DVS, is currently the most preferred cross-linking component for use in the method of the present invention.
[0027]
The first step, i.e. step I) in which a water-soluble intermediate precursor is formed, has a pH higher than 7, such as above 8.5, in particular higher than 9, such as above 10, such as a pH of approximately 10, It is preferably carried out in 10.5, 11 or 11.5 aqueous solutions. In the most common form, the reaction can be carried out at a temperature in the range of 0-60 ° C, but for example in the examples given here, as shown for carrier components such as dextran, 20-25 ° C. This range of temperatures is quite appropriate in many cases. In certain preferred embodiments of the invention, the pH at which the reaction is conducted is generally in the range of about 10 to 11.5. This is the pH range in which the reactive functional groups of most types of carrier components become reactive against the now preferred crosslinking components DVS and EPCH.
[0028]
With regard to the concentration of the carrier component in the aqueous solution, it is generally in the range 0.1-20% w / v, often in the range 0.5-10% w / v, for example in the range 0.5-5% w / v, in particular It is in the range of 0.5-2% w / v, for example about 0.5% w / v, about 1% w / v, about 1.5% w / v, or about 2% w / v. The concentration of the crosslinking component in the aqueous solution depends on the crosslinking component actually used, but is generally in the range of 0.1 to 35% v / v. The concentration in the aqueous solution of the cross-linking components which are now preferred, i.e. DVS and EPCH, is usually in the range of 0.1-15% v / v for DVS and often in the range of 1-10% v / v . In the case of EPCH, the concentration is usually in the range of 1-30% v / v, often in the range of 3-20% v / v. If the reactant for the preparation of the cross-linking component is a solid, the concentration will generally be in the range of 0.1-10% w / v.
[0029]
There is no general guideline on how long the reaction between the crosslinking component and the carrier component in the aqueous solution should proceed. This is because, for example, the temperature or pH at which the reaction takes place, the concentration of the carrier component and the concentration of the crosslinking component in the reaction mixture, the nature of the carrier component and / or the molecular weight and the nature of the crosslinking component, and for example gelation or precipitation. This is because, depending on how much crosslinking of the carrier proceeds (for example, by reaction with DVS) before the risk of occurrence occurs.
[0030]
However, the reaction time in question will usually be in the range of 5 minutes to 10 hours. As will be apparent from the examples provided herein, the reaction time required when using DVS as a crosslinking component is usually in the range of 5 to 120 minutes, such as in the range of 15 to 60 minutes, eg about In contrast to 30 minutes, activation of the carrier component by EPCH generally requires a longer reaction time, usually in the range of 1 to 10 hours, for example in the range of 3 to 7 hours, for example about 5 hours.
[0031]
As already mentioned, the carrier component of the water-soluble intermediate precursor has one or more moieties derived from the bifunctional cross-linking component covalently attached to it, each of which is a cross-linked bifunctional group. It is attached by a covalent bond formed between one of the two functional groups of the component and the reactive functional group of the carrier component. As will be appreciated, the remaining functional groups of the difunctional cross-linking component are free (“hanging”), and thus, under appropriate conditions, eg, primary targeting component, spacer component and / or signal component. Can react (see below).
[0032]
The number of crosslinkable groups attached to the carrier component in “road”, ie [Step I], is usually in the range of about 1 to about 5,000 micromoles (μmoles) of crosslinker component per gram of carrier component, for example In any of the following subranges (expressed in μmoles of crosslinking component per gram of carrier component): from about 1 to about 50; from about 50 to about 300; from about 300 to about 1,000; or from about 1,000 to about 5,000. The number of linking groups attached to the carrier component can be determined by a titration method known per se, such as the thiosulfate titration method described in Porath et al. (1975) J. Chromatogr. 103, 49, etc. Can be determined.
[0033]
As is apparent from the examples provided herein, the “load” of the linker is usually from about 300 to over 2,000, expressed in micromoles of crosslinking group per gram of carrier. Over. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, this range of about 1 to about 5,000 μmoles in micromoles of cross-linking groups per gram of carrier component is in particular from 200 to 3000, preferably from 500 to 2500. Should.
[0034]
The optional purification step (Step II) can be performed, for example, by a process such as dialysis (to remove excess reactants or other low molecular weight species) or any chromatograph suitable for this purpose, such as gel filtration. Graphical methods can be used. However, the purification method described above is only given as an example, and a skilled technician can, for each case, the actual conditions used in the binding step and the actual components used in the binding step and the production site. The most appropriate purification method could be selected depending on the equipment available at
[0035]
Carrier components suitable for use in the method of the present invention (which, as explained above, constitute the “backbone” of the conjugate) are initially uncrosslinked and are suitable for application in the present invention. It is preferably essentially zero charge at the relevant pH value.
[0036]
Due to the nature of the bond, to establish on the carrier component a chemistry used in the method of the invention, i.e. a covalently linked reactive moiety derived from a bifunctional molecule such as DVS or EPCH. Generally, it will be necessary for the carrier component to have a reactive functional group, preferably a nucleophilic functional group. Thus, suitable carrier components are, for example, polymer carrier components having the following functional groups:
[0037]
-O^-(Eg, deprotonated phenol-hydroxyl groups such as deprotonated aromatic hydroxy groups of tyrosine residues of polypeptides or proteins), -S^-(Eg, a deprotonated thiol group or aliphatic group of an aromatic ring such as a deprotonated thiol group of a cysteine residue of a polypeptide or protein), —OH (eg, glucose or other oligosaccharide or polysaccharide An aliphatic hydroxy group of a sugar ring such as a monosaccharide ring; or an alcohol hydroxy group of a polyol such as polyvinyl alcohol; or a hydroxy group of some amino acid residues of a polypeptide or protein such as a serine or threonone residue) , -SH (eg, thiol group of a cysteine residue of a polypeptide or protein), primary amino group (eg, lysine or ornithine residue of a polypeptide or protein; or amino of some polysaccharides or derivatives thereof such as chitosan Substituted sugar rings), or secondary amino groups (eg, polypeptides or tampers) In the histidine residue of the protein.
[0038]
It is a skilled technician that the question of whether the functional group is in a protonated or deprotonated state depends, of course, on the selected reaction conditions such as the pH of the reaction mixture. Will be understood.
For similar reasons, the functional groups in question in the targeting and spacer components (see below) in the present invention are also usually nucleophilic functional groups such as those of any of the types described above. Become a nuclear functional group.
[0039]
Second water-soluble intermediate precursor
In step III i) of the method of the invention, the spacer component is covalently bonded to the water soluble intermediate precursor by reaction with the crosslinking component to form a second water soluble intermediate precursor.
As described above, the “spacer component” is covalently attached to the carrier component via a bridging group. That is, the term “spacer component” as used in the present invention is intended to mean a protein or polypeptide having multiple sites that can be utilized for covalent attachment of a signal component such as a dye (see below).
[0040]
One purpose for incorporating a spacer component is that the number of signal components that can be attached to the conjugate (i.e., water-soluble intermediates), particularly in the case of spacer components having multiple sites available for attachment of the signal component. Appropriate to increase the sensitivity of this conjugate when used in various analyzes, such as the immunochemical analysis and cross-flow devices described herein, by increasing the “load” of the signal component in the conjugate (see above) It is a means (see below). In embodiments where the binding of the signal component (eg, dye molecule) is performed directly with the cross-linking component (not with the spacer component), there is (at least in principle) one signal molecule per molecule of the cross-linking component present in the conjugate. It will be understood that only one will adhere.
[0041]
In some embodiments where the second water soluble precursor was prepared, the number of moles of spacer per mole of dextran at the start (the “load” of the spacer) is in the range of 1 to 500, especially 2 to 100, most Often in the range of 5 to 75. Also, as described in detail in Example 3A of this specification, the second water-soluble intermediate (and thus the efficiency of the reaction performed in step III i) can be, for example, a spacer component attached per mole of carrier component. It can be expressed by the number of (moles).
[0042]
As previously mentioned, only a portion of the reactive portion of the crosslinking component of the water-soluble intermediate reacts with the spacer component. Depending on the spacer component and the crosslinking component, after reaction with the spacer component, 1 to 99%, preferably 20 to 99%, especially 30 to 99%, for example 40 to 99%, of the unreacted reactive part of the crosslinking component, In particular 50-99% is left unreacted. That is, in one embodiment, under certain conditions, 1 to 49% of the unreacted cross-linked molecules reacted with the spacer component.
[0043]
Preferably, the spacer component is a protein such as BSA, ovalbumin, globulin, or a polypeptide such as a homopolypeptide, such as polylysine, polyhistidine, polyornithine. However, it will be apparent to those skilled in the art that the choice of spacer component will depend on the signal component used (eg, the actual dye used in a particular conjugate) as well as the cross-linking component used.
[0044]
The molecular weight of the spacer component, eg protein, is preferably at least 10,000 Da, and preferably in the range 10,000 to 2,000,000, for example in the range 20,000 to 500,000. One of the features of the introduced spacer component is to increase the number of positions available for the introduction of the signal component, so the number of functional groups available for the attachment of the signal component is one molecule of the spacer component. It is preferred that there are at least 5 per, preferably 10 to 1,000, in particular 10 to 500.
[0045]
Alternatively, the spacer component may be a polysaccharide or a polynucleic acid. It may be necessary to chemically modify these polymers prior to the preparation of water-soluble intermediate conjugates.
[0046]
As stated previously, due to the nature of the binding chemistry of the spacer component (in the formation of the second water-soluble intermediate precursor, it is linked to the cross-linking component, or in the later formation of the water-soluble intermediate conjugate, the signal component , See below), reactive functional groups such as nucleophilic functional groups are present in the spacer component. Thus, suitable spacer components will have, for example, the following nucleophilic functional groups:
[0047]
-O^-(Eg, a deprotonated phenol-hydroxyl group, such as a deprotonated aromatic hydroxy group of a tyrosine residue of a polypeptide or protein), -S^-(E.g., deprotonated thiol group or aliphatic group of aromatic ring, such as deprotonated thiol group of cysteine residue of polypeptide or protein), -OH (e.g., polypeptide such as serine or threonone residue) Or an aliphatic hydroxy group present in several amino acid residues of a protein), -SH (eg, a thiol group of a cysteine residue of a polypeptide or protein), a primary amino group (eg, lysine or ornithine of a polypeptide or protein) Residue), or secondary amino group (eg, in a histidine residue of a polypeptide or protein).
[0048]
It is a skilled technician that the question of whether the functional group is in a protonated or deprotonated state depends, of course, on the selected reaction conditions such as the pH of the reaction mixture. Will be understood.
[0049]
In step III i) of the method according to the invention, a second water-soluble intermediate precursor is formed, which step comprises an aqueous solution with a pH higher than 7, for example greater than 8, in particular greater than 9, for example greater than 10. It is suitably carried out at a pH in the interval, for example from 10 to 11, for example from 10 to 10.5. Usually it is quite sufficient to carry out this reaction at a temperature in the range of 0-60 ° C., but the optimum temperature depends inter alia on the pH actually used. In most cases, especially when the reaction is carried out at a pH higher than 9, and especially when the reaction is carried out at a pH higher than 10, a temperature in the range of 20-40 ° C., for example a temperature around 30 ° C. Often very suitable.
[0050]
With regard to reaction time, it should be understood that several parameters affect the required reaction time. That is, the reaction time varies within wide limits depending on the pH used, the reaction temperature, the concentration of the spacer component of the peptide or polypeptide, the concentration of the water-soluble intermediate precursor, and the like. However, suitable reaction times are generally considered to be in the range of 1 hour to 48 hours and, as will be understood from the examples provided herein, for the specific reaction conditions disclosed in Examples 3A and 3B. With a set, a reaction time in the range of 10-30 hours, for example in the range of 15-25 hours, for example about 18 hours, is very suitable.
[0051]
As previously mentioned, only a portion of the unreacted reactive portion of the crosslinking component of the water soluble intermediate reacts with the spacer component. This means that the second water-soluble intermediate still has a significant amount of unreacted reactive moieties. The resulting second water-soluble intermediate precursor can be purified by the methods already described in connection with the purification step II), i.e. in connection with the purification of the water-soluble intermediate precursor. As will be apparent from the examples provided herein, a suitable method for purifying the resulting second water soluble intermediate precursor is gel filtration.
[0052]
Formation of water-soluble intermediate conjugates
In step III iii), the signal component is covalently attached to the second water-soluble intermediate precursor by reaction with the spacer component to form a water-soluble intermediate conjugate.
As used herein, the term “signal component” is intended to cover a component that can be directly physically detected or a precursor of a component that can be directly physically detected.
[0053]
In other words, the signal component can be obtained by any physical method known to those skilled in the art, for example, spectrophotometry, fluorescence, luminescence, phosphorescence, other methods such as "Instrumental Method of Chemical Analysis", GW Ewing, 5th Ed., McGraw-Hill Book Company, New York, 1988, must function as a label or marker that can be easily measured by means of optical methods such as those described in 1988. Alternatively, the signal component—as mentioned above—may be a precursor of such a physically detectable component. A typical example of such a precursor generates a molecular species, preferably colored, that can be detected by one or more of the above physical methods by acting on a suitable substrate. An enzyme that can.
[0054]
In light of the above discussion, it will be apparent to a skilled artisan that the signal component can be selected from the following materials: dyes; fluorescent, luminescent, phosphorescent and other luminescent materials Metal chelating materials such as iminodiacetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), and desferrioxamine B; radioisotope labeled materials; heavy atom labeled materials; Mixture of.
[0055]
Further, to give some examples, the fluorescent substances are, for example, fluorescein (suitable forms are fluorescein isothiocyanate, FITC), fluoresceinamine, 1-naphthol, 2-naphthol, eosin, erythrosine, morin, O-phenylenediamine. , Rhodamine and 8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid. Related radioisotopes are, for example, hydrogen isotopes (ie tritium,^ThreeH), carbon (¹⁴C), phosphorus (³²P), sulfur (³⁵S), iodine (¹³¹I), bismuth (²¹²Bi), yttrium (⁹⁰Y), Technetium (^99mTc), palladium (¹⁰⁹Pd), and samarium (¹⁵³Sm), you can choose from. Related heavy atoms are, for example, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, In, Ag, Au, Hg, I, Bi, Y, La, Ce, Eu, and Gd. Gold (Au) is a heavy atom that is particularly useful in many cases.
[0056]
A signal component that may be of particular interest is a dye. In this specification, the term “dye” is intended to mean a dye molecule or derivative thereof that can be detected spectrophotometrically. Preferred dyes for incorporation into the conjugate prepared by the method of the present invention are derived from visible dyes, phosphorescent dyes, fluorescent dyes, laser dyes, infrared dyes, and lanthanide chelates.
[0057]
Dyes of particular interest are visible dyes, including soluble visible dyes, solvent dyes, pigments, vat dyes, sulfur dyes, mordant dyes, leuco vat dyes, and fluorescein, rhodamine and their derivatives (sulforhodamine, rhodamine-hydride and rhodamine). Molecules such as hydrazide), and oxazine dyes, cyanine dyes and azole dyes. Specific examples of suitable dyes include, for example, Texas Red Hydrazine, Congo Red, Trypan Blue, Remazole Black, Remazol Brilliant Red, Rhodamine B Isothiocyanate, Cy5-Osu Monofunctional Reactive Dye, Reactive・ There are Orange 16, Uni Blue A, etc.
[0058]
The above dyes are useful as signal components for the purposes of the present invention, but are all well known to those skilled in the art, and other dyes are used by skilled technicians as signal components for the purposes of the present invention. It will be clear that you can. Other examples of dyes used as signal components include, for example, “Dyeing and Chemical Technology of Textile Fibers”, Trotman, 34th Ed., C. Griffin & Co., London and “The Chemistry. of Synthetic Dye ", Vankataramon (Ed.), Academic Press, New York, 1979, the contents of which are hereby incorporated by reference.
[0059]
Preferably, the signal component is capable of reacting with a protein such as BSA, and / or in other embodiments described below, capable of reacting with an unreacted reactive portion of the cross-linking component. There must be. In addition, it is preferred that the signal component does not impart undesirable properties to the resulting water-soluble intermediate conjugate when reacted or bound to the spacer component, ie, the signal component enhances uncontrollable non-specific binding. Or the activity of the targeting moiety (eg, antibody) bound to the conjugate is preferably not inhibited. Furthermore, it is preferred that the signal component does not significantly reduce the solubility of the conjugate in water.
[0060]
Depending on the size of the starting dextran, the type of signal component used, and in particular the “load” of the spacer, the “load” of the signal component will obviously vary. As previously mentioned, each spacer can accommodate several signal components. In preferred embodiments, the number of signal components per spacer component ranges from 1 to 100, expressed in moles of each component. Of particular interest are embodiments in which this molar ratio ranges from 2 to 80, in particular from 2 to 75.
[0061]
As previously mentioned, only a small portion of the cross-linking component of the second water soluble intermediate reacts with the signal component in forming the water soluble intermediate conjugate. After reacting with the signal component, depending on the signal component, the spacer component, and depending on the cross-linking component, compared to the amount of unreacted reactive cross-linking component in the second water soluble intermediate precursor, 50 to 100% of the reactive part of the reaction, preferably 60 to 100%, in particular 70 to 100%, for example in the range 80 to 100%, in particular 90 to 100%, is left unreacted (caution, second Compared to water-soluble intermediate precursors).
[0062]
Depending on the particular dye, the conjugate prepared by the method of the invention absorbs or emits photons in the visible range, UV range, or near infrared range, preferably in the visible range. When a visible dye such as rhodamine is used, the conjugates of the present invention will absorb photons in the visible region (eg, blue) and transmit light of a complementary color (eg, red) wavelength to the observer. Alternatively, when a fluorescent dye is used, the conjugate of the present invention will emit a photon of a specific wavelength by returning electrons to the ground state (when irradiated).
[0063]
In step III iii) of the method of the invention, a water-soluble intermediate conjugate is formed, which is in an aqueous solution with a pH higher than 7, for example higher than 8, especially in the range from about 8 to about 11, for example about It is suitably carried out in an aqueous solution having a pH in the range of 8.5 to 10.5. Depending on the actual signal component used, the aqueous reaction mixture may contain 0-60% v / v organic cosolvent.
[0064]
In other words, organic scavengers that can be mixed with various amounts of water, such as dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, dimethylformamide, to dissolve hydrophobic signal components (eg, certain dye molecules). It may be necessary to add (DMF) or the like to the aqueous reaction mixture to ensure sufficient dissolution of the signal components used. In order to avoid denaturation of the already bound spacer component (which is usually a polypeptide or protein), the concentration of this organic scavenger in the reaction mixture is preferably as low as possible.
[0065]
Similar to that described above in connection with the steps relating to the formation of the water-soluble intermediate precursor and the formation of the second water-soluble intermediate precursor, the temperature in this step is also in the range of 0-60 ° C., for example 20-40 ° C. It is sufficient to carry out the reaction at a temperature in the range, for example about 30 ° C.
[0066]
As will be apparent from the examples provided herein, the reaction time varies within wide limits. That is, the reaction time depends on, for example, the “load” of the spacer component on the carrier component, as well as the usual reaction parameters such as pH, temperature, and the nature and concentration of the reactants. In general, however, the reaction time is in the range of 1 to 48 hours. Preferably, the reaction time should be as short as possible, i.e. in the range from 1 to 24 hours, in particular in the range from 1 to 12 hours, for example in the range from 1 to 5 hours.
[0067]
In the same manner as described above, the resulting intermediate conjugate can be purified by a variety of different methods known to the skilled artisan. Furthermore, the resulting intermediate conjugate can be isolated in solid form by means such as, for example, lyophilization or solvent evaporation. In the latter case, the evaporation is usually carried out under reduced pressure, for example by a (vacuum) dryer.
[0068]
The resulting intermediate conjugate can be characterized in various ways. For example, if the signal component used is a visible dye, the absorbance is read and the intermediate conjugate (and thus the efficiency of coupling step III iii) is described, for example, in Example 4A of this specification. As shown, it can be expressed by the number of light absorption units (EU) present in the intermediate conjugate per 1 mg of the spacer component. Of course, a skilled engineer could express the properties of the resulting intermediate conjugate in several other ways.
[0069]
It should be noted that in the method of the invention described so far, the spacer component is bound to the carrier component via a crosslinking component, after which the signal component is attached to the spacer component. Thus, when a signal component (such as a dye) is attached to the spacer component, the spacer component is already attached to the carrier component (via the crosslinking component).
[0070]
An alternative to the formation of water-soluble intermediate conjugates
As previously mentioned, and as will be understood from the examples presented herein, the newly synthesized component is covalently attached to the cross-linking component, and the cross-linking component is further attached to the carrier component, i.e., protein. And the method in which the spacer component of the polypeptide is not incorporated into the conjugate is also suitable for the preparation of water-soluble crosslinked conjugates (see the latter).
[0071]
In such a case, of course, the signal component is, in addition to the above signal components, proteins such as ferritin, phycoerythrin, phycocyanin, and phycobilin; enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, galactosidase, and urease; And substances such as mixtures thereof.
[0072]
As will be apparent to those skilled in the art, the signal component can also be covalently attached to the spacer component prior to coupling the spacer component to the carrier component (via the crosslinking component).
[0073]
In certain preferred embodiments, only a portion of the reactive portion of the cross-linking component of the water-soluble intermediate reacts with the signal component under certain conditions. Depending on the crosslinking component, of the unreacted reactive part of the crosslinking component, after reaction with the signal component, 1 to 99%, preferably 1 to 89%, especially 1 to 69%, for example 1 to 59% In the range, in particular 1 to 49%, remain unreacted. That is, in a preferred embodiment, 50-99% of the reactive moiety has reacted with the signal component.
[0074]
Thus, in another interesting embodiment, the water-soluble intermediate conjugate is:
I) A water solution comprising a water-soluble portion of a carrier component in which at least one water-soluble carrier component is reacted with more than one cross-linking component in an aqueous solution having a pH higher than 7, and the reactive portion derived from the cross-linking component is covalently bonded. Forming an aqueous solution containing an ionic intermediate precursor;
II) If desired, purify this water-soluble intermediate precursor;
III) A water-soluble intermediate precursor, which may optionally be purified, is converted into at least one spacer component to which at least one signal component is covalently bonded via the reaction of the reactive moiety and only a part of the reactive moiety. Reacting in an aqueous solution with a pH greater than 7 under the condition that at least one signal component reacts with a covalently bonded spacer component to form a water soluble intermediate conjugate; and
IV) If desired, purify the water-soluble intermediate conjugate obtained in step III);
Can be prepared by a method comprising:
[0075]
The purification / isolation process can be by methods already discussed in connection with the optional purification of the water-soluble intermediate precursor.
[0076]
Formation of water-soluble crosslinks
Turning now to a detailed discussion of the precipitation step, the “key step” of the method of the present invention is the step of attaching the primary targeting moiety to the intermediate conjugate under reaction conditions that result in a reversible precipitate. It will be understood by those skilled in the art that a). In this specification, the term “reversible precipitate” is intended to mean that the resulting precipitate can be redissolved when diluted with water at 25 ° C.
[0077]
As used herein, the term “primary targeting moiety” refers to a molecule, particularly a biogenic molecule, that selectively binds to or reacts selectively to a complementary molecule or a complementary structural region of a biogenic substance. Intended to represent molecules that can do. Examples of relevant primary targeting components are, for example, antigens; haptens; monoclonal and polyclonal antibodies; gene probes; natural and synthetic oligo- and polynucleotides; natural and synthetic mono-, oligo- and Lectins; avidins; streptavidins; biotin; growth factors; hormones; receptor molecules; protein A and protein G; and mixtures thereof.
[0078]
Examples of primary targeting components that may be particularly beneficial for the purposes of the present invention include, for example: anti-human chorionic gonadotropin (anti-hCG), rabbit anti-human CRP, streptavidin, avidin Anti-HIV, anti-hepatitis C, anti-chlamydia, anti-herpes, anti-thyroid stimulating hormone (anti-TSH), anti-listeria, and anti-Salmonella.
Applicable primary targeting components that are hormones include, for example, steroid hormones (eg, estrogen, progesterone, or cortisone), amino acid hormones (eg, thyroxine), and peptide and protein hormones (eg, vasopressin, bombesin) , Gastrin, or insulin).
[0079]
EP 0 594 772 on page 12, lines 20-38, increases the effectiveness of attaching molecular species (eg antibodies) to a carrier (eg dextran) using the so-called “salting out” effect. It can be said that a suitable concentration would be a concentration corresponding to an ionic strength in the range of 0.5-5. The example disclosed in EP 0 594 772 actually shows that increasing the salt concentration to a certain level has had a positive effect on the amount of different molecular species bound to the carrier. . However, irreversible precipitates were formed when the salt concentration was increased to about 1M.
[0080]
As already mentioned, the inventor has surprisingly found that by further increasing the concentration of lyotropic salt in the reaction mixture, a reversible precipitate is formed, in which "large" conjugates are present. The conjugates included: i) are considered to be extensively cross-linked, ii) are water-soluble, and iii) high when used in various analyzes such as cross-flow devices as disclosed herein It has been found that it has sensitivity (by "high" loading of the targeting component and / or "high" loading of the signal component) (see below). The advantages of the water-soluble crosslinks obtained by the method described here are discussed in detail below.
[0081]
Without being bound by any particular theory, it is now believed that the presence of salt in the reaction mixture increases the activity coefficient of the intermediate conjugate, thereby decreasing the solubility of the intermediate conjugate. Similarly, the activity factor of the primary targeting component (eg, antibody) is increased, thereby decreasing the solubility of the primary targeting component. That is, one hypothesis is that when the intermediate conjugate as well as the primary targeting component is precipitated (perhaps together with water that precipitates together), the two reactants are very close together, increasing the probability of a chemical reaction occurring, ie This will increase the probability that the primary targeting component will react with the previously unreacted reactive moiety of the cross-linking component.
[0082]
However, it must be emphasized that the exact mechanism is not yet fully understood. In principle, extensive cross-linking / adhesion of the primary targeting component may occur in solution, after which the cross-linked conjugate may have precipitated, or the reaction may occur when precipitation occurs. Alternatively, the reaction may take place after precipitation has occurred (as described above). However, regardless of the actual mechanism by which extensive cross-linking / adhesion of the primary targeting component occurs, the reversible precipitate obtained when using the method of the present invention is the teaching disclosed in EP 0 594 772. It should be emphasized that, contrary to the theory-it can be concluded that the conjugate has the properties as found in irreversible precipitates.
[0083]
Without being limited to a particular theory, currently the bridge formed in connection with the precipitation step is constituted at least in part by a crosslinking component having a bifunctional group, i.e. the first reaction of the crosslinking component. The reactive moiety is covalently attached to the reactive functional group on the first part of the carrier component, and the second reactive part of the crosslinking component is covalently attached to the reactive functional group on the second part of the carrier component. It is thought to do. As an easy-to-understand example, for example, the formation of a cross-link using DVS as the cross-linking component and dextran as the carrier component would be as follows:
Dextran-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-O-Dextran
[0084]
However, it is believed that cross-linking of individual carrier components during the precipitation step may be aided by the primary targeting component, and thus, for example, cross-linking between two dextran carrier components when using DVS as the cross-linking component. Can have the following structure:
Dextran-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-"Primary targeting component"-
-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-O-Dextran
Or
Dextran-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-"Primary targeting component"-
-O-Dextran
[0085]
Perhaps some cross-links will incorporate more than one primary targeting component, which will react with even the third or fourth cross-linking component and more than two of the carrier components It will form a bridge between the parts. Indeed, it is possible, at least in principle, that the primary targeting component reacts with as many cross-linking components as it has reactive sites.
