JP4288337B2

JP4288337B2 - A method for differentiating sensitizing effects of hypoxic cell sensitizers and apoptotic signal-retaining agents under hypoxic conditions

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Publication number: JP4288337B2
Application number: JP2003193314A
Authority: JP
Inventors: 浩治横山; 典彦辻谷
Original assignee: Pola Pharma Inc
Current assignee: Pola Pharma Inc
Priority date: 2003-07-08
Filing date: 2003-07-08
Publication date: 2009-07-01
Anticipated expiration: 2023-07-08
Also published as: JP2005027515A

Description

【０００１】
【発明の属する技術範囲】
本発明は、低酸素性細胞放射線増感剤の増感効果の鑑別法及び低酸素条件下アポトーシス・シグナル保持剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌放射線治療における最大の課題は、放射線抵抗性の癌細胞の存在であり、かかる放射線抵抗性の癌細胞は低酸素状態の部位に存在し、放射線治療をくぐり抜けて、やがて再酸素化して再発の原因になると言われている。又、これらの細胞の放射線に対する抵抗性は、低酸素状態に於いては、放射線により誘導されたＤＮＡ損傷等の酸素による固定が起こらず、ＤＮＡ損傷をきっかけにして起こるアポトーシスが誘導されにくい為と言われている。この様な放射線抵抗性の低酸素性細胞は、２−ニトロイミダゾール誘導体を共存させることにより、その放射線抵抗性を著しく減じることが知られている。又、この時アポトーシスが起こることが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、本発明者らは、既に放射線がＤＮＡにラジカルを作り、それに２−ニトロイミダゾール誘導体が反応してＤＮＡ損傷をもたらす、あるいは固定することにより、低酸素性細胞の放射線感受性を有するようになることを見出している（非特許文献２参照）。
【０００４】
しかしながら、これらの報告に於いては、前記２−ニトロイミダゾール誘導体そのもののアポトーシス・シグナルへの作用は何ら考察されていない。又、低酸素条件とアポトーシスの関係についても、何ら考察されていない。更に、アポトーシス・シグナルと２−ニトロイミダゾール誘導体の関係について記述された報告も今のところ全く為されていない。従って、アポトーシス・シグナルの程度を指標に、２−ニトロイミダゾール誘導体などの低酸素性細胞放射線増感剤の増感効果を鑑別する試みも全く為されていない。
【０００５】
一方、低酸素性細胞放射線増感剤の増感効果を、イン・ビトロで、鑑別するには、これまでは、低酸素条件で癌細胞を培養し、放射線増感剤の存在下、及び、非存在下、種々放射線の線量を変えて照射を行い、その後培養し、コロニー形成などより癌細胞の放射線線量と生存細胞量の生存曲線を作成し、生存曲線を比較して鑑別するしか方法が無く、それは極めて煩雑で、労力のかかるものであった。又、定量性についても実験の回数を重ねなければ、なかなか安定しないのが現状であった。
【０００６】
他方、本発明者らは、低酸素条件下で照射すると、低酸素及びドラニダゾール、１−（２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシメチル）−２−ニトロイミダゾール、ミソニダゾール又はエタニダゾール等の２−ニトロイミダゾール誘導体の影響（増感作用）が見られる細胞（ＨＬ６０）と、低酸素もこれらの２−ニトロイミダゾール誘導体も全く影響が見られない細胞（ＭＯＬＴ−４）が存在し、低酸素および増感剤の影響（増感作用）が見られる細胞（ＨＬ６０）では、カスパーゼ３が活性化されるのを見出している（非特許文献３参照）。
【０００７】
【非特許文献１】
Aoki M., et al., J. Radiat. Res., 2002, 43, 161-6
【非特許文献２】
Kuwabara, M., et al., J. Radiat. Res. 43, 77-88, 2002
【非特許文献３】
Inanami, O., et al., Int. J. Radiat. Biol. 78, 267-274, 2002
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡便で、定量性に優れる、低酸素性細胞放射線増感剤の増感効果のイン・ビトロでの鑑別法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、簡便で、定量性に優れる、低酸素性細胞放射線増感剤の増感効果のイン・ビトロでの鑑別法を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、低酸素条件下における癌細胞と有酸素条件下における癌細胞について、低酸素性細胞放射線増感剤の存在下及び非存在下でのアポトーシス及び／又はアポトーシス・シグナルの程度を指標とすることにより、この様な鑑別が行えることを見出し、発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、放射線抵抗性の癌の放射線療法に使用される、低酸素性細胞放射線増感剤の増感効果の鑑別法であって、低酸素条件下における癌細胞と有酸素条件下に於ける癌細胞について、低酸素性細胞放射線増感剤の存在下及び非存在下でのアポトーシス及び／又はアポトーシス・シグナルの程度を指標とする、増感効果の鑑別法を提供するものである。
【００１１】
また、このとき、低酸素性細胞放射線増感剤として用いた２−ニトロイミダゾール誘導体が、低酸素条件下アポトーシス・シグナル保持剤として作用することも見出した。すなわち、本発明は、次の一般式（１）、
【００１２】
【化３】

【００１３】
（式中、Ｒは炭素原子間にエーテル結合又はアミド結合を有していてもよく、１〜４個の水酸基を有していてもよい総炭素数４〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル又はアルケニル基を示す）
で表される化合物を有効成分とする低酸素条件下アポトーシス・シグナル保持剤を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
（１）増感効果の鑑別法
本発明の増感効果の鑑別法は、癌放射線療法に於いて、放射線抵抗性の癌の放射線療法に使用される、低酸素性細胞放射線増感剤の増感効果の鑑別法であって、低酸素条件下における癌細胞と有酸素条件下に於ける癌細胞について、低酸素性細胞放射線増感剤の存在下及び非存在下でのアポトーシス及び／又はアポトーシス・シグナルの程度を指標とする。
【００１５】
ここで、酸素条件下放射線照射によってアポトーシスが誘導されるが、後記実施例に示すように、被放射線照射細胞を低酸素条件下に置くことにより、この様なアポトーシスは抑制される。又、前記放射線照射によって起こるアポトーシスは、放射線による傷害対象がＤＮＡであるＨＬ６０等の細胞でも誘導されるし、ＭＯＬＴ４の様な細胞膜傷害性の細胞に於いても誘導される。従って、従来の「放射線照射によるＤＮＡ損傷によってアポトーシスが誘導される」と言う認識は正しくなく、「放射線照射により誘導されるアポトーシス及び／又はアポトーシス・シグナルが、低酸素状態によって阻害される」の認識が正しいことがわかる。従って、低酸素性細胞放射線増感剤の効果は、「低酸素状態になることによって阻害される、アポトーシス及び／又はアポトーシス・シグナルの阻害を妨げ、それを保持する」効果であるといえる。本発明の増感効果の鑑別はこれに基づいて行われるものである。
【００１６】
ここで、指標となるアポトーシスの程度は、常法に従って判定すれば良く、例えば、プロピジウム・アイオダイド（ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ）による蛍光染色を行った後に、形態学的な観察を行い、クロマチン凝集の程度或いは核断片化の程度を判定することによって鑑別することが出来る。
【００１７】
また、アポトーシス・シグナルとしては、アポトーシス誘導に関連することが知られている因子、その因子をコードしたｍＲＮＡ等の核酸を指標とすることが出来、具体的には、Ｆａｓ抗原の発現量が好適に例示できる。このものは、常法に従ってウエスタンブロット、ＦａｓｍＲＮＡに特異的に結合するプライマー及びプローブを用いたＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロットにより、検出、判定することが出来る。また、カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）、更に上流に位置する活性化ストレス活性化蛋白質リン酸化酵素（Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）の発現量、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（ストレス応答ＭＡＰキナーゼ）の発現量、ストレス活性化蛋白質リン酸化酵素（ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）の発現量等も指標として用いることが出来、これらシグナルの発現の程度は、因子そのものをウエスタンブロットにより検出、判定することも出来る。
【００１８】
本発明の放射線増感効果の鑑別法は次に示す手順に従って行われる。即ち、
１）癌細胞を１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地等の細胞培養培地で、５％炭酸ガス気流下前培養する。
２）４種の条件用に分注する。即ち、（１）被験物質（低酸素性細胞放射線増感剤）存在下、有酸素条件培養用、（２）被験物質存在下低酸素条件培養用、（３）被験物質非存在下有酸素条件培養用及び（４）被験物質非存在下低酸素条件用の４種である。分注後、放射線の照射を行い、（１）と（２）に被験物質を添加する。
３）放射線照射及び被験物質添加後、（１）と（３）は有酸素条件下で後培養し、（２）と（４）は低酸素条件下で後培養する。
４）（１）〜（４）におけるアポトーシスの程度、或いは、アポトーシス・シグナルの発現の程度を計測する。（１）〜（４）を比較し、被験物質が存在しない条件で、有酸素条件下で誘導されるアポトーシスが、低酸素条件下でどの程度抑制されるかを判定するまた、被験物質の存在により前記抑制がどの程度緩和されるかを判定し、それを低酸素性細胞に対する増感効果として鑑別する。
【００１９】
ここで用いる低酸素性細胞放射線増感剤としては、前記一般式（１）で表される化合物が挙げられる。この化合物は、本発明鑑定法において、また癌放射線療法において低酸素条件下のアポトーシス・シグナル保持剤として作用する。
【００２０】
（２）本発明の低酸素条件下アポトーシス・シグナル保持剤
本発明の低酸素条件下アポトーシス・シグナル保持剤は、一般式（１）で表される化合物を有効成分とする。一般式（１）において、Ｒは、炭素原子間にエーテル結合（−Ｏ−）又はアミド結合（ＣＯＮＨ）を有していてもよく、１〜４個の水酸基を有していてもよい、総炭素数４〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル又はアルケニル基を示す。
【００２１】
この様なＲで示される基としては、例えば、２，３−ジヒドロキシメチル−１−（ヒドロキシメチル）プロピルオキシメチル基、２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシメチル基、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミノカルボニルメチル基、４−ヒドロキシ−２−ブテノキシメチル基、２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピル基等が好適に例示できる。これらの内、特に好ましい基は、２，３−ジヒドロキシメチル−１−（ヒドロキシメチル）プロピルオキシメチル基、２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシメチル基又はＮ−（２−ヒドロキシエチル）アミノカルボニルメチル基であり、化合物としてはドラニダゾール（ａ）、１−（２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシメチル）−２−ニトロイミダゾール（ｂ）、ミソニダゾール（ｃ）又はエタニダゾール（ｄ）が好ましく例示できる。
【００２２】
【化４】

