JP4392812B2 - Novel optically active 4-amino-2-methylbutyric acid derivative and method for producing the same - Google Patents

Description

（式中、Ｘはアルコキシカルボニル基、Ｒは水素原子または炭素数１から６の直鎖ま若しくは分岐状のアルキル基、＊は不斉炭素を示す。）
で表される新規光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体である。
【０００６】
また、本発明は、一般式、
【化４】

（式中、Ｘはアルコキシカルボニル基、Ｒは炭素数１から６の直鎖若しくは分岐状のアルキル基を示す。）
で表されるラセミ体エステルに該エステルの不斉加水分解反応を触媒する、微生物、その処理物、または酵素を作用させることを特徴とする上記新規光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体の製造方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
上記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）においてＸで表されるアルコキシカルボニル基としては、通常、アミノ基の保護に用いるものであり、酵素反応を阻害しないものであれば、特に制限無く使用可能である。例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基及びベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【０００８】
上記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）においてＲで表されるアルキル基としては,炭素数１から６の直鎖または分岐状のアルキル基であり、酵素反応の基質となるものであればよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基及びシクロヘキシル基等が挙げられる。
【０００９】
上記一般式（ＩＩ）で表されるラセミ体Ｎ−置換４−アミノ−２−メチル酪酸エステルは、任意の方法で製造可能である。例えば、青酸とメタクリル酸メチルより３−シアノイソ酪酸メチルを得た後(特開平８−２９１１５７号公報参照)、アルカリ加水分解で３−シアノイソ酪酸を得る。得られた３−シアノイソ酪酸を適当な溶媒中で、例えば、パラジウム−カーボンなどの触媒存在下、中圧で接触還元を行えば４−アミノ−２−メチル酪酸が得られる。得られた４−アミノ−２−メチル酪酸を適当な溶媒中でアミノ基を保護し、常法に従いエステル化反応を行えば、酵素反応の基質であるラセミ体エステルが得られる。アミノ基の保護には、例えば、クロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート等を用いることもできる。エステル化は適当なアルコール、脱水剤と反応させればよい。
【００１０】
本発明に使用する微生物、その処理物、または酵素は、一般式（ＩＩ）で表されるラセミ体エステルを不斉加水分解し、一般式（Ｉ）で表される光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体を与えるものであれば特に制限はない。微生物、植物又は動物由来の市販加水分解酵素（エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ等）、各種保存菌株の微生物培養菌体及び自然界より新たに単離された微生物等が使用可能である。
【００１１】
不斉加水分解酵素を生産する微生物として、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エセリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物が挙げられる。バチルス属に属する微生物としては、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス リケニフォルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ）、バチルス ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｉｘａ）、アスペルギルス属に属する微生物としては、アスペルギルスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス ソーユ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）、リゾプス属に属する微生物としては、リゾプス ジャポニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、ムコール属に属する微生物としては、ムコール ジャポニカス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、フミコーラ属に属する微生物としては、フミコーラ ラニュギノーザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス属に属する微生物としては、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、具体的にはシュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＭＲ−２０６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８４６）、エセリキア属に属する微生物としてはエセリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、具体的にはエセリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＲ−２１０３（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３５）等が挙げられる。尚、エセリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＲ−２１０３（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３５）は、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＭＲ−２０６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８４６）由来のエステラーゼ遺伝子で形質転換された株である。
