JP4339405B2 - 予防・治療剤 - Google Patents

Description

技術分野
本発明はＦａｓアンタゴニストを有効成分とする疾患の予防・治療剤又は細胞アポトーシス抑制剤および臓器保存剤に関する。
背景技術
Ｆａｓは、ヒト線維芽細胞でマウスを免疫して得られたモノクローナル抗体であるＦａｓ抗体（ヨネハラ S.（Yonehara S.）等、J. Exp. Med.、１６９巻、１７４７−１７５６頁、１９８９年）によって認識され、アポトーシスのシグナルを細胞に伝達する細胞表面抗原である。最近、イトウN.（Itoh N.）等によって、Ｆａｓ遺伝子がクローニングされ、Ｆａｓが約４５ｋＤの細胞膜上の蛋白質であり、そのアミノ酸配列からTNFレセプターファミリーに属する事が判明した（Cell、66巻、233-243頁、1991年）。また、マウスＦａｓ遺伝子もクローニングされ（ワタナベ−フクナガ（Watanabe-Fukunaga R.）等、J. Immunol., 148巻、1274-1279頁、1992年）、ＦａｓmRNAが、マウスの胸腺、肝、肺、心臓、卵巣で発現していることが確認された。
ヒトＦａｓリガンドは、Ｆａｓを発現する細胞に対してアポトーシスを誘導する生体内分子として、長田等により報告されたポリペプチドである（Ｔｏｍｏｈｉｒｏ Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６巻、１５６７−１５７４頁、１９９４年）。ヒトＦａｓリガンドは、ＴＮＦファミリーに属する分子量約４０ｋＤのＩＩ型膜蛋白質で、ＴＮＦと同様に、生体内で３量体を形成すると考えられている（Ｍａｓａｔｏ Ｔａｎａｋａ等、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１４巻、１１２９−１１３５頁、１９９５年）。また、ヒトＦａｓリガンドはラットＦａｓリガンド（Ｔａｋａｓｈｉ Ｓｕｄａ等、Ｃｅｌｌ、７５巻、１１６９−１１７８頁、１９９３年）やマウスＦａｓリガンド（Ｔｏｍｏｈｉｒｏ Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｃｅｌｌ、７６巻、９６９−９７６頁、１９９４年）と細胞外領域において高いホモロジーを有しており、ヒトＦａｓリガンドはヒトＦａｓのみでなくマウスＦａｓをも認識し、アポトーシスを誘導することができる。逆に、ラットＦａｓリガンド及びマウスＦａｓリガンドも、ヒトＦａｓを認識してアポトーシスを誘導することができる。
また、Ｆａｓを介するアポトーシスの細胞内シグナル伝達の機序に関しても研究が進んでおり、Ｆａｓの細胞内領域、特にデスドメイン（Ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）と呼ばれる領域と相互作用して、シグナルを伝達または抑制する因子の同定及びクローニングが報告されている他、インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）関連チオールプロテアーゼがＦａｓを介するアポトーシスのシグナル伝達に寄与している可能性が示唆されている。
近年、アポトーシス、特にＦａｓを介するアポトーシスと種々の疾患及び生理的現象との関連が示唆されている。例えば、エイズ患者におけるＴリンパ球の減少、ウイルス性劇症肝炎における肝細胞死及びある種の自己免疫疾患等において、Ｆａｓを介するアポトーシスの異常が関与する可能性が示唆されている。
また、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系はアポトーシス以外の機能、例えば、好中球に作用して起炎症性に働く作用等も担っている可能性が示唆されている（カヤガキ Ｎ．等、臨床免疫２８巻、６６７−６７５頁、１９９６年）。
ところで、種々の刺激、例えばエンドトキシン、又は侵襲により、好中球を初めとする免疫担当細胞が活性化され、サイトカインなど液性因子が血液中、組織中に放出された結果、全身性の炎症反応を起こしている状態は全身性炎症反応症候群（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：以下、ＳＩＲＳと略す）と呼ばれる。ＳＩＲＳにおいては、種々の臓器障害を伴う場合が多く、臓器障害が重篤な場合には多臓器機能不全症候群（ＭＯＤＳ）に移行する場合もある（若林ら、臨床検査、３８巻、３４９−３５２頁、１９９４年）。臓器が障害を受ける過程には、種々の要因が関与するとされるが、侵襲に際して局所で産生されたＩＬ−１などによりマクロファージなどの細胞から産生されるＩＬ−８の作用による好中球の浸潤、集積が重要な役割を果たすといわれており、最近注目を集めている。また、上述したようにＦａｓ／Ｆａｓリガンド系（以下、Ｆａｓ／ＦａｓＬ系と称す）も好中球の活性化に関与する可能性が報告されている。
虚血再灌流障害は、ほとんどすべての組織あるいは臓器において認められ、種々の疾患に関与している。また、臓器保存時やその移植の際にも問題となる。とりわけ、肝臓、心臓または腎臓における梗塞、外科手術または移植などに伴う虚血再灌流障害のうち、各臓器における組織障害（例えば細胞壊死など）、および、各臓器における機能障害（例えば心臓における不整脈など）は、重篤な場合には個体を死に至らしめるものであり、社会的に大きな問題となっている。種々の臓器障害または虚血再灌流障害においては、ＩＬ−８は、早期から晩期にわたって産生・分泌されることが知られている。また、臓器移植時等における臓器保存時及び再灌流時ではアポトーシスが起こっていることが知られている。さらに、いくつかの実験モデルにおいてアポトーシスが観察されること及びＦａｓ又はＦａｓＬの発現が変動することが報告されている。また、肝虚血再灌流２４時間後に好中球が著しく増加し、好中球の中和抗体が虚血再灌流障害を改善すること（ジェシケ，エイチ．等（Ｊａｅｓｃｈｋｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．），ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、４巻、３３５５−３３５９頁、１９９０年）、および、肺虚血再灌流３時間後にＩＬ−８、好中球およびマクロファージが著しく増加し、ＩＬ−８の中和抗体が、虚血再灌流障害を改善することが報告されている（セキド，エヌ．等（Ｓｅｋｉｄｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ、３６５巻、６５４−６５７頁、１９９３年）。以上のような事実から、好中球およびＩＬ−８は、臓器障害および虚血再灌流障害の早期から晩期にわたって、重要な役割を果たしていることが示唆される。一方、Ｆａｓ／ＦａｓＬが、これらの障害において、どのように関与しているかについては明らかでない。
細菌感染における内毒素（エンドトキシン）は、生体内において種々のサイトカイン産生を誘導し、例えばエンドトキシン血症、敗血症等においてエンドトキシンショックを惹起する他、多様な臓器、例えば肝臓等に障害をもたらし（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ Ｃ．Ａ．等、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ２６９巻、１８２９頁、１９９３年）、時に重篤な病態を引き起こす。この過程においても、実験的にアポトーシスが観察されること及びＦａｓ／ＦａｓＬ系が何らかの形で関与する可能性が報告されているものの、Ｆａｓ／ＦａｓＬ系がこれらの障害においてどのように関与しているかについては明らかでない。
従来、種々の心疾患における心筋細胞死は主に壊死（ネクローシス）によると考えられていたが、アポトーシス、特にＦａｓを介するアポトーシスが心疾患と何らかの関連を有する可能性が、臨床的に、及び実験的に報告されている。例えば、新生ラット心筋細胞をインビトロで虚血にすると、その際にＦａｓの発現量が増加すること（Ｔａｎａｋａ Ｍ．等、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７５，４２６−４３３，１９９４）、並びにＩＬ−１がラット血管平滑筋細胞の一酸化窒素（ＮＯ）合成を誘導すると共にアポトーシスを誘導すること、ＮＯ合成の阻害剤がＩＬ−１によるアポトーシスを抑制すること、及びＮＯはＦａｓの発現を誘導することからＮＯは動脈硬化のプラークのリモデリングに関与している可能性（Ｆｕｋｕｏ Ｋ．等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２７，８２３−８２６，１９９６）等が報告されている。また、イヌの心不全モデルにおいて、心筋細胞のアポトーシスがおこること、その際Ｆａｓの発現増加がおこること（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７３，７７１−７８７，１９９５）及びラット心筋梗塞モデルにおいて、心筋細胞死の大部分がアポトーシスであり、その際Ｆａｓの発現が１００倍以上に増加することが報告されている（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７４，８６−１０７，１９９６）。さらに、福田等は、心筋疾患患者の心筋細胞におけるＦａｓの発現を検討し、肥大性心筋症ではＦａｓの発現は認めなかったが、心筋炎及び拡張型心筋症では少なくとも一部の心筋細胞でＦａｓの発現を認めた（特発性心筋症調査班、平成６年度研究報告、１５２−１５５、１９９５）。しかしながら、これらの心疾患においてＦａｓがどのように関与しているかは明らかではなかった。従って、以上の報告では、Ｆａｓが心疾患において心筋細胞のアポトーシスを促進しているか、あるいは抑制的に作用するのかについては何らデータもなく、心疾患患者の心筋細胞障害又は心筋細胞死に対してＦａｓが直接関与しているか否かは依然として不明であった。したがって、現在までのところ、Ｆａｓを介するアポトーシスを抑制することによる心疾患の治療剤及び治療方法は知られていない。
腎疾患においても、アポトーシスの関与が示唆され、実験的腎虚血再灌流障害モデルでＦａｓ ｍＲＮＡの発現が増加することが報告されている（Ｈａｋｕｎｏ Ｎ．等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７巻、１９３８−１９４８頁、１９９６年）。しかし、腎疾患において、Ｆａｓ／ＦａｓＬ系がどのように関係しているかについては明らかではない。
移植片対宿主病（以下、ＧＶＨＤ，ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｄｅｓｅａｓｅ）は、供与者又は移植片由来のリンパ球が宿主の組織抗原に対して移植免疫反応を起こす移植片対宿主反応（ＧＶＨ反応）に起因する疾患である。不適合性骨髄移植や先天性免疫不全症への骨髄移植等の骨髄移植後に起るＧＶＨＤ、臓器移植後に起るＧＶＨＤ、免疫低下した宿主に対する大量輸血等の輸血後に起るＧＶＨＤ等がある。ＧＶＨＤは、ＧＶＨ反応に基づく臓器又は組織の障害を伴い、臨床的には下痢、体重減少及び痩身等の消耗症、皮疹、脾腫及び肝機能障害を含み、組織学的には、骨髄やリンパ組織の崩壊及び腸絨毛の萎縮を含む症状を特徴とする。
種々のＧＶＨＤにおける宿主組織構成細胞死は主に壊死（ネクローシス）によると考えられていたが、アポトーシス、特にＦａｓを介するアポトーシスがＧＶＨＤと何らかの関連を有する可能性が、実験的に報告されている。例えば、マウスＧＶＨＤモデルにおいて腸、皮膚及び舌の上皮細胞死は主にアポトーシスであることが報告されている（Ａｎｉｔｉ Ｃ．Ｇｉｌｌｉａｍ等、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１０７巻、３７７−３８３頁、１９９６年）。Ｆａｓを介したアポトーシスの関与についてはＦａｓリガンドが正常なコントロールマウスの脾リンパ球をドナーとした時と、Ｆａｓリガンドの変異マウスであるｇｌｄマウス由来の脾リンパ球をドナーとした場合で生存時間は変わらないが皮膚、肝障害はほとんど起らないことが報告されており（ＭａｔｔｈｅｗＢ．ＢａｒｋｅｒB等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３巻、２６４５−２６５９頁、１９９６年）、Ｆａｓを介したアポトーシスがＧＶＨＤに関与する可能性は示唆されているものの、Ｆａｓを介したアポトーシスがＧＶＨＤの致死に関与するのか否かについては結論がでていない。また、上記報告においては用いられている材料がｇｌｄマウス由来の脾リンパ球であることから、ｇｌｄマウス由来脾リンパ球においてＦａｓリガンド欠損の代替機構としてＦａｓリガンド以外の他の因子（例えば、パーフォリン、ＴＮＦなど）の発現量の変化などがＧＶＨＤ反応に影響を与えることが推察され、得られた結果が必ずしもＦａｓリガンド欠損の効果だけではない可能性がある。したがって、Ｆａｓを介したアポトーシスがＧＶＨＤにどのように関与しているのか、あるいはＦａｓを介したアポトーシスの特異的抑制物質のＧＶＨＤ治療薬としての可能性は不明であった。
