JP4399615B2

JP4399615B2 - トロンビンの安定化手段および組成物

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Publication number: JP4399615B2
Application number: JP2001526919A
Authority: JP
Inventors: 昌宏奥田; 紀弘菊川
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1999-09-27
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2010-01-20
Anticipated expiration: 2020-09-22
Also published as: AU7320300A; EP1221479A4; EP1221479A1; US20060246052A1; ATE346145T1; DE60032001D1; DE60032001T2; WO2001023536A1; EP1221479B1

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、トロンビンの安定化手段および安定化されたトロンビン含有組成物に関する。さらに詳しくは、臨床検査の分野において用いられるトロンビン試薬の安定化手段および安定化されたトロンビンを含有する試薬に関する。
【０００２】
背景技術
フィブリノゲンをフィブリンに変換する酵素であるトロンビンは血液凝固反応過程で非常に重要な役割をしている。臨床検査の分野においては、トロンビンを用いてフィブリノゲン濃度を測定したり、トロンビン阻害物質の活性、例えば、アンチトロンビン活性、ヒルジンの活性、さらに化学合成阻害剤の活性を測定するために多く用いられている。
しかしながら、一般にトロンビンは不安定であるため、長期間保存する場合には通常凍結乾燥処理を施して保存していた。
【０００３】
トロンビンを安定化させる試みは現在まで数多く行われてきた。例えば、特開昭５６−３９７８２号公報、特公平３−７６２９２号公報、特開平１−９３５３６号公報、特開平２−５３７３２号公報、特開昭６４−４０４３３号公報、特開平７−３３７９９号公報、特開平９−３２８４３６号公報、特公平８−１３７５０号公報、特開平７−１６５６０４号公報、特公平７−６４７４７号公報、特開昭６３−１９２７２３号公報、特開平４−３２０６８３号公報、特公昭５８−２６９５６号公報、特開平１０−５２２６７号公報、特開昭６０−１１１２７２１号公報、特開昭５６−６８６０７号公報にその例を見ることができる。
しかし、これらのいずれもトロンビンの安定化方法として完全なものではなく、とりわけ臨床検査診断薬に用いるには十分な安定性を示すには至っていない。
【０００４】
他方、測定試薬に用いられるトロンビンは、一般にヒトまたは動物由来のトロンビンを適当な緩衝液や安定化剤の含まれた溶液中に目標とする力価となるように加えて調製され、溶液または凍結乾燥品として保存、使用される。調製されたトロンビン試薬は、前述の如く様々な目的に用いられるが、いずれの場合にも、最終的にトロンビン自身の活性を測定することによりその目的を達成している。
【０００５】
トロンビンの活性の測定には、人工合成基質を用いた測定法と天然の基質であるフィブリノゲンを用いた測定法が一般的に用いられる。前者は比色分析が通常であり、後者は凝固時間分析が一般的である。後者の凝固時間分析法は、その検出手段として、散乱光や透過光の変化を検出することにより凝固時間を求める方法や、凝固形成により球の移動ができなくなることを検出することにより凝固時間を求める物理的方法等が知られている。
上記の検出方法による凝固時間測定の最大の課題は、測定の再現性が悪いことであった。特にトロンビンを用いたフィブリノゲンのフィブリンへの変換反応は液相反応から固相へ移行する反応であり、反応条件すなわちｐＨやイオン強度等により大きく変動することが知られている。これら反応条件の影響によって再現性が悪くなっていた。そこで、液状で安定なトロンビンを用いた、反応条件の影響を受けない、再現性の良い測定系の構築が待ち望まれていた。
【０００６】
発明の開示
本発明の目的は、トロンビンの安定化手段および安定化された測定再現性の良好なトロンビン含有組成物および当該組成物を用いた試薬を提供することにある。
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、トロンビンに、カルシウムイオンを、またはカルシウムイオンと水溶性の有機酸を混合して含ませることにより、溶液状態、凍結乾燥品、または凍結乾燥処理した後に再溶解させた溶液のいずれにおいてもトロンビンの失活を防止できることを見出した。さらに、カルシウムイオン、水溶性有機酸以外にも、界面活性剤やタンパク質等がトロンビンに対する安定化効果を示すことを見出した。また、安定化効果を示す上記物質の他に、高分子多糖類または合成高分子類の１種または２種以上を混合して含有させることにより、測定再現性の良好なトロンビン試薬が調製できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、
（１）検体中のフィブリノゲン濃度を測定するための液状試薬であって、トロンビンと、前記液状試薬中の前記トロンビンを安定化させる安定化剤とを含有し、
前記安定化剤が、カルシウムイオン、有機酸および非イオン性界面活性剤を含むフィブリノゲン濃度測定試薬、
（２）前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビトールエステルである前項１記載の試薬、
（３）前記非イオン性界面活性剤の終濃度が０．００１〜１重量／容量％である前項１または２記載の試薬、
（４）高分子多糖類をさらに含有する、前項１〜３のいずれかに記載の試薬、
（５）前記高分子多糖類がデキストラン類である前項４に記載の試薬、
（６）前記高分子多糖類の終濃度が１〜１０重量／容量％である前項４または５記載の試薬、
（７）検体中のフィブリノゲン濃度を測定するための液状試薬中で、トロンビンを、カルシウムイオン、有機酸および非イオン性界面活性剤と共存させることにより、前記トロンビンの安定性を向上させる、トロンビンの安定化方法、からなる。