【００２３】
【化５】

【００２４】
【化６】

【００２５】
【化７】

【００２６】
かかる一般式（１）で表される化合物は、何れも既知化合物であり、常法に従って製造することが出来る。例えば、ドラニダゾール（ａ）であれば、エリスリトールの４つの水酸基の内３つの水酸基をアセチル基などで保護し、しかる後にジメトキシメタンと五酸化リンを反応させて、２−メトキシメトキシ−１，３，４−トリアセトキシブタンと為し、これにルイス酸の存在下、無水酢酸を反応させ２−アセトキシメトキシ−１，３，４−トリアセトキシブタンに変換し、これと２−ニトロイミダゾールのトリメチルシリル化物をルイス酸を触媒として縮合し、脱保護することにより得られる。化合物（ｂ）であれば、５−ヒドロキシ−１，３−ジオキソランにジメトキシメタンと五酸化リンを反応させて５−メトキシメトキシ−１，３−ジオキソランと為し、これにルイス酸の存在下、無水酢酸を反応させ５−アセトキシメトキシ−１，３−ジオキソランに誘導し、しかる後、これと２−ニトロイミダゾールのトリメチルシリル化物をルイス酸を触媒として縮合し、脱保護することにより得られる。エタニダゾール（ｄ）であれば、トリメチルアミン等のアルカリ存在下、２−ニトロイミダゾールとブロモ酢酸メチルを縮合させ、しかる後モノエタノールアミンを反応させることにより製造することが出来る。
【００２７】
かくして得られた一般式（１）で表される化合物は、低酸素条件下において抑制されるＦａｓ抗原などのアポトーシス・シグナルの発現を有酸素下同様維持させる作用を有する。特に、低酸素性の条件で抑制される、放射線照射などに起因する細胞膜傷害をきっかけにして起こるＦａｓ抗原の発現を維持し、有酸素下同様にアポトーシスを誘導させる作用を有する。
【００２８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、かかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
【００２９】
＜実施例１＞
ヒト白血病細胞ＨＬ−６０とＭＯＬＴ−４細胞を用いて、酸素存在下（大気圧）でＸ線照射を行い、しかる後に有酸素条件下及び低酸素条件下に置いた際のアポトーシス発現と、それに対する本発明の低酸素条件下アポトーシス・シグナル保持剤の作用を調べた。
【００３０】
ＨＬ−６０とＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを氷冷し、酸素存在下（大気圧）にて１５Ｇｙ照射した後、予め氷中で冷却しておいた低酸素チャンバーに設置し、ドラニダゾール存在下或いは非存在下にて５％炭酸ガスを含む高純度窒素ガス（２Ｌ／ｍｉｎ）を３０分間通気して低酸素条件とした。その後直ちに、低酸素条件で３７℃にて６時間インキュベーションした。有酸素条件下の場合は、照射後、５％炭酸ガス気流下、３７℃にてインキュベートした。経時的に細胞を採取し、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色した後、蛍光顕微鏡にてＤＮＡ断片化と核濃縮を指標にアポトーシスを評価した。結果を図１に示す。
【００３１】
これより、アポトーシスの発現はＸ線照射後の低酸素条件により抑制されるが、一般式（１）に表される化合物が共存することにより、かかる抑制は緩和されることがわかる。これは、Ｘ線照射の影響がＤＮＡ傷害性である、ＨＬ６０のみならず、膜傷害性であるＭＯＬＴ−４細胞でも同様に観察された。即ち、１）放射線によるアポトーシス誘導は、ＤＮＡ傷害のみならず、膜傷害をきっかけにしても誘起される、２）放射線照射後の低酸素条件が１）のアポトーシス誘導を抑制する、３）一般式（１）の化合物が低酸素条件によるアポトーシス誘導の抑制を解除する現象が存在することがわかった。即ち、一般式（１）の化合物の存在下、非存在下に於ける、照射後の低酸素条件と有酸素条件でのアポトーシスの発現の変化を捉えることにより、一般式（１）の化合物の増感効果が鑑別できることがわかる。
【００３２】
＜実施例２＞
実施例１の結果を踏まえて、ＭＯＬＴ−４細胞を用いて、更に、Ｘ線照射後のアポトーシス・シグナル誘導と、酸素条件及びアポトーシス・シグナル保持剤の関連を調べた。
（検討１）
ＭＯＬＴ−４細胞における照射後、低酸素インキュベーションによるＸ線誘発アポトーシス誘導の抑制と、それに対するドラニダゾール処理による増強作用
【００３３】
（Ａ）ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを氷冷し、酸素存在下（大気圧）にて１５Ｇｙ照射した後、予め氷中で冷却しておいた低酸素チャンバーに設置し、５％炭酸ガスを含む高純度窒素ガス（１Ｌ／ｍｉｎ）を３０分間通気して低酸素条件とした。その後直ちに、低酸素条件で３７℃にてインキュベーションした。有酸素条件下の場合は、照射後、５％炭酸ガス気流下、３７℃にてインキュベートした。経時的に細胞を採取し、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色した後、蛍光顕微鏡にてＤＮＡ断片化と核濃縮を指標にアポトーシスを評価した。結果を図２のＡに示す。尚、図中黒丸はコントロール（非照射、有酸素条件下）、黒四角は細胞を１５Ｇｙ照射し、有酸素存在下にてインキュベートしたもの、△は細胞を１５Ｇｙ照射し、低酸素条件下（５％炭酸ガスを含有する高純度窒素）にてインキュベーションしたもののプロットを示す。
【００３４】
（Ｂ）Ａと同様に７．５Ｇｙ或いは１５ＧｙのＸ線を照射し、ドラニダゾール存在下或いは非存在下で有酸素条件或いは低酸素条件にて３７℃、６時間インキュベーションした後、細胞を採取した。細胞をＰＩで染色し、蛍光顕微鏡にてＤＮＡ断片化と核濃縮を指標にアポトーシスを評価した。結果は３例の平均と標準誤差により示した。＊はｐ＜０．０５の危険率で有意であることを示した。結果を図２のＢに示す。
【００３５】
（Ａ、Ｂの結果）
図２Ａより、照射時、初期損傷が同じでも、照射後低酸素培養をすることでアポトーシスの抑制が起きることがわかる。
【００３６】
（検討２）
増殖・サバイバルシグナルに対するＸ線照射と低酸素培養、ならびにドラニダゾールの効果
【００３７】
（Ａ）ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを氷冷し、酸素存在下（大気圧）にて１５Ｇｙ照射した後、有酸素条件下（５％炭酸ガス気流下、３７℃）にて培養した。経時的に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、リン酸化Ａｋｔ（活性型）、Ａｋｔ、リン酸化ＥＲＫ（活性型）及びＥＲＫについて、それぞれの特異抗体により検出した。この結果は図３のＡに示す。
【００３８】
（Ｂ）ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを予め氷中で冷却しておいた低酸素チャンバーに設置し、５％炭酸ガスを含む高純度窒素ガス（１Ｌ／ｍｉｎ）を３０分間通気して低酸素条件とした。その後直ちに、低酸素条件で３７℃にてインキュベーションした。経時的に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、リン酸化Ａｋｔ（活性化型）、Ａｋｔ、リン酸化ＥＲＫ（活性化型）ならびにＥＲＫについて、それぞれの特異抗体により検出した。この結果は図３のＢに示す。
【００３９】
（Ｃ）ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを氷冷し、酸素存在下（大気圧）にて１５Ｇｙ照射（或いは非照射）した後、予め氷中で冷却しておいた低酸素チャンバーに設置し、ドラニダゾール存在下或いは非存在下にて５％炭酸ガスを含む高純度窒素ガス（１Ｌ／ｍｉｎ）を３０分間通気して低酸素条件とした。その後直ちに、低酸素条件で３７℃にてインキュベーションした。有酸素条件下の場合は、１５Gｙ照射（或いは非照射）後、５％炭酸ガス気流下、３７℃にてインキュベートした。１．５時間或いは３時間インキュベート後に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、リン酸化Ａｋｔ（活性化型）、Ａｋｔ、リン酸化ＥＲＫ（活性化型）ならびにＥＲＫについて、それぞれの特異抗体により検出した。リン酸化Ａｋｔ（活性化型）及びＡｋｔについては３時間インキュベート後、リン酸化ＥＲＫ（活性化型）及びＥＲＫについては１．５時間インキュベート後について検討した。この結果は図３のＣに示す。
【００４０】
（結果）放射線（図３Ａ）ならびに低酸素（図３Ｂ）のみの処理でＡｋｔとＥＲＫ共に活性化することが示された。特にＡｋｔの活性化は放射線よりも低酸素の方が強く、持続的であった（図３Ａ、Ｂ及びＣのレーン２及び４）。また、放射線誘発Ａｋｔの活性化（図３Ｃレーン４）については低酸素条件下では更に強い活性を示し（図３Ｃレーン５）、それはドラニダゾールで影響を受けなかった（図３Ｃレーン６）。
【００４１】
（検討３）アポトーシスシグナルに対するＸ線照射と低酸素培養、ならびにドラニダゾールの効果
【００４２】
（Ａ）ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを氷冷し、酸素存在下（大気圧）にて１５Ｇｙ照射した後、有酸素条件下（５％炭酸ガス気流下、３７℃）にて培養した。経時的に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（活性型）、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、リン酸化ｐ３８（活性型）及びｐ３８について、それぞれの特異抗体により検出した。この結果は図４Ａに示す。
【００４３】
（Ｂ）ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを予め氷中で冷却しておいた低酸素チャンバーに設置し、５％炭酸ガスを含む高純度窒素ガス（１Ｌ／ｍｉｎ）を３０分間通気して低酸素条件とした。その後直ちに、低酸素条件で３７℃にてインキュベーションした。経時的に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（活性型）、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、リン酸化ｐ３８（活性型）及びｐ３８について、それぞれの特異抗体により検出した。この結果は図４Ｂに示す。
【００４４】
（Ｃ）ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを氷冷し、酸素存在下（大気圧）にて１５Ｇｙ照射（或いは非照射）した後、予め氷中で冷却しておいた低酸素チャンバーに設置し、ドラニダゾール存在下或いは非存在下にて５％炭酸ガスを含む高純度窒素ガス（１Ｌ／ｍｉｎ）を３０分間通気して低酸素条件とした。その後直ちに、低酸素条件で３７℃にてインキュベーションした。有酸素条件下の場合は、１５Gｙ照射（或いは非照射）後、５％炭酸ガス気流下、３７℃にてインキュベートした。１．５時間或いは６時間インキュベート後に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（活性型）、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、リン酸化ｐ３８（活性型）及びｐ３８について、それぞれの特異抗体により検出した。ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（活性型）及びＳＡＰＫ／ＪＮＫについては１．５時間インキュベート後、リン酸化ｐ３８（活性型）及びｐ３８については６時間インキュベート後について検討した。この結果は図４Ｃに示す。
