JP4294223B2 - 増殖抑制物質を産生する制限された迅速成長可能細胞の組成物およびその使用 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、迅速な対数期成長の状態にある細胞、または迅速な対数期成長が可能な細胞の増殖を制限することに関する。この場合、そのような細胞は、その増殖が生体適合性の半透過性物質において物理的に制限されたとき、同一または異なるタイプおよび／または起源の他の迅速に増殖する細胞の成長を阻害し得る正常に発現している１つまたは複数の因子を、正常には発現していないほどの量または増大した量で産生する。このような制限された細胞は、本明細書中下記においては増殖性細胞として示される。このカテゴリーに属する増殖性細胞の非限定的な列記には、新生物形成細胞、ガン細胞および非ガン性細胞が含まれる。非ガン性細胞には、胚細胞、幹細胞、ならびに肝細胞、繊維芽細胞および上皮細胞を含む組織傷害後の再生期の細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明の１つの特徴である構造体は、「そのまま」使用することができ、あるいは規定されたおおよその分子量を有し、例えばガンなどの疾患または状態に関連した迅速に増殖する細胞に対する抗増殖作用をも有する濃縮物などの物質を製造するために、または細胞の成長を制御して、手術後の痕の形成などの制御されない細胞成長から生じ得るある種の医学的問題を防止するために使用することができる。
【０００２】
（背景および先行技術）
様々な生物学的物質を生物学的に適合し得る物質でカプセル化することは、文献においてよく記載されているが、限定的な成功にもかかわらず、相当長い間にわたって使用されている技術である。例示的な技術は、米国特許第５，２２７，２９８号（Ｗｅｂｅｒら）；同第５，０５３，３３２号（Ｃｏｏｋら）；同第４，９９７，４４３号（Ｗａｌｔｈａｌｌら）；同第４，９７１，８３３号（Ｌａｒｓｓｏｎら）；同第４，９０２，２９５号（Ｗａｌｔｈａｌｌら）；同第４，７９８，７８６号（Ｔｉｃｅら）；同第４，６７３，５６６号（Ｇｏｏｓｅｎら）；同第４，６４７，５３６号（Ｍｏｓｂａｃｈら）；同第４，４０９，３３１号（Ｌｉｍ）；同第４，３９２，９０９号（Ｌｉｍ）；同第４，３５２，８８３号（Ｌｉｍ）；および同第４，６６３，２８６号（Ｔｓａｎｇら）である。ジャイン（Ｊａｉｎ）らの米国特許第５，６４３，５６９号もまた注目される（これは参照により本明細書中に取り込まれる）。ジャインらは、様々な生体適合性物質における小島のカプセル化をやや詳しく論じている。小島はインスリンを産生し、ジャインらにより開示された物質を糖尿病の処置において使用することがそれに教示されている。ジャインらの米国特許第５，８８８，４９７号は、非制限ガン細胞の成長を抑制する物質を、等しい数の制限されていない同じガン細胞が産生するよりも多く産生するガン細胞がその中に制限された移植可能なアガロースコーティングのアガロースビーズを記載している。
【０００３】
ジャインらのこれらの特許は、移植治療における技術によって採用されている先行方法をやや詳しく論じている。これらもまた本明細書中で要約される。
【０００４】
移植された組織を宿主の免疫応答から守る５つの主要な方法が知られている。これらはすべて、移植された組織を宿主の免疫系から隔離しようとすることを含む。今日まで使用されている免疫隔離技術には、血管外拡散チャンバー、血管内拡散チャンバー、血管内限外濾過チャンバー、マイクロカプセル化およびマクロカプセル化が含まれる。先行技術の方法には多くの問題が伴っている。そのような問題には、移植物に対する宿主の線維症性応答、移植物の不安定性、半透膜を通過する栄養物の限定的な拡散、分泌促進物および生成物の透過性、ならびに半透膜バリアを通過する拡散遅延時間が含まれる。
【０００５】
例えば、生細胞、組織および他の不安定な膜を半透膜内に包み込むためのマイクロカプセル化技術が１９７８年にリム（Ｌｉｍ）によって開発された（Ｌｉｍ、Ｄａｍｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに対する研究報告（１９７８））。リムは、アルギン酸塩およびポリＬ−リシンのマイクロカプセルを使用して、ランゲルハンス島（以降、「小島」として示される）をカプセル化した。１９８０年に、この新規な技術の糖尿病研究における最初の成功したインビボ適用が報告された（Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１０：９０８（１９８０））。このマイクロカプセル化小島の移植により、糖尿病動物における正常な血糖状態の持続が得られた。しかし、この実験を繰り返した他の研究者は、アルギン酸塩が組織反応を生じさせることを見出し、リムらの結果を再現することができなかった（Ｌａｍｂｅｒｔｉら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１０１（１９８４）；Ｄｕｐｕｙら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｒｅｓ．２２：１０６１（１９８８）；Ｗｅｂｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、４９：３９６（１９９０）；およびＤｏｏｎ−ｓｈｉｏｎｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、２２：７５４（１９９０））。これらのポリマーの水溶性が、これらのマイクロカプセルのインビボでの限定された安定性および生体適合性の原因であると現在では考えられている（Ｄｕｐｕｙら（上記）、Ｗｅｂｅｒら（上記）、Ｄｏｏｎ−ｓｈｉｏｎｇら（上記）、およびＳｍｉｄｓｒｏｄ、Ｆａｒａｄａｙ Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、５７：２６３（１９７４））。
【０００６】
イワタ（Ｉｗａｔａ）ら（Ｉｗａｔａら、Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｒｅｓ．２６：９６７（１９９２））は、同種膵小島をマイクロカプセル化するためにアガロースを利用して、アガロースがマイクロビーズ調製用媒体として使用できることを見出した。イワタらの研究において、１５００個〜２０００個の小島が５％アガロース中に個々にマイクロカプセル化され、ストレプトゾトシン誘導の糖尿病マウスに移植された。移植体は長期間にわたって生存し、レシピエントは正常血糖を限りなく維持した。
【０００７】
しかし、彼らの方法は多数の欠点で悩まされている。その方法は扱いが容易でなく、不正確である。例えば、多くのビーズが部分的にコーティングされた状態であり、数百個の中身のないアガロースビーズが形成される。従って、さらなる時間が、カプセル化された小島を中身のないビーズから分離するために必要になる。その上、大部分の移植されたマイクロビーズは骨盤腔に集まり、従って完全にコーティングされた個々のビーズに含まれる非常に多くの小島が、正常血糖を達成するために必要になる。さらに、移植されたビーズは、回収が困難であり、砕けやすい傾向を有し、わずかな損傷を受けて容易に小島を放出する。
【０００８】
マクロカプセル化技術もまた調べられている。ポリ−２−ヒドロキシエチル−メタクリラート、ポリ塩化ビニル−ｃ−アクリル酸、および酢酸セルロースなどの様々な異なる物質のマクロカプセルが小島の免疫隔離のために作製された（Ａｌｔｍａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３５：６２５（１９８６）；Ａｌｔｍａｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｏｒｇａｎｓ、３０：３８２（１９８４）；Ｒｏｎｅｌら、Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：８５５（１９８３）；Ｋｌｏｍｐら、Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：８６５〜８７１（１９８３）を参照のこと）。すべてのこれらの研究において、血糖の一時的な正常化が達成されただけであった。
【０００９】
アーカー（Ａｒｃｈｅｒ）ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８：７７（１９８０））は、アクリル酸コポリマーの中空ファイバーを使用して、小島の異種移植片の拒絶を一時的に阻止した。彼らは、中空ファイバーに分散され、糖尿病ハムスターに移植された新生児ネズミ膵臓移植片の長期間の生存を報告した。最近、ラシー（Ｌａｃｙ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１７８２〜１７８４（１９９１））は彼らの結果を確認したが、正常血糖の状態が一時的であることを見出した。ラシーらは、小島をファイバー内に注入した場合、小島が中空チューブ内で凝集し、壊死が小島塊の中心部で生じることを見出した。中心部の壊死により移植片の延長が不可能になった。この問題を解決するために、彼らはアルギン酸塩を使用して、小島をファイバー内に分散させた。しかし、この実験は広範囲には繰り返されなかった。従って、ヒトにおける小島移植媒体としての膜機能は疑問である。
【００１０】
上記で論じられたジャイン（Ｊａｉｎ）らの特許は、分泌性細胞を透過性の親水性ゲル物質でカプセル化することによって動物に移植することができ、長期間にわたって貯蔵することができ、インビボで治療的に有用である機能的な非免疫原性物質が得られることを報告している。分泌性細胞のマクロカプセル化により、分泌性細胞移植のより効果的で管理可能な技術が得られた。
【００１１】
この特許は、迅速な増殖が可能な細胞の取り込みを全く論じていない。
【００１２】
細胞のカプセル化に関する文献調査により、細胞は、カプセル化後、カプセル化されなかったときに産生するよりも少ない量の物質を常に産生することが明らかにされる。ロイド−ジョージ（Ｌｌｏｙｄ−Ｇｅｏｒｇｅ）ら、Ｂｉｏｍａｔ．Ａｒｔ．Ｃｅｌｌｓ＆Ｉｍｍｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（３）：３２３〜３３３（１９９３）；シンスチン（Ｓｃｈｉｎｓｔｉｎｅ）ら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、４（１）：９３〜１０２（１９９５）；チチェポルティシェ（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ）ら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ、３１：５４〜５７（１９８８）；イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８２：４１〜４６（１９９０）；ゼコーン（Ｚｅｋｏｒｎ）ら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ、２９：９９〜１０６（１９９２）；ゾウ（Ｚｈｏｕ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７４：Ｃ１３５６〜１３６２（１９９８）；ダークウィ（Ｄａｒｑｕｙ）ら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ、２８：７７６〜７８０（１９８５）；ツセ（Ｔｓｅ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆Ｂｉｏｅｎｇ．５１：２７１〜２８０（１９９６）；イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２１：４６９〜４８０（１９９２）；ホルテラノ（Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ）ら、Ｂｌｏｏｄ、８７（１２）：５０９５〜５１０３（１９９６）；ガーディナー（Ｇａｒｄｉｎｅｒ）ら、Ｔｒａｎｓｐ．Ｐｒｏｃ．２９：２０１９〜２０２０（１９９７）を参照のこと。これらの参考文献はいずれも、迅速な増殖が可能な細胞を包み込んでその成長を制限するが、それにもかかわらず、構造体の内外に物質を拡散させる構造体にそのような細胞を取り込むことを論じていない。
【００１３】
ガン集団の成長に関する１つの理論は、そのような集団（例えば、腫瘍）を正常な器官にたとえる。健康な器官、例えば、肝臓は、特定の大きさにまで成長し、その後はもはや成長しない。しかし、肝臓の一部が切除された場合、ある程度まで再生される。この現象は、腫瘍についても認められている。要約すると、腫瘍の一部が切除された場合、腫瘍の残った部分の細胞は非常に迅速に増殖し始め、その結果、生じる腫瘍は特定の大きさに達し、その後は増殖を遅くするか、または停止することが認められている。このことは、ガン細胞の何らかの内部調節が存在することを示唆している。
