JP4404553B2 - 単離された母体血液の胎児細胞に対する出生前診断の方法 - Google Patents
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Description
本発明は、母体血液試料に対して行われる非観血的な出生前診断のための新規方法を提供する。前記方法は、非アポトーシス性の、母体血液から単離された胎児上皮細胞に対して、濾過でこれらを濃縮した後に、出生前診断、並びに形態学的または免疫学的および遺伝的解析を行うことができる。本方法の特別な利点は、これが母または胎児に対して無害で、非常に高感度かつ高特異性の診断であることである。胎児の遺伝子もしくは染色体の異常、または胎児の遺伝子疾患もしくは感染症（ウイルス性、細菌性、または寄生虫性）の早期診断、迅速な遺伝子形質決定、および特に胎児の性の遺伝的な検出が可能になる。
出生前診断法は、主に、胎児または胚の遺伝情報を得ることを目的としている。胎児の遺伝情報の検索は、所与の遺伝子における特定の対立遺伝子もしくは所与の胎児DNA配列の対立遺伝子の組合せの存在を同定すること、または特定の対立遺伝子と胎児DNA多型性を遺伝的に関連づけることのいずれかからなる。出生前遺伝子診断の主要な適用の1つには、先天的異常の検出に関する。
出生前診断法は、羊水穿刺、毛膜絨毛の除去、胎児血液の除去、または組織診などの観血的技術を本質的に含む臨床実務において使用した。これらの技術は、胎児から直接、または卵子組織から間接的に試料を得ることを含む。これらの方法が非常に観血的な性質であるため、母または胎児に合併症を引き起こしやすい。羊水穿刺の場合にあげられるこのような合併症の例は、感染の危険、同種免疫化の可能性を有する胎児−母の出血、羊水の損失、および腹腔痛である。種々の研究により、羊水穿刺後の流産の危険性は、対照群のものよりも0.2%〜2.1%高いと見積もられている。その結果、羊水穿刺は、子供が遺伝的な障害を有する危険性が、医原性流産の危険性を超えた女性のために示唆されるだけである。
上述した合併症の危険があり、一般的に不快でおよび／または母のストレスのもとである、観血的な診断技術の使用を制限するために、新規の非観血的方法の開発は、現代の産科学における主要な目的である。
特に、母体血液を循環している胎児細胞は、出生前遺伝子診断に使用する可能性のある遺伝子材料原である（1、2）。
妊娠の間、胎児起源の種々の細胞タイプが、胎盤を横切って母体血に循環する（1）。このような細胞タイプには、リンパ球および赤血球系細胞、骨髄球性の前駆体および栄養膜上皮細胞（栄養膜細胞層および合胞栄養細胞）を含む。
出生前診断の目的で母体血に循環している胎児細胞のゲノムを解析するための方法は、従来技術において記載されているが、それらは診断（3、4、5、6）の感度および特異性に関して比較的制限されたままである。非観血的な、非常に特異的な出生前診断方法を開発する利点は、結局は結果が陰性である妊婦で実施される観血的な診断方法の比率を減少するためにこれを使用する可能性に起因する。例として、700人のうち1人の女性に関わる21トリソミーの場合、出生前診断は、フランスにおいて母が38才の場合にのみ現在提供されているが、羊水穿刺の5%の価格で21トリソミーの60%を検出することができる生化学分析的試験は、より若い女性のために提供されている。しかし、40%の21トリソミーの場合は、現在利用できる試験では検出されない。FISH技術を使用する母体血漿から分離された胎児細胞における21トリソミーの胎児期検出が最近記載された。そのアプローチは興味深いが、胎児細胞は、血漿中には珍しく（500個のうちの1つ〜2000個のうちの1つ）、またアポトーシス細胞を含むことが多いので、確実な診断には、非常に大量の細胞に対して該方法を実施する必要があり、これをルーチンで行うことは不可能であると考えられる。さらに、正倍数性の胎児細胞は、このアプローチによって同定することはできない。
このようなアプローチの1つの限界は、血液に循環している胎児細胞が非常に低濃度であるという事実に由来する。事前の選択を伴わない血液試料におけるY染色体のPCR検出に基づく研究では、胎児細胞の平均数が、血液のミリリットルあたり約1細胞であることを決定することができた（7）。さらに、骨髄性の、またはリンパ球系の起源（CD34または陽性のCD38）の胎児細胞は、妊娠または流産の27年後まで母体の血液に存在することが示された（8）。次いで、これらを単離するときに、これらが最新の妊娠に由来するかは不確かである。したがって、ルーチンで使用することができる母体血液の出生前診断を開発すること、およびそれぞれの妊娠の後に破壊され、かつ現在の妊娠について胎児のゲノムの解析を可能にする胎児の上皮細胞（栄養芽層）に的を絞る必要があることは、技術的に困難なことが容易に想像される。
しかし、何人かの著者は、胎児細胞の母体血に含まれる細胞群を濃縮することにより、または母体血に含まれる胎児細胞を分離することによる母体血における胎児細胞の検出感度の改善を提唱した（総説1、2を参照されたい）。
特に、従来技術では、ある抗体に対する胎児細胞の親和性に基づいて循環する胎児細胞を分離するための方法を開示する。
たとえば、国際特許出願WO-A-97/42503（BIOCOM S A）では、胎児細胞の磁気免疫分離のための方法であって、固定された胎児細胞の表面に発現された抗原に対して向けられた磁性ビーズ上の抗体に胎児細胞を固定することからなる方法を記載している。WO-A-90/06509（Finders Technologies Pty, Ltd）では、栄養膜細胞の表面に発現された抗原を認識する抗体を使用して、出生前診断のために栄養膜細胞を単離するための方法を記載する。しかし、胎児細胞にのみ特異的な抗体は、現在見出されていない。出生前診断は、「純粋な」胎児細胞群において実行されなければならないので、この点は重要である。
母体血に由来する細胞群を胎児細胞に濃縮するための方法の例で引用することができるものは、米国特許第US-A-5714325号（New England Medical Center Hospitals）、US-A-5580724号（Board of Regents, The University of Texas System）、およびUS-A-5646004号（Activated Cell Therapy, mc）である。
US-A-714325は、胎児顆粒球の表面に発現された抗原を認識する抗体を使用して、特に抗CD71抗体（トランスフェリン受容体）および抗グリコホリンA抗体の組合せを使用して、母体細胞から胎児顆粒球を分離することにより、胎児顆粒球を濃縮するための方法を記載する。
US-A-5580724は、特異的な増殖因子を使用して胎児の細胞増殖をインビトロで刺激することにより、母体血に由来する細胞群における胎児細胞を濃縮するためのさらなる方法を記載する。
また、胎児細胞は、US-A-S646004に記載されたように、勾配密度（たとえばパーコール、フィコール、アルブミン、シュークロース、またはデキストラン）のある溶液において血液試料を遠心することによって濃縮することができる。
しかし、これらのプロトコルは、胎児細胞に損傷を与えて有意な細胞損失を引き起こしす可能性がある複数の単離工程を含むことが示された。さらに、これらの方法はいずれも、母体細胞に由来する細胞群を、ルーチンで特異的な感度の出生前診断を想像するのに十分な程度の胎児細胞に濃縮することができない。胎児細胞において実行される診断の感度（および、それゆえにその信頼性）は、診断に使用する胎児細胞標品の純度と直接的な相関がある。上で引用した濃縮方法はいずれも、アポトーシスを起こしていない、十分に純粋な胎児細胞を生じることができず、特に母体起源の細胞フリーのものでない。
その結果、感度および診断特異性が非常に高く、好ましくは100%近くである非観血的な診断のための新たな方法の開発に対する純粋な要求がある。
従来技術および母体血に循環している胎児細胞の性質からみて、本発明は、胎児細胞の十分な濃縮を可能にする唯一の方法がこれらの形態学的調査に関連し、また、単一細胞のゲノムを標的とした遺伝的解析が既存の方法の不都合を克服することができるという事実から生じる。
生体液体試料を濾過することにより、血液に循環している病原性の上皮細胞、特に腫瘍細胞を分離するための方法は、フランス特許出願第FR-A-2782730号に記載されている。この方法は、循環上皮細胞が白血球細胞よりも大きいという事実に基づく。Vonaら（9）は、その濾過法を使用して血液試料に非常に低濃度で混合された種々の癌性細胞株（血液1ミリリットルにつき1〜3個の細胞）を検出して同定し、並びに肝癌を伴う患者から腫瘍細胞を単離した。