【００１２】
また、本発明に使用するエステル不斉加水分解酵素としては、市販の酵素を使用することも可能である。例えば、ＮＯＶＯ社製のアルカラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来）、リポラーゼ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ属由来）及びフラボザイム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来）、天野製薬社製のリパーゼＰＳ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ由来）、リパーゼＭ−１０（Ｍｕｃｏｒ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ由来）、ニューラーゼＦ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属由来）及びリパーゼＡＹ（Ｃａｎｄｉｄａ属由来）、シグマ社製のリパーゼＶＩＩ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来）及びリパーゼＸＸＩＩＩ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来）等が挙げられる。動物由来の酵素としては、シグマ社製のリパーゼＩＩ（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａ由来）、ブタやウシの膵臓由来のパンクレアチン、トリプシン及びＰＰＬ等が挙げられる。
【００１３】
本発明で使用する微生物の培養は、液体培地でも固体培地でも行うことができる。培地としては、微生物が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの成分を適宜配合したものを用いる。炭素源としては、例えばグルコース、シュクロース、マルトース等の糖類、酢酸、クエン酸等の有機酸類あるいはその塩、エタノール、グリセロール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、廃糖蜜、アミノ酸等の天然窒素源の他、各種無機・有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて使用される。微生物の加水分解能を向上させるため、培地に少量のエステルを加えることも有効である。培養は微生物が生育可能である温度、ｐＨで行われるが、使用する菌株の最適培養条件で行えばよい。例えば、ｐＨ４〜１０、温度２０〜５０℃の範囲で数時間〜数十時間培養する。微生物の生育を促進させるため、通気攪拌を行っても良い。
【００１４】
本発明においては、培養して得られる培養液そのままか、あるいは培養液から遠心分離などの集菌操作によって得られる微生物菌体、もしくはその処理物を用いることもできる。処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、無細胞抽出物、無細胞抽出物からゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の分離操作により得られた粗酵素または精製酵素等が挙げられる。また、微生物菌体または酵素は、架橋したアクリルアミドゲルなどに包括固定化したり、イオン交換樹脂、珪藻土などの固体担体に物理的あるいは化学的に固定化して用いることができる。
【００１５】
本発明において一般式（ＩＩ）で表されるラセミ体エステルの不斉加水分解反応は、次のようにして行うことができる。すなわち、反応媒体に酵素反応基質であるラセミ体エステルを添加し、溶解または懸濁し、触媒となる微生物、その処理物、または酵素を加える。反応媒体としては、例えば、イオン交換水、緩衝液等が用いられる。反応液中の基質濃度は、０．１〜７０重量％の間で特に制限はないが、基質の溶解度、変換効率などを考慮すると５〜５０重量％で行うの好ましい。また、基質の溶解性を向上させるため、例えば、メタノール、エタノールなどの低級アルコールを系内に添加することも可能である。反応温度は酵素の至適温度と基質の安定性を考慮して、通常５〜７０℃、好ましくは１０〜５０℃で行えばよい。反応液のｐＨは、通常４．０〜１０．０であり、好ましくは６．０〜８．０の範囲である。反応が進行するに従い、生成したカルボン酸によりｐＨが低下するので適当な中和剤を添加し、最適ｐＨを維持することが望ましい。
【００１６】
反応終了液より生成物の分離精製は、次のようにして行うことができる。中性付近で一般的な有機溶媒、例えば、酢酸エチル、ヘキサン、トルエン、ジエチルエーテル、塩化メチレン、クロロホルムなどを用いて抽出操作を行い、未反応の基質を分離することができる。また、抽出残液に硫酸や塩酸等の強酸を加え、ｐＨを２．０程度に調整し、上記と同様の一般的な抽出操作を行うことにより、酵素反応生成物である光学活性Ｎ−置換４−アミノ−２−メチル酪酸を抽出分離することができる。
【００１７】
本発明で得られる光学活性Ｎ−置換４−アミノ−２−メチル酪酸およびその対掌体エステルは、そのまま使用可能であるが、目的に応じて任意の手法で容易に脱保護が可能である。
【００１８】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものでは無い。
【００１９】
【実施例】
参考例１
ラセミ体Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸エステルの製造：
特開平８−２９１１５７号、実施例１の方法で得られた３−シアノイソ酪酸メチル１００ｇを５００ｍｌの３Ｎ ＮａＯＨに滴下し室温で一晩攪拌した。反応終了液に硫酸を滴下し、ｐＨを２．０に調整し、１／３量の酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機相を減圧濃縮し、８１．５ｇの３−シアノイソ酪酸を得た。得られた３−シアノイソ酪酸３８ｇを３５０ｍｌの酢酸に溶解し、１０％パラジウム−カーボンを５ｇ添加し、オートクレーブに仕込み、４０℃、水素圧１２kg/ｃｍ^２で接触還元を行った。ほぼ理論量の水素が吸収された時点（約４時間後）で反応を終了し、触媒を濾別し、酢酸を減圧留去した。油状残分にイソプロパノールを添加し、冷却し、析出した結晶を回収し、３２．０ｇの白色パウダーを得た。ＮＭＲで構造を確認したところ、４−アミノ−２−メチル酪酸と確認された。
【００２０】
４−アミノ−２−メチル酪酸１０ｇを５０ｍｌの４Ｎ ＮａＯＨに溶解し、氷冷下クロロギ酸メチル９ｇを滴下した後、室温で数時間攪拌した。反応終了後、硫酸でｐＨを酸性とし、酢酸エチルで抽出し、減圧濃縮し、１２．３ｇのＮ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸を得た。これを常法によりエステル化し、１１．６ｇのラセミ体Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチルを得た。