【００１４】
（発明の概要）
本発明は、下記の開示において理解されるが、迅速な増殖が可能な細胞が、包み込まれていることなどによって物理的に制限されたときに、その増殖速度が劇的に低下し、そして非制限の迅速に増殖する細胞に適用された場合、細胞は、これらの非制限細胞の増殖を阻害する物質を、予想されないほど多くの量で産生することを示している。ガン細胞の増殖を遅延させることができることは、腫瘍学のその始めからの目標である。従って、ガンならびに迅速な細胞増殖によって引き起こされる他の疾患状態および状況に関する本発明の治療的有用性は明らかであり、本明細書中に詳しく述べられている。産生される物質は、使用される迅速に増殖する細胞のタイプによって、あるいは迅速に増殖する細胞が由来する動物の種によって限定されないようである。さらに、その作用は種に特異的ではないようである。なぜなら、第１の種から得られる制限された細胞は、第２の種から得られた制限されていない細胞の増殖を阻害する物質を産生するからである。また、ガンに関して、その作用は、ガンのタイプに特異的でなないようである。なぜなら、第１のガンタイプから得られる制限された細胞は、別のガンタイプから得られた制限されていない細胞の増殖を阻害する物質を産生するからである。
【００１５】
また、その作用は免疫応答を必要としないようである。抗増殖性作用が、免疫細胞を使用しないインビトロの系で認められている。従って、抗増殖作用は、古典的な免疫学的応答によるものではあり得ない。
【００１６】
従って、本発明の好ましい実施形態は、生体適合性で増殖制限性の選択的透過性構造体を有する物質の組成物に関する。この構造体は、迅速に増殖する細胞を制限し、このとき、この細胞によって、迅速な細胞増殖を抑制する物質が、制限されていないときの等しい数の同じ迅速に増殖する細胞と比較して多く産生される。
【００１７】
本発明の別の好ましい実施形態は、生体適合性で増殖制限性の選択的透過性構造体の調製方法に関する。そのような構造体は、迅速に増殖する細胞を、そのような構造体を形成する生体適合性の増殖制限性物質と接触させることによって構造体を形成し、そして構造体を、等しい数の同じタイプの制限されていない迅速に増殖する細胞と比較して、抑制対象の迅速に増殖する細胞の増殖を抑制する物質が細胞によって産生されるように、迅速に増殖する細胞を制限するのに十分な時間にわたって培養することによって調製される。
【００１８】
さらに別の好ましい実施形態は、迅速に増殖する細胞によって細胞成長を抑制する物質の産生を増大させる方法に関する。この方法は、迅速に増殖する細胞を生体適合性の選択的透過性の増殖制限性構造体において制限すること、および迅速に増殖する細胞がそのような物質を産生するように細胞を培養することを含む。示された構造体が培養培地に入れられた場合、示された物質は構造体から遊離し、培養培地に入る。得られる培養用培地もまた本発明の特徴である。
【００１９】
強力な抗増殖性作用が、本発明の構造体を培養培地中で培養することにより得られる調整培地をろ過することによって達成され得ることもまた見出された。得られる濃縮物は、極めて強力な抗増殖性作用を有する。
【００２０】
上記の物質、調整培地、および／またはそれから得られる濃縮物もまた、他の制限されていない迅速に増殖する細胞によって抗増殖性物質の産生を誘導するために有用であり得る。
【００２１】
好ましい実施形態において、制限された細胞はガン細胞であるが、ガンおよび他の状態を処置するために非ガン性細胞を使用することの利点は、当業者には容易に明らかなさらなる利益をもたらす。
【００２２】
本発明のこれらの特徴および他の特徴は、下記の開示から理解される。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
実施例１
本実施例および下記の実施例では、ＲＥＮＣＡ細胞が用いられる。これは、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの自発性の腎臓腺ガン細胞であり、一般に入手可能であり、インビトロ培養およびインビボの両方で維持される。フランコ（Ｆｒａｎｃｏ）ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ、１８１〜１９３（１９９４）を参照のこと。
【００２４】
凍結したＲＥＮＣＡ細胞のサンプルを３７℃で融解し、次いで、１０％ウシ血清、ペニシリン（１００ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補足した（本明細書で以下「完全培地」として示される）ダルベッコ改変培地（Ｄ−ＭＥＭ）を含有する組織培養フラスコに入れた、。
【００２５】
細胞をコンフルエンスにまで成長させ、次いでトリプシン処理し、続いてハンクス平衡塩溶液で洗浄し、次いで上記の完全培地で洗浄した。
【００２６】
ＲＥＮＣＡ細胞が腫瘍を効率的に産生するかどうかを明らかにするために、２匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスに１０⁶ 個のこの細胞を腹腔内注射した。マウスを３〜４週間の期間にわたって観察した。臨床的には、マウスは、最初の２週間は健康そうであり、正常な活動を示した。その後、ガンの臨床的発現が明らかになった。１匹のマウスが２３日後に死亡し、２匹目が２５日後に死亡した。死後、マウスを調べ、様々なサイズのおびただしい腫瘍が認められた。腫瘍の中には出血をも示した。
【００２７】
１つの腫瘍サンプルを一方のマウスから採取し、その後の組織学的試験のために１０％ホルマリンで固定した。
【００２８】
実施例２
ＲＥＮＣＡ細胞がインビボで実際に成長したことが明らかにされた後、本発明の構造体において制限されたとき、この細胞が成長するかどうかを明らかにするために検討を行った。
【００２９】
ＲＥＮＣＡ細胞を、上記のようにコンフルエンスにまで成長させ、トリプシン処理して、同様に上記のように洗浄した。次いで、６０，０００細胞〜９０，０００細胞のサンプルを調製した。次いで、細胞を７５０ＲＰＭで遠心分離し、液体を除いた。次いで、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩溶液で、ｐＨが６．５の１％アテロコラーゲン溶液に懸濁した。
【００３０】
低粘度アガロースの１％溶液を最少必須培地（ＭＥＭ）で調製して６０℃で維持し、次いで、この１００ｕｌを上記のＲＥＮＣＡ細胞およびアテロコラーゲンの懸濁物に加えた。次いで、この物質を、滅菌した室温のミネラルオイル中に１個の大きな滴として直ちに移した。この混合物は１個の滑らかな半固体ビーズを形成した。この手順を繰り返して多数のビーズを作製した。
【００３１】
１分後、ビーズを３７℃の上記の完全培地に移した。次いで、ビーズを、上記の抗生物質を含有する最少必須培地（ＭＥＭ）で３回洗浄した。次いで、ビーズを、空気および５％ＣＯ₂ の加湿雰囲気のもと、３７℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、今度は固体になったビーズを、ＭＥＭ中５％アガロースの１ｍｌを含有する滅菌したスプーンに移した。ビーズを溶液中で２回〜３回転がして、ビーズにアガロースを均一にコーティングした。滑らかな外表面を得るために、ビーズをミネラルオイルに移し、その後、アガロースを固化させた。６０秒後、ビーズを３７℃の完全培地で５回洗浄して、オイルを除いた。一晩のインキュベーション（３７℃、空気および５％ＣＯ₂ の加湿雰囲気）を続けた。
【００３２】
このようなＲＥＮＣＡ含有ビーズを下記の実験において使用した。
【００３３】
実施例３
インビボ実験を行う前に、ＲＥＮＣＡ細胞が上記の方法で調製されたビーズ内で成長するかどうかを明らかにすることが必要であった。
【００３４】
この実験を行うために、実施例２で論じられているようにして調製されたビーズを、実施例２に記載される培地で、記載された条件のもとで３週間インキュベーションした。次いで、３個のビーズを小片に切断して、フラスコおよび培養培地の両方との直接的な接触をもたらす標準的な培養フラスコで培養した。
【００３５】
これらの培養物を観察することによって、細胞は成長して標準的なＲＥＮＣＡコロニーを形成していることが示された。このことは、細胞がビーズ内で生存し続けることを示していた。
【００３６】
実施例４
次いで、インビボ実験を行った。この実験では、ビーズを３７℃で７日間インキュベーションした。次いで、被験マウスにビーズを移植した。移植のために、４匹の各マウスは、腹膜内に達する正中切開を受けた。それぞれが６０，０００個のＲＥＮＣＡ細胞を含有する３個のビーズを移植した。次いで、切開を、吸収性縫合糸を使用して閉じた（２層閉鎖）。４匹のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）は、体重が２４ｇ〜２６ｇの正常な雄性マウスであり、健康であるように見えた。２組のコントロールを準備した。第１組において、２匹のマウスに、ＲＥＮＣＡ細胞を含有しない３個のビーズを与えた。第２組においては、２匹のマウスは何の処置も行わなかった。
【００３７】
移植した３週間後、すべてのマウスに１０⁶ 個のＲＥＮＣＡ細胞の腹腔内注射を行った。その１８日後、１匹のコントロールマウスが死亡した。次いで、残ったすべてのマウスを屠殺し、腫瘍の存在の有無について評価した。
【００３８】
コントロールのマウスはおびただしい腫瘍が見られたが、ビーズにカプセル化された細胞の移植物を受けたマウスは、腔全体にわたって孤立した小さな細胞塊が見られただけであった。
【００３９】
この勇気づける結果により、下記の実施例に示される実験が計画された。
【００４０】
実施例５
この実験では、樹立されたガンが、ＲＥＮＣＡ細胞を６匹の各ＢＡＬＢ／Ｃマウスの一方の腎嚢下部に注射することによって刺激された。その１５日後、マウスを２群に分けた。第１群の３匹の各マウスに、上記の実施例４に記載されている３個のビーズを与えた。第２群（コントロール群）には、ＲＥＮＣＡ細胞を含有しないビーズを与えた。
【００４１】
最初の４〜５日間、ＲＥＮＣＡ細胞を含有する移植物が投与されたマウスは嗜眠状態のようであり、それらの毛は針状になっていた。その後、マウスは正常に戻った。コントロール群は元気のままであり、毛の状態には変化がなかった。
【００４２】
しかし、移植の１０日後（ＲＥＮＣＡ細胞を注射した２５日後）、コントロールのマウスはのろくなり、膨張した腹部を示した。３匹のコントロールマウスの１匹が、ビーズ移植後の１４日目に死亡した。その後、マウスを屠殺した。
【００４３】
コントロールマウスの体腔はかなりの出血を示し、おびただしい腫瘍が、消化管、肝臓、胃および肺の一面に見られた。腹腔のすべての器官は、手のつけられないほどの腫瘍成長のために識別できなくなっていた。しかし、ＲＥＮＣＡ細胞がカプセル化されたビーズを受けたマウスは、出血が見られず、消化管に数個の細胞塊が見られただけであった。さらに、試験群およびコントロール群の比較により、試験群において、細胞塊は、腎嚢下部の、マクロビーズが移植される前のその最初の成長を超えて進行していないことが明らかにされた。
【００４４】
実施例６
インビトロにおいて、自由に接種されたＲＥＮＣＡ細胞の成長は、そのような細胞がマクロビーズのカプセル化ＲＥＮＣＡ細胞と一緒にインキュベーションされたときに阻害される。さらなる実験群を、この作用が他の細胞で観測され得るかを明らかにするために行った。
【００４５】
腺ガン細胞株、すなわち、ＭＭＴ（マウス乳ガン）をアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。カプセル化されたＭＭＴ細胞を、上記のように、ＭＭＴ細胞を用いて調製して、ビーズあたり１２０，０００個または２４０，０００個の細胞を含有するビーズを作製した。ビーズを調製した後、ビーズを、それらによってＲＥＮＣＡ細胞の増殖がインビトロで阻害されるかどうかを明らかにするために使用した。詳細には、２つの６ウエルペトリプレートを、４ｍｌの培地に１×１０⁴ 個／ウエルのＲＥＮＣＡ細胞を接種することによって調製した。各プレートにおいて、３ウエルをコントロールとして使用し、３ウエルを被験物として使用した。各プレートの３つのコントロールウエルの１つに１個の空ビーズを加えた。残りの各ウエルには、２個または３個のいずれかの空ビーズを与えた。ウエルの第２群を同様に処理したが、ウエルには、１２０，０００個または２４０，０００個のＭＭＴ細胞を含有するビーズを１個、２個または３個与えた。ウエルを３７℃で１週間インキュベーションした。その後、ＲＥＮＣＡ細胞をトリプシン処理して洗浄し、血球計を使用して計数した。結果を表１に示す：
【表１】