[0086]
The degree of crosslinking is believed to be directly related to the amount of unreacted reactive moieties of the crosslinking component available for reaction during the “salting out” process. The amount of unreacted reactive moiety remaining after spacer binding (formation of the second water soluble intermediate precursor) in the preferred embodiment is in the range of 50-99%, followed by signal component binding (water soluble intermediate binding). After formation of the body, in a preferred embodiment, the amount of unreacted reactive moieties does not change and is in the range of 50-99%, thus the amount of reactive moieties available for crosslinking, i.e. high The possibility of cross-linking is great. Clearly, the broader the cross-linking (by two or more cross-linking components between two dextrans, via a spacer or primary target), the greater the molecular weight of the conjugate. It is clear that the degree of crosslinking is also related to the method used for the reversible precipitation step.
[0087]
The precipitation step a) in the process according to the invention is suitably carried out in an aqueous solution with a pH in the range 6-11, preferably in the range 6-10, for example in the range 8-10, in particular in the range 8-9. Executed.
With respect to reaction time and reaction temperature, these parameters vary depending on the concentration and / or nature of the reactants used. However, the inventor has found that a suitable reaction temperature is in the range of 2-30 ° C, for example in the range of 4-16 ° C, preferably in the range of 4-10 ° C, in particular in the range of 4-6 ° C. It was.
The reaction time varies between 1 and 36 hours, but is usually between 6 and 24 hours, such as between 15 and 21 hours, such as about 18 hours.
[0088]
In interesting embodiments of the invention, the molar ratio of the initial conjugate in solution (ie, before precipitation occurs) to the primary targeting component is in the range of 1: 1 to 1:50; For example in the range from 1: 1 to 1:25, for example in the range from 1: 1 to 1:10, preferably in the range from 1: 1 to 1: 5, especially in the range from 1: 2.5 to 1: 5. is there.
[0089]
Preferably, the reversible precipitation is carried out by salting out suitably obtained by means of adding a lyotropic salt to the reaction mixture. Examples of suitable lyotropic salts are, for example, lithium, sodium, calcium, potassium, or ammonium sulfate, phosphate, citrate, or tartrate, or mixtures thereof. Examples of other lyotropic salts are shown in “Purification Tool for Monoclonal antibodies”, Gagnon, P., Validated Biosystems, 1996, incorporated herein by reference.
In the currently preferred embodiment of the salting out process, calcium phosphate and ammonium sulfate are particularly effective as lyotropic salts.
[0090]
The concentration of lyotropic salt must be sufficient to ensure cross-linking occurs in the reversible precipitation process. The concentration of salt required to achieve the desired effect depends on both the cation and anion nature of the lyotropic salt. As mentioned earlier, salt concentrations up to 1M resulted in the formation of irreversible precipitates (European Patent No. 0 594 772) and did not achieve the desired effect. However, salt concentrations above 1M, such as concentrations ranging from 1.25 to 3M, yield the desired cross-linked conjugate. As mentioned above, the salt concentration for a particular reversible precipitation will depend on the choice of salt used.
[0091]
Furthermore, the salt concentration for a particular reversible precipitation varies with the loading and nature of each of the components. The loading and selection of the cross-linking component, spacer component and signal component affects the precise salt concentration (for a particular salt chosen). In preferred embodiments, the concentration of lyotropic salt is in the range of 1.25 to 2.75M, such as at least 1.25M, or at least 1.5M, or at least 1.75M, or at least 2M, or at least 2.25M, or at least 2.5M, or At least 2.75M.
[0092]
The lyotropic salt must be present in a concentration sufficient to ensure that a reversible precipitate is formed, i.e. the concentration of the lyotropic salt, i.e. calcium phosphate or ammonium sulfate, is preferably between 1.25 and 2.75. In the range, preferably in the range of 1.75 to 2.50M.
[0093]
As explained above, although the salt precipitation step binds the primary targeting component very efficiently, the free “dangling” group derived from the remaining cross-linking component can be used in aqueous solutions containing reversible precipitates. A low molecular weight inactivating molecule can be added to inactivate. Examples of suitable inactivating molecular species are, for example, ethanololamine, mercaptoethanol, or some amino acids, such as cysteine, glycine, alanine, or valine.
[0094]
Following the reversible salt precipitation step, the (reversibly) precipitated conjugate is redissolved in an aqueous medium, preferably water. The conjugate obtained according to the method disclosed herein is well soluble in an aqueous medium such as water at room temperature, preferably has a solubility in water of at least 0.1 mg dry conjugate per ml of water at 25 ° C., preferably Is at least 1 mg, such as at least 10 mg, more preferably at least 50 mg, such as at least 100 mg, especially 200 mg.
[0095]
Obviously, and as will be apparent to the skilled artisan, the resulting water soluble cross-linked conjugate can be further purified and / or isolated and made into a solid form by means such as, for example, lyophilization. . The purification / isolation process may rely on the methods already described in connection with the optional purification of the water-soluble intermediate precursor.
[0096]
The precipitation step is preferably performed by adding a lyotropic salt to the reaction mixture, although it is contemplated that this step in which cross-linking / deposition of the primary targeting component can be performed by methods other than salt precipitation. An example of an alternative to the above salt precipitation is to carry out the reaction in a frozen aqueous solution, i.e. at a temperature from about -20 <0> C to 0 <0> C. In such frozen solutions, there are small “pockets” of water, in which the reactants are present in very high concentrations, resulting in a high probability of chemical reactions, ie primary targeting. There is a high probability that the component will react with the previously unreacted reactive moiety of the crosslinking component.
[0097]
Still other examples of methods that may be useful in the methods of the invention include, for example, solvent precipitation, ie, adding an organic solvent that is miscible with water to an aqueous reaction mixture; polymer precipitation, ie, an aqueous reaction. Add one or more inert polymers to the mixture; there are various concentration techniques such as evaporation, preferably evaporation under reduced pressure. A feature common to all of the above methods is that the proximity of the reactants is increased, increasing the probability that the primary targeting component will react with the previously unreacted reactive moieties of the cross-linking component.
[0098]
In embodiments where the water-soluble cross-linked product is purified by lyophilization, the degree of cross-linking is increased in the lyophilization process if the unreacted reactive portion of the remaining cross-linking component is not inactivated (by the inactivating molecule). There is a possibility that. Given that the above hypothesis regarding the mechanism by which crosslinks are formed is based on the proximity of the reactants, lyophilization may, to some extent, simulate the salt precipitation process in one or more aspects. That is, in this embodiment, the degree of cross-linking, and thus the average molecular weight, will be increased compared to before the purification process. Conversely, in another embodiment, the unreacted reactive portion of the cross-linking component is inactivated by the method described above prior to the optional purification process.
[0099]
As already mentioned, the importance of the water-soluble crosslinks prepared by the methods disclosed herein is currently seen primarily in relation to their use in the cross-flow apparatus described in detail below. Accordingly, the inventor has provided a suitable cross-flow apparatus analysis that allows a skilled technician to select an effective and preferred water-soluble cross-linked product prepared by the method of the present invention.
[0100]
That is, Example 7A discloses a test for the sensitivity of water-soluble crosslinked conjugates prepared by the methods disclosed herein. Note that this test is only appropriate for conjugates where the signal component is a visible dye and the primary targeting component is a rabbit anti-human CRP when used exactly as described herein. I have to leave. However, a skilled engineer will know how to extend this test to include other signal components and, more importantly, other primary targeting components.
[0101]
As will be appreciated by those skilled in the art and as will be apparent from the examples provided herein, the methods disclosed herein do not necessarily produce a “one type” of conjugates, but a certain molecular weight distribution. To produce a conjugate having From the above tests, it can be assessed whether the resulting water-soluble cross-linked product is deemed suitable for that purpose, or whether further purification / fractionation is desirable.
[0102]
The inventor has found that in a very interesting embodiment of the invention, the water-soluble cross-linked product obtained in the precipitation step a) is further purified / fractionated by gel filtration. Thus, for example, a water-soluble cross-linked product that is very suitable for use in a cross-flow device system can be obtained by re-dissolving in an aqueous medium and then, for example, gel material Sephacryl ™ HR S-500 or Sephacryl ™ HR S-1000. A conjugate that elutes into the interstitial volume when gel filtration is performed (using conditions specified in the examples disclosed herein).
[0103]
As mentioned earlier, this water soluble cross-linked conjugate is “large” compared to known conjugates. As will be appreciated by those skilled in the art and as described above, the conjugate prepared by the method disclosed herein does not yield a uniform, single weight conjugate, The resulting conjugate will have a certain molecular weight distribution. The different types of average molecular weights of such heterogeneous conjugates can be determined using a number of possible methods known to the skilled artisan. However, a very suitable method is, for example, ultracentrifugation analysis, in particular the light scattering method.
[0104]
Thus, in an interesting embodiment of the present invention, the mass average molecular weight of the conjugate obtained by the method disclosed herein is at least 2 × 10⁶ , At least 3x10⁶ , At least 4x10⁶ , At least 5x10⁶ , At least 6x10⁶ , At least 7x10⁶ , At least 8x10⁶ , At least 9x10⁶ , At least 10⁷ , At least 2x10⁷ , At least 3x10⁷ , At least 4x10⁷ , At least 5x10⁷ , At least 6x10⁷ , At least 7x10⁷ , At least 8x10⁷ , At least 9x10⁷ , At least 10⁸ , At least 2x10⁸ , At least 3x10⁸ , At least 4x10⁸ , At least 5x10⁸ , At least 6x10⁸ , At least 7x10⁸ , At least 8x10⁸ , At least 9x10⁸ , At least 10⁹ , At least 2x10⁹ , At least 3x10⁹ , At least 4x10⁹ , At least 5x10⁹ ,
[0105]
At least 6 x 10⁹ , At least 7x10⁹ , At least 8x10⁹ , At least 9x10⁹ , At least 10^Ten , At least 2x10^Ten , At least 3x10^Ten , At least 4x10^Ten , At least 5x10^Ten , At least 6x10^Ten , At least 7x10^Ten , At least 8x10^Ten , At least 9x10^Ten , At least 10¹¹ , At least 2x10¹¹ , At least 3x10¹¹ , At least 4x10¹¹ , At least 5x10¹¹ , At least 6x10¹¹ , At least 7x10¹¹ , At least 8x10¹¹ , At least 9x10¹¹ , At least 10¹² , At least 2x10¹² , At least 3x10¹² , At least 4x10¹² , At least 5x10¹² , At least 6x10¹² , At least 7x10¹² , At least 8x10¹² , At least 9x10¹² Or at least 10¹³ g / mol.
[0106]
The conjugate is preferably as large as possible, but preferably not larger than the pore size of the solid support material (eg, nitrocellulose) used in the cross flow device. This is because the combined body must be able to flow through the hole. In a particularly interesting embodiment of the present invention, the conjugate obtained by the method disclosed herein has a mass average molecular weight of about 10⁶ ~ 10^Ten In the range of Da, preferably 10⁶ ~ 10⁸ In the range of Da, for example about 10⁶ ~ 10⁸ It is in the range of Da.
[0107]
When using weight average molecular weight, individual conjugates are loaded according to their mass ratio in the sample, mi / m. That is, in this context, the term “mass average molecular weight” is defined with reference to Formula II below:
<M> ＝ (1 / m) ΣimiMi (II)
Where <M> is the mass average molecular weight, m is the total mass of the sample (ie, the total mass of the conjugate), and mi is the total mass of the molecule with a molecular weight of Mi (ie, the conjugate).
[0108]
Gel filtration profiles (Figures 3a-3f) show that the molecular weight (3a, c, e) of the conjugate prepared at high ionic strength is greater than the molecular weight (3b, d, f) of the conjugate prepared at low ionic strength. Is clearly shown to be large. That is, an important feature of the present invention is that the conjugate prepared by the method of the present invention is prepared into a water-soluble conjugate based on a polymer prepared by the method described in EP 0 594 772. The difference is that it is remarkably different from the others. The structural differences (degree and nature of crosslinking) resulting from the method of the present invention also work in part and, together with molecular weight differences and other characteristics, have not been previously described for polymer-based water-soluble conjugates The activity action is given.
[0109]
As previously mentioned in connection with the definition of the term “signal component”, the method disclosed herein also has no spacer component, ie, a signal component such as an enzyme or dye molecule is cross-linked by a cross-linking component. It is also suitable for the preparation of water-soluble cross-linked bonds directly attached to the carrier component (An alternative to the formation of water-soluble intermediate conjugatesAs mentioned in).
[0110]
That is, in another aspect, the invention includes at least one carrier component portion, more than one cross-linking component portion, at least one signal component portion, and at least one primary targeting component portion, wherein the signal component is cross-linked. A method for preparing a water-soluble cross-linked product covalently attached to a carrier component via a component comprising:
a) Water-soluble comprising at least one carrier component part, more than one cross-linking component part and at least one signal component part, said signal component being covalently attached to the spacer component via the cross-linking component The intermediate conjugate of
Reacting in an aqueous solution under conditions where a reversible precipitate is formed via reaction of at least one primary targeting component with unreacted reactive moieties derived from the cross-linking component;
b) re-dissolving the reversible precipitate containing the water-soluble cross-linker in an aqueous medium; and
c) purify water-soluble cross-linked conjugates as desired;
The method comprising:
[0111]
Similarly, the water soluble intermediate conjugate used in the preparation of the water soluble crosslinked conjugate described above is:
I) Water solubility of a carrier component in which at least one water-soluble carrier component is reacted with more than one cross-linking component in an aqueous solution having a pH higher than 7, and the reactive moiety derived from the cross-linking component is covalently attached Forming an aqueous solution comprising a water soluble intermediate precursor comprising a portion;
II) If desired, purify this water-soluble intermediate precursor;
III) A water-soluble intermediate precursor, which may optionally be purified, is subjected to the reaction of the reactive moiety under conditions where at least one signal component and only a portion of the reactive moiety react with the signal component, react in an aqueous solution with a pH higher than 7 to form a water-soluble intermediate conjugate; and
IV) If desired, purify the water-soluble intermediate conjugate obtained in step III);
Can be prepared by a method comprising:
[0112]
As can be seen, the formation of the water-soluble intermediate conjugate in step III) is a different step from the previously described method for preparing the water-soluble intermediate conjugate. In general, step III) above can be performed under conditions very similar to those previously described for the attachment of the signal component to the spacer component. That is, step III) of the method disclosed above in which a water-soluble intermediate conjugate is formed is carried out in an aqueous solution having a pH higher than 7, for example, a pH in the range of about 8-12, preferably about 9-12. In an aqueous solution in the range of 10 to 12, or in the range of 11 to 12, or 11 to 12.
[0113]
Depending on the signal component actually used, the aqueous reaction mixture may contain 0-60% v / v organic scavenger. That is, various amounts of organic scavengers that are miscible with water, such as dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, dimethylformamide (in order to dissolve fairly hydrophobic signal components (eg certain dye molecules) DMF) etc. may need to be added to the aqueous reaction mixture to ensure that the signal component used is sufficiently soluble. It is usually sufficient to carry out the reaction at a temperature in the range of 0-60 ° C, for example in the range of 15-40 ° C, ie in the range of 20-25 ° C.
[0114]
In general, the reaction time is in the range of 1 to 48 hours. Preferably, however, the reaction time is as short as possible, i.e. in the range from 1 to 24 hours, in particular in the range from 1 to 12 hours, for example in the range from 1 to 5 hours.
In a particularly preferred embodiment, dextran with a peak molecular weight of 500,000 is used, a crosslinking component DVS with an activation degree of 20-30% is used, a spacer component BSA is used, a signal component rhodamine B isothiocyanate is used, Using either the targeting component streptavidin or a monoclonal or polyclonal antibody is the component present in the key reversible precipitation step.
[0115]
As previously mentioned, the “key step” of the method described here is step a) where the primary targeting moiety is attached to the intermediate conjugate, and the reaction is such that a reversible precipitate is formed. Is something. Usually, the most expensive reactants used to prepare the conjugates described herein are primary targeting components (such as antibodies and antigens), while at the same time the reversible salt precipitation step is in the preparation of conjugates. This is one of the most time-consuming steps.
[0116]
Furthermore, since the primary target will vary depending on the targeting moiety that is actually to be detected, one very interesting aspect of the present invention involves the water-soluble intermediate conjugate (preferably in solid form) and is reversible. Test kit with instructions for performing a salt precipitation step followed by re-dissolution of the reversible precipitate and final purification of the water-soluble cross-linkage formed thereby (eg, by gel filtration) About. Various variants of this kit are also within the scope of the present invention, including, for example, a set of primary targeting components that are often used for diagnosis / analysis in the food industry, hospitals, and the like. Of course, the kit can also be accompanied by instructions regarding the use of the prepared conjugate in the cross-flow device described herein.
[0117]
Formation of water-soluble crosslinked complex
In another interesting aspect, the present invention does not comprise a conjugate, ligand and secondary targeting component prepared by any of the methods disclosed herein, wherein said ligand is a covalently bound secondary targeting component. A method of preparing a water-soluble cross-linked conjugate complex that is bound and a ligand is non-covalently bound to the primary targeting component of the conjugate:
I) preparing a water-soluble conjugate according to the method disclosed herein;
II) reacting in water solution an optionally purified water soluble cross-linked conjugate with a ligand covalently bound to the secondary targeting moiety;
III) stop the reaction;
IV) Optionally purify the water-soluble cross-linked conjugate complex;
The method comprising:
[0118]
In this context, the term “secondary targeting moiety” refers to a molecule, particularly a biogenic molecule, that selectively binds or selectively binds to a complementary molecule or a complementary structural region of a biogenic substance. Represents a molecule capable of reacting with Thus, the secondary targeting component can be selected from the same class of molecules described above in connection with the term “primary targeting component”, ie, examples of interesting secondary targeting components include, for example: Is like:
[0119]
Antigens; haptens; monoclonal and polyclonal antibodies; gene probes; natural and synthetic oligo- and polynucleotides; natural and synthetic mono-, oligo- and polysaccharides; lectins; avidin; streptavidin; biotin; Protein A and protein G; and mixtures thereof. In a particularly preferred embodiment of the invention, the secondary targeting component is anti-hCG.
[0120]
As used herein, the term “ligand” has a high affinity for the actual primary targeting moiety used and is thermodynamically stable between the primary targeting moiety present in the water-soluble cross-linked conjugate and the ligand. It is intended to mean a molecule such that a non-covalent bond is established. Thus, in certain preferred embodiments of the invention, the ligand / primary targeting moiety has a binding constant between the primary targeting moiety of the conjugate and the ligand of at least 10⁶ , Preferably at least 10⁸ For example, at least 10^Ten More preferably at least 10¹¹ For example at least 10¹² , Especially at least 10¹³ For example at least 10¹⁴ Ie, at least 10¹⁵ l / mol.
[0121]
As mentioned above, the choice of ligand will of course depend on the primary targeting component actually used. Specific examples of suitable ligands are, for example, biotin, anti-dinitrophenol, or anti-dioxygenin, especially biotin.
[0122]
In a very interesting embodiment of the invention, the ligand / primary targeting component used is a “biotin / streptavidin system” or “biotin / avidin system”, ie the ligand is biotin and the primary target The chemical component is streptavidin or avidin. As noted above, since the ligand used must be covalently bound to the secondary targeting moiety, biotinylated compounds, such as biotinylated antibodies, can be readily obtained, as will be appreciated by those skilled in the art. Available.
[0123]
It can be prepared, for example, as described in Kendall et al., Journal of Immunological Methods (1993), 56, 329-339. Thus, preparing a water-soluble cross-linked conjugate by the methods disclosed herein provides a useful “template” to which a biotinylated secondary targeting moiety of interest can be attached. However, it is understood that a “hapten / antibody system” may also be useful as a ligand / primary targeting moiety if the binding constant between the antibody used and the hapten used satisfies the conditions indicated above. It will be.
[0124]
The above reaction step II) is usually carried out at room temperature, after which the reaction is terminated, for example by changing the pH of the reaction mixture and / or adding an excess of free ligand, eg biotin [step III)].
As will be appreciated by those skilled in the art, the water soluble cross-linked conjugate complex can be purified by the same methods as previously described in connection with the purification of the water soluble cross-linked conjugate. In addition, it should be noted that the conjugate complex can of course be isolated in solid form in a manner similar to that previously described in connection with the conjugate.
[0125]
Since water soluble cross-linked conjugates and water soluble cross-linked conjugate complexes are a new class of compounds, another aspect of the present invention is that at least one carrier component portion, more than one type of cross-linking component portion, and at least one spacer. Comprising a component part, at least one signal component part and at least one primary targeting component part, wherein the signal component is covalently attached to the spacer component, and the spacer component is covalently attached to the carrier component via a cross-linking component. A water-soluble cross-linked body attached,
[0126]
Signal components are dyes, proteins (such as ferritin, phycoerythrin, phycocyanin, and phycobilin), enzymes (such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, galactosidase, and urease), fluorescence, luminescent, phosphorescent and other luminescent materials; Metal chelates (eg, iminodiacetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), and desferrioxamine B), radioisotope-labeled substances, substances labeled with heavy atoms, and Selected from the group consisting of:
The spacer component relates to the water-soluble cross-linked product, wherein the spacer component is selected from the group consisting of proteins and polypeptides.
[0127]
Yet another aspect of the invention includes a water-soluble cross-linker as defined herein, a ligand, and a secondary targeting moiety, wherein the ligand is covalently bound to the secondary targeting moiety and the ligand is non-binding. The present invention relates to a water-soluble cross-linked conjugate complex characterized in that it is bound to a primary targeting component of the conjugate by covalent bond.
[0128]
As will be appreciated, details regarding the nature and composition of the water-soluble cross-linked conjugates and water-soluble cross-linked conjugate complexes of the present invention can be found in the water-soluble cross-linked conjugates and water-soluble cross-links described in connection with the method embodiments above. The same or similar details regarding the nature and composition of the conjugate complex. This means that wherever applicable, statements made in connection with method aspects, as such, apply to conjugates and conjugate complexes, as such.
[0129]
Apparatus and utilization of conjugates and conjugate complexes
The invention also relates to a cross flow device for determining the presence or absence of at least one targeting component in a liquid sample, wherein the cross flow device is:
I) A test piece having an application part, a deposition part, and a detection part and arranged so that a liquid sample can flow from the application part through the deposition part to the detection part;
II) at least one dry deposit of a defined conjugate as defined herein, or at least one dry deposit of a conjugate complex as defined herein, or a mixture thereof, disposed in the deposit of the specimen;
III) At least one targeting component capable of selectively binding or selectively reacting with one or a plurality of targeting components present in a liquid sample, the targeting component being fixed to the detection portion of the test strip ;
Have
[0130]
In another interesting aspect, the present invention is a method for determining the presence or absence of at least one targeting component in a liquid sample:
I) Add the liquid sample to the application part of the cross flow device as defined here;
II) If desired, add wash buffer to the application section of the cross-flow device;
III) Let the added liquid and, if applicable, the washing buffer, leave for a sufficient time to flow from the application section through the deposition section to the detection section; and
IV) Determine the presence or absence of a signal at the detector;
The method comprising:
[0131]
The conjugate and / or conjugate complex of the present invention is dissolved in the deposit portion of the test strip, and when wet, the conjugate and / or conjugate complex is dissolved (detected by capillary force) into the detection portion of the test strip. It is supported (as a dry deposit) so that it can be transported.
[0132]
The targeting component supported by the detection portion of the test strip is supported in such a way that the targeting component remains stationary and therefore cannot be transported by capillary forces. Thus, the targeting component can be supported on the test strip, for example, by adsorption, covalent bonding, and the like. Means for immobilizing targeting components such as antibodies and antigens on a support material are generally known to those skilled in the art.
In certain embodiments of the invention, the so-called “sandwich” method is used for test analysis in any variation known to those skilled in the art.
[0133]
As will be appreciated by those skilled in the art, the so-called “application” portion of the test strip, ie the portion of the test strip that will be wetted with the sample containing the targeting component (ie, analyte) to be detected, May be the same as the deposit part. Thus, in one interesting embodiment of the invention, the sample containing the targeting component to be detected is applied directly to the portion of the test strip containing the conjugate and / or conjugate complex.
[0134]
The test strip is such that the targeted component can be absorbed from the applied sample, and when wet, the flow of the targeted component due to capillary attraction is passed from the application part through the deposit part (where the conjugate And / or melt the dry deposit of the conjugate complex, which allows it to bind to the targeting component and be carried together).
[0135]
The test strips used are made from materials that can support the conjugates and / or conjugate complexes of the invention and targeting components such as antibodies and / or antigens. Examples of suitable materials from which the test strip can be made include, for example, glass fiber, cellulose, nylon, cross-linked dextran, various chromatographic papers, cellulose esters such as nitrocellulose, and the like. Currently the most preferred material is nitrocellulose.
[0136]
It is called a “test piece”, and in the same plane, various parts are arranged so that the liquid containing the targeting component can flow from the application part through the deposit part to the detection part by capillary attraction. However, the support material may of course be in any form as long as the various parts and flowability requirements are met.
The fluid containing the targeting component to be detected is of a biological origin, such as, but not necessarily, a blood sample, serum sample, plasma sample, urine sample, semen sample, or a mixture thereof. is there.
[0137]
The cross-flow device described herein comprises small amounts of various targeting components such as antigens; haptens; monoclonal and polyclonal antibodies; gene probes; natural and synthetic oligo- and polynucleotides; natural and synthetic mono-, oligo- and poly Saccharides; growth factors; hormones; receptor molecules; and mixtures thereof. Specific examples of targeting components include, for example, hCG, rabbit human CRP, HIV, hepatitis C, chlamydia, herpes, thyroid stimulating hormone (TSH), listeria, salmonella, and the like Mixture of.
[0138]
In certain particularly preferred embodiments of the present invention, the signal component of the water-soluble cross-linked conjugate and / or conjugate complex used is a dose that can be directly detected by the naked eye. Thus, when such a conjugate / conjugate complex is used in the lateral flow device disclosed herein, it is possible to visually determine the presence or absence of a targeting component in the applied liquid sample. However, while another embodiment of the present invention uses a conjugate / conjugate complex as described herein, the signal component is present in the detector when applied to the individually disclosed crossflow device. After adding a reactive agent, it becomes detectable with the naked eye.
[0139]
As stated previously, the conjugates of the present invention are considerably "larger" than the conjugates disclosed in the prior art. While it may be difficult to determine the exact structure of a conjugate according to the present invention, extensive cross-linking has occurred, which causes the size of the conjugate (and hence the mass average molecular weight) to increase. Is currently considered. As will be apparent from the examples disclosed herein, the higher the molecular weight, the better performance (ie, higher sensitivity) that can be tested with the “standard cross-flow performance test” described in Example 7A. Seems to be a general rule.
[0140]
Note that the crossflow device disclosed in EP 0 291 194 A is an example of a suitable crossflow device that can incorporate the water-soluble crosslinked and / or conjugate complexes of the present invention. I have to do it. The contents of EP 0 291 194 are hereby incorporated by reference.
[0141]
In yet another aspect, the present invention also relates to the use of water-soluble cross-linked conjugates as defined herein and of water-soluble cross-linked conjugate complexes as defined herein in immunochemical analysis procedures. Enzyme immunoassay (EIA) such as ELISA, radioimmunoassay (RIA), turbidimetric and turbidity immunoassay, immunohistochemical method, cytochemical method, flow cytometry,in situHybridization methods, membrane hybridization methods, Southern and Northern blotting methods, biosensors, cross-flow devices, or methods based on lectin / carbohydrate interactions.
[0142]
The invention is further illustrated by the examples described below.
Experiment
Example 1 : Formation of water-soluble intermediate precursors
Example 1A.peak MW But 500,000 as well as 2,000,000 Of dextran DVS activation
Five separate solutions (A, B, C, D, and E) containing the same amount of dextran (obtained from Pharmacia, Sweden), different concentrations of DVS, and 0.25 mg sodium borohydride / ml Prepared in M dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide (pH 11.5) to obtain the following final concentrations:
[0143]
[Table 1]

