JP4285775B2 - O ▲ Up 2 ▼ -Arylation or O ▲ Up 2 ▼ -Glycosylated 1-Substituted Diazene-1-ium-1,2-diolates and O ▲ Up 2 ▼ -Substituted 1-[(2-carboxylato) pyrrolidine -1-yl] diazene-1-ium-1,2-diolates - Google Patents

Description

［式中、Ｎ₂Ｏ₂ ^-基のＯ²−酸素は官能基Ｒ³に結合している。］
を有するジアゼニウムジオレート類を開示している。Ｒ³基がＯ²−酸素から開裂する時、ＮＯは自発的に放出され得る。
Keeferら（’997）は、（i）Ｒ¹およびＲ²は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ピロリジニル、ピペラジノまたは他の複素環基を形成し得る、（ii）Ｒ³は、オレフィン性であってもおよび／またはヒドロキシ、ハロ、アシルオキシまたはアルコキシで置換されていてもよいＣ_1-12直鎖もしくはＣ_3-12分岐鎖アルキル、Ｃ_1-12無置換／置換アシル、スルホニル、カルボキサミド、スルフィニル、スルフェニル、カルボネート誘導基またはカルバメート誘導基であり、かつ（iii）ピロリジニル基は、構造：

［式中、ｗ＝４、かつＲ⁴＝水素、Ｃ_1-8直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、または置換もしくは無置換アリールである。］を有し得ることを開示しているが、Keeferら（’997）は、Ｒ³がアリールもしくは置換アリールであること、およびピロリジノ基が２位で置換もしくは無置換カルボキシル基で置換され得ること、を開示していない（米国特許第5,632,981号の実施例１も参照）。同様に、Keeferら（’997）は、ジアゼニウムジオレート類のＯ²−グリコシル化を開示していない。
これまで、ジアゼニウムジオレート類のＯ²−アリール置換体があり得ることは知られていなかった。さらに、以前から開示されていたジアゼニウムジオレート類の化学的研究は、それらが、低いｐＨと同様に高いｐＨにおいても、一般に少なくとも安定であること、および特定の他類の「ニトロ血管拡張」薬とは違って、それらのＮＯ放出速度は、求核性チオールの存在に影響されないことという結果を導いた。
従って、現在入手できる他のジアゼニウムジオレート類に対して利点を与えるような類のジアゼニウムジオレート類の必要性がある。この点について、Ｏ²−アリール置換ジアゼニウムジオレート類は、アルカリ条件下または求核性攻撃後に自発的にＮＯを放出し得る点で有利である。Ｏ²−アリール置換ジアゼニウムジオレート類はまた、酸化性または求電子性の活性化と求核性攻撃の組み合わせの後にも自発的にＮＯを放出し得る。
従って、本発明の主な目的は、ＮＯの自発的な放出からジアゼニウムジオレートを保護するために、Ｎ₂Ｏ₂ ^-基のＯ²−酸素がアリールまたは置換アリール基で誘導される、一酸化窒素／求核剤付加物を提供することである。本発明の別の目的は、中性または酸性溶液下では一酸化窒素の放出に抵抗するが、求核性攻撃時またはｐＨ増加時にＮＯを放出する、新規な類のジアゼニウムジオレート類を提供することである。本発明のさらに別の目的は、Ｏ²−グリコシル化１−置換ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート類およびＯ²−置換１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート類を提供することである。さらに本発明の目的は、そのような化合物を含有する組成物（新規なターゲティング部分を含む一酸化窒素／求核剤付加物を含有する組成物を含む）を提供することである。関連の目的は、ＮＯ放出をターゲティングするのにより大きい柔軟性および特異性を与える生物学的組織ターゲティング戦略に従う、Ｏ²−アリール置換ジアゼニウムジオレート類を提供することである。さらに本発明の目的は、そのような化合物の使用方法を提供することである。本発明のこれらおよび他の目的、並びに付加的な発明の特徴は、以下に与えられる本発明の記述から明らかだろう。
発明の要旨
本発明は、式：

［式中、Ｘは無機基または有機基であり、かつＱはアリール基である。］
により説明される、Ｏ²−アリール置換ジアゼニウムジオレート（即ち、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート）を提供する。この新規な類の化合物において、アリール基Ｑの原子はＮ₂Ｏ₂ ^-官能基のＯ²−酸素に結合している。式（I）のジアゼニウムジオレート類は、中性から酸性の溶液中で一酸化窒素の加水分解性の発生の点で安定である。意外にも、これらの新規化合物、またはこれらの化合物の酸化性または求電子性の活性化後に生じた生成物は、アリール基がジアゼニウムジオレート残基から分離する塩基性もしくは求核性環境下で、一酸化窒素を発生し得ることが証明された。
本発明はまた、Ｏ²−グリコシル化１−置換ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート類およびＯ²−置換１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート類も提供し、これらは、共に式：

［式中、ＸおよびＲは、ここで定義したように有機基および／または無機基であるが、Ｏ²−グリコシル化１−置換ジアゼニウムジオレート類の場合、Ｒは糖でなければならない。］で示され得る。
さらに、Ｏ²−グリコシル化１−置換ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート類に関して、基Ｘは、どの有機基または無機基であってもよい。好ましくは、Ｘは、炭素および水素とは異なる原子を含み、かつ炭素とは異なる原子を介してジアゼニウムジオレートの窒素に結合している。最も好ましくは、Ｘはアミノ基であり、かつ窒素原子を介してジアゼニウムジオレートの窒素に結合している。
Ｏ²−置換１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート類に関して、式IaのＸは

であってもよく、その［１−（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼニウムジオレート類は、以下の式によって示される。：

［式中、Ｒ²²は、水素、ヒドロキシ、ＯＭ（式中、Ｍはカチオンである。）、ハロまたはＸ¹Ｒ²³Ｒ²⁴（式中、Ｘ¹は酸素、窒素または硫黄であり、かつＲ²³およびＲ²⁴は、独立して置換もしくは無置換Ｃ_1-24アルキル、置換もしくは無置換Ｃ_3-24シクロアルキル、置換もしくは無置換Ｃ_2-24オレフィン基、置換もしくは無置換アリール（例えば、アクリジン、アントラセン、ベンゼン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾピラゾール、ベンゾチアゾール、カルバゾール、クロロフィル、シンノリン、フラン、イミダゾール、インドール、イソベンゾフラン、イソインドール、イソオキサゾール、イソチアゾール、イソキノリン、ナフタレン、オキサゾール、フェナントレン、フェナントリジン、フェノチアジン、フェノキサジン、フタルイミド、フタラジン、フタロシアニン、ポルフィン、プテリジン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロコリン、ピロール、キノリジニウムイオン、キノリン、キノキサリン、キナゾリン、シドノン、テトラゾール、チアゾール、チオフェン、チロキシン、トリアジンおよびトリアゾール）、または複素環基（例えばグリコシル等）であり、Ｘ¹がＯまたはＳの時、Ｒ²⁴は存在しない。）である。］。あるいは、Ｘ¹が窒素の時、Ｒ²³およびＲ²⁴は、Ｘ¹と一緒になって複素環、例えば、

［式中、ＡはＮ、ＯまたはＳであり、ｗは１−１２であり、ｙは１または２であり、ｚは１−５であり、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ²⁵およびＲ²⁶は、水素、Ｃ_1-8直鎖アルキル、Ｃ_3-8分岐鎖アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキルまたはアリールである。］からなる群より選択される複素環を形成する。上記のＲ²³およびＲ²⁴基は、無置換または適当に置換されてもよい。例えば、Ｒ²³およびＲ²⁴基は、アシルオキシ、アシルチオ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、メルカプト、ハロ、アミド、スルホニル、スルホキシ、スルフェニル、ホスホノ、ホスファト等で適当に置換されてもよい。
さらに、Ｏ²−置換１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート類に関して、式Iaの基Ｒは、どの有機基または無機基であってもよく、これは、示されるように、ジアゼニウムジオレートの末端酸素に共有結合するが、水素とは異なり、かつ置換もしくは無置換Ｃ_1-12直鎖もしくはＣ_3-12分岐鎖アルキル、置換もしくは無置換Ｃ_2-12直鎖もしくはＣ_3-12分岐鎖オレフィン基、置換もしくは無置換Ｃ_1-12アシル、スルホニル、カルボキサミド、グリコシル基、アリール基、または式−（ＣＨ₂）_n−ＯＮ＝Ｎ（Ｏ）ＮＲ²⁸Ｒ²⁹（式中、ｎは２−８の整数であり、かつＲ²⁸およびＲ²⁹は、独立してＣ_1-12直鎖アルキル、Ｃ_3-12分岐鎖アルキル、Ｃ_2-12直鎖もしくはＣ_3-12分岐鎖オレフィン基であるか、あるいはＲ²⁸およびＲ²⁹は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、複素環基、好ましくはピロリジノ、ピペリジノ、ピペラジノまたはモルホリノ基を形成する。）の基である。上記のＲ基は、無置換でもまたは置換されてもよい。好ましい置換として、ヒドロキシ、ハロ、アシルオキシ、アルコキシ、アシルチオまたはベンジルによる置換が挙げられる。
別の観点から、本発明は、本発明のジアゼニウムジオレートを含有する、医薬組成物を含む組成物を包含する。医薬組成物は、好ましくは、医薬上許容され得る担体を付加的に含有する。
さらに別の観点から、本発明は、本発明に従う化合物の使用方法を提供する。
さらに別の観点から、本発明は、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート類の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、時間（分）に対するTrp37蛍光（RFU）のグラフであり、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート類による、HIV-1核キャプシドp7タンパクからの亜鉛の放出を示す。グラフにおいて、○はネガティブコントロール、即ち薬剤なしを示し、□はポジティブコントロール、即ち624151（RiceらAntimicrob.Agents Chemother.41：419426（1997）参照）を示し、■は実施例１の化合物（LK1）を示し、◆は実施例８の化合物（LK2）を示し、▲は実施例５の化合物（LK3）を示し、●は実施例１０の化合物（LK4）を示し、×は実施例１１の化合物（LK5）を示す。
図２は、時間（分）に対する相対的ＮＯ放出速度のグラフであり、グルタチオンＳ−転移酵素（GST）によるDNP-PYRRO/NOからのＮＯの放出の触媒作用を示す。
発明の詳細な記述
Ｏ²−アリール化ジアゼニウムジオレート類
本発明は、式：

［式中、Ｘは有機基または無機基であり、かつＱはアリール基である。］
を有するＯ²−アリール１−置換ジアゼニウムジオレート（即ち、Ｏ²−アリール１−置換ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート）を提供する。
本発明によれば、Ｎ₂Ｏ₂ ^-基のＯ²−酸素は、アリール基の環の原子に直接結合している。言い換えると、アリール環からＯ²−酸素を分離するスペーサー（spacer）原子（例えば、メチレン）がない。もし、アリール基が、２環基または多環基を含み、そのアリール基の全ての環が必ずしも芳香性ではないなら、Ｏ²−酸素とアリール基間の結合は、芳香環の一部である原子を介している。さらに、Ｏ²−酸素は、Ｎ₂Ｏ₂ ^-基のＯ²−酸素に結合し得るアリール基のどの芳香環原子にも結合し得る。Ｎ₂Ｏ₂ ^-基のＯ²−酸素と結合し得る芳香環の原子は、他の結合もあり得るが、一般的には炭素または窒素である。
どの特別な理論にも結びつくとは思わないが、Ｏ²−酸素とアリール環の原子との結合は、その環の活性化された原子に結合することにより達成されると現在考えられる。活性化は、どの適当なメカニズムを介しても達成され得る。この点について、アリール環を活性化させる好ましいメカニズムは、部分的な正電荷を有するアリール環の原子を介してジアゼニウムジオレートを反応させるか、あるいはより特別には、環構造のアミノ置換基を置き換えることによる。
第１の好適な反応メカニズムにおいて、アリール環は、適当な電子求引性基で置換され、当該基は、実施例１２のように、環の一部で、かつジアゼニウムジオレートと反応する前は「脱離基」であってもよい。電子求引性基および脱離基は、ある場合には、同じ基であってもよいことが当業者にはわかるだろう。脱離基は、ジアゼニウムジオレートに置き換わり、本発明のＯ²−アリールジアゼニウムジオレートを形成する。好適な脱離基としては、限定されないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ₂、ＯＳＯ₂ＲおよびＯＳＯ₃Ｒ（ここで、Ｒは有機基、金属中心等である。）が挙げられ、その合成物は当業者には十分理解される。説明のために、限定はされないが、好適なＲ基として、Ｈ、アルキル、アルケニルまたはアリールが挙げられる。この反応は、よく知られたＳ_NＡｒメカニズムを基礎としている。例えば、Nucleophilic Aromatic Displacement：The Influence of the Nitro Group,Francois Terrier,VCH Publishing,Inc.,New York,New York,pages 1-11（1991）参照。好ましくは、これらのＳ_NＡｒ反応は、少なくとも１つの電子求引性基を含む、電子が不足したアリール環において行われる。
第２の好適な反応メカニズムにおいて、アリール反応物は、適当なアミノ基で置換されて、置き換わったアミノ基に結合するアリール基の環原子の直接誘導化を可能にする（例えば、アミノ基のジアゾ化後）。本発明化合物に組み込まれた後は、活性化されるべきＯ²−酸素に結合するアリール環の原子に対する要求はない。しかし、本発明化合物に組み込まれた後、この原子が活性化されるなら、その原子が結合するジアゼニウムジオレート基は、後続の求核性置換を介して置き換わり得る（例えば、適当な強い塩基下で）。言い換えると、酸化性または求電子性の活性化の結果、本発明化合物は変化して、Ｏ²−酸素に結合するアリール環原子が活性化され、従って、上記のように、その化合物は後続の求核性置換を受ける。
有利には、本発明化合物は、以前からこの分野で知られていた、他の一酸化窒素／求核剤付加物が有しない、新規で有用な特性を有する。一般的に、本発明化合物は、中性または酸性のｐＨ下では安定である（即ち、中性または酸性のｐＨ下では、式Ｉで示される化合物はＮＯを発生しない。）。本発明化合物の別の有利な特性は、Ｏ²−アリール結合は、水酸化イオンを含む求核剤による開裂をよく受けやすいということである。特定のＯ²−アリールジアゼニウムジオレートまたは酸化的もしくは求電子的に活性化された本発明のＯ²−アリールジアゼニウムジオレートは、塩基性または求核性環境下に置かれた時、Ｏ²−酸素へのアリール結合は壊れ得る。生じたジアゼニウムジオレートイオンは、予想できる第１段階メカニズムを介して自発的に減少し、ＮＯを発生する。生じたアリール基は、その環境により与えられた求核剤で置換される。もしその環境により与えれらた求核剤が酵素の一部であれば、その酵素は不活性化され得る。Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート類の求核性攻撃に対する感受性により、当該化合物はまた、求核性の組織成分、生体部位および生体の微環境へ一酸化窒素をターゲティングするための、プロドラッグを設計することに特に従う。
チオールが混合物で存在する時、本発明化合物はまた、個々のチオール（有機性−ＳＨ含有化合物）を同定および量を測定するのに有用である。例えば、Ｃ₄−Ｃ₈直鎖チオールから成ると予想されるサンプルは、実施例１の生成物をテトラヒドロフランまたは他の不活性溶媒に溶解し、次いで過剰モルの得られた溶液をアッセイされるべきサンプルと混合することにより、分析され得る。続く反応が終了した後、一部は、紫外線検出システムを用いてHPLC分析される。得られたクロマトグラムで見られるピークは、それらの保持時間と、別に誘導された信頼性のある、個々のＣ₄−Ｃ₈直鎖チオールの標準品の保持時間とを比較することにより同定され、そしてピーク面積を、個々の標準カーブを介した濃度に変換することにより量が測定され得る。
Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート類に関して、ここで使用される「アリール基」は、（同素）環（（homo）cyclic）、複素環または多環構造の一部であるかどうかにかかわらず、どの芳香基にも言及される。「芳香性」の標準的な理解がここで使用される（例えば、L.G.Wade,Jr.,Organic Chemistry,2d Edition,Prentice Hall,Englewood Cliffs,New Jersey,682-683（1991）参照）。ここで使用されるアリール基はまた、広範な種々の置換基を有してもよい。置換基がアリール環の芳香性を壊さないなら、どの適当なアリール置換基も、使用され得る。
式Ｉのアリール基Ｑに話を変えると、Ｑは、ジアゼニウムジオレートのＯ²−酸素原子との反応に従う（または従わされ得る）全てのアリール基を含むことを意味する。このような基Ｑとしては、同素環、複素環および多環の芳香性構造、並びにそれらの誘導体が挙げられる。アリール基Ｑの例として、アクリジン、アントラセン、ベンゼン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾピラゾール、ベンゾチアゾール、カルバゾール、クロロフィル、シンノリン、フラン、イミダゾール、インドール、イソベンゾフラン、イソインドール、イソオキサゾール、イソチアゾール、イソキノリン、ナフタレン、オキサゾール、フェナントレン、フェナントリジン、フェノチアジン、フェノキサジン、フタルイミド、フタラジン、フタロシアニン、ポルフィン、プテリジン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロコリン、ピロール、キノリジニウムイオン、キノリン、キノキサリン、キナゾリン、シドノン、テトラゾール、チアゾール、チオフェン、チロキシン、トリアジンおよびトリアゾールが挙げられる。
本発明と一致して、これら芳香性化合物Ｑのそれぞれは、環の芳香性が維持される限り、芳香環に置換され得る、この分野でよく知られた多くの置換基で不定に誘導化され得る。例えば、アリール基Ｑの置換基として、Ｘ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ］^-（式中、Ｘはこれ以後定義され、式ＩのＸと同様である。）、ハロ、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、モノ−またはジ−置換アミノ、アンモニオまたは置換アンモニオ、ニトロソ、シアノ、スルホナト、メルカプト、ニトロ、オキソ、Ｃ₁−Ｃ₂₄脂肪族基、Ｃ₃−Ｃ₁₂オレフィン基、Ｃ₃−Ｃ₂₄シクロアルキル、Ｃ₃−Ｃ₂₄ヘテロシクロアルキル、ベンジル、フェニル、置換ベンジル、置換フェニル、ベンジルカルボニル、フェニルカルボニル、糖類、置換ベンジルカルボニル、置換フェニルカルボニルおよびリン誘導基が挙げられる。リン誘導基の例として、ホスフェートおよびホスホノ基が挙げられる。ホスフェート基の例として、（ＯＨ）₂Ｐ（Ｏ）Ｏ−および置換（ＯＨ）₂Ｐ（Ｏ）Ｏ−基が挙げられ、これらの１またはそれ以上の酸素原子は、独立してＳまたはＮＲ’（式中、Ｒ’はＣ₁−Ｃ₁₀脂肪族基、シクロアルキルまたはアリール基であると理解される。）に置き換わってもよい。Ｃ₁−Ｃ₂₄脂肪族基の置換基のの例として、Ｃ₁−Ｃ₂₄アシル、および

［式中、Ｒは、水素、置換もしくは無置換Ｃ₁−Ｃ₂₃脂肪族基、置換もしくは無置換Ｃ₃−Ｃ₂₃シクロアルキル、置換もしくは無置換Ｃ₃−Ｃ₁₂オレフィン基、ベンジル、フェニル、置換ベンジルまたは置換フェニルであり、当該置換ベンジルまたは置換フェニルは、ニトロ、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₂₄アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキルアミノ、シアノ、フェニルおよびフェノキシからなる群より選択される１−５の置換基で置換されている。］が挙げられる。好適な糖類として、リボース、グルコース、デオキシリボース、デキストラン、スターチ、グリコーゲン、ラクトース、フコース、ガラクトース、フルクトース、グルコサミン、ガラクトサミン、ヘパリン、マンノース、マルトース、スクロース、シアル酸およびセルロースが挙げられる。他の好適な糖類は、ホスホリル化、３，５−シクロホスホリル化並びにポリホスホリル化された、ヘキソース類およびペントース類である。
ジアゼニウムジオレート基に結合し得る本発明の置換アリール化合物の例として、ジニトロフェノール（ベンゼン）、ヒポキサンチン（プリン）、ウリジン（ピリミジン）、ビタミンK₅（ナフタレン）およびリボシルウリジン（ヌクレオシド）が挙げられる。
本発明の別の特定の実施態様においては、アリール基は、生存している有機体で通常見られる分子またはその置換体と同一または構造的に類似している。これらの生物学的に適切な基は、ヌクレオチド類、ヌクレオシド類、核酸類、ペプチドホルモン類を含むペプチド類、非ペプチドホルモン類、ビタミン類および他の酵素補因子類（例えばポルフィリン等）からなる群より選択され得る。生物学的に適切なアリール基の例として、チロキシン、NAD（またはNADH）、クロロフィル、ヒポキサンチン、ウリジンおよびビタミンK₅である。
以下の反応概略図は、本発明のＯ²−アリールジアゼニウムジオレート類の製造方法を例証する。これらの例証する反応概略図において、一般的には、ジアゼニウムジオレート（Ｘ−［Ｎ₂Ｏ₂ ^-］）の５％炭酸水素ナトリウム水溶液（弱塩基性である）の溶液を、好ましくは窒素等の不活性ガスのブランケット下で、０℃に冷却する。次いで、１当量の活性化された芳香性試薬の、ｔ−ブチルアルコール、ジメチルスルホキシドまたはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の溶媒の溶液を、ゆっくりと添加する。どの特別な理論にも結びくわけではないが、極性の非プロトン性溶媒が好ましいと考えられる。反応温度は、より小さい反応性アリール基のために、例えば、室温またはそれ以上まで少しずつ上げる。一般的に、添加時に沈殿物が形成される。次いで、混合物を徐々に室温まで温め一晩攪拌する。生成物をジクロロメタン等の適当な抽出剤で抽出し、希塩酸次いで炭酸水素ナトリウム溶液で続いて洗浄する。有機層は、硫酸ナトリウム等の適当な乾燥剤で乾燥し、好ましくは無水硫酸マグネシウムの層を通して濾過し、真空下で溶媒を留去して、粗生成物を得る。通常は、生成物は固体である。エタノールまたは他の適当な溶媒からの再結晶化は、生成物の好ましい精製方法である。
これらの条件は、当業者の特定の適用に合うように改変し得ることは、当業者にはわかるだろう。
クロロ化されたキノリンおよびイソキノリンは、ジアゼニウムジオレートと反応でき、Ｃｌ置換基は、以下に示すように、ジアゼニウムジオレートのＯ²−酸素に置き換わる。

その上、キナゾリンは以下に示すように組み込まれ得る。

フタラジン類もまた、本発明に従って以下に示すように組み込まれる。

アクリジンは、以下に示すように組み込まれ得る。

シンノリンもまた、以下に示すように組み込まれ得る。

キノキサリンもまた、以下に示すように組み込まれ得る。

酸素−および窒素−含有ヘテロ芳香性化合物もまた、本発明に従って、ジアゼニウムジオレートのＯ²−酸素置換のための芳香性試薬として使用され得る。例えば、オキサゾールおよびベンゾオキサゾールは、以下に示すように、２位で誘導化され得る。

同様に、チアゾールおよびベンゾチアゾールもまた、２位で誘導化され得る。

誘導化されたビタミンK₇もまた、以下に示すように製造され得る。

最も右の（すぐ上の）構造における、アリール環のＯ²−ジアゼニウムジオレート化された原子は、活性化されない。従って、最も右の構造は、Ｘ−Ｎ₂Ｏ₂ ^-を再生させる求核性攻撃に抵抗する、言い換えると、ＮＯの製造が自発的に低下するだろう。従って、ＮＯを発生させるために、最も右の構造は、求核性攻撃の前に酸化性プレ活性化を行うことが必要である。要求される酸化を独自に行い得るある細胞または器官種をターゲティングし、従って、組織の他のＮＯ感受性部位での暴露を避けながら、所望の組織へのＮＯ暴露を制限するのに、この酸化性プレ活性化の要求もまた有利だろう。
求電子性プレ活性化を必要とする類の化合物の例として、以下に示す化合物がある。

トリアジン類も、同様に、以下に示すように、本発明のＯ²−アリール置換ジアゼニウムジオレート類を形成する芳香性試薬であり得る。そのような化合物の合成は、現存する、トリアジンから誘導された除草剤の有効性を向上させる。

核酸類、およびそれらが含むニトロを生ずる塩基（リボシル化された塩基を含む）もまた、本発明のＯ²−アリール置換ジアゼニウムジオレート類を形成する芳香性試薬として有用であり得る。このことは実施例１３で例証される。
別の興味あるＯ²−アリール化ジアゼニウムジオレートは、以下の反応の生成物として示される；それは、加水分解時にＮＯおよびアロプリノールを共に発生し得る。

有利には、アロプリノールは既に医薬上有用であることが知られている。従って、適当なアリール基を含む公知の医薬上有用な化合物を、本発明のＯ²−アリールジアゼニウムジオレート類に変換することによって、本発明は、現存する薬剤を、ＮＯの放出により増強させる。
同様に、ビオプテリンジアゼニウムジオレートの誘導体は、以下に示すように、置換プテリジンから製造され得る。

ヘテロ原子を介した結合を利用する適当なアリール置換の例は、以下の反応概略図で示され、BuONOまたは他の適当なニトロソ化剤と反応させることにより行われ得る。

よく知られた抗炎症剤であるベンダザック（Bendazac）の構造類似体は、以下のように製造され得る。

本発明によれば、ジアゼニウムジオレート類として定義される化合物類のどの化合物も、Ｏ²−アリール置換を受け得る。従って、式Ｉを有する化合物のＸはどの有機基または無機基であってもよい。好ましくは、Ｘは、炭素および水素とは異なる原子を含み、炭素とは異なる原子を介してＮ₂Ｏ₂ ^-基の窒素に結合している。最も好ましくは、Ｘのアミンであり、窒素原子を介してＮ₂Ｏ₂ ^-基の窒素に結合している。好適なＸの基としてまた、限定されないが、Ｃ_1-Ｃ₂₄脂肪族基、アリール、および非芳香環基が挙げられる。「脂肪族基」は、炭素および水素を含み、窒素、酸素、硫黄、リンおよびハロゲンを含んでもよい非環式基を意味する。「アリール」は、上述のように、少なくとも１つの芳香環を含む基を意味する。好ましくは、アリール基はＣ_3-Ｃ₃₀含有基である。非芳香環基は、少なくとも１つの環構造を含み、芳香環を含まない基を意味する。好ましくは、非芳香環基はＣ_3-Ｃ₃₀含有基である。
式Ｉの基Ｘは、無置換であるか、または適当な付加基で置換されてもよく、例えば、−［Ｎ（ＮＯ）Ｏ^-］、ハロ、ヒドロキシ、アルキルチオ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、モノ−またはジ−置換アミノ、シアノ、スルホナト、メルカプト、ニトロ、置換もしくは無置換Ｃ₁−Ｃ₁₂脂肪族基、置換もしくは無置換Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル、置換もしくは無置換Ｃ₃−Ｃ₈ヘテロシクロアルキル、置換もしくは無置換Ｃ₃−Ｃ₁₂オレフィン基、ベンジル、フェニル、置換ベンジル、置換フェニル、ベンジルカルボニル、フェニルカルボニル、糖類、置換ベンジルカルボニル、置換フェニルカルボニルおよびリン誘導基である。リン誘導基の例として、ホスファトおよびホスホノ基が挙げられる。ホスファト基の例として、（ＯＨ）₂Ｐ（Ｏ）Ｏ−および置換（ＯＨ）₂Ｐ（Ｏ）Ｏ−基が挙げられ、これらの１またはそれ以上の酸素原子は、独立してＳまたはＮＲ’（式中、Ｒ’はＣ₁−Ｃ₈含有脂肪族基、シクロアルキルまたはアリール基であると理解される。）に置き換わってもよい。好ましいＣ₁−Ｃ₁₂脂肪族基の置換基として、Ｃ₁−Ｃ₁₂アシル、および

［式中、Ｒは、Ｃ₁−Ｃ₁₀置換もしくは無置換脂肪族基、Ｃ₃−Ｃ₁₁オレフィン基、Ｃ₃−Ｃ₈置換もしくは無置換シクロアルキル、ベンジル、フェニル、置換ベンジルまたは置換フェニルであり、当該置換ベンジルまたは置換フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ₁−Ｃ₄アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁−Ｃ₄アルキルアミノ、フェニルおよびフェノキシからなる群より選択される１または２で置換されている。］が挙げられる。好適な糖類および多糖類として、リボース、グルコース、デオキシリボース、デキストラン、スターチ、グリコーゲン、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、グルコサミン、ガラクトサミン、ヘパリン、マンノース、マルトース、スクロース、シアル酸およびセルロースが挙げられる。他の好適な糖類は、ホスホリル化、３，５−シクロホスホリル化並びにポリホスホリル化された、ペントース類およびヘキソース類である。
本発明の１つの実施態様において、Ｘは、米国特許第5,212,204号に開示の無機基である。Ｘが無機基である式Ｉの好適な実施態様は、^-Ｏ₃Ｓ−（スルファイト）および−^-Ｏ（オキサイド）である。
本発明の別の実施態様において、Ｘは、米国特許第5,155,137号に開示のポリアミンである。従って、ポリアミン置換Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート類は以下の式を有する。

［式中、Ｑは式ＩのＱと同様で、上記のように定義され、ｂおよびｄは、同一または異なってもよく、０または１であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵として、同一または異なって、水素、置換もしくは無置換Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル、置換もしくは無置換Ｃ_1-Ｃ₁₂直鎖もしくは分岐鎖アルキル、置換もしくは無置換ベンジル、置換もしくは無置換ベンゾイル、置換もしくは無置換Ｃ₃−Ｃ₁₂オレフィン基、フタロイル、アセチル、トルフルオロアセチル、ｐ−トルイル、ｔ−ブトキシカルボニルまたは２，２，２−トリハロ−ｔ−ブトキシカルボニルが挙げられる。式IIのｉ、ｊおよびｋの値は、同一または異なってもよく、２〜１２の整数である。］
本発明の好適な実施態様において、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート類は、米国特許第5,039,705号（Keeferら）および第4,954,526号（Keeferら）に開示の化合物から誘導され、以下の式を有する。

［式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は、同一または異なってもよく、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₁₂直鎖アルキル、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルコキシもしくはアシルオキシ置換直鎖アルキル、Ｃ₂−Ｃ₁₂ヒドロキシもしくはハロ置換直鎖アルキル、Ｃ₃−Ｃ₁₂分岐鎖アルキル、Ｃ₃−Ｃ₁₂ヒドロキシ、ハロ、アルコキシもしくはアシルオキシ置換分岐鎖アルキル、Ｃ₂−Ｃ₁₂直鎖オレフィン基、およびＣ₃−Ｃ₁₂分岐鎖オレフィン基からなる群より選択され、無置換であるか、あるいはヒドロキシ、アルコキシ、アシルオキシ、ハロまたはベンジルで置換され、但し、Ｒ⁶とＲ⁷の両方がＨであるということはない；あるいはＲ⁶およびＲ⁷は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、

