JP4293971B2

JP4293971B2 - Ｆｐ−グレリン

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Publication number: JP4293971B2
Application number: JP2004302925A
Authority: JP
Inventors: エンデルレティロ; グラフマーティン; へーテルコーネリア; ジェンセンゾフマンサーナ; アルギリオスキタスエリック
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2003-10-16
Filing date: 2004-10-18
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2024-10-18
Also published as: CN1637416B; DE602004012207T2; CA2480199C; ES2300686T3; CN1637416A; DE602004012207D1; JP2005120093A; US7186798B2; US7173109B2; US20060073522A1; CA2480199A1; US20050085421A1

Description

本発明は、FP-グレリンに関する。

成長ホルモンは下垂体から分泌され、成長が可能な身体のあらゆる組織の成長を誘発する。さらに、成長ホルモンは、身体の代謝プロセスに対して以下の基本的な作用を及ぼすことが知られている：（1）身体の全細胞におけるタンパク質合成速度の上昇；（2）身体の細胞における炭水化物利用速度の低下；（3）遊離脂肪酸の動員および脂肪酸のエネルギー目的での利用の増加。成長ホルモン分泌の欠乏は小人症などのさまざまな医学的障害を引き起こす。

当技術分野では、化合物の成長ホルモン分泌促進物質としての活性を決定するための方法が知られている。例えば、エクスビボアッセイ法が非特許文献1によって記載されている（その中の図2の説明文を参照されたい）が、このアッセイ法は細胞培養物を用いる必要がある上、競合結合活性に関する指標は得られない。このため、成長ホルモン分泌促進物質の活性に役割を果たす細胞受容体の同定および特徴決定に用いられうる非放射性標識リガンドを開発することが望ましいと考えられる。同じく、化合物を成長ホルモン分泌促進活性に関して試験するためのアッセイ法に用いられうる非放射性標識リガンドがあれば望ましいと考えられる。

このような試験には通常、比放射能が高い放射性リガンドが必要である。[T]または[125I]で標識したGHRP-6由来のペプチドリガンドを用いる結合アッセイ法を開発するための従来の試みでは、大きな成果は得られていない（非特許文献2および非特許文献3参照）。一般に、このようなペプチドリガンドの結合は親和性が低い上に結合能が過度に高かった。さらに、その結合親和性はペプチドの成長ホルモン分泌活性とは相関しなかった。結合性と成長ホルモン分泌活性との間に相関がみられなかったのは、比放射能が比較的低かったこと（[T]GHRP-6の場合）および放射性リガンドの非特異的な結合特性の結果である可能性が高いと考えられた。

Smithら、Science, 260, 1640-1643（1993） R. F. Walkerら、Neuropharmacol. 989, 28, 1139 C. Y. Bowersら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991, 178, 31

本発明によって解決しようとした課題は、ハイスループットスクリーニングに用いられうる蛍光標識されたグレリン類似体を提供することである。

本発明は、式
R1-Cys-F
の標識された成長ホルモン分泌促進物質に関し、式中、R1はグレリン（ghrelin）のポリペプチド配列（配列番号:1）に由来するペプチド配列であり、Fは蛍光色素である。1つの好ましい態様において、R1は配列番号:2である。もう1つの好ましい態様において、R1はオクタノイル化(octanoylated)されている。もう1つの好ましい態様において、R1はN-オクタノイル化されている。より好ましい1つの態様において、R1は

である。N-オクタノイル化はエステラーゼ活性に対するグレリンの安定性を高める。さらにより好ましい1つの態様において、Fはテキサスレッド、テトラメチルローダミン、MR121からなる群より選択される（「New fluorescent dyes in the red region for biodiagnostics」、M. Sauerら、1995 J. Fluoresc. Vol. 5、pp 247-261、またはBODIPY-FL 4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸）。最も好ましい1つの態様において、FはMR121である。

本明細書中に前述した、標識された成長ホルモン分泌促進物質は、成長ホルモン分泌促進物質受容体と結合しうる化合物を同定するために用いられうる。また、前記標識された成長ホルモン分泌促進物質を、細胞受容体を成長ホルモン分泌促進物質受容体として同定するために用いることもできる。