実施例７
実施例６の結果に従い、同じ実験を、ＲＥＮＣＡ細胞ではなく、接種物（すなわち、自由の細胞）として１×１０⁴ 個のＭＭＴ細胞を使用して行った。実験を実施例６と同じに行った。結果を下記の表２に示す。
【００４６】
【表２】

これらの結果はインビボ実験を勇気づけた。これを実施例８に示す。
【００４７】
実施例８
上記のマウス乳ガン細胞株（ＭＭＴ）を使用した。上記のプロトコルを使用して、ビーズあたり１２０，０００個の細胞を含有する移植物およびビーズあたり２４０，０００個の細胞を含有する移植物を調製した。
【００４８】
使用した実験モデルは上記のマウスモデルであった。２２匹のマウスを、４匹（コントロール）、９匹および９匹の群に分けた。第１群（すなわち、コントロール）をさらに３群に分けた：１個の空ビーズの移植物を受けた２匹、２個の空ビーズの移植物を受けた１匹、および３個の空ビーズの移植物を受けた１匹。
【００４９】
実験群Ａ（９匹の動物）において、ビーズは１２０，０００個の細胞を含有した。一方、実験群Ｂにおいて、ビーズは２４０，０００個の細胞を含有した。群Ａおよび群Ｂにおいて、それぞれが３匹のマウスを含有する３つの細群が存在した。この細群には、ＭＭＴ細胞を含有する１個、２個または３個のビーズを与えた。
【００５０】
最初の数日間、群Ａおよび群Ｂのマウスは嗜眠状態であり、毛は針状になっていた。これは約５日間続いたが、その後は正常な挙動が認められた。移植した２１日後に、すべての動物に４０，０００個のＲＥＮＣＡ細胞を注射した。
【００５１】
さらに２０日後、コントロールマウスは、膨張した腹部を示し、そして極端な針状の毛を示した。１匹のコントロールマウスが注射の２５日後に死亡し、残りのコントロールマウスは末期的であるようであった。すべてのマウスを屠殺して、腫瘍の発達を観察した。これらの観察を下記の表３に示す：
【表３】

