JP4278118B2

JP4278118B2 - Phosphorylated sugar and method for producing the same

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Publication number: JP4278118B2
Application number: JP23654698A
Authority: JP
Inventors: 健二戸尾; 寛釜阪; 要日下; 隆栗木; 茂孝岡田
Original assignee: Ezaki Glico Co Ltd
Current assignee: Ezaki Glico Co Ltd
Priority date: 1997-08-08
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2018-08-07
Also published as: JPH11158197A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、グルカンとリン酸がエステル結合している糖類（本発明においてリン酸化糖と略す）のグルコース残基の６位と３位に結合しているリン酸基のうち、６位のリン酸基を特異的に脱リン酸化するホスファターゼＫＵ−８（以下本酵素と呼ぶ）、および本酵素を用いる、リン酸が結合している部位が構成グルコース分子の３位ばかりの少糖および多糖（以下、３位リン酸化糖と称する）の製法ならびにその３位リン酸化糖に関する。また、本発明はリン酸化糖のグルコース残基の６位と３位の結合リン酸基のうち、３位の結合リン酸基のみ脱リン酸化する処理、本処理を用いるリン酸が結合している部位が構成グルコース分子の６位ばかりの少糖および多糖（以下、６位リン酸化糖と称する）の製法ならびにその６位リン酸化糖に関する。さらに、本発明は３位あるいは６位リン酸化糖の還元末端が還元され糖アルコールとなったリン酸化糖アルコール（以下、３位あるいは６位リン酸化糖アルコールと称する）、３位あるいは６位リン酸化糖とタンパク質またはペプチドとの複合体であるリン酸化糖誘導体、もしくは３位あるいは６位リン酸化糖あるいはリン酸化糖誘導体とアルカリ土類金属あるいは鉄との結合体であるリン酸化糖誘導体に関する。
【０００２】
これらの３位あるいは６位リン酸化糖あるいはリン酸化糖誘導体は、カルシウムなどのアルカリ土類金属または、鉄の沈殿阻害効果（以下、可溶化という）、あるいはカルシウムなどの吸収促進作用を有している。さらに、３位あるいは６位リン酸化糖は難消化性であり、低カロリーであると同時に整腸作用も期待できる。従って、本発明は、食品、飲料、飼料、あるいは肥料に含まれるまたは含有させたカルシウムなどのアルカリ土類金属、または、鉄の生体への吸収を促進させることによって、あるいは、難消化性糖を摂取することによって、ヒトや動物の健康を増進して各種の疾患を予防する原料、飲食用組成物、食品添加用組成物、医薬品用組成物あるいは飼料の原料または組成物として有用である。
【０００３】
また、本発明品は食品のもつ甘みをさわやかな甘みに変えたり、塩味を増強したりする味質改善効果もあり、本効果を期待して食品へも有効に添加し得る。本発明はまた、植物へのカルシウムの吸収を促進して、植物あるいは果樹の日持ちを向上させる肥料の原料や組成物に関する。さらに、本発明品は、虫歯の予防効果を有しており、詳細には食品、飲料、飼料はもとより、練り歯磨き、マウスウオッシュ、トローチなどの口腔用組成物にも添加され得る。本発明は、種々のスケール、特にカルシウム系およびマグネシウム系スケールの発生を防止または抑制し得るスケール防止剤として使用され得る。また、この金属キレート作用およびｐＨ緩衝作用、保湿作用を有しており、シャンプー、リンス等の洗髪用組成物はもとより化粧品、整髪用組成物としても有用である。
【０００４】
尚、リン酸化糖を用いた製品において、その製造過程あるいは保存過程においてアミノカルボニル反応による褐変現象が生じることが好ましくない場合には、還元末端を還元したリン酸化糖アルコールを用いるとこれを避けることができる。
【０００５】
【従来の技術】
植物が貯蔵する澱粉の多くには、澱粉を構成するグルコースに一部リン酸がエステル結合している。澱粉中のリン酸含有量としては微量であるがゼロではなく、とりわけ芋類の澱粉には比較的多く、中でも馬鈴薯澱粉はリン酸基を多く含んでおり、リン酸含有量の非常に高い品種も存在している（矢木敏博ら、澱粉科学、２０巻、５１頁、１９７３年）。馬鈴薯澱粉中ではこれを構成するグルコース残基にリン酸基が比較的多くエステル結合していることが知られており、その９９％以上が６位あるいは３位に結合していることが知られている。（Ｔａｋｅｄａ＆Ｈｉｚｕｋｕｒｉ、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ、１０２巻３２１−３２７頁、１９８２年）。このような澱粉をアミラーゼなどの澱粉分解酵素を用いて分解する場合、澱粉構造中のリン酸基がエステル結合したグルコース残基の近傍には酵素は作用できず、この部分はリン酸化された少糖の形で未分解のまま残ることが知られている。釜阪らのリン酸化糖に関する技術（特開平８−１０４６９６）はこのような特性を生かし、糖質分解酵素を巧みに利用し効率的な製造法を確立したものであり、以下に要約したように食品およびその周辺用途への新しい利用技術を確立したものであった。
【０００６】
食品から摂取すべき栄養素の中で、ミネラルは、生体の機能を維持するために欠くことができない。しかし、このミネラルは現在の食生活においては不足しがちで、このため健康上への影響が問題となっている。例えば、１日のカルシウムの平均摂取量は栄養所要量の６００ｍｇに達していない（厚生省、平成９年度国民栄養調査）。カルシウムは容易に無機リン酸と結合し不溶性の沈殿を形成しやすく、特にカルシウムの吸収部位である腸管内は微アルカリ性になっており、このカルシウムの不溶化が促進されるために吸収されにくいわけである。さらにカルシウムは骨や歯などに多く存在し、生体での需要が高いことも事実であり、カルシウムの不足は骨粗鬆症等の各種疾患の発症につながることもわかっている（江澤郁子、日本栄養食糧学会誌、４９巻、２４７〜２５７頁、１９９６年）。また、同様に鉄やマグネシウムについてもその吸収率の悪さが知られており、カルシウムと同様に、摂取不足は各種疾患に関わっている（Ｒ．Ｄ．Ｂａｙｎｅｓ、Ａｎｎｕ. Ｒｅｖ. Ｎｕｔｒ．、１０巻、１３３−１３８頁、１９９０年）。特に成長期の子供や妊婦において、摂取量の不足は問題である。さらに、今日、ダイエットや偏食の問題も大きく、嗜好食品においてもカルシウムと同様に鉄やマグネシウムの有効な生体への吸収を考慮した食品が期待され、これらのバランスのよい摂取方法の開発は重要な課題である。