（式中、Ａは、Ｎ、ＯまたはＳであり、ｗは１〜１２であり、ｙは１または２であり、ｚは１〜５であり、Ｒ⁸は、水素、Ｃ₁−Ｃ₈直鎖アルキル、Ｃ₃−Ｃ₈分岐鎖アルキル、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル、置換もしくは無置換アリール（例えは、フェニル、トルイル等）であり、かつＲ⁹は、水素、Ｃ₁−Ｃ₆直鎖アルキルまたはＣ₃−Ｃ₆分岐鎖アルキルである。）からなる群より選択される複素環を形成する。］。典型的なアザクラウン基は、１−アザ−１２−クラウン−４、１−アザ−１５−クラウン−５および１−アザ−１８−クラウン−６である。Ａが窒素の時、例えば、ここに言及により組み込まれた、米国出願第08/475,732号に開示のように、窒素原子自体、置換されてもよい。
さらなる例として、以前に言及により完全に組み込まれた、参考のために組み入れた、米国特許第5,250,550号に開示の化合物から誘導される、Ｏ²−アリール置換ジアゼニウムジオレート類が挙げられ、以下の式を有する。

［式中、Ｄは、

であり、ここで、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は、同一または異なっている。置換基Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は、どの適当な置換基であってもよく、その例として、水素、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-12直鎖もしくは分岐鎖アルキル、ベンジル、ベンゾイル、フタロイル、アセチル、トルフルオロアセチル、ｐ−トルイル、ｔ−ブトキシカルボニルおよび２，２，２−トリハロ−ｔ−ブトキシカルボニルが挙げられる。式IVにおいて、ｆは０〜１２の整数である。］
好適なＯ²−アリール置換ジアゼニウムジオレート類として、実施例１４の化合物も挙げられる。
Ｏ²−アリール化ジアゼニウムジオレート類の代替の製造方法は、以下の文献反応（Stevens,J.Org.Chem.29：311-315（1964））の適用を通して可能である。

アリールオキシアニオンＡｒＯ^-をStevens反応のメトキシドに置換することによって、種々の構造のＯ²−アリールジアゼニウムジオレート類を得ることが可能である。同様に、ＡｒＳ^-種に対応する誘導体を得ることが可能である。
Ｏ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類および１−〔（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル〕ジアゼニウムジオレート類
本発明はまた、２つの他の新しい類のジアゼニウムジオレート類を提供する。この１つの類のジアゼニウムジオレート類は、加水分解的に不安定な基（Ｒ）を含むものであり、遊離ジアゼニウムジオレート（ＮＯ供与体）Ｘ−ＮＯ＝ＮＯ^-への開裂時に、無毒かつ恐らくは有益な糖を放出して、糖に基づくレセプター媒介現象を利用できる。他の類のジアゼニウムジオレート類は、とりわけ、抗血栓剤および血管拡張剤としての有効性が証明されている超高速ＮＯ供与体であるが、その不安定性により誘導化することが本質的に極めて困難である、１−〔（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル〕ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート二ナトリウム塩（ＰＲＯＬＩ／ＮＯ）のプロドラッグを提供する（Saavedraら、J.Med.Chem.31：4361-4365（1996）；および米国特許第5,632,981号（Saavedraら））。超高速ＮＯ供与体ＰＲＯＬＩ／ＮＯのプロドラッグを生成する新たに発見された能力は、そのＰＲＯＬＩ／ＮＯプロドラッグが、安定化しているＯ²−保護基の代謝的な除去のための所望の器官または細胞種に到達するまで、循環システムを介して自由に動くことを可能にし、それによって、特異的なまたは好ましい部位でＮＯの迅速な放出を与え、そしてターゲティング組織付近での調節された速度での注入による投与の必要性は除かれる。さらに、対応するニトロサミン（Ｎ−ニトロソプロリン）は、生物学的媒体中で形成される場合、他のニトロサミン類とは違って、発癌性のおそれはない。
従って、本発明は、Ｏ²−グリコシル化１−置換ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート類（Ｏ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類）およびＯ²−置換１−〔（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル〕ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート類（１−〔（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル〕ジアゼニウムジオレート類）を提供する。これらの両方は以下の式により表すことができる：

［式Ｉａにおいて、ＸおよびＲは、本明細書中で定義される有機基および／または無機基である。］。
Ｏ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類
Ｏ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレートに関して、ジアゼニウムジオレート類として定義される類の化合物（例えば、米国特許第5,039,705号、同第5,208,233号、同第5,155,137号、同第5,250,550号、同第5,389,675号、同第5,525,357号、同第5,405,919号ならびに関連特許および特許出願参照）のどの化合物も、ジアゼニウムジオレートのＯ²がグリコシル化に利用可能であるならば、Ｏ²−グリコシル化を受け得る。式Ｉａの基Ｒは、どの糖でもよく、これはピラノース環またはフラノース環の２位によりジアゼニウムジオレートのＯ²に結合している。この糖は官能化されてもよい。望ましくは、この糖およびその誘導体は、生理学的ｐＨで加水分解可能である。この糖は、単糖、二糖（例えば、スクロースまたはマルトース）、オリゴ糖または多糖であり得る。好ましい糖類および多糖類としては、とりわけ、リボース、グルコース、デオキシリボース、フコース、ラクトース、ガラクース、フルクトース、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノース、マルトース、スクロース、ならびにレセプター媒介細胞間相互作用において認識配列として役立つ多くの糖およびオリゴ糖単位が挙げられる。他の好ましい糖類としては、ホスホリル化、３，５−シクロホスホリル化ならびにポリホスホリル化されたペントース類およびヘキソース類が挙げられる。
例示として、この糖残基（例示のためにジアゼニウムジオレートに結合して示される）は、アミノ糖（例えば、以下の構造を有するグルコサミンまたは置換グルコサミン）であってもよい：

〔式中、Ｒ¹²およびＲ¹³は、同一でも異なってもよく、水素、Ｃ_1-6アルキル、アシル、ホスフェート、スルフェート、ペプチドまたはタンパクである。〕。この糖残基は、例えば、グルクロン酸または以下に表されるその誘導体であってもよい：

〔式中、Ｒ¹⁴はＸ¹Ｒ¹⁵Ｒ¹⁶であり、ここでＸ¹はＮ、ＯまたはＳであり、Ｘ¹がＮの時、Ｒ¹⁵およびＲ¹⁶は、独立して、水素、置換もしくは無置換Ｃ_1-24アルキル、Ｃ_3-24シクロアルキル、Ｃ_2-24オレフィン基、アリール（例えば、アクリジン、アントラセン、ベンゼン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾピラゾール、ベンゾチアゾール、カルバゾール、クロロフィル、シンノリン、フラン、イミダゾール、インドール、イソベンゾフラン、イソインドール、イソオキサゾール、イソチアゾール、イソキノリン、ナフタレン、オキサゾール、フェナントレン、フェナントリジン、フェノチアジン、フェノキサジン、フタルイミド、フタラジン、フタロシアニン、ポルフィン、プテリジン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロコリン、ピロール、キノリジニウムイオン、キノリン、キノキサリン、キナゾリン、シドノン、テトラゾール、チアゾール、チオフェン、チロキシン、トリアジン、およびトリアゾール）または複素環基（例えば、グリコシル等）であり、かつＸ¹がＯまたはＳの時、Ｒ¹⁶基は存在しない。〕。
あるいは、Ｘ¹が窒素の場合、Ｒ¹⁵およびＲ¹⁶は以下の基からなる群より選択される複素環を形成する：

〔式中、ＡはＮ、Ｏ、またはＳであり、ｗは１−１２であり、ｙは１または２であり、ｚは１−５であり、Ｒ⁸は、水素、Ｃ_1-8直鎖アルキル、Ｃ_3-8分岐鎖アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、アリール（例えば、フェニル、トリル等）またはカルボキシラト並びに後述するその誘導基であり、かつＲ⁹は、水素、Ｃ_1-6直鎖アルキルまたはＣ_3-6分岐鎖アルキルである。〕。上記基は、無置換でもあるいは適当に置換されてもよい。
アザクラウン基（すなわち、ＡがＮである時）の例としては、１−アザ−１２−クラウン−４、１−アザ−１５−クラウン−５および１−アザ−１８−クラウン−６が挙げられる。Ａが窒素である場合、窒素原子自体、例えば、米国特許出願第08/475,732号に記述のように置換されてもよい。
さらにＯ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類に関して、Ｘ¹を介してカルボニル基に結合している基は、ジアゼニウムジオレートアニオンへの開裂を妨げないどんなものでもよい。
さらにＯ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類に関して、Ｘ¹を介してカルボニル基に結合している基は、ジアゼニウムジオレートアニオンへの開裂を妨げないどんなものでもよい。
好ましくは、基Ｘは、炭素および水素とは異なる原子を含み、かつ炭素とは異なる原子を介してＮ₂Ｏ₂ ^-基の窒素に結合している。最も好ましくは、Ｘはアミノ基であり、かつ窒素原子を介してＮ₂Ｏ₂ ^-基の窒素に結合している。好適なＸの基としては、限定されないが、Ｃ_1-24脂肪族基、アリールおよび非芳香環基が挙げられる。「脂肪族基」は、炭素および水素を含み、窒素、酸素、硫黄、リンまたはハロゲンを含んでもよい非環式基を意味する。「アリール」は、少なくとも１つの芳香環を含む基を意味する。好ましくは、アリール基は、Ｃ_6-30基である。「非芳香環基」は、少なくとも１つの環構造を含み、かつ芳香環を含まない基を意味する。好ましくは、非芳香環基は、Ｃ_6-30基である。さらに、Ｘは、無置換でもあるいは好適な付加基（例えば、−〔Ｎ（ＮＯ）Ｏ^-〕、ハロ、ヒドロキシ、アルキルチオ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、モノ−またはジ−置換アミノ、シアノ、スルホナト、メルカプト、ニトロ、置換もしくは無置換Ｃ_1-12脂肪族基、置換もしくは無置換Ｃ_3-8シクロアルキル、置換もしくは無置換Ｃ_3-Ｃ₁₂オレフィン基、置換もしくは無置換Ｃ_3-8複素環アルキル、ベンジル、フェニル、置換ベンジル、置換フェニル、ベンジルカルボニル、フェニルカルボニル、糖、置換ベンジルカルボニル、置換フェニルカルボニルおよびリン誘導基）で置換されてもよい。リン誘導基の例としては、ホスファトおよびホスホノ基が挙げられる。ホスファト基の例としては、（ＯＨ）₂Ｐ（Ｏ）Ｏ−および置換（ＯＨ）₂Ｐ（Ｏ）Ｏ−基が挙げられ、その１つまたはそれ以上の酸素原子は、独立してＳまたはＮＲ¹⁷（式中、Ｒ¹⁷はＣ_1-8脂肪族基、

（式中、Ｒ¹⁸は、Ｃ_1-10無置換もしくは置換脂肪族基である。）、Ｃ_3-8無置換もしくは置換シクロアルキル、ベンジル、フェニル、置換ベンジルまたは置換フェニルであると理解される。）に置き換わってもよい。ベンジルまたはフェニルが置換されている場合、好ましくはそれはハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ_1-4アルキルアミノ、ジ−Ｃ_1-4アルキルアミノ、フェニルおよびフェノキシからなる群より選択される１または２の置換基で置換されている。
本発明の１つの実施態様において、式ＩａのＸは、米国特許第5,212,204号に記述のような無機基である。Ｘが無機基である式Ｉａの好ましい実施態様は、^-Ｏ₃Ｓ−（スルファイト）および−Ｏ^-（オキサイド）である。
本発明の別の実施態様において、式Ｉａ中のＸは、米国特許第5,250,550号で定義されるようなポリアミンである。従って、ポリアミンＯ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類は以下の式を有する：

〔式中、Ｑは、式Ｉａ中のＲと同一で上記で定義した通りであり、ｂおよびｄは同一または異なってもよく、０または１であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は、同一または異なって、水素、置換もしくは無置換Ｃ_3-8シクロアルキル、置換もしくは無置換Ｃ_1-12直鎖もしくは分岐鎖アルキル、置換もしくは無置換ベンジル、置換もしくは無置換ベンゾイル、置換もしくは無置換Ｃ_3-Ｃ₁₂オレフィン基、フタロイル、アセチル、トリフルオロアセチル、ｐ−トルイル、ｔ−ブトキシカルボニルまたは２，２，２−トリハロ−ｔ−ブトキシカルボニルである。〕。式ＩＩ中のｉ、ｊ、およびｋの値は、同一または異なって、２〜１２の整数である。
本発明の好ましい実施態様において、ジアゼニウムジオレート類は、米国特許第5,039,705号（Keeferら）および同第4,954,526号（Keeferら）に開示の化合物から誘導されて、以下の式を有する：

〔式中、Ｒは、式Ｉａ中のＲと同一で上記で定義した通りであり、かつＲ¹⁹およびＲ²⁰は、同一または異なって、水素、Ｃ_1-12直鎖アルキル、Ｃ_3-12分岐鎖アルキル、またはＣ_2-12直鎖もしくはＣ_3-12分岐鎖オレフィン基である。但し、Ｒ¹⁹およびＲ²⁰の両方が水素であるということはない。〕。上記のどの置換基も、無置換でもあるいはアルコキシ、アシルオキシ、アシルチオ、ヒドロキシ、ハロもしくはベンジル基で置換されてもよい。
あるいは、Ｒ¹⁹およびＲ²⁰は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、以下の基からなる群より選択される複素環を形成する：

〔式中、ＡはＮ、Ｏ、またはＳであり、ｗは１−１２であり、ｙは１または２であり、ｚは１−５であり、Ｒ⁸は、水素、Ｃ_1-8直鎖アルキル、Ｃ_3-8分岐鎖アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、置換もしくは無置換アリール（例えば、フェニル、トリル等）またはカルボキシラト並びに後述するその誘導基であり、かつＲ⁹は、水素、Ｃ_1-6直鎖アルキルまたはＣ_3-6分岐鎖アルキルである。〕。上記の基は、無置換でもあるいは適当に置換されてもよい。
アザクラウン基（すなわち、ＡがＮである時）の例としては、１−アザ−１２−クラウン−４、１−アザ−１５−クラウン−５および１−アザ−１８−クラウン−６が挙げられる。Ａが窒素である時、窒素原子自体、例えば、米国特許出願第08/475,732号に記述のように置換されてもよい。
さらに実施例として、米国特許第5,250,550号に開示の化合物から誘導されるＯ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類が挙げられ、以下の式を有する：

〔式中、Ｄは、

であり、ここでＲ²¹は式Ｉａの糖中のＲと同一で上記で定義した通りであり、かつＲ¹⁰およびＲ¹¹は、同一または異なってもよく、どの適当な基（この例としては、水素、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-12直鎖または分岐鎖アルキル、ベンジル、ベンゾイル、フタロイル、アセチル、トリフルオロアセチル、ｐ−トルイル、ｔ−ブトキシカルボニルおよび２，２，２−トリハロ−ｔ−ブトキシカルボニルが挙げられる。）でもよい。〕。式ＩＶにおいて、ｆは０〜１２の整数である。
好ましいＯ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレートは、式Ｉａに関して、ＸがＮ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂）₂であり、かつＲがフコースまたはマンノースである化合物である。
上記化合物は、当業者に公知の方法に従って製造することができる。グリコピラノシル化試薬としては、アセトブロモ−α−ガラクトースおよびアセトブロモグルコサミンが挙げられる。グリコフラノシル化試薬としては、トリベンジル−α−アラビノフラノシルブロミドおよびブロモアセチルキシロースが挙げられる。
オリゴ糖類は、例えば、Sigma Chemical Co.（St.Louis,MO）およびCarbomer Specialty Biochemicals and Polymers（Westborough,MA）から購入できる。さらに、オリゴ糖類は、Preparative Carbohydrate Chemistry,Stephen Hanessian,ed.,Marcel Dekker,New York,NY（1997）およびPolysaccharides in Medicinal Applications,Severian Dumitriu,ed.,Marcel Dekker,New York,NY（1996）に記述のような化学的および酵素的な製造法を含む、十分確立された手順に従って合成することができる。
保護された直鎖または分岐鎖多糖は、ジアゼニウムジオレートイオンとの反応のために、アノマー末端のハロゲン化により活性化されてもよく、続いてジアゼニウムジオレートのグリコシル化を受け得る。Ｏ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類の生成のための活性化された二糖類としては、アセトブロモ−α−マルトースおよびアセトブロモ−α−ラクトースが挙げられる。
Ｏ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類は、細胞接着を含む、分子のシグナル化および認識プロセスが、炭水化物に関与する場合に有用である。例えば、Ｏ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類は、寄生生物（例えば、ライシュマニア（lieshmania）属）、ウイルスまたはバクテリアに起因するような感染、ならびに炎症および転移の治療に有用であると考えられている。この点について、Ｏ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレートは、実施例３６に例示されるような、マンノース−フコースレセプターに指向するように製造することができる。糖残基（この場合マンノース）は、ジアゼニウムジオレートを保護すると考えられる。このマンノースは、マクロファージ上でマンノース−フコースレセプターに結合し、Ｏ²−マンノシル化ジアゼニウムジオレートがこの細胞内に入り、そこで糖残基が開裂する時、ＮＯが放出される。
１−〔（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル〕ジアゼニウムジオレート類
１−〔（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル〕ジアゼニウムジオレート類に関して、式Ｉａの基Ｘは、

であってもよく、１−〔（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル〕ジアゼニウムジオレート類は以下の式で構造的に表すことができる：

〔式中、Ｒ²²は、水素、ヒドロキシル、ＯＭ（式中、Ｍはカチオンである）、ハロまたはＸ¹Ｒ²³Ｒ²⁴（式中、Ｘ¹はＮ、ＯまたはＳであり、Ｘ¹がＮの時、Ｒ²³およびＲ²⁴は独立して、置換もしくは無置換Ｃ_1-24アルキル、Ｃ_3-24シクロアルキル、Ｃ_2-24オレフィン基、アリール（例えば、アクリジン、アントラセン、ベンゼン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾピラゾール、ベンゾチアゾール、カルバゾール、クロロフィル、シンノリン、フラン、イミダゾール、インドール、イソベンゾフラン、イソインドール、イソオキサゾール、イソチアゾール、イソキノリン、ナフタレン、オキサゾール、フェナントレン、フェナントリジン、フェノチアジン、フェノキサジン、フタルイミド、フタラジン、フタロシアニン、ポルフィン、プテリジン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロコリン、ピロール、キノリジニウムイオン、キノリン、キノキサリン、キナゾリン、シドノン、テトラゾール、チアゾール、チオフェン、チロキシン、トリアジン、およびトリアゾール）または複素環基（例えば、グリコシル等）であり、かつＸ¹がＯまたはＳの時、Ｒ²⁴は存在しない。）である。〕。あるいは、Ｘ¹が窒素の時、Ｒ²³およびＲ²⁴は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、複素環、例えば以下の基からなる群より選択される複素環を形成する：

