JP4427137B2 - Production method of fructosyl valine - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フルクトシルバリンの生産方法及び該生産方法により得られたフルクトシルバリンの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
血中のヘモグロビン（Ｈｂ）Ａ１ｃは、そのβ鎖のＮ末端のバリン残基にグルコースが非酵素的に結合し、シッフ塩基を形成した後、アマドリ転移により、結果的にフルクトースが結合した構造を有するフルクトシル蛋白質である。かかるＨｂＡ１ｃは、臨床的に過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病管理の指標として重要であり、その迅速かつ正確な定量法が求められている。
【０００３】
ところで、ＨｂＡ１ｃ等のグリコシル化蛋白質を測定する方法として、試料をプロテアーゼで処理し、そのプロテアーゼ処理試料をケトアミンオキシダーゼで処理し、その反応生成物を測定する非酵素的グリコシル化蛋白質の測定法（特開平５−１９２１９３号公報）が知られている。
【０００４】
しかしながら、ＨｂＡ１ｃを測定するには、ＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端のフルクトシルバリン残基を特異的に切り出すことができるプロテアーゼが必要であるが、該公報に記載されたプロテアーゼは、フルクトサミンのフルクトシルリジン残基を切り出すものであり、ＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端のフルクトシルバリン残基を特異的に切り出すことはできない。したがって、該公報に記載の方法は、ＨｂＡ１ｃの測定法として利用することはできない。
【０００５】
また、ＨｂＡ１ｃを定量する他の方法として、例えばＩＦＣＣの実用基準法（Ｋｏｂｏｌｄ Ｕ．，ｅｔ ａｌ：Ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎＡ１ｃ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｐｐｉｎｇ． Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９７，４３：１９４４−１９５１）に、ヘモグロビンをエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃで水解（３７℃で１８時間処理）し、得られるβ鎖Ｎ末端の６ペプチドフラグメントをＨＰＬＣで分離した後、キャピラリー電気泳動法又は質量分析法で定量する方法が記載されている。しかしながら、該方法は、特別な装置を必要とするため、操作が煩雑で経済性が悪いという問題がある。
【０００６】
したがって、本発明は、かかるＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質から、フルクトシルバリンを生産する方法を提供することを目的とする。
本発明はまた、かかる生産方法によって得られたフルクトシルバリンを定量する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、特定のセリンカルボキシペプチダーゼが、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質から、フルクトシルバリンを特異的に切り出すことができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質を、セリンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．１）を用いて酵素処理することを特徴とするフルクトシルバリンの生産方法を提供するものである。
本発明はまた、かかる生産方法により得られたフルクトシルバリンに、ケトアミンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とするフルクトシルバリンの定量方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のフルクトシルバリンの生産方法に用いる酵素は、セリンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．１）であり、これはペプチドや蛋白質のＬ−アミノ酸をＣ末端から順次遊離させるペプチダーゼである。ペプチドのＣ末端側から順次アミノ酸を切り出すペプチダーゼとしては、カルボキシペプチダーゼＡ（牛膵臓由来）、カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ膵臓由来）等が知られているが、これらを用いてＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質を処理しても、フルクトシルバリンは得られなかった。かかる状況下、セリンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．１）が、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質からフルクトシルバリンを切り出すことができることは、全く意外であり、これまで全く知られていなかったことである。該セリンカルボキシペプチダーゼは、植物、動物、カビ、酵母等に広く存在するが、本発明においては、このうち小麦由来のセリンカルボキシペプチダーゼを用いることが好ましい。