本発明はまた、標識グレリンを合成するための工程であって、a）CysをC末端アミノ酸と結合させる段階；およびb）そのチオール含有グレリンを蛍光色素と反応させる段階、を含む工程も提供する。前記蛍光色素はテキサスレッド、テトラメチルローダミン、MR121からなる群より選択されることが好ましい（「New fluorescent dyes in the red region for biodiagnostics」、M. Sauerら、1995 J. Fluoresc. Vol. 5、pp 247-261、またはBODIPY-FL（4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸）。

本発明はまた、成長ホルモン分泌促進物質受容体と結合しうる化合物を同定するための方法であって、前記化合物を、成長ホルモン分泌促進物質受容体を発現する宿主と、本明細書中に前述した標識された成長ホルモン分泌促進物質の存在下で接触させる段階、またはこのような宿主からの膜調製物と接触させる段階、および、化合物が、本明細書中に前述した標識された成長ホルモン分泌促進物質と成長ホルモン分泌促進物質受容体との結合に影響を及ぼすか否かを、結合した本明細書中に前述した標識された成長ホルモン分泌促進物質の標識の蛍光を測定することによってモニタリングする段階、を含む方法にも関する。

宿主は、自然下で成長ホルモン分泌促進物質受容体を発現する、または成長ホルモン分泌促進物質受容体が一時的もしくは安定的にトランスフェクトされた、組織試料、初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。細胞のトランスフェクションの方法は当技術分野で周知である（Sambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」（1989）、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA）。

本発明に係る標識グレリンにおいては、（１）下記式の標識グレリンであることを特徴とする：
R1-Cys-F
（式中、R1はグレリンのポリペプチド配列に由来するペプチド配列であり、Fは蛍光色素である）

また、本発明に係る標識グレリンにおいては、（２）R1が配列番号:2である、上記(1)記載の標識グレリンであることを特徴とする。

また、本発明に係る標識グレリンにおいては、（３）R1がオクタノイル化されている、上記(1)記載の標識グレリンであることを特徴とする。

また、本発明に係る標識グレリンにおいては、（４）R1がN-オクタノイル化されている、上記(1)記載の標識グレリンであることを特徴とする。

また、本発明に係る標識グレリンにおいては、（５）R1が

である、上記(1)記載の標識グレリンであることを特徴とする。

また、本発明に係る標識グレリンにおいては、（６）R1が

また、本発明に係る標識グレリンにおいては、（７）FがTxR、TMR、MR121、またはBODIPY-FLからなる群より選択される、上記(1)〜(6)のいずれか一項記載の標識グレリンであることを特徴とする。

また、本発明に係る使用においては、（８）成長ホルモン分泌促進物質受容体と結合しうる化合物を同定するための、上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の標識グレリンの使用であることを特徴とする。

また、本発明に係る使用においては、（９）細胞受容体を成長ホルモン分泌促進物質受容体として同定するための、上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の標識グレリンの使用であることを特徴とする。

また、本発明に係る工程においては、（１０）標識グレリンを合成する工程であって、
a）CysをC末端アミノ酸と結合させる段階；および
b）そのチオール含有グレリンを蛍光色素と反応させる段階、
を含む工程であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１１）細胞受容体を成長ホルモン分泌促進物質受容体として同定する方法であって、成長ホルモン分泌促進物質受容体を発現することが疑われる宿主を上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の標識された成長ホルモン分泌促進物質と接触させる段階、および結合が生じたか否かを判定する段階を含む方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１２）成長ホルモン分泌促進物質受容体と結合しうる化合物を同定するための方法であって、
a）前記化合物を、成長ホルモン分泌促進物質受容体を発現する宿主から単離された膜と、アッセイ緩衝液中にて、上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の標識された成長ホルモン分泌促進物質の存在下で、接触させる段階；
b）結合していない標識された成長ホルモン分泌促進物質を除去するために前記膜を洗浄する段階；および
c）化合物が、上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の標識された成長ホルモン分泌促進物質と成長ホルモン分泌促進物質受容体との結合に影響を及ぼすか否かを、前記膜の蛍光を測定することによってモニタリングする段階、
を含む方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１３）ハイスループットスクリーニング方法である、上記(12)記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１４）アッセイ緩衝液のpHが7.2である、上記(12)または(13)記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１５）成長ホルモン分泌促進物質としての化合物の活性を同定するための方法であって、成長ホルモン分泌促進物質としての活性を有することが疑われる化合物を、成長ホルモン分泌促進物質受容体を発現する宿主と、上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の標識された成長ホルモン分泌促進物質の存在下で接触させる段階、および、成長ホルモン分泌促進物質としての活性を有することが疑われる化合物が、上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の標識された成長ホルモン分泌促進物質と成長ホルモン分泌促進物質受容体との結合に影響を及ぼすか否かをモニタリングする段階、を含む方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る化合物、または薬学的に許容されるその塩においては、（１６）上記(12)〜(15)のいずれか一項記載の方法によって同定された化合物、または薬学的に許容されるその塩であることを特徴とする。