〔式中、ＡはＮ、Ｏ、またはＳであり、ｗは１〜１２であり、ｙは１または２であり、ｚは１〜５であり、かつＲ⁸、Ｒ⁹、Ｒ²⁵およびＲ²⁶は、水素、Ｃ_1-8直鎖アルキル、Ｃ_3-8分岐鎖アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキルまたはアリールである。〕。上記の基は、無置換でもあるいは適当に置換されてもよい。
窒素（Ｎ−４）上のＲ²⁶置換基は、水素、Ｃ_1-8アルキル基、アリール基またはＣ（Ｏ）−ＹＲ²⁷（式中、Ｙは硫黄、酸素または窒素であり、かつＲ²⁷は、ＣＨ₂ＯＣＨ₃、ビニル、Ｃ_1-9直鎖アルキル、Ｃ_3-6分岐鎖アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、ポリエチレングリコール、多糖、あるいは他のポリマー、ペプチドまたはタンパクである。）であってもよい。〕。ＹＲ²⁷は、タンパク類、ペプチド類、リン脂質類、多糖類、オリゴ糖類、プリン類、ピリミジン類および生体適合性ポリマー類（すなわち、ポリエチレングリコール、ポリラクチド類およびポリカプロラクトン）に結合するための活性化リンカー（例えば、ヒドロキシスクシンイミジル基）であってもよい。ＹＲ²⁷は、カルボニル基を、オリゴペプチド類、ポリアミン類およびタンパク類の求核性官能基と反応する求電子性部位にする、カルボニル基のための活性化基であってもよい。ＹＲ²⁷は、カルボニル基を多くの求核剤と反応させることができ、そしてポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）と反応して、ポリマー−結合化合物を形成できる。
さらに１−〔（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル〕ジアゼニウムジオレート類に関して、式Ｉａの基Ｒは、どの共有結合した有機基または無機基でもよく、水素とは異なり、かつＣ_1-12直鎖もしくはＣ_3-12分岐鎖アルキル、Ｃ_2-12直鎖もしくはＣ_3-12分岐鎖オレフィン基、Ｃ_1-12アシル、スルホニル、Ｃ_3-12シクロアルキル、カルボキサミド、上述のグリコシル基、上述のアリール基、または式−（ＣＨ₂）_n−ＯＮ＝Ｎ（Ｏ）ＮＲ²⁸Ｒ²⁹（式中、ｎは２−８の整数であり、かつＲ²⁸およびＲ²⁹は独立して、Ｃ_1-12直鎖アルキル、Ｃ_3-12分岐鎖アルキル、Ｃ_1-12直鎖もしくはＣ_3-12分岐鎖オレフィン基であるか、あるいはＲ²⁸およびＲ²⁹は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、複素環、好ましくはピロリジノ、ピペリジノ、ピペラジノまたはモルホリノ基を形成する。）の基である。上記のＲ基は、無置換でもあるいは適当に置換されてもよい。好ましい置換としては、ヒドロキシ、ハロ、アシルオキシ、アルコキシ、アシルチオまたはベンジルによる置換が挙げられる。
上記化合物は、当業者に公知の方法に従って製造することができる。例えば、Sanger,Biochem.J.39：507-515（1945）を参照。
Ｏ²−置換１−〔（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル〕ジアゼニウムジオレート類は、それらが水溶液においてＯ²−無置換アニオンよりも安定であるということ、および多くの場合、それらが酵素作用によりＮＯ放出のために活性化され得るということにおいて、他のジアゼニウムジオレート類にまさる利点を与える。さらに、Ｎ−ニトロソ誘導体が、１−〔（２−カルボキシラト）ピロリン−１−イル〕ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートのＮ−Ｎ二重結合の正味の正式の開裂により形成されるならば、このＮ−ニトロソ化合物は、非発癌性である。このような化合物は、劇性肝不全、マラリア、呼吸障害、インポテンス、および多様な心臓血管／血液の障害の治療において特に有用であると考えられる。
ポリマー結合ジアゼニウムジオレート類
本発明の特に有用な別の実施態様は、式ＩのＯ²−アリールジアゼニウムジオレート類または式ＩａのＯ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類を含むものであり、ここでＸがポリマーであるか、あるいは本発明のどのＯ²−アリールジアゼニウムジオレートまたはＯ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレートも、ポリマーマトリックスに組み込まれている。ＰＲＯＬＩ／ＮＯもまた、Ｒ²⁰およびＲを介したポリマー結合であってもよい。これらの両方の実施態様は、「ポリマーに結合している」Ｎ₂Ｏ₂ ^-官能基をもたらす。「ポリマーに結合している」とは、Ｎ₂Ｏ₂ ^-官能基が、物理的または化学的にポリマーマトリックスの一部と結びついている（associated）、ポリマーマトリックスに取り込まれている（incorporated）または含まれている（contained）ことを意味する。
Ｎ₂Ｏ₂ ^-官能基のポリマーへの物理的な結びつき（association）または結合（bonding）は、ポリマーを一酸化窒素／求核剤複合体と共沈させることにより、ならびにＮ₂Ｏ₂ ^-基のポリマーへの共有結合により達成することができる。Ｎ₂Ｏ₂ ^-基のポリマーへの化学的結合は、例えば、一酸化窒素／求核剤付加物の求核性基がポリマーと共有結合して、Ｎ₂Ｏ₂ ^-基が結合している求核剤残基がポリマー自体の一部を形成（すなわち、ポリマー骨格中にあるか、またはポリマー骨格上のペンダント基に結合している。）することでもよい。一酸化窒素放出Ｎ₂Ｏ₂ ^-官能基がポリマーの一部と結びついている、ポリマーに取り込まれているまたはポリマー内に含まれている、すなわちポリマーに「結合」している様式は本発明において重要ではなく、全ての結びつき（association）、取り込み（incorporation）および結合（bonding）の手段が本発明で意図されている。
ポリマー結合付加物組成物の部位特異的適用は、一酸化窒素放出Ｎ₂Ｏ₂ ^-官能基の作用の選択性を高める。もしポリマーに結合しているＮ₂Ｏ₂ ^-官能基が必然的に局在化しているならば、それらの一酸化窒素放出の効果はそれらが接触している組織に集中するだろう。もしこのポリマーが可溶性であれば、例えば、ターゲティング組織に対して特異的な抗体への結合により、あるいはそのような抗体の誘導化により、作用の選択性をさらにアレンジすることができる。同様に、核酸中のターゲティング配列との部位特異的な相互作用が可能なオリゴヌクレオチド類への結合のように、重要なレセプターのためのリガンドの認識配列を模倣した小さなペプチド類へのＮ₂Ｏ₂ ^-基の結合は、局在化した一酸化窒素放出を与える。
本発明のＯ²−ジアゼニウムジオレート類は、米国特許第5,525,357号（Keeferら）および同第5,405,919号（Keeferら）、ならびに米国特許出願第08/419,424号（Smithら）（これらはそれぞれ言及によりここに組み込まれる。）に開示の材料から誘導することができる。本発明に関して、広範な種々のどのポリマーも使用可能である。選択されるポリマーは、ただ、生物学的に許容し得るものであればよい。本発明における使用に適したポリマーの例として、ポリオレフィン類（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルクロライド、ポリジフッ化ビニリデン）、ポリエーテル類（例えば、ポリエチレングリコール）、多糖類（例えば、デキストラン）、ポリエステル類（例えば、ポリ（ラクチド／グリコライド））、ポリアミド類（例えば、ナイロン）、ポリウレタン類、ポリエチレンイミン類、生体ポリマー類（例えば、ペプチド類、タンパク類、オリゴヌクレオチド類、抗体類および核酸類）、スターブラストデンドライマー類（starburst dendrimers）、多糖類等が挙げられる。
この点において、ジアゼニウムジオレートを含むポリマーは、糖と反応でき、糖はＮ₂Ｏ₂ ^-官能基に結合する。
生体ポリマー由来のジアゼニウムジオレートの形成は、関心がある生物学的部位に特異的に適用することができる生体ポリマー結合ジアゼニウムジオレート組成物を与える。生体ポリマー結合ジアゼニウムジオレートの部位特異的適用は、一酸化窒素放出ジアゼニウムジオレートの作用（これは、ＰＲＯＬＩ／ＮＯにおいて、Ｏ²−アリールもしくはＯ²−グリコシル化結合またはＯ−Ｒ結合の開裂に続いて発生する（３１ページ参照））の選択性を高める。上記に開示した他のポリマーに関して、もし生体ポリマーに結合しているジアゼニウムジオレートがその分子の固有の特性により局在化しているならば、その一酸化窒素放出効果はそれらが接触している組織に集中するだろう。もし生体ポリマーが可溶性ならば、例えば、ターゲティング組織に対して特異的な抗体への結合により、あるいはそのような抗体の誘導化により、作用の選択性をさらにアレンジすることができる。同様に、核酸中のターゲティング配列との部位特異的な相互作用が可能なオリゴヌクレオチド類への結合のように、重要なレセプターのためのリガンドの認識配列を模倣した小さなペプチド類へのジアゼニウムジオレート基の結合は、局在化した一酸化窒素放出を与える。他のタンパク類、ペプチド類、ポリペプチド類、核酸類および多糖類も同様に利用できる。米国特許第5,405,919号（Keeferら）および米国特許第5,632,981号（Saavedraら）（言及により完全にここに組み込まれる）は、ジアゼニウムジオレート類の製造において有用な類似の化合物および製品を開示する。
例示として、Ｏ²−アリール化ピペラジンジアゼニウムジオレートは、癌細胞化学走性に重要なＩＫＶＡＶ認識配列を含むポリペプチドに共有結合され得る。抗接着剤（anti-adhesive agent）としてのＮＯの再生能と、癌細胞および／または癌細胞が接着（attach）しやすい血管系およびリンパ系の部位に対するＩＫＶＡＶ配列の親和力の両方の保持によって、転移を減少させる、あるいは予防することさえもできる。さらに、アリール基は、それがさらなる抗癌細胞活性を与えるように選択してもよい。ピペラジンのＮ⁴位での置換は、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク類、多糖類およびヌクレオチド類へのグリコシル化ジアゼニウムジオレートの結合に使用できる。
本発明のジアゼニウムジオレート類は、プロテーゼ、ステントおよび胸部インプラントのような医療用インプラントと関係する固形癌の発生の危険性を少なくする手段として、生体への外科的結合の前に、それらを被覆するのに用いることができると考えられる。さらに、このプロテーゼおよびインプラントは、出発物質の必須成分として、ジアゼニウムジオレートを使用して製造することができる。ジアゼニウムジオレートを組み込んだ医療用デバイスは、ＮＯの局所的放出もまた有利に与える有用な医療用構造物を提供して、多くの生物学的障害の治療への非常に貴重な二股のアプローチ（two-pronged approach）を提供する。
組成物
当該分野で十分知られているように、一酸化窒素およびＮ₂Ｏ₂ ^-官能基を含む化合物は、一部には、その生体調整プロセスにおける一酸化窒素の多方面の役割（multifaceted role）のために、広範な有用性を有し得る。従って、本発明はまた、本発明のジアゼニウムジオレートを含有する、医薬組成物を含む組成物も提供する。好ましくは、この医薬組成物は、さらに医薬上許容し得る担体を含有する。
本発明のジアゼニウムジオレート組成物を動物（例えば、哺乳動物）に投与する適当な方法が利用できること、およびある特定の組成物を投与するのに１より多い投与経路を用いることができるが、ある特定の投与経路が別の投与経路よりも、より迅速なかつ効果的な反応を与えることは、当業者であれば理解できるであろう。医薬上許容し得る担体もまた当業者によく知られている。担体の選択は、一部には、特定の組成物ならびに該組成物を投与するために用いられる特定の方法の両方により、決定されるだろう。従って、本発明の医薬組成物の広範な種々の適当な製剤がある。
経口投与に適した製剤は、（ａ）水または生理食塩水のような希釈剤に溶解した有効量のジアゼニウムジオレートのような液体溶液、（ｂ）固形物または顆粒として、予め決められた量の活性成分をそれぞれ含むカプセル剤、小袋剤（sachet）または錠剤、（ｃ）適当な液体中の懸濁剤、および（ｄ）適当な乳剤からなり得る。錠剤は、１またはそれ以上のラクトース、マンニトール、トウモロコシ澱粉、バレイショ澱粉、微結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、矯味剤、および医薬上適合し得る担体を含んでいてもよい。ロゼンジ剤は、矯味剤（通常、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガント）中の活性成分を含み、同様に香剤は、不活性基剤（ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴム乳剤、ゲル剤等）中に活性成分を含み、活性成分に加えて当該分野で公知の担体を含む。
本発明のジアゼニウムジオレート類は、単独でまたは他の適当な成分と組み合わせて、吸入により投与されるエアロゾル製剤に調製してもよい。これらエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容し得る噴射剤中に置かれる。
非経口投与に適した製剤としては、水性および非水性溶液、即ち、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤および該製剤を投薬を受ける者の血液と等張にするための溶質を含有し得る等張性無菌注射溶液、および懸濁化剤、溶解補助剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含有し得る水性および非水性の無菌の懸濁液が挙げられる。該製剤は、アンプルおよびバイアルのような１回投与量または複数回投与量の密閉された容器で与えられ、注射には、使用直前に、例えば水のような無菌の液体担体を添加するだけでよい、凍結乾燥状態で保存されてもよい。即席の注射溶液および懸濁液は前に述べた種類の無菌の粉末剤、顆粒剤および錠剤から調製され得る。
本発明において、動物（特にヒト）に投与する量は、適当な時間枠にわたって該動物に対して治療の効果を奏するのに十分量とすべきである。投与量は、使用する特定の組成物の強さ（少なくとも、ＮＯ発生速度、ＮＯ発生の範囲およびジアゼニウムジオレート類由来の分解産物の生物学的活性を考慮して）、治療すべき動物の状態および体重により決定されるであろう。投与量もまた、ある特定の組成物の投与に伴うかもしれない悪いいかなる副作用の有無、性質および程度によっても決定されるであろう。内部投与に適した投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である。好ましい投与量は、０．０１〜３５ｍｇ／ｋｇ／日である。より好ましい投与量は、０．０５〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。典型的な投与のための医薬組成物において、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート類の適切な濃度は、０．０５〜１５％（重量当たり）である。好ましい濃度は、０．０２〜５％である。より好ましい濃度は、０．１〜３％である。
使用方法
上記を考慮して、本発明は、本発明のジアゼニウムジオレートを使用する方法を提供する。１つの実施態様において、一酸化窒素によって治療可能な生物学的障害を有する動物（例えば、哺乳動物）を治療する方法が提供される。この方法は、動物における生物学的障害を治療するのに十分量の、本発明によるジアゼニウムジオレートを動物（例えば、哺乳動物）に投与することを含む。本実施態様において、「生物学的障害」は、一酸化窒素で治療可能な障害である限り、遺伝的欠陥または感染因子（例えば、ウィルス、バクテリアまたは寄生生物）による感染に起因する生物学的障害を含む、どの生物学的障害でもよい。
使用方法の別の実施態様において、例えば、ウィルス、バクテリアまたは寄生生物（例えば、ライシュマニア属）による感染のために、動物（例えば、哺乳動物）を治療するための方法が提供される。この方法は、動物における感染を治療するのに十分量のジアゼニウムジオレートを動物（例えば、哺乳動物）に投与することを含む。
本発明の本実施態様の１つの局面において、例えば、ウィルス（例えば、レトロウィルス、特にＨＩＶ、より特にＨＩＶ−１）、バクテリア（例えば、グラム陽性菌）または寄生生物（例えば、ギアルディア（Giardia）属）（これらのどれも、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートにより不活性化され得るジンクフィンガータンパクを含む）による感染のために、動物（例えば、哺乳動物）を治療する方法が提供される。「ジンクフィンガータンパク」は、システイン類単独またはシステインおよびヒスチジンリガンド類を含む短いアミノ酸ドメインを含むタンパクを意味し、これらの両方は亜鉛と配位結合して核酸と相互作用する（SouthおよびSummers、「ジンクフィンガー」（”Zinc Fingers,”）Chapter 7,In：Adv.Inorg.Biochem.Ser.8,pp.199-248（1990）、そこで引用されている全ての文献の内容を含めて、言及によって完全にここに組み込まれる。）。「不活性化された」とは、不活性化されるジンクフィンガータンパクの活性が部分的または完全に消失することを意味する。このような不活性化は、それ自身、動物の健康および良好な生活状態を過度に危険にさらすような程度までに、動物の生物学的に重要なジンクフィンガータンパクの不活性化をもたらすべきではない。この方法は、動物における感染を治療するように、上記感染因子中のジンクフィンガータンパクを不活性化するのに十分量の、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートを動物（例えば、哺乳動物）に投与することを含む。
上記方法はまた、ウィルス（例えば、タバコストリークウィルス（ＴＳＶ）またはアルファルファモザイクウィルス（ＡＩＭＶ））のような感染因子による感染に対して、植物、植物細胞またはその培養組織を治療する手段として適用され得る（上記SouthおよびSummers（1990）；およびSehnkeら、Virology 168：48（1989））。
ここに記述する方法は、Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ４−Ｈ−Ｘ４−Ｃモチーフ（ここで「Ｃ」はシステインを表し、「Ｈ」はヒスチジンを表し、「Ｘ」は任意のアミノ酸を表し、そして「２」および「４」は、「Ｘ」アミノ酸の数を表す）（例えば、Wain-Hobsonら、Cell 40（1）：9-17（1985）参照）を含むジンクフィンガーに対して有用である。このようなモチーフは、レトロウィルス、特にレトロウィルスのｇａｇタンパク（gag protein）を特徴付けるものである。従って、ここの方法は、レトロウィルス、例えばＨＩＶ、特にＨＩＶ−１（これらは、２つの亜鉛結合ドメインを含むヌクレオキャプシドｐ７タンパク（ＮＣｐ７タンパク）を含む）（Riceら、Nature Medicine 3（3）：341-345（1997）；およびRiceら、Reviews in Medical Virology 6：187−199（1986））に対して有用である。実際のおよび／または潜在的なジンクフィンガーもまた、とりわけ、アデノウィルスのＥＩＡゲノム領域の遺伝子産物、シモンウィルス４０（ＳＶ４０）およびポリオーマウィルス由来のラージＴ抗原、大腸菌（E.coli）におけるＵｖｒＡタンパク（Culpら、PNAS USA 85：6450（1988））、マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ−Ｆ；Greenら、PNAS USA 86：4047（1989））、およびバクテリオファージＴ４由来の遺伝子３２タンパク（Ｇ３２Ｐ）（Giedrocら、Biochemistry 28：2410（1989））のようなバクテリオファージタンパク（Berg、Science 232：484（1986））において同定されている。このようなタンパクは、当該分野で公知の方法（上記SouthおよびSummers（1990）に引用されている文献参照）に従って単離することができ、そしてこのようなジンクフィンガータンパクを不活性化し得るＯ²−アリールジアゼニウムジオレート類は、例えば、ここに記載のジンクフィンガーアッセイおよびRiceらのJ.Med.Chem.39：3606-3616（1996）の記載に従って同定することができる。
４または５のシステイン類を含むモチーフを有するジンクフィンガーを含むステロイドホルモンレセプターに限り、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートは、動物（例えば、哺乳動物）におけるステロイドホルモン活性を調整するために使用され得る。従って、本発明はまた、ステロイドホルモン活性の調整が必要で、かつＯ²−アリールジアゼニウムジオレートにより不活性化され得るジンクフィンガーを含むステロイドホルモンレセプタータンパクを含む動物（例えば、哺乳動物）において、ステロイドホルモン活性を調整する方法を提供する。この方法は、動物におけるステロイドホルモン活性を調整するように、ステロイドホルモンレセプタータンパクを不活性化するのに十分量の、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートを動物（例えば、哺乳動物）に投与することを含む。
さらに別の実施態様において、癌およびその転移のために、動物（例えば、哺乳動物）を治療する方法が提供される。この方法は、動物における癌の増殖または転移を予防するのに十分量のジアゼニウムジオレートを動物（例えば、哺乳動物）に投与することを含む。
本実施態様の１つの局面において、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートにより不活性化され得るジンクフィンガータンパクの活性に、少なくとも部分的に、直接的または間接的に起因する癌のために、動物（例えば、哺乳動物）を治療する方法が提供される。この方法は、動物における癌を治療するように（Riceら、PNAS 89：7703-7707（1992））、すなわち、動物における癌の増殖または転移を予防するように、ジンクフィンガータンパクを不活性化するのに十分量の、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートを動物（例えば、哺乳動物）に投与することを含む。
さらになお別の実施態様において、例えば、化学療法剤の活性に悪影響を与える酵素の作用に起因して、化学療法剤（例えば、Kelley et al.、Biochem.J.304：843-848（1994）を参照）、特にＤＮＡ損傷化剤（DNA damaging agent）（例えば、アルキル化剤または酸化剤）による治療に耐性である癌のために、動物（例えば、哺乳動物）を治療する方法が提供される。この方法は、動物における癌を化学療法剤による治療に影響されやすくするのに十分量の、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートを動物（例えば、哺乳動物）に投与することを含む。従って、このような方法は、必要に応じて化学療法に対する付加療法として使用され得る。
例えば、ある特定のＯ²−アリールジアゼニウムジオレート類は、グルタチオンＳ−転移酵素、特にアイソザイムπ（例えば、Jiら、Biochemistry 32（49）：12949-12954（1993）；およびJiら、Biochemistry 36：9690-9702（1997）参照）の活性部位に適合するように合成され得る。従って、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートを用いた、この化合物とグルタチオンとの酵素結合による、グルタチオンＳ−転移酵素πの活性部位からのグルタチオンの可逆的な消費は、この酵素が、種々の生体異物化合物（例えば、化学療法剤、特にアルキル化剤（例えば、クロラムブシル、メルファランおよびヘプスルファム（hepsulfam））および他のＤＮＡ損傷化剤（例えば、求電子性攻撃または酸化を誘導する薬剤））を解毒するのを防止し得る（例えば、Morganら、Cancer Chemother.Phamacol.37：363−370（1996）参照）。本方法はまた、インビトロにおいて、薬物耐性癌細胞株をスクリーニングするために適用可能である。
別の実施態様において、潜在的感染性のウィルス、バクテリアまたは寄生生物の存在のための、無生命体を処理する方法が提供される。この方法は、潜在的感染性のウィルス、バクテリアまたは寄生生物の存在を低減させるのに十分量の、本発明のジアゼニウムジオレートを無生命体に接触させることを含む。「潜在的感染性」は、動物（例えば、哺乳動物）を感染させる能力を意味する。
本実施態様の１つの局面において、無生命体上の、潜在的感染因子（例えばウィルス、バクテリアまたは寄生生物）（これらのどれも、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートにより不活性化され得るジンクフィンガータンパクを含む）の存在を低減させる方法が提供される。この方法は、無生命体上の、潜在的感染因子（例えば、ウィルス、バクテリアまたは寄生生物）の存在を低減するように、ジンクフィンガータンパクを不活性化するのに十分量の、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートを無生命体に接触させることを含む。「潜在的感染性」とは、動物（例えば、哺乳動物）を直接的または間接的に感染させる能力を意味する。
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、もちろん、それらは本発明の範囲を何ら制限するものではない。以下の実施例に関して、ＮＯはMatheson Gas Products（Montgomeryville,PA）より入手し、β−およびα−グリコシダーゼ並びにブタ肝臓エステラーゼはSigma Chemical Co.（St.Louis,MO）より入手し、ポリウレタン（Tecoflex）はThermedics Inc.（Woburn,MA）より入手し、グルコースおよびマンノースはAldrich Chemical Co.（Milwaukee,WI）より入手した。プロトンＮＭＲスペクトルは300MHz Varian Unity PlusまたはVarian XL-200 ＮＭＲ分光計を用いて記録した。スペクトルは共有化合物については重水素化クロロホルム中で、また塩についてはD₂O中で得た。化学シフトはＴＭＳからの低磁場でミリオン（ppm）に対して所々記録した。低分解および高分解質量スペクトル（ＭＳ）測定は、VG-Micromass Model 7070分光計で行った。特に示さなければ、ＭＳデータは、ダイレクトプローブを介して試料導入し、電子衝撃モードで集積した。紫外線（ＵＶ）スペクトルは、水溶液または0.01M NaOH溶液としてHP 8451A Diode Array分光光度計で実施した。グルタチオンＳ−転移酵素のカイネティックスは、Beckman DU 640分光光度計を用いて３８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の変化を測定することによりモニタリングした。化学発光測定はThermal Energy Analyzer Model 502A装置（Thermedics,Inc.,Woburn,MA）で実施した。元素分析はAtlantic Microlab Inc.が行った。
実施例１
本実施例ではＯ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製について説明する。
5%重炭酸ナトリウム水溶液20ml中のナトリウムジエチルアミノジアゼニウムジオレート1.67g（11mmol）の溶液を窒素下０℃に冷却し、ｔ−ブチルアルコール10ml中の２，４−ジニトロフルオロベンゼン1.3ml（0.01mol）の溶液をゆっくりと加えた。添加時に沈殿物が形成された。該混合物を放置して室温まで徐々に温め、次いで一晩攪拌した。生成物をジクロロメタンで抽出した後、冷希塩酸次いで重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸マグネシウム層を通して濾過し、真空下で溶媒を留去して赤色オイル状物1.3gを得、これを静置して結晶化した。エタノールからの再結晶化により黄橙色針状物を得た：融点76-7℃；NMRδ1.25（t,6H）,3.58（q,4H）,7.68（d,1H）,8.44（m,2H）,8.89（m,1H）；UV（エタノール）λ_max（ε）218（17.4mM^-1cm^1-）および302（15.6mM^-1cm^-1）nm；MS,正確な質量：C₁₀H₁₃N₅O₆としての計算値（M+）299.0865；実測値M+ 299.08658；C,H,N分析：C₁₀H₁₃N₅O₆としての計算値：C 40.13%,H 4.35%,N 23.41%；実測値：C 40.21%,H 4.43%,N 23.37%。
実施例２
本実施例では、アニオン性ジアゼニウムジオレートの、そのＯ²−アリール置換体（Ｏ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート）からの再生について説明する。
実施例１のように調製したＯ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート85mg（0.28mmol）のエーテル1ml中の溶液を-4℃に冷却し、ジエチルアミン1mlで処理した。該溶液を1時間-4℃に保ち、沈澱物を得た。該固体を濾取した。濾液を濃縮してＮＭＲで分析したところ、残渣は２，４−ジニトロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンの真正なサンプルと同一であることがわかった。沈澱物を石油エーテルで洗浄し、N₂下で乾燥させて、λ_max250nm；NMR（D₂O）δ0.96（t,6H）,1.28（t,6H）,2.94（q,4H）,3.08（q,4H）を有する生成物5.4mgを得た。この生成物はジエチルアンモニウム１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの真正なサンプルと同一であることがわかった。
実施例３
本実施例では、ナトリウムメトキシドにより仲介される、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートのＯ²−アリール結合の化学的開裂について説明する。
エーテル1ml中のＯ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート16mg（0.064mmol）の溶液を、メタノール0.14mmol中の25%ナトリウムメトキシド29μlで処理し、-4℃で2時間静置した。固体を濾取し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥して、１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートナトリウム塩の真正なサンプルと同一の固体4mgを得た。
実施例４
本実施例では、メタノール中での、Ｏ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートとナトリウムメトキシドとの反応のカイネティックスについて説明する。この反応のカイネティックスは、アルカリ性または求核性環境下における、Ｏ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートイオンへの変換速度を示す。
過剰のNaOMeを反応に使用した。アリコートを間隔をあけて回収し、メタノール中の0.1N HClで反応を止めた。Ｏ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの消失をＨＰＬＣによりモニタリングしたところ、一次反応速度式に合致することがわかった。このことは、４つの異なる濃度のNaOMeにおけるk_obs’を見出すために、ｌｏｇ［Ｏ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート］を時間に対してプロットすることにより決定した。同様に、二次速度定数（7.87M^-1min^-1）を、log k_obsをlog［NaOMe］に対してプロットすることにより決定した。
実施例５
本実施例ではＯ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ−イソプロピルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製について説明する。
5%重炭酸ナトリウム1ml中のナトリウム１−（Ｎ−イソプロピルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート84mg（0.597mmol）の溶液を0℃に冷却し、２，４−ジニトロフルオロベンゼン69mg（0.55mmol）を加えた。氷浴を除き、混合物を室温で一晩攪拌し、次いで混合物をジクロロメタンで抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過および真空下で溶媒留去してフィルム状物86mgを得、それを静置して結晶化させた：融点92-93℃；NMRδ1.39（d,6H）,3.99（septet,1H）,6.93（d,1H）,8.27（dd,1H）,8.5（b,1H）,9.15（d,1H）。
実施例６
本実施例では、ピロリジニウム１−［ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの合成について説明する。
エーテル50mlおよびアセトニトリル25ml中のピロリジン36g（0.507mol）の溶液を500ml Parrビン中に入れ、脱気して40psiの一酸化窒素を充填した。該反応器を-80℃に冷却した。圧力は40psiに維持した。４時間後、圧力を緩めて結晶性生成物をフリット化ガラス漏斗中で濾取し、次いで窒素雰囲気下、冷エーテルで洗浄した。該材料を真空デシケーター中、1mm Hgおよび25℃で３時間乾燥させ、白色針状物23g（45%）を得た：融点68-70℃。C,H,N分析：C₈H₁₈N₄O₂としての計算値：C 47.51%,H 8.97%,N 27.70%；実測値：C 47.62%,H 9.04%,N 27.46%。
後続のＯ²−アリール化のために、カチオン交換を促進する10N NaOH処理によりピロリジニウム塩をより安定なナトリウム塩に変換した。次いでそれに多量のエーテルで満たし、生成物を濾取した。
実施例７
本実施例では、実施例６で示した１−（ピロリジン−１−イル）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオールのナトリウム塩の調製の別法を提供する。
アセトニトリル100mlおよびエーテル100ml中のピロリジン28.2g（0.397mol）の溶液を、メタノール中の25%ナトリウムメトキシド94ml（0.4mol）と混合した。得られた溶液に窒素を大量に流し、次いで40psiのＮＯを充填して室温で２日間攪拌すると、濁った沈殿物を形成した（この沈殿物はＮＯに曝露してから１時間以内に形成し始めた。）。圧力を緩めて生成物を濾取した。該生成物をエーテルで洗浄し、真空乾燥させて白色粉末32.1g（54%）を得た：UV（0.01N NaOH）λ_max（ε）,252nm（8.84mM^-1cm^-1,）；t_1/2 25℃で8.5秒および37℃で2.8秒（リン酸緩衝液pH7.4中）；NMR（D₂O）δ1.91（m,4H）,3.22（m,4H）。
実施例８
本実施例では、Ｏ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（ピロリジン−１−イル）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製について説明する。
5%重炭酸ナトリウム水溶液10ml中のナトリウム１−（ピロリジン−１−イル）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート556mg（3.63mmol）の溶液を０℃に冷却した。ｔ−ブチルアルコール2ml中の２，４−ジニトロフルオロベンゼン456μl（3.63mmol）の溶液を加え、得られた混合物を室温で一晩攪拌した。黄橙色沈殿物を濾取し、水洗、乾燥して758mgの生成物を得、これをエタノールより再結晶化させた：融点94-95℃；NMR,δ2.04（m,4H）,3.35（m,4H）,6.90（d,1H）,8.20（dd,1H）,8.67（d,1H）；MS,m/z（%）,297（M⁺,1）,220（100）,237（30）,190（94）,180（15）,162（10）,149（26）,130（20）,100（95）,70（24）,63（35）,56（18）；正確な質量：C₁₀H₁₁N₅O₆としての計算値（M⁺）297.0708；実測値297.0709。
実施例９
本実施例では、ナトリウム１−［（４−エトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製について説明する。
メタノール60ml中のＮ−カルボエトキシピペラジン20g（0.126mol）の溶液をParrビンに入れた。該溶液をメタノール中の25%ナトリウムメトキシド溶液27.4ml（0.126mol）で処理した。この系を脱気し、40psiの一酸化窒素を充填して25℃で48時間保った。白色の結晶性生成物を濾取し、冷メタノールおよび大量のエーテルで洗浄した。該生成物を真空乾燥して収量14.5g（48%）のナトリウム１−［（４−エトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートを得た：融点184-5℃；UV（0.01N NaOH）λ_max（ε）252nm（10.4mM^-1cm^-1）；NMR（D₂O）δ1.25（t,3H），2.15（q,2H）,3.11（m,4H）,3.68（m,4H）。分析：C₆H₁₃N₄O₄Naとしての計算値：C 35.00%,H 5.42%,N 23.33%,Na 9.58%；実測値：C 34.87%,H 5.53%,N 23.26%,Na 9.69%。
この化合物のpH7および25℃での半減期は５分と評価された。この測定は、紫外スペクトルにおける252nmの発色団の消失に基づいた。
実施例１０
本実施例では、Ｏ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−［（４−エトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製について説明する。
5%重炭酸ナトリウム10ml中のナトリウム１−［（４−エトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート1.073g（0.0045mol）の溶液を窒素下０℃に冷却した。ｔ−ブチルアルコール10ml中の２，４−ジニトロフルオロベンゼン0.89ml（0.0044mol）の溶液の一部を加えた。添加時に沈殿物が生じた。該混合物を室温で４時間攪拌した。生成物をジクロロメタンで抽出した。該抽出物を水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥させて無水硫酸マグネシウム層を通して濾過した。溶媒を留去して橙色ガラス状物を得、静置して結晶化させた。該生成物をエタノール：ジクロロメタンより再結晶化させて1.3g（76%）の分析上純粋な物質を得た：融点140-141℃；NMRδ1.32（t,3H）,3.63（m,4H）,3.74（m,4H）,4.19（q,2H）,7.66（d,1H）,8.48（q,1H）,8.88（d,1H）；UV（H₂O）λ_max（ε）210nm（13.3mM^-1cm^-1）,300nm（12mM^-1cm^-1）。分析：C₁₃H₁₆N₆O₈としての計算値C 40.61%,H 4.20%,N 21.87%；実測値：C 40.74%,H 4.13%,N 21.98%。
実施例１１
本実施例では、Ｏ²−（２−クロロピリミジン−４−イル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製について説明する。
ジメチルスルホキシド2mlおよびテトラヒドロフラン5ml中の２，４−ジクロロピリミジン600mg（4mmol）の溶液を、窒素下、室温で、シリンジにより、テトラヒドロフラン5ml中のナトリウム１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート678mg（4.37mmol）のスラリーに加え、得られた混合物を72時間攪拌した。該混合物にエーテル5mlを加えた。水洗後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、硫酸マグネシウム層を通して濾過し、溶媒を留去して679mgのオイル状物を得、それを-20℃で結晶化させた。この物質をエーテル−石油エーテルより再結晶化させた：融点37-38℃；NMRδ1.25（t,6H）,3.56（q,4H）,7.00（d,lH）,8.50（d,lH）；UV,λ_max（ε）268nm（9.3mM^-1cm^-1）。C,H,N分析：C₈H₁₂N₅O₂Clとしての計算値：C 39.11%,H 4.92%,N 28.51%,Cl 14.43%；実測値：C 38.96%,H 4.96%,N 28.35%,Cl 14.60%。
実施例１２
本実施例では、Ｏ²−（２−クロロピリミジン−１−イル）１−［（４−エトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製について説明する。
ジメチルスルホキシド3ml中の２，４−ジクロロピリミジン262mg（1.76mmol）の溶液を、窒素下、室温で、テトラヒドロフラン10ml中のナトリウム１−［（４−エトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート424mg（1.76mmol）のスラリーに加え、72時間攪拌した。得られた均質な溶液を水100mlで処理した。沈殿物を濾取し、真空乾燥して300mgの生成物を得た：融点136-137℃；NMRδ1.29（t,3H）,3.69（m,4H）,3.71（m,4H）,4.18（q,2H）,6.99（d,1H）,8.52（d,1H）；（UV）λ_max（ε）270nm（4.1mM^-1cm^-1）。
この化合物は、メトキシドを用いた求核性置換により、Ｃ２位の塩素原子とＣ４位のジアゼニウムジオレートが置換されて、２，４−ジメトキシピリミジンとなる。
実施例１３
本実施例では下記の化合物の合成について記載する。

化合物１ないし５の一般的合成：ジメチルスルホキシド中のナトリウム１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの1M溶液を窒素下５℃で攪拌した。0.95モル当量のアリール化剤含有テトラヒドロフラン1M溶液をセプタム（septum）を通してインジェクションした。反応混合物を室温まで温め、一晩攪拌し、氷水で反応を止めてエーテル抽出した。該エーテルを水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸マグネシウム層を通して濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。精製方法は各々の調製で変更したが、それについては下記の個々の化合物とともに記述する（注：化合物１ないし５は、並行して液相合成法を用いて構築したＯ²−アリール化合物ライブラリーより選ばれた生成物である）。ＮＭＲスペクトルはCDCl₃中で測定した。
Ｏ²−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート，１：４−フルオロ−３−ニトロベンゾトリフルオライドを用いてアリール化した。該生成物の精製は、１inchのC-18カラムを用い、20%アセトニトリル水溶液から50%アセトニトリル：50%水までの溶媒グラジェントで溶出する分取用ＨＰＬＣにて行った。収量42%の生成物をオイル状物として得た：NMRδ1.23（t,6H）,3.50（q,4H）,7.66（d,1H）,7.82（d,1H）,8.28（s,1H）。
Ｏ²−（２−ニトロ−４−カルボキシラトフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート，２：この調製では４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸を用いた。該生成物の精製は、4.0 x 15.0cm KP-Silカラムを用いてBiotage Flash 40系にて行った。この系を、5：1のジクロロメタン：酢酸エチルを用い、15psiの気圧をかけて25ml/minの溶出速度で溶出し、収率22%で生成物を得た：融点115-6℃；NMRδ1.22（t,6H）,3.33（q,4H）,7.06（d,1H）,8.03（dd,1H）,8.37（m,1H）。
Ｏ²−（５−ニトロピリジン−２−イル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート，３：２−ブロモ−５−ニトロピリジンとの反応生成物をエーテル：エタノールより再結晶化させて純粋な３を収率62%で得た：融点77-8℃；NMRδ1.24（t,6H）,3.53（q,4H）,7.21（dd,1H）,8.52（dd,1H）,9.17（dd,1H）。C,H,N分析：C₉H₁₃N₅O₄としての計算値：C 42.35%,H 5.13%,N 27.44%；実測値：C 42.46%,H 5.14%,N 27.52%。
Ｏ²−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート，４：２−クロロ−３，５−ジニトロピリジンを用い、一般的手順に記述のようにアニール化（Anylation）した。粗生成物をエーテル：石油エーテルより再結晶化させて４を収率33%で得た：融点56-7℃；NMRδ1.28（t 6H）,3.57（q,4H）,8.81（d,1H）,9.10（d,1H）。
Ｏ²−（３−ニトロピリジン−２−イル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート，５：２−クロロ−３−ニトロピリジンをこの反応に使用した。100%ジクロロメタンで溶出する4.0 x 7.0cm KP-Silカラムを用いたFlash 40システムで粗生成物を精製し、収率52%で生成物を粘性のオイル状物として得た：NMRδ1.25（t,6H）,3.55（q,4H）,7.26（m,1H）,8.48（m,2H）。
実施例１４
本実施例では、Ｏ²−ビニル１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（Ｖ−ＰＲＯＬＩ／ＮＯ）の調製について説明する。
Ｏ²−（２−ブロモエチル）１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート ２−ブロモエチルエステル3.56g（9.2mmol）に10N水酸化ナトリウム溶液10mlを加えた。
該二相混合物を25℃で攪拌すると、該化合物は徐々に水層に溶解した。一晩攪拌後、反応混合物のＵＶは、266nmで最大吸収を示し（出発材料は252nmで吸収した）、ビニル基の形成が示された。
溶液を０℃に冷却し、10%塩酸をゆっくり添加してpH4まで注意深く酸性にした。酸を添加する間、溶液を保冷し続けるよう注意を払わねばならない。該酸性溶液を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸マグネシウム層を通して濾過した。溶媒を留去して1.4gのオイル状物を得た。4.0 x 7.0cm KP-Silカラムおよび溶出液として2：1の酢酸エチル：シクロヘキサンを用いたFlash 40システムで精製を行った：ir（film）3163,2987,1734,1630,1490cm^-1；NMR（CDCl₃）δ2.06-2.3（m,4H）,3.62（m,2H）,4.47（q,1H）,4.77（ABq,1H）,5.02（ABq,1H）,6.75（q,1H）；UVλ_max（ε）266nm（6.3mM^-1cm^-1）；MS,m/z（%）201（M⁺,5）,176（10）,150（49）,145（27）,114（9）,99（45）,70（99.9）,69（57）,68（45）。
実施例１５
本実施例では、グルタチオンの存在下ではＯ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートからＮＯが再生するが、非存在下では再生しないことを説明する。
1mMグルタチオン（GSH）含有10mMリン酸緩衝液をアルゴンで10分間で浄化して脱気した後、アリコート3mlをＯ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート2mMのジオキサン溶液3μlとを混合した。該混合物を37℃に保ちながらＮＯの放出を化学発光によりモニタリングした。短いラグタイムの後、反応開始約15分後に一酸化窒素発生のピークが観察され、約100分間容易に検出可能なレベルが続いた。最初の112分間の総ＮＯ発生量は約9nmolであった。Ｏ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート1molあたり2nmolのＮＯが発生すると仮定すると、この9nmolは、理論的収量のおよそ75%に相当する。
GSHを除く以外は上記のようにして反応を繰り返すと、ＮＯの発生は観察されなかった。求核性のグルタチオンがＯ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートと反応して下記式にしたがってＮＯを生成した。