畜産業界では生産性の向上のためから、ブロイラー、豚などは、急激な成長が求められるため、骨の発育が追いつかずに脚弱、奇形などの問題が起こっている。カルシウムは特に、骨、卵殻質改善、牛乳のカルシウム強化、鰻の骨曲がり防止などの目的で補給されているが、カルシウムの利用率が悪いことが大きな問題となっている。また、真珠等の養殖においてもカルシウムの十分な補給が商品の品質を左右することが知られている。植物にとってもカルシウムは重要な要素であり、ＥＤＴＡ−カルシウムなどのキレートカルシウムの投与によって、細胞壁の強化あるいはエチレンガスの発生抑制等の作用による老化抑制効果および日持ち性の向上が知られている（田中ら、Ｊ．Ｊａｐａｎ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．、６１巻、１８３−１９０頁、１９９２年）。
【０００７】
カルシウムが腸管内において不溶化しないようにすことにより、腸管から効率よく吸収させることを目的として、カルシウムと化合物を形成する能力のある物質が開発され利用されている。例えば、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）を飲料または、食品に添加する技術（特開平３−２４０４７０号公報、特開平５−２８４９３９号公報）、クエン酸カルシウム・リンゴ酸カルシウム複合体のカルシウム可溶化効果（特開昭５６−９７２４８）ペクチン酸カルシウムの骨強度増強作用（特開平６−７１１６号公報）等が知られている。これらの化合物は、一部食品にもすでに利用されている。しかし、用途によっては使用に制限があり、必ずしも満足のゆくものではない。例えば、カゼインホスホペプチドは比較的よく食品に利用されているが、乳タンパク質の酵素処理によって製造されているために大変高価であるとともに、精製度の低いものは苦みを呈しており利用が制限される問題がある。また、クエン酸カルシウム・リンゴ酸カルシウム複合体についても酸味を呈しており利用には制限が生じている。
【０００８】
このような背景から、釜阪らは馬鈴薯澱粉よりリン酸化糖を調製し、食品への利用を行っている（特開平８−１０４６９６）。このリン酸化糖は、安価であり、無味無臭であるためにその利用範囲の広さが期待されている。また、虫歯予防効果、難消化性糖としての作用も期待されており用途の広さも注目されている。
【０００９】
しかし、この画期的な素材も、３位あるいは６位リン酸化糖が混在しており、３位リン酸化糖あるいは６位リン酸化糖のみをとりだすことはできなかった。３位リン酸化糖および６位リン酸化糖はその結合安定性等の相違から、違う挙動を示すことが予想されるためそれらを分離することが望まれている。これは３位結合リン酸と６位結合リン酸の性質の差を研究するための基質を得て研究を発展させるうえでも望まれる。また、それぞれの結合型リン含量の簡便な定量方法も、開発利用に当たって望まれている。
【００１０】
一方、リン酸エステルの脱リン酸化を行うホスファターゼに関する研究自体は古くから行われている。例えば、Ｓｈｉｍａｄａらの報告（ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ, ４８０巻４１７−４２７頁、１９７７年）やＺｙｌａらの報告（Ｊ．Ｓｃｉ．ＦｏｏｄＡｇｒｉｃ．４９巻３１５頁、１９８９年）やＺｙｌａの報告（ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,９巻１１７−１１９頁、１９９３年）にアスペルギルスニガー由来の酸性ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２）に関する内容が記載されている。また、例えばＦａｕｌｋｅｒの報告（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６０巻５９０−５９６頁、１９９５年）にはグルコース−1 −リン酸に特異的なグルコース−1 −ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．１０）が報告されており、水島の報告（蛋白核酸酵素２２巻１５２４−１５２９頁、１９７７年）にはグルコース−６−リン酸に作用するグルコース−６−ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．９）が報告されている。
【００１１】
このように、単糖のリン酸化物のリン酸基の結合位置によって作用の異なるホスファターゼについては報告がされている。しかし、単糖以外のリン酸化糖におけるリン酸基の結合位置の違いを認識するホスファターゼについては過去全く報告はない。さらに単糖、少糖、多糖を問わず、３位結合リン酸と６位結合リン酸の結合のうちの一方のみを選択的に脱リン酸化するホスファターゼは知られていない。また、いくつかの市販されているホスファターゼ（小麦胚、牛乳、牛前立腺および大腸菌由来）においてもリン酸化糖におけるリン酸基の結合位置の違いを認識して選択的に脱リン酸化するものは見いだされていない。
【００１２】
ところで、馬鈴薯澱粉中のエステル結合リン酸基の約６０〜７０％はグルコース残基の６位に、３０〜４０％は３位に、それぞれ結合しているといわれている（Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｓｔａｒｃｈ、２２巻３３８−３４３頁、１９７０年）。だが３位のみあるいは６位のみのリン酸化されたリン酸化糖を分取したという報告はこれまでなされていない。
【００１３】