【００２１】
実施例１
光学活性Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ２−メチル酪酸及びその対掌体エステルの製造：
エセリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＲ−２１０３（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３５）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍｌに植菌し、３７℃、２０時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離により集菌し、イオン交換水で洗浄した後、全量を５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液に参考例１で得られたラセミ体Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチル５ｇを加え、３０℃にて２０時間反応させた。この間、反応液のｐＨは１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整した。反応終了後、遠心分離により菌体を除き、未反応のＮ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチルを３０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮し、２．０１ｇの残分を得た。このサンプルの物性値及び^１Ｈ−ＮＭＲチャート（図１）を以下に示した。次いで抽出残水相のｐＨを希硫酸で２．０に調整し、酵素反応生成物である光学活性Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸を３０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮し、１．７８ｇの残分を得た。このサンプルの物性値及び^１Ｈ−ＮＭＲチャート（図２）を以下に示した。
【００２２】
（＋）−Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチル
＜^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル＞ ＤＭＳＯ、内部標準ＴＭＳ（第１図）
ｄ^Ｈ １．０７２〜１．０９７ （３Ｈ，ｄ，−ＣＨ_３）
ｄ^Ｈ １．４５９〜１．４９５ （１Ｈ，ｍ，−ＣＨ_２）
ｄ^Ｈ １．６９０〜１．７４６ （１Ｈ，ｍ，−ＣＨ_２）
ｄ^Ｈ ２．４３３〜２．４８９ （１Ｈ，ｑ，−ＣＨ）
ｄ^Ｈ ２．９５３〜３．０１８ （２Ｈ，ｄｄ，−ＣＨ_２）
ｄ^Ｈ ３．５１７、３．６００ （６Ｈ，ｓ，−ＣＨ_３）
ｄ^Ｈ ７．０７２ （１Ｈ，ｓ，−ＮＨ）
＜比旋光度＞
［α］_Ｄ ^２６＝＋２７．４８（ｃ＝２．２２、ＭｅＯＨ）
＜光学純度＞
９９．８％ｅ．ｅ． （カラム；Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ， 移動相；ヘキサン／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１）
【００２３】
（−）−Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸
＜^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル＞ ＤＭＳＯ、内部標準ＴＭＳ（第２図）
ｄ^Ｈ １．０６１〜１．０８６ （３Ｈ，ｄ，−ＣＨ_３）
ｄ^Ｈ １．４０２〜１．５０４ （１Ｈ，ｍ，−ＣＨ_２）
ｄ^Ｈ １．６７５〜１．７７８ （１Ｈ，ｍ，−ＣＨ_２）
ｄ^Ｈ ２．３１２〜２．３８９ （１Ｈ，ｑ，−ＣＨ）
ｄ^Ｈ ２．９７１〜３．０４５ （２Ｈ，ｄｄ，−ＣＨ_２）
ｄ^Ｈ ３．５２４ （３Ｈ，ｓ，−ＣＨ_３）
ｄ^Ｈ ７．０５０ （１Ｈ，ｓ，−ＮＨ）
ｄ^Ｈ １２．０ （１Ｈ，ｂｒ，−ＯＨ）
＜比旋光度＞
［α］_Ｄ ^２６＝−１５．０７ （ｃ＝３．４５、ＭｅＯＨ）
＜光学純度＞
９６．８％ｅ．ｅ． （カラム；Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ， 移動相；ヘキサン／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１）
【００２４】
実施例２〜７
光学活性Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸及びその対掌体エステルの製造：
１ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に参考例１で得られたラセミ体Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチル１０ｍｌを加え、市販の酵素（液体の場合は５ｍｌ、粉末の場合は５ｍｇ）を加え、３０℃にて２０時間反応させた。得られた残存エステル及び酸画分の分析結果を表１に示した。なお、括弧内の（＋，−）は、サンプルの旋光性を示した。
【００２５】
【表１】

【００２６】
【発明の効果】
新規光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体は、医農薬合成中間体として有用であり、また本方法により高純度の光学活性体が製造可能である。
【００２７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 （＋）−Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチルの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図２】 （−）−Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The novel optically active 4-amino-2-methylbutyric acid derivative obtained in the present invention is a useful compound that is expected to be used in various applications as an optically active medical and agricultural chemical synthesis intermediate.