【００１０】
本発明においては、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質を、上記セリンカルボキシペプチダーゼを用いて酵素処理する。該ペプチド又は蛋白質は、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されていれば、アミノ酸配列、アミノ酸残基の数等に特に制限はないが、このうち、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されている蛋白質としては、ＨｂＡ１ｃが好ましい。また、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチドとしては、アミノ酸数には限定されないが、そのアミノ酸配列が配列番号１〜５で表されるものが好ましい。
【００１１】
上記Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチドは、かかる配列を有するペプチド又は蛋白質を、適当なエンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼ等を用いて処理することにより、調製することができる。これらプロテアーゼとしては、例えばエラスターゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、アルカリプロテアーゼ、トリプシン、プロリン特異エンドプロテアーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ等が挙げられる。これらプロテアーゼの活性量としては、０．０５〜１００００Ｕ／ｍＬ、特に１０〜２０００Ｕ／ｍＬが好ましい。
【００１２】
Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されている蛋白質又はペプチドを処理するときの、上記セリンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．１）の活性量は、０．０５〜１００００Ｕ／ｍＬ、特に１〜１０００Ｕ／ｍＬが好ましい。また、処理温度は、１０〜５０℃、特に２０〜４５℃が好ましい。また、処理時間は、３分〜２００時間、特に５分〜１５０時間が好ましい。かかる処理により、フルクトシルバリンを得ることができる。
【００１３】
次に、本発明のフルクトシルバリンの定量方法について説明する。本発明の定量方法は、フルクトシルバリンをケトアミンオキシダーゼで処理し、生成した過酸化水素を測定することにより、フルクトシルバリンを定量するものである。上記で得られたフルクトシルバリンは、そのまま、又は必要に応じて限外濾過等により精製して本発明の定量方法に供することができる。本発明において用いるケトアミンオキシダーゼとしては、フルクトシルバリンを基質とするものであれば特に制限はないが、フルクトシルバリンに対して高い特異性を有し、フルクトシルリジンに対して特異性の低いものが好ましい。かかるケトアミンオキシダーゼを用いれば、例えば本発明の定量方法を用いて血液中のＨｂＡ１ｃを定量する場合、被験試料中に混在する可能性のある、ヘモグロビンのα鎖及びβ鎖由来のフルクトシルリジンの影響を排除し、高い精度でＨｂＡ１ｃを定量することができる。かかるケトアミンオキシダーゼとしては、例えばコリネバクテリウム（Corynebacterium）属菌由来の酵素（キッコーマン社製）、コリネバクテリウム・スピシーズ（sp.）由来の遺伝子組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが挙げられる。ケトアミンオキシダーゼの活性量は、１〜１００００Ｕ／Ｌ、特に１０〜５０００Ｕ／Ｌが好ましい。また、ケトアミンオキシダーゼの処理温度は、１０〜５０℃、特に２０〜４５℃が好ましい。また、ケトアミンオキシダーゼの処理時間は、０．１分〜１時間、特に０．５分〜３０分間が好ましい。
【００１４】
フルクトシルバリンをケトアミンオキシダーゼで処理することによって生成する過酸化水素の測定方法は、特に制限はないが、反応系に色原体及びパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加し、該色原体を酸化して発色物質を生成させ、これを測定する方法が好適である。この色原体としては、４−アミノアンチピリンと、フェノール系化合物、ナフトール化合物又はアニリン系化合物との組み合わせ、３−ベゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系化合物との組み合わせ、ロイコメチレンブルー等が用いられる。また、特許第２５１６３８１号に記載されているように、ＰＯＤ存在下にて過酸化水素と２価のコバルトイオンとの反応により生じた３価のコバルトイオンを、３価のコバルトイオンに特異的な指示薬、例えばＴＡＳＢＢ（トリゾリウム２−（２−チアゾリルアゾ）−５−ジスルフォブチルアミノベンゾエート）と組み合わせ、発色キレート化合物を生成させ、これを測定する方法も利用できる。これによれば、上記方法の５〜１０倍の測定感度を得ることができる。また、過酸化水素を検出する試薬として、高感度に測定可能なＴＰＭ−ＰＳ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン）（同仁化学社製）等も利用できる。