現在にいたるまで、このようなリン酸化少糖あるいはリン酸化多糖の中から３位あるいは６位リン酸化糖のみを分画する方法は報告されていない。ただし、リン酸化少糖については本発明者が、リン酸化少糖溶液を適当な液体クロマトグラフィー、例えばＨｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＡＥＣ、ダイオネックスＤＸ−３００、ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ−１００カラム、ダイオネックス社製）やＨＰＬＣ（ダイソーパックＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−ＢＰカラム）などを用いてごく少量ずつ多大な時間と労力をかけて分画する方法をこのたび開発した。しかし、この方法では、大量調製は現実的には極めて困難である。
【００１４】
グルコース残基の１位リン酸結合と６位リン酸結合の性質については多少たりとも研究されているが、３位リン酸結合の性質については研究が進んでいない。これはひとえに、単糖のリン酸化物のグルコース−1 −リン酸およびグルコース−６−リン酸は試薬としても発売されているが、３位にリン酸が結合した糖は単糖、少糖を問わずその標品を得ることができなかったためと考えられる。その意味でも、３位のみリン酸化された糖の標品が効率よく得られることが待たれていた。また、６位リン酸結合の糖質として、グルコース−６−リン酸について、従来より研究がなされてきたが、６位のみリン酸化されたリン酸化少糖類、リン酸化多糖類についての報告はない。
さらには前述の通り、３位あるいは６位結合型糖質の分離は困難であり、それぞれの分別定量分析法も望まれていた。
【００１５】
また、虫歯と俗称される齲蝕は歯周病とともにヒトが歯を失う二大原因の一つであり、その発症に様々な因子が複雑に関わりあう多因子制の疾患である。しかし、完全なる予防方法が未だに存在しない疾患の一つでもある（西沢俊樹、ＦｏｏｄＳｔｙｌｅ２１、１巻、５０−５５頁、１９９７年）。また、虫歯になり難い糖類も多く開発されてきており、食品に応用されている。例えば、糖アルコール、カップリングシュガー、パラチノース等である（岡田茂孝、歯界展望、９０巻、８８９−８９１頁、１９９７年）。これらは、虫歯の原因菌に資化されず酸を生成しないことを特徴としている。しかし実際の甘味食品では味質のよさで砂糖などに及ばないため単独で使われることは少なく、結局砂糖やグルコースと併用されるため、酸が生成し、齲蝕を回避できなかった。
【００１６】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、リン酸化糖のリン酸基の結合位置を認識してグルコース残基の６位に結合したリン酸基を脱リン酸化し、３位に結合したリン酸基に作用しない新規なホスファターゼを提供し、さらにリン酸化糖から本酵素を用いることによって効率よく容易に３位リン酸化糖を得る方法を提供すること、またリン酸化糖に希酸溶液を用いた加熱処理を行って効率よく容易に６位リン酸化糖を得る方法を提供することを目的とする。
【００１７】
なお、本特許にいうリン酸化少糖とは、各種澱粉に対して澱粉分解酵素である液化型α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）、プルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１）等のアミラーゼを１種、あるいは２種以上作用させたのちに得られるα−１、４−グルカンのうち、α−１、４結合した２〜１０個のグルコースからなり、さらに該グルカンの１つ以上のグルコース残基の６位または３位にリン酸基が少なくとも１個エステル結合している少糖のことをいう。
これらのアミラーゼをさらに高濃度、長時間作用させ、分取すれば、最終的に２から５個のグルコースがα−１、４結合し、ひとつ以上のリン酸基が結合した少糖を得ることができる。
また、先のリン酸化糖に糖転移酵素であるシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．１９）を作用させることで、７から１２個のグルコースがα−１、４結合し、二つ以上のリン酸基が結合した少糖および多糖を得ることができる。
【００１８】
本特許にいうリン酸化多糖とは、各種澱粉およびその分解物をはじめとした、１１個以上のグルコースがα−１、４結合あるいはα−１、６結合した多糖類で１個以上のリン酸基がグルコース残基の３位または６位にエステル結合したものをいう。
【００１９】
そして、熱に不安定な３位リン酸化糖を除き、６位リン酸化糖単品を提供することで、食品、飲料、飼料製造工程中あるいは薬品、化粧品、口腔用組成物等の製造工程中における結合リンの安定性を向上させ、遊離無機リン酸の含量を低減させた製品の提供を目的とする。また、その逆に、糖質とリン酸の結合様式の研究用試薬などの用途に使用可能な3 位リン酸化糖のみの提供も目的とする。
さらに、３位あるいは６位のみのリン酸化糖の製造技術を用いて、それぞれの含量を簡便に定量分析することも目的とする。ことに、通常緩衝液としてもっともよく用いられるリン酸緩衝液中ではリン酸イオンが存在することにより、リン酸化糖からリン酸基を遊離させ生成した無機リン酸を定量するという手法はとれないが、本願においてはこの課題を克服し、リン酸化糖中のリン酸含量を測定することも目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
リン酸結合部位が３位と６位のものが混在しているリン酸化少糖またはリン酸化多糖に、リン酸化糖のリン酸基の結合位置を認識してグルコース残基の６位に結合したリン酸基のみ脱リン酸化する新規なホスファターゼを作用させる。あるいは、上記リン酸化少糖またはリン酸化多糖を希酸、好ましくは酢酸溶液中で加熱処理する。前者の処理によって、リン酸化少糖またはリン酸化多糖の６位に結合したリン酸基のみ切断される。後者の処理によっては３位に結合したリン酸基のみ切断される。これにより得られた３位、あるいは６位リン酸化糖を精製する手段は、デキストリンの分子量により膜透析、あるいは各種のイオン交換クロマトグラフィー（たとえば富士紡績株式会社製のキトパールによる陰イオン交換クロマトグラフィー）、電気透析装置（たとえば旭化成製のマイクロアシライザー）等を用いれば比較的容易であり、大量生産も可能である。