本発明者らは、今回、Vonaらによって記載された、細胞を濾過するための方法と、濾過によって保持された細胞の免疫学的または細胞学的な解析と、および個々の細胞を標的とした遺伝的な解析方法とを組み合わせて、母体血から単離されかつ胎児起源であることが明らかに示された個々の胎児細胞のゲノムに対して出生前診断を実行するための十分に濃縮された胎児起源の細胞を得ることが可能であることを発見した。特に、本発明は、6,000,000以上の因子によって母体血に由来する細胞群を胎児上皮細胞に濃縮することができる。本発明の方法は、解析した母体血の2mlについて1〜7個の胎児細胞を検出することができる。したがって、本発明の方法は、母体血に存在する胎児細胞のほとんど全てを単離することができると結論付けることができる。さらに、本発明者らは、顕微解剖によって細胞を濾過して回収した後に、約14〜20μmの範囲の直径を有する細胞栄養芽層タイプの単核のものと、44〜47μmの直径を有するシンシチウム栄養芽層タイプの多核のその他のものの、2つの特徴的な細胞タイプを得ることができる。
妊娠11〜12週の13人の女性で行った1つの研究により、単一の顕微解剖された細胞のゲノムのY染色体における特定の配列の検出を介して2ミリリットルの母体血を解析することにより、胎児が男性の性であることを診断できることが示された。また、対立形質を決定することにより、これらの単離された細胞の胎児起源または母体起源を決定できることが示された。
本発明は、FR-A-2782730に記載したとおりの濾過方法を実行することにより、胎児細胞を濃縮することができるという発見から一部が生じる。また、本発明は、フィルターに保持された細胞の形態学的解析により、前記細胞の胎児起源または母体起源に関する推定を確立することができ、これらの遺伝的解析により、これらの胎児起源または母体起源を示すことができるという実証から一部が生じる。特に、出生前診断は、単一細胞の顕微解剖によって得られた純粋な胎児ゲノムに対して実行できることが示される。最後に、本発明は、出産前診断方法を妊娠初期に、、かつ限られた量の母体血試料を使用して実施することができるという実証から一部が生じる。
「出生前診断」の用語は、胎児の特定の特徴（たとえば性）の同定、または遺伝的異常もしくは遺伝的病態（DNA変化）、感染症（ウイルス性の、細菌性の、または寄生性の）または代謝病（メッセンジャーRNAおよび／またはタンパク質の合成に対する変化）のいずれかのタイプの同定の両方で、単離された胎児細胞の遺伝的解析から検出することができるものを意味する。
したがって、本発明の選択された実施により、出生前診断は、胎児細胞のDNAにおける遺伝的異常もしくは染色体異常、遺伝的もしくは感染性の病気（ウイルス性の、細菌性の、または寄生性の）、または正確な遺伝子型（特に胎児の遺伝学的な性）を同定することからなる。
「少し観血的、または非観血的な方法」の用語は、生検および／または侵入（effraction）によって胎盤障壁から組織または胎児細胞を除去することを含まない方法を意味する。
したがって、本発明は、以下の工程を含む母体血から単離された胎児細胞の出生前診断のための方法を提供する：
a）純粋な、または希釈された母体血の試料を濾過して、大きさにより、一定の循環細胞、特に胎児起源の細胞をフィルターに濃縮することと；
b）フィルターに保持された細胞を解析して、これらの胎児起源または母体起源の推定または同定を達成すること；および、これらの上皮性の特徴を同定することと；
c）個々の単離された細胞の遺伝的な解析により、一定の濃縮された胎児起源の細胞を示すことと；
d）個々に解析したその胎児起源が示された細胞のゲノムを特異的に標的として遺伝的異常を同定すること。
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d）個々に解析したその胎児起源が示された細胞のゲノムを特異的に標的として遺伝的異常を同定すること。
信頼できるものであるためには、出生前診断は、純粋な胎児ゲノムで実行されなければならない。したがって、工程b）における「推定」または「推定された」の用語は、胎児起源の細胞の存在を高確率で示す。
工程c）の間、本解析は、以下でさらに詳細に説明するように、好ましくは胎児ゲノムに特異的なマーカーを使用する遺伝的解析によって行われる。
工程d）において同定され得る胎児細胞の特徴は、胎児の遺伝的異常または染色体異常、または後者の特定の遺伝子型であることもできる
この特定の特徴は、好ましくは、胎児起源がすでに示された単一細胞の遺伝的解析によって探索される。
この特定の特徴は、好ましくは、胎児起源がすでに示された単一細胞の遺伝的解析によって探索される。
本発明の出生前診断は、妊婦から血液試料を除去することを必要とする。本発明の1つの特定の実施において、母体血試料は、妊娠の早期（たとえば妊娠の第5週ころ）に除去される。しかし、母体血試料の除去および本発明の診断方法は、妊娠の始まりから終わりまでのいつでも実行することができる。本発明の好ましい実施において、試料採集および診断方法は、妊娠の第7〜第15週の間で実施される。さらなる実施において、試料採集および診断方法は、妊娠の第10〜第15週の間で実施される。一般に、3および20ミリリットルの間、好ましくは5および10ミリリットルの間の母体血液が除去される。実用的な理由のために3および20mlの間の母体血が除去される場合、後述するように、次の単離された胎児細胞の解析では、より限られた血液試料の量、たとえば、1〜10mlの範囲、好ましくは2〜5mの範囲で実行できることが理解されるはずである。診断の感受性を増大させるために、複数の独立した試料を採取して、種々の独立した試料について診断を繰り返すこともできる。さらに、本発明の好ましい実施において、父由来の血液試料および同時に母由来の細胞試料を、たとえば頬側細胞を「こする」ことによって取り除くかまたは妊娠前の血液を取り除くかによって除去して、父および母体のゲノムの特定のマーカーを同定するために試料物質を使用することができる。この並行研究により、父および母の特異的な遺伝的マーカーを決定することができ、このマーカーは、下記に記載した実施に従って濾過によって単離した細胞の胎児起源を示すために使用することができる。
本発明は、血液に循環している上皮細胞の直径が、母体の白血球または赤血球細胞より長いという観測から生じ、フランス特許FR-A-2782730に記載されたものなどの、血液に循環している病原性細胞の単離のために記載されたものに適合させた濾過法を使用して単離することができる。
本発明の方法によれば、血液試料を濾過して、胎児起源または母体起源の一定の循環細胞をフィルター上に大きさによって濃縮し、次いでこれらを血紅色の細胞、特に母体の白血球から分離する。
濾過工程a）の前に、胎児起源の細胞の血液試料から細胞群を濃縮することができるどのような方法を実施することもできる。本発明の1つの実施において、胎児の細胞群は、濃縮した胎児細胞によって発現される表面マーカーの発現の機能により細胞をソートすることによって、母体起源の細胞の比率が減少する。細胞選別技術の例は、FACS、免疫親和性カラム分離、もしく免疫磁気分離（MACS）、または物理的特徴（密度）または構造上の特徴（特に特定の抗原）に基づいて1つの細胞タイプの濃縮物を得ることができるいずれかの技術である。
濾過を容易にするために、1つの特定の実施において、濾過工程より前に、血液試料を濾過溶液に希釈する。前記濾過溶液は、有核細胞を固定するためのおよび／または赤血球を溶解させるための試薬からなる。濾過溶液の1つの例は、サポニンなどの赤血球膜を分解することができる界面活性剤、およびホルムアルデヒドなどの有核細胞膜を安定させることができる保留剤を含む。
好ましい実施において、母体血液試料は、濾過溶液に約10〜100倍に希釈される。
純粋のまたは希釈された母体血液試料を、大きさによって細胞を分離することができる多孔性のフィルターを使用して濾過する。フィルターの細孔径は、血液エレメント、特に赤血球、血小板、および母体白血球が通過し、かつ一定の有核細胞、特に母体または胎児起源の大細胞（上皮細胞または造血性前駆細胞）を保持することができるように選択される。