【００１５】
かかるフルクトシルバリンの定量方法を用いれば、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド、蛋白質、蛋白質のサブユニット等、例えばＨｂＡ１ｃを極めて高精度で定量することができる。ここでＨｂＡ１ｃの定量に使用される被験試料としては、例えば全血、赤血球等が挙げられる。
【００１６】
【実施例】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）又はＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５〜７）１６０μＬに、２５０μＭのｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ水溶液２００μＬ、及び２００Ｕ／ｍＬカルボキシペプチダーゼＷ（和光純薬社製）４０μＬを加え（総反応液量４００μＬ）、混和後、３７℃で１４時間保持した。これを、以下のケトアミンオキシダーゼによる検出系の試料として、フルクトシルバリン濃度を測定した。
【００１８】
（ケトアミンオキシダーゼを用いた検出系）
試薬▲１▼
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）
ＥＤＴＡ−２Ｎａ １０ｍＭ
ＴＰＭ−ＰＳ １６ｍｇ／ｄＬ
試薬▲２▼
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）
パーオキシダーゼ ５００Ｕ／ｄＬ
ケトアミンオキシダーゼ １０００Ｕ／ｄＬ
【００１９】
測定には、日立自動分析装置７０７０形を用い、２ポイントエンド法にて行った。具体的には、上記試料１０μＬに試薬▲１▼２６０μＬを加え、３７℃で５分間反応させた後、波長８００ｎｍ及び６００ｎｍにおける吸光度の差を測定した。次いで試薬▲２▼１３０μＬを加え、３７℃で５分間反応させた後、波長８００ｎｍ及び６００ｎｍにおける吸光度の差を測定した。標準液としては４０μＭのフルクトシルバリン溶液を用い、試薬ブランクとしては生理食塩水を用いて同様の操作を行い、標準液と試薬ブランクとの吸光度差から、試料中のフルクトシルバリン濃度を求めた。結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
表１から明らかなように、カルボキシペプチダーゼＷを用いることにより、フルクトシルペプチドからフルクトシルバリンを切り出すことができ、さらにケトアミンオキシダーゼを用いることにより、フルクトシルバリンを定量することができる。また、該カルボキシペプチダーゼＷの至適ｐＨは、一般に４であるが、実施例１においては、ｐＨ６のとき、ｐＨ４の場合の１０倍以上の活性が認められた。
【００２２】
実施例２
２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６）１２０μＬに、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド（ｆ−ＶＨＬ）の５００μＭ水溶液又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰ）の５００μＭ水溶液７５μＬ、１０００Ｕ／ｍＬのカルボキシペプチダーゼＷ（和光純薬社製）３０μＬ及び精製水４５μＬを加えた（総反応液量２７０μＬ）。これを混和後、３７℃で１４時間又は６６時間保持した後のフルクトシルバリン濃度を実施例１と同様にして測定した。また、比較のため、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６）の代わりに２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）を、１０００Ｕ／ｍＬのカルボキシペプチダーゼＷの代わりに１０００Ｕ／ｍＬのカルボキシペプチダーゼＢ（ＥＣ３．４．１７．２、ブタ膵臓由来、ベーリンガーマンハイム社製）を用い、他は上記と同様にしてフルクトシルバリン濃度を測定した。結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
表２から明らかなように、カルボキシペプチダーゼＢを用いた場合は、フルクトシルバリンはほとんど認められなかったが、カルボキシペプチダーゼＷを用いた場合は、ｆ−ＶＨＬ、ｆ−ＶＨＬＴＰのいずれからもフルクトシルバリンを得ることができた。
【００２５】
【発明の効果】
本発明のフルクトシルバリンの生産方法により、簡単に、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質からフルクトシルバリンを生産することができる。また、本発明のフルクトシルバリンの定量方法により、高精度でフルクトシルバリンを定量することができる。かかる定量方法は、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド、蛋白質、蛋白質のサブユニット等、例えばＨｂＡ１ｃ等の定量に特に有効である。
【００２６】
【配列表】
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing fructosyl valine and a method for quantifying fructosyl valine obtained by the production method.