[0002]
[Prior art]
For example, as a method for producing an optically active 4-amino-2-methylbutyric acid which is a related compound, a method of preferential crystallization using quinine after phthalimidation of racemic 4-amino-2-methylbutyric acid is known. . (Adams R., Fres D., J. Am. Chem. Soc., 81, 4946-4951 (1959)) However, purification requires a complicated operation of repeating recrystallization, and the recovery rate is 17-22. The optical purity is not clear.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel optically active 4-amino-2-methylbutyric acid derivative and a method for producing the same.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted intensive research. As a result, the microorganisms, processed products, or enzymes are allowed to act on racemic N-substituted 4-amino-2-methylbutyric acid esters. Was found to yield an optically active 4-amino-2-methylbutyric acid derivative, thereby completing the present invention.
[0005]
That is, the present invention has the general formula:
[Chemical 3]

(In the formula, X represents an alkoxycarbonyl group, R represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and * represents an asymmetric carbon.)
Is a novel optically active 4-amino-2-methylbutyric acid derivative represented by:
[0006]
The present invention also includes a general formula:
[Formula 4]

(In the formula, X represents an alkoxycarbonyl group, and R represents a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.)
Of the novel optically active 4-amino-2-methylbutyric acid derivative described above, characterized by allowing a microorganism, a treated product thereof, or an enzyme to act on the racemic ester represented by It is a manufacturing method.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The alkoxycarbonyl group represented by X in the above general formulas (I) and (II) is usually used for protecting an amino group and can be used without particular limitation as long as it does not inhibit the enzyme reaction. is there. Examples thereof include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a tert-butoxycarbonyl group, and a benzyloxycarbonyl group.
[0008]
In the above general formulas (I) and (II), the alkyl group represented by R is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and may be any substrate that can serve as a substrate for an enzymatic reaction. Examples thereof include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, an isobutyl group, a pentyl group, a hexyl group, and a cyclohexyl group.
[0009]
The racemic N-substituted 4-amino-2-methylbutyric acid ester represented by the general formula (II) can be produced by any method. For example, after obtaining methyl 3-cyanoisobutyrate from hydrocyanic acid and methyl methacrylate (see JP-A-8-291157), 3-cyanoisobutyric acid is obtained by alkaline hydrolysis. When the obtained 3-cyanoisobutyric acid is subjected to catalytic reduction in an appropriate solvent at an intermediate pressure in the presence of a catalyst such as palladium-carbon, 4-amino-2-methylbutyric acid is obtained. When the amino group of the obtained 4-amino-2-methylbutyric acid is protected in an appropriate solvent and an esterification reaction is carried out according to a conventional method, a racemic ester that is a substrate for the enzyme reaction is obtained. For protecting the amino group, for example, methyl chloroformate, ethyl chloroformate, di-tert-butyl dicarbonate and the like can be used. Esterification may be performed by reacting with an appropriate alcohol or dehydrating agent.