また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１７）上記(16)記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であることを特徴とする。

また、本発明に係る標識リガンド、化合物、方法、工程、用途、および組成物においては、（１８）実質的に本明細書中に記載されるような、特に実施例に関連して記載されるような、標識リガンド、化合物、方法、工程、用途、および組成物であることを特徴とする。

本発明により、ハイスループットスクリーニングに用いられうる蛍光標識されたグレリン類似体が提供された。

前記方法はハイスループットスクリーニング方法であることが好ましい。本明細書中に前述した方法は、用いるアッセイ緩衝液のpHに対して敏感である。pHが0.2ずれると結合が50％低下する。このため、1つの好ましい態様において、前記方法に用いるアッセイ緩衝液はpH 7.2である。本発明のペプチドは表面に吸収される傾向がある。したがって、本発明の1つの好ましい態様において、プラスチック製器具は、非結合性表面を含むか、またはカゼイン溶液でブロックされたものである。本明細書で用いる「プラスチック製器具（plastic ware）」という用語は、アッセイ法のために用いるプレートのほか、本発明のペプチドを含む溶液を調製するために用いる任意の種類のチューブのことを指す。前記カゼイン溶液は1％カゼインを含むことが好ましい。より好ましくは、ブロッキングは一晩かけて行われる。最も好ましい1つの態様においては、ブロックしたプレートは使用前に緩衝液で洗浄される。

本発明はまた、細胞受容体を成長ホルモン分泌促進物質受容体として同定する方法であって、成長ホルモン分泌促進物質受容体を発現することが疑われる宿主を、本明細書中に前述した標識された成長ホルモン分泌促進物質と接触させる段階、および結合が生じたか否かを判定する段階を含む方法も提供する。

さらに、本発明は、成長ホルモン分泌促進物質としての化合物の活性を同定するための方法であって、成長ホルモン分泌促進物質としての活性を有することが疑われる化合物を、成長ホルモン分泌促進物質受容体を発現する宿主と、本明細書中に前述した標識された成長ホルモン分泌促進物質の存在下で接触させる段階、および、成長ホルモン分泌促進物質としての活性を有することが疑われる化合物が、本明細書中に前述した標識された成長ホルモン分泌促進物質と成長ホルモン分泌促進物質受容体との結合に影響を及ぼすか否かをモニタリングする段階を含む方法にも関する。

本発明はまた、本明細書中に前述した方法によって同定された化合物、または薬学的に許容されるその塩も提供する。さらに本発明は、本明細書中に前述した化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も提供する。

「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、正しい医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適していて、妥当な便益／リスク比に相応するように、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症を伴わない、化合物、材料、組成物、および／または剤形のことを指して用いられる。

本明細書で用いる「薬学的に許容される塩」とは、同定された物質（agent）の誘導体であって、親物質がその酸性塩または塩基性塩を生成させることによって改変された誘導体のことを指す。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩；その他が非制限的に含まれる。薬学的に許容される塩には、例えば無毒性の無機酸または有機酸などから生成された、親化合物の従来の無毒性塩または第四アンモニウム塩が含まれる。このような従来の無毒性塩には、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来するもの；および、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルモン酸（palmoic）、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などの有機酸から調製された塩が含まれる。

本発明の薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性の部分を含む親物質から、従来の化学的方法によって合成することができる。一般に、このような塩は、遊離酸形態または遊離塩基形態にあるこれらの化合物を、化学量論量の適した塩基または酸と、水中または有機溶媒中またはこの2つの混合液中で反応させることによって調製しうる；一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒質が好ましい。適した塩の一覧は「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第17版、Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, P.1418に記載されており、その開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。