[0002]
[Prior art and problems to be solved by the invention]
Blood hemoglobin (Hb) A1c has a structure in which glucose is non-enzymatically bound to the N-terminal valine residue of the β chain to form a Schiff base and then a fructose is bound by Amadori transfer. It is a fructosyl protein. Since HbA1c clinically reflects the average blood glucose level in the past 1 to 2 months, it is important as an index for diabetes management, and a rapid and accurate quantitative method is required.
[0003]
By the way, as a method for measuring a glycosylated protein such as HbA1c, a non-enzymatic glycosylated protein measurement method (in which a sample is treated with a protease, the protease-treated sample is treated with ketoamine oxidase, and the reaction product is measured ( JP-A-5-192193) is known.
[0004]
However, in order to measure HbA1c, a protease capable of specifically cleaving the fructosyl valine residue at the N-terminus of the β chain of HbA1c is required. The protease described in this publication is a fructosamine fructosyl. It cuts out a lysine residue and cannot specifically cut out the fructosyl valine residue at the N-terminal of the β chain of HbA1c. Therefore, the method described in the publication cannot be used as a method for measuring HbA1c.
[0005]
Further, as another method for quantifying HbA1c, for example, the practical standard method of IFCC (Kobol U., et al: Candidate reference methods for hemoglobin A1c based on peptide mapping. Clin. Described is a method of hydrolyzing with endoprotease Glu-C (treated at 37 ° C. for 18 hours), separating the obtained β-peptide N-terminal 6 peptide fragment by HPLC, and then quantifying it by capillary electrophoresis or mass spectrometry. Yes. However, since this method requires a special apparatus, there is a problem that the operation is complicated and the economy is poor.
[0006]
Therefore, an object of the present invention is to provide a method for producing fructosyl valine from a peptide or protein in which such N-terminal valine is fructosylated.
Another object of the present invention is to provide a method for quantifying fructosyl valine obtained by such a production method.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive research aimed at achieving the above object, the present inventors have found that a specific serine carboxypeptidase specifically cleaves fructosyl valine from a peptide or protein in which the N-terminal valine is fructosylated. The present invention has been completed by finding out what can be done.
[0008]
That is, the present invention relates to the production of fructosyl valine, characterized in that a peptide or protein in which the N-terminal valine is fructosylated is treated with serine carboxypeptidase (EC 3.4.16.1). A method is provided.
The present invention also provides a method for quantitative determination of fructosyl valine, characterized in that ketoamine oxidase is allowed to act on fructosyl valine obtained by such a production method and hydrogen peroxide produced is measured. is there.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The enzyme used in the production method of fructosyl valine of the present invention is serine carboxypeptidase (EC 3.4.16.1), which is a peptidase that sequentially releases L-amino acids of peptides and proteins from the C-terminus. Known peptidases that sequentially cut out amino acids from the C-terminal side of the peptide include carboxypeptidase A (derived from bovine pancreas), carboxypeptidase B (derived from porcine pancreas), etc., and these are used to fructosylate the N-terminal valine. Fructosylvaline was not obtained by treating the peptide or protein. Under such circumstances, it is quite surprising that serine carboxypeptidase (EC 3.4.16.1) can cleave fructosyl valine from peptides or proteins in which the N-terminal valine is fructosylated. It was not known at all. The serine carboxypeptidase is widely present in plants, animals, molds, yeasts and the like. In the present invention, it is preferable to use a serine carboxypeptidase derived from wheat.