ＧＶＨＤの予防、治療薬として、従来サイクロスポリンＡなどの非特異的免疫抑制剤が用いられていたが、非特異的免疫抑制を起こすため感染症などの副作用が問題となっている。現在までのところ、Ｆａｓを介するアポトーシスを抑制することによるＧＶＨＤの治療剤及び治療方法は知られていない。また、選択的免疫抑制によるＧＶＨＤの治療剤及び治療方法は知られていない。
また、虚血再灌流障害に基づく疾患に関しては、上市されている薬物は、血栓溶解または循環改善を主体とするものであり、障害を直接予防または治療するような薬物は得られていない。エンドトキシン血症及び敗血症に関しても、例えば、ショックに対してはステロイドや蛋白分解酵素阻害剤等が用いられるが、臓器障害を直接予防又は治療するような薬物は現在のところない。臓器障害に基づく疾患に対して用いられている薬物は、対症療法が中心となっており、組織または臓器の障害に基づく疾患を予防または根治的に治療するような薬物は得られていない。また、種々の組織または臓器に対して広く有効な予防・治療薬も得られていない。
このような現状から、広く種々の組織または臓器において障害に基づく疾患を予防または治療する効果があり、生体内で効果が認められ、ヒトに対する毒性の低い医薬品が望まれているが、これらを満足するものは得られていないのが現状である。
本発明の目的は、Ｆａｓアンタゴニストを含有する、新しい作用機序による疾患予防・治療剤及び臓器保存剤としての医薬、及び治療方法を提供することである。より詳しくは、本発明はＦａｓアンタゴニストを有効成分とする、Ｆａｓの関与する疾患の予防・治療剤、臓器保存剤及び治療方法を提供する。
発明の開示
本発明者らは、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の機能及びＦａｓ／Ｆａｓリガンド系を介するアポトーシスの各種疾患における役割を鋭意研究してきたが、Ｆａｓアンタゴニストによって、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の作用、特にＦａｓ／Ｆａｓリガンド系を介するアポトーシスを抑制することにより種々の疾患モデルにおいて病態を改善すること、例えば、虚血再灌流時の心筋細胞の死、同種骨髄移植に伴うＧＶＨＤの発症及びエンドトキシンに惹起される臓器の障害が、Ｆａｓを介するアポトーシスを阻害するアンタゴニストにより抑制されることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明はＦａｓアンタゴニストを有効成分とする疾患、詳しくはＦａｓ／Ｆａｓリガンド系の関与する疾患であり、特にＦａｓを介するアポトーシスの関与する疾患の処置のための医薬、特に予防及び／又は治療のための医薬、すなわち予防・治療剤を提供する。ここで、対象となる疾患には、（１）心疾患、好ましくは虚血性心疾患、特に心筋梗塞、心不全又は心虚血再灌流障害、（２）腎疾患、好ましくは腎不全、腎虚血、虚血性再灌流障害、または急性腎不全、（３）ＧＶＨＤ、（４）虚血もしくは虚血再灌流障害又はそれに基づく疾患、特に、心臓、腎臓又は肝臓における虚血再灌流障害に基づく疾患、また、外科手術または移植に伴う虚血再灌流障害、あるいは血栓溶解療法もしくは血管再建術後の虚血再灌流障害またはそれらに基づく疾患（５）細菌内毒素（エンドトキシン）による臓器の障害、エンドトキシン血症、敗血症、またはそれらに伴う臓器もしくは組織、特に肝臓の障害又は肝不全、等が含まれる。
本発明の別の態様は、Ｆａｓアンタゴニストを有効成分として含有することを特徴とする臓器保存剤である。また、本発明はＦａｓアンタゴニストを有効成分とするアポトーシス抑制剤を提供する。ここで該Ｆａｓアンタゴニストは、抗Ｆａｓリガンド抗体、抗Ｆａｓ抗体又はＦａｓ誘導体の少なくともいずれか一つであることが好ましく、特に該抗Ｆａｓリガンド抗体がヒト化抗Ｆａｓリガンド抗体であることが好ましい。
すなわち、本発明は、Ｆａｓアンタゴニストの新規な用途を提供する。
なお、本発明においてＦａｓアンタゴニストとは、抑制または阻害作用を有する物質であり、詳しくは、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の生物作用、特に、Ｆａｓを介する細胞のアポトーシスを抑制または阻害する物質である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、マウスＦ９１９−９−１８抗体の軽鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲに下線を引き、成熟鎖の１番目のアミノ酸には二重下線を引いた。
第２図は、マウスＦ９１９−９−１８抗体の重鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲに下線を引き、成熟鎖の１番目のアミノ酸には二重下線を引いた。
第３図は、ヒト化Ｆ９１９抗体の軽鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲに下線を引き、成熟鎖の１番目のアミノ酸には二重下線を引いた。
第４図は、ヒト化Ｆ９１９抗体の重鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲに下線を引き、成熟鎖の１番目のアミノ酸には二重下線を引いた。
第５図は、Ｆａｓ誘導体の一つであるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ＦｃをコードするｃＤＮＡの塩基配列を含むベクター（ｐＭ１３０４）中の部分塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である（６４番のアミノ酸（２７５番のＤＮＡ）まで）。
第６図は、Ｆａｓ誘導体の一つであるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ＦｃをコードするｃＤＮＡの塩基配列を含むベクター（ｐＭ１３０４）中の部分塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である（６５〜１４４番のアミノ酸（２７６〜５１５番のＤＮＡ））。＊印は可能なＮ−グリコシレーションサイトを示す。
第７図は、Ｆａｓ誘導体の一つであるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ＦｃをコードするｃＤＮＡの塩基配列を含むベクター（ｐＭ１３０４）中の部分塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である（１４５〜２２４番のアミノ酸（５１６〜７５５番のＤＮＡ））。＊印は可能なＮ−グリコシレーションサイトを示す。
第８図は、Ｆａｓ誘導体の一つであるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ＦｃをコードするｃＤＮＡの塩基配列を含むベクター（ｐＭ１３０４）中の部分塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である（２２５〜３０４番のアミノ酸（７５６〜９９５番のＤＮＡ））。
第９図は、Ｆａｓ誘導体の一つであるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ＦｃをコードするｃＤＮＡの塩基配列を含むベクター（ｐＭ１３０４）中の部分塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である（３０５番のアミノ酸（９９６番のＤＮＡ）以降）。
第１０図は、Ｆａｓ誘導体の一つであるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅをコードするｃＤＮＡの塩基配列を含むベクター（ｐＭ１３１７）中の部分塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である（６４番のアミノ酸（２７５番のＤＮＡ）まで）。
第１１図は、Ｆａｓ誘導体の一つであるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅをコードするｃＤＮＡの塩基配列を含むベクター（ｐＭ１３１７）中の部分塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である（６５番のアミノ酸以降（２７６〜５１５番のＤＮＡ））。＊印は可能なＮ−グリコシレーションサイトを示す。
第１２図は、Ｆａｓ誘導体の一つであるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅをコードするｃＤＮＡの塩基配列を含むベクター（ｐＭ１３１７）中の部分塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である（５１６番のＤＮＡ以降）。
第１３図は、Ｆａｓ誘導体（ｈＦａｓ−Ｆｃ）の実験的ラット心虚血再灌流障害モデルにおける心筋梗塞巣抑制効果を示す図である。
第１４図は、Ｆａｓ誘導体（ｈＦａｓ−Ｆｃ）の実験的ラット心虚血再灌流障害モデルにおける再灌流３時間後の血漿中ＣＰＫ値上昇抑制効果を示す図である。
第１５図は、マウスＧＶＨＤモデルにおけるヒトＦａｓ−Ｆｃの生存日数延長効果を示す図である。白四角（□）はｈＦａｓ−Ｆｃ １０ｍｇ／ｋｇ投与群、黒四角（■）はコントロール群の生存率をそれぞれ示す。
第１６図は、マウス肝障害モデルにおける抗ヒトＦａｓリガンド抗体の致死抑制効果を示す図である。白四角（□）はＦ９１９−９−１８ ０．４ｍｇ／ｋｇ投与群、白三角（△）はＦ９１９−９−１８ １．２ｍｇ／ｋｇ投与群、黒四角（■）はコントロール群の生存率をそれぞれ示す。
第１７図は、抗マウスＦａｓリガンド抗体（＃５８−１１）の実験的ラット心虚血再灌流障害モデルにおける心筋梗塞巣抑制効果を示す図である。
第１８図は、抗マウスＦａｓリガンド抗体（＃５８−１１）の実験的ラット心虚血再灌流障害モデルにおける再灌流３時間後の血漿中ＣＰＫ値上昇抑制効果を示す図である。
第１９図は、マウスＧＶＨＤモデルにおける抗マウスＦａｓリガンド抗体（＃５８−１１）の生存率改善効果を示す図である。白丸（○）はＧＶＨＤ陰性群、黒丸（●）は＃５８−１１１０ｍｇ／ｋｇ投与群、黒四角（■）はコントロール抗体１０ｍｇ／ｋｇ投与群の生存率をそれぞれ示す。
第２０図は、抗マウスＦａｓリガンド抗体（＃５８−１１）のマウス腎虚血灌流モデルにおける血漿中尿素窒素上昇抑制効果を示す図である。
第２１図は、抗マウスＦａｓリガンド抗体（＃５８−１１）のマウス腎虚血灌流モデルにおける血漿中クレアチニン上昇抑制効果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下にさらに詳細に本発明を説明する。
本発明の予防・治療剤の対象となる疾患には、種々の疾患が含まれる。これらの疾患は、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の生物作用、特に、Ｆａｓを介するアポトーシスが関与するものである。詳しくは、それらの疾患において、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の生物作用、特に、Ｆａｓを介するアポトーシスが、該疾患又は付随する症状もしくは病態の発症、維持又は増悪に関与又は寄与している。
具体的には、心疾患、腎疾患、ＧＶＨＤ、虚血再灌流障害、エンドトキシンに起因する疾患等が挙げられ、（１）心疾患としては、好ましくは虚血性心疾患、特に心筋梗塞、種々の原因による心筋炎、心筋症、特に拡張型心筋症、心不全、並びに虚血再灌流障害及びそれに基づく心疾患等が含まれる。心筋梗塞には、急性及び陳旧性が含まれる。心不全には、特に虚血性心疾患における心不全が含まれ、それは、急性又は陳旧性の心筋梗塞の合併症として起こることが多い。
（２）ＧＶＨＤとしては、不適合性骨髄移植や先天性免疫不全症への骨髄移植等の骨髄移植後に起るＧＶＨＤ、臓器移植後に起るＧＶＨＤ、免疫低下した宿主に対する大量輸血等の輸血後に起るＧＶＨＤ等が含まれる。ＧＶＨＤは、ＧＶＨ反応に基づく臓器又は組織の障害を伴い、下痢、体重減少及び痩身等の消耗症、皮疹、肝機能障害を含み、組織学的には、骨髄やリンパ組織の崩壊及び腸絨毛の萎縮を含む症状を特徴とする。
（３）腎疾患には、腎虚血、腎虚血再灌流障害、それらに基づく疾患、腎不全及びその原因疾患が含まれ、好ましくは急性腎不全等が挙げられる。急性腎不全には腎前性急性腎不全、腎後性急性腎不全及び腎性急性腎不全が含まれる。腎性急性腎不全の原因疾患には腎循環障害若しくは腎虚血性の急性尿細管壊死、腎毒性による急性尿細管壊死、急性糸球体腎炎、急性間質性腎炎、急性皮質壊死が含まれる。
（４）虚血又は虚血再灌流障害に基づく疾患には、特に、心臓、腎臓、肝臓、脳、肺、脾臓又は膵臓、好ましくは心臓、腎臓又は肝臓における虚血再灌流障害に基づく疾患、また、外科手術または移植に伴う虚血再灌流障害、および血栓溶解療法または血管再建術後の虚血再灌流障害に基づく疾患が含まれる。