[0010]
The microorganism, treated product, or enzyme used in the present invention undergoes asymmetric hydrolysis of the racemic ester represented by the general formula (II) to produce an optically active 4-amino-2 represented by the general formula (I). -There is no restriction | limiting in particular if a methylbutyric acid derivative is given. Commercially available hydrolyzing enzymes (esterases, lipases, proteases, etc.) derived from microorganisms, plants or animals, microbial cultures of various storage strains, microorganisms newly isolated from nature, and the like can be used.
[0011]
Examples of microorganisms that produce asymmetric hydrolase include, for example, the genus Bacillus, the genus Aspergillus, the genus Rhizopus, the genus Mucor, the genus Candida, the genus Humicola, And microorganisms belonging to the genus Pseudomonas and the genus Escherichia. Examples of microorganisms belonging to the genus Bacillus include Bacillus subtilis, Bacillus licheniformus, Bacillus polyvix, and Aspergillus sp. ), Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus sojae, Aspergillus saito, Microorganisms belonging to the genus Aspergillus saitoi As a microorganism belonging to the genus Rhizopus japonicus, Rhizopus delemar, and the genus Mucor, the genus Mucor javnicus, the genus Mucor mihie, As a microorganism belonging to the genus Humicola lanuginosa and Pseudomonas, Pseudomonas putida, specifically, Pseudomonas putida MR-2068 (FERM BP-46, FERM BP-46). Kori (Escherichia coli), concrete The Eserikia coli (Escherichia coli) MR-2103 (FERM BP-3835), and the like. Incidentally, Escherichia coli MR-2103 (FERM BP-3835) is a strain transformed with an esterase gene derived from Pseudomonas putida MR-2068 (FERM BP-3848).
[0012]
Moreover, as the ester asymmetric hydrolase used in the present invention, a commercially available enzyme can also be used. For example, NOVO Alcalase (derived from Bacillus licheniformis), Lipolase (derived from the genus Humicola) and Flavozyme (derived from the genus Aspergillus), Lipase PS (derived from Pseudomonas cepacia), Lipase M-10 (mucorus), pulase M-10 (mucorus) Examples include Neurase F (derived from Rhizopus genus) and lipase AY (derived from Candida genus), lipase VII (derived from Candida rugosa), lipase XXIII (derived from Aspergillus oryzae), and the like. Examples of the animal-derived enzyme include lipase II (derived from Porcine pancreas) manufactured by Sigma, pancreatin derived from porcine and bovine pancreas, trypsin, and PPL.
[0013]
The microorganism used in the present invention can be cultured in a liquid medium or a solid medium. As a culture medium, what mixed suitably components, such as a carbon source, a nitrogen source, a vitamin, and a mineral which microorganisms can normally utilize, is used. As the carbon source, for example, sugars such as glucose, sucrose and maltose, organic acids such as acetic acid and citric acid or salts thereof, and alcohols such as ethanol and glycerol can be used. Examples of the nitrogen source include natural nitrogen sources such as peptone, meat extract, yeast extract, molasses, amino acids, and various inorganic / organic acid ammonium salts. In addition, inorganic salts, trace metal salts, vitamins and the like are used as necessary. In order to improve the hydrolytic ability of microorganisms, it is also effective to add a small amount of ester to the medium. The culture is performed at a temperature and pH at which the microorganism can grow, but may be performed under the optimal culture conditions for the strain to be used. For example, the cells are cultured for several hours to several tens of hours at a pH of 4 to 10 and a temperature of 20 to 50 ° C. In order to promote the growth of microorganisms, aeration and agitation may be performed.
[0014]
In the present invention, a culture solution obtained by culturing can be used as it is, or a microbial cell obtained by a collection operation such as centrifugation from the culture solution, or a processed product thereof can also be used. The treated product was obtained by separation of cells treated with acetone, toluene, etc., freeze-dried cells, disrupted cells, cell-free extract, cell-free extract, such as gel filtration and ion exchange chromatography. Examples include crude enzymes or purified enzymes. In addition, microbial cells or enzymes can be used by being comprehensively immobilized on a cross-linked acrylamide gel or the like, or physically or chemically immobilized on a solid support such as an ion exchange resin or diatomaceous earth.