[0010]
In the present invention, a peptide or protein in which the N-terminal valine is fructosylated is treated with the serine carboxypeptidase. As long as the peptide or protein is fructosylated at the N-terminal valine, the amino acid sequence, the number of amino acid residues and the like are not particularly limited. Among these, as the protein where the N-terminal valine is fructosylated, HbA1c is preferred. Further, the peptide in which the N-terminal valine is fructosylated is not limited to the number of amino acids, but those whose amino acid sequences are represented by SEQ ID NOs: 1 to 5 are preferable.
[0011]
The peptide in which the N-terminal valine is fructosylated can be prepared by treating a peptide or protein having such a sequence with an appropriate endoprotease or exoprotease. Examples of these proteases include elastase, proteinase K, pepsin, alkaline protease, trypsin, proline specific endoprotease, V8 protease, carboxypeptidase A, carboxypeptidase B and the like. The activity amount of these proteases is preferably 0.05 to 10,000 U / mL, particularly 10 to 2000 U / mL.
[0012]
When processing a protein or peptide in which the N-terminal valine is fructosylated, the amount of the serine carboxypeptidase (EC 3.4.16.1) is 0.05 to 10000 U / mL, particularly 1 to 1000 U / mL. mL is preferred. Further, the treatment temperature is preferably 10 to 50 ° C, particularly 20 to 45 ° C. The treatment time is preferably 3 minutes to 200 hours, particularly 5 minutes to 150 hours. By such treatment, fructosyl valine can be obtained.
[0013]
Next, the method for quantifying fructosyl valine of the present invention will be described. The quantification method of the present invention quantifies fructosyl valine by treating fructosyl valine with ketoamine oxidase and measuring the generated hydrogen peroxide. The fructosyl valine obtained above can be used for the quantification method of the present invention as it is or after purification by ultrafiltration or the like, if necessary. The ketoamine oxidase used in the present invention is not particularly limited as long as it uses fructosyl valine as a substrate, but has high specificity for fructosyl valine and specificity for fructosyl lysine. Are preferred. When such a ketoamine oxidase is used, for example, when HbA1c in blood is quantified using the quantification method of the present invention, the fructosyl lysine derived from the α chain and β chain of hemoglobin which may be mixed in the test sample. The influence can be eliminated and HbA1c can be quantified with high accuracy. Examples of such ketoamine oxidase include an enzyme derived from the genus Corynebacterium (manufactured by Kikkoman) and a recombinant fructosyl amino acid oxidase derived from Corynebacterium spicies (sp.). The amount of ketoamine oxidase activity is preferably 1 to 10000 U / L, particularly preferably 10 to 5000 U / L. The treatment temperature of ketoamine oxidase is preferably 10 to 50 ° C, particularly 20 to 45 ° C. Further, the treatment time of ketoamine oxidase is preferably 0.1 minute to 1 hour, particularly preferably 0.5 minute to 30 minutes.
[0014]
The method for measuring hydrogen peroxide produced by treating fructosyl valine with ketoamine oxidase is not particularly limited, but a chromogen and peroxidase (POD) are added to the reaction system, and the chromogen is added. A method is preferred in which a color-developing substance is formed by oxidation and measured. Examples of the chromogen include a combination of 4-aminoantipyrine and a phenol compound, a naphthol compound or an aniline compound, a combination of 3-bezothiazolinone hydrazone (MBTH) and an aniline compound, and leucomethylene blue. Used. In addition, as described in Japanese Patent No. 2516381, trivalent cobalt ions generated by the reaction of hydrogen peroxide and divalent cobalt ions in the presence of POD are specific to trivalent cobalt ions. A method of producing a colored chelate compound in combination with an indicator such as TASBB (trizolium 2- (2-thiazolylazo) -5-disulfobutylaminobenzoate) and measuring this can also be used. According to this, a measurement sensitivity 5 to 10 times that of the above method can be obtained. Further, as a reagent for detecting hydrogen peroxide, TPM-PS (N, N, N ′, N ′, N ″, N ″ -hexa (3-sulfopropyl) -4,4 ′, which can be measured with high sensitivity, can be used. , 4 "-triaminotriphenylmethane) (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) and the like.