本発明の方法によって同定された物質を、（i）カルボキシル基のエステル化、または（ii）カルボン酸によるヒドロキシル基のエステル化、または（iii）例えばリン酸塩、ピロリン酸塩もしくは硫酸塩、もしくはヘミコハク酸塩とのヒドロキシル基のエステル化、または（iv）薬学的に許容される塩の形成、または（v）薬学的に許容される複合体の形成、または（vi）薬理活性のある重合体の合成、または（vii）親水性部分の導入、または（viii）芳香環もしくは側鎖における置換基の導入／交換、置換基パターンの変更、または（ix）等配電子性部分もしくは生物学的に等価な部分の導入による改変、または（x）同族化合物の合成、または（xi）分枝側鎖の導入、または（xii）アルキル置換基の環状類似体への変換、または（xiii）ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、または（xiv）アミド、フェニルカルバメートへのN-アセチル化、または（xv）マンニッヒ塩基、イミンの合成、または（xvi）ケトンもしくはアルデヒドのシッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジンへの転換、またはそれらの組み合わせによる、（i）作用部位、活性スペクトルの変更、および／または（ii）効力の向上、および／または（iii）毒性の軽減（治療指数の向上）、および／または（iv）副作用の軽減、および／または（v）作用の発現、効果の持続時間の変更、および／または（vi）動態学的パラメーター（吸収、分布、代謝、および排泄）の変更、および／または（vii）物理化学的パラメーター（溶解性、吸湿性、色調、味、におい、安定性、状態）の変更、および／または（viii）全般的特異性、臓器／組織特異性の向上、および／または（ix）適用形態および経路の最適化、を達成するために改変すること；ならびに（b）前記改変による生成物を、薬学的に許容される担体、または芳香性もしくは香味性の組成物または生成物に対して許容される担体／希釈剤と配合すること、もできる。

任意の従来の担体材料を利用することができる。担体材料は、経腸的、経皮的、または非経口的な投与のために適した、有機性のものでも無機性のものでもよい。適した担体には、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、ワセリンなどが含まれる。さらに、製剤が別の薬学的活性物質を含んでもよい。香味物質、安定剤、乳化剤、緩衝剤といったそのほかの添加物を、一般に認められた薬剤配合の慣例に従って添加してもよい。

本発明はまた、実質的に本明細書中に前述した通り、特に以下の実施例に関連して記載される通りの、標識リガンド、化合物、方法、工程、用途、および組成物にも関する。

実施例：
実施例1：標識ペプチドの合成
実施例1.1：

の合成
「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A practical approach」（Oxford University Press 2000）pp 41-74、W.C. ChanおよびP.D. White編に記載された方法に従い、Tenta Gel S RAM樹脂（0.25mmol／g（Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Germany）を出発材料として、Pioneer（商標）ペプチド合成システムにて連続流固相合成を実施した。塩基不安定性のあるFmoc基をα-アミノの保護に用いた。側鎖は以下の保護基により保護した：-Asn（Trt）、Glu（OtBu）、Ser（tBu）、His（Trt）、Gln（Trt）、His（Trt）、Arg（Pbf）、Lys（Boc）、Cys（Trt)。Fmoc-アミノ酸（4当量）を1当量のテトラフルオロホウ酸O-(1,2-ジヒドロ-2-オキソピリド-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム（TPTU）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（ヒューニッヒ（Hunig）塩基）により活性化した。Fmocの脱保護は20％ピペリジンを含むDMFにより行った。残基^４Pheが標的配列に組み込まれた後に自動合成を中止した。Peptide Synthesizer SP650（Labortec AG）を用いてペプチド合成を半手動的に続けた。側鎖が保護されていないFmoc-^３Ser-OH（0.65g、2mmol）、TPTU（0.59g、2mmol）、ヒューニッヒ塩基（1.03ml）をペプチド樹脂に添加し、DMF溶媒（ニンヒドリン陰性）中で結合反応を1時間継続させた。側鎖ヒドロキシルのオクタノイル化は、N-メチルピロリジン溶媒中にてカプリル酸（2.0ml、12mmol）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（1.9ml、12mmol）、N,N'-ジメチルアミノピリジン（18mg、0.15mmol）を用いて行った。4時間後に反応混合物を濾過し、標準的なペプチド合成プロトコール（上記）を用いて合成を続けた。