[0144]
Dextran was dissolved in water at room temperature (20-25 ° C). To this solution, the same amount of 0.5 M dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide (pH 11.5) and 0.25 mg borohydride / ml were added. After the sodium borohydride dissolved, the reaction mixture was transferred to a well-ventilated hood and DVS (Merck Cat. No. 821215) was added. The mixture was slowly stirred for 30 minutes by a magnetic stirrer. After activation, the pH of the reaction mixture was adjusted to pH 7 with 25% (v / v) hydrochloric acid.
All five samples were fully dialyzed against water to remove excess reactants. After dialysis, the volume of each solution was measured and the final dextran concentration was calculated.
[0145]
The amount of free reactive vinyl groups was determined by reacting with a large excess of sodium thiosulfate, followed by titration of the resulting hydroxide ions with standardized hydrochloric acid. The reaction of free vinyl groups with thiosulfate occurs according to the following reaction scheme (Porath et al. (1975) J. Chromatogr. 103, 49):
(Substrate) -O-CH₂-CH₂-SO₂-CH = CH₂ + S₂O_Three ^2- + H₂O →
(Substrate) -O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂ -S₂O_Three ^- + OH^-
[0146]
Titration results (see table below) are preferably expressed in μmoles of vinyl groups per gram of dextran and / or in moles of vinyl groups per mole of dextran. The average number of activated glucose units was calculated as a percentage of the total amount of glucose units in the dextran molecule (dextran with a peak MW of 500,000 has an average of 2,778 glucose units / dextran molecules and the peak MW is 2,000,000 dextrans have an average of 11,112 glucose units / dextran molecules):
[0147]
[Table 2]