本実施例は、本発明のＯ²−アリールジアゼニウムジオレート化合物の幾つかが、酵素の活性部位においてしばしば見られる、システインのようなアミノ酸の求核性側鎖によって求核置換され得ることを示している。このような求核置換の結果、予測できる一次反応を介して、アミノ酸残基とＮＯを生成し得るジアゼニウムジオレートが置換されたアリール誘導体が発生する。
Ｏ²−（２，４−ジニトロフェニル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートとグルタチオンを、グルタチオンＳ−転移酵素の存在下および非存在下でアッセイした。アッセイは、25℃に温度制御されたセル隔壁（cell compartment）中で、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）を用いて最終容量3mlで行った。酵素濃度は0.7μg/ml、一方グルタチオン濃度は1.4mMであった。ジアゼニウムジオレート濃度は50-100μMで変化させた。Henri-Michaelis-Menten式の積分型を用いると、Ｋ_mは46.3μMであり、Ｖ_maxは0.89μMmin^-1であることがわかった。
実施例１６
本実施例では、ジアゼニウムジオール化したヌクレオチド類、ヌクレオシド類および核酸類の製造に有用な合成経路について説明し、さらに、アミノ基をジアゾニウム基に変換した後、ジアゾニウム基をジアゼニウムジオレートと反応させることを含む、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート類の合成経路について説明する。
２’−デオキシシチジンを、シチジンのアミノ基をジアゾニウム基に結果的に変換する適当な１電子酸化剤の存在下で、一酸化窒素と反応させる（該変換により該酸化剤は還元され、水酸化物イオンが生成される）。次いで、得られるジアゾ化（すなわちジアゾニウム誘導体）ピリミジンを、前記実施例で記載したように、１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートイオンと反応させて、ジアゼニウムジオレート２’−デオキシウリジン誘導体を生ずる。このジアゼニウムジオレート２’−デオキシウリジン誘導体は強力な求核剤（例えば、水酸化物イオン）と反応することができる。この結果、１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートイオンと２’−デオキシウリジンが再生するだろう。この再生した１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートイオンは、予測できる一次反応によりＮＯを発生するだろう。本実施例は、哺乳動物の特定の生体部位に一酸化窒素をターゲッティングし、ＮＯ作用の特異性を増大させ得るのに適当なメカニズムの原理を実証するものである。
実施例１７
本実施例では、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレートが亜鉛の放出によってジンクフィンガータンパクを不活性化し得ることを実証する。
ＨＩＶ−１（L.O.Arthur,AIDS Vaccine Program,NCI-FCRDC,Frederick,MD）由来の組換えヌクレオキャプシドタンパクp7（p7NC）のサンプルを10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH=7.0）中でμg/mlで調製し、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート25μmol（全量1.0ml中）で処理した。時間（分）に対するTrp37の蛍光（RFU）のグラフである図１に示すように、種々の時間間隔で、どんな人口的なクエンチ効果の導入も防ぐために、該サンプルを10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH=7.0）に1/10希釈し、各サンプル中のp7NCのＣ末端ジンクフィンガー中のトリプトファン残基（Trp37）の蛍光強度を以前に記載されているようにして測定した（Riceら，Int.Antiviral News 3：87-89（1995））。Shimadzu RF5000蛍光分光計で利用した励起および放出波長は、それぞれ280および351nmであった。結果を図１に示す。図中、○はネガティブコントロール、すなわち薬剤なしを表し、□はポジティブコントロール、すなわち642151（Riceら（1997），上述を参照）を表し、■は実施例１の化合物（LK1）を表し、◆は実施例８の化合物（LK2）を表し、▲は実施例５の化合物（Lk3）を表し、●は実施例１０の化合物（Lk4）を表し、×は実施例１１（LK5）の化合物を表す。結果はＯ²−アリールジアゼニウムジオレートがジンクフィンガータンパクから亜鉛を放出し得ることを示している。
実施例１８
本実施例ではＯ²−アリールジアゼニウムジオレートの抗ＨＩＶ活性を実証する。
CEM-SSと呼ばれるＴ４リンパ球の癌細胞株を胎仔ウシ血清含有合成培地（Riceら，Advances in Pharmacol.33：389-438（1995））中で増殖させた。国立癌研究所（National Cancer Institute）のＸＴＴに基づく細胞生存性アッセイ（例えば、Riceら（1995），上述を参照）に従って、Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート類をＨＩＶ−１感染および非感染CEM-SS細胞に10^-3.5〜10^-7.0Ｍの濃度範囲で投与した。
CEM-SS細胞を化合物に曝露した後、Ｔ細胞生存のパーセントを調べた。やや毒性のある濃度の上記Ｏ²−アリールジアゼニウムジオレート類のいずれかと接触させたＨＩＶ−１感染CEM-SS細胞も、非処理細胞に比べて生存性が実質的に増大した。実施例１３からの化合物１〜３が特に有効であった。
実施例１９
本実施例は、ジナトリウム１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製について記載する。
25%ナトリウムメトキシド（メタノール中）39ml（0.18mol）、メタノール20mlおよびエーテル40ml中のＬ−プロリン10g（0.087mol）の溶液を脱気して、40psiの一酸化窒素に20時間曝露した。圧力を緩めて固形残渣を濾取し、エーテルで洗浄し、真空乾燥して白色固体17gを得た：融点250℃（分解）；UV（0.01N NaOH）λ_max（ε）252nm（8.4mM^-1cm^-1）；NMR（D₂O）δ1.71（m,1H）,1.91（m,2H）,2.27（m,1H）,3.27-3.43（m,2H）,4.04（m,1H）（3.34におけるメタノールの一重線も観察される）；¹³C NMR,24.45ppm,30.97,48.73（methanol）,54.95,67.70,182.75。
C,H,N分析：C₅H₇N₃O₄Na₂・CH₃OHとしての計算値：C 28.69%,H 4.41%,N 16.73%,Na 18.30%；実測値：C 28.65%,H 3.99%,N 16.74%,Na 18.04%。
実施例２０
本実施例では、Ｏ²−メチル１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートメチルエステルの調製について記載する。
ジナトリウム１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（メタノール溶媒和物，FW 251；6.8g；0.027mol）を300ml ３首フラスコに入れて-20℃に冷却した。冷メタノール（-20℃；200ml）を攪拌しながら該固体に加えて均一溶液を得、それをさらに-35℃に冷却した。エーテル25ml中のジメチル硫酸9.5ml（0.1mol）の溶液を15分間かけて滴下した。次いで、反応混合物を室温まで徐々に温め、さらに４時間攪拌した。反応の進行を、展開液として10：1のジクロロメタン：エーテルを用いたシリカゲルＴＬＣでモニタリングした。反応混合物を濾過し、ロータリーエバポレーターでメタノールを除去し、残渣をジクロロメタンで抽出した。該溶液を重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸マグネシウム層を通して濾過した。溶媒を留去してオイル状物を得、それを静置して結晶化させた。エーテル：石油エーテルより再結晶化させて、分析上純粋なサンプル945mg（18%）を得た：融点62-63℃；UV（0.01N NaOH）,λ_max（ε）252nm（6.79mM^-1cm^-1）；NMRδ2.05（m,3H）,2.30（m,1H）,3.65（m,1H）,3.75（s,3H）,3.83（m,1H）,3.96（s,3H）,4.55（m,1H）；MS m/z（%）203（M⁺,6）,188（20）,58（35）,120（22）,99（100）,95（34）,69（36）,59（24）；C₇H₁₃N₃O₄として計算される正確な質量（M⁺）203.0906,実測値（M⁺）203.0906。
C,H,N分析：C₇H₁₃N₃O₄としての計算値C 41.38%,H 6.45%,N 20.68%：実測値C 41.48%,H 6.43%,N 20.59%。
実施例２１
本実施例では、Ｏ²−（Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル）１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製について記載する。
テトラヒドロフラン5ml中のＮ，Ｎ−ジメチル−スルファモイルクロリド1.08ml（0.01mol）の溶液を、0.1N NaOH（食塩水中）25ml中のジナトリウム１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート1.57g（0.0062mol）の冷（０℃）溶液に加えた。反応混合物を室温まで温め、一晩攪拌した。水層をジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出後、水層は有意なＵＶ吸収を示さず、したがって抽出物にはジアゼニウムジオレートがないことが示された。有機層を硫酸マグネシウム層を通して濾過し、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去して淡黄色オイル状物989mgを得、これを5：1のジクロロメタン：酢酸エチルを溶出液としてシリカゲルクロマトグラフィー処理した。所望の生成物を含む画分をあわせて真空下で濃縮して固体を得、エーテル：石油エーテルより再結晶化させた：融点97-98℃；UV（0.01N NaOH）λ_max（ε）266nm（8.05mM^-1cm^-1）；NMRδ2.16（m,3H）,2.40（m,1H）,3.01（s,6H）,3.83（m,1H）,3.94（m,1H）,4.69（q,1H）,6.80（b,1H）。
C,H,N,S分析：C₇H₁₄N₄SO₆としての計算値：C 29.79%,H 5.00%,N 19.85%,S 11.36%：実測値C 29.93%,H 5.09%,N 19.76%,S 11.27%。
実施例２２
本実施例ではＯ²−メトキシメチル１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートメトキシメチルエステルの調製について記載する。
無水テトラヒドロフラン20ml中ジナトリウム１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート485mg（1.93mmol）のスラリーを窒素雰囲気下０℃に冷却した。トリエチルアミン（0.5ml）を該冷溶液に加えた後、クロロメチルメチルエーテル360mg（4.45mmol）をゆっくりと加え、続いてメタノール0.5mlを滴下した。次いで該溶液を冷却しながら1.5時間攪拌した。反応混合物を室温まで温め、窒素下でさらに1.5時間攪拌した。砕いた氷で反応を止めた後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、残渣をジクロロメタンで抽出した。有機層を水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを通して濾過および真空下で溶媒留去して、黄色オイル状物330mgを得、これを5：1のジクロロメタン：酢酸エチルを溶出液としてシリカゲルカラムで精製した：UV（H₂O）λ_max（ε）250nm（8.58mM^-1cm^-1）；NMRδ2.09（m,3H）,2.35（m,1H）,3.48（s,H）,3.71（m,2H）,3.90（m,1H）,4.61（dd,1H）,5.17（ab q,2H）,5.31（ab q,2H）。
C,H,N分析：C₉H₁₇N₃O₆としての計算値：C 41.06%,H 6.51%,N 15.96%：実測値C 40.87%,H 6.53%,N 15.76%。
実施例２３
本実施例では、Ｏ²−（２−ブロモエチル）１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート２−ブロモエチルエステルの調製について記載する。
ジクロロメタン50ml中のブロモエタノール20ml（0.28mol）の溶液を０℃に冷却し、該溶液に、ジクロロメタン50ml中のスルフリルクロリド11.25ml（0.28mol）の溶液を滴加した。得られた溶液を72時間４℃に保った。洗浄液が試験の結果はっきりと塩基性となるまで、該溶液を冷10% NaOHで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸マグネシウム層を通して濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた粗生成物（２−ブロモエトキシスルホニルクロリド，BrCH₂CH₂OSO₂Cl）を真空蒸留して無色オイル状物35g（56%）を得た：沸点（1.5mmHgで）73-75℃；NMRδ3.64（t,2H）,4.752（t,2H）；MS m/z（%）221（M⁺,1）,143（10）,129（25）,106（100）,93（62）。C,H,N,S,X分析：C₂H₄SO₃ClBrとしての計算値：C 10.75%,H 1.80%,S 14.35%,全ハロゲンをBrとして71.52%およびClとして31.72%；実測値：C 10.82% H 1.80%,S 14.35%,全ハロゲンをBrとして71.63%およびClとして31.78%。
ジナトリウム１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（4.86g；0.0194mol）を、無水炭酸ナトリウム2.2gとともに100ml丸底フラスコに入れた。該フラスコをドライアイス−アセトニトリル浴（-40℃）中に浸漬し、冷（-20℃）エタノール50mlを加えた。次いで、混合物を攪拌し、窒素雰囲気下-40℃に安定化した。該冷スラリーに、２−ブロモエトキシスルホニルクロリド9.45g（0.0422mol）をシリンジにより10分間かけて添加した。２時間攪拌後、反応混合物を15℃まで温め、さらに２時間攪拌した。反応混合物を氷水250ml中に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を亜硫酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸マグネシウム層を通して濾過した後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。粗生成物を1：1のシクロヘキサン：酢酸エチルを溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、黄色オイル状物2.7g（36%）を得た：NMRδ2.11（m,3H）,2.35（m,1H）,3.55（m,4H）,3.68（m,1H）,3.86（m,1H）,4.46（m,4H）,4.59（m,1H）；UV（H²O）λ_max（ε）252nm（6.6mM^-1cm^-1）。
実施例２４
本実施例では、Ｏ²−［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］エステルの調製について記載する。
１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ、1.03g；0.0068mol）を、テトラヒドロフラン35ml中のＯ²−（２−ブロモエチル）１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート２−ブロモエチルエステル1.33g（0.0034mol）の溶液に加え、得られた溶液を窒素下、室温で攪拌した。２当量のチオール酢酸（0.479ml,0.0068mol）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。該混合物を濾過し、固形残渣をエーテルで洗浄した。濾液を溶媒留去して減圧乾燥し、残渣を塩化メチレンで抽出した。有機層を水冷した5N HCl、重炭酸ナトリウム水溶液および水で順次洗浄した。該溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸マグネシウム層を通して濾過し、真空下で溶媒留去して黄色オイル状物710mgを得た。クロマトグラフィーはシリカゲルカラムで行い、1：1のシクロヘキサン：酢酸エチルで溶出した：UV（H₂O）λ_max（ε）232nm（7.0mM^-1cm^-1）；NMRδ2.09（m,3H）,2.36（m,1H）,2.38（s,6H）,3.09（m,4H）,3.78（m,2H）,4.27（m,4H）,4.55（m,1H）。
実施例２５
本実施例では、ブタ肝臓エステラーゼの非存在下および存在下での、25℃およびpH7.4における実施例２４で製造した化合物の半減期の測定を記載する。
0.009M Ｏ²−［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート［Ｓ−アセチル−（２−メルカプト−エチル）］エステルのエタノールストック溶液を調製した。この化合物の崩壊を、リン酸緩衝液3ml（pH7.4）およびストック溶液50mlを含む4mlクオーツキュベット中の1.5 x 10^-4M溶液として、25℃でモニタリングした。232nmの発色団の消滅を紫外分光光度計でモニタリングした。半減期は3.2時間と見積られた。
第２セットの実験は、上記パラメーターを用いて行い、ブタ肝臓エステラーゼ懸濁液5ml添加後の崩壊を測定した。エステラーゼ反応に対する半減期は25℃で８分であった。
実施例２６
本実施例では、Ｏ²−［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］エステルの一酸化窒素放出性ポリマー混合物の調製について記載する。
テトラヒドロフラン1ml中のＯ²−［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］エステル50mg（0.132mmol）の溶液を、テトラヒドロフラン10ml中のポリウレタン498mgの溶液に溶解した。均一なラッカーを乾燥窒素ガス流下で濃縮した後、高真空下でさらに乾燥して、ポリマー複合物1mgあたりＯ²−［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］エステル0.091mg（0.24mmol）含む固形物を得た。ＮＯ放出速度を、ジアゼニウムジオレートのアリコート32mg（2mlリン酸緩衝液，pH7.4中）の浸漬後の時間の関数として、化学発光検出器を用いて37℃で測定した。１セットの実験は混入物のない緩衝液中で行ったが、もう１つのセットはブタ肝臓エステラーゼの存在下で行った。酵素の非存在下では、200時間をかけてごく少量のＮＯが放出されたが、酵素が緩衝液中に存在すると顕著な速度でＮＯの生成が観察された。このことは、ポリマー複合物からジアゼニウムジオレートが漏出するにしたがって、それが酵素よって加水分解されてさらにＮＯに開裂することを示している。
実施例２７
本実施例では、β−シクロデキストリンへの一酸化窒素放出性Ｏ²−［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］エステルの導入を記載する。
β−シクロデキストリン（228mg,0.201mmol）を水2mlと混合し、65℃に加熱して均一溶液を得た。該温溶液に、Ｏ²−［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］エステル76mg（0.201mmol）を加えた。混合すると白色沈殿物が形成された。該混合物を室温まで冷却し、生成物を濾取し、水洗し、真空乾燥して生成物170mgを得た。33mgのＯ²−［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］１−［（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート［Ｓ−アセチル−（２−メルカプトエチル）］エステル：β−シクロデキストリン混合物を含む水溶液は232nmで最大吸収を、またモル吸光係数（ε）10.8mM^-1cm^-1を示した。ＮＯ放出速度を、そのカプセル化された物質のアリコート13mg（4mlリン酸緩衝液，pH7.4中）の浸漬後の時間の関数として、化学発光検出器を用いて37℃で測定した。１セットの実験は混入物のない緩衝液中で行ったが、もう１つのセットはブタ肝臓エステラーゼの存在下で行った。酵素の非存在下では、400時間をかけてごく少量のＮＯが放出されたが、酵素が緩衝液中に存在すると顕著な速度でＮＯの生成が観察された。
実施例２８
本実施例では、Ｏ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレート類の調製の一般的な手順を記載する。
２，３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド（アセトブロモグルコース）をRedemannら，Org.Syn.Coll.Vol.III：11-14（1955）に記載のようにして調製した。２，３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルブロミド（アセトブロモマンノース）をLeveneら，J.Biol.Chem.90：247-250（1931）に記載のようにして調製した。次いで、ジメチルスルホキシド（DMSO）中のジアゼニウムジオレート１当量のスラリー（0.5mmol固形物/1ml DUSO）を酸化銀0.03当量とともに窒素下室温で攪拌した。DMSO中の1.2当量のアセトブロモマンノースまたはアセトブロモグルコースの0.5M溶液を滴下注入して混合物を３日間攪拌した。得られた均一溶液を氷水100mlに注ぎエーテル抽出した。エーテル層を水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥し、木炭で処理した。溶液を硫酸マグネシウムを通して濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して真空乾燥した。該グルコース誘導体は再結晶化により精製したが、ガラス状のマンノース付加生成物はカラムクロマトグラフィーを要した。
実施例２９
本実施例では、ナトリウム１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（“DEA/NO”）の調製について記載する。
1：1のエーテル：アセトニトリル100ml中のジエチルアミン119g（1.63mol）の溶液を500ml Parrビン中に入れた。該溶液を脱気し、40psiの一酸化窒素を充填して室温で一晩静置した。圧力を緩めて結晶性生成物を濾取し、窒素下で乾燥してジエチルアンモニウム１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート13gを得た。この塩を10M水酸化ナトリウム溶液10mlで処理し、得られたペーストをエーテル200mlで処理してナトリウム塩を得た。このナトリウム塩（“DEA/NO”）を真空濾過して集め、エーテルで洗浄し、真空乾燥して生成物7.1gを得た：UV（0.01N NaOH中）λ_max（ε）250（6.88mM^-1cm^-1）；NMR（D₂O）δ0.96（t,3H）,2.94（q,2H）；DMSO-d₆中δ0.84（t,3H）および2.75（q,2H）。
実施例３０
本実施例では、Ｏ²−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製を記載する。
実施例２８の一般的手順に記載したように、DMSO中のDEA/NO（2.98g；0.019mol）を、アセトブロモグルコース6.9g；0.017mol）と反応させた。生成物を石油エーテルより再結晶化させて5.7g（72%）結晶性固体108mgを得た：融点107-108℃；UVλ_max（ε）228nm（6.92mM^-1cm^-1）；NMRδ1.11（t,6H,J=7.11）,2.02（s,3H）,2.03（s,3H）,2.04（s,3H）,2.07（s,3H）,3.21（q,4H,J=7.12）,3.81（m,1H）,4.20（m,2H）,5.14（m,1H）,5.33（m,3H）。分析：C₁₈H₂₉N₃O₁₁としての計算値：C,46.65；H,6.31；N,9.07。実測値：C,46.73；H,6.26；N,9.01。
実施例３１
本実施例では、Ｏ²−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（実施例３０より）の脱アシル化について記載する。
メタノール5ml中の上記化合物253mg（0.55mmol）の溶液を、25%メタノール性ナトリウムメトキシド10μlとともに攪拌した。反応の進行を5：1のCH₂Cl₂：酢酸エチルを用いたＴＬＣによってモニタリングした。反応は25℃で１時間以内に完了した。
Dowex-50W-H⁺樹脂（1g）を攪拌中の該メタノール溶液に加えた。該混合物を濾過して樹脂を除去し、メタノール溶液を真空下で溶媒留去してＯ²−グルコピラノシル１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート122mg（75%）を得た：UVλ_max（ε）228nm（6.4mM^-1cm^-1）；NMR（CDCl₃）δ1.08（t,6H）,3.23（9,4H）,5.59（m,4H）,3.88（m,2H）,5.29（m,1H）
驚くべきことに、この脱アシル化生成物は、そのアセタール様構造にもかかわらず、pH3で極めてゆっくりと１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（ＤＥＡ／ＮＯ）アニオン、次いでＮＯに開裂するに過ぎなかった。いっそう驚くべきことに、この開裂はpH13では極めて急速に進行した。
実施例３２
本実施例では、ナトリウム１−［（１−エトキシカルボニル）ピペラジン−４−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートの調製について記載する。
メタノール60ml中のカルボエトキシピペラジン20g（0.126mol）の溶液をParrビンに入れた。該溶液をメタノール中の25%ナトリウムメトキシド27.4ml（0.126mol）で処理した。この系を脱気し、40psiの一酸化窒素を充填して25℃に48時間保った。白色の結晶性生成物を濾取し、冷メタノールおよび大量のエーテルで洗浄した。該生成物を真空乾燥してナトリウム１−［（１−エトキシカルボニル）ピペラジン−４−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート14.5g（収率48%）を得た：融点：184-185℃；UV（0.01N NaOH）λ_max（ε）252nm（10mM^-1cm^-1）；NMR（D₂O）δ1.25（t,3H）,3.11（m,2H）,3.68（m,2H）,2.15（q,2H）。分析：C₆H₁₃N₄O₄Naとしての計算値：C 35.00%,H 5.42%,N 23.33%,Na 9.58%。実測値：C 34.87%,H 5.53%,N 23.26%,Na 9.69%。この化合物のpH7および25℃での半減期は５分と見積もられた。この測定は紫外スペクトルにおける252nmの発色団の消失に基づいた。
実施例３３
本実施例では、Ｏ²−（グルコピラノース−２−イル）１−［（１−エトキシカルボニル）ピペラジン−４−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートテトラアセテートエステルの調製について記載する。
アセトブロモグルコース（2.055g；0.005mol）とナトリウム１−［（１−エトキシカルボニル）ピペラジン−４−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート1.11g（0.00466mol）とを上記のように反応させてＯ²−（グルコピラノース−２−イル）１−［（１−エトキシカルボニル）ピペラジン−４−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートテトラアセテートエステル624mg（25%）を得た：UVλ_max（ε）228nm（7.20mM^-1cm^-1）；NMRδ1.26（t,3H）,2.02（s,3H）,2.03（s,3H）,2.04（s,3H）,2.09（s,3H）,3.46（m,4H）,3.68（m,4H）,3.82（m,1H）,4.17（q,2H）,4.25（m,3H）,5.27（m,3H）。
実施例３４
本実施例では、Ｏ²−（マンノピラノース−２−イル）１−［（１−エトキシカルボニル）ピペラジン−４−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートテトラアセテートの調製について記載する。
アセトブロモマンノース（10.2g；0.025mol）とナトリウム１−［（１−エトキシカルボニル）ピペラジン−４−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート5.28g（0.022mol）とを上記のように反応させて6.4g（53%）のガラス状物を得た：UVλ_max（ε）238nm（7.5mM^-1cm^-1）；NMRδ1.29（t,3H）,2.01（s,3H）,2.05（s,3H）,2.11（s,3H）,2.17（s,3H）,3.13（m,1H）,3.50（m,4H）,3.78（m,5H）,4.19（q,2H）,4.27（m,3H）,5.28（m,3H）,5.42（m,1H）。
実施例３５
本実施例では、マンノース−フコースレセプターに指向されるＯ²−グリコシル化ジアゼニウムジオレートの調製について記載する。
ビス−［２−（Ｎ−エトキシカルボニルアミノ）エチル］アミン：２つの滴下漏斗を備えた３首フラスコを氷水浴中に浸した。ジエチレントリアミン（10.7g,0.104mol）を該冷フラスコ中に入れ、95%エタノール100mlに溶解した。該冷溶液にクロロ蟻酸エチル10ml（0.205mo1）を滴加した。蒸留水100ml中の炭酸ナトリウム10.6g（0.1mol）の溶液をクロロ蟻酸エチル10ml（0.205mol）と同時に加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した。ロータリーエバポレーターでエタノールを除去し、水性部分をジクロロメタンで抽出した。有機層を水洗し、次いで5%塩酸で抽出した。中性生成物を含む有機層を分離して取っておいた。水層をジクロロメタンで抽出し、水酸化ナトリウムで塩基性にした。生成物をジクロロメタン中に抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを通して濾過し、溶媒を留去して無色オイル状物4gを得た：NMR（CDCl₃）δ1.25（t,6H）,2.78（m,4H）,3.36（m,4H）,4.14（q,4H）,5,13（b,2H）。
ナトリウム１−［ビス−{２−（Ｎ−エトキシカルボニルアミノ）エチル}アミノ］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート：エーテル20mlおよびメタノール5ml中のビス−［２−（Ｎ−エトキシカルボニルアミノ）エチル］アミン2.6g（0.011mol）の溶液を50ml Parrビン中に入れ、25%メタノール性ナトリウムメトキシド2.4ml（0.011mol）で処理し、脱気し、-80℃で冷却して50psiの一酸化窒素を充填した。３時間攪拌後に濁った沈殿物が観察された。該混合物を24時間ＮＯに曝露し、圧力を緩めて生成物を濾取した。該固形物をエーテルで洗浄し、真空乾燥してジアゼニウムジオレート1.26g（35%）を得た：融点170-2℃；UVλ_max（ε）252nm（7.6mM^-1cm^-1）；NMRδ1.24（t,6H）,3.19（m,8H）,4.11（q,4H）。
Ｏ²−（マンノース−２−イル）１−［ビス−{２−（Ｎ−エトキシカルボニルアミノ）エチル}アミノ］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートテトラアセテート：ジメチルスルホキシド（DMSO）2ml中のナトリウム１−［ビス−{２−（Ｎ−エトキシカルボニルアミノ）エチル}アミノ］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート251mg（0.763mmol）の溶液の一部を窒素下０℃に冷却した。これに酢酸銀10mg（0.06mmol）を加えた後、テトラヒドロフラン中の0.82Mアセトブロモマンノース溶液1mlをゆっくりと加えた。該反応混合物を48時間室温で攪拌し、氷水に注ぎ、エーテル抽出した。該エーテル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥、硫酸マグネシウム層を通して濾過し、真空下で溶媒留去してオイル状物307mgを得た：UVλ_max240nm。
Ｏ²−（マンノース−２−イル）１−［ビス（２−アミノエチル）アミノ］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート］：
10N NaOH 2ml、エタノール2mlおよび水2mlの混合物中のＯ²−（マンノース−２−イル）１−［ビス−{２−（Ｎ−エトキシカルボニルアミノ）エチル}アミノ］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレートテトラアセテート145mg（0.23mmol）の溶液を15時間加熱還流した。該溶液を真空下で濃縮し残った水溶液をジクロロメタンで抽出した。該水溶液を真空下で溶媒留去して乾燥した。残渣をメタノール中に取り、10g、60ccのプレパックC-18カラムに通してメタノールで溶出した。236nmで最大吸収を示す画分を集め、溶媒を留去して白色粉末32mgを得た：NMR（CD₃OD）δ2.74（t,4H）,3.02（t,4H）,3.74（m,4H）,4.2（m,3H）；UVλ_max238nm。
実施例３６
本実施例では、ジナトリウム１−（２−カルボキシラト）ピロリジン−１−イル ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（ＰＲＯＬＩ／ＮＯ）を出発材料として用いた組み合わせライブラリーの調製について記載する。
Calbiochem-Novabiochem Int’l.（San Diego,CA）より入手できるピペラジントリチル樹脂１を塩化スルフリルで処理してクロロスルホンアミド２を形成させる。この樹脂をＰＲＯＬＩ／ＮＯと反応させて化合物３を得る。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミドとの反応によりフリーのカルボン酸を４に活性化することができる。樹脂結合ジアゼニウムジオレートへのR³⁰XH（X=O,N,S）の求核性付加により分子のカルボキシラト基で置換された化合物５の、潜在的に大きなライブラリーが提供される。５の塩基加水分解により、樹脂からアニオン性ジアゼニウムジオレート６が遊離する。このライブラリー６を求電子剤³¹Xと反応させて構造７を有する化合物の新しいセットを形成できる。

ここに引用した刊行物、特許および特許出願は、各刊行物が言及によって組み込まれるために個々にそして具体的に述べられ、ここに完全に明らかにされたと同程度に、ここに言及することで組み込まれるものである。
本発明を好ましい実施態様を強調して説明してきたが、当業者には好ましい実施態様が変更され得ることが自明であろう。本発明はここで特別に記載された以外の方法でも実施され得ることが意図される。したがって、本発明は添付の請求の範囲の精神および範囲に包含される全ての変形を含むものである。Technical field
The present invention provides O²-Aryl 1-substituted diazene-1-ium-1,2-diolates (O²-Aryl diazeniumdiolates), O²-Glycosylated 1-substituted diazeniumdiolates, and O²-Substituted 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazeniumdiolates, as well as compositions containing such diazeniumdiolates, of such diazeniumdiolates Usage and O²-It relates to a process for producing aryl diazeniumdiolates.
Background of the Invention
Nitric oxide (NO) is involved in a wide variety of bioregulatory processes, and compounds containing or capable of releasing nitric oxide are useful for regulating these processes. Has been proven. A wide variety of nitric oxide-containing and / or release adducts such as trinitroglycerin, nitroprusside, etc. are known in the art (US Pat. No. 5,405,919 (Keefer et al., Restricting Their Use in Biological Applications). Is outlined in)). The limited utility of such compounds has led in part to the development of another biologically useful nitric oxide generating compound, namely diazeniumdiolates.
N as diazeniumdiolates₂O₂ ^-Compounds that contain functional groups are distinguished structurally and functionally from nitrosamines (see, for example, Reilly, US Pat. No. 3,153,094). Known diazeniumdiolates are disclosed in recently issued patents. US Pat. Nos. 5,039,705 (Keefer et al.) And 5,208,233 (Keefer et al.) Disclose secondary amine-nitric oxide adducts and salts thereof. US Pat. Nos. 5,155,137 (Keefer et al.) And 5,250,550 (Keefer et al.) Disclose nitric oxide and polyamine complexes. US Pat. Nos. 5,389,675 (Christodoulou et al.) Disclose mixed ligand metal complexes of nitric oxide-nucleophile adducts; US Pat. Nos. 5,525,357 (Keefer et al.) And 5,405,919 (Keefer et al.) A combined nitric oxide / nucleophile adduct composition is disclosed. U.S. Pat. Nos. 4,954,526 (Keefer et al .; '526 patent) and 5,212,204 (Keefer et al.) Disclose the use of ionic diazeniumdiolates as cardiovascular agents. In addition, the '526 patent²Disclosed are substituted and metal bonded diazeniumdiolates. Keefer et al., US Pat. No. 5,366,997 ('997) has the formula:

[Where N₂O₂ ^-O of group²Oxygen is a functional group R^ThreeIs bound to. ]
Diazeniumdiolates having the following are disclosed: R^ThreeThe group is O²NO can be released spontaneously when cleaved from oxygen.
Keefer et al. (’997) (i) R¹And R²Together with the nitrogen atom to which they are attached may form a pyrrolidinyl, piperazino or other heterocyclic group, (ii) R^ThreeMay be olefinic and / or optionally substituted with hydroxy, halo, acyloxy or alkoxy_1-12Linear or C_3-12Branched alkyl, C_1-12An unsubstituted / substituted acyl, sulfonyl, carboxamide, sulfinyl, sulfenyl, carbonate-derived group or carbamate-derived group, and (iii) a pyrrolidinyl group has the structure:

[Where, w = 4 and R^Four= Hydrogen, C_1-8Linear or branched alkyl, C_3-8Cycloalkyl or substituted or unsubstituted aryl. However, Keefer et al. ('997)^ThreeDoes not disclose that is an aryl or substituted aryl and that the pyrrolidino group can be substituted at the 2-position with a substituted or unsubstituted carboxyl group (see also Example 1 of US Pat. No. 5,632,981). Similarly, Keefer et al. ('997) described the diazeniumdiolates O²-Glycosylation is not disclosed.
Until now, diazeniumdiolates O²-It was not known that there could be aryl substituents. Furthermore, chemical studies of previously disclosed diazeniumdiolates have shown that they are generally at least stable at high as well as low pH, and certain other “nitro vasodilators” “Unlike drugs, their NO release rates led to the result that they were not affected by the presence of nucleophilic thiols.
Accordingly, there is a need for a class of diazeniumdiolates that provides advantages over other currently available diazeniumdiolates. In this regard, O²-Aryl substituted diazeniumdiolates are advantageous in that they can spontaneously release NO under alkaline conditions or after nucleophilic attack. O²-Aryl substituted diazeniumdiolates can also spontaneously release NO after a combination of oxidative or electrophilic activation and nucleophilic attack.
Therefore, the main object of the present invention is to protect the diazeniumdiolate from the spontaneous release of NO.₂O₂ ^-O of group²Providing a nitric oxide / nucleophile adduct wherein the oxygen is derived from an aryl or substituted aryl group. Another object of the present invention is to develop a new class of diazeniumdiolates that resist release of nitric oxide under neutral or acidic solutions, but release NO upon nucleophilic attack or pH increase. Is to provide. Yet another object of the present invention is to provide O²-Glycosylated 1-substituted diazene-1-ium-1,2-diolates and O²-To provide substituted 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolates. It is a further object of the present invention to provide compositions containing such compounds, including compositions containing nitric oxide / nucleophile adducts containing novel targeting moieties. A related objective is to follow a biological tissue targeting strategy that gives greater flexibility and specificity to target NO release, O²-To provide aryl substituted diazeniumdiolates. It is a further object of the present invention to provide methods for using such compounds. These and other objects of the invention, as well as additional inventive features, will be apparent from the description of the invention given below.
Summary of the Invention
The present invention has the formula:

[Wherein, X is an inorganic group or an organic group, and Q is an aryl group. ]
Explained by O²-Aryl-substituted diazeniumdiolates (ie O²-Aryl diazeniumdiolate). In this novel class of compounds, the atom of the aryl group Q is N₂O₂ ^-O of functional group²-It is bound to oxygen. The diazeniumdiolates of formula (I) are stable in terms of generating hydrolyzable nitric oxide in neutral to acidic solutions. Surprisingly, these new compounds, or the products produced after the oxidative or electrophilic activation of these compounds, have a basic or nucleophilic environment in which the aryl group is separated from the diazeniumdiolate residue. Below it has been demonstrated that nitric oxide can be generated.
The present invention also provides O²-Glycosylated 1-substituted diazene-1-ium-1,2-diolates and O²-Substituted 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolates are also provided, both of which have the formula:

[Wherein X and R are organic and / or inorganic groups as defined herein,²-For glycosylated 1-substituted diazeniumdiolates, R must be a sugar. ].
In addition, O²-With respect to glycosylated 1-substituted diazene-1-ium-1,2-diolates, the group X can be any organic or inorganic group. Preferably, X contains an atom different from carbon and hydrogen and is bonded to the nitrogen of the diazeniumdiolate via an atom different from carbon. Most preferably, X is an amino group and is bonded to the nitrogen of the diazeniumdiolate via a nitrogen atom.
O²-For substituted 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolates, X in formula Ia is

The [1- (2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazeniumdiolates are represented by the following formula: :

[Wherein R^{twenty two}Is hydrogen, hydroxy, OM (wherein M is a cation), halo or X¹R^{twenty three}R^{twenty four}(Where X¹Is oxygen, nitrogen or sulfur and R^{twenty three}And R^{twenty four}Are independently substituted or unsubstituted C_1-24Alkyl, substituted or unsubstituted C_3-24Cycloalkyl, substituted or unsubstituted C_2-24Olefin group, substituted or unsubstituted aryl (e.g. acridine, anthracene, benzene, benzofuran, benzothiophene, benzoxazole, benzopyrazole, benzothiazole, carbazole, chlorophyll, cinnoline, furan, imidazole, indole, isobenzofuran, isoindole, iso Oxazole, isothiazole, isoquinoline, naphthalene, oxazole, phenanthrene, phenanthridine, phenothiazine, phenoxazine, phthalimide, phthalazine, phthalocyanine, porphine, pteridine, purine, pyrazine, pyrazole, pyridazine, pyridine, pyrimidine, pyrocholine, pyrrole, quinolizini Umum ion, quinoline, quinoxaline, quinazoline, sydnone, tetrazole, thiazole Thiophene, thyroxine, triazine and triazole), or a Hajime Tamaki (e.g., glycosyl, etc.), X¹R is O or S, R^{twenty four}Does not exist. ). ]. Or X¹R is nitrogen^{twenty three}And R^{twenty four}X¹Together with a heterocycle, for example,

Wherein A is N, O or S, w is 1-12, y is 1 or 2, z is 1-5, R⁸, R⁹, R^{twenty five}And R²⁶Is hydrogen, C_1-8Straight chain alkyl, C_3-8Branched alkyl, C_3-8Cycloalkyl or aryl. A heterocyclic ring selected from the group consisting of R above^{twenty three}And R^{twenty four}The group may be unsubstituted or appropriately substituted. For example, R^{twenty three}And R^{twenty four}A group may be suitably substituted with acyloxy, acylthio, hydroxy, amino, carboxy, mercapto, halo, amide, sulfonyl, sulfoxy, sulfenyl, phosphono, phosphato, and the like.
In addition, O²-For substituted 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolates, the group R of the formula Ia may be any organic or inorganic group, This is covalently bonded to the terminal oxygen of the diazeniumdiolate as shown, but unlike hydrogen and substituted or unsubstituted C_1-12Linear or C_3-12Branched alkyl, substituted or unsubstituted C_2-12Linear or C_3-12Branched olefin group, substituted or unsubstituted C_1-12Acyl, sulfonyl, carboxamide, glycosyl group, aryl group, or the formula — (CH₂)_n-ON = N (O) NR²⁸R²⁹(Wherein n is an integer of 2-8 and R²⁸And R²⁹Is independently C_1-12Straight chain alkyl, C_3-12Branched alkyl, C_2-12Linear or C_3-12A branched olefin group or R²⁸And R²⁹Together with the nitrogen atom to which they are attached form a heterocyclic group, preferably a pyrrolidino, piperidino, piperazino or morpholino group. ). The above R groups may be unsubstituted or substituted. Preferred substitutions include substitution with hydroxy, halo, acyloxy, alkoxy, acylthio or benzyl.
From another aspect, the present invention includes compositions, including pharmaceutical compositions, containing the diazeniumdiolate of the present invention. The pharmaceutical composition preferably additionally contains a pharmaceutically acceptable carrier.
From yet another aspect, the present invention provides a method of using a compound according to the present invention.
From yet another aspect, the present invention provides O²A method for producing aryl diazeniumdiolates is provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph of Trp37 fluorescence (RFU) versus time (minutes).²-Shows the release of zinc from HIV-1 nuclear capsid p7 protein by aryl diazeniumdiolates. In the graph, ○ indicates negative control, ie no drug, □ indicates positive control, ie 624151 (Rice et al.Antimicrob.Agents Chemother.41: 419426 (1997)), ■ indicates the compound (LK1) of Example 1, ◆ indicates the compound (LK2) of Example 8, ▲ indicates the compound (LK3) of Example 5, ● represents the compound (LK4) of Example 10, and x represents the compound (LK5) of Example 11.
FIG. 2 is a graph of relative NO release rate versus time (minutes) showing the catalytic action of NO release from DNP-PYRRO / NO by glutathione S-transferase (GST).
Detailed description of the invention
O²-Arylated diazeniumdiolates
The present invention has the formula:

[Wherein, X is an organic group or an inorganic group, and Q is an aryl group. ]
O with²-Aryl 1-substituted diazeniumdiolates (ie O²-Aryl 1-substituted diazene-1-ium-1,2-diolate).
According to the invention, N₂O₂ ^-O of group²The oxygen is directly bonded to the ring atom of the aryl group. In other words, from the aryl ring, O²-There are no spacer atoms (eg methylene) separating oxygen. If the aryl group contains a bicyclic group or a polycyclic group and all the rings of the aryl group are not necessarily aromatic, O²The bond between the oxygen and the aryl group is through an atom that is part of the aromatic ring. In addition, O²Oxygen is N₂O₂ ^-O of group²It can be bonded to any aromatic ring atom of the aryl group that can be bonded to oxygen. N₂O₂ ^-O of group²The atom of the aromatic ring that can be bonded to oxygen is generally carbon or nitrogen, although there may be other bonds.
I don't think it will lead to any special theory, but O²It is presently believed that the bond between an oxygen and an atom of the aryl ring is achieved by bonding to an activated atom of the ring. Activation can be achieved via any suitable mechanism. In this regard, the preferred mechanism for activating the aryl ring is to react the diazeniumdiolate via a partially positively charged aryl ring atom or, more particularly, an amino substituent of the ring structure. By replacing.
In the first preferred reaction mechanism, the aryl ring is substituted with a suitable electron withdrawing group, which is part of the ring and reacts with diazeniumdiolate, as in Example 12. The former may be a “leaving group”. One skilled in the art will recognize that the electron withdrawing group and the leaving group may in some cases be the same group. The leaving group is replaced by diazeniumdiolate and the O of the present invention.²-Form aryl diazeniumdiolates. Suitable leaving groups include, but are not limited to, F, Cl, Br, I, NO₂, OSO₂R and OSO_ThreeR (wherein R is an organic group, a metal center, etc.) can be mentioned, and the synthesis thereof is well understood by those skilled in the art. For purposes of illustration, suitable R groups include, but are not limited to, H, alkyl, alkenyl, or aryl. This reaction is the well-known S_NBased on the Ar mechanism. For example,Nucleophilic Aromatic Displacement: The Influence of the Nitro Group, Francois Terrier, VCH Publishing, Inc., New York, New York, pages 1-11 (1991). Preferably, these S_NThe Ar reaction takes place on an electron deficient aryl ring containing at least one electron withdrawing group.
In a second preferred reaction mechanism, the aryl reactant is substituted with an appropriate amino group to allow direct derivatization of the ring atom of the aryl group attached to the substituted amino group (eg, diazo of the amino group). After conversion). After being incorporated into the compound of the present invention, O to be activated²-There is no requirement for the atoms of the aryl ring attached to oxygen. However, if this atom is activated after incorporation into a compound of the present invention, the diazeniumdiolate group to which it is attached can be replaced via subsequent nucleophilic substitution (eg, suitable strong Under base). In other words, as a result of oxidative or electrophilic activation, the compounds of the present invention change to O²The aryl ring atom attached to the oxygen is activated, so that, as described above, the compound undergoes a subsequent nucleophilic substitution.
Advantageously, the compounds of the present invention have novel and useful properties that are absent from other nitric oxide / nucleophile adducts previously known in the art. In general, the compounds of the present invention are stable under neutral or acidic pH (that is, compounds of formula I do not generate NO under neutral or acidic pH). Another advantageous property of the compounds of the invention is that O²The -aryl bond is well susceptible to cleavage by nucleophiles containing hydroxide ions. Specific O²-Aryldiazeniumdiolates or oxidatively or electrophilically activated O of the present invention²-Aryl diazeniumdiolates are O when placed in a basic or nucleophilic environment.²The aryl bond to oxygen can be broken. The resulting diazeniumdiolate ions spontaneously decrease through a predictable first stage mechanism and generate NO. The resulting aryl group is replaced with a nucleophile provided by its environment. If the nucleophile provided by the environment is part of the enzyme, the enzyme can be inactivated. O²-Due to the susceptibility of aryl diazeniumdiolates to nucleophilic attack, the compounds also design prodrugs to target nitric oxide to nucleophilic tissue components, biological sites and biological microenvironments. Especially to do.
When thiols are present in a mixture, the compounds of the present invention are also useful for identifying and measuring individual thiols (organic-SH containing compounds). For example, C_Four-C₈Samples expected to consist of linear thiols are obtained by dissolving the product of Example 1 in tetrahydrofuran or other inert solvent and then mixing the molar excess of the resulting solution with the sample to be assayed. Can be analyzed. After the subsequent reaction is complete, a portion is HPLC analyzed using a UV detection system. The peaks seen in the resulting chromatograms show their retention times as well as the individual C_Four-C₈The amount can be determined by comparing the retention time of the standard thiol standard to the standard, and converting the peak area to a concentration via an individual standard curve.
O²-With regard to aryl diazeniumdiolates, an "aryl group" as used herein, regardless of whether it is part of a (homo) cyclic, heterocyclic or polycyclic structure Any aromatic group is mentioned. A standard understanding of “aromatic” is used here (eg L.G.Wade, Jr.,Organic Chemistry,2d Edition, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 682-683 (1991)). The aryl group used here may also have a wide variety of substituents. Any suitable aryl substituent can be used provided that the substituent does not break the aromaticity of the aryl ring.
Turning to the aryl group Q of formula I, Q is the diazeniumdiolate O²-Meant to include all aryl groups that follow (or can be) subjected to reaction with an oxygen atom. Such groups Q include homocyclic, heterocyclic and polycyclic aromatic structures, and derivatives thereof. Examples of the aryl group Q include acridine, anthracene, benzene, benzofuran, benzothiophene, benzoxazole, benzopyrazole, benzothiazole, carbazole, chlorophyll, cinnoline, furan, imidazole, indole, isobenzofuran, isoindole, isoxazole, isothiazole. , Isoquinoline, naphthalene, oxazole, phenanthrene, phenanthridine, phenothiazine, phenoxazine, phthalimide, phthalazine, phthalocyanine, porphine, pteridine, purine, pyrazine, pyrazole, pyridazine, pyridine, pyrimidine, pyrocholine, pyrrole, quinolidinium ion, quinoline, Quinoxaline, quinazoline, sydnone, tetrazole, thiazole, thiophene, thyroxine, Triazine and triazole.
Consistent with the present invention, each of these aromatic compounds Q is indefinitely derivatized with a number of substituents well known in the art that can be substituted for the aromatic ring as long as the aromaticity of the ring is maintained. obtain. For example, as a substituent of the aryl group Q, X [N (O) NO]^-(Wherein X is defined hereinafter and is the same as X in formula I), halo, hydroxy, alkylthio, arylthio, alkoxy, aryloxy, amino, mono- or di-substituted amino, ammonio or substituted ammonio, Nitroso, Cyano, Sulfonato, Mercapto, Nitro, Oxo, C₁-C_{twenty four}Aliphatic group, C_Three-C₁₂Olefin group, C_Three-C_{twenty four}Cycloalkyl, C_Three-C_{twenty four}Heterocycloalkyl, benzyl, phenyl, substituted benzyl, substituted phenyl, benzylcarbonyl, phenylcarbonyl, sugars, substituted benzylcarbonyl, substituted phenylcarbonyl and phosphorus derived groups. Examples of phosphorus-derived groups include phosphate and phosphono groups. Examples of phosphate groups include (OH)₂P (O) O- and substitution (OH)₂P (O) O— groups, wherein one or more oxygen atoms are independently S or NR ′ where R ′ is C₁-C_TenIt is understood that it is an aliphatic group, cycloalkyl or aryl group. ) May be substituted. C₁-C_{twenty four}Examples of aliphatic substituents include C₁-C_{twenty four}Acyl, and

[Wherein R is hydrogen, substituted or unsubstituted C₁-C_{twenty three}Aliphatic group, substituted or unsubstituted C_Three-C_{twenty three}Cycloalkyl, substituted or unsubstituted C_Three-C₁₂An olefin group, benzyl, phenyl, substituted benzyl or substituted phenyl, wherein the substituted benzyl or substituted phenyl is nitro, halo, hydroxy, C₁-C_{twenty four}Alkyl, C₁-C_{twenty four}Alkoxy, amino, mono-C₁-C_{twenty four}Alkylamino, di-C₁-C_{twenty four}Substituted with 1-5 substituents selected from the group consisting of alkylamino, cyano, phenyl and phenoxy. ]. Suitable saccharides include ribose, glucose, deoxyribose, dextran, starch, glycogen, lactose, fucose, galactose, fructose, glucosamine, galactosamine, heparin, mannose, maltose, sucrose, sialic acid and cellulose. Other suitable saccharides are phosphorylated, 3,5-cyclophosphorylated and polyphosphorylated hexoses and pentoses.
Examples of substituted aryl compounds of the present invention that can be bonded to a diazeniumdiolate group include dinitrophenol (benzene), hypoxanthine (purine), uridine (pyrimidine), vitamin K_Five(Naphthalene) and ribosyluridine (nucleoside).
In another specific embodiment of the invention, the aryl group is identical or structurally similar to a molecule normally found in living organisms or a substitution thereof. These biologically relevant groups include the group consisting of nucleotides, nucleosides, nucleic acids, peptides including peptide hormones, non-peptide hormones, vitamins and other enzyme cofactors (such as porphyrins). More can be selected. Examples of biologically relevant aryl groups include thyroxine, NAD (or NADH), chlorophyll, hypoxanthine, uridine and vitamin K_FiveIt is.
The following reaction schematic shows the O of the present invention.²-Illustrates methods for producing aryl diazeniumdiolates. In these illustrated reaction schematics, the diazeniumdiolate (X- [N₂O₂ ^-]) Is cooled to 0 ° C., preferably under a blanket of inert gas such as nitrogen. Then a solution of one equivalent of activated fragrance reagent in a solvent such as t-butyl alcohol, dimethyl sulfoxide or N, N-dimethylformamide is slowly added. Without being bound to any particular theory, it is believed that polar aprotic solvents are preferred. The reaction temperature is increased gradually, for example, to room temperature or higher for smaller reactive aryl groups. Generally, a precipitate is formed upon addition. The mixture is then gradually warmed to room temperature and stirred overnight. The product is extracted with a suitable extractant such as dichloromethane and subsequently washed with dilute hydrochloric acid and then with sodium bicarbonate solution. The organic layer is dried with a suitable desiccant such as sodium sulfate, preferably filtered through a layer of anhydrous magnesium sulfate, and the solvent is distilled off under vacuum to obtain the crude product. Usually the product is a solid. Recrystallization from ethanol or other suitable solvent is a preferred method of purification of the product.
Those skilled in the art will appreciate that these conditions can be modified to suit the particular application of those skilled in the art.
Chlorinated quinolines and isoquinolines can react with diazeniumdiolate, and the Cl substituent can be converted to the O of diazeniumdiolate as shown below.²-Replaces oxygen.

Moreover, quinazoline can be incorporated as shown below.

Phthalazines are also incorporated as shown below in accordance with the present invention.

Acridine can be incorporated as shown below.

Cinnoline can also be incorporated as shown below.

Quinoxaline can also be incorporated as shown below.

Oxygen- and nitrogen-containing heteroaromatic compounds may also be prepared according to the present invention by diazeniumdiolate O.²-It can be used as an aromatic reagent for oxygen substitution. For example, oxazole and benzoxazole can be derivatized at the 2-position as shown below.

Similarly, thiazole and benzothiazole can also be derivatized at the 2-position.

Derivatized vitamin K₇Can also be produced as shown below.

The aryl ring O in the rightmost (immediately above) structure²-Diazeniumdiolated atoms are not activated. Therefore, the rightmost structure is XN₂O₂ ^-Resists nucleophilic attacks to regenerate, in other words, the production of NO will be reduced spontaneously. Therefore, in order to generate NO, the rightmost structure needs to undergo oxidative preactivation prior to nucleophilic attack. This oxidative property targets certain cell or organ types that can independently perform the required oxidation, thus limiting NO exposure to the desired tissue while avoiding exposure at other NO sensitive sites in the tissue. Pre-activation requirements may also be advantageous.
Examples of classes of compounds that require electrophilic preactivation include the compounds shown below.

Similarly, triazines can be obtained as described below.²-Aromatic reagents that form aryl-substituted diazeniumdiolates. The synthesis of such compounds improves the effectiveness of existing triazine-derived herbicides.

Nucleic acids and the bases (including ribosylated bases) that produce the nitro they contain are also O of the present invention.²-Can be useful as aromatic reagents to form aryl substituted diazeniumdiolates. This is illustrated in Example 13.
Another interesting O²-Arylated diazeniumdiolate is shown as the product of the following reaction; it can generate both NO and allopurinol upon hydrolysis.

Advantageously, allopurinol is already known to be pharmaceutically useful. Accordingly, known pharmaceutically useful compounds containing a suitable aryl group can be converted to O of the present invention.²-By converting to aryl diazeniumdiolates, the present invention enhances existing drugs by releasing NO.
Similarly, derivatives of biopterin diazeniumdiolate can be prepared from substituted pteridines as shown below.

An example of a suitable aryl substitution utilizing a bond through a heteroatom is shown in the reaction scheme below and can be performed by reacting with BuONO or other suitable nitrosating agent.

A structural analog of Bendazac, a well-known anti-inflammatory agent, can be prepared as follows.

According to the present invention, any of the compounds defined as diazeniumdiolates is O²-Can undergo aryl substitution. Thus, X of the compound having Formula I can be any organic or inorganic group. Preferably, X contains an atom different from carbon and hydrogen, and N via an atom different from carbon.₂O₂ ^-Bonded to the group nitrogen. Most preferably, it is an amine of X and N via the nitrogen atom.₂O₂ ^-Bonded to the group nitrogen. Suitable groups for X also include, but are not limited to, C_1-C_{twenty four}Aliphatic groups, aryl, and non-aromatic ring groups are included. “Aliphatic group” means an acyclic group containing carbon and hydrogen and which may contain nitrogen, oxygen, sulfur, phosphorus and halogen. “Aryl” means a group comprising at least one aromatic ring, as described above. Preferably, the aryl group is C_3-C₃₀It is a containing group. A non-aromatic ring group means a group containing at least one ring structure and no aromatic ring. Preferably, the non-aromatic ring group is C_3-C₃₀It is a containing group.
The group X of formula I may be unsubstituted or substituted with a suitable additional group, for example — [N (NO) O^-], Halo, hydroxy, alkylthio, alkoxy, aryloxy, amino, mono- or di-substituted amino, cyano, sulfonate, mercapto, nitro, substituted or unsubstituted C₁-C₁₂Aliphatic group, substituted or unsubstituted C_Three-C₈Cycloalkyl, substituted or unsubstituted C_Three-C₈Heterocycloalkyl, substituted or unsubstituted C_Three-C₁₂Olefin groups, benzyl, phenyl, substituted benzyl, substituted phenyl, benzylcarbonyl, phenylcarbonyl, sugars, substituted benzylcarbonyl, substituted phenylcarbonyl and phosphorus derivative groups. Examples of phosphorus-derived groups include phosphato and phosphono groups. Examples of phosphato groups include (OH)₂P (O) O- and substitution (OH)₂P (O) O— groups, wherein one or more oxygen atoms are independently S or NR ′ where R ′ is C₁-C₈It is understood that it is a containing aliphatic group, cycloalkyl or aryl group. ) May be substituted. Preferred C₁-C₁₂As an aliphatic group substituent, C₁-C₁₂Acyl, and

[Wherein R is C₁-C_TenSubstituted or unsubstituted aliphatic group, C_Three-C₁₁Olefin group, C_Three-C₈Substituted or unsubstituted cycloalkyl, benzyl, phenyl, substituted benzyl or substituted phenyl, wherein the substituted benzyl or substituted phenyl is halogen, hydroxy, C₁-C_FourAlkyl, C₁-C_FourAlkoxy, amino, mono-C₁-C_FourAlkylamino, di-C₁-C_FourSubstituted with 1 or 2 selected from the group consisting of alkylamino, phenyl and phenoxy. ]. Suitable saccharides and polysaccharides include ribose, glucose, deoxyribose, dextran, starch, glycogen, lactose, galactose, fructose, glucosamine, galactosamine, heparin, mannose, maltose, sucrose, sialic acid and cellulose. Other suitable saccharides are phosphorylated, 3,5-cyclophosphorylated and polyphosphorylated pentoses and hexoses.
In one embodiment of the invention, X is an inorganic group disclosed in US Pat. No. 5,212,204. A preferred embodiment of formula I wherein X is an inorganic group is^-O_ThreeS- (sulfite) and-^-O (oxide).
In another embodiment of the invention, X is a polyamine disclosed in US Pat. No. 5,155,137. Therefore, polyamine substituted O²-Aryl diazeniumdiolates have the following formula:

[Wherein Q is the same as Q in formula I and is defined as above; b and d may be the same or different and are 0 or 1;¹, R², R^Three, R^FourAnd R^FiveAs the same or different, hydrogen, substituted or unsubstituted C_Three-C₈Cycloalkyl, substituted or unsubstituted C_1-C₁₂Linear or branched alkyl, substituted or unsubstituted benzyl, substituted or unsubstituted benzoyl, substituted or unsubstituted C_Three-C₁₂Examples include olefin groups, phthaloyl, acetyl, trifluoroacetyl, p-toluyl, t-butoxycarbonyl or 2,2,2-trihalo-t-butoxycarbonyl. The values of i, j and k in Formula II may be the same or different and are integers from 2 to 12. ]
In a preferred embodiment of the invention, O²-Aryl diazeniumdiolates are derived from the compounds disclosed in US Pat. Nos. 5,039,705 (Keefer et al.) And 4,954,526 (Keefer et al.) And have the following formula:

[Wherein R⁶And R⁷May be the same or different and H, C₁-C₁₂Straight chain alkyl, C₁-C₁₂Alkoxy or acyloxy substituted linear alkyl, C₂-C₁₂Hydroxy or halo substituted linear alkyl, C_Three-C₁₂Branched alkyl, C_Three-C₁₂Hydroxy, halo, alkoxy or acyloxy substituted branched alkyl, C₂-C₁₂Linear olefin groups, and C_Three-C₁₂Selected from the group consisting of branched olefin groups, unsubstituted or substituted with hydroxy, alkoxy, acyloxy, halo or benzyl, provided that R⁶And R⁷Are not both H; or R⁶And R⁷Together with the nitrogen atom to which they are attached,

Wherein A is N, O or S, w is 1 to 12, y is 1 or 2, z is 1 to 5, R⁸Is hydrogen, C₁-C₈Straight chain alkyl, C_Three-C₈Branched alkyl, C_Three-C₈Cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl (eg, phenyl, toluyl, etc.) and R⁹Is hydrogen, C₁-C₆Straight chain alkyl or C_Three-C₆Branched alkyl. A heterocyclic ring selected from the group consisting of ]. Typical azacrown groups are 1-aza-12-crown-4, 1-aza-15-crown-5 and 1-aza-18-crown-6. When A is nitrogen, the nitrogen atom itself may be substituted, for example as disclosed in US application Ser. No. 08 / 475,732, incorporated herein by reference.
By way of further example, derived from the compounds disclosed in US Pat. No. 5,250,550, previously incorporated by reference, fully incorporated by reference, O²-Aryl substituted diazeniumdiolates are mentioned and have the following formula:

[Wherein D is

Where R^TenAnd R¹¹Are the same or different. Substituent R^TenAnd R¹¹Can be any suitable substituent, for example hydrogen, C_3-8Cycloalkyl, C_1-12Examples include linear or branched alkyl, benzyl, benzoyl, phthaloyl, acetyl, trifluoroacetyl, p-toluyl, t-butoxycarbonyl and 2,2,2-trihalo-t-butoxycarbonyl. In Formula IV, f is an integer of 0-12. ]
Preferred O²Examples of the aryl-substituted diazeniumdiolates also include the compound of Example 14.
O²-An alternative method for preparing arylated diazeniumdiolates is the literature reaction (Stevens,J.Org.Chem.29:311-315 (1964)).