有利には、使用されるフィルターは、6〜15μmの細孔径で、選択された細孔径に適した密度を有し、濾過の際に細胞を保持することができるが、その妨害を回避できるものである。好ましくは、フィルターは、約8μmの直径かつ5×104〜5×105細孔/cm2の範囲の密度で、実質的に円柱形の細孔を有する。より好ましくは、使用されるフィルターは、全ての細孔が実質的に同一の直径を有するように等級分けされる。本発明の方法に使用することができるフルターの1つの例は、Whatman(登録商標)によって販売されているものなどの、細孔密度1×105細孔/cm2、厚さ12μm、および細孔径8μmを有する「Track-Etched 膜」タイプのポリカーボネートの等級分けされた濾過膜である。
フィルターに保持された細胞は、たとえばヘマトキシリンおよびエオジンで染色後に顕微鏡下で観察して、これらの形態を解析することができる。これらの上皮性の性質は、たとえば抗サイトケラチン抗体（タイプKL1）で免疫標識することによって同定することができる。現段階において、形態学的特徴に基づいて、胎児の、特に細胞栄養芽層の起源の細胞、大きな細胞核、凝縮された染色質、および減少した細胞質を有し、14〜20μmの範囲の直径を有する単核細胞、並びに大きな直径（44〜47μm以上）および多核を有するシンシチウム栄養芽層細胞を認識することが可能であると考えられる。
フィルターに保持された細胞の遺伝的解析により、前記細胞のそれぞれの胎児起源または母体起源の指標を生み出すことができる。特に、感受性が高くかつ特異的な診断の点では、胎児起源であると推定される細胞が最初の濾過後にフィルター上に観察されない場合、濾過工程が繰り返される。実施に依存するが、遺伝的解析は、胎児起源であることが推定される一定の細胞を含むフィルターに保持された全ての細胞について、または個々に単離した細胞のゲノムにおいて実行することができる。
1つの特定の実施において、フィルターに保持された細胞の胎児起源または母体起源の推定は、胎児細胞の特徴である免疫学的または細胞学的マーカーの存在を同定することによって解析される。
「胎児細胞の特徴である免疫学的なマーカー」の用語は、その発現が胎児細胞と母体細胞の間で非常に異なるいずれかの抗原または抗原の組合せであり、前記抗原または抗原の組合せに対して特異的向けられた抗体または抗体の組合せを使用して検出することができるものを意味する。前記免疫学的なマーカーの特定の例は、WO-A-90/06509に記載された栄養膜細胞と結合する抗原である。胎児細胞の特徴である免疫学的なマーカーの存在を同定することは、たとえば：
・母体血液試料に含まれる細胞を持ち込み、胎児細胞の特徴である抗原に対して向けられた少なくとも1つの抗体と接触させること；
・フィルターに保持された細胞において、前記細胞の表面に発現した抗原と前記抗体の特異的な結合を決定することと；からなり、抗体と細胞の前記接触は、おそらく濾過工程の前か後に実行される。選択された抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのタイプであることができる。
・母体血液試料に含まれる細胞を持ち込み、胎児細胞の特徴である抗原に対して向けられた少なくとも1つの抗体と接触させること；
・フィルターに保持された細胞において、前記細胞の表面に発現した抗原と前記抗体の特異的な結合を決定することと；からなり、抗体と細胞の前記接触は、おそらく濾過工程の前か後に実行される。選択された抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのタイプであることができる。
胎児細胞の特徴である抗原の1つの例は、胎盤のアルカリホスファターゼ抗原である。
さらなる実施において、細胞の胎児起源の推定は、細胞栄養芽層細胞および／またはシンシチウム栄養芽層細胞の特異的な細胞マーカーを決定することによって解析することができる。使用することができる細胞マーカーは、フィルターに保持される可能性があるその他の循環している細胞タイプと区別することができる胎児細胞の全ての細胞学的な特徴、特に細胞のサイズ、細胞の形状、特定の有機物（organites）の存在および大きさ、核の大きさおよび数、クロマチン構造、その他...、または前記細胞学的な特徴の任意の特定の組合せも含む。細胞学的な特徴は、細胞学において従来から使用される染色、特にヘマトキシリン-エオシンを使用して細胞を染色することによって、および光学顕微鏡下で染色された細胞を観察することによって観察されることができる。
1つの特定の実施において、検出される染色体異常または性に特異的なプローブの、フィルターに保持された細胞のゲノムに対するインサイチューハイブリダイゼーションで、染色体異常または性を同定するときに、および細胞のゲノムの特異的なハイブリダイゼーションの同定のときに、その胎児起源が推定される。染色体配列に特異的なプローブは、DNAまたはPNA（ペプチド核酸）タイプのプローブであることもできる（11）。インサイチューハイブリダイゼーション技術の1つの例は、FISH（蛍光インサイチュウハイブリダイゼーション）として知られるが、特異的なプローブを使用して細胞ゲノムの染色体異常または性染色体を検出することができる当業者に既知の任意の方法を、本発明の環境において使用することができる（10）。
引用することができる検出可能な染色体異常の例は、13トリソミー、18トリソミー、21トリソミー、ターナー症候群、ペンタX症候群、XYY症候群、およびXXY症候群である。
本発明の特に好ましい実施において、細胞の胎児起源または母体起源の推定を解析した後、さらにその胎児起源が推定される細胞が個々に回収される。「細胞を個々に回収すること」の用語は、フィルターに保持された相手の細胞のその後の解析のために、フィルターに保持された個々の特定の細胞を回収することができるどのような方法も意味することが理解されるはずある。好ましい実施において、フィルターに保持された細胞は、個々に顕微解剖によって回収される。顕微解剖による個々の細胞の回収は、細胞が保持された濾過膜の一部分をレーザー切断すること、またはレーザーを使用して細胞をフィルターから分離し、次いで適切なチューブに回収された単一の細胞を取り戻すことを意味する。次いで、以下に詳細を説明したように、これで種々の解析を行って出生前診断を行うことができる。
細胞の個々の回収により、有利には単一細胞のゲノムに対する遺伝的解析を標的とすることができる。また、遺伝的解析によってすでに胎児起源であることが示された単一細胞のゲノムにおいて、胎児の遺伝的もしくは染色体の異常またはその特定の遺伝子型を同定することができる。次いで、本発明のこの実施を使用して、我々は、有利には、純粋な、すなわち単一細胞に由来する遺伝的材料を得て、これを解析下の細胞の胎児起源を示すために、次いでその遺伝的異常もしくは特徴または特定の遺伝子型のいずれかを同定するための両方に使用することができる。
どのようなタイプの遺伝的解析方法も、前記方法が単一の細胞に特徴のあるものを同定するために十分な感受性のあることを条件として、単一の回収された細胞の胎児起源もしくは母体起源を示すために、または胎児の遺伝的異常もしくはその特定の遺伝子型の同定を行うために使用することができる。。
胎児起源を示すための好ましい解析方法は、父または母体のDNAの特異的なマイクロサテライトマーカーを同定することにより、回収した細胞のDNA対立形質を決定することである。
その結果、単一の回収した細胞に由来するDNA標品において、1つもしくは複数の遺伝的なマーカー／標的を、もしくは多型を、もしくは前記マーカー／標的の組合せを同定することによって、または前記マーカーのもしくは遺伝的標的の特定の対立形質アッセイすることによって：
・細胞の胎児起源または母体起源を示すこと；次いで
・胎児の遺伝的異常もしくは染色体異常、またはその特定の遺伝子型を同定することによって出生前診断を行うこと；
が可能である。
・細胞の胎児起源または母体起源を示すこと；次いで
・胎児の遺伝的異常もしくは染色体異常、またはその特定の遺伝子型を同定することによって出生前診断を行うこと；
が可能である。
下記の本文において、我々は、「遺伝的標的」の用語が、出生前診断の環境において、多型を含む同定される遺伝的特徴をさすこと、および「マーカー」の用語は、解析した細胞の胎児起源または母体起源を示すことができるエレメントをさすこと、が好ましい。
「遺伝的標的」の用語は、どのような遺伝的特徴も、たとえば、特に胎児の表現型または遺伝子疾患もしくは感染症に関連した遺伝子の特定の変異を意味する。
「多型マーカー」の用語は、その存在が特定の遺伝子型と相関しているDNAにおいて同定することができるどのような特徴も意味する。これらのマーカーは、母体のDNAから父のDNAを区別することができ、したがって胎児DNAの両親の組成を示すことができる。引用することができるマーカーの例は、制限断片長多形性（RFLP）マーカー、SNP（単一ヌクレオチド多型）マーカー、マイクロサテライトマーカー、VNTR（タンデムリピートの変数）マーカー、またはSTR（短いタンデムリピート）マーカーである。