これらの結果は、処置された１８匹のマウスのうち、１３匹は何の疾患も示さなかったことを示している。群Ａのマウスのうち、１匹のマウスは少数の小さな細胞塊（＋）が見られ、別のマウスは少数の腫瘍（＋＋）が見られた。
【００５２】
群Ｂにおいて、１個のビーズが投与された１匹のマウスに、そして２個のビーズが投与された１匹のマウスに、腸を巻き込んだ少数の腫瘍が見られた。３個のビーズが投与された１匹のマウスは、大きな固形腫瘍を発達させ、明らかに重症（＋＋＋）であった。すべてのコントロールマウスはおびただしい腫瘍（＋＋＋＋）が見られた。これらの結果により、カプセル化されたマウス乳腫瘍細胞は腫瘍形成を阻害することが示された。
【００５３】
実施例９
上記に示唆されているように、本発明の実施によって、腫瘍細胞の増殖を阻害および／または防止する物質の産生がもたらされる。これを下記の実験でさらに検討した。
【００５４】
さらなるビーズを上記の実施例２のようにして作製したが、アテロコラーゲンを含まない。従って、このビーズはアガロース／アガロースビーズである。上記に記載されているＲＥＮＣＡ細胞が、再度ではあるが上記のように、このビーズに取り込まれた。
【００５５】
次いで、２組の３つの６ウエルプレートをコントロール群および実験群として使用した。コントロール群において、ウエルを４ｍｌのＲＰＭＩ完全培地（１０％ウシ胎児血清および１１ｍｌ／ｌペニシリン）で満たした。次いで、コントロール群の各ウエルに１０，０００個のＲＥＮＣＡ細胞を接種した。
【００５６】
実験群において、１０個のＲＥＮＣＡ含有ビーズ（１２０，０００細胞／ビーズ）を５０ｍｌのＲＰＭＩ完全培地を含有する３５×１００ｍｍペトリプレートでインキュベーションすることにより得られた物質を加えることによって、ＲＰＭＩ完全培地を調整した。インキュベーションした５日後、培地をこれらのプレートから集め、その４ｍｌを各試験ウエルに入れた。次いで、これらのウエルに１０，０００個のＲＥＮＣＡ細胞をそれぞれ接種した。
【００５７】
すべてのプレート（コントロールおよび実験の両方）を３７℃で５日間インキュベーションした。インキュベーション期間の後、細胞をトリプシン処理し、洗浄して集め、血球計を使用して計数した。結果を表４に示す：
【表４】

これらの結果は、細胞が、例えば実施例のビーズにおいて制限されたときに、腫瘍細胞増殖の抑制をもたらす何らかの物質を産生していることを示している。
【００５８】
実施例１０
上記に示される実験は、調整培地におけるＲＥＮＣＡ細胞の成長が、コントロール培地における細胞の約半分の成長であることを示していた。本実施例に示される実験により、調整培地を凍結させた後、増殖の抑制が続くかどうかを調べた。
【００５９】
ＲＥＮＣＡ調整培地を、１０個のＲＥＮＣＡ含有ビーズを５日間インキュベーションすることによって調製した。インキュベーションを、５０ｍｌのＲＰＭＩ完全培地を用いて、３５×１００ｍｍペトリプレートで、３７℃で行った。インキュベーション後、培地を集め、−２０℃で貯蔵した。調整培地を、ＭＭＴ（マウス乳ガン）細胞含有ビーズをインキュベーションすることによって調製した。ビーズは２４０，０００個／ビーズの細胞を含有した：それ以外の条件はすべて同じであった。
【００６０】
凍結培地を３７℃で融解し、次いで下記の試験で使用した。３つの６ウエルプレートを各処置に使用した。すなわち、（ｉ）ＲＰＭＩコントロール培地、（２）ＲＥＮＣＡ凍結調整培地、および（３）ＭＭＴ凍結調整培地。合計で４ｍｌの培地を各ウエルに分注した。次いで、すべてのウエルに１０，０００個のＲＥＮＣＡ細胞を接種し、３７℃で５日間インキュベーションした。インキュベーション後、２つのプレートのサンプルを各ウエルから取り、トリプシン処理し、洗浄して集め、血球計で計数した。８日目に、残る３つのプレートの各ウエルを同じように試験した。
【００６１】
結果を下記に示す：
【表５】

これらの結果を上記の実施例６の結果と比較した場合、凍結／融解したＲＥＮＣＡ調整培地は、凍結／融解したＭＭＴ調整培地が抑制するのと同じ程度に増殖を抑制していない（実施例６および７を比較のこと）が、それにもかかわらず、凍結／融解したＲＥＮＣＡ調整培地は増殖を抑制したことが認められる。
【００６２】
実施例１１
上記に示される実験は、ＲＥＮＣＡまたはＭＭＴを含有するマクロビーズから得られた凍結調整培地は、インビトロでＲＥＮＣＡ細胞の増殖を阻害することを示した。本実施例に示される実験により、ろ過によって３０ｋｄ濃縮物または５０ｋｄ濃縮物として調製されたＲＥＮＣＡマクロビーズまたはＭＭＴマクロビーズの調整培地がインビトロでＲＥＮＣＡ細胞の増殖を阻害するかどうかが調べられた。マクロビーズの調整培地の作用を、コンフルエンスにまで成長させた制限されていない腫瘍細胞もまた増殖調節物質を作るかどうかを明らかにするために、単層培養で成長する制限されていないＲＥＮＣＡ細胞およびＭＭＴ細胞の存在下での調整培地の作用と比較した。
【００６３】
この実験のために、それぞれが１２０，０００個のＲＥＮＣＡ細胞またはＭＭＴ細胞を含有する１０個のマクロビーズ（すなわち、合計で１．２×１０⁶ 個の細胞）を使用して、５日間にわたって培地（完全ＲＰＭＩ）を調整した。同時に、１．２×１０⁶ 個のＲＥＮＣＡ細胞またはＭＭＴ細胞、すなわち、同じ数の細胞を培養ディッシュに置床して、完全ＲＰＭＩ培地で４日間にわたって単層として増殖させた。その後、培地を換え、この培地を２４時間後に集めた。ビーズと制限されていない細胞との曝露時間の長さが異なる理由は、５日間の期間の最後で単層対ビーズでの細胞数が異なっていたためである（単層で細胞は３倍〜５倍多い）。すなわち、制限されていない細胞は、カプセル化された細胞よりもはるかに迅速に成長したので、３倍〜５倍多い細胞が存在した。
【００６４】
３０ｋｄおよび５０ｋｄのフィルターを使用して、活性物質を含有すると考えられ、さらに、実験での混乱因子としての毒性代謝産物および／または老廃物を除いた調整培地の濃縮物を調製した。このような混在物は、よく知られているが、非常に小さいので、３０ｋｄのフィルターで保持され得ない。ろ液もまた試験したが、この物質を用いた結果の解釈は、細胞老廃物が存在することによって複雑になる。無血清培地（ＡＩＭ Ｖ）もまた、血清自体の何らかの作用を確実に抑えるためにいくつかの実験で使用した。
【００６５】
本質的には、調整培地を、マクロビーズを培地に加えた３日後〜５日後、あるいは新しい培地を制限されていない細胞に加えた２４時間後のいずれかで集めた。次いで、培地を、適切なフィルター（３０ｋｄフィルターまたは５０ｋｄフィルターのいずれか）を有する試験管ろ過器に入れ、９０分間遠心分離した。フィルターに残った物質は「濃縮物」として示され、フィルターを通過して試験管の底に集まった物質はろ液である。
【００６６】
下記の表６、７および８にまとめられている結果は、マクロビーズ中の制限されたＲＥＮＣＡ細胞から得られた調整培地を使用したときに、この調整培地は２つの別個の実験でＲＥＮＣＡ細胞の増殖を約５２％阻害したことを示している。５０ｋｄ濃縮物は両方の場合において増殖を約９９％阻害したが、３０ｋｄ濃縮物は増殖を約９７％阻害した。
【００６７】
【表６】