Aryloxyanion ArO^-Can be substituted with methoxides of Stevens reaction²It is possible to obtain aryl diazeniumdiolates. Similarly, ArS^-It is possible to obtain derivatives corresponding to the species.
O²-Glycosylated diazeniumdiolates and 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazeniumdiolates
The present invention also provides two other new classes of diazeniumdiolates. This one class of diazeniumdiolates contains hydrolytically labile groups (R) and is free diazeniumdiolate (NO donor) X—NO═NO^-Upon cleavage into, a non-toxic and possibly beneficial sugar is released and a sugar-based receptor-mediated phenomenon is available. Other classes of diazeniumdiolates are inter alia ultrafast NO donors that have proven to be effective as antithrombotic and vasodilators, but are inherently derivatized by their instability. Provides a prodrug of 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate disodium salt (PROLI / NO), which is extremely difficult (Saavedra et al.,J.Med.Chem.31: 4361-4365 (1996); and US Pat. No. 5,632,981 (Saavedra et al.)). The newly discovered ability to produce a prodrug of the ultra-fast NO donor PROLI / NO is that the PROLI / NO prodrug is stabilized O²-Allows free movement through the circulatory system until the desired organ or cell type for metabolic removal of the protecting group is reached, thereby rapid release of NO at specific or preferred sites And the need for administration by infusion at a controlled rate near the targeted tissue is eliminated. Furthermore, the corresponding nitrosamine (N-nitrosoproline) is unlikely to be carcinogenic when formed in biological media, unlike other nitrosamines.
Accordingly, the present invention provides O²-Glycosylated 1-substituted diazene-1-ium-1,2-diolates (O²-Glycosylated diazeniumdiolates) and O²-Substituted 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolates (1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazeniumdiolate A). Both of these can be represented by the following formula:

[In Formula Ia, X and R are organic and / or inorganic groups as defined herein. ].
O²-Glycosylated diazeniumdiolates
O²-With respect to glycosylated diazeniumdiolates, a class of compounds defined as diazeniumdiolates (e.g. U.S. Pat. Nos. 5,039,705, 5,208,233, 5,155,137, 5,250,550, 5,389,675). No. 5,525,357, 5,405,919 and related patents and patent applications) are all compounds of diazeniumdiolate²O is available for glycosylation²-Can undergo glycosylation. The group R of formula Ia can be any sugar, which is diazeniumdiolate O 2 by the 2-position of the pyranose or furanose ring.²Is bound to. This sugar may be functionalized. Desirably, the sugar and its derivatives are hydrolyzable at physiological pH. The sugar can be a monosaccharide, disaccharide (eg, sucrose or maltose), oligosaccharide or polysaccharide. Preferred sugars and polysaccharides include, among others, ribose, glucose, deoxyribose, fucose, lactose, galactose, fructose, glucosamine, galactosamine, mannose, maltose, sucrose, and many sugars that serve as recognition sequences in receptor-mediated cell-cell interactions. And oligosaccharide units. Other preferred saccharides include phosphorylated, 3,5-cyclophosphorylated and polyphosphorylated pentoses and hexoses.
By way of example, this sugar residue (shown linked to diazeniumdiolate for illustration) may be an amino sugar (eg, glucosamine or substituted glucosamine having the following structure):

[In the formula, R¹²And R¹³May be the same or different, hydrogen, C_1-6Alkyl, acyl, phosphate, sulfate, peptide or protein. ]. The sugar residue may be, for example, glucuronic acid or a derivative thereof represented below:

[In the formula, R¹⁴Is X¹R¹⁵R¹⁶Where X¹Is N, O or S and X¹When N is R¹⁵And R¹⁶Is independently hydrogen, substituted or unsubstituted C_1-24Alkyl, C_3-24Cycloalkyl, C_2-24Olefin group, aryl (for example, acridine, anthracene, benzene, benzofuran, benzothiophene, benzoxazole, benzopyrazole, benzothiazole, carbazole, chlorophyll, cinnoline, furan, imidazole, indole, isobenzofuran, isoindole, isoxazole, isothiazole , Isoquinoline, naphthalene, oxazole, phenanthrene, phenanthridine, phenothiazine, phenoxazine, phthalimide, phthalazine, phthalocyanine, porphine, pteridine, purine, pyrazine, pyrazole, pyridazine, pyridine, pyrimidine, pyrocholine, pyrrole, quinolidinium ion, quinoline, Quinoxaline, quinazoline, sydnone, tetrazole, thiazole, thiophene, tyros Singh, triazine, and triazole) or a Hajime Tamaki (e.g., glycosyl, etc.), and X¹R is O or S, R¹⁶There is no group. ].
Or X¹R is nitrogen¹⁵And R¹⁶Forms a heterocycle selected from the group consisting of:

Wherein A is N, O or S, w is 1-12, y is 1 or 2, z is 1-5, R⁸Is hydrogen, C_1-8Straight chain alkyl, C_3-8Branched alkyl, C_3-8Cycloalkyl, aryl (eg, phenyl, tolyl, etc.) or carboxylato and derivatives thereof as described below, and R⁹Is hydrogen, C_1-6Straight chain alkyl or C_3-6Branched alkyl. ]. The above groups may be unsubstituted or appropriately substituted.
Examples of azacrown groups (ie when A is N) include 1-aza-12-crown-4, 1-aza-15-crown-5 and 1-aza-18-crown-6. . When A is nitrogen, the nitrogen atom itself may be substituted, for example as described in US patent application Ser. No. 08 / 475,732.
Furthermore O²For glycosylated diazeniumdiolates X¹The group attached to the carbonyl group via can be any that does not interfere with the cleavage to the diazeniumdiolate anion.
Furthermore O²For glycosylated diazeniumdiolates X¹The group attached to the carbonyl group via can be any that does not interfere with the cleavage to the diazeniumdiolate anion.
Preferably, the group X contains an atom different from carbon and hydrogen, and N via an atom different from carbon.₂O₂ ^-Bonded to the group nitrogen. Most preferably, X is an amino group and is N through a nitrogen atom.₂O₂ ^-Bonded to the group nitrogen. Suitable groups for X include, but are not limited to, C_1-24Aliphatic groups, aryl and non-aromatic ring groups are included. “Aliphatic group” means an acyclic group containing carbon and hydrogen and which may contain nitrogen, oxygen, sulfur, phosphorus or halogen. “Aryl” means a group comprising at least one aromatic ring. Preferably, the aryl group is C_6-30It is a group. “Non-aromatic ring group” means a group containing at least one ring structure and no aromatic ring. Preferably, the non-aromatic ring group is C_6-30It is a group. Further, X may be unsubstituted or a suitable additional group (for example,-[N (NO) O^-], Halo, hydroxy, alkylthio, alkoxy, aryloxy, amino, mono- or di-substituted amino, cyano, sulfonate, mercapto, nitro, substituted or unsubstituted C_1-12Aliphatic group, substituted or unsubstituted C_3-8Cycloalkyl, substituted or unsubstituted C_3-C₁₂Olefin group, substituted or unsubstituted C_3-8Heterocyclic alkyl, benzyl, phenyl, substituted benzyl, substituted phenyl, benzylcarbonyl, phenylcarbonyl, sugar, substituted benzylcarbonyl, substituted phenylcarbonyl and phosphorus derivative groups). Examples of phosphorus-derived groups include phosphato and phosphono groups. Examples of phosphato groups include (OH)₂P (O) O- and substitution (OH)₂P (O) O— group, wherein one or more oxygen atoms are independently S or NR.¹⁷(Wherein R¹⁷Is C_1-8Aliphatic groups,

(Wherein R¹⁸Is C_1-10An unsubstituted or substituted aliphatic group. ), C_3-8It is understood that it is unsubstituted or substituted cycloalkyl, benzyl, phenyl, substituted benzyl or substituted phenyl. ) May be substituted. When benzyl or phenyl is substituted, preferably it is halogen, hydroxy, C_1-4Alkyl, C_1-4Alkoxy, amino, mono-C_1-4Alkylamino, di-C_1-4Substituted with one or two substituents selected from the group consisting of alkylamino, phenyl and phenoxy.
In one embodiment of the invention, X of formula Ia is an inorganic group as described in US Pat. No. 5,212,204. A preferred embodiment of Formula Ia where X is an inorganic group is:^-O_ThreeS- (sulfite) and -O^-(Oxide).
In another embodiment of the invention, X in formula Ia is a polyamine as defined in US Pat. No. 5,250,550. Therefore, polyamine O²-Glycosylated diazeniumdiolates have the following formula:

Wherein Q is the same as defined above for R in formula Ia, b and d may be the same or different and are 0 or 1;¹, R², R^Three, R^FourAnd R^FiveAre the same or different, hydrogen, substituted or unsubstituted C_3-8Cycloalkyl, substituted or unsubstituted C_1-12Linear or branched alkyl, substituted or unsubstituted benzyl, substituted or unsubstituted benzoyl, substituted or unsubstituted C_3-C₁₂Olefin group, phthaloyl, acetyl, trifluoroacetyl, p-toluyl, t-butoxycarbonyl or 2,2,2-trihalo-t-butoxycarbonyl. ]. The values of i, j, and k in Formula II are the same or different and are integers of 2 to 12.
In a preferred embodiment of the invention, the diazeniumdiolates are derived from the compounds disclosed in US Pat. Nos. 5,039,705 (Keefer et al.) And 4,954,526 (Keefer et al.) And have the following formula:

Wherein R is the same as defined above for R in formula Ia and R¹⁹And R²⁰Are the same or different, hydrogen, C_1-12Straight chain alkyl, C_3-12Branched alkyl or C_2-12Linear or C_3-12It is a branched chain olefin group. However, R¹⁹And R²⁰Both are not hydrogen. ]. Any of the above substituents may be unsubstituted or substituted with an alkoxy, acyloxy, acylthio, hydroxy, halo or benzyl group.
Or R¹⁹And R²⁰Together with the nitrogen atom to which they are attached form a heterocyclic ring selected from the group consisting of the following groups:

Wherein A is N, O or S, w is 1-12, y is 1 or 2, z is 1-5, R⁸Is hydrogen, C_1-8Straight chain alkyl, C_3-8Branched alkyl, C_3-8Cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl (eg, phenyl, tolyl, etc.) or carboxylate and derivatives thereof as described below, and R⁹Is hydrogen, C_1-6Straight chain alkyl or C_3-6Branched alkyl. ]. The above groups may be unsubstituted or appropriately substituted.
Examples of azacrown groups (ie when A is N) include 1-aza-12-crown-4, 1-aza-15-crown-5 and 1-aza-18-crown-6. . When A is nitrogen, the nitrogen atom itself may be substituted, for example as described in US patent application Ser. No. 08 / 475,732.
As a further example, O derived from the compounds disclosed in US Pat. No. 5,250,550.²-Glycosylated diazeniumdiolates, which have the following formula:

[Wherein D is

Where R^{twenty one}Is the same as defined above for R in the sugar of formula Ia and R^TenAnd R¹¹Can be the same or different and can be any suitable group (for example, hydrogen, C_3-8Cycloalkyl, C_1-12Examples include linear or branched alkyl, benzyl, benzoyl, phthaloyl, acetyl, trifluoroacetyl, p-toluyl, t-butoxycarbonyl and 2,2,2-trihalo-t-butoxycarbonyl. ) ]. In Formula IV, f is an integer of 0-12.
Preferred O²A glycosylated diazeniumdiolate, wherein X is N (CH₂CH₂NH₂)₂And R is fucose or mannose.
The above compounds can be produced according to methods known to those skilled in the art. Glycopyranosylation reagents include acetobromo-α-galactose and acetobromoglucosamine. Glycofuranosylation reagents include tribenzyl-α-arabinofuranosyl bromide and bromoacetylxylose.
Oligosaccharides can be purchased from, for example, Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) and Carbomer Specialty Biochemicals and Polymers (Westborough, Mass.). In addition, oligosaccharidesPreparative Carbohydrate Chemistry,Stephen Hanessian, ed., Marcel Dekker, New York, NY (1997) andPolysaccharides in Medicinal Applications,Severian Dumitriu, ed., Marcel Dekker, New York, NY (1996) can be synthesized according to well-established procedures, including chemical and enzymatic production methods as described.
A protected linear or branched polysaccharide may be activated by halogenation at the anomeric end for subsequent reaction with a diazeniumdiolate ion, followed by glycosylation of the diazeniumdiolate. . O²-Activated disaccharides for the production of glycosylated diazeniumdiolates include acetobromo-α-maltose and acetobromo-α-lactose.
O²Glycosylated diazeniumdiolates are useful when molecular signaling and recognition processes, including cell adhesion, involve carbohydrates. For example, O²-Glycosylated diazeniumdiolates are believed to be useful in the treatment of infections such as those caused by parasites (eg, the genus Lyshmania), viruses or bacteria, and inflammation and metastasis. In this regard, O²-Glycosylated diazeniumdiolates can be made to be directed to the mannose-fucose receptor, as exemplified in Example 36. Sugar residues (in this case mannose) are thought to protect diazeniumdiolate. This mannose binds to the mannose-fucose receptor on macrophages, and O²-NO is released when mannosylated diazeniumdiolate enters the cell where the sugar residue is cleaved.
1-[(2-Carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazeniumdiolates
With respect to 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazeniumdiolates, the group X of formula Ia is

1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazeniumdiolates can be structurally represented by the following formula:

[In the formula, R^{twenty two}Is hydrogen, hydroxyl, OM (where M is a cation), halo or X¹R^{twenty three}R^{twenty four}(Where X¹Is N, O or S and X¹When N is R^{twenty three}And R^{twenty four}Are independently substituted or unsubstituted C_1-24Alkyl, C_3-24Cycloalkyl, C_2-24Olefin group, aryl (for example, acridine, anthracene, benzene, benzofuran, benzothiophene, benzoxazole, benzopyrazole, benzothiazole, carbazole, chlorophyll, cinnoline, furan, imidazole, indole, isobenzofuran, isoindole, isoxazole, isothiazole , Isoquinoline, naphthalene, oxazole, phenanthrene, phenanthridine, phenothiazine, phenoxazine, phthalimide, phthalazine, phthalocyanine, porphine, pteridine, purine, pyrazine, pyrazole, pyridazine, pyridine, pyrimidine, pyrocholine, pyrrole, quinolidinium ion, quinoline, Quinoxaline, quinazoline, sydnone, tetrazole, thiazole, thiophene, tyros Singh, triazine, and triazole) or a Hajime Tamaki (e.g., glycosyl, etc.), and X¹R is O or S, R^{twenty four}Does not exist. ). ]. Or X¹R is nitrogen^{twenty three}And R^{twenty four}Together with the nitrogen atom to which they are attached form a heterocycle, for example a heterocycle selected from the group consisting of the following groups:

Wherein A is N, O, or S, w is 1-12, y is 1 or 2, z is 1-5, and R⁸, R⁹, R^{twenty five}And R²⁶Is hydrogen, C_1-8Straight chain alkyl, C_3-8Branched alkyl, C_3-8Cycloalkyl or aryl. ]. The above groups may be unsubstituted or appropriately substituted.
R on nitrogen (N-4)²⁶Substituent is hydrogen, C_1-8Alkyl group, aryl group or C (O) -YR²⁷Where Y is sulfur, oxygen or nitrogen and R²⁷Is CH₂OCH_Three, Vinyl, C_1-9Straight chain alkyl, C_3-6Branched alkyl, C_3-8A cycloalkyl, polyethylene glycol, polysaccharide, or other polymer, peptide or protein. ). ]. YR²⁷Are activated linkers (for binding to proteins, peptides, phospholipids, polysaccharides, oligosaccharides, purines, pyrimidines and biocompatible polymers (ie polyethylene glycols, polylactides and polycaprolactones)). For example, it may be a hydroxysuccinimidyl group). YR²⁷May be an activating group for the carbonyl group, making the carbonyl group an electrophilic site that reacts with nucleophilic functional groups of oligopeptides, polyamines and proteins. YR²⁷Can react a carbonyl group with many nucleophiles and can react with a polymer (eg, polyethylene glycol) to form a polymer-linked compound.
Further with respect to 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazeniumdiolates, the group R of formula Ia can be any covalently bonded organic or inorganic group, unlike hydrogen and C_1-12Linear or C_3-12Branched alkyl, C_2-12Linear or C_3-12Branched chain olefin group, C_1-12Acyl, sulfonyl, C_3-12A cycloalkyl, a carboxamide, a glycosyl group as described above, an aryl group as described above, or a formula — (CH₂)_n-ON = N (O) NR²⁸R²⁹(Wherein n is an integer of 2-8 and R²⁸And R²⁹Is independently C_1-12Straight chain alkyl, C_3-12Branched alkyl, C_1-12Linear or C_3-12A branched olefin group or R²⁸And R²⁹Together with the nitrogen atom to which they are attached form a heterocyclic ring, preferably a pyrrolidino, piperidino, piperazino or morpholino group. ). The above R groups may be unsubstituted or appropriately substituted. Preferred substitutions include substitution with hydroxy, halo, acyloxy, alkoxy, acylthio or benzyl.
The above compounds can be produced according to methods known to those skilled in the art. For example, Sanger,Biochem. J.39: See 507-515 (1945).
O²-Substituted 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazeniumdiolates are those in aqueous solution²-Provides advantages over other diazeniumdiolates in that they are more stable than unsubstituted anions and in many cases they can be activated for NO release by enzymatic action. Furthermore, the N-nitroso derivative is formed by the net formal cleavage of the N—N double bond of 1-[(2-carboxylato) pyrrolin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate. This N-nitroso compound is non-carcinogenic. Such compounds are believed to be particularly useful in the treatment of fulminant liver failure, malaria, respiratory disorders, impotence, and various cardiovascular / blood disorders.
Polymer-bound diazeniumdiolates
Another particularly useful embodiment of the present invention is an O of formula I²Aryl diazeniumdiolates or O of formula Ia²-Containing glycosylated diazeniumdiolates, where X is a polymer or any O of the invention²Aryl diazeniumdiolates or O²-Glycosylated diazeniumdiolates are also incorporated into the polymer matrix. PROLI / NO is also R²⁰And a polymer bond via R. Both of these embodiments are “polymer-bound” N₂O₂ ^-Provide functional groups. “Polymer bound” means N₂O₂ ^-It means that a functional group is physically or chemically associated, incorporated or contained in a polymer matrix.
N₂O₂ ^-Physical association or bonding of functional groups to the polymer is achieved by coprecipitation of the polymer with the nitric oxide / nucleophile complex as well as N₂O₂ ^-This can be achieved by covalent attachment of the group to the polymer. N₂O₂ ^-Chemical attachment of the group to the polymer can be achieved, for example, when the nucleophilic group of the nitric oxide / nucleophile adduct is covalently bonded to the polymer and N₂O₂ ^-The nucleophile residue to which the group is attached may form part of the polymer itself (ie, be in the polymer backbone or attached to a pendant group on the polymer backbone). Nitric oxide release N₂O₂ ^-The manner in which the functional group is associated with, incorporated into, or contained within the polymer, i.e. "attached" to the polymer, is not critical to the present invention, and all associations ), Means of incorporation and bonding are contemplated by the present invention.
Site-specific application of the polymer-bound adduct composition can be achieved with nitric oxide releasing N₂O₂ ^-Increase the selectivity of the functional group action. N bound to polymer₂O₂ ^-If the functional groups are necessarily localized, their nitric oxide releasing effect will be concentrated in the tissue with which they are in contact. If the polymer is soluble, the selectivity of action can be further arranged, for example, by binding to an antibody specific for the targeting tissue or by derivatization of such an antibody. Similarly, N to small peptides that mimic the ligand recognition sequence for key receptors, such as binding to oligonucleotides capable of site-specific interaction with targeting sequences in nucleic acids.₂O₂ ^-Group attachment provides localized nitric oxide release.
O of the present invention²Diazeniumdiolates are disclosed in US Pat. Nos. 5,525,357 (Keefer et al.) And 5,405,919 (Keefer et al.), And US patent application Ser. No. 08 / 419,424 (Smith et al.), Each incorporated herein by reference. ) Can be derived from the disclosed materials. Any of a wide variety of polymers can be used in connection with the present invention. The selected polymer need only be biologically acceptable. Examples of polymers suitable for use in the present invention include polyolefins (eg, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polytetrafluoroethylene, polyvinyl chloride, poly (vinylidene fluoride)), polyethers (eg, polyethylene glycol), polysaccharides (eg, Dextran), polyesters (eg, poly (lactide / glycolide)), polyamides (eg, nylon), polyurethanes, polyethyleneimines, biopolymers (eg, peptides, proteins, oligonucleotides, antibodies) And nucleic acids), star blast dendrimers, polysaccharides and the like.
In this regard, a polymer containing diazeniumdiolate can react with a sugar, which is N₂O₂ ^-Bind to a functional group.
Formation of biopolymer-derived diazeniumdiolate provides a biopolymer-bound diazeniumdiolate composition that can be specifically applied to the biological site of interest. The site-specific application of biopolymer-bound diazeniumdiolate is based on the action of nitric oxide releasing diazeniumdiolate (this is the OLI in PROLI / NO.²-Aryl or O²-Increase the selectivity of glycosylation or O-R bond cleavage (see page 31)). For the other polymers disclosed above, if the diazeniumdiolate bound to the biopolymer is localized due to the intrinsic properties of the molecule, its nitric oxide releasing effect Will concentrate on the organization that is. If the biopolymer is soluble, the selectivity of action can be further arranged, for example, by binding to an antibody specific for the targeting tissue or by derivatization of such an antibody. Similarly, diazenium to small peptides that mimic the ligand recognition sequence for key receptors, such as binding to oligonucleotides capable of site-specific interaction with targeting sequences in nucleic acids. The attachment of the diolate group provides localized nitric oxide release. Other proteins, peptides, polypeptides, nucleic acids and polysaccharides can be used as well. US Pat. No. 5,405,919 (Keefer et al.) And US Pat. No. 5,632,981 (Saavedra et al.), Fully incorporated herein by reference, disclose similar compounds and products useful in the manufacture of diazeniumdiolates. .
As an example, O²An arylated piperazine diazeniumdiolate can be covalently linked to a polypeptide containing an IKVAV recognition sequence important for cancer cell chemotaxis. Metastasis by maintaining both the ability of NO to regenerate as an anti-adhesive agent and the affinity of IKVAV sequences for cancer cells and / or vascular and lymphoid sites to which cancer cells tend to attach Can be reduced or even prevented. Furthermore, the aryl group may be selected such that it provides additional anticancer cell activity. Piperazine N^FourSubstitutional substitution can be used to attach glycosylated diazeniumdiolates to peptides, polypeptides, proteins, polysaccharides and nucleotides.
The diazeniumdiolates of the present invention can be used as a means to reduce the risk of developing solid cancers associated with medical implants such as prostheses, stents and breast implants prior to their surgical attachment to the body. It is believed that it can be used to coat. In addition, the prostheses and implants can be manufactured using diazeniumdiolate as an essential component of the starting material. A medical device incorporating diazeniumdiolate provides a useful medical structure that also favors local release of NO, and is a very valuable bifurcated to the treatment of many biological disorders. Provide a two-pronged approach.
Composition
As is well known in the art, nitric oxide and N₂O₂ ^-Compounds that contain functional groups can have broad utility, in part due to the multifaceted role of nitric oxide in the bioconditioning process. Accordingly, the present invention also provides compositions, including pharmaceutical compositions, containing the diazeniumdiolate of the present invention. Preferably, the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
Although any suitable method of administering the diazeniumdiolate composition of the present invention to an animal (eg, a mammal) can be used, and more than one route of administration can be used to administer a particular composition. Those skilled in the art will appreciate that one particular route of administration provides a more rapid and effective response than another route of administration. Pharmaceutically acceptable carriers are also well known to those skilled in the art. The choice of carrier will be determined, in part, by both the particular composition and the particular method used to administer the composition. Accordingly, there are a wide variety of suitable formulations of the pharmaceutical composition of the present invention.
Formulations suitable for oral administration are predetermined as (a) an effective amount of a liquid solution such as diazeniumdiolate dissolved in a diluent such as water or saline, and (b) a solid or granule. Capsules, sachets or tablets each containing a sufficient amount of the active ingredient, (c) a suspension in a suitable liquid, and (d) a suitable emulsion. Tablets may contain one or more lactose, mannitol, corn starch, potato starch, microcrystalline cellulose, gum arabic, gelatin, colloidal silicon dioxide, croscarmellose sodium, talc, magnesium stearate, stearic acid, and other supplements. Forms, colorants, diluents, buffers, wetting agents, preservatives, flavoring agents, and pharmaceutically compatible carriers may be included. Lozenges contain active ingredients in flavoring agents (usually sucrose and gum arabic or tragacanth), and perfumes in inert bases (gelatin and glycerin or sucrose and gum arabic emulsions, gels, etc.) It contains the active ingredient and contains carriers known in the art in addition to the active ingredient.
The diazeniumdiolates of the present invention may be prepared alone or in combination with other suitable ingredients into aerosol formulations to be administered by inhalation. These aerosol formulations are placed in a pressurized acceptable propellant such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen and the like.
Formulations suitable for parenteral administration may contain aqueous and non-aqueous solutions, ie, antioxidants, buffers, antibacterial agents, and solutes that make the formulation isotonic with the blood of the recipient. Isotonic sterile injectable solutions and aqueous and non-aqueous sterile suspensions which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers and preservatives. The formulation is given in single-dose or multiple-dose sealed containers such as ampoules and vials, and for injection, just add a sterile liquid carrier such as water just before use. It may be stored in a lyophilized state. Extemporaneous injection solutions and suspensions may be prepared from sterile powders, granules and tablets of the kind previously described.
In the present invention, the amount administered to an animal (particularly a human) should be sufficient to exert a therapeutic effect on the animal over an appropriate time frame. Dosage depends on the strength of the particular composition used (considering at least the rate of NO generation, the range of NO generation and the biological activity of degradation products from diazeniumdiolates), the animal to be treated Will be determined by the condition and weight. The dosage will also be determined by the presence, nature, and extent of any adverse side effects that may accompany the administration of a particular composition. A suitable dosage for internal administration is 0.01-100 mg / kg / day. A preferred dosage is 0.01 to 35 mg / kg / day. A more preferable dose is 0.05 to 5 mg / kg / day. In a pharmaceutical composition for typical administration, O²A suitable concentration of aryl diazeniumdiolates is 0.05 to 15% (by weight). A preferred concentration is 0.02 to 5%. A more preferable concentration is 0.1 to 3%.
how to use
In view of the above, the present invention provides a method of using the diazeniumdiolate of the present invention. In one embodiment, a method of treating an animal (eg, a mammal) having a biological disorder treatable with nitric oxide is provided. This method comprises administering to an animal (eg a mammal) a diazeniumdiolate according to the present invention in an amount sufficient to treat a biological disorder in the animal. In this embodiment, a “biological disorder” is a biological disorder resulting from a genetic defect or infection by an infectious agent (eg, a virus, bacterium, or parasite) as long as the disorder is treatable with nitric oxide. Any biological disorder, including
In another embodiment of the method of use, a method is provided for treating an animal (eg, a mammal), eg, for infection by a virus, bacteria or parasite (eg, Leishmania). The method includes administering to the animal (eg, a mammal) a sufficient amount of diazeniumdiolate to treat the infection in the animal.
In one aspect of this embodiment of the invention, for example, a virus (eg, retrovirus, particularly HIV, more particularly HIV-1), a bacterium (eg, Gram positive) or a parasite (eg, Giardia) (None of these are O²A method of treating an animal (eg, a mammal) for infection by a zinc finger protein that can be inactivated by aryl diazeniumdiolate is provided. “Zinc finger protein” means a protein containing a short amino acid domain containing cysteines alone or containing cysteine and histidine ligands, both of which coordinate with zinc and interact with nucleic acids (South and Summers, “ “Zinc Fingers,” Chapter 7, In: Adv. Inorg. Biochem. Ser. 8, pp. 199-248 (1990), including the contents of all references cited therein, by reference. Fully incorporated here.) “Inactivated” means that the activity of the zinc finger protein that is inactivated partially or completely disappears. Such inactivation should itself lead to inactivation of the animal's biologically important zinc finger proteins to such an extent that they endanger the animal's health and good living conditions. Absent. This method comprises an amount of O sufficient to inactivate zinc finger protein in the infectious agent to treat infection in animals.²-Administering an aryldiazeniumdiolate to an animal (eg, a mammal).
The method can also be applied as a means of treating plants, plant cells or cultured tissues thereof against infection by infectious agents such as viruses (eg tobacco streak virus (TSV) or alfalfa mosaic virus (AIMV)). (South and Summers (1990) above; and Sehnke et al.,Virology 168: 48 (1989)).
The method described here is a C-X2-C-X4-H-X4-C motif (where "C" represents cysteine, "H" represents histidine, "X" represents any amino acid, And “2” and “4” represent the number of “X” amino acids) (eg, Wain-Hobson et al.,Cell 40 (1): 9-17 (1985)). Such motifs characterize retroviruses, particularly the retrovirus gag protein. Thus, the methods herein include retroviruses, such as HIV, in particular HIV-1, which include a nucleocapsid p7 protein (NCp7 protein) containing two zinc binding domains (Rice et al.,Nature Medicine 3 (3): 341-345 (1997); and Rice et al.,Reviews in Medical Virology6: 187-199 (1986)). Actual and / or potential zinc fingers also include, inter alia, gene products of the EIA genomic region of adenovirus, large T antigen from Simon virus 40 (SV40) and polyoma virus, UvrA protein in E. coli (E. coli) ( Culp et al.PNAS USA 85: 6450 (1988)), murine leukemia virus (MuLV-F; Green et al.,PNAS USA 86: 4047 (1989)), and bacteriophage T4 derived gene 32 protein (G32P) (Giedroc et al.,Biochemistry 28: 2410 (1989)) bacteriophage proteins (Berg,Science232: 484 (1986)). Such proteins can be isolated according to methods known in the art (see literature cited in South and Summers (1990) above) and can inactivate such zinc finger proteins.²-Aryl diazeniumdiolates include, for example, the zinc finger assay described herein and Rice et al.J.Med.Chem.39: 3606-3616 (1996).
Only for steroid hormone receptors containing zinc fingers with motifs containing 4 or 5 cysteines, O²-Aryl diazeniumdiolates can be used to modulate steroid hormone activity in animals (eg, mammals). Thus, the present invention also requires adjustment of steroid hormone activity and O²Provided is a method for modulating steroid hormone activity in an animal (eg, mammal) comprising a steroid hormone receptor protein comprising a zinc finger that can be inactivated by aryl diazeniumdiolate. This method involves a sufficient amount of O to inactivate the steroid hormone receptor protein to modulate steroid hormone activity in the animal.²-Administering an aryldiazeniumdiolate to an animal (eg, a mammal).
In yet another embodiment, a method of treating an animal (eg, a mammal) for cancer and its metastases is provided. The method includes administering to the animal (eg, a mammal) a sufficient amount of diazeniumdiolate to prevent cancer growth or metastasis in the animal.
In one aspect of this embodiment, O²A method of treating an animal (eg, a mammal) for cancer caused at least in part, directly or indirectly, by the activity of a zinc finger protein that can be inactivated by aryl diazeniumdiolate Provided. This method is used to treat cancer in animals (Rice et al.,PNAS 89: 7703-7707 (1992)), ie, an amount of O sufficient to inactivate zinc finger protein so as to prevent cancer growth or metastasis in animals.²-Administering an aryldiazeniumdiolate to an animal (eg, a mammal).
In still yet another embodiment, the chemotherapeutic agent (eg, Kelley et al., Biochem. J. 304: 843-848 (1994) due to the action of an enzyme that adversely affects the activity of the chemotherapeutic agent, for example. For the treatment of animals that are resistant to treatment with DNA damaging agents (eg, alkylating agents or oxidizing agents), in particular, DNA damaging agents (eg, mammals). . This method is sufficient to make cancer in animals susceptible to chemotherapeutic treatment.²-Administering an aryldiazeniumdiolate to an animal (eg, a mammal). Thus, such methods can be used as an additional therapy to chemotherapy as needed.
For example, certain O²Aryl diazeniumdiolates are glutathione S-transferases, especially isozymes π (eg Ji et al.,Biochemistry 32 (49): 12949-12954 (1993); and Ji et al.,Biochemistry 36: 9690-9702 (1997)). Therefore, O²-Reversible consumption of glutathione from the active site of glutathione S-transferase π by enzyme binding of this compound with glutathione using aryl diazeniumdiolate, this enzyme is a variety of xenobiotic compounds ( For example, detoxifying chemotherapeutic agents, particularly alkylating agents (eg, chlorambucil, melphalan and hepsulfam) and other DNA damaging agents (eg, agents that induce electrophilic attack or oxidation). (E.g. Morgan et al.Cancer Chemother.Phamacol.37: 363-370 (1996)). The method is also applicable for screening drug resistant cancer cell lines in vitro.
In another embodiment, a method of treating an inanimate object for the presence of a potentially infectious virus, bacterium or parasite is provided. This method involves contacting an inanimate object with a sufficient amount of the diazeniumdiolate of the present invention to reduce the presence of a potentially infectious virus, bacterium or parasite. “Latent infectivity” means the ability to infect an animal (eg, a mammal).
In one aspect of this embodiment, a potential infectious agent (such as a virus, bacterium, or parasite) on an inanimate object (all of which are O²-Methods for reducing the presence of zinc finger proteins that can be inactivated by aryl diazeniumdiolates are provided. This method is sufficient to inactivate zinc finger proteins to reduce the presence of potential infectious agents (eg, viruses, bacteria or parasites) on an inanimate object.²-Bringing the aryl diazeniumdiolate into contact with an inanimate object. “Latent infectivity” means the ability to infect an animal (eg, a mammal) directly or indirectly.
The invention is further illustrated by the following examples, which, of course, do not limit the scope of the invention in any way. For the following examples, NO is obtained from Matheson Gas Products (Montgomeryville, PA), β- and α-glycosidase and porcine liver esterase are obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) and polyurethane (Tecoflex). Was obtained from Thermedics Inc. (Woburn, Mass.), And glucose and mannose were obtained from Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.). Proton NMR spectra were recorded using a 300 MHz Varian Unity Plus or Varian XL-200 NMR spectrometer. Spectra are in deuterated chloroform for shared compounds and D for salts.₂Obtained in O. Chemical shifts were recorded in millions (ppm) at low magnetic fields from TMS. Low resolution and high resolution mass spectral (MS) measurements were performed on a VG-Micromass Model 7070 spectrometer. Unless otherwise indicated, MS data was sampled through a direct probe and accumulated in electron impact mode. Ultraviolet (UV) spectra were performed on an HP 8451A Diode Array spectrophotometer as an aqueous solution or 0.01 M NaOH solution. Glutathione S-transferase kinetics was monitored by measuring changes in UV absorption at 380 nm using a Beckman DU 640 spectrophotometer. Chemiluminescence measurements were performed on a Thermal Energy Analyzer Model 502A instrument (Thermedics, Inc., Woburn, Mass.). Elemental analysis was performed by Atlantic Microlab Inc.
Example 1
In this embodiment, O²The preparation of-(2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate will be described.
A solution of 1.67 g (11 mmol) of sodium diethylaminodiazeniumdiolate in 20 ml of 5% aqueous sodium bicarbonate solution is cooled to 0 ° C. under nitrogen and 1.3 ml (0.01%) of 2,4-dinitrofluorobenzene in 10 ml of t-butyl alcohol. mol) solution was added slowly. A precipitate formed upon addition. The mixture was allowed to warm slowly to room temperature and then stirred overnight. The product was extracted with dichloromethane and then washed with cold dilute hydrochloric acid and then sodium bicarbonate solution. The organic layer was dried over sodium sulfate, filtered through a magnesium sulfate layer, and the solvent was distilled off under vacuum to obtain 1.3 g of a red oily product, which was left to crystallize. Recrystallization from ethanol gave yellow-orange needles: mp 76-7 ° C; NMR δ 1.25 (t, 6H), 3.58 (q, 4H), 7.68 (d, 1H), 8.44 (m, 2H ), 8.89 (m, 1H); UV (ethanol) λ_max(Ε) 218 (17.4mM^-1cm^1-) And 302 (15.6mM)^-1cm^-1) Nm; MS, exact mass: C_TenH₁₃N_FiveO₆Calculated as (M +) 299.0865; found M + 299.08658; C, H, N analysis: C_TenH₁₃N_FiveO₆Calculated as: C 40.13%, H 4.35%, N 23.41%; found: C 40.21%, H 4.43%, N 23.37%.
Example 2
In this example, the anionic diazeniumdiolate, its O²-Aryl substituent (O²The regeneration from-(2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate) will be described.
O prepared as in Example 1.²A solution of 85 mg (0.28 mmol) of (2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate in 1 ml of ether is cooled to -4 DEG C. and 1 ml of diethylamine Was processed. The solution was kept at -4 ° C for 1 hour to obtain a precipitate. The solid was collected by filtration. The filtrate was concentrated and analyzed by NMR. The residue was found to be identical to an authentic sample of 2,4-dinitro-N, N-diethylaniline. The precipitate is washed with petroleum ether and N₂Dried under λ_max250 nm; NMR (D₂O) 5.4 mg of product with δ 0.96 (t, 6H), 1.28 (t, 6H), 2.94 (q, 4H), 3.08 (q, 4H) was obtained. This product was found to be identical to an authentic sample of diethylammonium 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate.
Example 3
In this example, O mediated by sodium methoxide.²-O of aryl diazeniumdiolate²-Chemical cleavage of an aryl bond will be described.
O in 1 ml of ether²-A solution of 16 mg (0.064 mmol) of (2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate was added with 29 μl of 25% sodium methoxide in 0.14 mmol of methanol. Treated and left at -4 ° C for 2 hours. The solid was collected by filtration, washed with ether and dried in vacuo to give 4 mg of a solid identical to an authentic sample of 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate sodium salt. It was.
Example 4
In this example, O in methanol.²The kinetics of the reaction of-(2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate with sodium methoxide will be described. The kinetics of this reaction is that O in an alkaline or nucleophilic environment.²1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-dioyl of-(2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate The rate of conversion to rate ions is shown.
Excess NaOMe was used in the reaction. Aliquots were collected at intervals and quenched with 0.1N HCl in methanol. O²The disappearance of-(2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate was monitored by HPLC and found to be consistent with the first-order rate equation. This means that k in four different concentrations of NaOMe_obs'Log [O²-(2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate] was determined by plotting against time. Similarly, the second order rate constant (7.87M^-1min^-1), Log k_obsWas plotted against log [NaOMe].
Example 5
In this embodiment, O²The preparation of-(2,4-dinitrophenyl) 1- (N-isopropylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate will be described.
A solution of 84 mg (0.597 mmol) of sodium 1- (N-isopropylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate in 1 ml of 5% sodium bicarbonate was cooled to 0 ° C. and 69 mg of 2,4-dinitrofluorobenzene (0.55 mmol) was added. The ice bath was removed and the mixture was stirred overnight at room temperature, then the mixture was extracted with dichloromethane. The extract was dried over sodium sulfate, filtered and evaporated in vacuo to give 86 mg of a film which crystallized upon standing: mp 92-93 ° C; NMR δ 1.39 (d, 6H ), 3.99 (septet, 1H), 6.93 (d, 1H), 8.27 (dd, 1H), 8.5 (b, 1H), 9.15 (d, 1H).
Example 6
In this example, the synthesis of pyrrolidinium 1- [pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate is described.
A solution of 36 g (0.507 mol) pyrrolidine in 50 ml ether and 25 ml acetonitrile was placed in a 500 ml Parr bottle, degassed and charged with 40 psi nitric oxide. The reactor was cooled to -80 ° C. The pressure was maintained at 40 psi. After 4 hours, the pressure was released and the crystalline product was filtered off in a fritted glass funnel and then washed with cold ether under a nitrogen atmosphere. The material was dried in a vacuum desiccator at 1 mm Hg and 25 ° C. for 3 hours to give 23 g (45%) of white needles: mp 68-70 ° C. C, H, N analysis: C₈H₁₈N_FourO₂Calculated as: C 47.51%, H 8.97%, N 27.70%; found: C 47.62%, H 9.04%, N 27.46%.
Subsequent O²-For arylation, the pyrrolidinium salt was converted to the more stable sodium salt by treatment with 10N NaOH to promote cation exchange. It was then filled with a large amount of ether and the product was filtered off.
Example 7
This example provides an alternative method for the preparation of the sodium salt of 1- (pyrrolidin-1-yl) diazen-1-ium-1,2-diol shown in Example 6.
A solution of 28.2 g (0.397 mol) pyrrolidine in 100 ml acetonitrile and 100 ml ether was mixed with 94 ml (0.4 mol) 25% sodium methoxide in methanol. The resulting solution was flushed with nitrogen and then charged with 40 psi NO and stirred at room temperature for 2 days to form a cloudy precipitate (this precipitate formed within 1 hour after exposure to NO). I started.). The product was filtered off by releasing the pressure. The product was washed with ether and dried in vacuo to give 32.1 g (54%) of white powder: UV (0.01 N NaOH) λ_max(Ε), 252nm (8.84mM^-1cm^-1,); T_1/2 8.5 seconds at 25 ° C and 2.8 seconds at 37 ° C in phosphate buffer pH 7.4; NMR (D₂O) δ 1.91 (m, 4H), 3.22 (m, 4H).
Example 8
In this embodiment, O²The preparation of-(2,4-dinitrophenyl) 1- (pyrrolidin-1-yl) diazen-1-ium-1,2-diolate will be described.
A solution of 556 mg (3.63 mmol) of sodium 1- (pyrrolidin-1-yl) diazen-1-ium-1,2-diolate in 10 ml of 5% aqueous sodium bicarbonate solution was cooled to 0 ° C. A solution of 456 μl (3.63 mmol) of 2,4-dinitrofluorobenzene in 2 ml of t-butyl alcohol was added and the resulting mixture was stirred at room temperature overnight. The yellow-orange precipitate was collected by filtration, washed with water and dried to give 758 mg of product, which was recrystallized from ethanol: mp 94-95 ° C .; NMR, δ 2.04 (m, 4H), 3.35 ( m, 4H), 6.90 (d, 1H), 8.20 (dd, 1H), 8.67 (d, 1H); MS, m / z (%), 297 (M⁺, 1), 220 (100), 237 (30), 190 (94), 180 (15), 162 (10), 149 (26), 130 (20), 100 (95), 70 (24), 63 (35), 56 (18); exact mass: C_TenH₁₁N_FiveO₆Calculated value as (M⁺) 297.0708; measured value 297.0709.
Example 9
In this example, the preparation of sodium 1-[(4-ethoxycarbonyl) piperazin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate is described.
A solution of 20 g (0.126 mol) of N-carboethoxypiperazine in 60 ml of methanol was placed in a Parr bottle. The solution was treated with 27.4 ml (0.126 mol) of a 25% sodium methoxide solution in methanol. The system was degassed and charged with 40 psi nitric oxide and held at 25 ° C. for 48 hours. The white crystalline product was filtered off and washed with cold methanol and copious amounts of ether. The product was dried in vacuo to yield 14.5 g (48%) of sodium 1-[(4-ethoxycarbonyl) piperazin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate, mp 184- 5 ℃; UV (0.01N NaOH) λ_max(Ε) 252nm (10.4mM^-1cm^-1); NMR (D₂O) δ1.25 (t, 3H), 2.15 (q, 2H), 3.11 (m, 4H), 3.68 (m, 4H). Analysis: C₆H₁₃N_FourO_FourCalculated as Na: C 35.00%, H 5.42%, N 23.33%, Na 9.58%; Found: C 34.87%, H 5.53%, N 23.26%, Na 9.69%.
The half-life of this compound at pH 7 and 25 ° C. was estimated to be 5 minutes. This measurement was based on the disappearance of the 252 nm chromophore in the ultraviolet spectrum.
Example 10
In this embodiment, O²The preparation of-(2,4-dinitrophenyl) 1-[(4-ethoxycarbonyl) piperazin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate will be described.
A solution of 1.073 g (0.0045 mol) of sodium 1-[(4-ethoxycarbonyl) piperazin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate in 10 ml of 5% sodium bicarbonate was cooled to 0 ° C. under nitrogen. did. A portion of a solution of 0.89 ml (0.0044 mol) 2,4-dinitrofluorobenzene in 10 ml t-butyl alcohol was added. A precipitate formed upon addition. The mixture was stirred at room temperature for 4 hours. The product was extracted with dichloromethane. The extract was washed with water, dried over sodium sulfate and filtered through an anhydrous magnesium sulfate layer. The solvent was distilled off to obtain an orange glass, which was allowed to stand for crystallization. The product was recrystallized from ethanol: dichloromethane to give 1.3 g (76%) of analytically pure material: mp 140-141 ° C .; NMR δ 1.32 (t, 3H), 3.63 (m, 4H) , 3.74 (m, 4H), 4.19 (q, 2H), 7.66 (d, 1H), 8.48 (q, 1H), 8.88 (d, 1H); UV (H₂O) λ_max(Ε) 210nm (13.3mM^-1cm^-1), 300nm (12mM^-1cm^-1). Analysis: C₁₃H₁₆N₆O₈Calculated as C 40.61%, H 4.20%, N 21.87%; found: C 40.74%, H 4.13%, N 21.98%.
Example 11
In this embodiment, O²The preparation of-(2-chloropyrimidin-4-yl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate will be described.
A solution of 600 mg (4 mmol) of 2,4-dichloropyrimidine in 2 ml of dimethyl sulfoxide and 5 ml of tetrahydrofuran is syringed under nitrogen at room temperature with sodium 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium in 5 ml of tetrahydrofuran. The slurry was added to 678 mg (4.37 mmol) of -1,2-diolate and the resulting mixture was stirred for 72 hours. To the mixture was added 5 ml of ether. After washing with water, the organic layer was dried over sodium sulfate, filtered through a magnesium sulfate layer, and the solvent was distilled off to obtain 679 mg of an oily substance, which was crystallized at -20 ° C. This material was recrystallized from ether-petroleum ether: mp 37-38 ° C .; NMR δ 1.25 (t, 6H), 3.56 (q, 4H), 7.00 (d, lH), 8.50 (d, lH); UV, λ_max(Ε) 268nm (9.3mM^-1cm^-1). C, H, N analysis: C₈H₁₂N_FiveO₂Calculated as Cl: C 39.11%, H 4.92%, N 28.51%, Cl 14.43%; found: C 38.96%, H 4.96%, N 28.35%, Cl 14.60%.
Example 12
In this embodiment, O²The preparation of-(2-chloropyrimidin-1-yl) 1-[(4-ethoxycarbonyl) piperazin-1-yl] diazene-1-ium-1,2-diolate will be described.
A solution of 262 mg (1.76 mmol) of 2,4-dichloropyrimidine in 3 ml of dimethyl sulfoxide was added to sodium 1-[(4-ethoxycarbonyl) piperazin-1-yl] diazene-1-in 10 ml of tetrahydrofuran at room temperature under nitrogen. The slurry was added to a slurry of 424 mg (1.76 mmol) of ium-1,2-diolate and stirred for 72 hours. The resulting homogeneous solution was treated with 100 ml of water. The precipitate was filtered off and dried in vacuo to give 300 mg of product: mp 136-137 ° C .; NMR δ 1.29 (t, 3H), 3.69 (m, 4H), 3.71 (m, 4H), 4.18 ( q, 2H), 6.99 (d, 1H), 8.52 (d, 1H); (UV) λ_max(Ε) 270nm (4.1mM^-1cm^-1).
This compound is converted to 2,4-dimethoxypyrimidine by nucleophilic substitution using methoxide to replace the chlorine atom at the C2 position and the diazeniumdiolate at the C4 position.
Example 13
This example describes the synthesis of the following compounds.