【０００８】
発明を実施するための最良の形態
本発明のトロンビン安定化手段および該安定化手段が導入されたトロンビン含有組成物について、さらに詳しく説明する。本発明のトロンビンの安定化手段は、カルシウムイオン、界面活性剤、およびタンパク質から選択される１または２以上のトロンビン安定化機能を有する化合物のトロンビンについての安定化有効量を含有させることを特徴とする。また、これらの化合物に加えて、水溶性有機酸でトロンビン安定化機能を有する化合物をさらに併用するトロンビン安定化手段でありうる。ここで、安定化機能を有する化合物の安定化有効量とは、安定性を向上させる量であればよく、特に限定されないが、例えばトロンビンを含む溶液を２５℃で６ヶ月保存した場合において、トロンビン溶液調製直後のトロンビン活性に対して少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上の活性が保持される程度の安定化機能を有する化合物の量を意味する。ここで手段とは、目的を達成するために使用する方法および／または媒体を意味する。
【０００９】
（トロンビン）
本発明のトロンビン安定化手段で安定化されるトロンビンは、動物由来、ヒト血漿由来、または遺伝子工学的手法で調製されたもののいずれでもよい。また、該安定化手段が導入されたトロンビン含有組成物の、溶液中のトロンビン濃度は、その活性が目的とする活性値に調整されていればよく、特に限定されない。
【００１０】
（カルシウムイオン）
トロンビンの安定化手段として用いるカルシウムイオンとして、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルクロン酸カルシウム、酒石酸カルシウム等の水溶性のカルシウム化合物が例示される。これらカルシウム化合物は１種または２種以上を組み合わせて選択し使用することができる。
カルシウム化合物のトロンビンに対する安定化有効量は、安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばトロンビンの液状溶解時における化合物の終濃度が５ｍＭ〜１００ｍＭであることが好適で、より好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭである。
【００１１】
（有機酸）
トロンビンの安定化手段として用いる有機酸は、水溶性のものが用いられ、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、グルコン酸、乳酸、グルクロン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、グルタル酸、アミノ酢酸、アミノカプロン酸等を例示することができる。これらの有機酸は、遊離酸またはその塩のどちらを用いても良い。また、１種もしくは２種以上を組み合わせて選択し使用することができる。
有機酸のトロンビンに対する安定化有効量は、安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばトロンビンの液状溶解時における有機酸の終濃度が１０ｍＭ〜５００ｍＭであることが好適で、より好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭである。
【００１２】
（界面活性剤）
トロンビンの安定化手段として用いる界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が、陽イオン性界面活性剤として、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムクロリド等が、両イオン性界面活性剤として、３−［（３−コラミドプピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、パルミトイルリゾレシチン、ドデシル−Ｎ−ベタイン、ドデシル−β−アラニン等が、非イオン性界面活性剤として、オクチルグルコシド、ペプチルチオグルコシド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（トライトンＸシリーズ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル（Ｔｗｅｅｎシリーズ）を例示することができる。
【００１３】
これら界面活性剤のうち非イオン性界面活性剤が特に好ましく用いられる。また、これら界面活性剤は１種もしくは２種類以上を組み合わせて選択し用いることができる。
界面活性剤のトロンビンに対する安定化有効量は、安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばトロンビンの液状溶解時における界面活性剤の終濃度が０．００１〜１重量／容量％であることが好適で、より好ましくは０．００５〜０．１重量／容量％で用いる。
【００１４】
（タンパク質）
トロンビンの安定化手段として用いるタンパク質としては、アルブミン、ゼラチン、グロブリンを例示することができるが、トロンビンに対する生理学的または生化学的機能をもたないものは一般的に使用できる。これらタンパク質は１種もしくは２種以上を組み合わせて選択し用いることができる。
タンパク質のトロンビンに対する安定化有効量は、安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばトロンビンの液状溶解時におけるタンパク質の終濃度が０．０５〜１０重量／容量％であることが好適で、より好ましくは０．１〜５重量／容量％である。