[0148]
Example 1B.peak MW But 500,000 Epichlorohydrin Activity of Dextran Conversion
Three separate solutions (A, B, and C) with the same amount of peak MW containing 500,000 dextran were prepared to the following final concentrations:
[0149]
[Table 3]

[0150]
Dextran was dissolved in water at room temperature (20-25 ° C.). To this solution was added sodium hydroxide, the mixture was transferred to a well-ventilated hood, and epichlorohydrin (Merck Cat. No. 903296) was added. The mixture was slowly stirred with a magnetic stirrer for 5 hours. After activation, the pH of the reaction mixture was adjusted to pH 7 with 25% (v / v) hydrochloric acid.
[0151]
All three samples were fully dialyzed against water to remove excess reactants. After dialysis, the volume of each solution was measured and the final dextran concentration was calculated.
The amount of free reactive epoxy groups was determined by reacting with a large excess of sodium thiosulfate, followed by titration of the resulting hydroxide ions with standardized hydrochloric acid, as described in Example 1A. .
[0152]
The results obtained were as follows:
[Table 4]

In the examples given, it can be seen that both DVS and EPCH serve well as activators for high and low molecular weight dextrans.
[0153]
Example 2 : Formation of second water-soluble intermediate precursor
Example 2A.peak MW But 500,000 as well as 2,000,000 of DVS Bovine serum albumin to activated dextran (BSA) Binding
Five solutions of DVS-activated dextran (A, B, C, D, and E) were bound to BSA. The procedure for binding BSA to DVS-activated dextran was as follows:
[0154]
solution A: 60 mg DVS-activated dextran (peak MW 500,000, prepared as described in “Solution A” in Example 1A) and 200 mg BSA in dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide buffer, pH 10 .4, dissolved.
solution B: 30 mg DVS-activated dextran (peak MW 500,000, prepared as described in “Solution A” in Example 1A) and 200 mg BSA in dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide buffer, pH 10 .4, dissolved.
[0155]
solution C152 mg DVS-activated dextran (peak MW 2,000,000, prepared as described in “Solution C” in Example 1A) and 500 mg BSA in dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide buffer, pH 10 .4, dissolved.
solution D152 mg DVS-activated dextran (peak MW 2,000,000, prepared as described in “Solution D” in Example 1A) and 500 mg BSA in dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide buffer, pH 10 .4, dissolved.
solution E152 mg DVS-activated dextran (peak MW 2,000,000, prepared as described in “Solution E” in Example 1A) and 500 mg BSA in dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide buffer, pH 10 .4, dissolved.
[0156]
After the BSA was dissolved, buffer was added to achieve the following final concentration:
17mg BSA / ml
5.2mg DVS-activated dextran / ml
10 mM dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide buffer, pH 10.4
Binding was performed at 30 ° C. for 18 hours, after which the reaction was stopped by adding 1M hydrochloric acid to adjust the pH of the solution to pH 6-7.
[0157]
The amount of bound BSA was determined by gel filtration on a Sephacryl HR S-300 (Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0599-01). All gel filtrations were performed by FPLC (Pharmacia, Sweden) using a Pharmacia column (Cat. No. XK26 / 40) with Sephacryl HR S-300 having a diameter of 2.7 cm and a bed volume of 230 ml. Gel filtration was performed in 100 mM sodium chloride with a flow rate of 3 ml / min and a maximum sample load of 20 ml. Fractionation was monitored using a UV monitor (Pharmacia, Sweden, Cat. No. 19-2448-01 / 18-0601-01) and a pen recorder (Pharmacia, Sweden, Cat. No. 19-8004-01) .
[0158]
Separation on Sephacryl HR S-300 yielded two peaks collected in two separate fractions.
When using the gel filtration method, large molecules that exceed the so-called “exclusion limit” of the gel cannot enter the pore (pore), and therefore such large molecules elute from the column into the so-called “void volume” That is, the void volume is the volume between individual beads. Usually the void volume is about 1/3 of the total volume of the column.
OD280nm was measured for both the collected fractions and the results obtained were expressed as the number of BSA molecules attached to one average MW dextran molecule corresponding to the dextran peak MW. The results obtained are summarized below.
[0159]
[Table 5]

[0160]
The above values can be calculated as described below:
The binding performed by 30 mg dextran (peak MW 500,000) and 200 mg BSA (ie the molar ratio in solution is dextran: BSA = 1: 25) can be calculated as follows:
A = OD280nm, 1cm cuvette, peak 1 from Sephacryl S-300;
B = OD280nm, 1cm cuvette, peak 2 from Sephacryl S-300;
C = Peak 1 volume (unit: ml)
D = Peak 2 volume (unit: ml)
ε (BSA, 280 nm, 1 cm, 1 mg / ml) = 0.65;
[0161]
Peak 1 mgBSA = (A x C) / 0.65 = YmgBSA;
Peak 2 mgBSA = (B x D) / 0.65 = ZmgBSA;
Percentage of bound BSA = (Y × 100) / (Y + Z);
Moles of bound BSA / 1 mole of dextran = (specific dextran: BSA ×% of bound BSA) / 100;
The first peak containing BSA bound to dextran (ie, the peak obtained with Sephacryl HR S-300 void volume) is referred to below as the “Dex-BSA” conjugate.
[0162]
The “Dex-BSA” conjugate was measured with Sephacryl HR S-500 (Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0613-01). All gel filtration was performed by FPLC (Pharmacia, Sweden) using an FPLC column (Cat. No. HR 10/30, Pharmacia, Sweden) with Sephacryl HR S-500 with a bed volume of 25 ml. Gel filtration was performed in 100 mM sodium chloride at a flow rate of 1 ml / min and a maximum sample load (in each run) of 100-500 μl.
[0163]
Separation with Sephacryl HR S-500 gave two partially fused peaks. The first peak (Peak 1) eluted after 8 ml in the “void volume” (25 ml Sephacryl HR S-500 void volume is 8 ml).
The Sephacryl HR S-500 measurement was expressed as the percentage of “Dex-BSA” conjugate (hereinafter referred to as “conjugate eluted in void volume”) in the first peak of the profile. By calculating the size of the fractions, the fractions were measured from the start of the peak to mark 5.25 (ie 10.5 ml from the start of gel filtration). The results obtained were as follows:
[0164]
[Table 6]

[0165]
Example 2B.peak MW But 500,000 Epichlorohydrin - Activated dextran and bovine serum albumin (BSA) Binding
Three solutions (A, B, and C) of epichlorohydrin activated dextran were coupled to BSA (Boehringer Mannheim Cat. No. 100 350). The procedure for binding BSA to DVS-activated dextran was as follows:
solution A: 90 mg epichlorohydrin activated dextran (peak MW 500,000, prepared as described in “Solution A” in Example 1B) and 300 mg BSA in dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide buffer Solution, pH 10.4.
[0166]
solution B: 90 mg epichlorohydrin activated dextran (peak MW 500,000, prepared as described in “Solution B” in Example 1B) and 300 mg BSA in dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide buffer Solution, pH 10.4.
solution C: 90 mg epichlorohydrin activated dextran (peak MW 500,000, prepared as described in “Solution C” in Example 1B) and 300 mg BSA in dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide buffer Solution, pH 10.4.
[0167]
After the BSA was dissolved, buffer was added to the final concentration:
18mg BSA / ml
5.5mg epichlorohydrin activated dextran / ml
10 mM dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide buffer, pH 10.4
Binding was performed at 30 ° C. for 18 hours, after which the reaction was stopped by adding 1M hydrochloric acid to adjust the pH of the solution to pH 6-7.
The amount of bound BSA was determined by gel filtration on Sephacryl HR S-300 as described in Example 2A.
[0168]
The results obtained were as follows:
[Table 7]