３位リン酸化糖製造に使用する菌株はアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ) が好適である。
【００２１】
１．３位リン酸化糖製造に用いる酵素の製造
ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＫＵ−８（生工研寄託Ｐ−１６２４８として寄託された）を培地に培養する。培地の栄養源は、本菌株が良好に生育して目的の酵素を順調に生産するならば特に限定するものではない。炭素源としてはグルコース、シュークロース、マルトース、コーンスターチ、デキストリンなどを挙げることができ、また、窒素源としてはポリペプトン、カゼイン、酵母エキスなどを挙げることができる。また、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオンなどの無機塩類や各種ビタミン類を使用することが出来る。培養は振とう培養もしくは通気撹袢培養などの好気条件下で、培地をｐＨ３〜８の範囲、好ましくはｐＨ４〜７の範囲に調整し、培養温度は１０℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃程度で１〜１０日間、好ましくは２〜７日間程度培養する。培養後、本酵素は培養物から採取される。
【００２２】
このようにして得られた培養物から菌体を回収し、破砕後、水や緩衝液などを用いて抽出を行い、固形分を除去して培養抽出液を得る。このようにして得られた培養抽出液からホスファターゼを精製し、本発明のホスファターゼを得る。培養抽出液からホスファターゼを精製するためには、例えば硫安塩析処理、フェニルセファロースカラム（ファルマシア社製）による疎水クロマトグラフィー処理、Ｑ−セファロースあるいはソース−Ｑカラム（ともにファルマシア社製）によるイオン交換クロマトグラフィー処理、スーパーデックスＧ−２００カラム（ファルマシア社製）によるゲルろ過クロマトグラフィー処理、ＴＳＫゲルスーパーＱ−５ＰＷカラム（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィー処理などのいずれかを必要に応じて組み合わせた処理を行い、必要に応じて凍結乾燥処理を行い、高純度に精製したホスファターゼを得る。
【００２３】
２．ホスファターゼＫＵ−８の作用
種々のリン酸エステルやピロリン酸およびポリリン酸を加水分解することにより脱リン酸化する。３位リン酸化糖と６位リン酸化糖が混在していれば６位リン酸化糖の６位結合リン酸基を特異的に脱リン酸化する。リン酸化少糖のみならず、グルコースの結合が一部α−１、６結合であるリン酸化多糖に対しても、６位結合リン酸基を特異的に脱リン酸化する性質を有すると見られる。
【００２４】
３．ホスファターゼＫＵ−８の酵素化学的諸性質
（１）作用至適ｐＨ
本酵素の作用至適ｐＨは図１に示すようにｐＨ１．５〜３．０である。
（２）ｐＨ安定性
本酵素を各ｐＨで３７℃、１時間処理したのちにおいても図２に示すようにｐＨ２〜１０の範囲で安定であった。
（３）作用至適温度
本酵素の作用至適温度は図３に示すように６０℃である。
（４）温度安定性
図４に示す各温度での３０分間処理後の残存活性より５０℃まで安定であるといえる。
（５）分子量
モノマーとして約６６，０００ダルトンである（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）。ゲルろ過法による分子量は約２６０，０００ダルトンのテトラマーである。
（６）酵素活性測定法
ホスファターゼ活性は次のようにして測定される。
それぞれ３７℃に保った酵素液１２５μｌ、２００ｍＭのグリシン- 塩酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）２５０μｌおよび２０ｍＭのグルコース−６−リン酸溶液（２００ｍＭのグリシン- 塩酸緩衝溶液でｐＨ２．０に調整する）１２５μｌを混合し、３７℃で１５分間反応させる。この反応液に１０規定の過塩素酸５０μｌ、１０規定の過塩素酸を４％含有する２０ｍＭのバナジン酸アンモニウム溶液１５０μｌ、３．５３％のモリブデン酸アンモニウム溶液３００μｌを添加して撹拌し室温で３０分間放置する。この溶液の4 ２０ｎｍにおける吸光度を測定し、活性を求めた。標準物質としてリン酸一カリウムを用いた。
ホスファターゼ活性の１単位は上記条件下で１分間に１μｍｏｌのリンを遊離させる酵素量とする。
【００２５】
４. ３位リン酸化糖の製造方法（１）
膨潤させた馬鈴薯澱粉にα−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）、プルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１）を十分に作用させた後、生じた中性糖を除去して調整したリン酸化糖溶液（以下、馬鈴薯リン酸化糖溶液と称す）に、本酵素を適当量添加して３７℃で十分に反応させる。この反応によってリン酸化糖の６位結合リン酸基は脱リン酸化される。デキストリンの分子量により膜透析、あるいは電気透析で３位リン酸化糖を精製することができる。なお、これら３位リン酸化糖を製造するために用いる本酵素は必ずしも単一に精製したものである必要はなく、培養抽出液を粗酵素液として用いることも可能である。
【００２６】
５．３位リン酸化糖の製造方法（２）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、本酵素を適当量添加して３７℃で十分に反応させる。この反応によってリン酸化糖の６位結合リン酸基は脱リン酸化される。マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースといった中性オリゴ糖のほかに非還元末端より２個めのグルコース残基の３位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトテトラオース、リン酸化マルトペンタオースといった３位リン酸化糖が生成する。この生成した中性オリゴ糖と３位リン酸化糖を、各種のイオン交換クロマトグラフィー、例えばキトパール（富士紡績株式会社製）などの陰イオン交換樹脂を用いて、あるいは電気透析により分画することにより、上記３位リン酸化糖を製造することができる。なお、これら３位リン酸化糖を製造するために用いる本酵素は必ずしも単一に精製したものである必要はなく、培養抽出液を粗酵素液として用いることも可能である。