マイクロサテライトマーカーは、特に細胞の特徴付けのために、および出生前診断を実行するために好ましい。本発明の1つの実施において、同定する多型のための少なくとも1つのマーカーは、マイクロサテライトマーカー、VNTR（タンデムリピートの変数）マーカー、またはSTR（短いタンデムリピート）マーカーである。これらは、特定のプライマーを使用する増幅によって同定可能であるという利点がある。マイクロサテライトマーカー（VNTRまたはSTR）は、タンデムリピート（通常ポリCA/GT部分）からなる。繰り返しの数のバリエーションによる対立遺伝子のバリエーションは、マイクロサテライトの側面に位置している独特の配列に対応するプライマーを使用するPCRタイプの増幅によって、容易に検出される。これらのマイクロサテライトマーカーの物理的地図およびこれらに関するプライマーの配列は、Dibら（12）によって記載されている。この方法を使用して、解析した細胞の遺伝子型の両親の寄与を、明確な方法で確証し、細胞の胎児起源を解析できる。さらに、特定のマイクロサテライトマーカーの存在は、特に、出生前診断のため、特に特定の染色体の変化の診断のための遺伝的標的として詳細に調査することもできる。
単一の回収した細胞の胎児起源または母体起源を示すために、1つの特定の実施において、母体細胞のゲノムのものと区別されるマーカーもしくはマーカーの組合せ、または前記マーカーの対立遺伝子アッセイ法は、特に前記回収した細胞のゲノムにおいて、父の細胞のDNAに対するマーカーまたはマーカーの組合せを同定することによって同定することができる。これらの存在は、必然的に問題の細胞が胎児起源である印となる。
胎児の性が男性であることが既知である場合、胎児細胞のDNAに対する1つの特定のマーカーは、Y染色体に特異的な遺伝的マーカーまたは前記マーカーの組合せであってもよい。
有利には、回収した細胞の胎児起源または母体起源を示し、および／または胎児の遺伝的もしくは染色体の異常またはその特定の遺伝子型を探究する前に、前記回収した細胞を溶解し、たとえば既知のPEP（Primer Extension Preamplification）法（13）またはDOP-PCR法を使用する全ての生じ得る配列をカバーしている一般的なプライマーを使用して、その全ゲノムを予め増幅する。このような方法により、単一細胞の総ゲノムを増幅することができる。次いで、単一細胞のDNAから得られ、かつ単一細胞のDNAに由来する予め増幅されたDNA標品を精製して、遺伝的マーカまたは多型の特異的な検出のための、および／または遺伝的標的を検出するための遺伝的材料として使用することができる。
好ましくは、回収された細胞の胎児起源または母体起源は、単一細胞のDNAに由来する予め増幅されたDNA標品から、遺伝的なマーカーもしくは多型または前記マーカーの組合せを増幅することによって示される。胎児DNAに対する両親の寄与を示すことができる遺伝的マーカーは、従来の父および母体のDNAの解析によって同定される。次いで、同定された遺伝的標的を有する1つまたは複数の配列を増幅することにより、単一細胞のDNAに由来する予め増幅されたDNAの同じ標品から、出生前診断のための遺伝的標的を同定することができる。所与の核酸を特異的に増幅するためのどのような技術も、本発明の方法に使用することができる。引用することができる例は、PCR増幅（ポリメラーゼ連鎖反応法）、またはTMA（転写を媒介した増幅）などの等温性増幅方法、NASBA（核酸配列に基づいた増幅）、3SR（自己持続性配列複製、または標準的な置換増幅である。
増幅方法、特にPCRは、予め増幅したDNA標品の5分の1未満から実行したものでも十分な感受性がある。その結果、それぞれの回収した細胞の予め増幅したDNA標品は、少なくとも5つの異なるマーカーまたは遺伝的標的を増幅するために使用することができる。
特に、増幅を行うことにより、マイクロサテライトマーカーを検出することもできる。
実例として、たとえば我々は、予め増幅されたDNA標品のPCR増幅を使用する本発明の方法を使用して、単離した細胞の胎児起源を示すために、マイクロサテライトマーカーの検出を引用することができる。また、PCR増幅は、遺伝的標的、特に点変異もしくは欠失型変異、または遺伝的性質にもしくは特定の疾患に関連した微小欠失を検出することもできる。欠失を有しやすい配列を増幅し、増幅産物を大きさによって、たとえば電気泳動によって分離する。欠失の存在は、欠失を有さない増幅産物より小さな増幅産物の存在によって検出する。
また、増幅産物は、同定されたマーカーまたは遺伝的標的を特に正確に特徴づけるために、特に、出生前診断の目的で特定の変異または遺伝子型を同定するためにシーケンスすることもできる。1つの特定の実施において、我々は、回収した細胞および／または出生前診断の胎児起源または母体起源を示すことができ、特に、増幅されたマーカーまたは遺伝的標的をシーケンスすることにより胎児の遺伝的もしくは染色体の異常またはその特定の遺伝子型を探索することもできる。たとえば、本発明の方法を使用して、CFTR遺伝子のΔF508微小欠失などの嚢胞性繊維症の診断に関連したCFTR遺伝子の一定の変異を検出することもできる。
また、D21S1414およびD21S1411のマーカーなどの21染色体のVNTRマーカーのPCR増幅および前記マーカーの対立遺伝子アッセイ法によって、21トリソミーを診断することができる。
本発明の方法のさらなる実施において、我々は、特に、特異的DNAプローブを使用して予め増幅したDNA標品の全てまたは一部のハイブリダイズによって、胎児の遺伝的または染色体の異常またはその特定の遺伝子型を探索する場合に、回収した細胞の胎児起源または母体起源を示し、次いで出生前診断を実行することができる。DNAプローブは、これらが、同定するための遺伝的標的または多型に、または同定する遺伝的標的を有する配列に特異的にハイブリダイズするように選択される。遺伝的標的に対するプローブのハイブリダイゼーションは、スロットブロット、サザンブロット、または有利には現在使用しているDNAマイクロアレイもしくはマクロアレイにおいて、核酸のハイブリダイゼーション複合体を検出するための従来の技術を使用して検出することができる（14）。分子プローブは、たとえば嚢胞性繊維症、筋ジストロフィー、ゴーシェ病、ヘモグロビン病、血友病、フェニルケトン尿症、および嚢胞性繊維症を特異的に検出するために選択することができる。
本発明の1つの実施において、同定する遺伝的標的に特異的なDNAプローブは、DNAマイクロアレイまたはマクロアレイを形成している支持体に固定される。予め増幅したDNA標品は、たとえば放射性のまたは蛍光性のマーカーでラベルして、特異的なプローブを含むDNAマイクロアレイまたはマクロアレイと接触させた状態にする。ハイブリダイゼーション強度は、特異的なプローブを含むそれぞれの点について測定し、したがって、回収した細胞のDNAにおける所望のマーカーの存在の測定に優れた感受性を提供する。
遺伝的標的の選択は、検索する遺伝子型に依存することが明らかである。出生前診断に使用することができる遺伝的標的の例は、従来技術において記載されている。
出生前診断のための染色体異常、特に染色体の増加および欠失を決定するための代替方法は、（i）本方法に従って濾過した後に回収した単一の細胞のゲノムに由来する予め増幅したDNAを調製するものと、母体起源の細胞または非胎児の対照細胞に由来する予め増幅したDNAを調製するものの（2つの標品は異なるマーカーでラベルされている）、染色体もしくはコスミド標品に対するまたはDNAアレイに対するハイブリダイゼーションを比較し、および（ii）濾過後に回収した細胞のDNAと母体DNAとの間のハイブリダイゼーションを相違を同定することとを含む、比較ゲノムハイブリダイゼーション法（CGH）である（16）。本発明の1つの実施において、出生前診断は、その胎児起源が示されている単一の回収細胞のDNAに由来する予め増幅したDNA標品と母体起源の細胞のまたは非胎児対照細胞の予め増幅したDNAとの比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）によって行う。
さらなる側面において、本発明は、母体血液から分単離した細胞群に由来する胎児細胞群を産生して胎児起源の細胞を濃縮するための方法であって、前記方法は、以下の工程を含む方法に関する：