「虚血再灌流障害」の語は、梗塞や外科手術、移植、血栓溶解療法あるいは血管再建術など種々の原因により局所の血流が全くなくなった（虚血）後に再び血流が戻った（再灌流）際に起きる組織損傷や臓器または組織の機能障害であり、「虚血再灌流障害に基づく疾患」の語は、肝臓、心臓、腎臓、脳、肺、脾臓、膵臓などにおいて認められ、例えば、肝不全、再灌流不整脈、腎不全などを含み、これらの疾患に付随する症状及び病態も含んでいる。
（５）細菌内毒素（エンドトキシン）に起因する疾患としては、エンドトキシンによる臓器の障害、エンドトキシン血症もしくは敗血症又はそれらにおける臓器障害およびそれらに基づく疾患が挙げられ、例えば、肝障害、急性肝不全、腎障害および腎不全等が挙げられる。
（６）さらに、その他、臓器障害に基づく疾患等が本発明の予防・治療剤の対象疾患として含まれる。本明細書において、「臓器障害に基づく疾患」の語は、例えば肝不全、腎不全などの各種臓器不全のみならず、これらの疾患に付随する黄疸、血中ＧＰＴ・ＧＯＴ・ＬＤＨ等の上昇、疲労・倦怠感、食欲不振、意識障害、興奮、昏睡、腹水、糸球体濾過量の低下、浮腫、蛋白尿、乏尿、高カリウム血症、代謝性アシドーシス、血中クレアチニン・尿素窒素量等の上昇などの症状も含んでいる。また、ＳＩＲＳに伴うＭＯＤＳも含んでいる。
本発明の予防・治療剤のその他の可能な対象疾患としては、ウイルス性肝炎又はアルコール性もしくは薬剤性の非ウイルス性肝炎もその用途に含まれる。
これらの疾患においては、該Ｆａｓアンタゴニストが臓器又は組織の細胞、例えば心筋細胞のアポトーシスを抑制する。
本発明の別の態様は、Ｆａｓアンタゴニストを有効成分として含有することを特徴とする臓器、例えば、心臓、腎臓、肝臓等の臓器保存剤である。
なお、治療対象としては、ヒトが重要であるが、ヒト以外の動物も含みうる。
本発明で使用されるＦａｓアンタゴニストは、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系アンタゴニストと言うべきものであり、Ｆａｓによるシグナルの発生又は伝達をいずれかの段階で何らかの形で遮断し、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の機能又は生物作用、特に、Ｆａｓを介するアポトーシス、特にＦａｓリガンドによるＦａｓを介するアポトーシスを抑制又は阻害するものであれば、特に限定されず、ＦａｓリガンドもしくはＦａｓの作用もしくは機能を阻害するもの、Ｆａｓリガンド細胞外領域もしくはＦａｓ細胞外領域と相互作用するもの、ＦａｓリガンドとＦａｓの相互作用を阻害するもの、Ｆａｓ細胞内領域とそれと相互作用する細胞内因子との間の相互作用に影響するもの、またはＦａｓを介するアポトーシスのシグナル伝達に関与する細胞質内因子（例えばＩＣＥ様プロテアーゼ）の活性を抑制するもの等の様々な作用機序を有するものが含まれる。また、タンパク質性の高分子物質および低分子の化合物のいずれもが含まれる。具体的には、本発明で使用されるＦａｓアンタゴニストとしては、Ｆａｓ／ＦａｓＬ系の作用、特にＦａｓを介するアポトーシスを抑制する活性を有する、Ｆａｓ誘導体、抗Ｆａｓリガンド抗体、抗Ｆａｓ抗体、ＦａｓもしくはＦａｓリガンドの遺伝子もしくはｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｆａｓの細胞内領域と相互作用する物質、またはＩＣＥ阻害剤等が挙げられる。ここで、本発明で用いるＦａｓアンタゴニストとしては、Ｆａｓを介するアポトーシスを抑制する作用を有する、Ｆａｓ誘導体、抗Ｆａｓ抗体、又は抗Ｆａｓリガンド抗体が好ましい。さらに、Ｆａｓ及びＦａｓリガンドはヒト由来のものが好ましく、抗Ｆａｓ抗体及び抗Ｆａｓリガンド抗体はそれぞれ抗ヒトＦａｓ抗体及び抗ヒトＦａｓリガンド抗体が好ましく、抗Ｆａｓリガンド抗体は、ヒト化抗Ｆａｓリガンド抗体であるのが好ましい。ヒト化抗Ｆａｓリガンド抗体とは、定常領域と、フレームワーク領域がヒト由来で、相補性決定領域が非ヒト由来であるのが好ましい。また、本発明で用いるＦａｓアンタゴニストは、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１３２９３などに記載されている適当なアッセイ法においてＦａｓ発現細胞のアポトーシスを抑制するものが好ましい。
なお、本明細書において引用する文献はこれらをもって本明細書の一部と成す。
なお、本発明で用いられる抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、また、本発明に使用される抗体の分子種は特に限定されない。通常の形態の抗体分子であってもよいし、さらには抗原に結合し、Ｆａｓ抗原を介するアポトーシスを阻害するかぎり抗体の断片、たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを一本鎖となるよう適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）も使用することができる。また、いずれのクラス、サブクラス及びイソタイプに分類される免疫グロブリンであってもよい。これら抗体はＦａｓリガンド又はＦａｓと結合することにより、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の生物作用、特に、Ｆａｓを介するアポトーシスを阻害する機能を有するものであれば特に限定されない。
本発明で使用される抗Ｆａｓリガンド抗体又は抗Ｆａｓ抗体はその由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）及び製法を問わないが、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。また、本発明に用いるモノクローナル抗体の産生細胞の動物種は哺乳類が好ましく、ヒト由来またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ウサギあるいはげっ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マウス、ラット及びハムスターなどが好ましく例示される。これらの動物を用いるとモノクローナル抗体作製が簡便だからである。また、該モノクローナル抗体としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）等の通常の免疫学的手段により抗原を認識し、また、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１３２９３などに記載されている適当なアッセイ法によりＦａｓを発現する細胞のアポトーシスに対する抑制活性が測定されるものが好ましい。
これらのうちでも特に、平成７年６月２２日付で日本国茨城県つくば市東一丁目一番三号の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し（受託番号Ｐ−１５００２）、さらに平成８年５月９日付で原寄託から国際寄託に移管した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５５３５）ハイブリドーマＦ９１９−９−１８により産生されるマウスＦ９１９−９−１８抗体が好ましい例である。該抗体の可変領域配列を図１（配列番号１にｃＤＮＡを記載）及び図２（配列番号２にｃＤＮＡを記載）に示した。
本発明で用いる抗Ｆａｓリガンド抗体及び抗Ｆａｓ抗体は、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１３２９３、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９６／０１８２０、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１０５４０などに記載されている方法を用いて作製することが出来る。
本発明においてモノクローナル抗体を用いる場合は、公知技術を使用して作製してもよく、例えば、ＦａｓもしくはＦａｓリガンド又はそれらの部分ペプチド等を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
より具体的には、感作抗原が、ヒトＦａｓリガンド又はその断片の場合、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔ．等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６巻、１５６７−１５７４頁、１９９４年に開示されたヒトＦａｓリガンドの遺伝子配列を用い、該遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のＦａｓリガンドタンパク質を精製し、この精製Ｆａｓリガンドタンパク質を感作抗原として用いるのが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用できる。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法を用いることが出来る。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、特に限定されないが、哺乳動物、特にマウス等の公知の種々のミエローマ細胞株、例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）等が好適に使用される。前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）等に準じて行うことができる。
次いで、公知の方法により、目的とする本発明で用いる抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローン化が行われる。
このようにして作製される、本発明で用いるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清から得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水から得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
さらに、前記の方法により得られる本発明に用いるモノクローナル抗体は、塩析法、ゲル漉過法、アフィニティークロマトグラフィー法等の公知の精製手段を利用して高純度に精製してもよい。
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを用いる方法に限られず、ＥＢＶ等によって不死化した抗体産生細胞を用いる方法、遺伝子工学的に作製する方法を用いて作製することもできる。
また、本発明で用いる抗Ｆａｓリガンド抗体及びＦａｓ抗体は、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したキメラ抗体またはヒト化抗体がより好ましい。
これは、非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体の使用は、ヒトの治療において、繰り返しの治療療養法において欠点を有するからである。第一の欠点は、マウスモノクローナル抗体は、比較的短い循環半減期を有し、そして、ヒトに用いられた場合は、他の重要な免疫グロブリンの機能的特性を欠くことである。
第二の欠点は、非ヒトモノクローナル抗体は、ヒト患者中に注入されたときに免疫原性となるアミノ酸の実質的長さを含むことである。すなわち、多くの研究により、外来の抗体の注入後、患者によって引き起こされた抗体に対する免疫応答が、非常に強くなり得て、最初の処置後の抗体の治療的有用性を本質的に排除してしまうことが示されている。さらに今後種々のマウス若しくは他のヒトに対する抗原性を有するモノクローナル抗体が開発されたときには、いずれかの異なった非ヒト抗体を用いた最初若しくは初期数回の処置の後、それに続く関連のない療法のための処置でさえ、交叉反応性のために効果がなかったり、若しくはそれ自身が危険な物質となることがあり得る。
本発明で用いる事ができるキメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなる。このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝子組換技法を用いて製造することができる。
さらに好ましくは、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト型抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ置換したものである。すなわち、定常領域と、フレームワーク領域がヒト由来で、相補性決定領域が非ヒト由来であるのが好ましい。本発明に有用な再構成ヒト型抗体（ヒト化抗体）の好適な例としては、国際特許出願公開番号ＷＯ９７／０２２９０（出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９６／０１８２０）に開示されているマウス抗体Ｆ９１９−９−１８抗体のＣＤＲを有するものが挙げられる。その可変領域の１例を図３（配列番号３にｃＤＮＡを記載）及び図４（配列番号４にｃＤＮＡを記載）に示した。