【００２７】
６．３位リン酸化糖の製造方法（３）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、本酵素および糖化型α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）を適当量添加して３７℃で十分に反応させる。この反応によって、グルコースとマルトースを主体とする中性糖と、マルトトリオースの中央のグルコース残基の３位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトトリオースとが生成される。この生成した中性糖とリン酸化マルトトリオースを、各種のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは電気透析を用いて分画することにより中央のグルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースを製造することができる。なお本酵素と糖化型α−アミラーゼを作用させる順序は問わない。また、上記のリン酸化マルトテトラオースを製造するために用いる本酵素は必ずしも単一に精製したものである必要はなく、培養抽出液を粗酵素液として用いることも可能である。
【００２８】
７．３位リン酸化糖の製造方法（４）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、本酵素とネオプルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３５）を適当量添加して３７℃で十分に反応させる。この反応によって、グルコースとマルトースを主体とする中性糖と、マルトテトラオースの非還元末端側から２個目のグルコース残基の３位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトテトラオースとが生成する。この生成した中性糖とリン酸化マルトテトラオースを、各種のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは電気透析を用いて分画することにより上記のリン酸化マルトテトラオースを製造することができる。なお本酵素とネオプルラナーゼを作用させる順序は問わない。また、リン酸化マルトテトラオースを製造するために用いる本酵素は必ずしも単一に精製したものである必要はなく、培養抽出液を粗酵素液として用いることも可能である。
【００２９】
８．６位リン酸化糖の製造方法（１）
市販デキストリン溶液に、弱酸の溶液、望ましくは希酢酸を添加して加熱処理する。希酸の種類は酢酸には限らず、乳酸、クエン酸も好適に用いられる。ただ酸の作用が強すぎるとグルコース同士の結合も切断されてしまうので、リン酸化糖の３位結合リン酸、６位結合リン酸、グルコースのα−１、４結合およびα−１、６結合のうち、３位結合リン酸のみを切断するような弱酸の種類と濃度と反応温度と反応時間を設定するべきである。例えば０．０５−０．７規定の酢酸で３０分以上煮沸もしくは８０−１００℃で加熱することによって６位リン酸化多糖を製造することができる。乳酸、クエン酸を用いる時も、０．０５Ｍから０．５Ｍ程度の濃度で同じく加熱処理することで、６位リン酸化多糖を製造することができる。デキストリンの分子量により膜透析、あるいは電気透析で６位リン酸化糖を精製することができる。
【００３０】
９．６位リン酸化糖の製造方法（２）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、弱酸の溶液、好ましくは希酢酸を添加して加熱処理する。希酸の種類は酢酸には限らず、乳酸、クエン酸も好適に用いられる。ただ酸の作用が強すぎるとグルコース同士の結合も切断されてしまうので、リン酸化糖の３位結合リン酸、６位結合リン酸、グルコースのα−１、４結合およびα−１、６結合のうち、３位結合リン酸のみを切断するような弱酸の種類と濃度と反応温度と反応時間を設定するべきである。例えば０．１−０．７規定の酢酸で３０分以上煮沸もしくは８０−１００℃で加熱することによってリン酸化糖の３位結合リン酸基は脱リン酸化される。乳酸、クエン酸を用いる時も、０．０５Ｍから０．５Ｍ程度の濃度で同じく加熱処理することで、６位リン酸化糖を製造することができる。マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースといった中性オリゴ糖のほかにグルコース残基の６位にリン酸基が結合したリン酸化マルトトリオース、リン酸化マルトテトラオース、リン酸化マルトペンタオースといった６位リン酸化糖が生成する。この生成した中性オリゴ糖と６位リン酸化糖を、各種のイオン交換クロマトグラフィー、例えばキトパール（富士紡績株式会社製）などの陰イオン交換樹脂を用いて、あるいは電気透析により分画することにより、上記６位リン酸化糖を製造することができる。またグルコアミラーゼを併用することで、中性糖は全てグルコースに変化し、エタノール沈殿法や活性炭カラム等の簡便な方法でも６位リン酸化糖のみを容易に得ることができる。
【００３１】
１０．６位リン酸化糖の製造方法（３）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、希酸加熱処理を行う前後に糖化型α−アミラーゼ、あるいはネオプルラナーゼを適当量添加して３７℃で反応させる。この反応によって、グルコースを主体とする中性糖のほかに前者では、マルトトリオースまたはマルトテトラオースのひとつのグルコース残基の６位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトテトラオースが、後者ではリン酸化マルトトリオースのみが生成する。この生成した中性糖とリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトテトラオースを、各種のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは電気透析を用いて分画することによりグルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトテトラオースを製造することができる。なお酸加熱処理と糖化型α−アミラーゼ処理あるいはネオプルラナーゼ処理の順序は問わない。しかし、糖化型α−アミラーゼあるいはネオプルラナーゼを作用させる際には、ｐＨ等を本酵素の好適な条件に設定することが望ましい。