a）妊婦から除去した純粋のまたは希釈した血液試料を、大きさに従ったフィルターで濾過して、一定の循環細胞および特に胎児起源の細胞を濃縮することと；
b）フィルターに保持された細胞を培養して、胎児細胞に濃縮された細胞培養を得ること。
a）妊婦から除去した純粋のまたは希釈した血液試料を、大きさに従ったフィルターで濾過して、一定の循環細胞および特に胎児起源の細胞を濃縮することと；
b）フィルターに保持された細胞を培養して、胎児細胞に濃縮された細胞培養を得ること。
上記方法は、本発明の方法が、予想外に、特に母体血から単離した細胞群を胎児起源の細胞に非常に濃縮することができるという本発明者による観測から生じる。また、細胞を固定する前、すなわち生存したままでさえ、濾過することができるという観測から生じる。
さらに、上記方法によって得られる細胞群から、既知のクローニング技術および発現技術を使用して胎児細胞の純粋培養を得ることができる。本方法によって得られた純粋のまたは濃縮された胎児細胞群は、前記胎児細胞またはそれらの分化に由来する細胞を含む細胞療法製品の製造に特定の適用を有する。
上記方法は、欧州特許EP-A-0513139に記載されたとおりの、上皮腫瘍細胞の大きさによる単離（ISET）のための特定の器具の存在および開発に基づいており、枠組みとして：
・多孔性のフィルターであって、その大きさに従って一定の循環細胞を保持することができ、2つの凝集装置の間に、それぞれフルターの向きに関して上流および下流に取り付けられ、かつ濾過シールを提供する多孔性のフィルター；
・解析する試料を貯蔵し、および／または前もって処理するための手段を含む上流ブロック；
・前記貯蔵手段に面する穿孔を含む下流ブロック；
・強制的な濾過のための手段；
を含む。
・多孔性のフィルターであって、その大きさに従って一定の循環細胞を保持することができ、2つの凝集装置の間に、それぞれフルターの向きに関して上流および下流に取り付けられ、かつ濾過シールを提供する多孔性のフィルター；
・解析する試料を貯蔵し、および／または前もって処理するための手段を含む上流ブロック；
・前記貯蔵手段に面する穿孔を含む下流ブロック；
・強制的な濾過のための手段；
を含む。
本発明は、母体血に存在する胎児細胞を濾過するための、前記型の装置の適応および使用に属する。
「適応および使用」の用語は：
・好ましくは等級分けされて、かつ8μm以上、好ましくは10μm以上、およびより好ましくは15μm以上の平均直径を有する細胞を保持することができる細孔径を有するフルターを、装置に組み入れることと、8μm以上の平均細孔径を有するフィルターは、所望の特徴を満たすことが示されている；
・細孔径の機能として、フィルターの細孔密度を適応させて濾過能力を最適化することと；
・濾過手段に適用される圧力を適応させて、胎児細胞の物理的な完全性を保持することと；
・母体血液試料に稀釈培地を適応させて、患者細胞の完全性および生存率を保存することと、
を意味する。
・好ましくは等級分けされて、かつ8μm以上、好ましくは10μm以上、およびより好ましくは15μm以上の平均直径を有する細胞を保持することができる細孔径を有するフルターを、装置に組み入れることと、8μm以上の平均細孔径を有するフィルターは、所望の特徴を満たすことが示されている；
・細孔径の機能として、フィルターの細孔密度を適応させて濾過能力を最適化することと；
・濾過手段に適用される圧力を適応させて、胎児細胞の物理的な完全性を保持することと；
・母体血液試料に稀釈培地を適応させて、患者細胞の完全性および生存率を保存することと、
を意味する。
より詳細には、本発明は、使用する母体血液から胎児細胞を単離するISET型濾過装置であって、および6μm〜15μmの範囲、好ましくは約8μmの平均細孔径を有するフィルターを具備する装置の使用に属する。
また、フィルターが、約8μmの直径およびの、5×104〜5×105の範囲の細孔密度を有する細孔を有するISET型装置の使用に属する。
最後に、適用される濾過圧力が0.05バール〜0.8バールの範囲、好ましくは0.1バールであるISET型濾過装置の使用に属する。
以下の実施例および添付の図は、胎児の性を検出するための出生前診断方法およびその適用の実施を例示する。また、これらは、その感受性および特異性を示す。
より正確には、下記の実施例において、本診断方法を13人の妊婦から単離した細胞に実施した。使用した方法では、形態学的解析および男性のための特異的なマーカー（Y染色体のシーケンスのための増幅プライマー）による胎児細胞の検出を含んだ。また、これらは、PCR増幅を使用してマイクロサテライトマーカーの対立遺伝子を決定することにより、フィルターに保持された細胞の胎児起源を示すことを含む。結果は、女性胎児を有する母では、細胞の100%がY染色体試験に陰性であったので、本診断方法が特に感受性のあることを示す。さらに、11個の単離細胞に対する特異的なマイクロサテライトマーカー（STR、短いタンデムリピート）解析により、そのうちの6個が「胎児細胞」タイプのプロフィールを有し、5個が「母体」プロフィールを有することが明らかとなった。これらの結果は、Y染色体検出について得られた結果と一致している。これらは、本試験が、胎児細胞を特異的に検出することができ、および特に感受性で特異的な出生前診断を実施することができるという分子的証明を構成する。
明らかであるが、本実施例は限定的ではなく、上記した手段を用いて単離した胎児細胞から同定することができ、個々に区別することができ、特徴づけることができることを条件として、本発明の方法は、どのような胎児にも特徴的な出生前診断に適用できる。
母体血から単離した胎児細胞における出産前診断方法の実施の例：胎児の性の決定に対する適用
研究の概要
本研究は、遺伝病のリスクについて、胎児（6人の男性胎児および7人の女性胎児）を有する11〜12週の13人の妊婦に対して行い、彼女らの同意を得た。EDTA緩衝液に除去して回収した2ミリリットルの血液を解析した。試料採取は、いずれの観血的なプロトコルの前に行い、血液試料は、せいぜい除去の4時間後に濾過した。胎児の性の診断は、絨毛癌の絨毛を除去することによって（DNA解析によって）決定した。
研究の概要
本研究は、遺伝病のリスクについて、胎児（6人の男性胎児および7人の女性胎児）を有する11〜12週の13人の妊婦に対して行い、彼女らの同意を得た。EDTA緩衝液に除去して回収した2ミリリットルの血液を解析した。試料採取は、いずれの観血的なプロトコルの前に行い、血液試料は、せいぜい除去の4時間後に濾過した。胎児の性の診断は、絨毛癌の絨毛を除去することによって（DNA解析によって）決定した。
A.方法
血液試料は、0.175%のサポニン、0.2%のパラホルムアルデヒド、0.0372%のEDTAおよび0.1%のBSAを含む濾過緩衝液に10倍に希釈し、次いで円柱形の等級分けされた直径8μmの細孔を有する等級分けされたポリカーボネートフィルタを使用して濾過した。フィルターに保持された細胞は、直径0.6cmの円形スポットに回収した。エオシンおよびヘマトキシリンで染色後、スポットを顕微鏡下で解析し、それぞれの細胞の写真を高倍率および低倍率で撮影した。Adobe Photoshopソフトウェアを使用して細胞サイズを決定し、参照として8μm細孔径を取った。写真により、Pixcell II Arcturus顕微鏡（Mountain View CA）で細胞を位置づけることができる。図2は、この方法によって得られた顕微鏡解析を示す。
血液試料は、0.175%のサポニン、0.2%のパラホルムアルデヒド、0.0372%のEDTAおよび0.1%のBSAを含む濾過緩衝液に10倍に希釈し、次いで円柱形の等級分けされた直径8μmの細孔を有する等級分けされたポリカーボネートフィルタを使用して濾過した。フィルターに保持された細胞は、直径0.6cmの円形スポットに回収した。エオシンおよびヘマトキシリンで染色後、スポットを顕微鏡下で解析し、それぞれの細胞の写真を高倍率および低倍率で撮影した。Adobe Photoshopソフトウェアを使用して細胞サイズを決定し、参照として8μm細孔径を取った。写真により、Pixcell II Arcturus顕微鏡（Mountain View CA）で細胞を位置づけることができる。図2は、この方法によって得られた顕微鏡解析を示す。