【００４５】
（結果）放射線（図４Ａ）のみの処理でＳＡＰＫ／ＪＮＫの強い活性化が観察されたが、ｐ３８の活性化は起こさなかった。また、低酸素培養では、ＳＡＰＫ／ＪＮＫならびｐ３８の活性化は引き起こさなかった。放射線誘発ＳＡＰＫ／ＪＮＫの活性化（図４Ｃレーン４）はＸ線照射後、低酸素培養（図４Ｃレーン５）すると、その活性化は減弱し、さらに、その低酸素培養時にドラニダゾールが存在すると（図４Ｃレーン６）、酸素条件下で培養した時（図４Ｃレーン４）の活性まで増強した。このことから、ドラニダゾールの低酸素時の放射線誘発アポトーシス誘導がＳＡＰＫ／ＪＮＫを介して、増強していることが結論づけられた。
【００４６】
（検討４）Ｆａｓ発現とカスパーゼ３活性化に及ぼすＸ線照射と低酸素培養、ならびにドラニダゾールの効果
【００４７】
（Ａ）ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを氷冷し、酸素存在下（大気圧）にて１５Ｇｙ照射した後、有酸素条件下（５％炭酸ガス気流下、３７℃）にて培養した。経時的に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、Ｆａｓの特異抗体により検出した。また、細胞内標準タンパク質として特異抗体によりアクチンを検出した。この結果は図５Ａの右側パネルに示す。
【００４８】
ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを予め氷中で冷却しておいた低酸素チャンバーに設置し、５％炭酸ガスを含む高純度窒素ガス（１Ｌ／ｍｉｎ）を３０分間通気して低酸素条件とした。その後直ちに、低酸素条件で３７℃にてインキュベーションした。経時的に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、Ｆａｓの特異抗体により検出した。また、細胞内標準タンパク質として特異抗体によりアクチンを検出した。この結果は図５Ａの右側パネルに示す。
【００４９】
（Ｂ）ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを氷冷し、酸素存在下（大気圧）にて１５Ｇｙ照射（或いは非照射）した後、予め氷中で冷却しておいた低酸素チャンバーに設置し、ドラニダゾール存在下或いは非存在下にて５％炭酸ガスを含む高純度窒素ガス（１Ｌ／ｍｉｎ）を３０分間通気して低酸素条件とした。その後直ちに、低酸素条件で３７℃にてインキュベーションした。有酸素条件下の場合は、１５Gｙ照射（或いは非照射）後、５％炭酸ガス気流下、３７℃にてインキュベートした。６時間インキュベート後に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、Ｆａｓの特異抗体により検出した。また、細胞内標準タンパク質として特異抗体によりアクチンを検出した。結果は３例のブロットをデンシトメーターにかけ、その数値化した濃度の平均と標準誤差により示した。＊はｐ＜０．０５の危険率で有意であることを示した。この結果は図５Ｂに示す。
【００５０】
（Ｃ）上記Ｂと同一の条件にて細胞質抽出液を調製した。カスパーゼ３の基質としてＡｃ−ＤＥＶＤ−ＭＣＡ（Ａｃｅｔｙｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−α−（４−ｍｅｔｈｙｌ−ｃｏｕｍａｒｙ１−７−ａｍｉｄｅ））を用いて、３８０ｎｍ励起、４６０ｎｍ蛍光での蛍光分光法を用いて検討した。結果は３例の平均と標準誤差により示した。＊はｐ＜０．０５の危険率で有意であることを示した。この結果は図５Ｃに示す。
【００５１】
（結果）放射線によりＦａｓの発現が観察されたが、低酸素培養のみでは発現は観察されなかった（図５Ａ）。放射線によるＦａｓの発現は、照射後の低酸素培養で有意に抑制し（図５Ｂレーン５）、ドラニダゾール存在下での低酸素培養では、酸素存在下レベルにまでその発現が増強した（図５Ｂレーン６）。これは、放射線誘発ＭＯＬＴ−４細胞のアポトーシスがタンパク質合成依存性のＦａｓ発現とＤＩＳＣの形成、カスパーゼ８、３のカスケードで起こることを示した以前の研究と考え合わせると、放射線誘発Ｆａｓの低酸素培養による発現低下とドラニダゾールによる増強が、アポトーシスでの低酸素培養による抑制と、ドラニダゾールによる増強を説明しているものと結論づけられる。さらに、カスパーゼ３の活性化（図５Ｃ）もＦａｓの発現とパラレルであったことからも、このことを裏付けている。
【００５２】
（検討５）ＭＯＬＴ−４細胞の細胞内グルタチオン濃度に及ぼすＸ線照射、低酸素培養ならびにＸ線照射＋低酸素培養＋ドラニダゾールの影響。
【００５３】
図５Ｂと同一の条件にて細胞質抽出液を調製し、これにｍｏｍｏｃｈｌｏｂｉｍａｔｅ溶液及びグルタチオンＳトランスフェラーゼを加え、３７℃にて３０分間作用させた後、生じた蛍光物質を３８０ｎｍ励起、４６０ｎｍ蛍光での蛍光分光法により測定した。還元型グルタチオンにより標準直線を作成し、細胞内グルタチオン濃度を細胞数当たりで算出した。結果は３例の平均と標準誤差により示した。＊はｐ＜０．０５の危険率で有意であることを示した。この結果は図６に示す。
【００５４】
（結果）低酸素のみ（図６レーン２）ならびに低酸素培養＋ドラニダゾール処理（図６レーン３）では細胞内グルタチオン濃度に影響は見られなかった。Ｘ線照射（図６レーン４）ではコントロールの約半分にまで細胞内グルタチオン濃度は低下したが、照射後の低酸素培養では有意に増加した（図６レーン５）。この増加はドラニダゾール存在下で消失した（図６レーン６）。以上の結果は細胞内グルタチオンを低酸素培養ならびにドラニダゾール処理で修飾し、細胞内情報伝達機構、とりわけアポトーシスシグナルをレドックス制御している可能性が示唆された。
【００５５】
（検討６）ＭＯＬＴ−４細胞の放射誘発アポトーシスとＳＡＰＫ／ＪＮＫ活性化ならびその発現に及ぼすＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の影響
【００５６】
（Ａ）ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを氷冷し、酸素存在下（大気圧）にて７．５Ｇｙ照射（或いは非照射）した後、１５ｍＭのＮＡＣ存在下或いは非存在下で有酸素条件下（５％炭酸ガス気流下、３７℃）にて培養した。培養９時間後のアポトーシス誘導をＰＩ染色後、蛍光頼微鏡で観察し、カウントした。結果は３例の平均と標準誤差により示した。＊はｐ＜０．０５の危険率で有意であることを示した。この結果は図７Ａに示す。
【００５７】
（Ｂ）上記と同一の条件にて照射ならびＮＡＣ処理を行った。培養１．５時間後に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（活性型）、ＳＡＰＫ／ＪＮＫについて、それぞれの特異抗体により検出した。また、細胞内標準タンパク質として特異抗体によりアクチンを検出した。結果は３例のブロットをデンシトメーターにかけ、その数値化した濃度の平均と標準誤差により示した。＊はｐ＜０．０５の危険率で有意であることを示した。この結果は図７Ｂに示す。
【００５８】
（結果）放射線により誘発されたアポトーシスとＳＡＰＫ／ＪＮＫの活性化は、照射後ＮＡＣ処理することで減弱することが観察された。これは、放射線誘発ＳＡＰＫ／ＪＮＫ活性化は細胞内のチオールなどの還元物質により抑制的に制御されていることを示しており、これが放射線誘発アポトーシスのメカニズムの一部に影響を与えていることを示している。したがって、ドラニダゾールによる低酸素条件での放射線誘発アポトーシスの増感も、図６の細胞内グルタチオンの変動から類推すると、こうした細胞内グルタチオンを減少させていることが一つのメカニズムを担っている可能性が強く示唆された。
【００５９】
（検討７）Ｆａｓ発現とカスパーゼ３活性化に及ぼすＸ線照射と低酸素培養、並びに一般式（１）の化合物効果
【００６０】
ＭＯＬＴ−４細胞を播種した培養用ディッシュを氷冷し、酸素存在下（大気圧）にて１５Ｇｙ照射（或いは非照射）した後、予め氷中で冷却しておいた低酸素チャンバーに設置し、ドラニダゾール、ＲＰ１７０及びＰＲ３１３（ミソニダゾール）存在下或いは非存在下にて５％炭酸ガスを含む高純度窒素ガス（１Ｌ／ｍｉｎ）を３０分間通気して低酸素条件とした。その後直ちに、低酸素条件で３７℃にてインキュベーションした。有酸素条件下の場合は、１５Ｇｙ照射（或いは非照射）後、５％炭酸ガス気流下、３７℃にてインキュベートした。６時間インキュベート後に細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、タンパク溶液を調製した。このタンパク溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写した後、Ｆａｓの特異抗体により検出した。また、細胞内標準タンパク質として特異抗体によりアクチンを検出した。この結果は図８に示す。
【００６１】
（結果）放射線誘発Ｆａｓ発現は、照射後の低酸素培養で有意に抑制したが、ドラニダゾール、ＲＰ１７０ならびにＰＲ３１３存在下での低酸素培養では、酸素存在下で培養した場合と同程度の発現量まで増強した。このことは、今まで見てきた低酸素培養におけるドラニダゾールによる放射線誘発Ｆａｓの増強とそれに引き続くアポトーシス誘導は、この増感剤に限局した現象でなく他のイミダゾール誘導体に共通した現象であることが予想された。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便で、定量性に優れる、低酸素性細胞放射線増感剤の増感効果のイン・ビトロでの鑑別法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の結果を示す図である。（図中ＰＲはドラニダゾールを表す。）
【図２】実施例２の検討１の結果を示す図である。（図中ＤＲはドラニダゾールを表す。）
【図３】実施例２の検討２の結果を示す図である。（図中ＤＲはドラニダゾールを表す。）
【図４】実施例２の検討３の結果を示す図である。（図中ＤＲはドラニダゾールを表す。）
【図５】実施例２の検討４の結果を示す図である。（図中ＤＲはドラニダゾールを表す。）
【図６】実施例２の検討５の結果を示す図である。（図中ＤＲはドラニダゾールを表す。）
【図７】実施例２の検討６の結果を示す図である。
【図８】実施例２の検討７の結果を示す図である。（図中ＤＲはドラニダゾールを表す。）[0001]
[Technical scope to which the invention belongs]