【表７】

【表８】

この実験の重要な点は、ＭＭＴ細胞およびＲＥＮＣＡ細胞は、マクロビーズ中に包み込まれて制限されたとき、ともにＲＥＮＣＡ細胞の増殖を抑制していることである。このことは、増殖制限作用が腫瘍タイプに特異的でないことを示している。これらの実験により、ＭＭＴ含有マクロビーズがＲＥＮＣＡ細胞の増殖をインビボで抑制した実施例８の実験が確認される。さらに、これらの実験により、これらの発見は、マクロビーズから培地に放出された物質が、部分的には増殖制限作用を担う分子量が少なくとも３０ｋｄである分子を含有することを明らかにするために拡大される。最後に、これらの実験は、マクロビーズ中で制限されたＲＥＮＣＡ細胞およびＭＭＴ細胞は、単層培養でコンフルエンスにまで成長させた同じ細胞よりもはるかに多くの増殖抑制物質を産生することを示している。
【００６８】
実施例１２
上記に示される実験は、ＭＭＴマクロビーズおよびＲＥＮＣＡマクロビーズの調整培地が、マクロビーズ中で増殖が制限された細胞から放出され、インビボおよびインビトロでＲＥＮＣＡ細胞の増殖を阻害し得る物質を含有することを示している。重要なことに、実験は、増殖阻害作用が腫瘍タイプに特異的でないことを示している。本実施例で示される実験により、その作用もまた、腫瘍が最初に生じた種に依存していないかどうかが調べられる。本実施例において、（マクロビーズおよびマクロビーズ調整培地を使用する）ＲＥＮＣＡ細胞に対して、さらには（マクロビーズ調整培地のみを使用する）ＭＭＴ細胞に対するヒト乳ガン由来細胞株のインビトロでの腫瘍細胞増殖阻害作用を調べた。
【００６９】
これらのインビトロ研究の方法論は、上記の実施例に記載されている方法論と類似していた。１００，０００個のＭＣＦ−７細胞（ヒト乳ガン細胞）をマクロビーズにカプセル化し、得られたＭＣＦ−７マクロビーズをＲＥＮＣＡ細胞（１０，０００個／ウエル）と５日間インキュベーションして、マクロビーズの増殖阻害作用を評価した。さらに、ＭＣＦ−７マクロビーズ調整培地を５日のインキュベーション期間にわたって調製して、ＲＥＮＣＡ細胞およびＭＭＴ細胞の両方について試験した。細胞増殖を５日間にわたり測定した。
【００７０】
結果を下記に示す：
【表９】

【表１０】

【表１１】

結果は、ＭＣＦ−７（ヒト乳腺ガン細胞株）が、マクロビーズ中で増殖が制限されたとき、マクロビーズ自体およびそれから得られる調整培地の両方によって明らかにされているように、マウス腎腺ガン細胞およびマウス乳ガン腫瘍細胞の増殖を著しい程度（３０％〜７０％）に阻害する物質を産生していることを示している。このことは、成長を制限されたガン細胞の増殖阻害作用が腫瘍タイプおよび腫瘍起源の種（すなわち、マウスおよびヒト）の両方に依存していないことを示している。
【００７１】
実施例１３
上記に示されている実験は、ヒト由来の乳腺ガン細胞株（ＭＣＦ−７）が、マクロビーズ中で成長が制限されたとき、マウス腎腺ガン細胞およびマウス乳腺ガン細胞の増殖阻害をインビトロでもたらすことを示している。本実施例で示される実験により、ＲＥＮＣＡ細胞の腫瘍成長に対するＭＣＦ−７含有マクロビーズのインビボでの同様な作用が存在するかどうかが調べられる。
【００７２】
１８匹のＢａｌｂ／ｃマウスに２０，０００個のＲＥＮＣＡ細胞を腹腔内注射した。３日後、マウスを２群に分けた。群１は６匹のマウスを有し、群２は残りの１２匹のマウスを有した。群１のマウス（コントロール）にはそれぞれ３個の空マクロビーズを移植した。群２のマウスには、３個のＭＣＦ−７含有マクロビーズ（１００，０００細胞／ビーズ）をそれぞれ与えた。２５日後、群１から２匹のマウスおよび群２から３匹のマウスを屠殺した。同じ数を２６日目に屠殺し、残りのマウスを２７日目に屠殺した。
【００７３】
検死解剖した時、コントロールマウスの腹膜腔が腫瘍で完全に詰まっていることが認められ、正常な器官を同定することが困難であった。本発明者らは、これを＋＋＋＋（１００％）の腫瘍強度として分類した。処置マウスでは、腫瘍強度は＋（１０％〜２０％）と評価された。
【００７４】
これらの結果により、ヒト乳腺ガン細胞を含有するマクロビーズはマウスにおいて腎細胞腺ガンの腫瘍成長を阻害し得ることが示される。このことにより、ガン細胞増殖／腫瘍成長の阻害作用はタイプ特異的でも種特異的でもないことが再度確認される。
【００７５】
実施例１４
上記に示される実験は、マクロビーズ中で成長が制限された腫瘍の細胞増殖／腫瘍成長阻害作用は腫瘍タイプまたは種のいずれに対しても特異的でないことを明らかにしている。本実施例で示される実験により、（マクロビーズで）増殖が制限されたマウス乳腺ガン細胞が自発的な乳腫瘍およびＭＭＴ細胞の注射から生じる腫瘍の両方の成長を阻害し得るかどうかが調べられる。
【００７６】
Ｃ３Ｈマウスは、その寿命期間中での乳腫瘍の非常に大きい発生率を有している。そのような腫瘍の発生に関する危険性を有する７匹のマウスが１６月令で腫瘍を示した。このとき、７匹のマウスの内５匹に、それぞれが１００，０００個の細胞を含有する４個のＭＭＴマクロビーズを移植した。残る２匹のコントロールマウスには４個の空マクロビーズをそれぞれ与えた。２匹のコントロールマウスは大きな腫瘍が発達し、ビーズ移植後の３ヶ月以内に死亡した。処置したマウスを、ＭＭＴマクロビーズを移植した１１ヶ月後に屠殺した。回収されたマクロビーズ、器官および腫瘍を全体的および組織化学的に調べた。ＭＭＴマクロビーズのヘルノトキシリン（ｈｅｒｎｏｔｏｘｙｌｉｎ）＆エオシン染色によって生存細胞が示された。前から存在していた腫瘍はサイズが大きくなっていなかった。何らかの腫瘍が新たに発生した形跡はなかった。
【００７７】
ＭＭＴ腫瘍細胞を胸部領域に皮下注射した実験もまた行った。１４匹のＣ３Ｈマウスを２群に分けた。５匹のコントロール群マウスには３個の空マクロビーズをそれぞれ移植した。９匹の処置マウスには３個のＭＭＴ含有マクロビーズ（２４０，０００細胞）をそれぞれ与えた。移植した３週間後、１４匹のマウスのすべてに、２０，０００個のＭＭＴ細胞をそれぞれの乳腺領域に皮下注射した。
【００７８】
２５日〜３０日のうちに、５匹のコントロール群マウスは病気になり、明らかな腫瘍形成を伴っていた。すべてが注射後の３５日までに死亡した。９匹の処置マウスを毎週観察したが、この期間中、腫瘍形成または悪化した健康状態の何らかの形跡が認められない状態が続いた。腫瘍注射の１０ヶ月後〜１２ヶ月後、９匹の処置マウスの内４匹にしこりおよびパッチ状の脱毛が発生した。残る５匹のマウスには、最初の腫瘍注射を行った１３ヶ月後に、再度、３個のＭＭＴマクロビーズを移植した。１匹のマウスがこの手術の３日後に死亡したが、検死解剖した時、腫瘍は全くなかった。４匹の生存したマウスを第２回目のマクロビーズ移植の８ヶ月後に屠殺した。検死解剖により、最小の腫瘍増殖が見られるかまたは腫瘍増殖は全く見られなかった。
【００７９】
これらの実験から得られるさらなる観察は、最初の移植から回収されたビーズは、組織学と、ビーズから除いた後の組織培養での攻撃的な腫瘍成長パターンを再開し得るその能力との両方に基づいて生存腫瘍細胞を含有していることであった。
【００８０】
これらの実験の結果は、マクロビーズ中で制限されたガン細胞（この場合、マウスの乳腺ガン細胞）の細胞増殖／腫瘍成長阻害作用は、自発的に生じる腫瘍、および乳腺領域に腫瘍細胞に注射することから生じる実験的に誘導された腫瘍の両方の発達および成長に影響し得ることを示している。
【００８１】
実施例１５
上記に示される実験により、マクロビーズ中で増殖が制限されたガン細胞の腫瘍細胞増殖／腫瘍成長阻害作用は、複数の腫瘍タイプおよび種にまたがるその有効性、ならびに自発性腫瘍および人工的に誘導された腫瘍の両方におけるその有効性によって特徴づけられることが明らかにされている。本実施例に記載される実験により、このような知見は、マクロビーズに包み込まれて増殖が制限されたヒト前立腺腺ガン由来細胞（ＡＲＣａｐ１０）、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）腎腺ガン細胞（ＲＥＮＣＡ細胞）およびマウス（Ｃ３Ｈ）乳腺ガン細胞（ＭＭＴ）の、ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスにおけるＡＲＣａＰ１０腫瘍細胞の増殖およびＡＲＣａＰ１０腫瘍成長に対する作用を調べるために拡大される。
【００８２】
最初の一連の実験において、１５匹のＮｕ／Ｎｕマウスに２．５×１０⁶ 個のＡＲＣａＰ１０細胞をわき腹に皮下注射した。平均最大腫瘍直径が０．５ｃｍになった注射後１２日めに、マウスを２群に分けた。９匹には４個のＡＲＣａＰ１０マクロビーズ（１．０×１０⁵ 細胞／マクロビーズ）をそれぞれ移植し、６匹のコントロールマウスには４個の空マクロビーズをそれぞれ与えた。
【００８３】
移植した１０週間後、コントロールマウスの内５匹は、血管が分布する非常に大きな腫瘍（平均して２．５ｃｍの直径）を有していたが、１匹のマウスはわずかに小さな腫瘍（０．５ｃｍ未満）を示した。処置群においては、５匹のマウスは初期腫瘍の完全な退行を示し、すべてのマウスは、８ヶ月目に屠殺されるまで、腫瘍がないままであった。２匹のマウスは腫瘍成長を全く示さなかった。すなわち、その腫瘍は、マクロビーズが移植されたときに有していたのと同じ最大直径を有していた。２匹のマウスは、マクロビーズを移植してから拡大した腫瘍を示した。
【００８４】
４匹のＮｕ／Ｎｕマウスにおいて動物あたり３．０×１０⁶ 個のＡＲＣａＰ１０腫瘍細胞をわき腹に皮下注射した１８日後に、ＲＥＮＣＡ含有マクロビーズ（１．２×１０⁵ ）を移植した実験の結果（腫瘍容量およびサイズ（ｌ×ｗ×ｈ））を下記に示す：
【表１２】