なお、必要に応じ、ヒト化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域の１以上のアミノ酸を置換してもよい。
本発明に用いるヒト化抗体を製造するには、リーチマンら、ネーチャー、３３２：３２３（１９８８）及びヨーロッパ特許公開第０２３９４００号公報、クイーンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９（１９８９）、国際特許出願公開公報ＷＯ９０／０７８６１及びＷＯ９２／１１０１８、Ｃｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９（１９９１）、Ｃｏ及びＱｕｅｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３５１巻、５０１頁、１９９１年、ならびに、コーら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）等に開示されている方法を用いることができる。
本発明で使用されるＦａｓ誘導体は、少なくともＦａｓリガンドとの結合能を有するか、もしくはＦａｓリガンドによるアポトーシスを抑制するものであれば、特に限定されない。公知のＦａｓのアミノ酸配列中に置換、欠失、付加または／および挿入といった任意の変異を有し、Ｆａｓリガンドとの結合活性を維持したまま、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の生物作用、特に、Ｆａｓを介するアポトーシスを阻害するものが含まれる。さらに該Ｆａｓ誘導体には、Ｆａｓ変異体、切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）Ｆａｓ、キメラタンパク質、融合タンパク質および化学的に修飾されたものも含まれる。なお、その由来となるＦａｓは上記の性質を有する限り、その動物種を問わないが、抗原性を考慮すればヒト由来のものを使用するのが好ましい。
具体的には、公知のＦａｓの細胞外領域、膜貫通領域を欠失したＦａｓ抗原、及びＦａｓ細胞外領域と他の蛋白質とのキメラ蛋白質、例えばヒトＦａｓ細胞外領域とヒト免疫グロブリンのＦｃ断片のキメラ蛋白質であるｈＦａｓ−Ｆｃ等が挙げられる。Ｆａｓ誘導体は、何れの製法のものでも良く、公知のＦａｓの配列及び公知の遺伝子組み換え技術等により、製造することができる。例えば、ヒトＦａｓ−Ｆｃの製法は、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１３２９３の実施例中などに記載されている。また、ＦａｓのＮ末端に欠失を有するＦａｓ誘導体も好ましく、平成８年３月１４日付で日本国茨城県つくば市東一丁目一番三号の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し（受託番号Ｐ−１５５１４及びＰ−１５５１５）、さらに平成９年３月６日付で原寄託から国際寄託に移管（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５８５４及び受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５８５５）されている大腸菌が含むプラスミド（ｐＭ１３０４及びｐＭ１３１７）（台湾寄託番号はそれぞれＣＣＲＣ９４０１７１およびＣＣＲＣ９４０１７０）にコードされているＦａｓ誘導体は、公知のヒトＦａｓのＮ末端の１番目から２９番目までのアミノ酸配列を欠失したＦａｓ細胞外領域を含有する誘導体（図５〜９および配列番号５にｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ＦｃをコードするｃＤＮＡの塩基配列を含むベクター（ｐＭ１３０４）中の部分塩基配列を記載し、図１０〜１２および配列番号６にＦａｓ誘導体の一つであるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅをコードするｃＤＮＡの塩基配列を含むベクター（ｐＭ１３１７）中の部分塩基配列を記載）であるが、その活性が高く、本発明の予防・治療剤の有効成分として好適な例である。これらの本発明に用いるＦａｓ誘導体は、適当なアッセイ法によりＦａｓリガンドに対する結合活性又はＦａｓを介するアポトーシスの抑制活性を有することがわかる。
本発明で使用されるＦａｓ又はＦａｓリガンドの遺伝子またはｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｆａｓ又はＦａｓリガンドの発現を抑制するものであれば、その配列は限定されず、例えば国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１３２９３に開示されているＦａｓリガンドのアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる（本明細書はこの文献を引用して明細書の内容とする）。
本発明の予防・治療剤は、上述のＦａｓアンタゴニストを含有することを特徴とし、少なくとも一種の医薬用担体、または媒体、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、鉱油、高級アルコール、高級脂肪酸、無害性有機溶媒等、さらには必要に応じて賦形剤、着色剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、溶解補助剤、吸着防止剤、安定化剤、保存剤、保湿剤、酸化防止剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤等と適宜組み合わせて注射剤や経口剤などの医薬組成物やキットの形態をとることができる。本発明の予防・治療剤は、好ましくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的に、ならびに急速もしくは持続的に投与することができる。本発明の予防・治療剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが可能である。例えば、全身投与の場合、約０．１−１００mg／kgの範囲で適当な分割容量を選択することができる。しかしながら、本発明の予防・治療剤の使用はこれらの投与方法および投与量に制限されるものではない。さらに、複数のＦａｓアンタゴニストを組み合わせて使用したり、他の薬剤と併用してもよい。
本発明の心疾患予防・治療剤は常法にしたがって製剤化することができる。たとえば、注射用製剤は、精製されたＦａｓアンタゴニストを溶剤、たとえば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに、必要に応じて吸着防止剤などを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための一般的な賦形剤を使用することができる。
本発明の疾患の予防・治療剤に用いるＦａｓアンタゴニストは、心疾患モデル、特に実施例のような心虚血再灌流モデルにおいて、またはＧＶＨＤモデル、特に実施例に記載するようなＧＶＨＤモデルにおいて、宿主の臓器及び組織の障害を抑制し、生存日数延長及び生存率上昇効果を示す。また、腎疾患モデルにおいて、血清クレアチニンの上昇抑制作用を示し、さらに、エンドトキシン誘発肝障害モデルにおいて、肝障害の指標であるＧＯＴ、ＧＰＴ等の上昇抑制作用及び生存率上昇効果を示す。よって、本発明の疾患の予防・治療剤は、前述したような疾患の患者等に投与することにより、各種臓器又は組織の細胞の障害及び細胞死、特にアポトーシスを抑制し、該疾患の予防又は治療効果、およびそれに付随する症状の緩和及び病態の改善効果、ならびに症状の進行や悪化を抑制する効果を有する。
また、インビトロでの細胞障害抑制活性、心臓および腎臓の虚血再灌流モデルにおける組織障害を抑制したことから、各種臓器の保存効果を有する。
また、抗Ｆａｓリガンド抗体を用いた実施例ではげっ歯類（マウスおよびラット）で実験を行っているため、主に抗マウスＦａｓリガンド抗体を使用し予防・治療剤の効果を示しているが、ヒトに用いる場合は抗ヒトＦａｓリガンド抗体およびヒト化抗Ｆａｓリガンド抗体により実施例と同様の効果が期待できる。
本発明に用いるＦａｓアンタゴニストは、心疾患、ＧＶＨＤ、腎疾患、虚血再灌流障害に基づく疾患及び臓器障害に基づく疾患に対する予防・治療作用、並びに臓器保存剤としての作用及び細胞アポトーシス抑制作用を有する。従って、本発明に用いるＦａｓアンタゴニスト及びそれを含有する薬剤は、Ｆａｓの関与する疾患、特にＦａｓを介するアポトーシスの関与する疾患の予防治療剤として有用である。例えば、心疾患、特に心筋梗塞等の虚血性心疾患、種々の原因による心筋炎、心筋症、特に拡張型心筋症、心不全、並びに虚血再灌流障害及びそれに基づく心疾患等を予防・治療することができる。
また、前記した種々のＧＶＨＤ、およびＧＶＨＤに伴う症状又は病態の予防又は治療のために使用できる。ＧＶＨＤには、不適合性骨髄移植や先天性免疫不全症への骨髄移植等の骨髄移植後に起るＧＶＨＤ、臓器移植後に起るＧＶＨＤ、免疫低下した宿主に対する大量輸血等の輸血後に起るＧＶＨＤ等が含まれる。ＧＶＨＤは、ＧＶＨ反応に基づく臓器又は組織の障害を伴い、下痢、体重減少及び痩身等の消耗症、皮疹、肝機能障害を含み、組織学的には、骨髄やリンパ組織の崩壊及び腸絨毛の萎縮を含む症状を特徴とし、これらのＧＶＨＤに伴う症状又は病態の予防又は治療のためにも使用できる。
肝臓、心臓、腎臓、肺、脾臓、小腸、大腸、胃、膵臓、脳、筋肉、皮膚などにおいて認められる虚血再灌流障害及びそれに基づく疾患、例えば、肝不全、再灌流不整脈、腎不全、壊死性腸炎などで各臓器の損傷や機能障害を直接予防・治療する目的で用いることができる。また、外科手術や移植に伴う虚血再灌流の際に、術前・術後に投与することにより、上記の臓器または組織の障害を予防または治療し、移植後の上記の臓器または組織の生着率を改善する効果および機能を維持する効果が期待される。さらに組織損傷または壊死性梗塞巣の形成・拡大等に対する阻止効果、上記の臓器または組織の機能障害の改善効果が期待される。また、血栓溶解療法あるいは血管再建術後の虚血再灌流障害に基づく疾患の予防・治療剤として用いることができる。また、種々の臓器障害に基づく疾患、例えば、肝不全、腎不全など、肝臓、腎臓などの損傷や機能障害を直接予防・治療する目的で使用することができ、また、これらの疾患に付随する黄疸、血中ＧＰＴ・ＧＯＴ・ＬＤＨ等の上昇、疲労・倦怠感、食欲不振、意識障害、興奮、昏睡、腹水、糸球体濾過量の低下、浮腫、蛋白尿、乏尿、高カリウム血症、代謝性アシドーシス、血中クレアチニン・尿素窒素量等の上昇などを予防、治療または改善する目的で使用することができる。また、上記の組織または臓器を移植する際の保存液中に添加する、臓器の灌流液中に添加する等の方法により、移植時における臓器保存剤として用いることができる。さらに、Ｆａｓの関与する種々の疾患、例えば、上述した虚血再灌流障害に基づく疾患の予防・治療剤として用いることができる。さらには、ＳＩＲＳに伴うＭＯＤＳの予防・治療剤としても用いることができる。
本発明に用いるＦａｓアンタゴニストは、エンドトキシンによる臓器障害、特に肝臓障害又はエンドトキシン血症もしくは敗血症において、急性期のみならず、慢性的な障害をも抑制する。従って、本発明に用いるＦａｓアンタゴニストは、これらに基づく疾患および付随する病態について予防、治療または改善することが期待され、医薬品としては非常に好ましい特性を有すると考えられる。
本発明に用いるＦａｓアンタゴニストは、肝臓においては、移植などの外科的手術時、あるいはショックおよび循環不全などによる肝血流量（血液供給）の減少あるいは遮断の際の虚血再灌流障害において、肝不全や組織障害ならびに肝機能低下に対する予防、治療または改善作用が期待される。また、心臓においては、心筋梗塞に対する血栓溶解療法、経皮的冠動脈内血栓溶解療法（ＰＴＣＲ）や経皮的冠動脈内腔拡張術（ＰＴＣＡ）後の再灌流の結果、細胞内カルシウムイオンの過負荷等に起因する不可逆的な細胞死や致死的な不整脈に対する予防、治療または改善作用が期待される。また、腎臓においては、術後または腎移植等に起因する腎虚血、腎虚血再灌流障害、それらに基づく疾患、腎不全、その原因疾患及び糸球体固有細胞（内皮細胞、上皮細胞、メサンギウム細胞）、メサンギウム基質、基底膜の細胞外基質または尿細管上皮細胞などの障害に対する予防、治療または改善作用が期待される。
実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１．ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ及びｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅの調製
（１）形質転換体の作製および培養