上記、トロンビンの安定化手段に用いるカルシウムイオン、水溶性有機酸、界面活性剤、およびタンパク質は、トロンビンの溶液状態での保存時、乾燥状態での保存時、および乾燥もしくは凍結乾燥品を溶解した時等の、トロンビンの酵素活性への影響を考慮して選択され用いられる。これらは、単独で使用しても安定化効果があり、さらに２種以上を選択して使用することにより一層の安定化効果が期待できる。好ましくは２種以上を組み合わせて使用する。特に好ましくはカルシウムイオンと水溶性有機酸とを組み合わせて使用することであり、トロンビンの安定化効果はほぼ１００％得られる。トロンビンの安定化機能を有する上記化合物を２種以上組み合わせて含有させる場合、上記各化合物の使用量の範囲内で各化合物を使用すればよい。また、これらの化合物を単独で使用する場合においても、２種以上組み合わせて使用する場合においても、トロンビンの液状製剤にあっては液状製剤中に上記の濃度で含有させ、乾燥製剤または凍結乾燥製剤にあっては最終的に液状にしたときの終濃度が上記の濃度になるように調整し含有させる。
【００１５】
（測定再現性の向上のための添加物）
本発明は、上記本発明のトロンビンの安定化手段に加えて、トロンビン活性の測定再現性を向上させるために、高分子多糖類、および合成高分子類から選択された１種または２種以上を組み合わせてその有効量を含有させてもよい。この場合における測定再現性の有効量とは、再現性を向上させる量であればよく、特に限定されないが、例えばトロンビンを含有した試薬を用いて被検物質を２０回測定した場合において、変動係数であるＣＶ値が、少なくとも１０％以下、好ましくは７％以下、より好ましくは５％以下に保つことができる量をいう。
【００１６】
高分子多糖類としては、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストラン２００，０００、デキストラン５００，０００、フィコール等、合成高分子類としては、ポリビニルアルコール５００、ポリビニルアルコール１５００、ポリビニルアルコール２０００、ポリエチレングリコール１５００、ポリエチレングリコール２０００、ポリエチレングリコール４０００、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール８０００、ポリエチレングリコール２００００およびポリビニルピロリドン等を挙げることができる。しかし、これらと同等物であって、トロンビンを含有した試薬を用いる被検物質の測定再現性向上が達成される限りはこれらに限定されるものではない。また、これらの高分子物質は１種もしくは２種以上を組み合わせて選択し使用できる。
【００１７】
高分子多糖類もしくは合成高分子類の再現性有効量は、再現性を向上させる量であればよく、特に限定されないが、例えばトロンビンの、液状時における終濃度が、１〜１０重量／容量％であることが好適で、より好ましくは１〜３重量／容量％である。トロンビンの液状製剤にあっては液状製剤中に上記の濃度で含有させ、乾燥製剤または凍結乾燥製剤にあっては最終的に液状にしたときの終濃度が上記の濃度になるように調整し含有させる。
【００１８】
（トロンビン含有組成物）
本発明のトロンビン含有組成物は、トロンビンに、少なくともカルシウムイオン、界面活性剤、およびタンパク質から選択される１または２以上のトロンビン安定化機能を有する化合物をトロンビンについての安定化有効量を含有してなるか、これらに加えてトロンビン安定化機能を有する水溶性有機酸をその有効量含有してなる。また、これらのトロンビン安定化機能を有する化合物の他に、トロンビンを含有した試薬を用いる被検物質の測定再現性を向上させるために、高分子多糖類、および合成高分子類から選択された１種または２種以上を組み合わせてその有効量を含有せしめてなる。トロンビン含有組成物は溶液状態において、通常緩衝液が使用される。その種類は、ｐＨ４〜９の範囲に緩衝能をもつ緩衝剤を適宜選択して用いる。例えば、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳＯ、ＡＤＡ、ＭＥＳ等から１種もしくは２種以上が選択され用いられる。またトロンビン含有組成物には適当な防腐剤を添加してもよい。防腐剤としては、シプロフロキサシン、プロピオン酸もしくは安息香酸ナトリウム等の中から１種もしくは２種以上が選択して用いられる。また、必要に応じて食塩等の塩や、アミノ酸、糖等の一般的な安定化剤等を含ませることもある。
【００１９】
かくして得られるトロンビン含有組成物は、従来使用されているトロンビン試薬や組成物と比較して安定性が高く、トロンビンを含有した試薬を用いる被検物質の測定再現性もよい。
具体的には、５ｍＭ〜２５ｍＭの緩衝液に、５ｍＭ〜１００ｍＭのカルシウムイオン、例えば乳酸カルシウムを加え、１０ｍＭ〜５００ｍＭの有機酸、例えば酢酸を加え、さらに合成高分子類、例えばポリビニルアルコール５００を１〜１０重量／容量％、および／または界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０を０．００１〜１％添加する。これらの化合物の添加濃度は、適宜調整可能である。防腐剤を添加した後、溶液のｐＨを６〜７付近に調整して母液を調製する。この母液に目的とする濃度または活性量のトロンビンを溶解し、トロンビン溶液を調製する。その溶液を適当な孔径のフィルターで濾過することもある。このようにして調製されたトロンビン溶液は、そのまま液状試薬としてあるいは凍結乾燥処理して乾燥製剤試薬として製剤化され使用に提供される。上記具体例は、本発明のトロンビン含有組成物の一例を示すものであり、本発明はこの例に限定されるものではない。
【００２０】
実施例
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１）
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）（無添加溶液）、同緩衝液に２５ｍＭの乳酸カルシウムを加えた溶液（Ｃａ添加溶液）、同緩衝液に１００ｍＭの酢酸を加えｐＨ６．０に調整した溶液（酢酸添加溶液）、および酢酸添加溶液に２５ｍＭの乳酸カルシウムを加えた溶液（二種添加溶液）の４種類の溶液を調製し、それぞれにヒトトロンビンを１００単位／ｍｌとなるように添加しトロンビン溶液を調製した。調製したトロンビン溶液に防腐剤としてシプロフロキサシン０．１重量／容量％を加えて０．２２μｍのフィルターで除菌ろ過後、ガラス瓶に３ｍｌずつ分注し、密栓後２５℃で保存した。調製直後、１、２、３、４、５および６ヶ月後のトロンビンの残存活性を日本薬局方に従って測定し、トロンビンの安定化効果を調べた。その結果を表１に示した。
【００２２】
【表１】