【００３２】
１１．６位リン酸化糖の製造方法（４）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、希酸加熱処理を行う前後に糖化型α−アミラーゼとグルコアミラーゼ、あるいはネオプルラナーゼとグルコアミラーゼを適当量添加して３７℃で十分に反応させる。この反応によって、グルコースとマルトースを主体とする中性糖のほかに、前者ではマルトトリオースあるいはマルトースのひとつのグルコース残基の６位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトースが生成する。後者ではリン酸化マルトースのみが生成する。この生成した中性糖とリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトースを、各種のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは電気透析を用いて分画することによりグルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトースを製造することができる。なお酸加熱処理と糖化型α−アミラーゼとグルコアミラーゼ、あるいはネオプルラナーゼとグルコアミラーゼを作用させる順序は問わない。しかし、糖化型α−アミラーゼとグルコアミラーゼ、あるいはネオプルラナーゼとグルコアミラーゼを作用させる際には、本酵素の好適な条件に設定することが望ましい。
【００３３】
以上のようにリン酸化糖は馬鈴薯澱粉より調製できるが、特に原料澱粉を限定するものではない。馬鈴薯澱粉以外にも、キャッサバ澱粉、米澱粉、食用カンナ澱粉等の植物由来の結合リン含有澱粉が好適に用いられるし、化学的にリン酸化した澱粉も好適に用いることが可能である。
【００３４】
本発明のリン酸化糖からは、リン酸化糖の誘導体のひとつである、タンパク質あるいはペプチドとの複合体を製造することができる。糖質のタンパク質とのメイラード反応を利用した複合体の作成は古くから行われてきた。このメイラード反応は、通常の食品調理中にも起こる反応であり、反応産物は生体への安全性がきわめて高い。その反応は、糖質の還元末端がタンパク質のアミノ基に脱水縮合することによって起こる。多糖の場合はタンパク質1 分子に糖1 から２分子が結合し、単糖の場合はほとんどのタンパク質のアミノ基に糖が結合することが可能である（加藤ら、ＭｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓａｎｄｅｍｕｌｓｉｏｎｓｉｎＦｏｏｄ、ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ編集、１６章、２１３−２２９頁、１９９１年）。また、その機能として、タンパク質の熱安定性およびｐＨ安定性の向上、乳化特性の付与、あるいは水に不溶性のタンパク質の可溶化などが報告されている（加藤ら、Ｊ. Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．、３９巻、１０５３−１０５６頁、１９９１年）。最近、グルコース−６−リン酸をタンパク質に結合させること（青木ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８巻、１７２７−１７２８頁、１９９４年）により、あるいは馬鈴薯澱粉由来リン酸化オリゴ糖を結合させることによりカルシウム可溶化効果が得られること（特開平８−１０４６９６）も判った。しかし、単糖は反応性が高く、タンパク質の変性も起こりやすい欠陥があり、リン酸化オリゴ糖も３位と６位リン酸化糖の混合物であり、各純品での報告は全く行われていない。オリゴ糖の場合反応が緩やかに進み、単糖に比べタンパク質への副反応が少なく、タンパク質に有機リガンドを結合させ得る方法として優れた方法である。用いるタンパク質としては特に問わないが、安価に入手でき、食品として安全なものが望ましい。このようなタンパク質としては、例えば、卵白アルブミン、小麦タンパク質、大豆タンパク質などが挙げられる。それらを加水分解したペプチドもまた好適に用いられる。
【００３５】
また、一般に糖アルコールは、原料糖をニッケルの触媒下、高温、高圧で水素添加する方法によって製造されている。実験室レベルでは、室温で1 時間程度、水素化ホウ素ナトリウムと共存させることで、簡単に作成しうる。本発明のリン酸化糖も同様の常識的な処理によってリン酸化糖アルコールに変化させ得る。この反応によってリン酸エステル結合がはずれることはない。また、本発明のリン酸化糖の製造法と組み合わせることで、３位あるいは６位リン酸化糖アルコールを作成しうる。こうして得たリン酸化糖アルコールは、アミノカルボニル反応を起こさず、つまり、食品における褐変を引き起こし難いと考えられる。
【００３６】
本発明のリン酸化糖により、肥料、飼料、医薬品、または食品の摂取におけるカルシウムの吸収を促進し得る。またリン酸化糖がカルシウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属や鉄、亜鉛などの微量金属元素とも化合物または錯体を形成し、それらの生体への吸収を促進することが可能となる。従って、これらのミネラル不足に起因する骨粗鬆症循環器疾患（糸川嘉則・吉田政彦偏、Ｍｇと循環器疾患、メディカルトリビューン、１９８６年）などの各種疾患の予防も期待できる。さらに今日、ダイエットや偏食の問題が大きく、嗜好食品においてもカルシウムと同様に鉄およびマグネシウムの有効な生体への吸収を考慮した製品が期待される。本発明のリン酸化糖またはその誘導体は、安全であり、難消化性であり、低カロリーである。このリン酸化糖にはまた、多くのオリゴ糖に報告されているような保湿作用、ビフィズス菌増殖作用、整腸作用、脂質改善作用、血圧低下作用、および免疫賦活作用等も期待できる（日高ら、日本農芸化学雑誌、６１巻、９１５−９２３頁、１９８７年）（酒井重男、月刊フードケミカル、４巻、８１−８８頁、１９９５年）。さらに、鉄との錯体を形成し、この錯体には抗酸化作用も期待できる。この金属キレート作用による活性酸素の生成抑制効果は、生体においては、発ガンや老化といったものを抑制する効果があることも知られている（Ｅ．Ｇｒａｆら、Ｃａｎｃｅｒ、５６巻、７１７−７１８頁、１９８５年）（寺尾純二、栄養と健康のサイエンス、４巻、２１−２５頁、１９９６年）。また、従来、これらの目的で既に食品に用いられている糖質、フラボン類（ファイトケミカルズ分科会調査報告書、フード・フォーラム・つくば・ファイトケミカルズ分科会編、１９９８年）、ポリフェノール類（近藤、Ｌａｎｃｅｔ、３４４巻、１１５２頁、１９９４年）等との併用においても相乗効果が期待できる。