それぞれの細胞の顕微解剖は、フィルターにどのような従来の処理も行わずにレーザー捕獲によって行った。各時点において単一の細胞が回収されたことを保証するために、顕微解剖の前後にフィルターの写真をとり、顕微解剖された細胞の写真をカプセル（CapSure（商標）HS）に貯蔵した。次いで、15μlの溶解緩衝液（100mMのトリス-HCl pH8（400μg/mlプロテイナーゼK）中で37℃で16時間、細胞を溶解した。遠心後に可溶化液を回収し、プロテイナーゼKを90℃で10分間不活性化させた。Zhangら(上記参照)によって記載されたように、プライマー伸張の予め増幅（primer extension preamplification）（PEP）の後、DNAをエタノール中で沈殿させて、10μlの水に再懸濁した。次いで、それぞれの試料を、まず以下のHLAプライマー：
5'-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3'
5'-CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTT-3'
前記HLAプライマーは、DNAの増幅機能を試験することができる（ポジティブ増幅対照）、
で試験し、および第２に、以下のSTR特異的なプライマーによって試験した：
マーカーD16S3018
（センス）5'-6.-FAM-GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-3'；および
（アンチセンス）5'-AGACAGAGTCCCAGGCATT-3'；
マーカーDi6S3031
（センス）5'-TET-ACTTACCACTGTGCCAGTTG-3'；および
（アンチセンス）5'-ATACATGGGTCCTTAAACCG-3'；
マーカーD16S539
（センス）5'-HEX-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3'；および
（アンチセンス）5'-ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-3'
また、試料を、Y染色体に対して特異的なプライマーで試験した（Yプライマ：参照17にて説明したように、Y1.7およびY1.9）。PCRは、2μlのPEP産物、10mmのトリス-HCl、50mmのKCl、1.5mmのMgCl2、0.01%のゼラチン、200mMの各デオキシヌクレオチド、20ピコモルの各Yプライマー、HLAまたはSTR、および1UのTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA）を含む20μlの反応液混合液量で行った。Perkin Elmer9700サーモサイクラーにおいて、94℃で5分間の最初の変性工程の後、40回の増幅サイクル（94℃、15秒、60℃、30秒、72℃、30秒）、次いで72℃で5分間の最後の伸長工程を行った。10μlの一定分量の増幅産物を2%のアガロースにおけるゲル電気泳動によって解析した。
5'-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3'
5'-CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTT-3'
前記HLAプライマーは、DNAの増幅機能を試験することができる（ポジティブ増幅対照）、
で試験し、および第２に、以下のSTR特異的なプライマーによって試験した：
マーカーD16S3018
（センス）5'-6.-FAM-GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-3'；および
（アンチセンス）5'-AGACAGAGTCCCAGGCATT-3'；
マーカーDi6S3031
（センス）5'-TET-ACTTACCACTGTGCCAGTTG-3'；および
（アンチセンス）5'-ATACATGGGTCCTTAAACCG-3'；
マーカーD16S539
（センス）5'-HEX-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3'；および
（アンチセンス）5'-ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-3'
また、試料を、Y染色体に対して特異的なプライマーで試験した（Yプライマ：参照17にて説明したように、Y1.7およびY1.9）。PCRは、2μlのPEP産物、10mmのトリス-HCl、50mmのKCl、1.5mmのMgCl2、0.01%のゼラチン、200mMの各デオキシヌクレオチド、20ピコモルの各Yプライマー、HLAまたはSTR、および1UのTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA）を含む20μlの反応液混合液量で行った。Perkin Elmer9700サーモサイクラーにおいて、94℃で5分間の最初の変性工程の後、40回の増幅サイクル（94℃、15秒、60℃、30秒、72℃、30秒）、次いで72℃で5分間の最後の伸長工程を行った。10μlの一定分量の増幅産物を2%のアガロースにおけるゲル電気泳動によって解析した。
結果を図1に示す。Y染色体に特異的なプライマーを使用する増幅のためのPCR条件は、3人の男性個体の血液白血球に由来する5ngのDNAの増幅によって、次いでHuH6細胞（肝細胞癌に由来した）の予め増幅されたDNA産物を増幅し、濾過して顕微解剖することによって確立した。STR特異的なプライマーを使用するPCRについては、94℃で5分間のDNA変性後に、40回の増幅サイクル（94℃、30秒；54℃、30秒；72℃、20秒）に続き、72℃で5分間の伸長段階を実行した。最初のPCR産物の2マイクロリットルを、同じPCR条件を使用して再び増幅した。最後のPCR産物の1マイクロリットルを、20μlの脱イオン化したホルムアミドおよび0.4μlのGenescan-500 TAMRAマーカーと混合し、次いでABI Prism 310自動シーケンサーに充填した。Genescanソフトウェア（Perkin Elmer, Foster City, CA）を使用して、プロフィールを解析した。対立形質決定は、同じSTRプライマーを使用して、1.5ngの血液白血球に由来する父のDNAおよび／または1.5ngの妊娠前の母の血液または白血球に由来する母体DNAおよび1.5ngの絨毛膜絨毛由来の試料から得られる栄養膜DNAを増幅することによって行った。
特異性の対照
Yプライマーの特異性は、20人の女性からの血液白血球に由来する10ngのDNAを増幅することによって試験した。PCR産物におけるあらゆる汚染を回避するために使用した予防措置は、上記してある（18）。さらに、ネガティブ対照（試料のない緩衝液）は、それぞれの試料について溶解工程において挿入して、試験の最後までその他の試料のように解析した。顕微解剖を行うときに、我々は、少なくとも1つの新たなフィルター（細胞なし）の顕微解剖を含め、試料および対照と並行しておこなった。ポジティブな結果の特異性を検査するために、試料および対照（ネガティブおよびポジティブ）に対して、特異的なY染色体プライマーまたはSTR特異的なプライマーで増幅を繰り返した。
Yプライマーの特異性は、20人の女性からの血液白血球に由来する10ngのDNAを増幅することによって試験した。PCR産物におけるあらゆる汚染を回避するために使用した予防措置は、上記してある（18）。さらに、ネガティブ対照（試料のない緩衝液）は、それぞれの試料について溶解工程において挿入して、試験の最後までその他の試料のように解析した。顕微解剖を行うときに、我々は、少なくとも1つの新たなフィルター（細胞なし）の顕微解剖を含め、試料および対照と並行しておこなった。ポジティブな結果の特異性を検査するために、試料および対照（ネガティブおよびポジティブ）に対して、特異的なY染色体プライマーまたはSTR特異的なプライマーで増幅を繰り返した。
B.結果
20人の女性から得られるDNAを増幅することでYプライマーの特異性を決定した。図1で示したとおり、トラック1〜12、14〜21（女性）とライン13(男性)を比較することにより、試験は、女性からのDNA試料についてネガティブであり、ポジティブ対照としての男性からのDNAについて陽性であった。
20人の女性から得られるDNAを増幅することでYプライマーの特異性を決定した。図1で示したとおり、トラック1〜12、14〜21（女性）とライン13(男性)を比較することにより、試験は、女性からのDNA試料についてネガティブであり、ポジティブ対照としての男性からのDNAについて陽性であった。
次いで、男性胎児を有する母由来の血液において予備検査を実行した。フィルターに保持された細胞を顕微解剖して、節Aで定義したY染色体およびHLAに特異的なプライマーを使用して解析した。HLAプライマーによる試験では、全ての細胞について陽性であり、Yプライマーによる試験では、これらの細胞の半分について陽性であった。