ｐＭ１３０４、ｐＭ１３１７、および国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１に記載のｐＢＦ−Ｆｃ１（ヒトＦａｓ抗原の細胞外領域とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とのキメラ蛋白質（ｈＦａｓ−Ｆｃと表記することがある）の発現プラスミド）を使用して、以下の方法で形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１３０４、ＣＯＳ−１／ｐＭ１３１７、ＣＯＳ−１／ｐＢＦ−Ｆｃ１を作製した。すなわち、それぞれのプラスミドＤＮＡ１００μｇを５００μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（以下、ＴＥバッファーと略す）溶液に溶解した。これらに、それぞれ０．２ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストランおよび５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有するＤ−ＭＥＭ（日水製薬）１２５ｍｌを添加し、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を作製した。１７００ｃｍ²ローラーボトル（コーニング社製）でセミコンフルエントまで単層培養したＣＯＳ−１細胞にＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を添加し、３７℃にて培養し、形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１３０４、ＣＯＳ−１／ｐＭ１３１７、ＣＯＳ−１／ｐＢＦ−Ｆｃ１を得た。４時間後、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を除去し、１０％ウシ胎児血清（ライフテックオリエンタル社製）を含有するＤ−ＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。その後、培地をｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ ｆｒｅｅ Ｄ−ＭＥＭ（ＦＢＳ，ＢＳＡ無添加）に交換し、さらに７２時間培養した後、培養上清を回収した。
（２）ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃの精製
▲１▼アフィニティークロマトグラフィー
ＣＯＳ−１／ｐＭ１３０４培養上清１ｌを、硫安沈殿（７０％飽和）した後、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に懸濁し、ＰＢＳに対して透析した。得られた懸濁液５７ｍｌを、使用説明書に従い、アフィプレッププロテインＡプレパラティヴカートリッジ（バイオラッド社製；７．３ｍｌ）カラムにアプライし、溶出しｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃを回収した。フィルトロンオメガセル（フジフィルター社製；分画分子量３０ｋＤ）を用いて限外濾過を行い、濃縮した。この濃縮液を０．９％ＮａＣｌに対して透析し、精製ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃを得た。また、同様にして、ｈＦａｓ−Ｆｃを精製した。各標品のタンパク質量はウシ血清アルブミンを標準物質としてＬｏｗｒｙ法で測定した。
得られた精製ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃを、０．１％ＳＤＳを含む５−２０％グラジエントゲルを用いたポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行い、２Ｄ−銀染色試薬・II「第一」（第一化学薬品社製）で染色し、バンドを検出した。精製されたｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃは非還元下で２量体に相当する分子量約８５ｋＤ、還元下で単量体に相当する約４３ｋＤのほぼ１本のバンドとして検出された。
得られた精製ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃを、予め０．０５％トリフルオロ酢酸にて平衡化したＶＹＤＡＣ Ｃ４カラム（４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、サイプレス社製）に供し、次いでカラムを０．０５％トリフルオロ酢酸で洗浄した。洗浄後、０．０５％トリフルオロ酢酸／０〜１００％アセトニトリルを使用し、直線濃度勾配法により流速１ｍｌ／分にて溶出を行った。
溶出されたメインピークの画分を凍結乾燥し、７０％蟻酸に溶解してサンプルとし、モデル４７７Ａプロテインシークエンシングシステム−１２０ＡＰＴＨアナライザー（パーキンエルマー社製）を使用し、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した。即ち、ＰＴＨアミノ酸の検出を２７０ｎｍの紫外部吸収にて行い、予め同一の方法で分離した標準ＰＴＨアミノ酸（パーキンエルマー社製）の保持時間を基準にしてアミノ酸を同定した。この結果、ヒトＦａｓ抗原のＮ末端アミノ酸２９残基を欠失したＮ末端アミノ酸配列（ＴｈｒＧｌｎＡｓｎＬｅｕＧｌｕＧｌｙＬｅｕＨｉｓＨｉｓＡｓｐ）を有していることが確認された。
（３）ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅの精製
ヒトＦａｓ抗原で免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞を用いて公知の方法（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻、４９５頁、１９７５年）で作製した、抗Ｆａｓモノクローナル抗体（４Ｂ４−Ｂ３）を、ホルミルーセルロファイン（生化学工業社製）と混合し、常法に従い、抗体アフィニティーカラムを作製した。
ＣＯＳ−１／ｐＭ１３１７培養上清１０ｌを、フィルトロンミニセット（分画分子量１０ｋＤ；フジフィルター社製）で限外濾過濃縮し、１．５ｌとした。その後に、濃縮液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を添加してｐＨ８．０に調製し、１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて予め平衡化した抗Ｆａｓ抗原モノクローナル抗体固定化アフィニティーカラムにアプライした。カラムを１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）３２０ｍｌで洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）でｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅを溶出した。ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅを含む画分をプールし、フィルトロンオメガセル（分画分子量１０ｋＤ；フジフィルター社製）を用いて限外濾過を行い、濃縮した。この濃縮液を０．９％ＮａＣｌに対して透析し、精製ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅを得た。
得られた精製ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅを、０．１％ＳＤＳを含む５−２０％グラジエントゲルを用いたポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行い、２Ｄ−銀染色試薬・II「第一」（第一化学薬品社製）で染色し、バンドを検出した。精製されたｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅは非還元下で分子量約４３ｋＤ及び約２７ｋＤの２本のバンドとして、還元下で約２３ｋＤ及び２７ｋＤの２本のバンドとして検出された。
上記で得た精製ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅを用い、前記と同様に、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、ヒトＦａｓ抗原のＮ末端アミノ酸２９残基を欠失したＮ末端アミノ酸配列を有していることが確認された。
（４）ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅ及びｈＦａｓ−Ｆｃのアポトーシス抑制活性の比較
ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ及びｈＦａｓ−Ｆｃが１Ａ１２細胞及びＦＬｍ１４細胞のＷＣ８細胞及びＷ４細胞に対する細胞障害活性を抑制する活性を指標として測定した。１Ａ１２細胞はヒトＦａｓリガンドを発現するようにマウスＷＲ１９Ｌ細胞を形質転換させた細胞であり、また、ＦＬｍ１４細胞はマウスＦａｓリガンドを発現するようにマウスＦＤＣ−Ｐ１細胞を形質転換させた細胞である。ＷＣ８細胞はヒトＦａｓ抗原を、Ｗ４細胞はマウスＦａｓ抗原を発現させるようにマウスＷＲ１９Ｌ細胞を形質転換させた細胞である。このＷＲ１９Ｌ細胞は、マウスＦａｓ抗原を殆ど発現せず、ＴＮＦの細胞障害作用に感受性の細胞である。細胞障害活性の測定は、ルービエ Ｅ．（Ｒｏｕｖｉｅｒ Ｅ．）等の方法に準じて行った（Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．，１７７巻、１９５−２００頁、１９９３年）。先ず、１Ａ１２細胞或はＦＬｍ１４細胞を１０％非働化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０で洗浄し、エフェクター細胞とした。一方、１００μｌの１０％非働化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で、２０μＣｉの［５１Ｃｒ］クロム酸ナトリウム（ＮＥＮ社製）と共に１×１０⁶個のＷＣ８細胞またはＷ４細胞を３７℃で２時間インキュベートした。１０％非働化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０で洗浄した後、これらの細胞をターゲット細胞として使用した。１×１０⁴個の１Ａ１２細胞或は１×１０⁵個のＦＬｍ１４細胞とターゲット細胞１×１０⁴個とを、様々な濃度のｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ及びｈＦａｓ−Ｆｃと丸底のマイクロタイタープレートの各ウェル中で混合した。このとき全液量が計１００μｌになるようにした。８００ｒｐｍで２分間、プレートの遠心操作を行った後、３７℃で４時間インキュベートした。更に、１，２００ｒｐｍで５分間プレートの遠心操作を行い、各ウェルより上清５０μｌを分取してγカウンターを用いて放射活性を測定し、特異的細胞溶解率を算出した。51Ｃｒの自然放出は、培地のみでターゲット細胞をインキュベートすることにより決定し、一方、最大放出量は、ターゲット細胞に０．１％となるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えることにより決定した。
１Ａ１２細胞をエフェクター細胞とし、ＷＣ８細胞をターゲット細胞としたとき、および、ＦＬｍ１４細胞をエフェクター細胞とし、Ｗ４細胞をターゲット細胞としたときのｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ及びｈＦａｓ−Ｆｃの特異的細胞障害抑制活性を比較したところ、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃは、ｈＦａｓ−Ｆｃと比較して３〜１０倍高い細胞障害抑制活性を有していた。
同様に、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅはｈＦａｓ−Ｆｃと比較して３〜１０倍高い細胞障害抑制活性を有していた。
実施例２．Ｆａｓアンタゴニストの心疾患モデルにおける効果
（１）心虚血再灌流モデルの作製