【００３７】
さらに、本発明のリン酸化糖は齲蝕の原因であるミュータンス菌（岡橋ら、微生物、４巻、２０９−２１７頁、１９８８）の栄養源にならず、酸や非水溶性のグルカンを生成しない糖質である。従って、歯垢が生じず、歯の脱灰も生じない。むしろ、カルシウムとの親和性の高さを考慮に入れると歯の再石灰化も期待される（松久保ら、口腔衛生学会雑誌、４６巻、４４２−４４３頁、１９９６年）。その上に、本リン酸化糖は緩衝作用を有し、ｐＨの低下を防ぐ効果がある。したがって、例え、砂糖やグルコースが共存しており、ミュータンス菌等の虫歯菌による酸発酵が生じてもｐＨの低下を防ぎ虫歯の発生を抑制する効果がある。この効果は、齲蝕になり難い糖質との併用や、齲蝕予防効果のあるフッ素（菅原ら、口腔衛生学会雑誌、４６巻、６３２−６３３頁、１９９６年）等との併用により相乗作用によって、さらに虫歯に有効であることが期待できる。このことにより、リン酸化糖はほとんどすべての飲食用組成物または食品添加物用組成物に使用することが可能である。この飲食用組成物とは、ヒトの食品、動物あるいは養魚貝用の飼料、ペットフードを総称する。すなわち、コーヒー、コーラ、紅茶、日本茶、烏龍茶、ジュース、加工乳、スポーツドリンク、栄養ドリンク、スープなどの液体および粉末の飲料類、パン、クッキー、クラッカー、ビスケット、ケーキ、ピザ、パイなどのベーカリー類、スパゲティー、マカロニなどのパスタ類、うどん、そば、ラーメンなどの麺類、ソース、醤油、ケチャップ、たれ、だしの素、シチューの素、カレーの素、麺類のつゆ、ドレッシング、マヨネーズ等の調味料類、ガム、キャラメル、キャンデー、チョコレート等の菓子類、おかき、ポテトチップス、スナック等のスナック菓子類、アイスクリーム、シャーベット等の冷菓、クリーム、チーズ、粉乳、練乳、乳飲料等の乳製品、ゼリー、プリン、ムース、ヨーグルト等の洋菓子類、饅頭、ういろう、もち、おはぎ、団子等の和菓子類、カレー、シチュー、ハヤシ、スープ、どんぶり等のレトルト食品もしくは缶詰め食品、ハム、ハンバーグ、ミートボール、コロッケ、餃子、ピラフ、おにぎり、等の冷凍食品および冷蔵食品、ちくわ、かまぼこ等の水産加工食品、弁当のご飯、寿司などの米飯類にも効果的に利用できる。さらに、乳児用ミルク、離乳食、ベビーフード、ペットフード、動物用飼料、スポーツ飲料、整腸剤、風邪薬、栄養補給食品や飲料等の医薬品、練り歯磨き、マウスウオッシュ、トローチ等の口腔用組成物にも好適に添加され得る。また、ｐＨ調整作用や金属を吸着する作用等は、先の用途以外に、シャンプー、リンス等の洗髪用組成物や整髪用組成物等の化粧品にも好適に利用することができる。
【００３８】
本発明のリン酸化糖は、カルシウム、鉄、マグネシウム等が含まれる飲み薬、入浴剤などの薬剤にも使用されうる。
【００３９】
また、本発明実施に用いる酸性ホスファターゼを用いることで、６位結合リンのみを遊離することから、６位結合リン酸含量を無機リン酸の定量方法あるいは中性糖をグルコアミラーゼを用いてグルコースにまで分解してグルコースの定量分析を行うことによって、例え３位結合リンが存在しても簡便に定量分析できる。無機リン酸あるいはグルコースの定量分析法は、特に限定するものではないが、前者はバナド−モリブデン酸法（板谷、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ、１４、３６１−３６６頁、１９６６年）等が好適に用いられるし、後者はグルコースオキシダーゼ法（生物化学実験法１、学会出版センター、１４３−１５０頁、１９９０年）等が好適に用いられる。同様に、本発明のリン酸化糖の酸処理を行えば、３位結合リンのみを遊離することから、３位結合含量を無機リン酸の定量方法を用いて、あるいは中性糖をグルコアミラーゼを用いてグルコースにまで分解してグルコースの定量分析を行うことによって、例え６位結合リンが存在しても簡便に定量分析できる。また、このように遊離する無機リン量をグルコース量として定量することによって、試料溶液中にあらかじめリン酸塩が存在していたとしても容易に遊離する無機リン量を定量しうる。もちろん、リンを遊離せずに残存するリン酸化糖を液体クロマトグラフィーを用いても分析できる。
【００４０】
具体的には、馬鈴薯リン酸化糖溶液に、さらに、糖化型α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ネオプルラナーゼを十分に作用させることで、マルトトリオースの中央のグルコース残基の３位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトトリオースとマルトースの非還元末端のグルコース残基の６位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトースの２種を含む溶液が得られる。この溶液を試料溶液A とする。試料溶液Ａに本発明の酸性ホスファターゼを適当量添加して３７℃で十分に反応させて得た溶液（試料溶液Ｂと称す）の遊離リン酸含量を定量することでグルコース残基の６位結合リン酸含量が測定できる。あるいは、試料溶液Ｂにグルコアミラーゼを十分に作用させると、脱リン酸化されたマルトースにはグルコアミラーゼは作用し得るためにグルコースが生じる。この生じたグルコース含量を定量すること（遊離リン含量は、生じたグルコース含量の１／２量）で、例え溶液中にリン酸塩が存在しても生成した遊離リン酸含量を測定できる。