Tenta Gel S-樹脂（2.0g）を、95％TFA、2.5％H₂O、2.5％EDT、2.5％トリイソプロピルシランからなる混合物（100ml）により5時間処理した。この反応混合物を濃縮して、ジエチルエーテルに注ぎ入れ、沈殿物を濾過によって収集した上で、凍結乾燥させて水分を除去した。粗ペプチド（0.80g）を調製用RP-HPLCにより精製した。

が得られた（0.18g、イオンスプレーMS分析（M+2H）^２＋／2＝1165.4、（M+3H）^３＋／3＝777.2）。

実施例1.1b：

の合成
(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-3-オクタノイルアミノ-プロピオン酸；Fmoc-L-Dapa(N-オクタノイル)-OH
DMF（20ml）中にカプリン酸（1.54ml、10mmol）、TPTU（2.8g、9.5mmol）、およびヒューニッヒ塩基（3.4ml、20mmol））を含むあらかじめ活性化された混合物に対して、Fmoc-L-Dapa-OH Neosysytem FA040028（3.3g、10mmol）を含むDMF溶液（10ml）を添加した。この反応混合物を1時間攪拌し、減圧下で濃縮した上で酢酸エチル中に溶解し、5％／10％KHSO_４／K_２SO_４で洗浄し、塩水に浸し、Na_２SO_４で乾燥させ、濾過した上で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサンによる結晶化：3.7g、82％；MS＝451.4（MH）⁻。

Fmoc-L-Dapa（N-オクタノイル）-OHを組み入れるペプチド合成を、Tentagel S-NH2樹脂（0.55mmol）を出発材料として、上記の通りにPioneer（商標）ペプチド合成システムにて実施し、精製ペプチド

を得た：135mg；イオンスプレーMS：（M+2H）^２＋／2＝1164.8,（M+3H）^３＋／3＝776.8）。

ペプチドとフルオロフォアとの結合
実施例1.2：

上記のチオール含有ペプチド（1.3mg）を9：1 DMSO：50mMリン酸緩衝液pH 6中に最終濃度2.5mMとして溶解した。1.2当量のTxR（テキサスレッド）-マレイミド（DMSO中に新たに調製した30mM溶液）を添加し、混合物を室温で10分間反応させた。この反応混合物をRP-HPLCにより直接精製した：0.17mg；MS分析：算出されたモノアイソトピック質量：C136H198N36O39S3＝3055.38；観測されたモノアイソトピック質量：3055.35。

実施例1.3：

TMR（テトラメチルローダミン）により誘導体化したペプチドを、実施例1.2と同じように調製した：1.7mgのペプチド出発材料から0.44mgの標識ペプチドが単離された。MS分析：算出されたモノアイソトピック質量：C127H185N35O36S＝2808.34；観測されたモノアイソトピック質量：2808.40。

実施例1.4：

MR121^*により誘導体化したペプチドを実施例1.2と同じように調製した。1.5mgの最初のペプチド材料から0.37mgの標識ペプチドが単離された。MS分析：算出されたモノアイソトピック質量：C129H196N37O35S＝2855.44；観測されたモノアイソトピック質量：2855.38。

実施例1.5：

BODIPY-FL（4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸）により誘導体化したペプチドを実施例1.2と同じように調製した：0.7mgの出発材料から0.20mgの標識ペプチドが単離された。MS分析：算出されたモノアイソトピック質量：C119H183BF2N36O34S＝2742.4；観測されたモノアイソトピック質量：2742.4。

実施例1.6：

MR121^*により誘導体化したペプチドを実施例1.2と同じように調製した：0.7mgの最初のペプチド材料から0.17mgの標識ペプチドが単離された。MS分析：算出されたモノアイソトピック質量：C129H197N36O35S＝2854.46；観測されたモノアイソトピック質量：2854.49。

^*MR-121はオキサジン蛍光色素の1つである［文献：「New fluorescent dyes in the red region for biodiagnostics」、M. Sauerら、1995 J. Fluoresc. Vol. 5, pp 247-261を参照されたい］。