The present invention relates to a method for distinguishing a sensitizing effect of a hypoxic cell radiosensitizer and an apoptosis signal-retaining agent under hypoxic conditions.
[0002]
[Prior art]
The biggest challenge in cancer radiotherapy is the presence of radiation-resistant cancer cells, which are present in hypoxic sites, which have passed through radiotherapy and eventually reoxygenated and relapsed. It is said to be the cause. In addition, the resistance of these cells to radiation is that, under hypoxic conditions, there is no fixation by oxygen such as DNA damage induced by radiation, and apoptosis caused by DNA damage is less likely to be induced. It is said. It is known that such a radiation resistant hypoxic cell significantly reduces the radiation resistance by coexisting a 2-nitroimidazole derivative. In addition, it has been reported that apoptosis occurs at this time (see Non-Patent Document 1).
[0003]
On the other hand, the present inventors have already made radiation sensitive to hypoxic cells by generating radicals in DNA and reacting with 2-nitroimidazole derivatives to cause DNA damage or fixation. (See Non-Patent Document 2).
[0004]
However, in these reports, the effect of the 2-nitroimidazole derivative itself on the apoptosis signal is not considered at all. Moreover, no consideration is given to the relationship between hypoxic conditions and apoptosis. Furthermore, no reports describing the relationship between apoptosis signals and 2-nitroimidazole derivatives have been made so far. Therefore, no attempt has been made to distinguish the sensitizing effect of hypoxic cell radiosensitizers such as 2-nitroimidazole derivatives using the degree of apoptosis signal as an index.
[0005]
On the other hand, in order to differentiate the sensitizing effect of the hypoxic cell radiosensitizer in vitro, until now, cancer cells were cultured under hypoxic conditions, in the presence of the radiosensitizer, and In the absence, irradiation with various radiation doses is performed, followed by culturing, creating a survival curve of the cancer cell radiation dose and the amount of surviving cells by colony formation, etc., and comparing the survival curves for differentiation None, it was extremely cumbersome and labor intensive. In addition, with regard to the quantitative property, it has been difficult to stabilize unless the number of experiments is repeated.
[0006]
On the other hand, the present inventors, when irradiated under hypoxic conditions, showed low oxygen and 2-nitroimidazole such as 1- (2-hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethoxymethyl) -2-nitroimidazole, misonidazole or etanidazole. There are cells (HL60) in which the influence (sensitization action) of the nitroimidazole derivative is observed, and cells (MOLT-4) in which neither the hypoxia nor these 2-nitroimidazole derivatives are affected. It has been found that caspase 3 is activated in cells (HL60) in which the influence (sensitization effect) of the sensitizer is observed (see Non-Patent Document 3).
[0007]
[Non-Patent Document 1]
Aoki M., et al., J. Radiat. Res., 2002, 43, 161-6
[Non-Patent Document 2]
Kuwabara, M., et al., J. Radiat. Res. 43, 77-88, 2002
[Non-Patent Document 3]
Inanami, O., et al., Int. J. Radiat. Biol. 78, 267-274, 2002
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an in vitro differentiation method for the sensitizing effect of a hypoxic cell radiosensitizer that is simple and excellent in quantitative properties.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In view of such a situation, the present inventors sought for an in vitro differentiation method for the sensitizing effect of a hypoxic cell radiosensitizer that is simple and excellent in quantitativeness, and has made extensive research efforts. As a result of the analysis, with respect to cancer cells under hypoxic conditions and cancer cells under aerobic conditions, the degree of apoptosis and / or apoptosis signal in the presence and absence of hypoxic cell radiosensitizer is used as an index. As a result, the inventors have found that such discrimination can be performed, and have completed the invention.
[0010]
That is, the present invention is a method for differentiating the sensitizing effect of a hypoxic cell radiosensitizer used in radiotherapy for radiation-resistant cancer, which comprises cancer cells under hypoxic conditions and aerobic conditions. A method for distinguishing sensitizing effects of cancer cells in cancer using the degree of apoptosis and / or apoptosis signal in the presence and absence of a hypoxic cell radiosensitizer as an index .
[0011]
Moreover, it discovered that the 2-nitroimidazole derivative used as a hypoxic cell radiosensitizer at this time acted as an apoptosis signal retention agent under hypoxic conditions. That is, the present invention provides the following general formula (1),
[0012]
[Chemical 3]