３２０〜４５０ｇの雄性Wistarラット（日本チャールスリバー（株）製）にネンブタール（大日本製薬（株）製）６０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し、麻酔した。３５℃に保温した保温台（ＩＫＥＤＡ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＣＯ．ＬＴＤ製）上に仰臥位にラットを固定後、気管を切開し人工呼吸器（シナノ製作所製 ＳＮ−４８０−７）を接続した。次に左側胸部第４肋間で開胸し心臓を露出し、左冠状動脈の起支部より２〜３ｍｍ上流を糸付き縫合針（眼科用弱湾針、（株）夏目製作所製）を用いて片蝶結びにて結紮した。２０分後に片蝶結びを解くことで結紮を解除し、再灌流を３時間行った。次に虚血領域を決定するために、再び結紮を行い、左大腿静脈から１％エバンスブルー含有生理食塩水を投与した。その後、心臓を摘出し、液体窒素で凍結後、剃刀刃（フェザー安全剃刀（株）製）を用いて５つの切片に分け、１％ＴＴＣ（塩化２、３、５、トリフェニルテトラゾリウム、和光純薬工業（株）製）含有生理食塩水中で３７℃、２０分染色した。各切片は以後の解析まで、１０％中性緩衝ホルマリン液中に保存した。また、血漿中クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）測定用に、再灌流１時間後および３時間後に頚静脈から採血を行った。
（２）ヒトＦａｓ−Ｆｃの投与
ヒトＦａｓ−Ｆｃ（ｈＦａｓ−Ｆｃ）は、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１３２９３の実施例１に記載の方法に従って調製したものを使用した。０．１％ヒト血清アルブミン（（財）化学及血清療法研究所製）含有生理食塩水にて希釈し、１ｍｇ／１０ｍｌ／ｋｇの用量で、再灌流開始直後に右大腿静脈から投与した。なお、コントロール群には０．１％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水を投与した。ｈＦａｓ−Ｆｃ１ｍｇ／ｋｇ投与群を５例、コントロール群を８例とした。
（３）各切片中の非虚血領域、虚血領域、壊死領域の測定
各切片の非虚血領域（エバンスブルー陽性、ＴＴＣ陽性領域）、虚血領域（エバンスブルー陰性、ＴＴＣ陽性領域）、壊死領域（エバンスブルー陰性、ＴＴＣ陰性領域）の割合は以下の方法で算出した。心切片の両面（上面、下面）について、実体顕微鏡（ＳＨＺ１０、オリンパス光学工業（株）製）からの画像を画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＣｏｍｍａｎｄ５０９８、オリンパス光学工業（株）製）に入力し、モニター上で非虚血領域、虚血領域、壊死領域を分画し、分画した画面をプリンターに打ち出した。打ち出した画像中の各領域の面積をデジタルプラニメーター（（株）内田洋行製）を用いて測定した。次に以下の式により、各領域の湿重量を計算した。切片の上面、下面の各領域の面積比を各々Ａ、Ｂとすると各領域の湿重量＝０．５×（Ａ＋Ｂ）×切片湿重量である。
（４）心標本に占める非虚血領域、虚血領域、壊死領域の比率（％）の算出
各切片における非虚血領域の湿重量の和を全非虚血領域の湿重量とした。また、全非虚血領域の湿重量と各切片の湿重量の和（心標本全湿重量）の比率（％）を心標本に占める非虚血領域の比率（％）とした。同様に、虚血領域、壊死領域について全湿重量および、心標本に占める比率（％）を算出した。
（５）血漿中クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）測定
血漿中ＣＰＫ値は、ＣＰＫテストワコーおよび、オートアナライザー（ＣＯＢＡＳＦＡＲＡ、ロッシュ社製）を用いて測定した。
（６）結果
ｈＦａｓ−Ｆｃ投与群の虚血領域に対する壊死領域の比率（％）はコントロール群よりも低かった（図１３）。また、ｈＦａｓ−Ｆｃ投与群の血漿中クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）活性値はコントロール群よりも低かった（図１４）。
実施例３．ｈＦａｓ−Ｆｃの毒性試験
（１）方法
７週齢の雌性ＩＣＲマウス（日本エスエルシー（株）製）にｈＦａｓ−Ｆｃ２．５ｍｇ／ｋｇを連日３日間腹腔内に投与した。対照群には生理食塩水を投与した。投与開始前日から、投与終了の翌日まで、連日体重を測定し、ｈＦａｓ−Ｆｃ投与の体重に及ぼす影響を調べた。また、投与終了の翌日に剖検を実施し、主要臓器の肉眼的観察及び脾細胞数の測定を行い、ｈＦａｓ−Ｆｃ投与の影響を調べた。
（２）結果
連日３日間のｈＦａｓ−Ｆｃ２．５ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与は、体重および脾細胞数に影響を及ばさなかった。また、剖検においてもｈＦａｓ−Ｆｃ投与による影響は観察されなかった。
実施例４．ＦａｓアンタゴニストのマウスＧＶＨＤモデルにおける効果
（１）宿主マウスの骨髄抑制
宿主マウスとして、雄性、６週齢、ＢＤＦ１マウス（日本チャールスリバー（株）製）を用いた。宿主マウスの腹腔内にシクロホスファミド（塩野義製薬（株）、エンドキサン）を４５０ｍｇ／ｋｇを投与し骨髄抑制を誘導した。
（２）供与マウス由来脾臓リンパ球の調製および宿主マウスへの移植
供与マウスとして雄性、７週齢、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本チャールスリバー（株）製）を用いた。供与マウスの脾臓をハンクス液（日水製薬（株）製）中でピンセットを用いてほぐした後、遠心し、得られた細胞を０．０１７Ｍトリス−０．７４７％塩化アンモニウム溶液中に懸濁し赤血球のみを溶血させた。残った細胞をハンクス液で洗浄したものを供与マウス由来脾臓リンパ球とし、前述のシクロホスファミド投与１日後の宿主マウスに３×１０⁷個／マウス尾静脈から移植した。
（３）ｈＦａｓ−Ｆｃの効果検討
供与マウス由来脾臓リンパ球移植の翌日から、ｈＦａｓ−Ｆｃ１、３、１０ｍｇ／ｋｇを２日に１回、尾静脈から投与し、生存日数に対する効果を調べた。なお、コントロール群にはｈＦａｓ−Ｆｃの希釈液である０．１％ヒト血清アルブミン（（財）化学及血清療法研究所製）含有生理食塩水を投与し、各群ｎ＝５とした。その結果、コントロール群に比較して、ｈＦａｓ−Ｆｃ１０ｍｇ／ｋｇ投与群に生存日数延長効果が認められた（図１５）。また、体重減少も軽度であった。
実施例５．ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ生産ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（ｐＭ１３０４）７２−１０５−５５）の作製
（１）ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ形質転換体の作製
プラスミドｐＭ１３０４ １６μｇを５．５μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶液に溶解した。これらにＦ−１２Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製；以下、ＨａｍＦ１２培地と略す）を８００μｌになるよう加え、溶液Ａとした。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）９６μｌにＨａｍＦ１２培地を８００μｌになるよう加え、溶液Ｂとした。溶液Ａと溶液Ｂを混合し、室温で３０分間インキュベート後、ＨａｍＦ１２培地を６．４ｍｌ添加し、ＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ混合液を作製した。前日に、１．２×１０⁶個のＣＨＯ ＤＸＢ１１細胞を１０ｃｍΦシャーレ（コーニング社製）に植え込んだものをＨａｍＦ１２培地で洗浄後、ＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ混合液８ｍｌを添加した。５％ＣＯ₂／９５％ａｉｒ存在下、３７℃で７．５時間インキュベート後、ＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ混合液を除去し、１０％非働化ウシ胎児血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社製）含有ＨａｍＦ１２培地に交換し、さらに２４時間培養した。再度、１０％非働化ウシ胎児血清含有ＨａｍＦ１２培地に交換し、２４時間培養後１０³、１０⁴、１０⁵個／１０ｍｌ １０％非働化ウシ胎児血清含有ＨａｍＦ１２培地／１０ｃｍΦシャーレになるよう蒔き直した。その２日後、１０％非働化透析ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）含有Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｓｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製；以下、ＭＥＭα（−）と略す）培地に交換し、ＤＨＦＲ遺伝子が導入された細胞の選択を開始した。その後、３または４日毎に１０％非働化透析ウシ胎児血清含有ＭＥＭα（−）培地で培地交換すると約２週間目ごろより、ＤＨＦＲ陽性細胞のコロニーが形成された。これらから、延原らの方法（実験医学、Ｖｏｌ．５ Ｎｏ．１１ １９８７年、１１０８−１１１２頁）に従い、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ発現／ＤＨＦＲ陽性細胞をクローニングした。すなわち、約100個の単コロニーをペニシリンカップを用いてクローニングし、４８穴プレート（ＮＵＮＣ社製）へ継代した。その後、３または４日毎に１０％非働化透析ウシ胎児血清含有ＭＥＭα（−）培地で培地交換し、コンフルエントになるとスケールアップした。６穴プレート（ＮＵＮＣ社製）でコンフルエントになる程度まで、細胞が増殖したら、細胞数を２．５×１０⁵個／５００μｌ １０％非働化透析ウシ胎児血清含有ＭＥＭα（−）培地／２４穴プレート（ＮＵＮＣ社製）にそろえて植え込み、２または３日後に上清を回収した。上清中のｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ量をＥＩＡで測定し、発現量の高い株（ＣＨＯ（ｐＭ１３０４）７２）を選択した。
（２）遺伝子増幅によるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ高発現株（ＣＨＯ（ｐＭ１３０４）７２−１０５−５５）の作製
延原らの方法（実験医学、Ｖｏｌ．５ Ｎｏ．１１ １９８７年、１１０８−１１１２頁）に従いメソトレキセート（ＭＴＸ）による遺伝子増幅を行い、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ高発現株を作製した。すなわち、ＣＨＯ（ｐＭ１３０４）７２細胞を１０³、１０⁴、１０⁵個／１０ｍｌ １０％非働化透析ウシ胎児血清含有ＭＥＭα（−）培地／１０ｃｍΦシャーレになるよう植え込み、翌日５ｎＭ ＭＴＸ（Ｌｅｄｅｒｌｅ社製）を含む１０％非働化透析ウシ胎児血清含有ＭＥＭα（−）培地に交換し、遺伝子増幅を開始した。その後、３または４日毎に５ｎＭ ＭＴＸを含む１０％非働化透析ウシ胎児血清含有ＭＥＭα（−）培地で培地交換すると、約２週間目ごろより５ｎＭ ＭＴＸ耐性細胞のコロニーが形成された。以降、ＣＨＯ（ｐＭ１３０４）７２細胞取得と同様の方法で、５ｎＭ ＭＴＸ耐性株ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ高発現細胞（ＣＨＯ（ｐＭ１３０４）７２−１０５）を得た。その後、同様の操作を繰り返すことで、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性株ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ高発現細胞（ＣＨＯ（ｐＭ１３０４）７２−１０５−５５）を得た。
実施例６．ＣＨＯ細胞を用いたｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃの生産およびその精製
（１）ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ生産ＣＨＯ細胞の培養
実施例５で作製したＣＨＯ（ｐＭ１３０４）７２−１０５−５５を培養面積６０００ｃｍ²のセルファクトリー（Ｎｕｎｃ社製）に増殖培地として５０ｎＭ ＭＴＸ含有ＩＢＬ ＭｅｄｉａＩ（（株）免疫生物研究所製）を用い、２．３×１０⁴個／ｃｍ²となるよう植え込み、５％ＣＯ₂／９５％ａｉｒ存在下、３７℃で６日間培養した。コンフルエントになったのを確認後、培地をＩＢＬ ＭｅｄｉａＩからインシュリンとトランスフェリンを除いた培地（生産培地）に交換した。５％ＣＯ₂／９５％ａｉｒ存在下、３７℃で４日間培養した後に上清を回収した。上清回収後の細胞に、再び生産培地を加え、さらに４日間培養し上清を再び回収した。
（２）ＣＨＯ細胞培養上清からのｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃの精製
実施例１−（２）と同様の方法で上述の培養上清から、プロテインＡクロマトグラフィーを用いてｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃを精製した。
実施例７．ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃの毒性試験
ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃの毒性を調べるために、雄性、６週齢、ＢＤＦ１マウス（日本チャールスリバー（株）製）にｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃを１０、３０ｍｇ／ｋｇの用量で2日に1回、１２日間、計７回尾静脈から投与し、その影響を調べた。実験はコントロール群、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ１０ｍｇ／ｋｇ投与群、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ３０ｍｇ／ｋｇ投与群の３群とし、各群ｎ＝３とした。なお、各投与群の投与蛋白質量を同じ３０ｍｇ／ｋｇとするために、コントロール群には３０ｍｇ／ｋｇのヒト血清アルブミンを、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ１０ｍｇ／ｋｇ投与群にはｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ１０ｍｇ／ｋｇとヒト血清アルブミン２０ｍｇ／ｋｇを、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ３０ｍｇ／ｋｇ投与群にはｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ３０ｍｇ／ｋｇを投与した。投与開始日から、２日に１回、体重測定を行った。投与開始１４日目に眼底静脈より採血を行い血球数を測定後、血漿を調製し、ＧＯＴ、ＧＰＴ、クレアチニンを測定した。また、採血終了後、剖検を行い、目視による主要臓器（肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、腸）の変化を調べた。血球数の測定はＳｙｓｍｅｘ社の自動血球測定装置Ｋ−２０００を用いて行った。ＧＯＴ、ＧＰＴ、およびクレアチニンはオートアナライザーＣＯＢＡＳＦＡＲＡ（ロッシュ社製）を用いて測定した。
その結果、１０、３０ｍｇ／ｋｇのｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃを2日に1回、１２日間、計７回マウスに投与しても体重増加、血球数、肝臓（ＧＯＴ、ＧＰＴ）、腎臓（クレアチニン）、その他主要臓器（肉眼的所見）への有意な影響は認められなかった。
実施例８．Ｆａｓアンタゴニストのエンドトキシン誘発肝障害モデルにおける効果
（１）ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃのマウス肝障害抑制作用
Ｃ５７ＢＬ／６Ｃｒ Ｓｌｃマウス（雄、９週齢、日本エスエルシー株式会社製）を用い、１群５匹、３群を被験動物として用いた。同マウスに１．５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように生理食塩水に溶解したプロピオンバクテリウムアクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓｓ）加熱死菌（リビイムノケミカルコーポレーション社製）液を尾静脈から０．２ｍｌ投与した。８日後に、実施例１で調製したｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃを希釈液（０．１％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水）で希釈し、０．３ｍｇ／８ｍｌ／ｋｇ、１ｍｇ／８ｍｌ／ｋｇの用量で尾静脈から投与した。対照群には希釈液を投与した。５分後に５μｇ／ｍｌの濃度になるように生理食塩水で調製したリポポリサッカライド（シグマ社製）液を０．２ｍｌ腹腔内に投与した。リポポリサッカライド投与８、２４時間後に眼底から７５μｌを採血した。採血した血液は３．８％クエン酸ナトリウム水溶液８．３μｌと混合後、３０００回転、１０分間遠心した。遠心後、得られた血漿を液体窒素で凍結後、使用時までマイナス３０度で保存した。ＧＯＴ、ＧＰＴの測定はＧＯＴ−ＦＡテストワコー（和光純薬工業株式会社製）、ＧＰＴ−ＦＡテストワコー（和光純薬工業株式会社製）とオートアナライザー（ロッシュ社製、コバスファラ）を用いて測定した。その結果、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃ １ｍｇ／８ｍｌ／ｋｇ投与群においてＧＯＴおよびＧＰＴの値は対照群のそれよりも低値であり、肝障害抑制効果が認められた。
（２）ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅのマウス肝障害抑制作用
Ｃ５７ＢＬ／６Ｃｒ Ｓｌｃマウス（雄、９週齢、日本エスエルシー株式会社製）を用い、１群５匹、３群を被験動物として、上記と同様に行った。その結果、ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−ｈｉｎｇｅ投与群のＧＯＴおよびＧＰＴの値は対照群のそれよりも低値であり、肝障害抑制効果が認められた。
実施例９．抗ヒトＦａｓリガンド抗体の肝障害モデルマウスにおける効果
（１）肝障害モデルマウスの作製
雄性、５週齢、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー（株）製）を用いた。同マウスに５．０ｍｇ／ｍｌのＰ．ａｃｎｅｓ加熱死菌（ＲＩＢＩＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＩＮＣ．）含有生理食塩水を尾静脈から０．２ｍｌ投与し、１０日後にヒトＦａｓリガンド細胞外領域を０．１％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水で５０μｇ／ｍｌに希釈し、尾静脈から０．２ｍｌ投与することで肝障害モデルマウスを作製した。なお、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母用プラスミドｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域をコードするＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドで、ピキア酵母ＧＳ１１５株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換し、得られた形質転換体の培養上清から、８０％飽和硫安塩析、ｈＦａｓ−Ｆｃ結合プロテインＡ−セルロファインアフィニティーカラム、及びＭｏｎｏＳ（ファルマシア社製）カラム等による精製操作により得た（タナカ Ｍ．等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２巻、３１７−３２２頁、１９９６年）。また、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１３２９３の実施例１８に記載の方法に従って調製したものも同様に使用できる。
（２）抗ヒトＦａｓリガンド抗体の致死抑制効果
前述の受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５５３５のハイブリドーマＦ９１９−９−１８により産生されるマウス抗ヒトＦａｓリガンドモノクローナル抗体Ｆ９１９−９−１８を使用した。抗ヒトＦａｓリガンドモノクローナル抗体Ｆ９１９−９−１８投与群には、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域投与の５分前にＦ９１９−９−１８を０．４ｍｇ／ｋｇあるいは１．２ｍｇ／ｋｇ尾静脈から投与した。コントロール群には、抗ヒトＦａｓリガンド抗体の希釈液である０．１％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水を投与した。各群ｎ＝５とした。その結果、コントロール群はＦａｓリガンド細胞外領域投与８時間後までに全例死亡したが、抗ヒトＦａｓリガンド抗体０．４ｍｇ／ｋｇ投与群の２４時間後の生存率は２０％、抗ヒトＦａｓリガンド抗体１．２ｍｇ／ｋｇ投与群の２４時間後の生存率１００％であった（図１６）。
実施例１０．抗マウスＦａｓリガンド抗体の作製および生産、精製
（１）抗マウスＦａｓリガンド抗体の作製
可溶型マウスＦａｓリガンドＷＸ２（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７巻、３９１８−３９２４頁、１９９６年）由来のマウスＦａｓリガンド細胞外領域とマウスＣＤ４０リガンドの細胞内領域、膜貫通領域および細胞外領域の一部（Ｎ末端から７８アミノ酸）を融合したキメラ蛋白質をコードする遺伝子をヒトエロンゲーションファクター（ＥＦ）プロモータの下流に有するプラスミドを作製した（ミズシマ−ナガタ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ−Ｎａｇａｔａ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８巻、５３２２頁、１９９０年）。上記プラスミドをＷＲ１９Ｌ細胞にトランスフェクトし、細胞膜上にマウスＦａｓリガンドを発現している組換え細胞Ｗ４０ＬＦＬを得て、投与抗原として用いた。免疫動物としてアルメニアハムスターを用いた。フロイント完全アジュバントと混合した１×１０⁷個のＷ４０ＬＦＬをアルメニアハムスターの皮下に投与し、１ヶ月後にＰＢＳに懸濁した２×１０⁷個のＷ４０ＬＦＬを皮下に投与した。さらに１ヶ月後、ＰＢＳに懸濁した５×１０⁶個のＷ４０ＬＦＬをフットパッドに投与した。３日後、リンパ節細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）と細胞融合した。ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）による選択の後、生育したハイブリドーマの中から、その培養上清中にマウスＦａｓリガンドによる細胞障害性を中和する活性を有するハイブリドーマＦＬＩＭ４（＃４−２）、ＦＬＩＭ２３（＃２３−２）、ＦＬＩＭ５８（＃５８−１１）を得た。
（２）ＦＬＩＭ５８（＃５８−１１）の生産および精製
ハイブリドーマ＃５８−１１を無血清培地Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）にて培養し、その培養上清をプロテイン−Ａカラム（ＰＲＯＳＥＰ−Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社）で精製し、精製抗体ＦＬＩＭ５８（＃５８−１１）を得た。蛋白濃度は２８０ｎｍの吸光度より算出した。
実施例１１．マウスおよびラットＦａｓリガンドに対する抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１の中和活性
抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１の中和活性は国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１３２９３の実施例に記載されている方法と同様に、⁵¹Ｃｒの遊離を指標としたアッセイにより調べた。
（１）エフェクター細胞の調製
雄性、７週令、ＩＣＲマウス（日本チャールスリバー）および、雄性、１１週令、Ｗｉｓｔａｒラット（日本チャールスリバー）の脾細胞を実施例４の方法と同様に調製した。得られた脾細胞を２×１０⁶個／ｍｌの濃度に調製し、４０Ｕ／ｍｌ組換え型ヒトＩＬ−２（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社）および１０％非働化ＦＢＳ（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）にて、５％炭酸ガス存在下３７℃で一晩培養した。１００ｎＭコンカナマイシンＡ（和光純薬工業）を添加し、１時間培養後、１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ（ＳＩＧＭＡ社）および５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を添加し、さらに２時間培養した。細胞を回収し、１０％非働化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄後、２．５×１０⁷個／ｍｌとなるよう１０％非働化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。
（２）ターゲット細胞の調製
ターゲット細胞の調製は国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１３２９３に記載されているのと同様の方法でおこなった。すなわち、ターゲットにはマウスＦａｓ発現細胞Ｗ４細胞を用い、１０⁶個のＷ４細胞を２０μＣｉの⁵¹Ｃｒ-クロム酸ナトリウム（ＮＥＮ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて３７℃で５％炭酸ガス存在下で２時間培養し、⁵¹Ｃｒ標識した。