Compound1Or5General synthesis of: A 1M solution of sodium 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate in dimethyl sulfoxide was stirred at 5 ° C. under nitrogen. 0.95 molar equivalents of an arylating agent-containing tetrahydrofuran 1M solution was injected through a septum. The reaction mixture was warmed to room temperature, stirred overnight, quenched with ice water and extracted with ether. The ether was washed with water, dried over sodium sulfate, filtered through a magnesium sulfate layer and concentrated on a rotary evaporator. The purification method was changed for each preparation, but it is described with the following individual compounds (Note: Compound1Or5Was constructed in parallel using a liquid phase synthesis method.²A product selected from an aryl compound library). NMR spectrum is CDCl_ThreeMeasured in.
O²-(2-nitro-4-trifluoromethylphenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate,1: Arylated with 4-fluoro-3-nitrobenzotrifluoride. The product was purified by preparative HPLC using a 1 inch C-18 column and eluting with a solvent gradient from 20% acetonitrile aqueous solution to 50% acetonitrile: 50% water. The product with a yield of 42% was obtained as an oil: NMR δ 1.23 (t, 6H), 3.50 (q, 4H), 7.66 (d, 1H), 7.82 (d, 1H), 8.28 (s, 1H) .
O²-(2-nitro-4-carboxylatophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate,2In this preparation, 4-fluoro-3-nitrobenzoic acid was used. The product was purified on a Biotage Flash 40 system using a 4.0 × 15.0 cm KP-Sil column. The system was eluted using 5: 1 dichloromethane: ethyl acetate with a pressure of 15 psi and an elution rate of 25 ml / min to give the product in 22% yield: mp 115-6 ° C .; NMR δ 1. 22 (t, 6H), 3.33 (q, 4H), 7.06 (d, 1H), 8.03 (dd, 1H), 8.37 (m, 1H).
O²-(5-nitropyridin-2-yl) 1- (N, N-diethyl) diazen-1-ium-1,2-diolate,3: The reaction product with 2-bromo-5-nitropyridine is pure by recrystallization from ether: ethanol.3Was obtained in 62% yield: mp 77-8 ° C; NMR δ 1.24 (t, 6H), 3.53 (q, 4H), 7.21 (dd, 1H), 8.52 (dd, 1H), 9.17 (dd, 1H ). C, H, N analysis: C₉H₁₃N_FiveO_FourCalculated as: C 42.35%, H 5.13%, N 27.44%; found: C 42.46%, H 5.14%, N 27.52%.
O²-(3,5-dinitropyridin-2-yl) 1- (N, N-diethyl) diazen-1-ium-1,2-diolate,4: Annealed with 2-chloro-3,5-dinitropyridine as described in the general procedure. The crude product is recrystallized from ether: petroleum ether4Was obtained in a yield of 33%: mp 56-7 ° C .; NMR δ 1.28 (t 6H), 3.57 (q, 4H), 8.81 (d, 1H), 9.10 (d, 1H).
O²-(3-nitropyridin-2-yl) 1- (N, N-diethyl) diazen-1-ium-1,2-diolate,5: 2-Chloro-3-nitropyridine was used for this reaction. The crude product was purified on a Flash 40 system using a 4.0 x 7.0 cm KP-Sil column eluting with 100% dichloromethane to give the product as a viscous oil in 52% yield: NMRδ1.25 (t , 6H), 3.55 (q, 4H), 7.26 (m, 1H), 8.48 (m, 2H).
Example 14
In this embodiment, O²Preparation of -vinyl 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate (V-PROLI / NO) will be described.
O²-(2-Bromoethyl) 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate 2-bromoethyl ester 3.56 g (9.2 mmol) in 10N sodium hydroxide solution 10 ml Was added.
When the biphasic mixture was stirred at 25 ° C., the compound gradually dissolved in the aqueous layer. After stirring overnight, the UV of the reaction mixture showed maximum absorption at 266 nm (starting material absorbed at 252 nm), indicating the formation of vinyl groups.
The solution was cooled to 0 ° C. and carefully acidified to pH 4 by slow addition of 10% hydrochloric acid. Care must be taken to keep the solution cold while adding the acid. The acidic solution was extracted with ethyl acetate, dried over sodium sulfate, and filtered through a magnesium sulfate layer. The solvent was distilled off to obtain 1.4 g of an oily product. Purification was done on a Flash 40 system with 4.0 x 7.0cm KP-Sil column and 2: 1 ethyl acetate: cyclohexane as eluent: ir (film) 3163,2987,1734,1630,1490cm^-1NMR (CDCl_Three) Δ2.06-2.3 (m, 4H), 3.62 (m, 2H), 4.47 (q, 1H), 4.77 (ABq, 1H), 5.02 (ABq, 1H), 6.75 (q, 1H); UVλ_max(Ε) 266nm (6.3mM^-1cm^-1); MS, m / z (%) 201 (M⁺, 5), 176 (10), 150 (49), 145 (27), 114 (9), 99 (45), 70 (99.9), 69 (57), 68 (45).
Example 15
In this example, O in the presence of glutathione.²It will be explained that NO is regenerated from-(2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate but not in the absence.
A 10 mM phosphate buffer containing 1 mM glutathione (GSH) was degassed by purging with argon for 10 minutes, and then a 3 ml aliquot was O²-(2,4-Dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate 2mM in 3ml of dioxane was mixed. The release of NO was monitored by chemiluminescence while maintaining the mixture at 37 ° C. After a short lag time, a peak of nitric oxide evolution was observed about 15 minutes after the start of the reaction, followed by an easily detectable level for about 100 minutes. Total NO generation during the first 112 minutes was about 9 nmol. O²Assuming that 2 nmol of NO per 1 mol of (2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate is generated, this 9 nmol is approximately 75% of the theoretical yield. Equivalent to%.
Generation of NO was not observed when the reaction was repeated as described above except that GSH was excluded. Nucleophilic glutathione is O²Reaction with-(2,4-dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate produced NO according to the following formula.