[0169]
The “Dex-BSA” conjugate was then measured on a Sephacryl HR S-500 as described in Example 3A. Separation with Sephacryl yielded two peaks, but no “Dex-BSA” conjugate peak was observed in the void volume fraction.
From the examples given, it can be derived that two different types of dextran activation give satisfactory binding yields using BSA as a spacer component.
[0170]
Example Three : Formation of water-soluble intermediate conjugate
Example 3A.DVS Activated dextran BSA Binding of rhodamine dyes to conjugates.
Three solutions (A, B, and C) of “Dex-BSA” with two different peak MW dextrans (peak MW of 500,000 and 2,000,000, respectively) were added to rhodamine B isothiocyanate (Sigma, Cat. No. R 1755, Rhodamine ITC).
[0171]
solution A: "Dex-BSA" with peak MW 500,000 was coupled to 17 moles BSA / mole dextran as described for "Solution A" in Example 2A.
solution B: "Dex-BSA" with peak MW 500,000 was coupled to 17 moles BSA / mole dextran as described for "Solution A" in Example 2A.
solution C: "Dex-BSA" with a peak MW of 2,000,000 was coupled to 48 moles BSA / mole dextran as described for "Solution C" in Example 2A.
[0172]
Three separate solutions were mixed with 20 mg BSA (as “Dex-BSA”) and rhodamine ITC (from a solution stock of 5 mg rhodamine ITC / ml DMSO) to buffer to the following final concentrations:
Solution A: 400μg rhodamine ITC / ml and 2mgBSA / ml
Solution B + C: 200 μg rhodamine ITC / ml and 2 mg BSA / ml
All three solutions contained 30% DMSO and 0.2M sodium bicarbonate and had a pH of 8.6.
[0173]
Binding was performed at 30 ° C. for 3 hours, after which the solution was dialyzed extensively against 10 mM potassium phosphate, pH 7.2 to remove the reactants.
After dialysis, the volume of each solution was measured to calculate the amount of “Dex-BSA” (hereinafter referred to as “Dex-BSA-rhodamine” conjugate) bound to rhodamine ITC. The optical density (1 cm cuvette) at 558 nm was measured for all samples and the absorbance unit (EU) was calculated for each sample. The results obtained were as follows:
[0174]
[Table 8]

[0175]
As seen in the table above, the amount of rhodamine ITC bound is expressed as OD558EU / mgBSA. This value is calculated as follows:
A = volume of "Dex-BSA-rhodamine" solution after dialysis
B = mgBSA used for binding
Combined OD558EU / mgBSA = (A × OD558) / B
The properties of this “Dex-BSA-rhodamine” conjugate are Sephacryl HR S-500 (Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0613-01) and Sephacryl S-300 (Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0599). -01).
[0176]
All gel filtration was performed as described in Example 2A for S-500 gel filtration by FPLC (Pharmacia, Sweden) with a bed volume of 25 ml Sephacryl HR S-300 or 25 ml Sephacryl HR S-500 (Cat. HR 10/30, Pharmacia, Sweden). Gel filtration was performed in 50 mM Tris 0.1 M sodium chloride, 1% v / v Tween 20 adjusted to pH 9 with 1 M hydrochloric acid. The flow rate was 1 ml / min and the sample load was 100-500 μl (with each run) depending on the concentration. The results obtained were as follows:
[0177]
[Table 9]

[0178]
Example 3B.With rhodamine dye EPCH Activated dextran BSA Coupling with conjugate
Three solutions (A, B and C) of “Dex-BSA” with a peak molecular weight of 500,000 were conjugated with rhodamine B isothiocyanate (Sigma, catalog number R1755, rhodamine ITC).
[0179]
solution A: “Dex-BSA” having a peak molecular weight of 500,000 combined with 4 mol BSA / 1 mol dextran similar to “Solution A” in Example 2B.
solution B: “Dex-BSA” with a peak molecular weight of 500,000 combined with 5 mol BSA / 1 mol dextran similar to “Solution B” in Example 2B.
solution C: “Dex-BSA” with a peak molecular weight of 500,000 combined with 6 mol BSA / 1 mol dextran similar to “Solution C” in Example 2B.
[0180]
Three separate solutions containing 6 mg BSA (as “Dex-BSA”) and rhodamine ITC (from 5 mg rhodamine ITC / 1 ml DMSO stock solution) were mixed with buffer to give the following final concentrations: Obtained:
200μg rhodamine ITC / ml
0.5 mg BSA / ml
30% dimethyl sulfoxide
0.2M sodium bicarbonate, pH 8.6
Coupling and subsequent dialysis was performed as in Example 3A.
After dialysis, the optical density at 558 nm (1 cm cuvette) was measured for all samples, and the absorbance unit (EU) was calculated for each sample. The results obtained are shown below:
[0181]
[Table 10]

[0182]
The Dex-BSA-Rhodamine complex was characterized for Sephacryl HR S-500 and Sephacryl S-300 as described in Example 4A. The only difference was the eluent containing 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 0.5% v / v Tween-20 adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid. The results obtained are shown below:
[0183]
[Table 11]

[0184]
Example 3C.Cy5 With dye DVS Activated dextran BSA Coupling with conjugate
Two solutions (A and B) of “Dex-BSA” with a peak molecular weight of 500,000 were conjugated with Cy5-OSu monofunctional reactive dye (Amersham Pharmacia Biotec UK, catalog number PA 15102).
solution A and B: “Dex-BSA” with a peak molecular weight of 500,000 combined with 17 mol BSA / 1 mol dextran similar to “Solution A” in Example 2A.
Two separate solutions containing BSA (as “Dex-BSA”) and Cy5 (from 8 mg C strong / 1 ml DMSO stock solution) were mixed with buffer to give the following final concentrations: :
[0185]
solution A: 2 mg BSA / ml, 4000 μg Cy5 / ml, 50% DMSO, 0.05 M sodium bicarbonate, pH 8.6.
solution B: 1 mg BSA / ml, 4000 μg Cy5 / ml, 50% DMSO, 0.05 M sodium bicarbonate, pH 8.6.
Coupling and subsequent dialysis was performed as in Example 3A. The only difference was that the reaction time was reduced to 2 hours.
After dialysis, the optical density at 655 nm (1 cm cuvette) was measured for all samples and the absorbance unit (EU) was calculated for each sample. The results obtained are shown below:
[0186]
[Table 12]

[0187]
Example 3D.With reactive orange dye DVS Activated dextran BSA Coupling with conjugate
A solution of “Dex-BSA” with a peak molecular weight of 500,000 combined with 17 moles of BSA / 1 mole of dextran similar to “Solution A” of Example 2A was reacted with Reaction Orange 16 (Aldrich, catalog number 30.650-9). Combined.
[0188]
A solution containing 10 mg BSA (as “Dex-BSA”) and Reaction Orange 16 (from a stock solution of 5 mg Reaction Orange 16/1 ml DMSO) is mixed with buffer to give the following final concentrations: Obtained:
5 mg BSA / ml
250μg reaction orange 16 / ml
5% DMSO
0.4 M potassium phosphate, pH 10.4
Coupling and subsequent dialysis was performed as in Example 3A. The only difference was that the reaction time was increased to 18 hours.
After dialysis, the optical density at 493 nm (1 cm cuvette) was measured for all samples, and the absorbance unit (EU) was calculated for each sample. The results obtained are shown below:
[0189]
[Table 13]

[0190]
The “Dex-BSA-reacted orange 16” complex was characterized for Sephacryl HR S-500 and Sephacryl HR S-300 as in Example 3A. The only difference was the eluent containing 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 0.5% v / v Tween-20 adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid. The results obtained are shown below:
[0191]
[Table 14]

[0192]
Example 3E.Uni Blue A With dye DVS Activated dextran BSA Coupling with conjugate
A solution of “Dex-BSA” with a peak molecular weight of 500,000 combined with 17 mol of BSA / 1 mol of dextran similar to “Solution A” of Example 2A is combined with Uniblue A (Sigme, catalog number 29.840-9). I let you.
[0193]
A solution containing 10 mg BSA (as “Dex-BSA”) and Uniblue A (from 5 mg Uniblue A / 1 ml DMSO stock solution) was mixed with the buffer to give the following final concentrations: :
5 mg BSA / ml
500μg Uni Blue A / ml
10% DMSO
0.4 M potassium phosphate, pH 10.4
Coupling and subsequent dialysis was performed as in Example 3A.
After dialysis, the optical density at 595 nm (1 cm cuvette) was measured for all samples, and the absorbance unit (EU) was calculated for each sample. The results obtained are shown below:
[0194]
[Table 15]

[0195]
The “Dex-BSA-Uni Blue A” complex was characterized for Sephacryl HR S-500 and Sephacryl HR S-300 as in Example 3A. The only difference was the eluent containing 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 0.5% v / v Tween-20 adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid. The results obtained are shown below:
[Table 16]

[0196]
From certain examples, a number of different dyes are obtained that are efficiently attached to the Dex-BSA intermediate that has been activated with DVS or EPCH.
[0197]
Example Four:Formation of water-soluble intermediate complex
Example 4A.Rabbit anti-human at high ionic strength CRP When DVS activation" Dex-BSA- Coupling of "Rhodamine" conjugates
Five solutions of the “Dex-BSA-Rhodamine” complex (A, B, C, D and E) were conjugated with rabbit anti-human CRP immunoglobulin fraction (DAKO, Denmark, catalog number Q 0329).
solution A and D: “Dex-BSA-Rhodamine” with a peak molecular weight of 500,000 combined with 29 OD 558 units / 1 mg BSA similar to “Solution A” in Example 3A.
solution B , C and E: “Dex-BSA-Rhodamine” with a peak molecular weight of 500,000 combined with 13 OD 558 units / 1 mg BSA similar to “Solution B” in Example 3A.
[0198]
The following solutions containing the antibody and “Dex-BSA-Rhodamine” were prepared:
solution A and B: 0.0016 μmol of antibody and 0.000645 μmol of dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8 to give the following final concentrations:
1.75 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.24 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / antibody: 1 / 2.5

[0199]
solution C: 0.007742 μmol of antibody and 0.001548 μmol of dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8 to give the following final concentrations:
2.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.21 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / Antibody: 1/5

[0200]
solution D: 0.003226 μmol of antibody and 0.00129 μmol of dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8 to give the following final concentrations:
2.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.13 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / antibody: 1 / 2.5

[0201]
solution E: 0.0016 μmol of antibody and 0.000645 μmol of dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8 to give the following final concentrations:
2.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.15 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / antibody: 1 / 2.5

[0202]
After mixing, a precipitate was observed in the solution and antibody coupling was allowed to continue for 18 hours at 4-6 ° C. After coupling, cysteine (Merck, catalog number 1.02838) was added to the sample to a final concentration of 0.01 M cysteine. The concentration of phosphate buffer in solutions C, D and E was adjusted to 1.75 M by addition of deionized water to the solution. All five solutions were spun at 10,000 rpm for 5 minutes and the clear, almost colorless supernatant was carefully aspirated with a pipette. The precipitate (pellet) containing free antibody and bound antibody was dissolved in deionized water.
[0203]
The pellets from solutions A and B were dissolved in 400 μl deionized water and Tween 20 was added to a final concentration of 1% v / v.
The pellet from solution C was dissolved in 700 μl deionized water and dialyzed for 1 hour against 50 mM Tris and 0.1 M sodium chloride adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid. After dialysis, Tween 20 was added to a final concentration of 0.5% v / v.
The pellets from solutions D and C were dissolved in 500 μl deionized water and Tween 20 was added to a final concentration of 0.5% v / v.
[0204]
Free antibody and “Dex-BSA-Rhodamine” -bound antibody in the sample were separated by gel filtration on Sephacryl HR S-300 (Pharmacia, Sweden, catalog number 17-0599-01). All gel filtrations were performed on FPLC (Pharmacia, Sweden) using a Pharmacia column (catalog number HR 10/30) with a 1 cm diameter and 25 ml bed volume Sephacryl HR S-300. Gel filtration of solutions A and B was performed in 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 1% v / v Tween 20 adjusted to pH 9 with 1 M hydrochloric acid. Gel filtration of solutions C, D and E was performed in 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, Tween 20 adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid (concentration of tween 20 in solutions C and D: 0.5% v / v, concentration of tween 20 in solution E: 0.1% v / v). All gel filtrations were performed at a flow rate of 1 ml / min.
[0205]
Separation on Sephacryl HR S-300 yielded two peaks. Peak 1 from Sephacryl HRS-300 containing rabbit anti-human CRP bound to “Dex-BSA-Rhodamine ITC” is hereinafter referred to as “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” complex.
Collect “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” complex (obtained from “Solution B”) as a fraction from 8 to 10.5 ml (from mark 4 to 5.25 in the profile shown in FIG. 1) did.
[0206]
OD558 was measured for the “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” complex, and then the complex was characterized on Sephacryl HR S-500 (Pharmacia, Sweden, catalog number 17-0613-01). All gel filtrations were performed by FPLC (Pharmacia, Sweden) using an FPLC column (catalog number HR 10-30, Pharmacia, Sweden) with a bed volume of 25 ml Sephacryl HR S-500. Gel filtration of solutions A and B was performed in 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 1% v / v Tween 20 adjusted to pH 9 with 1 M hydrochloric acid. Solutions C and E were gel filtered in 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, Tween 20 adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid (Tween 20 concentration of solution C: 0.5% v / v. Solution). E Tween 20 concentration: 0.1% v / v). All gel filtrations were performed at a flow rate of 1 ml / min.
[0207]
Separation on Sephacryl HR S-500 (“Solution B”) resulted in one main peak eluting after 7 ml as shown in FIG. However, two peaks were collected by gel filtration of the complex from solution C. Fraction 1 was collected from 7-10.5 ml and fraction 2 was collected from 10.5-18 ml.
Characterization on Sephacryl HR S-500 is expressed as a percentage of the “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” complex located in the first peak of the profile, hereinafter “elution complex in void volume”. Call. The size of the fractions was from the start of peak 1 to 10.5 ml from the start of gel filtration. The results obtained are shown below:
[0208]
[Table 17]

[0209]
Example 4B.Rabbit anti-human at high ionic strength CRP When EPCH activation" Dex-BSA- Coupling of "Rhodamine" conjugates
A solution of “Dex-BSA-Rhodamine” conjugate was conjugated with rabbit anti-human CRP immunoglobulin fraction (DAKO, Denmark, catalog number Q 0329).
“Dex-BSA-Rhodamine” with a peak molecular weight of 500,000 combined with 25 OD 558 units / 1 mg BSA similar to “Solution C” in Example 3B.
[0210]
The following solutions containing the antibody and “Dex-BSA-Rhodamine” were prepared:
0.003226 μmol of antibody and 0.00129 μmol of dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8 to give the following final concentrations:
2.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.1 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / antibody: 1 / 2.5

[0211]
After mixing, a precipitate was observed in the solution and antibody coupling was allowed to continue for 18 hours at 4-6 ° C. After coupling, cysteine (Merck, catalog number 1.02838) was added to the sample to a final concentration of 0.01 M cysteine. The concentration of phosphate buffer in the solution was adjusted to 1.75 M by addition of deionized water to the solution. The solution was spun at 10,000 rpm for 5 minutes and the clear, almost colorless supernatant was carefully aspirated with a pipette. The pellet containing free and bound antibodies was dissolved in 500 μl deionized water and Tween 20 was added to a final concentration of 0.5% w / v.
[0212]
Free antibody and “Dex-BSA-Rhodamine” -bound antibody in the sample were run on Sephacryl HR S-300 in 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 0.5% Tween 20 adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid. And peak 1 from Sephacryl HR S-300 was characterized on Sephacryl HR S-500 as in Example 4A. Subsequent separation on Sephacryl HR S-500 (similar to Example 4A) yielded two overlapping peaks. The first peak, peak 1, eluted after 7 ml. The results obtained are shown below:
[0213]
[Table 18]

[0214]
Example 4C.High ionic strength hCG With monoclonal antibodies DVS activation" Dex-BSA- Coupling of "Rhodamine" conjugates
A solution of the “Dex-BSA-Rhodamine” complex was conjugated with an anti-hCG monoclonal antibody Mab (Genzyme MIH, batch number M21452).
“Dex-BSA-Rhodamine” with a peak molecular weight of 500,000 combined with 29 OD 558 units / 1 mg BSA similar to “Solution A” in Example 3A.
[0215]
The following solutions containing the antibody and “Dex-BSA-Rhodamine” were prepared:
0.0016 μmol of antibody and 0.00064 μmol of dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8 to give the following final concentrations:
2.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.06 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / antibody: 1 / 2.5

[0216]
After mixing, a precipitate was observed in the solution and antibody coupling was allowed to continue for 18 hours at 4-6 ° C. After coupling, cysteine (Merck, catalog number 1.02838) was added to the sample to a final concentration of 0.01 M cysteine. The concentration of phosphate buffer in the solution was adjusted to 1.75 M by addition of deionized water to the solution. The solution was spun at 10,000 rpm for 5 minutes and the clear, almost colorless supernatant was carefully aspirated with a pipette. The pellet containing free and bound antibodies was dissolved in 500 μl deionized water and Tween 20 was added to a final concentration of 0.5% w / v.
[0217]
Free antibody and “Dex-BSA-Rhodamine” -bound antibody in the sample were run on Sephacryl HR S-300 in 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 0.5% Tween 20 adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid. And peak 1 from Sephacryl HR S-300 was characterized on Sephacryl HR S-500 as in Example 4A. Subsequent separation on Sephacryl HR S-500 (similar to Example 4A) yielded two overlapping peaks. The first peak, peak 1, eluted after 7 ml. The results obtained are shown below:
[0218]
[Table 19]