[0013]
(In the formula, R may have an ether bond or an amide bond between carbon atoms, and may have 1 to 4 hydroxyl groups, a linear or branched alkyl group having 4 to 8 carbon atoms in total. Or an alkenyl group)
The present invention provides an apoptosis / signal retention agent under hypoxic conditions comprising a compound represented by formula (1) as an active ingredient.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(1) Differentiation method of sensitization effect
The method for differentiating the sensitizing effect of the present invention is a method for differentiating the sensitizing effect of a hypoxic cell radiosensitizer used in radiotherapy of cancer with radioresistance in cancer radiotherapy, For cancer cells under hypoxic conditions and cancer cells under aerobic conditions, the degree of apoptosis and / or apoptosis signal in the presence and absence of a hypoxic cell radiosensitizer is used as an index.
[0015]
Here, apoptosis is induced by irradiation under oxygen conditions, but as shown in the examples below, such apoptosis is suppressed by placing irradiated cells under hypoxic conditions. In addition, apoptosis caused by the radiation irradiation is induced in cells such as HL60, which are DNA-induced damage targets, or in cell membrane-damaging cells such as MOLT4. Therefore, the conventional recognition that “apoptosis is induced by DNA damage caused by irradiation” is incorrect, and “apoptosis and / or apoptosis signal induced by irradiation is inhibited by hypoxia”. You can see that is correct. Therefore, it can be said that the effect of the hypoxic cell radiosensitizer is an effect of “preventing and retaining the inhibition of apoptosis and / or apoptosis signal that is inhibited by becoming hypoxic”. The discrimination of the sensitization effect of the present invention is performed based on this.
[0016]
Here, the degree of apoptosis serving as an index may be determined according to a conventional method. For example, after fluorescent staining with propidium iodide, morphological observation is performed, and the degree of chromatin aggregation or nucleus Identification can be made by determining the degree of fragmentation.
[0017]
In addition, as an apoptosis signal, a factor known to be related to apoptosis induction or a nucleic acid such as mRNA encoding the factor can be used as an index. Specifically, the expression level of Fas antigen is suitable. Can be illustrated. This can be detected and determined by Western blot, RT-PCR using a primer and a probe that specifically binds to Fas mRNA, and Northern blot according to a conventional method. In addition, caspase, expression level of activated stress-activating protein kinase (Phospho-SAPK / JNK) located further upstream, expression level of SAPK / JNK (stress-responsive MAP kinase), stress-activating protein phosphorus The expression level of oxidase (SAPK / JNK) can also be used as an indicator, and the level of expression of these signals can be detected and determined by Western blotting of the factor itself.
[0018]
The method for distinguishing the radiosensitizing effect of the present invention is performed according to the following procedure. That is,
1) Cancer cells are pre-cultured in a cell culture medium such as RPMI medium supplemented with 10% FBS in a 5% carbon dioxide gas stream.
2) Dispense for 4 conditions. That is, (1) for aerobic condition culture in the presence of a test substance (hypoxic cell radiosensitizer), (2) for low oxygen condition culture in the presence of a test substance, (3) aerobic condition in the absence of a test substance There are 4 types for culture and (4) hypoxic conditions in the absence of the test substance. After dispensing, irradiate with radiation and add the test substance to (1) and (2).
3) After irradiation and addition of the test substance, (1) and (3) are post-cultured under aerobic conditions, and (2) and (4) are post-cultured under hypoxic conditions.
4) The degree of apoptosis in (1) to (4) or the degree of expression of an apoptosis signal is measured. Compare (1) to (4) to determine how much apoptosis induced under aerobic conditions is suppressed under hypoxic conditions in the absence of the test substance. To determine how much the suppression is mitigated, and distinguish it as a sensitizing effect on hypoxic cells.
[0019]
Examples of the hypoxic cell radiosensitizer used here include compounds represented by the general formula (1). This compound acts as an apoptosis signal retention agent under hypoxic conditions in the present invention testing method and in cancer radiotherapy.
[0020]
(2) Apoptosis / signal retention agent under hypoxic conditions of the present invention
The apoptosis / signal retention agent under hypoxic conditions of the present invention comprises a compound represented by the general formula (1) as an active ingredient. In the general formula (1), R may have an ether bond (—O—) or an amide bond (CONH) between carbon atoms, and may have 1 to 4 hydroxyl groups. A linear or branched alkyl or alkenyl group having 4 to 8 carbon atoms is shown.
[0021]
Examples of such a group represented by R include 2,3-dihydroxymethyl-1- (hydroxymethyl) propyloxymethyl group, 2-hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethoxymethyl group, N- (2- Preferable examples include hydroxyethyl) aminocarbonylmethyl group, 4-hydroxy-2-butenoxymethyl group, 2-hydroxy-3-methoxypropyl group and the like. Among these, particularly preferred groups are 2,3-dihydroxymethyl-1- (hydroxymethyl) propyloxymethyl group, 2-hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethoxymethyl group or N- (2-hydroxyethyl) amino. It is a carbonylmethyl group, and the compound is preferably dranidazole (a), 1- (2-hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethoxymethyl) -2-nitroimidazole (b), misonidazole (c) or etanidazole (d). It can be illustrated.
[0022]
[Formula 4]