This example shows the O of the present invention.²-It has been shown that some of the aryl diazeniumdiolate compounds can be nucleophilically substituted by nucleophilic side chains of amino acids such as cysteine often found in the active site of enzymes. As a result of such nucleophilic substitution, an aryl derivative substituted with an amino acid residue and diazeniumdiolate capable of producing NO is generated through a predictable primary reaction.
O²-(2,4-Dinitrophenyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate and glutathione were assayed in the presence and absence of glutathione S-transferase. The assay was performed in a cell compartment, temperature controlled at 25 ° C., with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) in a final volume of 3 ml. The enzyme concentration was 0.7 μg / ml, while the glutathione concentration was 1.4 mM. The diazeniumdiolate concentration was varied from 50-100 μM. Using the integral type of Henri-Michaelis-Menten equation, K_mIs 46.3μM and V_maxIs 0.89μMmin^-1I found out that
Example 16
This example describes a synthetic route useful for the production of diazeniumdioled nucleotides, nucleosides and nucleic acids, and further converts the diazonium group to a diazeniumdiolate after converting the amino group to a diazonium group. Including reacting with O²-The synthesis route of aryl diazeniumdiolates will be described.
2'-deoxycytidine is reacted with nitric oxide in the presence of a suitable one-electron oxidant that results in the conversion of the cytidine amino group to a diazonium group (the oxidant is reduced and hydroxylated by the conversion). Product ions are generated). The resulting diazotized (ie, diazonium derivative) pyrimidine is then reacted with 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate ion as described in the previous examples, This produces a diazeniumdiolate 2'-deoxyuridine derivative. This diazeniumdiolate 2'-deoxyuridine derivative can react with strong nucleophiles (eg, hydroxide ions). As a result, 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate ion and 2'-deoxyuridine will be regenerated. This regenerated 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate ion will generate NO through a predictable primary reaction. This example demonstrates the principle of a mechanism that is suitable for targeting nitric oxide to specific biological sites in mammals and increasing the specificity of NO action.
Example 17
In this embodiment, O²-Demonstrate that aryl diazeniumdiolates can inactivate zinc finger proteins by releasing zinc.
Samples of recombinant nucleocapsid protein p7 (p7NC) from HIV-1 (LOArthur, AIDS Vaccine Program, NCI-FCRDC, Frederick, MD) in 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.0) at μg / ml Prepare and O²-Treated with 25 μmol of aryl diazeniumdiolate (in a total volume of 1.0 ml). As shown in FIG. 1, which is a graph of Trp37 fluorescence (RFU) versus time (minutes), at various time intervals, to prevent the introduction of any artificial quenching effect, the samples were treated with 10 mM sodium phosphate buffer ( pH = 7.0) and the fluorescence intensity of the tryptophan residue (Trp37) in the C-terminal zinc finger of p7NC in each sample was measured as previously described (Rice et al.,Int.Antiviral News3: 87-89 (1995)). The excitation and emission wavelengths utilized in the Shimadzu RF5000 fluorescence spectrometer were 280 and 351 nm, respectively. The results are shown in FIG. In the figure, ○ represents a negative control, that is, no drug, □ represents a positive control, that is, 642151 (Rice et al. (1997), see above), ■ represents the compound of Example 1 (LK1), and ◆ represents The compound (LK2) of Example 8 is represented, ▲ represents the compound (Lk3) of Example 5, ● represents the compound (Lk4) of Example 10, and x represents the compound of Example 11 (LK5). The result is O²-Shows that aryl diazeniumdiolates can release zinc from zinc finger proteins.
Example 18
In this embodiment, O²-Demonstrate the anti-HIV activity of aryl diazeniumdiolates.
A T4 lymphocyte cancer cell line called CEM-SS was synthesized in a fetal calf serum-containing synthetic medium (Rice et al.,Advances in Pharmacol.33: 389-438 (1995)). According to the XTT-based cell viability assay of the National Cancer Institute (see, eg, Rice et al. (1995), supra)²-Aryl diazeniumdiolates on HIV-1 infected and uninfected CEM-SS cells^-3.5~Ten^-7.0Administration was in the M concentration range.
After exposing CEM-SS cells to the compounds, the percent T cell survival was examined. Slightly toxic concentrations of O²-HIV-1 infected CEM-SS cells contacted with any of the aryl diazeniumdiolates also have substantially increased viability compared to untreated cells. Compounds 1-3 from Example 13 were particularly effective.
Example 19
This example describes the preparation of disodium 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate.
A solution of 10 g (0.087 mol) L-proline in 39 ml (0.18 mol) 25% sodium methoxide (in methanol), 20 ml methanol and 40 ml ether was degassed and exposed to 40 psi nitric oxide for 20 hours. The pressure was released and the solid residue was collected by filtration, washed with ether and dried in vacuo to give 17 g of white solid: mp 250 ° C. (decomposition); UV (0.01 N NaOH) λ_max(Ε) 252nm (8.4mM^-1cm^-1); NMR (D₂O) δ1.71 (m, 1H), 1.91 (m, 2H), 2.27 (m, 1H), 3.27-3.43 (m, 2H), 4.04 (m, 1H) (single lines of methanol at 3.34 were also observed ;);¹³C NMR, 24.45 ppm, 30.97, 48.73 (methanol), 54.95, 67.70, 182.75.
C, H, N analysis: C_FiveH₇N_ThreeO_FourNa₂・ CH_ThreeCalculated as OH: C 28.69%, H 4.41%, N 16.73%, Na 18.30%; found: C 28.65%, H 3.99%, N 16.74%, Na 18.04%.
Example 20
In this embodiment, O²-The preparation of methyl 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate methyl ester is described.
Disodium 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate (methanol solvate, FW 251; 6.8 g; 0.027 mol) is placed in a 300 ml 3-neck flask. And cooled to -20 ° C. Cold methanol (−20 ° C .; 200 ml) was added to the solid with stirring to obtain a homogeneous solution, which was further cooled to −35 ° C. A solution of 9.5 ml (0.1 mol) of dimethyl sulfate in 25 ml of ether was added dropwise over 15 minutes. The reaction mixture was then gradually warmed to room temperature and stirred for an additional 4 hours. The progress of the reaction was monitored by silica gel TLC using 10: 1 dichloromethane: ether as the developing solution. The reaction mixture was filtered, methanol was removed on a rotary evaporator and the residue was extracted with dichloromethane. The solution was washed with aqueous sodium bicarbonate, dried over sodium sulfate, and filtered through a magnesium sulfate layer. The solvent was distilled off to obtain an oily substance, which was allowed to stand for crystallization. Ether: Recrystallized from petroleum ether to give 945 mg (18%) of analytically pure sample: mp 62-63 ° C .; UV (0.01 N NaOH), λ_max(Ε) 252nm (6.79mM^-1cm^-1); NMRδ 2.05 (m, 3H), 2.30 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.83 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 4.55 (m, 1H); MS m / z (%) 203 (M⁺, 6), 188 (20), 58 (35), 120 (22), 99 (100), 95 (34), 69 (36), 59 (24); C₇H₁₃N_ThreeO_FourThe exact mass (M⁺) 203.0906, measured value (M⁺) 203.0906.
C, H, N analysis: C₇H₁₃N_ThreeO_FourCalculated as C 41.38%, H 6.45%, N 20.68%: Found C 41.48%, H 6.43%, N 20.59%.
Example 21
In this embodiment, O²The preparation of-(N, N-dimethylsulfamoyl) 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate is described.
A solution of 1.08 ml (0.01 mol) of N, N-dimethyl-sulfamoyl chloride in 5 ml of tetrahydrofuran was added to disodium 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl in 25 ml of 0.1N NaOH (brine). It was added to a cold (0 ° C.) solution of 1.57 g (0.0062 mol) of diazene-1-ium-1,2-diolate. The reaction mixture was warmed to room temperature and stirred overnight. The aqueous layer was extracted with dichloromethane, and the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate. After extraction, the aqueous layer did not show significant UV absorption, thus indicating that the extract was free of diazeniumdiolate. The organic layer was filtered through a magnesium sulfate layer and the solvent was removed on a rotary evaporator to give 989 mg of a pale yellow oil, which was chromatographed on silica gel using 5: 1 dichloromethane: ethyl acetate as eluent. Fractions containing the desired product were combined and concentrated in vacuo to give a solid which was recrystallized from ether: petroleum ether: mp 97-98 ° C; UV (0.01N NaOH) λ_max(Ε) 266nm (8.05mM^-1cm^-1); NMRδ 2.16 (m, 3H), 2.40 (m, 1H), 3.01 (s, 6H), 3.83 (m, 1H), 3.94 (m, 1H), 4.69 (q, 1H), 6.80 (b, 1H).
C, H, N, S analysis: C₇H₁₄N_FourSO₆Calculated as: C 29.79%, H 5.00%, N 19.85%, S 11.36%: Found C 29.93%, H 5.09%, N 19.76%, S 11.27%.
Example 22
In this embodiment, O²The preparation of -methoxymethyl 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate methoxymethyl ester is described.
A slurry of 485 mg (1.93 mmol) of disodium 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate in 20 ml of anhydrous tetrahydrofuran was cooled to 0 ° C. under a nitrogen atmosphere. After adding triethylamine (0.5 ml) to the cold solution, 360 mg (4.45 mmol) of chloromethyl methyl ether was slowly added followed by dropwise addition of 0.5 ml of methanol. The solution was then stirred for 1.5 hours with cooling. The reaction mixture was warmed to room temperature and stirred for an additional 1.5 hours under nitrogen. After stopping the reaction with crushed ice, the solvent was removed on a rotary evaporator and the residue was extracted with dichloromethane. The organic layer was washed with water, dried over sodium sulfate, filtered through magnesium sulfate and evaporated in vacuo to give 330 mg of a yellow oil, which was silica gel column eluting with 5: 1 dichloromethane: ethyl acetate. Purified with: UV (H₂O) λ_max(Ε) 250nm (8.58mM^-1cm^-1); NMRδ 2.09 (m, 3H), 2.35 (m, 1H), 3.48 (s, H), 3.71 (m, 2H), 3.90 (m, 1H), 4.61 (dd, 1H), 5.17 (ab q , 2H), 5.31 (ab q, 2H).
C, H, N analysis: C₉H₁₇N_ThreeO₆Calculated as: C 41.06%, H 6.51%, N 15.96%: Found C 40.87%, H 6.53%, N 15.76%.
Example 23
In this embodiment, O²The preparation of-(2-bromoethyl) 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate 2-bromoethyl ester is described.
A solution of 20 ml (0.28 mol) of bromoethanol in 50 ml of dichloromethane was cooled to 0 ° C., and a solution of 11.25 ml (0.28 mol) of sulfuryl chloride in 50 ml of dichloromethane was added dropwise to the solution. The resulting solution was kept at 4 ° C. for 72 hours. The solution was washed with cold 10% NaOH until the wash was clearly basic as a result of the test. The organic layer was dried over sodium sulfate, filtered through a magnesium sulfate layer and concentrated on a rotary evaporator. The resulting crude product (2-bromoethoxysulfonyl chloride, BrCH₂CH₂OSO₂Cl) was distilled in vacuo to give 35 g (56%) of a colorless oil: boiling point (at 1.5 mmHg) 73-75 ° C .; NMR δ 3.64 (t, 2H), 4.752 (t, 2H); MS m / z (%) 221 (M⁺, 1), 143 (10), 129 (25), 106 (100), 93 (62). C, H, N, S, X analysis: C₂H_FourSO_ThreeCalculated values for ClBr: C 10.75%, H 1.80%, S 14.35%, 71.52% for all halogens as Br and 31.72% for Cl; measured values: C 10.82% H 1.80%, S 14.35%, all halogens as Br 71.63% and 31.78% as Cl.
Disodium 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate (4.86 g; 0.0194 mol) was placed in a 100 ml round bottom flask with 2.2 g of anhydrous sodium carbonate. . The flask was immersed in a dry ice-acetonitrile bath (−40 ° C.) and 50 ml of cold (−20 ° C.) ethanol was added. The mixture was then stirred and stabilized at −40 ° C. under a nitrogen atmosphere. To the cold slurry, 9.45 g (0.0422 mol) of 2-bromoethoxysulfonyl chloride was added by syringe over 10 minutes. After stirring for 2 hours, the reaction mixture was warmed to 15 ° C. and stirred for an additional 2 hours. The reaction mixture was poured into 250 ml of ice water and extracted with dichloromethane. The organic layer was washed with an aqueous sodium hydrogen sulfite solution, dried over sodium sulfate, filtered through a magnesium sulfate layer, and then the solvent was removed with a rotary evaporator. The crude product was subjected to silica gel column chromatography using 1: 1 cyclohexane: ethyl acetate as an eluent to obtain 2.7 g (36%) of a yellow oily substance: NMRδ2.11 (m, 3H), 2.35 ( m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.68 (m, 1H), 3.86 (m, 1H), 4.46 (m, 4H), 4.59 (m, 1H); UV (H²O) λ_max(Ε) 252nm (6.6mM^-1cm^-1).
Example 24
In this embodiment, O²-[S-acetyl- (2-mercaptoethyl)] 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate [S-acetyl- (2-mercaptoethyl) The preparation of the ester is described.
1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU, 1.03 g; 0.0068 mol) was added O in 35 ml of tetrahydrofuran.²-(2-bromoethyl) 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate 2-bromoethyl ester added to a solution of 1.33 g (0.0034 mol) The solution was stirred at room temperature under nitrogen. Two equivalents of thiolacetic acid (0.479 ml, 0.0068 mol) were added and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The mixture was filtered and the solid residue was washed with ether. The filtrate was evaporated and dried under reduced pressure, and the residue was extracted with methylene chloride. The organic layer was washed sequentially with water-cooled 5N HCl, aqueous sodium bicarbonate and water. The solution was dried over sodium sulfate, filtered through a magnesium sulfate layer and evaporated in vacuo to give 710 mg of a yellow oil. Chromatography was performed on a silica gel column, eluting with 1: 1 cyclohexane: ethyl acetate: UV (H₂O) λ_max(Ε) 232nm (7.0mM^-1cm^-1); NMRδ 2.09 (m, 3H), 2.36 (m, 1H), 2.38 (s, 6H), 3.09 (m, 4H), 3.78 (m, 2H), 4.27 (m, 4H), 4.55 (m, 1H).
Example 25
This example describes the determination of the half-life of the compound prepared in Example 24 at 25 ° C. and pH 7.4 in the absence and presence of porcine liver esterase.
0.009M O²-[S-acetyl- (2-mercaptoethyl)] 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate [S-acetyl- (2-mercapto-ethyl) )] An ester stock solution of ethanol was prepared. Disintegration of this compound was measured at 1.5 x 10 in a 4 ml quartz cuvette containing 3 ml phosphate buffer (pH 7.4) and 50 ml stock solution.^-FourMonitoring was performed at 25 ° C. as an M solution. The disappearance of the 232 nm chromophore was monitored with an ultraviolet spectrophotometer. The half-life was estimated to be 3.2 hours.
A second set of experiments was performed using the above parameters and the decay after adding 5 ml of porcine liver esterase suspension was measured. The half-life for the esterase reaction was 8 minutes at 25 ° C.
Example 26
In this embodiment, O²-[S-acetyl- (2-mercaptoethyl)] 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate [S-acetyl- (2-mercaptoethyl) The preparation of the nitric oxide releasing polymer mixture of esters is described.
O in 1 ml of tetrahydrofuran²-[S-acetyl- (2-mercaptoethyl)] 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate [S-acetyl- (2-mercaptoethyl) ] A solution of 50 mg (0.132 mmol) of the ester was dissolved in a solution of 498 mg of polyurethane in 10 ml of tetrahydrofuran. The uniform lacquer is concentrated under a stream of dry nitrogen gas and then further dried under high vacuum to obtain O per mg of polymer composite.²-[S-acetyl- (2-mercaptoethyl)] 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate [S-acetyl- (2-mercaptoethyl) A solid containing 0.091 mg (0.24 mmol) of ester was obtained. The NO release rate was measured at 37 ° C. using a chemiluminescence detector as a function of time after immersion of a 32 mg aliquot of diazeniumdiolate (2 ml phosphate buffer, pH 7.4). One set of experiments was performed in a buffer free of contaminants, while the other set was performed in the presence of porcine liver esterase. In the absence of enzyme, very little NO was released over 200 hours, but when the enzyme was present in the buffer, NO production was observed at a significant rate. This indicates that as diazeniumdiolate leaks from the polymer composite, it is hydrolyzed enzymatically and further cleaved to NO.
Example 27
In this example, nitric oxide-releasing O to β-cyclodextrin²-[S-acetyl- (2-mercaptoethyl)] 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate [S-acetyl- (2-mercaptoethyl) The introduction of ester is described.
β-cyclodextrin (228 mg, 0.201 mmol) was mixed with 2 ml of water and heated to 65 ° C. to obtain a homogeneous solution. To the warm solution, O²-[S-acetyl- (2-mercaptoethyl)] 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate [S-acetyl- (2-mercaptoethyl) ] 76 mg (0.201 mmol) of ester were added. A white precipitate formed upon mixing. The mixture was cooled to room temperature and the product was collected by filtration, washed with water and dried in vacuo to give 170 mg of product. 33mg O²-[S-acetyl- (2-mercaptoethyl)] 1-[(2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate [S-acetyl- (2-mercaptoethyl) ] An aqueous solution containing an ester: β-cyclodextrin mixture has a maximum absorption at 232 nm and a molar extinction coefficient (ε) of 10.8 mM.^-1cm^-1showed that. The NO release rate was measured at 37 ° C. using a chemiluminescence detector as a function of time after immersion of a 13 mg aliquot of the encapsulated material (in 4 ml phosphate buffer, pH 7.4). One set of experiments was performed in a buffer free of contaminants, while the other set was performed in the presence of porcine liver esterase. In the absence of enzyme, very little NO was released over 400 hours, but when the enzyme was present in the buffer, NO production was observed at a significant rate.
Example 28
In this embodiment, O²Describe the general procedure for the preparation of glycosylated diazeniumdiolates.
2,3,4,6-tetraacetyl-α-D-glucopyranosyl bromide (acetobromoglucose) was obtained by Redemann et al.,Org.Syn.Coll.Vol.III: Prepared as described in 11-14 (1955). 2,3,4,6-tetraacetyl-α-D-mannopyranosyl bromide (acetobromomannose) was obtained from Levene et al.,J. Biol. Chem.90: 247-250 (1931). A slurry of 1 equivalent of diazeniumdiolate (0.5 mmol solid / 1 ml DUSO) in dimethyl sulfoxide (DMSO) was then stirred at room temperature under nitrogen with 0.03 equivalent of silver oxide. 1.2 equivalents of 0.5M solution of acetobromomannose or acetobromoglucose in DMSO was added dropwise and the mixture was stirred for 3 days. The obtained homogeneous solution was poured into 100 ml of ice water and extracted with ether. The ether layer was washed with water, dried over sodium sulfate and treated with charcoal. The solution was filtered through magnesium sulfate, concentrated on a rotary evaporator and dried in vacuo. The glucose derivative was purified by recrystallization, but the glassy mannose addition product required column chromatography.
Example 29
This example describes the preparation of sodium 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate (“DEA / NO”).
A solution of 119 g (1.63 mol) diethylamine in 100 ml 1: 1 ether: acetonitrile was placed in a 500 ml Parr bottle. The solution was degassed and charged with 40 psi nitric oxide and left at room temperature overnight. The pressure was released and the crystalline product was collected by filtration and dried under nitrogen to give 13 g of diethylammonium 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate. This salt was treated with 10 ml of 10M sodium hydroxide solution and the resulting paste was treated with 200 ml of ether to obtain the sodium salt. The sodium salt (“DEA / NO”) was collected by vacuum filtration, washed with ether and dried in vacuo to give 7.1 g of product: UV (in 0.01N NaOH) λ_max(Ε) 250 (6.88mM^-1cm^-1); NMR (D₂O) δ 0.96 (t, 3H), 2.94 (q, 2H); DMSO-d₆Medium δ 0.84 (t, 3H) and 2.75 (q, 2H).
Example 30
In this embodiment, O²The preparation of-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate is described.
DEA / NO (2.98 g; 0.019 mol) in DMSO was reacted with 6.9 g of acetobromoglucose (0.017 mol) as described in the general procedure of Example 28. The product was recrystallized from petroleum ether to give 108 mg of 5.7 g (72%) crystalline solid: mp 107-108 ° C .; UVλ_max(Ε) 228nm (6.92mM^-1cm^-1); NMRδ1.11 (t, 6H, J = 7.11), 2.02 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 3.21 (q, 4H, J = 7.12), 3.81 (m, 1H), 4.20 (m, 2H), 5.14 (m, 1H), 5.33 (m, 3H). Analysis: C₁₈H₂₉N_ThreeO₁₁Calculated as: C, 46.65; H, 6.31; N, 9.07. Found: C, 46.73; H, 6.26; N, 9.01.
Example 31
In this embodiment, O²Removal of (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl) 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate (from Example 30) Acylation is described.
A solution of 253 mg (0.55 mmol) of the above compound in 5 ml of methanol was stirred with 10 μl of 25% methanolic sodium methoxide. Reaction progress 5: 1 CH₂Cl₂: Monitored by TLC using ethyl acetate. The reaction was complete within 1 hour at 25 ° C.
Dowex-50W-H⁺Resin (1 g) was added to the stirring methanol solution. The mixture is filtered to remove the resin and the methanol solution is evaporated in vacuo to remove O.sub.2.²-Glucopyranosyl 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate 122 mg (75%) was obtained: UVλ_max(Ε) 228nm (6.4mM^-1cm^-1); NMR (CDCl_Three) Δ1.08 (t, 6H), 3.23 (9,4H), 5.59 (m, 4H), 3.88 (m, 2H), 5.29 (m, 1H)
Surprisingly, this deacylated product, despite its acetal-like structure, was very slowly at pH 3 1- (N, N-diethylamino) diazen-1-ium-1,2-diolate (DEA / It was only cleaved to the NO) anion and then to NO. Even more surprising, this cleavage proceeded very rapidly at pH 13.
Example 32
This example describes the preparation of sodium 1-[(1-ethoxycarbonyl) piperazin-4-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate.
A solution of 20 g (0.126 mol) carboethoxypiperazine in 60 ml methanol was placed in a Parr bottle. The solution was treated with 27.4 ml (0.126 mol) of 25% sodium methoxide in methanol. The system was degassed and charged with 40 psi nitric oxide and held at 25 ° C. for 48 hours. The white crystalline product was filtered off and washed with cold methanol and copious amounts of ether. The product was dried in vacuo to give 14.5 g (48% yield) of sodium 1-[(1-ethoxycarbonyl) piperazin-4-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate: melting point: 184 -185 ℃; UV (0.01N NaOH) λ_max(Ε) 252nm (10mM^-1cm^-1); NMR (D₂O) δ1.25 (t, 3H), 3.11 (m, 2H), 3.68 (m, 2H), 2.15 (q, 2H). Analysis: C₆H₁₃N_FourO_FourCalculated as Na: C 35.00%, H 5.42%, N 23.33%, Na 9.58%. Found: C 34.87%, H 5.53%, N 23.26%, Na 9.69%. The half-life of this compound at pH 7 and 25 ° C. was estimated to be 5 minutes. This measurement was based on the disappearance of the 252 nm chromophore in the ultraviolet spectrum.
Example 33
In this embodiment, O²The preparation of-(glucopyranose-2-yl) 1-[(1-ethoxycarbonyl) piperazin-4-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate tetraacetate ester is described.
Acetobromoglucose (2.055 g; 0.005 mol) and sodium 1-[(1-ethoxycarbonyl) piperazin-4-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate 1.11 g (0.00466 mol) as described above. React with O²-(Glucopyranose-2-yl) 1-[(1-ethoxycarbonyl) piperazin-4-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate tetraacetate ester 624 mg (25%) was obtained: UVλ_max(Ε) 228nm (7.20mM^-1cm^-1); NMRδ 1.26 (t, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 3.46 (m, 4H), 3.68 (m, 4H), 3.82 (m, 1H), 4.17 (q, 2H), 4.25 (m, 3H), 5.27 (m, 3H).
Example 34
In this embodiment, O²The preparation of-(mannopyranose-2-yl) 1-[(1-ethoxycarbonyl) piperazin-4-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate tetraacetate is described.
Acetobromomannose (10.2 g; 0.025 mol) and sodium 1-[(1-ethoxycarbonyl) piperazin-4-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate 5.28 g (0.022 mol) as described above. Reaction gave 6.4 g (53%) of glassy material: UVλ_max(Ε) 238nm (7.5mM^-1cm^-1); NMRδ 1.29 (t, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 3.13 (m, 1H), 3.50 (m, 4H), 3.78 (m, 5H), 4.19 (q, 2H), 4.27 (m, 3H), 5.28 (m, 3H), 5.42 (m, 1H).
Example 35
In this example, O directed to the mannose-fucose receptor.²-Describes the preparation of glycosylated diazeniumdiolates.
Bis- [2- (N-ethoxycarbonylamino) ethyl] amine: A three-necked flask equipped with two dropping funnels was immersed in an ice-water bath. Diethylenetriamine (10.7 g, 0.104 mol) was placed in the cold flask and dissolved in 100 ml of 95% ethanol. To the cold solution was added dropwise 10 ml (0.205 mol) of ethyl chloroformate. A solution of 10.6 g (0.1 mol) sodium carbonate in 100 ml distilled water was added simultaneously with 10 ml (0.205 mol) ethyl chloroformate. The reaction mixture was stirred at room temperature overnight. The ethanol was removed on a rotary evaporator and the aqueous portion was extracted with dichloromethane. The organic layer was washed with water and then extracted with 5% hydrochloric acid. Separate the organic layer containing the neutral product. The aqueous layer was extracted with dichloromethane and made basic with sodium hydroxide. The product was extracted into dichloromethane, dried over sodium sulfate, filtered through magnesium sulfate and evaporated to give 4 g of a colorless oil: NMR (CDCl_Three) Δ1.25 (t, 6H), 2.78 (m, 4H), 3.36 (m, 4H), 4.14 (q, 4H), 5, 13 (b, 2H).
Sodium 1- [bis- {2- (N-ethoxycarbonylamino) ethyl} amino] diazen-1-ium-1,2-diolate: bis- [2- (N-ethoxycarbonylamino) in 20 ml ether and 5 ml methanol ) Ethyl] A solution of 2.6 g (0.011 mol) of amine in a 50 ml Parr bottle, treated with 2.4 ml (0.011 mol) of 25% methanolic sodium methoxide, degassed, cooled at −80 ° C. and cooled to 50 psi. Filled with nitric oxide. A cloudy precipitate was observed after stirring for 3 hours. The mixture was exposed to NO for 24 hours, the pressure was released and the product was filtered. The solid was washed with ether and dried in vacuo to give 1.26 g (35%) of diazeniumdiolate: mp 170-2 ° C .; UVλ_max(Ε) 252nm (7.6mM^-1cm^-1); NMR δ 1.24 (t, 6H), 3.19 (m, 8H), 4.11 (q, 4H).
O²-(Mannose-2-yl) 1- [bis- {2- (N-ethoxycarbonylamino) ethyl} amino] diazen-1-ium-1,2-diolate tetraacetate: in 2 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO) A portion of a solution of sodium 1- [bis- {2- (N-ethoxycarbonylamino) ethyl} amino] diazene-1-ium-1,2-diolate 251 mg (0.763 mmol) was cooled to 0 ° C. under nitrogen. To this was added 10 mg (0.06 mmol) of silver acetate followed by the slow addition of 1 ml of a 0.82 M acetobromomannose solution in tetrahydrofuran. The reaction mixture was stirred for 48 hours at room temperature, poured into ice water and extracted with ether. The ether solution was dried over sodium sulfate, filtered through a magnesium sulfate layer and evaporated in vacuo to give 307 mg of an oil: UVλ_max240nm.
O²-(Mannose-2-yl) 1- [bis (2-aminoethyl) amino] diazen-1-ium-1,2-diolate]:
O in a mixture of 2 ml of 10N NaOH, 2 ml of ethanol and 2 ml of water²A solution of 145 mg (0.23 mmol) of-(mannose-2-yl) 1- [bis- {2- (N-ethoxycarbonylamino) ethyl} amino] diazen-1-ium-1,2-diolate tetraacetate Heated to reflux for hours. The solution was concentrated under vacuum and the remaining aqueous solution was extracted with dichloromethane. The aqueous solution was evaporated to dryness under vacuum. The residue was taken up in methanol and passed through a 10 g, 60 cc Prepack C-18 column and eluted with methanol. Fractions showing maximum absorption at 236 nm were collected and the solvent was distilled off to give 32 mg of white powder: NMR (CD_ThreeOD) δ 2.74 (t, 4H), 3.02 (t, 4H), 3.74 (m, 4H), 4.2 (m, 3H); UVλ_max238nm.
Example 36
This example describes the preparation of a combinatorial library using disodium 1- (2-carboxylato) pyrrolidin-1-yl diazene-1-ium-1,2-diolate (PROLI / NO) as a starting material. .
Piperazine trityl resin 1 available from Calbiochem-Novabiochem Int'l. (San Diego, Calif.) Is treated with sulfuryl chloride to form chlorosulfonamide 2. This resin is reacted with PROLI / NO to give compound 3. Free carboxylic acid can be activated to 4 by reaction with dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide. R to resin-bound diazeniumdiolate³⁰A potentially large library of compound 5 substituted with the carboxylate group of the molecule by nucleophilic addition of XH (X = O, N, S) is provided. 5 base hydrolysis liberates anionic diazeniumdiolate 6 from the resin. This library 6 is used as an electrophile.³¹It can be reacted with X to form a new set of compounds having structure 7.

The publications, patents and patent applications cited herein are individually and specifically stated for each publication to be incorporated by reference, and are hereby incorporated by reference to the same extent as fully disclosed. It is to be incorporated.
While the invention has been described with emphasis on preferred embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that the preferred embodiments can be modified. It is contemplated that the present invention may be practiced other than as specifically described herein. Accordingly, this invention includes all modifications encompassed within the spirit and scope of the appended claims.

Claims (32)

formula

[In the formula, ^{_{X, - O-, - O 3 S-}} , amino, polyamino, C ₁ -C ₂₄ aliphatic group, the aryl, C ₃ -C ₃₀ non-aromatic ring group, an oxime, a polycyclic group and aromatic Selected from the group consisting of polycyclic groups, wherein X is — [N (NO) O ⁻ ], halo, hydroxy, alkylthio, alkoxy, aryloxy, amino, cyano, sulfonate, mercapto, nitro, C ₁ — C ₁₂ aliphatic radical, C ₃ -C ₈ cycloalkyl, C ₃ -C ₈ heterocycloalkyl, C ₃ -C ₁₂ olefinic group, benzyl, phenyl, benzyl carbonyl, phenylcarbonyl, sugar, phosphono, and one or more oxygen atoms, (wherein, R ¹ is C ₁ -C ₈ aliphatic group, a cycloalkyl or an aryl group.) independently S or NR ¹ is selected from the group consisting of phosphato, which are replaced by 1 Others may be substituted with more groups, and, X is either may be bonded to the polymer, or may be part of a polymer, and Q is acridine, anthracene, Baie Nzofuran, benzothiophene, benzoxazole, benzopyrazole, benzothiazole, carbazole, chlorophyll, cinnoline, furan, imidazole, indole, isobenzofuran, isoindole, isoxazole, isothiazole, isoquinoline, naphthalene, oxazole, phenanthrene, phenanthridine, Phenothiazine, phenoxazine, phthalimide, phthalazine, phthalocyanine, porphine, pteridine, may be part of nucleic acid, may be purine, pyrazine, pyrazole, pyridazine, pyridine, part of nucleic acid There pyrimidine, Pirokorin, pyrrole, quinolizinium ion, quinoline, quinoxaline, quinazoline, sydnone, tetrazole, thiazole, thiophene, thyroxine, Ru is selected from the group consisting of a triazine and triazole groups, wherein, the equivalent base ring The atom is bound to O ² -oxygen , Q may be part of a vitamin or part of a hormone, respectively, and Q is X [N (O) NO] ⁻ (where X are as defined above.), halo, hydroxy, alkylthio, arylthio, alkoxy, aryloxy, amino, ammonio, nitroso, cyano, sulfonato, mercapto, nitro, oxo, C ₁ -C ₂₄ aliphatic groups, C ₃ -C ₁₂ olefin groups, C ₃ -C ₂₄ cycloalkyl, C ₃ -C ₂₄ heterocycloalkyl, Njiru, phenyl, benzyl carbonyl, phenylcarbonyl, saccharides, phosphono, and 1 or more oxygen atoms, independently S or NR ¹ (in the formula, R ¹ is C ₁ -C ₁₀ aliphatic group, a cycloalkyl or An aryl group. ) May be substituted with one or more groups selected from the group consisting of phosphato . However, when Q is imidazole, X is not imidazole. ]
The having O ² - substitution diazeniumdiolate (diazeniumdiolate). The diazeniumdiolate of claim 1, wherein the Q group is part of a vitamin. The diazeniumdiolate of claim 1, wherein the Q group is part of a hormone. The diazeniumdiolate of claim 1, wherein Q is a pyrimidine which may be part of a nucleic acid. The diazeniumdiolate of claim 4, wherein Q is ribosylpyrimidine. The diazeniumdiolate of claim 1, wherein Q is a purine that may be part of a nucleic acid. 7. A compound according to claim 6 wherein Q is ribosylpurine. The diazeniumdiolate of any of claims 1-7, wherein X is attached to the N ¹ nitrogen through an atom different from the carbon atom. X is — [N (NO) O ⁻ ], halo, hydroxy, alkylthio, alkoxy, aryloxy, amino, cyano, sulfonate, mercapto, nitro, C ₁ -C ₁₂ aliphatic group, C ₃ -C ₈ cycloalkyl. , C ₃ -C ₈ heterocycloalkyl, C ₃ -C ₁₂ olefinic group, benzyl, phenyl, benzyl carbonyl, phenylcarbonyl, sugar, phosphono, our and 1 or more oxygen atoms, S independently or NR ¹ (in the formula, R ¹ is C ₁ -C ₈ aliphatic group, a cycloalkyl or a. a a reel group) substituted with one or more groups selected from the group consisting of phosphato, which are replaced by The diazeniumdiolate of any of claims 1-8. Q is, X [N (O) NO ] - (. Wherein, X is as defined in claim 1, wherein), halo, hydroxy, alkylthio, arylthio, alkoxy, aryloxy, amino, A Nmonio, two Toroso, cyano, sulfonato, mercapto, nitro, oxo, C ₁ -C ₂₄ aliphatic radical, C ₃ -C ₁₂ olefinic groups, C ₃ -C ₂₄ cycloalkyl, C ₃ -C ₂₄ heterocycloalkyl, benzyl, phenyl, base down Jill carbonyl, phenylcarbonyl, saccharides, Ho Suhono, Contact and 1 or more oxygen atoms, in independently S or N R ¹ (wherein, R ¹ is C ₁ -C ₁₀ aliphatic group, cyclo alkyl or an a reel group.) consisting of by being phosphato that replaced the substituted with one or more groups selected from the group, one of the ranges 1-9 claims Jiazeniu Dioleate. formula

[Wherein b and d may be the same or different and may be 0 or 1, and R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ and R ⁵ may be the same or different and represent hydrogen, C ₃ -C _{Consists of 8} cycloalkyl, C _1-12 linear or branched alkyl, benzyl, benzoyl, phthaloyl, acetyl, trifluoroacetyl, p-toluyl, t-butoxycarbonyl and 2,2,2-trihalo-t-butoxycarbonyl Selected from the group, and i, j and k are the same or different and are integers of 2 to 12. ]
The diazeniumdiolate of claim 1 having: formula

[Wherein D is

Wherein R ¹⁰ and R ¹¹ are the same or different and are hydrogen, C _3-8 cycloalkyl, C _1-12 linear or branched alkyl, benzyl, benzoyl, phthaloyl, acetyl, trifluoroacetyl, Selected from the group consisting of p-toluyl, t-butoxycarbonyl and 2,2,2-trichloro-t-butoxycarbonyl, and f is an integer from 0-12. ]
The diazeniumdiolate of claim 1 having: formula:

Wherein R ⁶ and R ⁷ may be the same or different and are H, C ₁ -C ₁₂ linear alkyl, C ₁ -C ₁₂ alkoxy or acyloxy substituted linear alkyl, C ₂ -C ₁₂ hydroxy or halo. substituted straight chain alkyl, C ₃ -C ₁₂ branched alkyl, C ₃ -C ₁₂ hydroxy, halo, alkoxy or acyloxy substituted branched chain alkyl, C ₂ -C ₁₂ linear olefins group, or C ₃ -C ₁₂ branched olefins, A group, wherein R ⁶ and R ⁷ may be substituted with hydroxy, alkoxy, acyloxy, halo or benzyl; or R ⁶ and R ⁷ together with the nitrogen atom to which they are attached. And

(Wherein, A is N H, O, or S, w is 1 to 12, y is 1 or 2, z is 1 to 5, R ⁸ is hydrogen, C ₁ -C ₈ linear alkyl, C ₃ -C ₈ branched alkyl, C ₃ -C ₈ cycloalkyl are the aryl, and R ⁹ is hydrogen, C ₁ -C ₆ straight chain alkyl or C ₃ -C ₆ branched-chain Alkyl, provided that R ⁶ and R ⁷ are not both H. to form a heterocycle selected from the group consisting of: ]
The diazeniumdiolate of claim 1 having: R ⁶ is hydrogen, diazeniumdiolate claims 13. R ⁶ and R ⁷ are ethyl and Q is

The diazeniumdiolate of claim 13, selected from the group consisting of: The diazeniumdiolate of any of claims 1-15, wherein X is attached to the polymer. 17. The diazenium of claim 16, wherein the polymer is selected from the group consisting of polyolefin, polyurethane, peptide, protein, polyethyleneimine, starburst dendrimer, polyamide, polyether, polyester, nucleic acid and polysaccharide. Georate. The diazeniumdiolate of claim 17, wherein the polyolefin is selected from the group consisting of polystyrene, polyethylene, polytetrafluoroethylene, polyvinyl chloride, and polyvinylidene difluoride. The diazeniumdiolate of claim 17, wherein the polyamide is nylon. O ² - atoms Q which oxygen is bonded is carbon or nitrogen, either diazeniumdiolate range 1 and 8-19 of the claims. A composition comprising the diazeniumdiolate of any of claims 1-20 and a carrier. O ² - atoms Q which oxygen is bonded is carbon or nitrogen, compositions within the scope 21 of claims. In animals, for treating or preventing a biological disorder that can be treated or prevented with nitric oxide, one of diazeniumdiolate or expression claims 1- 20

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
A composition comprising a diazeniumdiolate and a carrier . Diazeniumdiolate or formula of any of claims 1-20

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
Zia by peptidase onium diolate to treat infected animals by infectious agent comprising a zinc finger protein that can be inactivated, either diazeniumdiolate or expression claims 1- 20

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
A composition comprising a diazeniumdiolate and a carrier . 25. The composition of claim 24 , wherein the zinc finger protein comprises a C-X2-C-X4-H-X4-C domain. Diazeniumdiolate or formula of any of claims 1-20

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
Zia by peptidase onium diolate for treating animals for cancer involved in zinc finger protein can be inactivated, either diazeniumdiolate or expression claims 1- 20

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
A composition comprising a diazeniumdiolate and a carrier . Diazeniumdiolate or formula of any of claims 1-20

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
A method of treating a plant, plant cell or cultured tissue thereof infected with an infectious agent comprising a zinc finger protein that can be inactivated by a diazeniumdiolate of
21. A diazeniumdio of any of claims 1-20 , in an amount sufficient to inactivate zinc finger protein in the infectious agent so as to treat infection of the plant, plant cell or cultured tissue thereof. Rate or formula

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
A method comprising contacting said diazeniumdiolate with said plant, plant cell or cultured tissue thereof. 28. The method of claim 27 , wherein the infectious agent is a virus. 30. The method of claim 28 , wherein the virus is selected from the group consisting of tobacco streak virus and alfalfa mosaic virus. Diazeniumdiolate or formula according to any of claims 1-20 , wherein adjustment of steroid hormone activity is required

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
Jiazeniumujio of the diazeniumdiolate including steroid hormone receptor protein comprising a zinc finger that can be inactivated, for adjusting the scan steroid hormone activity in a mammal of any of claims 1- 20 Rate or formula

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
A composition comprising a diazeniumdiolate and a carrier . Diazeniumdiolate or formula of any of claims 1-20

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
A method for reducing the presence of infectious agents in an inanimate object, including zinc finger proteins that can be inactivated by the diazeniumdiolate of
A diazeniumdiolate or formula of any of claims 1-20 , in an amount sufficient to inactivate zinc finger proteins so as to reduce the presence of infectious agents on the inanimate object.

[Wherein X and Q are imidazoles. ]
A method comprising contacting the inanimate object of said diazeniumdiolate. 32. The method of claim 31 , wherein the infectious agent is selected from the group consisting of viruses, bacteria and parasites.

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