【表１３】

別の実験において、１０匹のＮｕ／Ｎｕマウスに２．５×１０⁶ 個のＡＰＣａＰ１０細胞を注射した。６匹のマウスは注射の６４日後に腫瘍発達を示した。これらのマウスの内３匹に４個のＭＭＴマクロビーズ（２．４×１０⁵ 細胞）をそれぞれ与え、３匹には空マクロビーズを与えた。結果を下記に示す：
【表１４】

【表１５】

これらの実験の結果により、様々なタイプの腫瘍に対する増殖を制限する腫瘍成長阻害作用の種交差性、腫瘍交差性がさらに確認される。さらに、これらの実験は、増殖が制限されたガン細胞が腫瘍成長を抑制して腫瘍形成を防止し得るだけでなく、インビボでの腫瘍の実際の退行をも引き起こし得ることを明らかにしている。
【００８５】
実施例１６
上記に示される実験は、いくつかのタイプの腫瘍および種に由来する増殖が制限されたガン細胞がインビトロで同じガン細胞タイプおよび異なるガン細胞タイプの増殖を阻害して、自発性腫瘍および誘導された腫瘍の両方の形成を防げ、腫瘍の成長を妨げ、そして種およびガンタイプに依存しない作用でインビボにおいて腫瘍を退行させることを示している。本実施例に示される実験により、これらの知見が別の種（ウサギ）およびウイルスで誘発されることが知られているウサギの腫瘍（ＶＸ２）に拡大されることが記される。
【００８６】
この実験において、ニュージーランドホワイトラビット（２．５ポンド）に、０．５ｍｌのＶＸ２腫瘍スラリー（＃２６ゲージ針を通過し得ることを特徴とする）を一方の大腿部（２部位）においてそれぞれの部位に筋肉内注射した。３．５週間目に、５ｃｍ×２．５ｃｍ（ｌ×ｗ）の腫瘍が背側の大腿部に現れ、直径が３ｃｍの２つの腫瘍が腹側の大腿部に存在していた。この時点で、２１１個のマクロビーズ（１０８個のＲＥＮＣＡ細胞ビーズ、６３個のＭＭＴ細胞ビーズ、および４０個のＭＣＦ−７ヒト乳ガン細胞含有ビーズ）を腹腔内に移植した。２日以内に、背側大腿部の腫瘍は約５０％縮小した。しかし、２つの腹側の腫瘍は変化しなかった。動物をマクロビーズ移植の１０日後に屠殺した。検死解剖したとき、背側腫瘍と腹側腫瘍との間には、前者はマクロビーズ移植時の大きさよりもはるかに小さくなっていたが、２つの腹側の腫瘍は出血性で壊死性であったという点で明らかな差があった。
【００８７】
この実験によって、腫瘍成長の防止、停止およびさらには退行に関連して、様々なタイプのガン細胞の増殖を効果的に制限するという発見が別の種であるウサギにまで拡大され、知られているウイルス起源の腫瘍がガンタイプのリストに加えられ、さらに、成長阻害作用の腫瘍交差性および種交差性が裏付けられる。なぜなら、マウス腎ガン細胞含有マクロビーズ、マウス乳ガン細胞含有マクロビーズおよびヒト乳ガン細胞含有マクロビーズの組み合わせが使用されたからである。さらに、この実験により、ガンの処置に関して、ガン細胞の増殖制限の有効性のインビボ試験に、より大型の動物モデルが加えられる。
【００８８】
実施例１７
上記に示される実験によって、様々なタイプの腫瘍細胞の増殖制限は、同じタイプまたは異なるタイプの細胞のインビトロでの成長を阻害して、インビボでの様々なタイプの腫瘍の形成を妨げ、その成長を抑制し、あるいはその退行を生じさせることができることをもたらすこと、および認められる作用は腫瘍タイプおよび種に依存していないことが示される。本実施例に示される実験により、１ヶ月、６ヶ月、２年および３年の期間にわたって培養状態に維持されたアガロース−アガロースマクロビーズ中で増殖が制限されたＲＥＮＣＡガン細胞の長期間の生存性が、組織学的技術、培養技術およびインビボ技術を使用して評価された。ＭＭＴ含有マクロビーズは、６ヶ月までの期間、培養状態で維持された。さらに、移植後の２ヶ月〜８ヶ月の期間が経過した後のＢａｌｂ／ｃマウスおよびＣ３Ｈマウスからそれぞれ回収されたＲＥＮＣＡ含有マクロビーズおよびＭＭＴ含有マクロビーズを、組織学的技術および培養技術の両方によって生存腫瘍細胞について調べた。
【００８９】
これらの実験に関して、アガロース−アガロースマクロビーズを、１．２×１０⁵ 個のＲＥＮＣＡ細胞または２．４×１０⁵ 個のＭＭＴ細胞のいずれかを用いて調製した。マクロビーズを、上記の間隔で、細胞生存性および腫瘍特性について、組織学的（ヘルマトキシリン（ｈｅｒｍａｔｏｘｙｌｉｎ）＆エオシン染色）に、そして培養技術によって調べた。ＲＥＮＣＡマクロビーズの場合、細胞数は、最初の１ヶ月で約３倍〜５倍増大し、その後、６ヶ月でさらに２倍になった。１年後、細胞量は増大し続けていたが、細胞の増殖速度は低下していた。２年後、不定形の物質がビーズの中心部に現れ始めていたが、細胞量／数は増大し続けていないようであった。しかし、有糸分裂像は依然として明らかであった。３年後、多少より不定形の物質がビーズ中心部に存在しているようであったが、細胞量／数は安定していた。ＭＭＴマクロビーズは６ヶ月間だけ行ったが、細胞増殖およびビーズ外見の初期パターンはＲＥＮＣＡのパターンと類似している。
【００９０】
上記の間隔でのＲＥＮＣＡ細胞およびＭＭＴ細胞の生存性および生物学的挙動を評価するために、１０個のビーズを破砕し、完全ＲＰＭＩ培地を入れた２つ以上の２５ｃｍ² 組織培養フラスコに入れた。次いで、フラスコを細胞成長について観測した。１ヶ月目および６ヶ月目の間隔において、ビーズから回収された生存細胞の数は増大した。１年目において、破砕したビーズから成長しているＲＥＮＣＡ細胞の数は、６ヶ月目の数と類似しているようであった。２年目および３年目において、生存細胞の割合は多少少ないようであり、培養状態での３年後にはビーズ内（すなわち、その制限された状態）で達した最大数の約２０％に低下した。
【００９１】
インビボ移植の後（ＲＥＮＣＡマクロビーズの場合には１年〜４年、ＭＭＴマクロビーズの場合には８ヶ月までの期間）で回収されたＲＥＮＣＡマクロビーズおよびＭＭＴマクロビーズを評価するために、組織学的技術を今日まで利用している。細胞増殖および細胞量のパターンは、対応する期間にわたって培養状態で維持されたビーズのパターンと非常に類似している。すなわち、細胞は、ＲＥＮＣＡの場合には少なくとも４ヶ月まで、そしてＭＭＴの場合には８ヶ月まで数が増大している。
【００９２】
ＭＣＦ−７およびＡＲＣａＰ１０などの使用された他のガン細胞株の場合、マクロビーズでの生存性パターンは、ＲＥＮＣＡおよびＭＭＴの場合に観測されたパターンと類似している。
【００９３】
これらの実験によって、ガン細胞が、増殖が制限された環境において、インビトロでは３年までの期間にわたって、そしてインビボでは少なくとも８ヶ月の期間にわたって維持され得ること、およびガン細胞はこれらの期間にわたってその生存性を維持し、少なくとも１年までは細胞数を増大させることを明らかに示すことが示される。これは、ガン処置物質を生成して貯蔵し得るためだけでなく、増殖が制限された細胞が、温血動物において、実験的なガンまたは自然に発生するガンの処置を成功させるために必要と考えられる連続した長期間にわたって腫瘍成長抑制物質を産生し得るためにも重要である。
【００９４】
実施例１８
上記に示される実験は、様々なタイプのガン細胞が、増殖制限状態で、その増殖能、その腫瘍形成能、および細胞増殖を阻害して腫瘍成長を妨げ、抑制し、かつさらには退行させる物質を放出するその能力を保持しながら、（３年までの）長期間にわたって維持され得ることを示している。本実施例に示される実験により、ガン細胞含有アガロース−アガロースマクロビーズのＢａｌｂ／ｃマウスにおける長期間（１年）移植の考えられる毒性が評価される。
【００９５】
７匹のＢａｌｂ／ｃマウスに３個のＲＥＮＣＡマクロビーズ（１．２×１０⁵ 細胞／ビーズ）をそれぞれ移植した。手術直後、マウスは数日間病気（針状の毛および嗜眠状態）のようになったが、その後、再び健康になった。すべてのマウスは、少なくとも１年間にわたって外見上良好な健康状態で生存したが、１匹のマウスが老衰で死亡し、もう１匹が無関係の原因で死亡した。すべてのマウスを屠殺した。検死解剖した時、線維症、腹膜炎または腫瘍成長などの異常は全く認められなかった。観察された器官はすべて正常そうであったが、特に腸係蹄が存在する腸の漿膜表面に対するビーズの若干の癒着が認められた。腸の正常な機能または構造への妨害は全く認められなかった。
【００９６】
これらの結果は、ガン細胞含有アガロース−アガロースマクロビーズは１年の期間にわたって実験動物において十分に寛容であることを示している。これらの知見は、増殖が制限されたガン細胞のビーズが、様々なタイプのインビボでの腫瘍を含む細胞増殖の防止、抑制および退行のためにインビボで利用できることを示している。
【００９７】
前記の実施例によって、特に、迅速に増殖する細胞の増殖を抑制または制御する物質、特にガン細胞を抑制する物質を産生させるために使用できる組成物を含む本発明が説明される。このような組成物は、包み込まれた細胞の増殖を制限する構造体を形成する選択的透過性物質に包み込まれた対数期成長（迅速増殖期）の細胞を含む。細胞が制限された結果、細胞は、ガン細胞などの迅速に増殖する細胞の増殖を抑制する物質を予想されないほど多く産生する。制限された細胞は、そのような物質を、制限されていない細胞の比較可能な量よりも多く産生する。
【００９８】