[0219]
Example 4D.Rabbit anti-human at high ionic strength CRP When DVSH activation" Dex-BSA- Reaction orange 16 Coupling coupling
A solution of the “Dex-BSA-reactive orange 16” complex was conjugated to a rabbit anti-human CRP immunoglobulin fraction (DAKO, Denmark, catalog number Q 0329).
“Dex-BSA-reaction orange 16” with a peak molecular weight of 500,000 combined with 1.4 OD 493 units / 1 mg BSA as in Example 3D.
[0220]
The following solutions containing the antibody and “Dex-BSA-Reaction Orange 16” were prepared:
0.00323 μmol of antibody and 0.00129 μmol of dextran (as “Dex-BSA-reaction orange 16”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8 to give the following final concentrations:
2.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.23 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-reaction orange 16” / antibody: 1 / 2.5

[0221]
After mixing, a precipitate was observed in the solution and antibody coupling was allowed to continue for 18 hours at 4-6 ° C. After coupling, cysteine (Merck, catalog number 1.02838) was added to the sample to a final concentration of 0.01 M cysteine. The concentration of phosphate buffer in the solution was adjusted to 1.75 M by addition of deionized water to the solution. The solution was spun at 10,000 rpm for 5 minutes and the clear, almost colorless supernatant was carefully aspirated with a pipette. The pellet containing free and bound antibodies was dissolved in 500 μl deionized water and Tween 20 was added to a final concentration of 0.5% w / v.
[0222]
The free antibody in the sample and “Dex-BSA-reacted orange 16” -bound antibody were separated from Sephacryl HR S-300 in 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 0.5% Tween 20 adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid. Separated by gel filtration above, peak 1 from Sephacryl HR S-300 was characterized on Sephacryl HR S-500 as in Example 4A. Subsequent separation on Sephacryl HR S-500 (similar to Example 4A) yielded two overlapping peaks. The first peak, peak 1, eluted after 7 ml. The results obtained are shown below:
[0223]
[Table 20]

[0224]
Example 4E.Rabbit anti-human at high ionic strength CRP When DVS activation" Dex-BSA- Uni Blue A Coupling coupling
Two solutions (A and B) of the “Dex-BSA-Uniblue A” conjugate were conjugated with rabbit anti-human CRP immunoglobulin fraction (DAKO, Denmark, catalog number Q 0329).
“Dex-BSA-Uniblue A” with a peak molecular weight of 500,000 coupled to 3OD595 units / 1 mg BSA as in Example 3E.
[0225]
The following solutions containing the antibody and “Dex-BSA-Uniblue A” were prepared:
solution A: 0.0015 μmol antibody and 0.0015 μmol dextran (as “Dex-BSA-Uniblue A”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8 to give the following final concentrations:
2.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.09 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Uni Blue A” / Antibody: 1/1

[0226]
solution B: 0.0030 μmol of antibody and 0.0015 μmol of dextran (as “Dex-BSA-Uniblue A”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8 to give the following final concentrations:
2.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.2 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Uni Blue A” / Antibody: 1/2

[0227]
After mixing, a precipitate was observed in the solution and antibody coupling was allowed to continue for 18 hours at 4-6 ° C. After coupling, cysteine (Merck, catalog number 1.02838) was added to the sample to a final concentration of 0.01 M cysteine. The concentration of phosphate buffer in the solution was adjusted to 1.75 M by addition of deionized water to the solution. Both solutions were spun at 10,000 rpm for 5 minutes and the clear, almost colorless supernatant was carefully aspirated with a pipette. The pellet containing free and bound antibody was dissolved in 500 μl deionized water and Tween 20 was added to a final concentration of 5% w / v.
[0228]
Free antibody in sample and “Dex-BSA-Uniblue A” -bound antibody on Sephacryl HR S-300 in 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 0.5% Tween 20 adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid Separation by gel filtration on, peak 1 from Sephacryl HR S-300 was characterized on Sephacryl HR S-500 as in Example 4A. Subsequent separation on Sephacryl HR S-500 (similar to Example 4A) yielded two overlapping peaks. The first peak, peak 1, eluted after 7 ml. The results obtained are shown below:
[0229]
[Table 21]

[0230]
Example 4F.Rabbit anti-human at high and low ionic strength CRP When DVS activation" Dex-BSA- Of the coupling of "Rhodamine" conjugates
Two solutions (A and B) of the “Dex-BSA-Rhodamine” conjugate were conjugated with rabbit anti-human CRP immunoglobulin fraction (DAKO, Denmark, catalog number Q 0329).
[0231]
solution A and B: “Dex-BSA-Rhodamine” having a peak molecular weight of 500,000 bound to 13OD558 units / 1 mg BSA in the same manner as “Solution B” in Example 3A.
The following solutions containing the antibody and “Dex-BSA-Rhodamine” were prepared:
solution A: 0.01548 μmol of antibody and 0.003097 μmol of dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8 to give the following final concentrations:
2.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.21 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Uni Blue A” / Antibody: 1/5

[0232]
solution B: 0.00645 μmol of antibody and 0.00129 μmol of dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 8.8, and water to give the following final concentrations:
0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.6
0.54 mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / Antibody: 1/5

[0233]
A precipitate was observed in solution A after mixing. Both couplings were continued at 4-6 ° C. for 18 hours. After coupling, cysteine (Merck, catalog number 1.02838) was added to the sample to a final concentration of 0.01 M cysteine. The concentration of phosphate buffer in solution A was adjusted to 1.75 M by addition of deionized water to the solution. Solution A was then spun at 10,000 rpm for 5 minutes and the clear, almost colorless supernatant was carefully aspirated with a pipette. The precipitate (pellet) containing free antibody and bound antibody was dissolved in 1 ml deionized water. The redissolved precipitate (obtained from solution A) and solution B (clear solution without precipitation) were dialyzed against 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid for 1 hour. .
[0234]
Characterization by gel filtration:
Peak 1 obtained from gel filtration on Sephacryl HR S-300 was characterized on Sephacryl HR S-500 and Sephacryl HR S-1000 as in Example 4A.
The profiles obtained from gel filtration on Sephacryl HR S-300, HR S-500 and HR S-1000 are shown in Figures 3a-3f.
[0235]
Example 4G.Of streptavidin at high ionic strength DVS activation" Dex-BSA- Coupling of "Rhodamine" conjugates
Five solutions of “Dex-BSA-Rhodamine” conjugates (A, B, C, D and E) were conjugated with streptavidin (KEM-EN-TEC, Denmark, catalog number 4610H). All samples combined with 25 OD 558 units / 1 mg BSA similar to “Solution A” in Example 3B.
[0236]
The following solutions containing the antibody and “Dex-BSA-Rhodamine” were prepared:
solution A: 0.00833 μmol streptavidin and 0.004165 μmol dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 9, to give the following final concentrations:
2.5 M potassium phosphate buffer, pH 9
0.05 mg streptavidin / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / Streptavidin: 1/2

[0237]
solution B: 0.00833 μmol streptavidin and 0.001667 μmol dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 9, to give the following final concentrations:
2.5 M potassium phosphate buffer, pH 9
0.11 mg streptavidin / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / Streptavidin: 1/5

[0238]
solution C: 0.00833 μmol streptavidin and 0.000833 μmol dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 9, to give the following final concentrations:
2.5 M potassium phosphate buffer, pH 9
0.22 mg streptavidin / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / Streptavidin: 1/10

[0239]
solution D: 0.00833 μmol streptavidin and 0.0004165 μmol dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 9, to give the following final concentrations:
2.5 M potassium phosphate buffer, pH 9
0.42 mg streptavidin / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / Streptavidin: 1/20

[0240]
solution E: 0.00833 μmol streptavidin and 0.000208 μmol dextran (as “Dex-BSA-Rhodamine”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer, pH 9, to give the following final concentrations:
2.5 M potassium phosphate buffer, pH 9
0.71 mg streptavidin / ml
Molar ratio in solution: “Dex-BSA-Rhodamine” / Streptavidin: 1/40

[0241]
After mixing, a precipitate was observed in the solution and streptavidin coupling was allowed to continue at 4-6 ° C. for 18 hours. After coupling, cysteine (Merck, catalog number 1.02838) was added to the sample to a final concentration of 0.01 M cysteine. The concentration of phosphate buffer in the total solution was adjusted to 1.75 M by addition of deionized water to the solution. All five solutions were spun at 10,000 rpm for 5 minutes and the clear, almost colorless supernatant was carefully aspirated with a pipette. A precipitate (pellet) containing free streptavidin and bound streptavidin was dissolved in deionized water.
[0242]
The pellet from all solutions was dissolved in 1 ml deionized water. Dialyzed against 0.1 M sodium chloride adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid and 50 mM Tris for 1 hour. After dialysis, Tween 20 was added to a final concentration of 0.1% v / v, the solution was spun at 1,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant (sample) was carefully aspirated while the remaining complex (Pellets) were not used.
[0243]
Free streptavidin and “Dex-BSA-rhodamine” -bound streptavidin in the sample were separated by gel filtration on Sephacryl HR S-300 (Pharmacia, Sweden, catalog number 17-0599-01). All gel filtrations were performed on FPLC (Pharmacia, Sweden) using Sephacryl HR S-300 Pharmacia columns (catalog number HR 10/30) with a diameter of 1 cm and a bed volume of 25 ml. Total gel filtration was performed in 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 0.1% v / v Tween 20 adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid using a flow rate of 1 ml / min.
[0244]
Separation on Sephacryl HR S-300 yielded two peaks. Peak 1 from Sephacryl HRS-300 containing streptavidin bound to “Dex-BSA-Rhodamine ITC” is hereinafter referred to as the “Dex-BSA-Rhodamine / Streptavidin” complex.
The “Dex-BSA-Rhodamine / Streptavidin” complex was collected as a fraction after 8 to 10.5 ml.
[0245]
OD558 was measured for the “Dex-BSA-Rhodamine / Streptavidin” complex, and then the complex was characterized on Sephacryl HR S-500 (Pharmacia, Sweden, catalog number 17-0613-01). All gel filtrations were performed by FPLC (Pharmacia, Sweden) using an FPLC column (catalog number HR 10-30, Pharmacia, Sweden) with a bed volume of 25 ml Sephacryl HR S-500. Gel filtration of the entire solution was performed in 50 mM Tris adjusted to pH 9 with 1 M hydrochloric acid, 0.1 M sodium chloride, 1% v / v Tween 20, using a flow rate of 1 ml / min.
[0246]
Separation on Sephacryl HR S-500 yielded one main peak eluting after 7 ml.
Characterization on Sephacryl HR S-500 is expressed as a percentage of the “Dex-BSA-Rhodamine / Streptavidin” complex located in the first peak of the profile and is hereinafter referred to as “elution complex in void volume”. The results obtained are shown below:
[0247]
[Table 22]

[0248]
From a given example, it is inferred that a number of different major target components, which are antibodies or specific binding molecules, can be bound to activated dextran carrying spacer component and dye, preferably at high ionic strength. The
[0249]
Example Five:An alternative method for the formation of water-soluble complexes.
Example 5A.Dye and peak molecular weight 2,000,000 Have DVS Coupling with activated dextran
Dextran (peak molecular weight 2,000,000) activated with DVS as in “Solution C” of Example 1A (ie, using 1% (w / v) dextran and 3% (v / v) DVS) did. The activated dextran had a content of 554 μmol reactive vinyl groups per g dextran. The final concentration of DVS activated dextran was 8.3 mg activated dextran / ml.
[0250]
Four separate solutions (A, B, C and D) containing the same concentration of DVS activated dextran were prepared. Buffer was added so that the final concentration of dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide was 0.25 M, the final concentration of sodium chloride was 0.50 M, and the pH of the solution was 11.5.
After filtration through a 0.45 μm filter, a concentrate of the dye (Remazol-Black B Gran, DE HA 725, Hoechst) was added. The final concentrations of DVS activated dextran and dye are shown below:
[0251]
[Table 23]

[0252]
Solutions A, B, C and D were incubated for 3 hours at room temperature (20-25 ° C.). After coupling, the pH of the reaction mixture was adjusted to pH 8 with 1 M hydrochloric acid. All samples were dialyzed extensively against 50 mM sodium chloride to remove unbound dye. After dialysis, the volume of each solution was measured and the final concentration of dextran was calculated.
After dialysis, each sample was measured at OD 600 nm (1 cm cuvette) and characterized by the numerical value of bound OD 600 units / 1 mg dextran. The results of the coupling reaction are listed below:
[0253]
[Table 24]

[0254]
The number of bound OD 600 units / 1 mg dextran was calculated by the following formula:
(AxB) / C = bonded OD 600 units / 1 mg dextran
(Where A is the OD 600 as measured after termination of dialysis, B is the volume of solution obtained after termination of dialysis, and C is the amount of DVS-activated dextran (mg) used in the experiment. ).
[0255]
Example 5B.Dye and peak molecular weight 2,000,000 Have DVS Coupling with activated dextran
Dextran (peak molecular weight 2,000,000) activated with DVS as in “Solution C” of Example 1A (ie, using 1% (w / v) dextran and 3% (v / v) DVS) did. The activated dextran had a content of 554 μmol reactive vinyl groups per g dextran. The final concentration of DVS activated dextran was 8.3 mg activated dextran / ml.
[0256]
Two separate solutions (A and B) containing the same concentration of DVS activated dextran were prepared. Buffer was added so that the final concentration of dipotassium hydrogen phosphate / sodium hydroxide was 0.25 M, the final concentration of sodium chloride was 0.50 M, and the pH of the solution was 11.5.
[0257]
After filtration through a 0.45 μm filter, a concentrate of dye (Remazol-Brilliant Red F3B, DE BE 305, Hoechst) was added. The final concentrations of DVS activated dextran and dye are shown below:
[0258]
[Table 25]

[0259]
Solutions A and B were incubated at room temperature (20-25 ° C.) for 4 hours. After coupling, the pH of the reaction mixture was adjusted to pH 7 with 1 M hydrochloric acid. All samples were dialyzed extensively against 50 mM sodium chloride to remove unbound dye. After dialysis, the volume of each solution was measured and the final concentration of dextran was calculated.
After dialysis, each sample was measured at OD 530 nm (1 cm cuvette) and characterized by the numerical value of bound OD 530 units / 1 mg dextran. The results of the coupling reaction are listed below:
[0260]
[Table 26]

The number of bound OD 530 units / 1 mg dextran was calculated as in Example 5A:
From a given example, it can be deduced that two different dyes (black or red) have bound approximately the same amount of OD.
[0261]
Example 6:An alternative method for the formation of water-soluble crosslinks
Example 6A.At high ionic strength DVS- activation" Dex-Remazol Black Rabbit anti-human to conjugate CRP Binding
Five solutions of “Dex-Remazol Black” conjugates (A, B, C, D and E) were conjugated with rabbit anti-human CRP immunoglobulin fraction (DAKO, Denmark, catalog number Q0329).
[0262]
solution A and E: 11 OD600 units / mg dextran bound with “Dex-Remazol Black” having a maximum molecular weight of 2,000,000 as described for “Solution A” in Example 5A
solution B: 8OD600 units / mg dextran bound with “Dex-Remazol Black” having a maximum molecular weight of 2,000,000 as described for “Solution B” in Example 5A
solution C: 4OD600 units / mg dextran bound with “Dex-Remazol Black” having a maximum molecular weight of 2,000,000 as described for “Solution C” in Example 5A
solution D: 2OD600 units / mg dextran bound with “Dex-Remazol Black” having a maximum molecular weight of 2,000,000 as described for “Solution D” in Example 5A
[0263]
Solutions A, B, C, and D: 0.003226 μmol antibody and 0.000645 μmol dextran (as “Dex-Remazol Black”) are mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer (pH 8.8) to give the following final concentrations: Obtained:
1.75M potassium phosphate buffer
pH8.6
0.6mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-Remazol Black” / Antibody: 1/5