[0015]
In the present invention, the asymmetric hydrolysis reaction of the racemic ester represented by the general formula (II) can be carried out as follows. That is, a racemic ester as an enzyme reaction substrate is added to a reaction medium, dissolved or suspended, and a microorganism serving as a catalyst, a processed product thereof, or an enzyme is added. As the reaction medium, for example, ion exchange water, a buffer solution or the like is used. The substrate concentration in the reaction solution is not particularly limited between 0.1 and 70% by weight, but it is preferably 5 to 50% by weight in consideration of the solubility of the substrate, the conversion efficiency and the like. In order to improve the solubility of the substrate, for example, a lower alcohol such as methanol or ethanol can be added to the system. The reaction temperature is usually 5 to 70 ° C., preferably 10 to 50 ° C., taking into consideration the optimum temperature of the enzyme and the stability of the substrate. The pH of the reaction solution is usually 4.0 to 10.0, and preferably 6.0 to 8.0. As the reaction proceeds, the pH is lowered by the carboxylic acid produced, so it is desirable to add an appropriate neutralizing agent to maintain the optimum pH.
[0016]
Separation and purification of the product from the reaction completion liquid can be performed as follows. An unreacted substrate can be separated by performing an extraction operation using a common organic solvent such as ethyl acetate, hexane, toluene, diethyl ether, methylene chloride, chloroform, etc. near neutrality. Further, by adding a strong acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid to the extraction residual liquid, adjusting the pH to about 2.0, and performing the same general extraction operation as described above, the optically active N-substitution that is the enzyme reaction product is performed. 4-Amino-2-methylbutyric acid can be extracted and separated.
[0017]
The optically active N-substituted 4-amino-2-methylbutyric acid and its enantiomer ester obtained in the present invention can be used as they are, but can be easily deprotected by any method depending on the purpose.
[0018]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, the scope of the present invention is not limited to the range of these Examples.
[0019]
【Example】
Reference example 1
Production of racemic N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyrate:
100 g of methyl 3-cyanoisobutyrate obtained by the method of JP-A-8-291157 and Example 1 was dropped into 500 ml of 3N NaOH and stirred overnight at room temperature. Sulfuric acid was added dropwise to the reaction completion solution, the pH was adjusted to 2.0, and the mixture was extracted twice with 1/3 amount of ethyl acetate. The obtained organic phase was concentrated under reduced pressure to obtain 81.5 g of 3-cyanoisobutyric acid. 38 g of the obtained 3-cyanoisobutyric acid was dissolved in 350 ml of acetic acid, 5 g of 10% palladium-carbon was added, charged into an autoclave, and contact reduction was performed at 40 ° C. and a hydrogen pressure of 12 kg / cm ² . The reaction was terminated when almost the theoretical amount of hydrogen was absorbed (after about 4 hours), the catalyst was filtered off, and acetic acid was distilled off under reduced pressure. Isopropanol was added to the oily residue, cooled, and the precipitated crystals were collected to obtain 32.0 g of white powder. When the structure was confirmed by NMR, it was confirmed to be 4-amino-2-methylbutyric acid.
[0020]
10 g of 4-amino-2-methylbutyric acid was dissolved in 50 ml of 4N NaOH, and 9 g of methyl chloroformate was added dropwise under ice cooling, followed by stirring at room temperature for several hours. After completion of the reaction, the pH was acidified with sulfuric acid, extracted with ethyl acetate, and concentrated under reduced pressure to obtain 12.3 g of N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyric acid. This was esterified by a conventional method to obtain 11.6 g of racemic methyl N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyrate.