実施例2：結合アッセイ法
実施例2.1：膜の調製
ヒト胎児腎臓HEK 293（EBNA）細胞を懸濁液中で増殖させ、以前に記載された方法に従ってトランスフェクションを行った（SchlaegerおよびChristensen、Cytotechnology, 30, 71-83, 1999）。細胞を500rpmで10分間遠心し、PBS-0.7mM EDTA／（4℃）で1回洗った後に、PBS-EDTA-PI（プロテアーゼ阻害剤混合物を含む）中に2ml／細胞1gとして再懸濁した。細胞をUltra Turax（グリーンレベル）により15''×3回、氷上で30''破砕した。細胞片を除去するために懸濁液をSorvall SS34ローターにより2'000rpmで20分間遠心した。上清を採取し、さらに20'000rpmで40分間遠心した。ペレットをPBS-EDTA中に再懸濁した。T-MK 0677を用いた飽和結合アッセイ法により、受容体密度は4.9pmol／mgタンパク質であることが確かめられた。

実施例2.2：FP-アッセイ法
実施例2.2.1 アッセイ法の開発
GHSR-1aを含む細胞膜をFP-緩衝液：25mM Hepes、5mM MgCl_２、1mM CaCl_２、4％PEG、0.1％BSA（第V画分）中に最終容積が0.5〜1mlとなるように希釈し、0.4mmシリンジを通過させた上で、氷上に保ちながら20パルスによる超音波処理を4回行った。MR121-標識グレリン（トレーサー）の10nM溶液、および競合物質を含むFP-緩衝液を20倍に濃縮した溶液を調製した。受容体に結合したトレーサーの偏光を測定するために、180μlの試料を3種類調製した：全結合：膜＋トレーサー、遊離リガンド：膜＋トレーサー＋競合物質、蛍光バックグラウンド：膜＋緩衝液。3×50μlの各試料を混合した後、直ちにアッセイ用プレートに移した。

実施例2.2.2 FP-グレリン競合結合アッセイ法のためのHTSプロトコール
図1は、ハイスループットスクリーニング用の384ウェルプレートに関して考えられるレイアウトを示している。

1回目のスクリーニングには、119個の試料プレートおよび1個のDMSOプレート（膜p20F1＋p22F1）を用いた。以下は、MR121を蛍光色素として用いるHTSプロトコールの代表的で非制限的な例である。本アッセイ法には、非結合性表面を有するCostar 384ウェルUVプレートを用いた。以下のアッセイ緩衝液を用いた：25mM Hepes pH 7.2、5mM MgCl_２、1mM CaCl_２、4％ポリエチレングリコール。この緩衝液にに0.1％BSA（第V画分）を毎週新たに添加した。受容体は以下の通りに用意した：膜を実施例2.1に記載した通りに単離した。最終的なアッセイ濃度は、125Iグレリン飽和結合による評価でGHSR-1a 1.4nMであった。膜貯蔵物に関する代表的な値は以下の通りである：Bmax＝6 fmol／μg；タンパク質濃度＝50μg／μl。

沈降を避けるためには膜を針に通過させ（3回／0.4mm）、強度レベル3〜4に設定した「Branson sonifier 250」で20パルス×4回（間に30秒間の休止をおく）の超音波処理を行う必要がある。超音波処理中は膜を氷上に保った。受容体の最終濃度が1.4nMとなるように膜を希釈した。

トレーサー用のグレリン(1-19)［K19MR121］は1μM DMSO貯蔵液から緩衝液中に希釈した。最終的なアッセイ濃度は0.5nMであった。このペプチドは表面に吸収される傾向があるため、希釈ペプチド溶液に用いるプラスチック製器具は、非結合表面を有するものか、または1％カゼイン溶液で一晩ブロックしたものとし、使用前に緩衝液で洗浄した。