[0264]
solution E: 0.000645 μmol antibody and 0.00129 μmol dextran (as “Dex-Remazol Black”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer (pH 8.8) to obtain the following final concentrations:
2.2M potassium phosphate buffer
pH8.6
0.22mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-Remazol Black” / Antibody: 1/5

[0265]
After mixing, a precipitate was observed in the solution and antibody binding was continued for 18 hours at 4-6 ° C. After conjugation, cysteine (Merck, catalog number 1.02838) was added to the sample to a final concentration of 0.01M cysteine. Solutions A, B, C, and D were dialyzed against 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 9) for 1 hour. After dialysis, Tween 20 was added to a final concentration of 0.5% v / v.
The concentration of the phosphate buffer in solution E was adjusted to 1.75 M by adding deionized water to the solution. The conjugate was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes and the supernatant was carefully aspirated with a pipette. The precipitate (pellet) was dissolved in 1 ml of deionized water and Tween 20 was added to a final concentration of 0.5% v / v.
[0266]
The free antibody and “Dex-Remazol Black” conjugated antibody in the sample were separated by gel filtration on Sephacryl HR S-300 (Pharmacia, Sweden, catalog number 17-0599-01). All gel filtrations were performed on FPLC (Pharmacia, Sweden) using a Pharmacia column (catalog number HR 10/30) with Sephacryl HR S-300 with a diameter of 1 cm and a bed volume of 25 ml. . For solutions A, B, C, and D, gel filtration was performed with 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 9), 0.5% v / v Tween 20. Solution E was gel filtered in 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 0.5% Tween (adjusted to pH 7.2 with 1 M hydrochloric acid). All gel filtrations were performed at a flow rate of 1 ml / min.
[0267]
Separation on Sephacryl HR S-300 gave two peaks. Peak 1 from Sephacryl HR S-300 containing rabbit anti-human HRP bound to “Dex-Remazol Black” is hereinafter referred to as “Dex-Remazol Black / a-CRP” conjugate.
[0268]
The “Dex-Remazol Black / a-CRP” conjugate was collected as a fraction from 8 ml. The OD600 is measured for the “Dex-Remazol Black / a-CRP” conjugate, and then the conjugate from solutions A, B, C, and D is separated from Sephacryl HR S-500 (Pharmacia, Sweden, catalog number). 17-0613-01). All gel filtrations were performed on FPLC (Pharmacia, Sweden) using an FPLC column (catalog number HR10 / 30, Pharmacia, Sweden) with a bed volume of 25 ml Sephacryl HR S-500. Gel filtration was performed in 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 9), 0.5% v / v Tween 20, at a flow rate of 1 ml / min.
[0269]
Separation on Sephacryl HR S-500 gave two overlapping peaks. The first peak (peak 1) was eluted after 7 ml.
Characterization by Sephacryl HR S-500 expressed as a percentage of the “Dex-Remazol Black / a-CRP” conjugate located in the first peak of the profile (hereinafter “conjugate eluted at void volume”) . The results are as follows:
[0270]
[Table 27]

[0271]
Example 6B.At high ionic strength DVS- activation" Dex-Remazol Brillant Red Rabbit anti-human to conjugate CRP Binding
A solution of “Dex-Remazol Brillant Red” conjugate was conjugated to a rabbit anti-human CRP immunoglobulin fraction (DAKO, Denmark, catalog number Q0329).
7OD530 units / mg dextran bound with “Dex-Remazol Brillant Red” with a maximum molecular weight of 2,000,000 as described for “Solution A” in Example 5B.
[0272]
The following solutions containing the antibody and “Dex-Remazol Brillant Red” were prepared:
0.000645 μmol antibody and 0.00129 μmol dextran (as “Dex-Remazol Brillant Red”) were mixed with 3.5 M potassium phosphate buffer (pH 8.8) to obtain the following final concentrations:
1.75M potassium phosphate buffer
pH8.6
0.57mg antibody / ml
Molar ratio in solution: “Dex-Remazol Brillant Red” / Antibody: 1/5

[0273]
After mixing, a precipitate is observed in the solution and antibody binding is observed at 4-6 ° C.
And continued for 18 hours. After conjugation, cysteine (Merck, catalog number 1.02838) was added to the sample to a final concentration of 0.01M cysteine. The conjugate was dialyzed against 0.1 M sodium chloride, 50 mM Tris (adjusted to pH 9 with 1 M hydrochloric acid) for 1 hour. After dialysis, Tween 20 was added to a final concentration of 1% v / v.
The free antibody in the sample and the “Dex-Remazol Brillant Red” -bound antibody were gel filtered with Sephacryl HR S-300 with 50 mM Tris, 0.1 M sodium chloride, 1% Tween 20 (adjusted to pH 9 with 1 M hydrochloric acid). Separated. The flow rate was 1 ml / min.
[0274]
Separation on Sephacryl HR S-300 gave two peaks. Peak 1 from Sephacryl HRS-300 containing rabbit anti-human HRP bound to “Dex-Remazol Brillant Red” is hereinafter referred to as “Dex-Remazol Brillant Red / a-CRP” conjugate. Dex-Remazol Brillant Red conjugate was collected as a single fraction from 8 ml and measured for OD530:
OD558 of peak 1 obtained after gel filtration with Sephacryl HR S-300
1.67
From the above examples, it can be seen that the primary targeting moiety can bind to DVS activated dextran with two dyes.
[0275]
Example 7:Equipment and use of cross-linked and cross-linked composites
Example 7A."Standard cross-flow performance test"
The following “standard cross-flow performance test” is designed for the purpose of testing colored conjugates using reproducible standard conditions and a set of commercially available antigens.
[0276]
material:
Nitrocellulose paper: Millipore SRHF, 25 × 300mm, catalog number SRHF02020
Glass-Farber paper: Whatman Glass-Farber paper with binder, 20x300mm, catalog number 9699-9432
Absorbent pad: Whatman, 20 x 300mm, cellulose paper, 3mm, catalog number 3030-9433
Plastic lining: 0.01 white. Adhesives Research Inc., P.O.Box 100, Glen Rock, Pennsylvania, 17327, USA

[0277]
Antigen: Human serum cross-reactive protein (CRP) DAKO human serum calibrator, catalog number X0925
Antibody: Rabbit anti-human CRP, DAKO, catalog number Q0329
Coating buffer: 0.1M potassium phosphate buffer (pH 7.2)
Antigen buffer: 50 mm Tris / HCl + 0.1 M NaCl + 0.5% Tween 20 (pH 8.6)
Blocking buffer: 50 mm Tris / HCl + 0.1 M NaCl + 0.5% Tween 20 (pH 8.6)

[0278]
Washing buffer: 50mm Tris / HCl + 0.1M NaCl + 0.5% Tween 20 (pH 8.6)
Conjugate buffer: 50 mm Tris / HCl + 0.1 M NaCl + 0.5% Tween 20 (pH 8.6)
Conjugate I: 1.49 OD558 “Dex-BSA-Rhodamine / aCRP” conjugate prepared according to this patent: prepared as in Example 4A
Conjugate II: 1.74 OD558 “Dex-BSA-Rhodamine / aCRP” conjugate prepared according to WO93 / 01498
[0279]
Method:
Preparation of the cross-flow test strip:
The dried nitrocellulose paper was cut into strips (width 6 mm, length 6 mm) and placed on a plastic backing (width 5 mm, length 6 mm). A glass fiber pad (5 mm wide, 20 mm long) was placed on one end of the nitrocellulose strip. An absorbent pad (5 mm wide, 20 mm long) was placed on the other end of the nitrocellulose strip.
[0280]
Preparation of antibody solution:
Rabbit anti-human CRP is diluted to a final concentration of 0.125 mg immunoglobulin / ml coating buffer.
Preparation of antigen solution:
Dilute DAKO human serum calibrator with antigen buffer to prepare the following antigen solution (dilute serum calibrator with specific concentration of CRP in calibrator):
A: 250 ng CRP / ml
B: 125 ng CRP / ml
C: 63 ng CRP / ml
D: 31 ng CRP / ml
E: 16 ng CRP / ml
F: 8 ng CRP / ml
G: 0 ng CRP / ml

[0281]
Preparation of conjugate solution:
Prepare dilutions of conjugate I and II to be tested in conjugate buffer:
Conjugate: “Dex-BSA-Rhodamine / a-cCRP” conjugate (from solution D in Example 4A) “Dex-BSA-Black / a-cCRP” conjugate (from solution E in Example 6A)
Dilution: Binding to a final concentration having an absorption of 0.7 when measured at the actual absorption maximum of the conjugate using a 1 cm optical path in the visible region of the absorption spectrum (ie, in the range of about 450 nm to about 650 nm) Dilute the body.
[0282]
Test implementation:
1) For each of the seven lateral flow test strips designated A1, B1, C1, D1, E1, F1 and G1, place 3 μl of rabbit anti-human CRP (0.125 mg immunoglobulin / ml).
2) Add 25 μl blocking buffer to the top of the glass fiber pad on each strip to block the remaining protein binding capacity of the test strip.
3) Wait approximately 10 minutes for the buffer to reach the absorbent pad at the other end of the test strip by capillary flow.
[0283]
4) At the top of the glass fiber pad, add 25 μl of antigen solution to each test strip. Antigen solution A (250 ng CRP / ml) is added to the A1 test strip, and antigen solution B is added to the B1 test strip. The antigen solution is added gradually to avoid “spilling” from the glass fiber pad.
5) Wait 10 minutes for the antigen solution to flow to the absorbent pad at the other end of the test strip.
6) Add 25 μl wash buffer to the bottom of the glass fiber pad of each test strip. Wait 10 minutes and add again 25 μl of wash buffer to the lower end of the glass fiber pad of each test strip.
[0284]
7) Wait 30 minutes.
8) Add 50 μl of conjugate I dilution to the bottom of the glass fiber pad on each test strip.
9) Wait 10 minutes.
10) Add 25 μl wash buffer to the bottom of the glass fiber pad on each test strip. Wait 10 minutes and add again 25 μl of wash buffer to the lower end of the glass fiber pad of each test strip.
[0285]
Repeat step 1 with a new set of lateral flow test strips named A2, B2, C2, D2, E2 and F2, and G2 uses steps 2-10 using the conjugate II dilution of step 8. I do.
Evaluation of test results:
The color intensity of the spots appearing on the test strip is evaluated by a scoring test. Analyze the intensity of the appearing spot using the following numbers:
5: Very intensely colored spot
4: Medium colored spots
3: Weakly colored spot
2: Spots appear faint
1: Spot cannot be detected
[0286]
Spot test readings:
[Table 28]

[0287]
Example 7B.Different Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP Standard cross-flow performance test with a combination
Different “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” conjugates were tested in a standard cross-flow performance test. All tests were performed as described in Example 7A.
The antigen concentration (CRP) and “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” conjugate concentration during the study will vary from study to study and are therefore listed separately for each study.
In all tests, antibodies were spotted on nitrocellulose strips at a concentration of 0.1 mg antibody / ml and 1 μl for each spot.
[0288]
Exam number 1
A lateral flow performance test was performed using the “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” conjugate from Example 4A, Solution C.
Lateral flow performance tests were performed using the following conjugate fractions:
I: Peak 1 from Sephacrylose HR S-300 Concentration: OD558 = 0.1
II: Peak 1 from Sephacrylol HR S-500 Concentration: OD558 = 0.1
III: Peak 2 from Sephacrylose HR S-500 Concentration: OD558 = 0.1

[0289]
The color intensity of the spots appearing on the test strip was measured using the AGFA flatbed scanner ARUSII with the following settings:
Original: Reflective
Mode: Grayscale
Input: 240 dpi
Scale: 100%
Range: Histogram Minimum = 130, Maximum = 254
Tone curve: None
Sharpness: None
Descreen: None
Size: A4 portrait
[0290]
The software CREAM for Windows (1-D, Kem-En-Tec A / S, Copenhagen, Denmark, catalog number 990012) was used for the calculation of the results given in intensity units.
result:
[0291]
[Table 29]

[0292]
Conclusion:
The conjugate collected in fraction 1 (taken from 7-10.5 ml) from Sephacryl HR S-500 responded significantly better than the conjugate taken in fraction 2 (taken from 10.5-18 ml) give. The peak 1 test from Sephacryl HR S-300 containing two fractions from Sephacryl HR S-500 gives almost the same response as Fraction 2 obtained from Sephacryl HR S-500. The above test results illustrate the advantages of using a water soluble high molecular weight conjugate (ie, a conjugate that is completely or almost excluded from volume when gel filtered on a Sephacryl HR S-500 column). .
[0293]
Exam number 2
A lateral flow performance test was performed using the “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” conjugate from Example 4B.
The performance of the conjugate was compared to the reference conjugate from Example 4A, Solution E (prepared with DVS activated dextran) “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP”.
I: “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP”, Example 4B
II: “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP”, Example 4A, Solution E (see)
Conjugate concentration: OD = 0.5
result:
[0294]
[Table 30]

[0295]
Conclusion:
The above test results demonstrate the possibility of using EPCH activated carrier residues as the basis for high molecular weight conjugates that have similar or better performance than conjugates based on DVS activated carrier residues. Yes.
[0296]
Exam number Three
A cross flow performance test was performed using the “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” conjugate of Example 4F (prepared with high ionic strength (solution A) and low ionic strength (solution B), respectively). Various fractions collected from gel filtration on Sephacryl HR S-1000 and the reference conjugate solution E of Example 4A were also tested.
[0297]
I: “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP”, Example 4F, Solution A OD558 = 0.35
II: “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP”, Example 4F, Solution B OD558 = 0.5
III: “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP”, Example 4A, Solution E (reference) OD558 = 0.5
IV: Fraction 1 (Sephacryl HR S-1000, collected from 8-10 ml from solution A
V: Fraction 2 (collected from 10-12 ml from Sephacryl HR S-1000, solution A
VI: Fraction 3 (Sephacryl HR S-1000, collected from 14-16 ml from solution A
VII: Fraction 4 (Sephacryl HR S-1000, collected from solution 20 to 18-20 ml
Fractions IV-VII were tested using a concentration of OD558 = 0.35.
result
[0298]
[Table 31]

Test of fractions collected from Sephacryl HR S-1000.
[0299]
[Table 32]

[0300]
Conclusion
The test results show that conjugates made by antibody coupling (conjugate B) with low ionic strength, ie, without (reversibly) precipitating the reactants, undergo antibody coupling under reversible precipitation conditions. It shows that the performance is very inferior compared to the conjugate (conjugate A). These results are consistent with the fact that Conjugate B has a significantly lower molecular weight than Conjugate A. Furthermore, it can be seen that when the conjugate is fractionated into a low molecular weight sample, the performance of the sample decreases with molecular weight, ie, the high molecular weight conjugate provides higher performance.
[0301]
Example 7C.Different Dex-BSA-Dye- / a-CRP "and" Dex-Dye- / a-CRP Standard cross-flow performance test with a combination
Different “Dex-BSA-Dye / a-CRP” and “Dex-Dye / a-CRP” conjugates were tested by standard cross-flow performance tests. All tests were performed as described in Example 7A.
The antibody concentration used for the dots, the volume of antibody used for spotting on the nitrocellulose strip (μl), the antigen concentration (CRP) and the conjugate concentration will vary from test to test and are described separately for each test.
[0302]
Exam number 1
A cross flow performance test was performed using the “Dex-Remazol Black / a-CRP” conjugate of Example 6A, Solutions A, B and C.
The performance of the conjugate was compared to “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP”, which is the reference conjugate of Example 4A solution E.
A cross flow performance test was conducted under the following conditions.
When testing the “Dex-Remazol Black / a-CRP” conjugate, 3 μl of antibody at a concentration of 1 mg / ml was used in the spot, and when testing the “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” reference conjugate, the concentration was 0.1. 1 μl of mg / ml antibody was used.
[0303]
I: “Dex-Remazol Black / a-CRP” conjugate A OD600 = 0.6
II: “Dex-Remazol Black / a-CRP” conjugate B OD600 = 0.6
III: “Dex-Remazol Black / a-CRP” conjugate C OD600 = 0.6
IV: “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” Example 4A, solution E (reference) OD558 = 0.5
result
[0304]
[Table 33]