（３）抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１のマウスおよびラットＦａｓリガンドに対する中和活性
上述の活性化マウスあるいはラット脾細胞１×１０⁶個に種々の濃度の抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１を添加し、５％炭酸ガス存在下で３７℃、３０分間培養した。次に上述の⁵¹Ｃｒで標識したＷ４細胞を１×１０⁴個を添加し、８００ｒｐｍ、２分間の遠心後、５％炭酸ガス存在下３７℃で４時間培養した。１２００ｒｐｍで５分間遠心して得られた上清中の⁵¹Ｃｒ量を測定し、抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１の効果を調べた。また、上述の活性化マウスおよびラット脾細胞による細胞障害活性がＦａｓＬによる細胞障害活性であることを確かめるために、抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１と同様の方法にて国際特許出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９７／０１５０２に記載されているＦａｓ誘導体ｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃを添加し、アッセイの陽性コントロールとして用いた。得られた結果は国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１３２９３に記載されている⁵¹Ｃｒの遊離を指標としたアッセイと同様の方法にて解析した。その結果、陽性コントロールとして用いたｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃは活性化マウスおよびラット脾細胞による細胞障害活性を０．３μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌの間で用量依存的に抑制し、用いた活性化マウスおよびラット脾細胞はＦａｓＬ依存的に細胞障害性を示すことが証明された。また、抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１もｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃと同様に、マウスおよびラットの活性化脾細胞の細胞障害活性を０．０３μｇ／ｍｌ〜０．３μｇ／ｍｌの間で用量依存的に抑制した。すなわち、抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１はマウスおよびラットＦａｓリガンドを阻害した。
実施例１２．抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１の毒性試験
（１）方法
雄性、８週齢、ＤＢＡ／１ＪマウスおよびＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールスリバー）を用いた。抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１を１００ｍｇ／３０ｍｌ／ｋｇの用量で尾静脈から投与した。またコントロール群には生理食塩水（大塚製薬）を３０ｍｌ／ｋｇの用量で尾静脈から投与した。２種の系統ともに各群ｎ＝３とした。観察期間を７日間とし、体重測定、血液学的検査（赤血球、白血球、血小板）、血液生化学的検査（ＧＯＴ、ＧＰＴ、尿素窒素）、肉眼による剖検を行った。
（２）結果
抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１投与群の投与後の体重増加、血液学的検査値（赤血球、白血球、血小板）、血液生化学的検査値（ＧＯＴ、ＧＰＴ、尿素窒素）はコントロール群と比べて差を認めなかった。また、肉眼による剖検所見においても抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１投与群に異常は認められなかった。
実施例１３．抗マウスＦａｓリガンド抗体の心虚血再灌流障害に対する効果
（１）方法
実施例２と同様の方法でラット心虚血再灌流モデルを作製した。抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１を０．１％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水にて希釈し、１ｍｇ／５ｍｌ／ｋｇの用量で、再灌流開始直後にラット右大腿静脈から投与した。なお、コントロール群には正常ハムスター血清由来精製ＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社）を１ｍｇ／５ｍｌ／ｋｇの用量で投与した。＃５８−１１投与群３例、コントロール群３例とした。実施例２と同様の方法で各切片中の非虚血領域、虚血領域、壊死領域の測定、および血漿中クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）測定を測定した。
（２）結果
抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１投与群の虚血領域に対する壊死領域の比率（％）はコントロール群よりも低かった（図１７）。また、抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１投与群の血漿中ＣＰＫ値はコントロール群よりも低かった（図１８）。
実施例１４．マウスＧＶＨＤモデルにおける抗マウスＦａｓリガンド抗体の生存率に対する効果
（１）宿主マウスの骨髄抑制
宿主マウスとして、雄性、６週齢、ＤＢＡ／２マウス（日本チャールスリバー（株））を用いた。宿主マウスの腹腔内に３５０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（塩野義製薬（株）、エンドキサン）を投与し骨髄抑制を誘導した。
（２）供与マウス由来脾臓リンパ球の調製および宿主マウスへの移植
供与マウスとして雄性、７〜８週齢、Ｂ１０．Ｄ２マウス（日本エスエルシー（株））を用いた。供与マウスの脾臓をハンクス液（日水製薬（株））中でピンセットを用いてほぐした後、遠心し、得られた細胞を０．０１７Ｍトリス−０．７４７％塩化アンモニウム溶液中に懸濁し赤血球のみを溶血させた。残った細胞をハンクス液で洗浄したものを供与マウス由来脾臓リンパ球とし、前述のシクロホスファミド投与１日後の宿主マウスに３×１０⁷個／マウス尾静脈から移植した。
（３）抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１の効果検討
供与マウス由来脾臓リンパ球移植の３０分前に、１０ｍｇ／１０ｍｌ／ｋｇの抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１あるいは正常ハムスター血清由来精製ＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社）を尾静脈から投与し、生存率を調べた。なお、上記抗体の代わりに抗体希釈液である生理食塩水（大塚製薬）１０ｍｌ／ｋｇを、供与マウス由来脾臓リンパ球の代わりに細胞懸濁液であるハンクス液を投与したマウスをＧＶＨＤ陰性群とした（各群ともｎ＝８）。その結果、脾細胞移殖８日後における生存率は、ＧＶＨＤ陰性群６３％、抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１投与群６３％、コントロール抗体投与群３８％であった。コントロール抗体投与群の生存率との比較から、抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１投与群にＧＶＨＤにおける生存率改善効果が認められた（図１９）。
実施例１５．抗マウスＦａｓリガンド抗体の腎虚血再灌流モデルにおける効果
（１）腎虚血再灌流モデルの作製
雄性、６週令、ＩＣＲ系マウス（日本エスエルシー（株））をペントバルビタール麻酔下で手術台上に仰臥位に固定し、腹部を切開した。開腹部より右側腎臓を摘出した後、左側腎動静脈をクリップ（ＶＡＳＣＵＬＡＲ ＣＬＩＰ ＡＳ−１、協和時計工業）を用いて遮断し、虚血状態とした。３０分後クリップをはずし血液を再灌流した。血液再灌流の２４時間後、腹部大静脈より採血し、血漿中クレアチニン、および尿素窒素を測定した。クレアチニンの測定はデタミナＣＲＥ５５ｓ（協和メディックス）を、尿素窒素の測定は尿素窒素Ｂテストワコー（和光純薬工業（株））を用いてオートアナライザー（ＣＯＢＡＳＦＡＲＡ、ロッシュ）により測定した。
（２）抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１の投与
抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１を０．１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）含有生理食塩水にて希釈し、０．３ｍｇ／１０ｍｌ／ｋｇあるいは３ｍｇ／１０ｍｌ／ｋｇの用量で左側腎動静脈虚血直前および再灌流直後に静脈内投与した。なお、コントロール群は０．１％ＢＳＡ含有生理食塩水を投与した。偽手術群は右腎摘出した後、虚血状態とせずに０．１％ＢＳＡ含有生理食塩水を投与した。各群８例ずつとした。
（３）結果
抗マウスＦａｓリガンド抗体＃５８−１１３ｍｇ／ｋｇ投与群の血漿クレアチニン値、尿素窒素値はコントロール群より低値であり、腎虚血再灌流障害の抑制効果が認められた（図２０および２１）。以上の結果は、本願発明の疾患予防・治療剤または臓器保存剤が疾患に優れた効果を有することを示すものである。また、本発明の疾患予防・治療剤は、著しい毒性を示さず、少なくともＦａｓ／Ｆａｓリガンド系の生物作用を抑制することによる毒性は認められない。従って、本発明のＦａｓアンタゴニストを有効成分とする疾患予防・治療剤は、Ｆａｓによるシグナルの発生又は伝達を遮断し、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の生物作用、特にＦａｓを介した細胞の死、特にアポーシスが抑制される限り、これが関与する疾患の治療に有効である。
産業上の利用可能性
本発明のＦａｓアンタゴニストを有効成分とする疾患の予防・治療剤はＦａｓ／Ｆａｓリガンド系の生物作用、特に、Ｆａｓを介する細胞の死、特に、アポトーシスを抑制し、疾患の予防又は治療効果を有する。又、著しい毒性を示さず、少なくともＦａｓ／Ｆａｓリガンド系の生物作用を抑制することによる毒性は認められない。したがって、本発明のＦａｓアンタゴニストは、細胞の死、特に、アポトーシスが関与する疾患の予防・治療剤として期待される。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：３８１
配列の型：核酸
配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ
配列：

配列番号：２
配列の長さ：４０８
配列の型：核酸
配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ
配列：

配列番号：３
配列の長さ：３８１
配列の型：核酸
配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ
配列：

配列番号：４
配列の長さ：４０８
配列の型：核酸
配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ
配列：

配列番号：５
配列の長さ：１１８２
配列の型：核酸
配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ
配列：

配列番号：６
配列の長さ：５３１
配列の型：核酸
配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ
配列：

Claims (1)

1. Ｆａｓを介する細胞のアポトーシスを抑制または阻害するＦａｓリガンド細胞外領域もしくはＦａｓ細胞外領域と相互作用する物質を有効成分とする移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防・治療剤であって、前記Ｆａｓリガンド細胞外領域もしくはＦａｓ細胞外領域と相互作用する物質が、
   １） ヒトＦａｓ抗原の細胞外領域とヒトＩｇＧのＦｃ領域とを結合させたキメラタンパク質であるｈＦａｓ−Ｆｃ、および
   ２） 図５〜図９であらわされるアミノ酸配列からなるｓｈＦａｓ（ｎｄ２９）−Ｆｃからなる群から選択される少なくとも１つである移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防・治療剤。

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