[0015]
By using such a method for quantifying fructosyl valine, peptides, proteins, protein subunits, etc. in which the N-terminal valine is fructosylated can be quantified with extremely high accuracy. Here, examples of the test sample used for quantification of HbA1c include whole blood and red blood cells.
[0016]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
[0017]
Example 1
Add 200 μL of 250 μM fructosyl-Val-His-Leu aqueous solution and 40 μL of 200 U / mL carboxypeptidase W (Wako Pure Chemical Industries) to 160 μL of 200 mM acetate buffer (pH 4-6) or MES buffer (pH 5-7) (Total reaction volume 400 μL) After mixing, the mixture was kept at 37 ° C. for 14 hours. The fructosyl valine concentration was measured using this as a sample for the detection system using the following ketoamine oxidase.
[0018]
(Detection system using ketoamine oxidase)
Reagent ▲ 1 ▼
20 mM phosphate buffer (pH 7)
EDTA-2Na 10 mM
TPM-PS 16mg / dL
Reagent (2)
100 mM phosphate buffer (pH 8)
Peroxidase 500 U / dL
Ketoamine oxidase 1000 U / dL
[0019]
The measurement was performed by a two-point end method using Hitachi automatic analyzer 7070 type. Specifically, 260 μL of reagent (1) was added to 10 μL of the sample and reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and then the difference in absorbance at wavelengths of 800 nm and 600 nm was measured. Next, 130 μL of reagent (2) was added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and then the difference in absorbance at wavelengths of 800 nm and 600 nm was measured. The same operation was performed using a 40 μM fructosyl valine solution as the standard solution and physiological saline as the reagent blank, and the fructosyl valine concentration in the sample was determined from the difference in absorbance between the standard solution and the reagent blank. Asked. The results are shown in Table 1.
[0020]
[Table 1]
As is apparent from Table 1, fructosyl valine can be excised from the fructosyl peptide by using carboxypeptidase W, and fructosyl valine can be quantified by using ketoamine oxidase. Further, the optimum pH of the carboxypeptidase W is generally 4, but in Example 1, the activity at 10 times or more that at pH 4 was recognized at pH 6.
[0022]
Example 2
A peptide (f-VHL) in which N-terminal valine having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is fructosylated in 120 μL of 200 mM acetate buffer (pH 6) or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 75 μL of a 500 μM aqueous solution of a peptide (f-VHLTP) in which the N-terminal valine having fructosylation is added, 30 μL of 1000 U / mL carboxypeptidase W (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 45 μL of purified water were added (total reaction volume) 270 μL). After mixing this, the fructosyl valine concentration after maintaining at 37 ° C. for 14 hours or 66 hours was measured in the same manner as in Example 1. For comparison, 200 mM Tris buffer (pH 8) is used instead of 200 mM acetate buffer (pH 6), and 1000 U / mL carboxypeptidase B (EC 3.4.17.2 is used instead of 1000 U / mL carboxypeptidase W). , From porcine pancreas, manufactured by Boehringer Mannheim), and the fructosyl valine concentration was measured in the same manner as described above. The results are shown in Table 2.
[0023]
[Table 2]
As is apparent from Table 2, when carboxypeptidase B was used, almost no fructosyl valine was observed, but when carboxypeptidase W was used, it was found that both f-VHL and f-VHLTP were full. Kutosylvaline could be obtained.
[0025]
【The invention's effect】
By the fructosyl valine production method of the present invention, fructosyl valine can be easily produced from a peptide or protein in which the N-terminal valine is fructosylated. Moreover, fructosyl valine can be quantified with high accuracy by the method for quantifying fructosyl valine of the present invention. Such a quantification method is particularly effective for quantification of peptides, proteins, protein subunits, etc., such as HbA1c, in which the N-terminal valine is fructosylated.
[0026]
[Sequence Listing]
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