This test shows the possibility of using Remazol Black as a signal component.
[0305]
Exam number 2
A cross flow performance test was performed using the “Dex-BSA-UniblueA / a-CRP” conjugate of Example 4E, solutions A and B.
The performance of the conjugate was compared to “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP”, which is the reference conjugate of Example 4A solution E.
A cross flow performance test was conducted under the following conditions.
[0306]
When testing the “Dex-BSA-UniblueA / a-CRP” conjugate and the “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” conjugate, 1 μl of antibody at a concentration of 0.1 mg / ml was used in the spot.
I: “Dex-BSA-UniblueA / a-CRP” conjugate A OD595 = 0.5
II: “Dex-BSA-UniblueA / a-CRP” conjugate B OD595 = 0.5
III: “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” Example 4A, Solution E (reference) OD558 = 0.5
result
[0307]
[Table 34]

This test shows the possibility of using Uniblue A as a signal component.
[0308]
Exam number Three
A cross flow performance test was performed using the “Dex-Remazol Brilliant Red / a-CRP” conjugate of Example 6B.
The performance of the conjugate was compared to “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP”, which is the reference conjugate of Example 4A solution E.
A cross flow performance test was conducted under the following conditions.
[0309]
When using the “Dex-Brilliant Red / a-CRP” conjugate, use 3 μl of antibody at a concentration of 1 mg / ml as a spot, and when testing the “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” reference conjugate. 1 μl of antibody at a concentration of 0.1 mg / ml was used.
I: “Dex-Remazol Brilliant Red / a-CRP” OD530 = 1.0
II: “Dex-BSA-Rhodamine / a-CRP” Example 5A, Solution E (reference) OD558 = 0.5
result
[0310]
[Table 35]

This test shows the possibility of using Remazol Brilliant Red as a signal component.
From the examples given, reversible precipitation conditions show that antibody-dye-conjugated binding performs better in cross-flow specimens than conjugates prepared without reversible precipitation conditions, with or without a spacer component. The conclusion to give a body is drawn.
[Brief description of the drawings]
[Figure 1]Figure 1 : Dex-BSA- Rhodamine / a-CRP Conjugate purification
Gel filtration UV absorption profiles of samples obtained by combining rabbit anti-human CRP with DVS-activated “Dex-BSA-rhodamine” conjugate at high ionic strength (1.75M potassium phosphate buffer) (Examples) 5A “Solution B”, gel filtration is Sephacryl^TM Done with S-300). The main peak, (1), contains a water-soluble crosslinked “Dex-BSA-rhodamine” conjugate. Each mark on the horizontal axis represents 2 ml. The mark on the vertical axis indicates an arbitrary absorption unit at 280 nm. The figure shows that free, unbound antibody, peak (2) can be separated from the conjugate.
[Figure 2]Figure 2 : Characteristic curve. Dex-BSA- Rhodamine ”conjugate
Gel filtration UV absorption profiles of samples obtained by combining rabbit anti-human CRP with DVS-activated “Dex-BSA-rhodamine” conjugate at high ionic strength (1.75M potassium phosphate buffer) (Examples) 5A “Solution B”, gel filtration is Sephacryl^TM Done with S-300). The main fraction, (1), contains a water-soluble crosslinked “Dex-BSA-rhodamine” conjugate. Each mark on the horizontal axis represents 2 ml. The mark on the vertical axis indicates an arbitrary absorption unit at 280 nm. The figure shows that the conjugate has a high and constant molecular weight, resulting in fast elution and sharp peaks.
[Fig. 3a]Figure 3a : Properties of conjugates precipitated at high and low ionic strength
Combines rabbit anti-human CRP and DVS-activated “Dex-BSA-rhodamine” conjugate with high ionic strength (2.2M potassium phosphate buffer) and low ionic strength (0.1M potassium phosphate buffer) Gel filtration UV absorption profile of the resulting sample (Figure 3a-b: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-300; Fig. 3c-d: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-500; Fig. 3e-f: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-1000;).
Figures 3a, 3c, 3e show conjugates prepared with high ionic strength and Figs. 3b, 3d, 3f show conjugates prepared with low ionic strength. Label (1) indicates the conjugate and label (2) indicates the free unbound antibody. Each mark on the horizontal axis represents 2 ml. The mark on the vertical axis indicates an arbitrary absorption unit at 280 nm.
The gel filtration profile clearly shows that the molecular weight of the conjugate prepared at high ionic strength is greater than that prepared at low ionic strength.
FIG. 3bFigure 3b : Properties of conjugates precipitated at high and low ionic strength
Combines rabbit anti-human CRP and DVS-activated “Dex-BSA-rhodamine” conjugate with high ionic strength (2.2M potassium phosphate buffer) and low ionic strength (0.1M potassium phosphate buffer) Gel filtration UV absorption profile of the resulting sample (Figure 3a-b: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-300; Fig. 3c-d: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-500; Fig. 3e-f: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-1000;).
Figures 3a, 3c, 3e show conjugates prepared with high ionic strength and Figs. 3b, 3d, 3f show conjugates prepared with low ionic strength. Label (1) indicates the conjugate and label (2) indicates the free unbound antibody. Each mark on the horizontal axis represents 2 ml. The mark on the vertical axis indicates an arbitrary absorption unit at 280 nm.
The gel filtration profile clearly shows that the molecular weight of the conjugate prepared at high ionic strength is greater than that prepared at low ionic strength.
FIG. 3cFigure 3c : Properties of conjugates precipitated at high and low ionic strength
Combines rabbit anti-human CRP and DVS-activated “Dex-BSA-rhodamine” conjugate with high ionic strength (2.2M potassium phosphate buffer) and low ionic strength (0.1M potassium phosphate buffer) Gel filtration UV absorption profile of the resulting sample (Figure 3a-b: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-300; Fig. 3c-d: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-500; Fig. 3e-f: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-1000;).
Figures 3a, 3c, 3e show conjugates prepared with high ionic strength and Figs. 3b, 3d, 3f show conjugates prepared with low ionic strength. Label (1) indicates the conjugate and label (2) indicates the free unbound antibody. Each mark on the horizontal axis represents 2 ml. The mark on the vertical axis indicates an arbitrary absorption unit at 280 nm.
The gel filtration profile clearly shows that the molecular weight of the conjugate prepared at high ionic strength is greater than that prepared at low ionic strength.
FIG. 3dFigure 3d : Properties of conjugates precipitated at high and low ionic strength
Combines rabbit anti-human CRP and DVS-activated “Dex-BSA-rhodamine” conjugate with high ionic strength (2.2M potassium phosphate buffer) and low ionic strength (0.1M potassium phosphate buffer) Gel filtration UV absorption profile of the resulting sample (Figure 3a-b: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-300; Fig. 3c-d: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-500; Fig. 3e-f: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-1000;).
Figures 3a, 3c, 3e show conjugates prepared with high ionic strength and Figs. 3b, 3d, 3f show conjugates prepared with low ionic strength. Label (1) indicates the conjugate and label (2) indicates the free unbound antibody. Each mark on the horizontal axis represents 2 ml. The mark on the vertical axis indicates an arbitrary absorption unit at 280 nm.
The gel filtration profile clearly shows that the molecular weight of the conjugate prepared at high ionic strength is greater than that prepared at low ionic strength.
FIG. 3eFigure 3e : Properties of conjugates precipitated at high and low ionic strength
Combines rabbit anti-human CRP and DVS-activated “Dex-BSA-rhodamine” conjugate with high ionic strength (2.2M potassium phosphate buffer) and low ionic strength (0.1M potassium phosphate buffer) Gel filtration UV absorption profile of the resulting sample (Figure 3a-b: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-300; Fig. 3c-d: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-500; Fig. 3e-f: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-1000;).
Figures 3a, 3c, 3e show conjugates prepared with high ionic strength and Figs. 3b, 3d, 3f show conjugates prepared with low ionic strength. Label (1) indicates the conjugate and label (2) indicates the free unbound antibody. Each mark on the horizontal axis represents 2 ml. The mark on the vertical axis indicates an arbitrary absorption unit at 280 nm.
The gel filtration profile clearly shows that the molecular weight of the conjugate prepared at high ionic strength is greater than that prepared at low ionic strength.
FIG. 3fFigure 3f : Properties of conjugates precipitated at high and low ionic strength
Combines rabbit anti-human CRP and DVS-activated “Dex-BSA-rhodamine” conjugate with high ionic strength (2.2M potassium phosphate buffer) and low ionic strength (0.1M potassium phosphate buffer) Gel filtration UV absorption profile of the resulting sample (Figure 3a-b: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-300; Fig. 3c-d: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-500; Fig. 3e-f: Sephacryl^TM Characteristic profile of gel filtration performed on HR S-1000;).
Figures 3a, 3c, 3e show conjugates prepared with high ionic strength and Figs. 3b, 3d, 3f show conjugates prepared with low ionic strength. Label (1) indicates the conjugate and label (2) indicates the free unbound antibody. Each mark on the horizontal axis represents 2 ml. The mark on the vertical axis indicates an arbitrary absorption unit at 280 nm.
The gel filtration profile clearly shows that the molecular weight of the conjugate prepared at high ionic strength is greater than that prepared at low ionic strength.
FIG. 4aFigure Four : Outline of process for preparing water-soluble cross-linked complex
A schematic diagram of one embodiment of the preparation of the components and precursors mentioned herein is shown in FIG. The figure shows an episodic example in an embodiment to help the reader to follow the general outline of the procedure described in this method, and is used for illustration only. Should.
FIG. 4bFigure Four : Outline of process for preparing water-soluble cross-linked complex
A schematic diagram of one embodiment of the preparation of the components and precursors mentioned herein is shown in FIG. The figure shows an episodic example in an embodiment to help the reader to follow the general outline of the procedure described in this method, and is used for illustration only. Should.

Claims (33)

At least one carrier component portion, more than one linking component portion, at least one spacer component portion, at least one signal component portion and at least one primary targeting component portion, wherein the signal component is a spacer component A method for preparing a water-soluble crosslinked product, wherein the spacer component is covalently bonded to a carrier component via a linking component,
a) comprising at least one carrier component portion, more than one linking component portion, at least one spacer component portion and at least one signal component portion, wherein the signal component is covalently bound to the spacer component, and A water-soluble intermediate conjugate in which a spacer component is covalently bonded to a carrier component via a linking component,
Reacting with at least one primary targeting component in an aqueous solution via reaction of an unreacted reactive moiety derived from a linking component under conditions where a reversible precipitate is formed, wherein said reversible precipitate The formation of the precipitate is performed by salting out with a lyotropic salt present at a concentration greater than 1M; and b) re-dissolving the reversible precipitate comprising the water-soluble cross-linker in an aqueous medium;
A method comprising that.   The method of claim 1, further comprising, after step b), c) purifying the water-soluble cross-linked conjugate. At least one carrier component portion, more than one linking component portion, at least one signal component portion and at least one primary targeting component portion, wherein the signal component is covalently bound to the carrier component by the linking component. A method for preparing a water-soluble crosslinked product comprising:
a) a water soluble intermediate conjugate comprising at least one carrier component portion, more than one linking component portion, at least one signal component portion, wherein the signal component is covalently bonded to the carrier component by the linking component;
Reacting with at least one primary targeting component in an aqueous solution via reaction of an unreacted reactive moiety derived from a linking component under conditions where a reversible precipitate is formed, wherein said reversible The formation of the precipitate is carried out by salting out with a lyotropic salt present at a concentration above 1M; and b) redissolving the reversible precipitate comprising the water-soluble cross-linker in an aqueous medium. ;
A method comprising that.   4. The method of claim 3, further comprising, after step b), c) purifying the water soluble cross-linked conjugate.   The process according to any one of claims 1 to 4, wherein the precipitation step a) is carried out by salting out with a lyotropic salt present at a concentration of at least 1.25M.   6. The lyotropic salt according to any one of claims 1 to 5, wherein the lyotropic salt is selected from the group consisting of lithium, sodium, potassium, calcium and ammonium sulfates, phosphates, citrates and tartrate salts and mixtures thereof. The method described in 1.   7. A process according to any one of claims 1 to 6, wherein the precipitation step a) is carried out at a pH above 6.   The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the carrier component is selected from the group consisting of dextran, starch, glycogen, agarose derivatives, cellulose derivatives, natural rubber and mixtures thereof.   9. The method of claim 8, wherein the dextran is carboxymethyl dextran; the starch is hydroxyethyl starch or hydroxypropyl starch; and the cellulose derivative is hydroxyethyl or hydroxypropylcellulose.   10. A method according to claim 8 or 9, wherein the carrier component is dextran.   11. A method according to any one of claims 1 to 10, wherein the linking component is selected from the group consisting of divinyl sulfone and epichlorohydrin.   The method according to claim 1, wherein the connecting component is divinyl sulfone.   13. A method according to any one of claims 1, 2 or claims 5-12, wherein the spacer component is selected from the group consisting of proteins and polypeptides.   14. The method of claim 13, wherein the spacer component is selected from the group consisting of BSA, ovalbumin and globulin.   15. A method according to any one of claims 1 to 14, wherein the signal component is a dye.   16. A method according to any one of the preceding claims, wherein the solubility of the water-soluble crosslinked conjugate in water is at least 10 mg dry conjugate per ml of water at 25 ° C. 17. A conjugate prepared by the method of any one of claims 1-16, comprising a ligand and a secondary targeting moiety, wherein the ligand is covalently bound to a secondary targeting moiety, and A method for preparing a water-soluble cross-linked conjugate complex in which a ligand is non-covalently bound to the primary targeting component of the conjugate comprising:
I) preparing a water-soluble crosslinked product by the method according to any one of claims 1 to 16;
II) reacting the water-soluble crosslinked conjugate with an ligand covalently bound to the secondary targeting moiety in aqueous solution; and
III) terminate the reaction;
A method comprising that.   The method according to claim 17, wherein the water-soluble crosslinked product in the step II) is a purified water-soluble crosslinked product.   18. A method according to claim 17, wherein step III) is performed by addition of free ligand.   The water-soluble crosslinked body obtained by the method of any one of Claims 1-16.   A water-soluble cross-linked complex obtained by the method according to any one of claims 17 to 19. A lateral flow device for determining the presence or absence of at least one target component in a liquid sample,
I) A test piece having an application unit, a deposition unit, and a detection unit, and arranged so that a liquid sample flows from the application unit through the deposition unit to the detection unit;
II) A dry deposit of at least one water-soluble cross-linked conjugate according to claim 20 or a dry deposit of at least one water-soluble cross-linked conjugate complex according to claim 21 located in the deposit part of the specimen. Or a mixture thereof; and
III) at least one immobile targeting component immobilized on the detection portion of the test strip that can selectively bind or selectively react with one or more target components present in the liquid sample;
Having a cross flow device. A method for determining the presence or absence of at least one target component in a liquid sample, comprising:
I) Add a liquid sample or add a liquid sample and wash buffer to the application part of the cross flow device as defined in claim 22;
II) Allow sufficient time for the applied liquid sample, or liquid sample and wash buffer, to flow from the application section through the deposition section to the detection section; and
III) Detect the presence or absence of a signal at the detector;
A method comprising that.   24. The method of claim 23, wherein the signal is directly detectable by the naked eye.   25. The method according to claim 24, wherein the signal can be directly detected by the naked eye after adding a reagent to the detector.   The method according to any one of claims 23 to 25, wherein the liquid sample is derived from a living organism.   27. The method of claim 26, wherein the liquid sample is a blood sample, a serum sample, a plasma sample, a urine sample, a semen sample, or a mixture thereof. Immunochemical assay technology, radioimmunoassay (RIA), turbidimetric and turbidimetric immunoassay, immunohistochemical method, cytochemical method, flow cytometry, in situ hybridization technology, membrane hybridization technology, biosensor, cross flow device, or lectin / in have you to process hydrocarbon-based interactions, addressed in a manner to target the target component, at least one targeting component of the water-soluble cross-linked conjugate according to claim 20, the target component A method comprising a step of selectively binding or a step of selectively reacting with a target component .   29. The method of claim 28, wherein the immunochemical assay technique is an enzyme immunoassay (EIA).   30. The method of claim 29, wherein the enzyme immunoassay (EIA) is an ELISA. Immunochemical assay technology, radioimmunoassay (RIA), turbidimetric and turbidimetric immunoassay, immunohistochemical method, cytochemical method, flow cytometry, in situ hybridization technology, membrane hybridization technology, biosensor, cross flow device, or lectin / in have you to process hydrocarbon-based interactions, addressed in a manner to target the target component, at least one targeting component of the water-soluble cross-linked conjugate according to claim 21, the target component A method comprising a step of selectively binding or a step of selectively reacting with a target component .   32. The method of claim 31, wherein the immunochemical assay technique is an enzyme immunoassay (EIA).   35. The method of claim 32, wherein the enzyme immunoassay (EIA) is an ELISA.

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