図2は、試験で陽性であった細胞では、前記フィルター上の細胞でとった写真が以下の形態学的特徴を有する2つの細胞タイプであることが明らかとなったという事実を例示する：
・14.3〜19.9μmの範囲（平均値16.9±2）の直径を有し、凝縮染色質かつ小さな細胞質を有する大きな核の、しばしば膜表面にいくつかの微小絨毛を有する栄養膜細胞層タイプの単核細胞；
・より大きな直径（一般に44〜47μm）を有するシンシチウム栄養芽層細胞タイプの多核細胞。
・14.3〜19.9μmの範囲（平均値16.9±2）の直径を有し、凝縮染色質かつ小さな細胞質を有する大きな核の、しばしば膜表面にいくつかの微小絨毛を有する栄養膜細胞層タイプの単核細胞；
・より大きな直径（一般に44〜47μm）を有するシンシチウム栄養芽層細胞タイプの多核細胞。
次いで、男性胎児を有する女性からの血液試料に由来する23個の「胎児の」細胞の形態学的外観、および女性胎児に由来する26個の細胞を、顕微解剖およびY染色体配列の増幅によって解析した。結果を以下の表1に示してある。
Y陽性細胞の数を括弧内に示してある。
この表は、HLAプライマーでの試験が、全ての細胞について陽性であり、Yプライマーでの試験が、15個の細胞について陽性であったことを示す。これらの結果の特異性を試験するために、Y増幅産物を同じYプライマーで再び増幅した。対照およびPCRにネガティブな細胞の全てが、試験においてネガティブな結果を与えたが、陽性細胞は、陽性の結果を与え、および弱い陽性の細胞（図1におけるトラック34）では、より強いバンドを生じた。
全体的には、胎児起源の細胞の決定は、2mlの血液から分離した様々な数の細胞（1〜7個のY陽性細胞）について証明された。しかし、本研究において、「胎児の」形態学的外観を有する全ての細胞を、顕微解剖したわけではなかった。形態学的データに基づいて、最初の迅速な定量では、その数が血液1ミリリットルにつき約5個の細胞であることが得られた。
表の第2の部分は、女性胎児の細胞解析についての結果を示す。HLAプライマーを使用する試験では、解析した女性胎児に由来する26個の細胞について陽性であったが、Y染色体特異的なプライマーを使用する試験では、女性胎児に由来する細胞の全てについてネガティブであったことが分かる。これらの結果は、このアプローチが偽陽性を伴わずに特異的に胎児細胞を検出することができ、性を決定するために適しているであろう。
4つの場合において、父の血液DNAおよび／または母の血液DNA（妊娠前に得た）、および栄養膜DNAを利用した。これらのDNA試料を、個々に単離した細胞の胎児起源の性同定を同定するために使用した。3つのSTRマーカーおよび予め増幅されたDNA標品の5分の1を使用することにより、男性胎児を有する母から単離した11個の顕微解剖した細胞の胎児起源または母体起源を決定することができ、さらにY染色体特異的なプライマーも使用して試験した。結果を表2に、および図3に要約してある。
*表1を参照されたい；MC：母体細胞；FC：胎児細胞プロフィール。
母体血から単離して濾過後に回収した単一細胞のSTR遺伝形質決定
6個の細胞は、陽性のY染色体の検出と一致した胎児プロフィールを有し、および5個の細胞は、Y染色体のネガティブな検出と一致して、母体プロフィールを有する。
6個の細胞は、陽性のY染色体の検出と一致した胎児プロフィールを有し、および5個の細胞は、Y染色体のネガティブな検出と一致して、母体プロフィールを有する。
1つの場合において（図3A）、試験したSTRマーカーは、母体の対立遺伝子（M）（250および262bpのヘテロ接合）と父の対立遺伝子（F）を区別することができないが、栄養膜DNA（T）は、1つの対立遺伝子（250bp）に対してホモ接合性の状態を有する。同じプロフィール（250bpの対立遺伝子に対してホモ接合性）が、本発明の方法を使用して単離した胎児細胞（FL）について検出され、この細胞は、Y染色体検出試験に陽性であった。対照的に、Y染色体検出試験に対してネガティブな、さらに顕微解剖された細胞は、明らかにヘテロ接合性プロフィール（母親細胞、MC）を有する。
もう一つの場合において（図3B）、母体の対立遺伝子（256bp）が母体のDNA（M）においも検出されたことに加えて、栄養膜DNA（T）は、父の対立遺伝子（258bp）も有した。これらの2つの対立遺伝子は、顕微解剖された細胞（PC）の両方において見られ、これらの胎児起源が決定された。
考察
本研究は、母体血液を循環している胎児細胞を濾過によって濃縮することができる最初のものであることを示す。また、性の同定において独立して胎児細胞の同定を、非常に多形のSTRマーカーのPCR増幅によって実行することができることを示す。STRマーカー検査法の臨床的な影響は、胎児細胞を濃縮するために特に有効なアプローチと前記方法を組み合わせることに依存する。本研究は、2つのアプローチをうまく組み合わせることができることを最初に示す。大きさで分離する技術は、血液に循環している腫瘍細胞を分離するためにすでに記載されている（上記Vonaら、を参照されたい）。本発明者は、今回、2ミリリットルだけの母体血試料から濃縮し、これらを濃縮後に回収した胎児細胞を遺伝的に解析することができることを発見した。個々の細胞に対してレーザー顕微解剖およびY染色体特異的なプライマーまたはSTRプライマーを使用するPCRを組み合わせて、このアプローチにより、回収された細胞の胎児起源示すことができた。血液に循環している胎児細胞の数が血液1ミリリットルにつき1細胞である、すなわち10,000,000個の白血球につき1つの胎児細胞であると見積もられることを考慮すると、得られた濃縮物は、約6,600,000倍（フィルターに保持された1.5個の大細胞につき1つの胎児細胞）である。さらに、本アプローチでは、血液に循環している胎児細胞の形態学的情報を提供することもできる。おそらく栄養膜細胞層タイプの細胞である単核細胞、およびシンシチウム栄養芽層細胞である多核細胞が単離された。これらの2つの細胞タイプは、同じ分離および顕微解剖技術を使用して解析した22人の健康な給血者および44人の癌腫の患者では決して観察されなかった（結果は示さず）。
本研究は、母体血液を循環している胎児細胞を濾過によって濃縮することができる最初のものであることを示す。また、性の同定において独立して胎児細胞の同定を、非常に多形のSTRマーカーのPCR増幅によって実行することができることを示す。STRマーカー検査法の臨床的な影響は、胎児細胞を濃縮するために特に有効なアプローチと前記方法を組み合わせることに依存する。本研究は、2つのアプローチをうまく組み合わせることができることを最初に示す。大きさで分離する技術は、血液に循環している腫瘍細胞を分離するためにすでに記載されている（上記Vonaら、を参照されたい）。本発明者は、今回、2ミリリットルだけの母体血試料から濃縮し、これらを濃縮後に回収した胎児細胞を遺伝的に解析することができることを発見した。個々の細胞に対してレーザー顕微解剖およびY染色体特異的なプライマーまたはSTRプライマーを使用するPCRを組み合わせて、このアプローチにより、回収された細胞の胎児起源示すことができた。血液に循環している胎児細胞の数が血液1ミリリットルにつき1細胞である、すなわち10,000,000個の白血球につき1つの胎児細胞であると見積もられることを考慮すると、得られた濃縮物は、約6,600,000倍（フィルターに保持された1.5個の大細胞につき1つの胎児細胞）である。さらに、本アプローチでは、血液に循環している胎児細胞の形態学的情報を提供することもできる。おそらく栄養膜細胞層タイプの細胞である単核細胞、およびシンシチウム栄養芽層細胞である多核細胞が単離された。これらの2つの細胞タイプは、同じ分離および顕微解剖技術を使用して解析した22人の健康な給血者および44人の癌腫の患者では決して観察されなかった（結果は示さず）。
さらに、胎児のリンパ球系または骨髄性の前駆体は妊娠後の血液に残留するが、栄養膜細胞は残留しない。したがって、栄養膜細胞の解析の利点は、現在の妊娠と遺伝的試験の結果に明確に関連し得るということである。