【００２３】
この結果、少なくともカルシウムを添加することによりトロンビンが安定化され、２５℃で６ヶ月保存した後でも７２％の残存活性が保持された。酢酸添加の効果は、特開昭５６−３９７８２に開示されている効果ではあるが、有機酸である酢酸の添加に加えてさらにカルシウムを添加することにより安定化効果がより高くなり、２５℃で６ヶ月保存した後も全くトロンビン活性の低下は認められず、完全に安定化されることがわかった。
【００２４】
（実施例２）
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に１５０ｍＭの食塩、０．１重量／容量％のアジ化ナトリウムを添加した後、２０ｍＭとなるように乳酸カルシウムを添加した溶液および乳酸カルシウム無添加の溶液を調製した。これらの溶液に、更にポリビニルアルコール２０５（ＰＶＡ２０５）、ポリビニルアルコール５００（ＰＶＡ５００）、またはポリビニルアルコール１５００（ＰＶＡ１５００）をそれぞれ無添加、０．１、０．５、１、２、３および５重量／容量％となるように添加した溶液を調製した。
各溶液にトロンビンを１００単位／ｍｌとなるように溶解し、トロンビン溶液を調製した。調製した各トロンビン溶液を用いて、市販のコントロール血漿についてフィブリノゲン濃度の測定を行った。コントロール血漿をフィブリノゲン測定用緩衝液で１０倍希釈したものを試料として、その１００μｌに上記調製したトロンビン溶液５０μｌを加え、３７℃でその凝固するまでの時間を測定した。
上記一連の操作は、全自動凝固分析装置コアグレックス７００（島津製作所製）を用いて行った。同一試料を同時に２０回測定して得られた凝固時間をもとにその変動係数を求め再現性の比較を行った。その結果を表２に示した。
【００２５】
【表２】