本発明の構造体を作製するために使用される物質には、迅速に増殖する細胞の成長を制限し、それによって、細胞増殖／成長を抑制する物質のより多くの量を産生するように細胞を誘導する任意の生体適合性物質が含まれる。そのような構造体は、上記の抑制物質が外部の環境に拡散することができ、かつ宿主の免疫系由来の生成物または細胞が構造体に進入して、ガン細胞の拒絶を生じさせないようにすることができ、あるいはそうでなければ、その生存能を弱めて、所望する物質を産生し続けることができるような好適な細孔サイズを有する。そのような構造体を形成するために使用される物質はまた、インビトロおよびインビボの両方で生存し得る（増殖が制限されているが、生存している）細胞を、適切な栄養物の進入、細胞老廃物の除去、および生体適合性で物理化学的な構造物内環境を提供することによって、好ましくは数年までの期間にわたって維持することができる。そのような構造体を調製するために使用される物質は、好ましくは、生体内に移植されたときに寛容であり、最も好ましくは、宿主における移植の全期間について寛容である。
【００９９】
利用できる物質および物質の組み合わせの非限定的な列記には、アルギン酸塩−ポリ−（Ｌ−リシン）；アルギン酸塩−ポリ−（Ｌ−リシン）−アルギン酸塩；アルギン酸塩−ポリ−（Ｌ−リシン）−ポリエチレンイミン；キトサン−アルギン酸塩；ポリヒドロキシエチル−メタクリラート−メタクリル酸メチル；カルボニルメチルセルロース；Ｋ−カラギーナン；キトサン；アガロース−ポリエーテルスルホン−ヘキサジ−メチリンブロミド（ポリブレン）；エチルセルロース；シリカゲル；およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１００】
組成物を含む構造体は、ビーズ、球体、円筒体、カプセル、シート、あるいは対象における移植および／またはインビトロ環境での培養に好適な任意の他の形状などの多くの形態を取ることができる。構造体のサイズは、当業者には明らかであるように、その最終的な使用に依存して変化し得る。
【０１０１】
本発明の構造体は、栄養物が構造体に進入することができるように、そして増殖阻害物質ならびに細胞老廃物が構造体から流出し得るように選択的透過性である。インビボで使用される場合、構造体は、制限された細胞の拒絶を引き起こすか、そうでなければ、増殖抑制物質を産生する細胞の能力を低下させる宿主の免疫系の生成物または細胞を進入させないことが好ましい。
【０１０２】
本発明の別の局面には、ガン細胞の増殖を抑制する際に有用な組成物が含まれる。このような組成物は、上記に記載される制限された細胞を適切な培養培地で培養し、その後、得られた調整培地を回収することによって調製される。次いで、濃縮物を、例えば、３０ｋｄよりも大きな分子量または５０ｋｄよりも大きな分子量を有し、ガン細胞に対して高い抗増殖作用を有する画分を分離することによって調整培地から得ることができる。
【０１０３】
本発明は、何らかの特定のタイプの増殖性細胞に限定されない。上記に定義されている任意の迅速に増殖する細胞を本発明に従って使用することができる。そのような細胞には、新生物形成細胞、胚細胞、幹細胞、手術後または傷害などの再生期の細胞、特に、肝細胞、繊維芽細胞および上皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。ガン細胞は、１つの好ましいタイプの細胞である。使用することができるガン細胞の例示的なタイプには、腎ガン細胞、乳ガン細胞、前立腺ガン細胞、絨毛ガン細胞などが含まれる。ガン細胞は、上皮性、中皮性、内皮性または生殖細胞起源であってもよく、白血病細胞などの固形腫瘍を一般に形成しないガン細胞を含むことができる。
【０１０４】
本開示から明らかであるように、本発明のさらなる局面は、ガン、炎症、線維症および栄養膜症などの過増殖性疾患に罹っている個体を処置するための治療方法である。増殖期にある細胞の成長を、制御された様式で細胞が再生するように制御することもまた本発明の局面である。これは、例えば、ケロイドおよび瘢痕組織の生成を抑えること、腹部手術後の癒着を防止すること、およびおそらくは乾癬などの過増殖性皮膚疾患において特に有用である。治療の意味で使用される場合、下記に詳しく記載されているように、構造体中で制限される細胞のタイプは、患者に苦痛をもたらす（または、もたらし得る）細胞と同じタイプである必要はないが、そのようなタイプとすることができる。１つのそのような方法は、少なくとも１つの本発明の構造体を、対象における細胞増殖の抑制を引き起こすのに十分な量で対象に挿入することを含む。好ましくは、この方法はガンを処置するために行われ、対象はヒトである。しかし、この方法は、他の動物に、例えば、室内動物、家畜、またはガンに罹っている任意のタイプの動物などに適用することができる。
【０１０５】
本発明の組成物は、過増殖性疾患の処置における一次治療として、そして他の治療と組み合わせた補助的な処置として使用することができる。例えば、患者は、放射線療法、化学剤療法、サイトカイン、アンチセンス分子、ステロイドホルモン、遺伝子治療などの他の生物学的活性物質による処置などの知られている治療と一緒に、本明細書中に記載されている組成物および方法で処置され得る。本発明の組成物および方法はまた、例えば、再成長および転移を防止するために腫瘍を切除した後にマクロビーズを移植することによって、ガンを処置する外科的手法と一緒に使用することもできる。手術できない状態で存在するガンは、本発明の抗増殖性組成物による処置によって手術可能にすることができる。
【０１０６】
本発明の組成物はまた、ガンを発症する危険性（例えば、個々の危険因子、ガンの家族履歴、一般には、特定のタイプのガン（例えば、乳ガン）の家族履歴、および職業的な発ガン因子もしくは他の発ガン因子またはガン促進因子に対する曝露）を有する個体において予防的に使用することができる。ガンに対する予防の場合、予防有効量の本発明の構造体が、１つまたは複数の危険因子が同定されたとき、個体に投与される。
【０１０７】
上記の実施例により示されているように、抗増殖作用は、使用される増殖性細胞のタイプによって、あるいは増殖性細胞が由来する種によって限定されない。従って、例えば、第１のタイプのガン細胞を含有する構造体を、第２の異なるタイプのガンを有する対象に投与することができる。さらに、処置される種とは異なる種の増殖性細胞を、投与される構造体において使用することができる。例えば、マウスのガン細胞を本発明の構造体において制限し、次いでヒトに投与することができる。当然のことではあるが、構造体は、処置されている同じ種から得られるガン細胞を含有することができる。なおさらに、増殖性細胞は、処置される個体から採取され、包み込まれ、制限され、次いで、同じ個体に投与することができる。すなわち、患者自身のガン細胞を制限して、同じガンを抑制するために使用することができる。
【０１０８】
本発明のさらに別の局面は、本明細書中に記載されている濃縮物を治療剤として使用することである。このような濃縮物は、本明細書中に記載されているように調製され、次いで、ガンなどの過増殖性疾患の対象に投与することができ、あるいは過度な瘢痕組織が有害であるか、または単に望まれない部位に傷を有する手術後の患者などの細胞成長速度を制御することが必要な患者に投与することができる。上記の実施形態はすべて、濃縮物を調製する際に使用することができる。例えば、マウスのガン細胞を含有する構造体をインビトロで培養した後、濃縮物を調製し、次いでヒトに投与することができる。同様に、構造体は、ヒト細胞を含有することができ、そして同じ個体由来の細胞さえ含有することができる。また、上記に論じられているように、濃縮物を調製するために使用されるガン細胞のタイプは、対象者が罹っているガンと同じタイプであってもよいが、同じタイプである必要はない。従って、ネズミの乳ガン細胞を使用して、例えば、メラノーマのヒトを治療するために使用される濃縮物を調製することができる。あるいは、前立腺ガンの個体は、その前立腺ガン細胞の一部が取り出され、本発明の構造体に包み込まれ、適切な培地で培養され、次いで得られた調整培地をろ過して、濃縮物を調製することができる。本発明の構造体のインビトロ培養から得られる調整培地もまた本発明の一部であることに留意しなければならない。
【０１０９】
本発明の構造体ならびに本発明の濃縮物を作製するための方法もまた本発明の一部である。濃縮物の場合、本発明の構造体が、十分な量の抗増殖性物質を得るために十分な時間にわたって単に培養され、次いで、得られた調整培地から、例えば、３０キロダルトンまたは５０キロダルトンなどの適切なカットオフ点を有するフィルターでろ過することによって、所望する部分が分離される。
【０１１０】
本発明の他の面は、当業者には明らかであり、ここで示す必要はない。
【０１１１】
用いられている用語および表現は説明する用語として使用され、限定する用語としては使用されていない。従って、そのような用語および表現の使用において、示された特徴および記載された特徴またはその一部の何らかの均等物を除外する意図はない。従って、様々な改変が本発明の範囲内において可能であることが認識される。