[0021]
Example 1
Production of optically active N-methoxycarbonyl-4-amino 2-methylbutyric acid and its enantiomer ester:
Escherichia coli MR-2103 (FERM BP-3835) was inoculated into 50 ml of LB medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) containing 50 μg / ml ampicillin, 37 Cultured with shaking at 20 ° C. for 20 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, washed with ion-exchanged water, and then suspended in 50 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0). To this bacterial cell suspension, 5 g of racemic N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyrate methyl obtained in Reference Example 1 was added and reacted at 30 ° C. for 20 hours. During this time, the pH of the reaction solution was adjusted to pH 7.0 using 1N NaOH. After completion of the reaction, the cells were removed by centrifugation, and unreacted methyl N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyrate was extracted three times with 30 ml of ethyl acetate. The obtained organic phase was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure to obtain 2.01 g of residue. The physical property values and ¹ H-NMR chart (FIG. 1) of this sample are shown below. Next, the pH of the extracted aqueous phase was adjusted to 2.0 with dilute sulfuric acid, and the optically active N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyric acid, which is an enzyme reaction product, was extracted three times with 30 ml of ethyl acetate. The obtained organic phase was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure to obtain 1.78 g of residue. The physical property values and ¹ H-NMR chart (FIG. 2) of this sample are shown below.
[0022]
Methyl (+)-N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyrate < ¹ H-NMR spectrum> DMSO, internal standard TMS (FIG. 1)
^{d H 1.072~1.097 (3H, d,} -CH 3)
^{d H 1.459~1.495 (1H, m,} -CH 2)
^{d H 1.690~1.746 (1H, m,} -CH 2)
^{d H 2.433~2.489 (1H, q,} -CH)
d ^H 2.953-3.018 (2H, dd, —CH ₂ )
d ^H 3.517, 3.600 (6H, s, —CH ₃ )
d ^H 7.072 (1H, s, —NH)
<Specific rotation>
[Α] _D ²⁶ = + 27.48 (c = 2.22, MeOH)
<Optical purity>
99.8% e. e. (Column; Chiralcel OD, mobile phase; hexane / isopropanol / trifluoroacetic acid = 90/10 / 0.1)
[0023]
(−)-N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyric acid < ¹ H-NMR spectrum> DMSO, internal standard TMS (FIG. 2)
^{d H 1.061~1.086 (3H, d,} -CH 3)
^{d H 1.402~1.504 (1H, m,} -CH 2)
^{d H 1.675~1.778 (1H, m,} -CH 2)
^{d H 2.312~2.389 (1H, q,} -CH)
^{d H 2.971~3.045 (2H, dd,} -CH 2)
^{d H 3.524 (3H, s,} -CH 3)
d ^H 7.050 (1H, s, —NH)
d ^H 12.0 (1H, br, —OH)
<Specific rotation>
[Α] _D ²⁶ = -15.07 (c = 3.45, MeOH)
<Optical purity>
96.8% e. e. (Column; Chiralcel OD, mobile phase; hexane / isopropanol / trifluoroacetic acid = 90/10 / 0.1)
[0024]
Examples 2-7
Production of optically active N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyric acid and its enantiomer ester:
10 ml of racemic N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyrate obtained in Reference Example 1 was added to 1 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and a commercially available enzyme (5 ml in the case of liquid, In the case of powder, 5 mg) was added and reacted at 30 ° C. for 20 hours. The analysis results of the obtained residual ester and acid fraction are shown in Table 1. In addition, (+, −) in parentheses indicates the optical rotation of the sample.
[0025]
[Table 1]

[0026]
【The invention's effect】
The novel optically active 4-amino-2-methylbutyric acid derivative is useful as a pharmaceutical and agrochemical synthesis intermediate, and a highly pure optically active substance can be produced by this method.
[0027]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a ¹ H-NMR spectrum of methyl (+)-N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyrate.
FIG. 2 shows a ¹ H-NMR spectrum of (−)-N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyric acid.

Claims (1)

Formula (II)

Pseudomonas putida MR-2068 (FERM BP-3848) or a racemic N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyrate represented by the formula: A method for producing an optically active N-methoxycarbonyl-4-amino-2-methylbutyric acid derivative, which comprises reacting Escherichia coli MR-2103 (FERM BP-3835) or a processed product thereof.

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