このアプローチのさらなる利点は、単一の個々の細胞のDNAから、少なくとも5回のPCR解析を行うことができることである。これにより、胎児起源が証明された細胞において、分子的解析、特にSTR多形マーカー解析と並行して遺伝的試験を実施する可能性を生じる。頻回の血液試料から単離した種々の個々の胎児細胞について得られる独立した結果の対比に基づいて診断することもできる。重要なことに、FISHプロトコルも、本濾過方法を使用して単離した細胞に効率よく適用することができる点に留意する必要がある（9）。その形態学的観測に基づいて回収して解析したほとんど100%の胎児細胞が、本発明の方法によって同定されるので、本発明の方法のその他の利点は、第１に、その感受性にあり、およびアポトーシス胎児細胞および特に母体起源細胞をこれらの遺伝的および形態的な特徴からみて解析から除去することができるので、その特異性にある。
したがって、本発明の方法は、初期の、非観血的、および特に感受性が高く、特異的な出生前診断を実行するための新規アプローチを提供する。
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トラック22〜42：男性胎児（軌道23,25,27,29,31,33,34,36および38）を有する母体血液から単離した個々の細胞におけるYプライマーのPCR試験。
Yプライマー試験は、トラック25、29、33、36、および38の男性胎児細胞のDNAについて陽性であった。
Yプライマー試験は、トラック23、27、、31、および34の母親細胞からのDNAについて陰性であった.。
トラック22、24、26、28、30、32、35、37、および39：細胞溶解工程の代わりに試料のない緩衝液に対応するネガティブ対照の結果であり、試験の終わりまで継続して挿入した。
トラック41および42：ポジティブ対照の結果：HuH6細胞（トラック40）、3人の男性（トラック41および42）の血液からの白血球に由来する5ngおよび2ngのDNA。M：分子量マーカー（ΦX174HaellI消化）。
ISETによって単離された循環する胎児細胞の形態学的性質の顕微鏡解析。
A：多核のシンシチウム栄養芽層細胞。
B：フィルターにおいて観察された栄養膜細胞層形態を有する単核の細胞。2つの空の細孔は、写真の最上段で見ることができる。
親のかつ栄養芽層のDNA、および母体血から単離しかつ濾過後に個々に回収した細胞からのDNAのSTRマーカーを使用する遺伝形質決定。
STRマーカー（短いタンデムリピート）D16S3018に特異的なマーカーを使用して得られた増幅産物の電気泳動図を示す。
A：この場合に使用したSTRマーカーは、母体（M）または父（F）起源のDNA（ヘテロ接合状態、250bpおよび262bpの対立遺伝子）を識別することができなかった。しかし、栄養膜DNA（T）は、1つの対立遺伝子（250bp）について同型接合状態を示し、同じプロフィールが胎児細胞（FC）についても見られた。対照的に、顕微解剖したもう一つの細胞（母親細胞、MC）は、明らかに母体プロフィール（ヘテロ接合状態）を有した。
B：この例では、STRマーカーは、細胞の父または母体の起源を識別することができた。栄養膜DNA（T）は、256bpの対立遺伝子を有し、母体DNA（M）においても、見られ；対照的に、父のDNAでは異なる258bpの対立遺伝子を有した。2つの対立遺伝子（256bpおよび258bp）が、顕微解剖した2つの細胞において検出され、したがって、これらの胎児起源（FC）を示した。
Claims (19)
- 以下の工程を含む母体血から単離した胎児細胞の出生前における遺伝的もしくは染色体異常、またはその遺伝子型の同定方法：
ａ）純粋な、または希釈された母体血の試料を6〜15μmの範囲の細孔径を有するフィルターで濾過して、それによって上皮細胞を前記フィルターに保持することと；
ｂ）フィルターに保持された細胞を、栄養膜細胞および／またはシンシチウム栄養芽層細胞の特徴である少なくとも１つの免疫学的または細胞学的マーカーの存在について解析して、栄養膜細胞および／またはシンシチウム栄養芽層細胞を同定すること；ならびに、栄養膜細胞および／またはシンシチウム栄養芽層細胞として同定された少なくとも１つの細胞を個々に回収し、それによって胎児起源と推定された単一の細胞または胎児起源と推定された単一の細胞の回収物を得ることと；
ｃ）工程ｂ）の前記単一の細胞または工程ｂ）で得られた前記回収物の単一の細胞を溶解し、それによってこの単一の細胞のゲノムを増幅プライマーに接触可能とすることと；
ｄ）工程ｃ）で得られた前記溶解した単一の細胞のゲノムを増幅し、予め増幅した産物を単一の細胞から得ることと；
ｅ）工程ｄ）で得られた前記予め増幅した産物を用いて、前記単一の細胞の胎児起源の実証、および出生前において胎児細胞の遺伝的もしくは染色体異常、またはその遺伝子型の同定の実行の両方を行うこと：
ここにおいて、
ｉ）前記予め増幅した産物は、母体細胞のゲノムとの区別が可能な遺伝的もしくは多型マーカーの存在または対立形質について、前記予め増幅した産物から前記マーカーを増幅することによって解析され、その結果、前記存在により前記単一の細胞が胎児起源であることが実証され、および
ｉｉ）前記胎児起源であることが実証された場合、前記予め増幅した産物の遺伝的解析によって、胎児の少なくとも１つの遺伝的もしくは染色体異常、またはその遺伝子型が同定される。 - 前記フィルターに保持された前記細胞が個々に顕微解剖によって回収される、請求項１に記載の方法。
- 前記顕微解剖が、細胞が保持された前記フィルターの部分をレーザーで切断し、次いで単一の回収した細胞を適切なチューブに回収することからなる、請求項２に記載の方法。
- 前記胎児のまたはその遺伝子型の、少なくとも１つの遺伝的もしくは染色体の異常の同定が、前記予め増幅された産物における１以上の遺伝的標的を同定することによって行われる、請求項１に記載の方法。
- 工程ｅ）の前に、工程ｄ）の予め増幅した産物を精製し、前記単一の細胞のゲノムに由来する予め増幅されたDNA標品を得る、請求項１に記載の方法。
- 胎児のもしくはその前記遺伝子型の少なくとも１つの遺伝的または染色体の異常が、前記予め増幅した産物から、前記遺伝的標的を有する1つもしくは複数の核酸配列の増幅によって同定される、請求項４に記載の方法。
- 遺伝的標的を有する1つもしくは複数の核酸配列の前記増幅が、前記予め増幅された産物の5分の1よりも少量で行われる、請求項６に記載の方法。
- 胎児のもしくはその前記遺伝子型の少なくとも１つの遺伝的または染色体の異常の前記同定が、前記増幅された核酸配列において行われる遺伝的標的のシーケンシングによって示される、請求項６に記載の方法。
- 前記胎児のもしくはその前記遺伝子型の少なくとも１つの遺伝的または染色体の異常が、前記予め増幅されたDNA標品の全てまたは一部を、特異的なDNAプローブもしくはペプチド核酸（PNA）タイプのプローブでハイブリダイゼーションすることによって同定される、請求項５に記載の方法。
- 前記特異的なDNAプローブが、DNAマイクロアレイまたはマクロアレイを形成する支持体に固定される、請求項９に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記多型マーカーが、マイクロサテライトマーカー、可変数のタンデムリピート（VNTR）マーカー、単一ヌクレオチド多型（SNP）マーカー、または短いタンデムリピート（STR）マーカーである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記胎児起源が、母体細胞のＤＮＡに特異的な、マーカーもしくはマーカーの組合せ、その存在、またはその対立形質を同定することにより示される、請求項１に記載の方法。
- 染色体異常が、前記単一の細胞であって胎児起源が示されたもののゲノムに由来する予め増幅されたDNA標品と、母体起源の細胞または非胎児の対照細胞の予め増幅されたDNA標品との、比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）方法によって同定される、請求項５に記載の方法。
- 前記濾過した母体血が妊娠の第5週以後に作製された血液試料に由来する、請求項１に記載の方法。
- 母体血の前記濾過が、1〜10mＬの母体血の濾過である、請求項１に記載の方法。
- 前記母体の血液試料が濾過溶液で10〜100倍に希釈される、請求項１に記載の方法。
- 前記純粋のまたは希釈された母体血液試料は、8μmの直径の細孔を有するフィルターを使用して濾過される、請求項１に記載の方法。
- 前記フィルターが8μmの直径および5×10４〜5×105細孔／cm2の細孔密度の細孔を有する、請求項１７に記載の方法。
- 前記フィルターはポリカーボネートフィルターであり、および前記ポリカーボネートフィルターの全ての細孔が同一の直径を有する、請求項１に記載の方法。
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