Claims (21)

1. 細胞の増殖の抑制に有用な組成物であって、前立腺ガン細胞試料を生体適合性で増殖制限性の選択的透過性ビーズに包み込み、前記ビーズがアガロースまたはアテロコラーゲンとアガロースとの組み合わせから形成され、前記包み込まれた細胞の増殖を制限するのに十分な時間にわたって前記ビーズを培養培地中で培養し、ここで、前記包み込まれた細胞によって、前記細胞の増殖を抑制する細胞増殖抑制物質が産生され、少なくとも約３０ｋｄの分子量を有する物質を３０ｋｄ未満の分子量を有する物質から分離するフィルターで前記培地をろ過して、少なくとも約３０ｋｄの分子量を有する前記物質を回収することによって得られる組成物。
2. 前記包み込まれた細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記包み込まれた細胞がマウス細胞である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ビーズが約１０，０００個〜約５００，０００個の細胞を含有する、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ビーズが約３０，０００個〜約２５０，０００個の細胞を含有する、請求項１に記載の組成物。
6. 細胞増殖阻害作用を有する物質の産生を刺激する方法であって、前立腺ガン細胞がその中に包み込まれている生体適合性で増殖制限性の選択的透過性ビーズを、前記細胞が増殖抑制物質を産生するのに十分な時間にわたって培地中で培養すること、少なくとも約３０ｋｄの分子量を有する物質を、３０ｋｄ未満の分子量を有する物質から分離するフィルターで前記培地をろ過すること、および少なくとも約３０ｋｄの分子量を有する前記物質を回収することを含み、前記ビーズがアガロースまたはアテロコラーゲンとアガロースとの組み合わせから形成される、方法。
7. 前記培地が無血清である、請求項６に記載の方法。
8. 前記包み込まれた細胞がヒト細胞である、請求項６に記載の方法。
9. 前記包み込まれた細胞がマウス細胞である、請求項６に記載の方法。
10. 前記ビーズが約１０，０００個〜約５００，０００個の細胞を含有する、請求項６に記載の方法。
11. 前記ビーズが約３０，０００個〜約２５０，０００個の細胞を含有する、請求項１０に記載の方法。
12. 必要とする対象における細胞の増殖を抑制する組成物であって、前記対象における細胞増殖を抑制するのに十分な量の請求項１に記載の組成物を前記対象に投与することを含む組成物。
13. 前記包み込まれた細胞がヒト細胞でない、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記包み込まれた細胞がマウス細胞である、請求項１２に記載の組成物。
15. 前記包み込まれた細胞がヒト細胞である、請求項１２に記載の組成物。
16. 前記包み込まれた細胞が前記対象が悩まされている状態にその増殖が関連する同じタイプの細胞である、請求項１２に記載の組成物。
17. 前記包み込まれた細胞が前記ビーズが投与される対象から採取される、請求項１２に記載の組成物。
18. 前記ビーズが約１０，０００個〜約５００，０００個の細胞を含有する、請求項１２に記載の組成物。
19. 前記ビーズが約３０，０００個〜約２５０，０００個の細胞を含有する、請求項１２に記載の組成物。
20. 前記包み込まれた細胞がヒト細胞である、請求項１２に記載の組成物。
21. 前記対象がヒトである、請求項１２に記載の組成物。