【００２６】
表２から、変動係数が乳酸カルシウムを２０ｍＭ添加したトロンビン溶液の方が乳酸カルシウム無添加のトロンビン溶液よりも小さくなり、再現性が向上することがわかった。さらにポリビニルアルコールを添加することにより再現性の向上がはかられることが判明し、１〜３重量／容量％でその効果は最大であった。実施例１の結果と実施例２の結果より、カルシウムイオンはトロンビンの安定化効果と共に、再現性の向上に有効であることが判った。
【００２７】
（実施例３）
ポリビニルアルコールに代えてデキストラン４０（Ｄｅｘ４０）、デキストラン７０（Ｄｅｘ７０）、デキストラン２００，０００（Ｄｅｘ２００）を用い、その濃度を０．１、０．５、１、３、５、６、８および１０重量／容量％とし、全てに２０ｍＭ乳酸カルシウムを含ませた以外はすべて実施例２と同様に操作して、再現性の比較を行った。その結果を表３に示した。
【００２８】
【表３】

【００２９】
表３から、高分子多糖類であるデキストラン類を添加することにより再現性の向上がはかられることが判明し、１〜１０重量／容量％の濃度でその効果は最大であった。
【００３０】
（実施例４）
試料として２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）（無添加溶液）、同緩衝液に２５ｍＭの乳酸カルシウムを加えｐＨ６．０に調整した溶液（Ｃａ添加溶液）、同緩衝液に１００ｍＭの酢酸を加えｐＨ６．０に調整した溶液（酢酸添加溶液）、同緩衝液に０．０２重量／容量％のＴｗｅｅｎ８０を加えｐＨ６．０に調整した溶液（Ｔｗｅｅｎ８０溶液）、同緩衝液に１．０重量／容量％のウシ血清アルブミンを加えｐＨ６．０に調整した溶液（１％ＢＳＡ）、同緩衝液に２．０重量／容量％のウシ血清アルブミンを加えｐＨ６．０に調整した溶液（２％ＢＳＡ）、同緩衝液に０．１重量／容量％の水溶性ゼラチンを加えｐＨ６．０に調整した溶液（水溶性ゼラチン）、および、上記酢酸添加溶液に２５ｍＭの乳酸カルシウムを加えｐＨ６．０に調整した溶液（二種添加溶液）、上記酢酸添加溶液に２５ｍＭの乳酸カルシウムおよび０．０２重量／容量％のＴｗｅｅｎ８０を加えｐＨ６．０に調整した溶液（三種添加溶液）の９種類の溶液を調製し、それぞれにヒトトロンビンを１００単位／ｍｌとなるように添加し、トロンビン溶液を調製した。
調製したトロンビン溶液に防腐剤としてシプロフロキサシン０．１重量／容量％を加え、０．２２μｍのフィルターで除菌ろ過後、ガラス瓶に３ｍＬずつ分注し、密栓後２５℃で保存した。調製後、１、２、３、４、５および６ヶ月後のトロンビンの残存活性を日本薬局方に従って測定し、トロンビンの安定化効果を調べた。その結果を表４に示した。
【００３１】
【表４】

【００３２】
この結果、無添加溶液に比べ、Ｃａ、酢酸、Ｔｗｅｅｎ８０、１％ＢＳＡ、２％ＢＳＡ、水溶性ゼラチンの添加によりトロンビンの安定性が向上し、さらに上記Ｃａおよび酢酸の二種添加溶液、Ｃａ、酢酸およびＴｗｅｅｎ８０の三種添加溶液により、さらに安定化性が向上した。
【００３３】
産業上の利用可能性
以上説明したように、少なくともカルシウムの添加によりトロンビンが安定化され、さらに有機酸の補助添加により一層の安定化効果が得られた。その他、トロンビンの安定化に、界面活性剤やタンパク質も有用であることを見出した。また、カルシウムイオンはトロンビンの安定化効果と共に、トロンビン活性の測定再現性の向上に有効であることも判明した。さらに高分子多糖類または合成高分子類が、トロンビン活性の測定再現性の向上に有用であることを見出した。かくして本発明のトロンビンの安定化手段および該安定化手段を導入したトロンビン含有組成物は、従来にないトロンビンの安定化手段を提供するものであり、極めて有用な臨床検査用試薬組成物を提供するものである。

Claims

検体中のフィブリノゲン濃度を測定するための液状試薬であって、トロンビンと、前記液状試薬中の前記トロンビンを安定化させる安定化剤とを含有し、
前記安定化剤が、カルシウムイオン、有機酸および非イオン性界面活性剤を含むフィブリノゲン濃度測定試薬。
前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビトールエステルである請求項１記載の試薬。
前記非イオン性界面活性剤の終濃度が０．００１〜１重量／容量％である請求項１または２記載の試薬。
高分子多糖類をさらに含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の試薬。
前記高分子多糖類がデキストラン類である請求項４に記載の試薬。
前記高分子多糖類の終濃度が１〜１０重量／容量％である請求項４または５記載の試薬。
検体中のフィブリノゲン濃度を測定するための液状試薬中で、トロンビンを、カルシウムイオン、有機酸および非イオン性界面活性剤と共存させることにより、前記トロンビンの安定性を向上させる、トロンビンの安定化方法。