[0023]
[Chemical formula 5]

[0024]
[Chemical 6]

[0025]
[Chemical 7]

[0026]
Any of the compounds represented by the general formula (1) is a known compound and can be produced according to a conventional method. For example, in the case of dranidazole (a), three of the four hydroxyl groups of erythritol are protected with an acetyl group, and then dimethoxymethane and phosphorus pentoxide are reacted to give 2-methoxymethoxy-1,3,3. 4-triacetoxybutane was converted to 2-acetoxymethoxy-1,3,4-triacetoxybutane by reacting with acetic anhydride in the presence of Lewis acid, and this was trimethylsilylated with 2-nitroimidazole. It can be obtained by condensation using Lewis acid as a catalyst and deprotection. In the case of the compound (b), 5-methoxy-1,3-dioxolane is reacted with dimethoxymethane and phosphorus pentoxide to form 5-methoxymethoxy-1,3-dioxolane, and in the presence of a Lewis acid, It is obtained by reacting acetic anhydride to give 5-acetoxymethoxy-1,3-dioxolane, and then condensing this with trimethylsilylated 2-nitroimidazole using Lewis acid as a catalyst and deprotecting. Etanidazole (d) can be produced by condensing 2-nitroimidazole and methyl bromoacetate in the presence of an alkali such as trimethylamine and then reacting with monoethanolamine.
[0027]
The compound represented by the general formula (1) thus obtained has the effect of maintaining the expression of apoptosis signals such as Fas antigen that is suppressed under hypoxic conditions as well as under aerobic conditions. In particular, it has the function of maintaining the expression of Fas antigen that is triggered by radiation membrane damage caused by radiation irradiation and the like, which is suppressed under hypoxic conditions, and induces apoptosis in the same manner as in aerobic conditions.
[0028]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited to such examples.
[0029]
<Example 1>
Human leukemia cells HL-60 and MOLT-4 cells were used for X-ray irradiation in the presence of oxygen (atmospheric pressure), and then apoptotic expression when placed under aerobic and hypoxic conditions, The effect of the apoptosis / signal retention agent on hypoxic conditions of the present invention was examined.
[0030]
The culture dish seeded with HL-60 and MOLT-4 cells is ice-cooled, irradiated with 15 Gy in the presence of oxygen (atmospheric pressure), and then placed in a low-oxygen chamber that has been cooled in ice in advance, and dranidazole A high-purity nitrogen gas (2 L / min) containing 5% carbon dioxide gas was bubbled for 30 minutes in the presence or absence of low-oxygen conditions. Immediately thereafter, the mixture was incubated at 37 ° C. for 6 hours under hypoxic conditions. In the case of an aerobic condition, after the irradiation, it was incubated at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream. Cells were collected over time and stained with propidium iodide (PI), and then apoptosis was evaluated with a fluorescence microscope using DNA fragmentation and nuclear enrichment as indicators. The results are shown in FIG.
[0031]
From this, the expression of apoptosis is suppressed by hypoxic conditions after X-ray irradiation, but it can be seen that such suppression is alleviated by the coexistence of the compound represented by the general formula (1). This was similarly observed not only in HL60, in which the influence of X-ray irradiation is DNA damage, but also in MOLT-4 cells, which are membrane damage. That is, 1) induction of apoptosis by radiation is induced not only by DNA damage but also by triggering membrane damage, 2) hypoxic conditions after irradiation suppress 1) apoptosis induction, 3) general formula It has been found that there is a phenomenon in which the compound (1) cancels the suppression of apoptosis induction caused by hypoxic conditions. That is, by capturing changes in apoptosis under hypoxic conditions and aerobic conditions after irradiation in the presence or absence of the compound of the general formula (1), the compound of the general formula (1) It can be seen that the sensitizing effect can be distinguished.
[0032]
<Example 2>
Based on the results of Example 1, MOLT-4 cells were used to further examine the relationship between apoptosis signal induction after X-ray irradiation, oxygen conditions, and apoptosis signal retention agents.
(Examination 1)
Inhibition of X-ray-induced apoptosis induction by hypoxic incubation after irradiation in MOLT-4 cells and its potentiating effect by treatment with dranidazole
[0033]
(A) A culture dish seeded with MOLT-4 cells is ice-cooled, irradiated with 15 Gy in the presence of oxygen (atmospheric pressure), and then placed in a low-oxygen chamber that has been cooled in ice in advance, and 5% High-purity nitrogen gas (1 L / min) containing carbon dioxide gas was aerated for 30 minutes to achieve low oxygen conditions. Immediately thereafter, incubation was performed at 37 ° C. under hypoxic conditions. In the case of an aerobic condition, after irradiation, it was incubated at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream. Cells were collected over time and stained with propidium iodide (PI), and then apoptosis was evaluated with a fluorescence microscope using DNA fragmentation and nuclear enrichment as indicators. The results are shown in FIG. In the figure, black circles are controls (non-irradiated, aerobic conditions), black squares are cells irradiated with 15 Gy and incubated in the presence of aerobic, Δ are cells irradiated with 15 Gy, and hypoxic conditions (5 Plots of those incubated with high purity nitrogen containing% carbon dioxide).
[0034]
(B) X-rays of 7.5 Gy or 15 Gy were irradiated in the same manner as in A, and the cells were collected after incubation at 37 ° C. for 6 hours under aerobic conditions or hypoxic conditions in the presence or absence of dranidazole. The cells were stained with PI, and apoptosis was evaluated with a fluorescence microscope using DNA fragmentation and nuclear enrichment as indicators. The results are shown by the average and standard error of 3 cases. * Indicates significance at p <0.05 risk. The results are shown in FIG.
[0035]
(Results of A and B)
FIG. 2A shows that even when the initial damage is the same at the time of irradiation, suppression of apoptosis occurs by performing hypoxic culture after irradiation.
[0036]
(Examination 2)
Effects of X-ray irradiation, hypoxic culture, and dranidazole on growth and survival signals
[0037]
(A) A culture dish seeded with MOLT-4 cells is ice-cooled, irradiated with 15 Gy in the presence of oxygen (atmospheric pressure), and then cultured under aerobic conditions (5% carbon dioxide gas flow, 37 ° C.). did. Cells were collected over time, washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then phosphorylated Akt (active type), Akt, phosphorylated ERK (active type) and ERK were detected by each specific antibody. The result is shown in FIG.
[0038]
(B) The culture dish seeded with MOLT-4 cells was placed in a low-oxygen chamber that had been cooled in ice in advance, and high-purity nitrogen gas (1 L / min) containing 5% carbon dioxide was aerated for 30 minutes. And low oxygen conditions. Immediately thereafter, incubation was performed at 37 ° C. under hypoxic conditions. Cells were collected over time, washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then phosphorylated Akt (activated), Akt, phosphorylated ERK (activated) and ERK were detected by each specific antibody. The result is shown in FIG.
[0039]
(C) The culture dish seeded with MOLT-4 cells is ice-cooled, irradiated with 15 Gy in the presence of oxygen (atmospheric pressure) (or non-irradiated), and then placed in a low-oxygen chamber that has been cooled in ice in advance. It was installed, and high-purity nitrogen gas (1 L / min) containing 5% carbon dioxide gas was aerated for 30 minutes in the presence or absence of dranidazole to achieve low oxygen conditions. Immediately thereafter, incubation was performed at 37 ° C. under hypoxic conditions. In the case of an aerobic condition, the cells were incubated at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas flow after 15 Gy irradiation (or non-irradiation). After incubation for 1.5 hours or 3 hours, cells were collected, washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then phosphorylated Akt (activated), Akt, phosphorylated ERK (activated) and ERK were detected by each specific antibody. Phosphorylated Akt (activated) and Akt were examined after 3 hours of incubation, and phosphorylated ERK (activated) and ERK were examined after 1.5 hours of incubation. The result is shown in FIG.
[0040]
(Results) It was shown that both Akt and ERK were activated by treatment with only radiation (FIG. 3A) and hypoxia (FIG. 3B). In particular, Akt activation was stronger and more sustained in hypoxia than radiation (lanes 2 and 4 in FIGS. 3A, B and C). In addition, the activation of radiation-induced Akt (FIG. 3C lane 4) showed stronger activity under hypoxic conditions (FIG. 3C lane 5), and it was not affected by dranidazole (FIG. 3C lane 6).
[0041]
(Study 3) Effects of X-ray irradiation, hypoxic culture, and dranidazole on apoptosis signals
[0042]
(A) A culture dish seeded with MOLT-4 cells is ice-cooled, irradiated with 15 Gy in the presence of oxygen (atmospheric pressure), and then cultured under aerobic conditions (5% carbon dioxide gas flow, 37 ° C.). did. Cells were collected over time, washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then SAPK / JNK (active type), SAPK / JNK, phosphorylated p38 (active type) and p38 were detected with their specific antibodies. The result is shown in FIG. 4A.
[0043]
(B) The culture dish seeded with MOLT-4 cells was placed in a low-oxygen chamber that had been cooled in ice in advance, and high-purity nitrogen gas (1 L / min) containing 5% carbon dioxide was aerated for 30 minutes. And low oxygen conditions. Immediately thereafter, incubation was performed at 37 ° C. under hypoxic conditions. Cells were collected over time, washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then SAPK / JNK (active type), SAPK / JNK, phosphorylated p38 (active type) and p38 were detected with their specific antibodies. The result is shown in FIG. 4B.
[0044]
(C) The culture dish seeded with MOLT-4 cells is ice-cooled, irradiated with 15 Gy in the presence of oxygen (atmospheric pressure) (or non-irradiated), and then placed in a low-oxygen chamber that has been cooled in ice in advance. It was installed, and high-purity nitrogen gas (1 L / min) containing 5% carbon dioxide gas was aerated for 30 minutes in the presence or absence of dranidazole to achieve low oxygen conditions. Immediately thereafter, incubation was performed at 37 ° C. under hypoxic conditions. In the case of an aerobic condition, the cells were incubated at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas flow after 15 Gy irradiation (or non-irradiation). After incubation for 1.5 hours or 6 hours, cells were collected, washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then SAPK / JNK (active type), SAPK / JNK, phosphorylated p38 (active type) and p38 were detected with their specific antibodies. SAPK / JNK (active form) and SAPK / JNK were examined after 1.5 hours of incubation, and phosphorylated p38 (active form) and p38 were examined after 6 hours of incubation. The result is shown in FIG. 4C.