ハイスループットスクリーニングには以下の工程を用いた：
1）1.33×膜溶液30μlをアッセイ用プレートのすべてのウェルに添加した。
2）緩衝液4.4μlを「FPBLK」／「100％対照」ウェルに移し、基準化合物溶液4.4μlを「STD」ウェルおよび「0％対照」ウェルに、蓄積用プレートからアッセイ用プレートに移した。
3）水10μl（0％DMSO）を、1μlの2mM化合物（最終濃度20μM）を含む化合物貯蔵プレートのカラム3〜24に添加した。
4）貯蔵プレートの内容物を混合した。
5）希釈した化合物4.4μlを貯蔵プレートからアッセイ用プレートに移した。
6）アッセイ用プレートの内容物を5回混合した後に24℃で30分間インキュベートした。
7）7.143×トレーサー溶液5.6μlをアッセイ用プレートに添加した。ただし、ウェルA1〜D2（図1で「FPBLK」と表記したウェル）には代わりに緩衝液5.6μlを添加した。
8）アッセイ用プレートの内容物を5回混合した。
9）各ウェル中の溶液30μlをアッセイ用プレートから読取り用プレート（Corning UV非結合性表面）に移した。
10）読取り用プレートを室温で10分間インキュベートした。
11）Zeiss plate::visionマイクロタイタープレートリーダーを用い、平行（‖）および直交（⊥）偏光の設定で、650〜695nmのMR121蛍光を読取り用プレートから読み取った（5秒間、底面に対して1mmに焦点、xyスキャン0.5mm）。

HTSアッセイ用プレートの構成を示す図である。 Zeiss-SystemによるHTS条件での競合曲線を示す図である。a）グレリン(1-19)MR121のH6935との競合；b）グレリン(1-19)MR121のヘキサレリン（hexarelin）との競合。 125I-グレリン競合アッセイ法にて評価した、蛍光類似体の親和性を示す図である。a）グレリン(1-19)MR121；b）グレリン(1-19)TMR；c）グレリン(1-19)BoFl（BIODIPY-FL）；d）グレリン(1-19)テキサスレッド。実施例2.2.1および2.2.2のプロトコールに従って評価した、蛍光類似体の偏光を示す図である。赤色（色の濃い方、左側のバー）：グレリン(1-19)MR121、青色（色の薄い方、右側のバー）：グレリン(1-19-N-oct)MR121。1）結合した全蛍光リガンドによる蛍光偏光（GHSR-1a膜の存在下）；2）遊離リガンドによる蛍光偏光（GHSR-1a膜および過剰量の競合物質の存在下）；3）緩衝液中の蛍光リガンドによる蛍光偏光。

Claims

下記式の標識グレリン：
R1-Cys-F
（式中、R1は配列番号２のグレリンのポリペプチド配列であり、CysはR1のC末端のアミノ酸に結合しており、Fは蛍光色素である）
R1がオクタノイル化されている、請求項1記載の標識グレリン。
R1がN-オクタノイル化されている、請求項1記載の標識グレリン。
R1が

である、請求項1記載の標識グレリン。
R1が

である、請求項1記載の標識グレリン。
FがTxR、TMR、MR121、またはBODIPY-FLからなる群より選択される、請求項1〜５のいずれか一項記載の標識グレリン。
成長ホルモン分泌促進物質受容体と結合しうる化合物を同定するための、請求項1〜６のいずれか一項記載の標識グレリンの使用。
細胞受容体を成長ホルモン分泌促進物質受容体として同定するための、請求項1〜６のいずれか一項記載の標識グレリンの使用。
請求項１〜６の標識グレリンを合成する工程であって、
a）Cysを配列番号：２のポリペプチドのC末端アミノ酸と結合させる段階；および
b）そのチオール含有グレリンを蛍光色素と反応させる段階、
を含む工程。
成長ホルモン分泌促進物質受容体と結合しうる化合物を同定するための方法であって、
a）該化合物を、成長ホルモン分泌促進物質受容体を発現する宿主から単離された膜と、アッセイ緩衝液中にて、請求項1〜6のいずれか一項記載の標識された成長ホルモン分泌促進物質の存在下で、接触させる段階；
b）結合していない標識された成長ホルモン分泌促進物質を除去するために該膜を洗浄する段階；および
c）化合物が、請求項1〜６のいずれか一項記載の標識された成長ホルモン分泌促進物質と成長ホルモン分泌促進物質受容体との結合に影響を及ぼすか否かを、該膜の蛍光を測定することによってモニタリングする段階、
を含む方法。
ハイスループットスクリーニング方法である、請求項10記載の方法。
アッセイ緩衝液のpHが7.2である、請求項10または11記載の方法。