[0045]
(Results) Strong activation of SAPK / JNK was observed by treatment with radiation (FIG. 4A) alone, but activation of p38 did not occur. In addition, hypoxic culture did not cause SAPK / JNK and p38 activation. The activation of radiation-induced SAPK / JNK (FIG. 4C lane 4) is attenuated in the hypoxic culture (FIG. 4C lane 5) after X-ray irradiation, and further, if dranidazole is present during the hypoxic culture (FIG. 4C lane 4). FIG. 4C lane 6) was enhanced to the activity when cultured under oxygen conditions (FIG. 4C lane 4). From this, it was concluded that the radiation-induced apoptosis induction of dranidazole during hypoxia is enhanced via SAPK / JNK.
[0046]
(Study 4) Effects of X-ray irradiation, hypoxic culture, and dranidazole on Fas expression and caspase 3 activation
[0047]
(A) A culture dish seeded with MOLT-4 cells is ice-cooled, irradiated with 15 Gy in the presence of oxygen (atmospheric pressure), and then cultured under aerobic conditions (5% carbon dioxide gas flow, 37 ° C.). did. Cells were collected over time, washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then detected with a Fas specific antibody. In addition, actin was detected with a specific antibody as an intracellular standard protein. The result is shown in the right panel of FIG. 5A.
[0048]
The culture dish seeded with MOLT-4 cells was placed in a low-oxygen chamber that had been cooled in ice in advance, and high-purity nitrogen gas (1 L / min) containing 5% carbon dioxide gas was aerated for 30 minutes to reduce hypoxia. Condition. Immediately thereafter, incubation was performed at 37 ° C. under hypoxic conditions. Cells were collected over time, washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then detected with a Fas specific antibody. In addition, actin was detected with a specific antibody as an intracellular standard protein. The result is shown in the right panel of FIG. 5A.
[0049]
(B) The culture dish seeded with MOLT-4 cells is ice-cooled, irradiated with 15 Gy in the presence of oxygen (atmospheric pressure) (or non-irradiated), and then placed in a low-oxygen chamber that has been cooled in ice in advance. It was installed, and high-purity nitrogen gas (1 L / min) containing 5% carbon dioxide gas was aerated for 30 minutes in the presence or absence of dranidazole to achieve low oxygen conditions. Immediately thereafter, incubation was performed at 37 ° C. under hypoxic conditions. In the case of an aerobic condition, the cells were incubated at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas flow after 15 Gy irradiation (or non-irradiation). After incubation for 6 hours, the cells were collected, washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then detected with a Fas specific antibody. In addition, actin was detected with a specific antibody as an intracellular standard protein. The results were expressed by means of a densitometer on three blots and the average of the quantified concentration and the standard error. * Indicates significance at p <0.05 risk. The result is shown in FIG. 5B.
[0050]
(C) A cytoplasmic extract was prepared under the same conditions as in B above. Using Ac-DEVD-MCA (Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-α- (4-methyl-coma1-7-amide)) as a substrate for caspase-3, fluorescence spectroscopy with 380 nm excitation and 460 nm fluorescence was performed. We examined using. The results are shown by the average and standard error of 3 cases. * Indicates significance at p <0.05 risk. The result is shown in FIG. 5C.
[0051]
(Results) Fas expression was observed by radiation, but expression was not observed only in the hypoxic culture (FIG. 5A). The expression of Fas by radiation was significantly suppressed in the hypoxic culture after irradiation (FIG. 5B lane 5), and in the hypoxic culture in the presence of danidazole, the expression was enhanced to the level in the presence of oxygen (FIG. 5B lane). 6). This, combined with previous studies showing that apoptosis in radiation-induced MOLT-4 cells occurs in a cascade of protein synthesis-dependent Fas expression and DISC formation, caspases 8,3, hypoxia in radiation-induced Fas It can be concluded that the decreased expression by culture and the enhancement by dranidazole explain the suppression by hypoxic culture in apoptosis and the enhancement by dranidazole. Furthermore, the activation of caspase 3 (FIG. 5C) was parallel to Fas expression, confirming this.
[0052]
(Study 5) Effects of X-ray irradiation, hypoxic culture and X-ray irradiation + hypoxic culture + Dranidazole on intracellular glutathione concentration of MOLT-4 cells.
[0053]
A cytoplasmic extract is prepared under the same conditions as in FIG. 5B, and a momloblobite solution and glutathione S-transferase are added thereto and allowed to act at 37 ° C. for 30 minutes, and then the resulting fluorescent substance is excited at 380 nm and fluorescent with 460 nm fluorescence. Measured by spectroscopy. A standard straight line was prepared using reduced glutathione, and the intracellular glutathione concentration was calculated per number of cells. The results are shown by the average and standard error of 3 cases. * Indicates significance at p <0.05 risk. The result is shown in FIG.
[0054]
(Results) Hypoxia alone (FIG. 6 lane 2) and hypoxic culture + Dranidazole treatment (FIG. 6 lane 3) had no effect on intracellular glutathione concentration. X-ray irradiation (FIG. 6, lane 4) decreased the intracellular glutathione concentration to about half of the control, but significantly increased in hypoxic culture after irradiation (lane 6 in FIG. 6). This increase disappeared in the presence of dranidazole (FIG. 6, lane 6). These results suggest that intracellular glutathione may be modified by hypoxic culture and treatment with dranidazole to redox-control intracellular signal transduction mechanisms, especially apoptotic signals.
[0055]
(Study 6) Effect of N-acetylcysteine (NAC) on radiation-induced apoptosis and SAPK / JNK activation and its expression in MOLT-4 cells
[0056]
(A) A culture dish seeded with MOLT-4 cells is ice-cooled, irradiated with 7.5 Gy (or non-irradiated) in the presence of oxygen (atmospheric pressure), and then present in the presence or absence of 15 mM NAC. The cells were cultured under oxygen conditions (5% carbon dioxide gas flow, 37 ° C.). Apoptosis induction after 9 hours of culture was observed with a fluorescent microscope after PI staining and counted. The results are shown by the average and standard error of 3 cases. * Indicates significance at p <0.05 risk. The result is shown in FIG. 7A.
[0057]
(B) Irradiation and NAC treatment were performed under the same conditions as above. After 1.5 hours of culture, cells were collected and washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then SAPK / JNK (active type) and SAPK / JNK were detected by their specific antibodies. In addition, actin was detected with a specific antibody as an intracellular standard protein. The results were expressed by means of a densitometer on three blots and the average of the quantified concentration and the standard error. * Indicates significance at p <0.05 risk. The result is shown in FIG. 7B.
[0058]
(Results) It was observed that radiation-induced apoptosis and SAPK / JNK activation were attenuated by NAC treatment after irradiation. This indicates that radiation-induced SAPK / JNK activation is repressively regulated by reducing substances such as intracellular thiols, which affects part of the mechanism of radiation-induced apoptosis. Show. Therefore, the sensitization of radiation-induced apoptosis under hypoxic conditions by dranidazole may be one mechanism that the decrease in intracellular glutathione is analogized from the fluctuation of intracellular glutathione in FIG. It was strongly suggested.
[0059]
(Study 7) X-ray irradiation and hypoxic culture on Fas expression and caspase 3 activation, and compound effect of general formula (1)
[0060]
The culture dish seeded with MOLT-4 cells was ice-cooled, irradiated with 15 Gy in the presence of oxygen (atmospheric pressure) (or non-irradiated), and then placed in a low-oxygen chamber that had been cooled in ice in advance. High-purity nitrogen gas (1 L / min) containing 5% carbon dioxide gas was aerated for 30 minutes in the presence or absence of dranidazole, RP170, and PR313 (misonidazole) to achieve low oxygen conditions. Immediately thereafter, incubation was performed at 37 ° C. under hypoxic conditions. In the case of an aerobic condition, it was incubated at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream after irradiation (or non-irradiation) with 15 Gy. After incubation for 6 hours, the cells were collected, washed with PBS, and a protein solution was prepared. This protein solution was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, and then detected with a Fas specific antibody. In addition, actin was detected with a specific antibody as an intracellular standard protein. The result is shown in FIG.
[0061]
(Results) Radiation-induced Fas expression was significantly suppressed in hypoxic culture after irradiation, but in hypoxic culture in the presence of dranidazole, RP170 and PR313, up to the same level of expression as when cultured in the presence of oxygen Enhanced. This suggests that the enhancement of radiation-induced Fas by dranidazole and the subsequent induction of apoptosis in hypoxic cultures observed so far is not a phenomenon limited to this sensitizer but a phenomenon common to other imidazole derivatives. It was done.
[0062]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to provide an in vitro differentiation method for the sensitizing effect of a hypoxic cell radiosensitizer that is simple and excellent in quantitative properties.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of Example 1. FIG. (In the figure, PR represents dranidazole.)
FIG. 2 is a diagram showing the results of Study 1 of Example 2. FIG. (DR in the figure represents dranidazole.)
3 is a diagram showing the results of Study 2 of Example 2. FIG. (DR in the figure represents dranidazole.)
4 is a diagram showing the results of Study 3 in Example 2. FIG. (DR in the figure represents dranidazole.)
5 is a diagram showing the results of Study 4 in Example 2. FIG. (DR in the figure represents dranidazole.)
6 is a diagram showing the results of Study 5 of Example 2. FIG. (DR in the figure represents dranidazole.)
7 is a diagram showing the results of Study 6 of Example 2. FIG.
8 is a diagram showing the results of Study 7 of Example 2. FIG. (DR in the figure represents dranidazole.)

Claims

A method for differentiating the sensitizing effect of a hypoxic cell radiosensitizer used for radiotherapy of radiation resistant cancer,
(A) After irradiation of cancer cells whose damage target by irradiation is DNA or cell membrane, (1) aerobic condition in the presence of test substance, (2) hypoxic condition in the presence of test substance, (3) test Culturing under aerobic conditions in the absence of the substance, and (4) hypoxic conditions in the absence of the test substance,
(B) measuring the degree of apoptosis or apoptosis signal in the above (1) to (4);
(C) Determine the degree of suppression of apoptosis or apoptosis signal induced in the condition (3) under the condition (4) to determine how much the condition (2) mitigates, and test it The process of identifying substances as sensitizing effects on hypoxic cells
Including sensitizing effects.

The degree of apoptosis signal is selected from the expression level of Fas antigen, the expression level of activated stress-activating protein kinase (Phospho-SAPK / JNK), and the expression level of stress-activating protein kinase (SAPK / JNK) The differentiation method of the sensitization effect of Claim 1 which is 1 type, or 2 or more types.

Hypoxic cell radiosensitizer is represented by the following general formula (1)

(In the formula, R may have an ether bond or an amide bond between carbon atoms, and may have 1 to 4 hydroxyl groups, a linear or branched alkyl group having 4 to 8 carbon atoms in total. Or an alkenyl group)
The method for differentiating a sensitizing effect according to claim 1 or 2, wherein the compound is represented by the formula:

The method for distinguishing sensitizing effects according to claim 1, wherein the cancer cells are HL-60 or MOLT-4.