また、試料溶液Ａに、終濃度０．３５Ｎになるように酢酸を添加し、１００℃で８時間処理した溶液（試料溶液Ｃと称す）の遊離リン酸含量を定量することでグルコース残基の３位結合リン酸含量が測定できる。あるいは、試料溶液Ｃにグルコアミラーゼを十分に作用させると、脱リン酸化されたマルトトライオースにはグルコアミラーゼは作用し得るためにグルコースが生じる。この生じたグルコース含量を定量すること（遊離リン含量は、生じたグルコース含量の１／３量）で、例え溶液中にリン酸塩が存在しても生成した遊離リン酸含量を測定できる。以上の操作によって、馬鈴薯澱粉中の３位および６位の結合リン酸含量の両方が測定し得る。さらに、試料溶液Ａを湿式あるいは乾式灰化すれば、全結合リン酸が遊離してくる。これによって、３位あるいは６位リン酸含量の一方を定量しておくだけでもう一方の含量は算出し得る。あるいは、試料溶液Ａをアルカリホスファターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来）を十分に作用させることでも全結合リン酸含量が定量し得る。
これらの定量分析法を適宜組み合わせることによって、各種起源の澱粉中の３位あるいは６位リン酸化糖の存在比率も簡単に算出できるようになった。
【００４１】
【実施例】
（実施例１）
０．１％ポリリン酸、０．５％グルコース、０．１％イーストエキス、０．５％ポリペプトン、０．１％塩化ナトリウム、０．１％塩化カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、０．００２％硫酸第一鉄を含有する培地（ｐＨ６．５に調製する）５００ｍｌを、２０００ｍｌ容の坂口フラスコにいれ、ＫＵ−８菌株を接種し、３７℃で４日間振とう培養した。菌体をろ紙（アドバンテックＮＯ．２）ろ過によって回収・集菌し、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５に調製、以下本実施例においてＡ緩衝液と称する）を約１０倍容加えて懸濁し、超音波による破砕を行って破砕液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）にかけて培養抽出液を得た。この抽出液に対して８０％飽和になるように硫酸アンモニウム（硫安）を添加し、一晩冷蔵放置した。これを遠心分離（１８，０００ｒｐｍ、３０分間）にかけて得られた上清を、８０％飽和硫安を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５に調製、以下本実施例においてＢ緩衝液と称する）で平衡化したフェニルセファロースカラム（２６×１００ｍｍ、ファルマシア社製）による疎水クロマトグラフィーにかけて酵素を吸着させた。ついで１００％Ｂ緩衝液、５０％Ｂ緩衝液、０％Ｂ緩衝液（＝１００％Ａ緩衝液）の順でステップワイズ溶出を行った。本酵素活性を示す画分（０％Ｂ緩衝液のところに相当する）を回収し、Ａ緩衝液を用いて一晩透析した。得られた透析内液を、Ａ緩衝液で平衡化したＱ−セファロースあるいはソース−Ｑカラム（ともに１０×８０ｍｍ、ファルマシア社製）によるイオン交換クロマトグラフィーにかけて酵素を吸着させた。ついでＡ緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０〜３００ｍＭに直線的に増加させることによりグラジエント溶出を行った。本酵素活性を示す画分（塩化ナトリウム濃度が５０〜２００ｍＭのところに相当する）をＡ緩衝液に対して一晩透析を行った。得られた透析内液を、Ａ緩衝液で平衡化したＴＳＫゲルスーパーＱ−５ＰＷカラム（８×７５ｍｍ、東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィーにかけて酵素を吸着させた。ついでＡ緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０〜３００ｍＭに直線的に増加させることによりグラジエント溶出を行い、本酵素の活性画分（塩化ナトリウム濃度が５０〜２００ｍＭのところに相当する）を得た。この活性画分を、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含むＡ緩衝液で平衡化したスーパーデックスＧ−２００カラム（１６×２００ｍｍ、ファルマシア社製）によるゲルろ過クロマトグラフィーにかけて、本酵素の精製画分（１８０Ｕ／ｍｇ蛋白）を得た。この実施例によって精製したホスファターゼＫＵ−８を「本酵素」と記載し、実施例２から４に用いる。この精製画分はポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うと単一のバンドを示し、電気泳動的に単一の物質であることが示された。
【００４２】
（実施例２）
１％馬鈴薯澱粉溶液に３５Ｕのα−アミラーゼ（上田化学、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）を５０℃で３０分間作用させたのち、２Ｕのプルラナーゼ（林原生物化学研究所、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来）と６Ｕのグルコアミラーゼ（東洋紡、Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｐ．由来）を同時に４０℃で２０時間作用させた。なお以下の実施例において、各種アミラーゼ酵素の活性は１分間に１μｍｏｌのグルコシル結合を切断する活性を１Ｕと定義する。５分間煮沸することによって酵素反応を停止し、この溶液から陰イオン交換樹脂（キトパールＢＣＷ２５０１）により中性糖を除去した後、脱塩、凍結乾燥することにより重合度３〜５のリン酸化少糖の混合粉末物を得た。次いで、２００ｍＭグリシン- 塩酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）２００μｌ、重合度３〜５のリン酸化糖混合物の３％溶液（２００ｍＭグリシン- 塩酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）で調製）２００μｌに、実施例１に記載の本酵素溶液２００μｌを添加して３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液をＨＰＡＥＣで分析した。その結果を図５に示す。ＨＰＡＥＣによる分析は１００ｍＭの水酸化ナトリウムを基本溶液として１Ｍ酢酸ナトリウム濃度を上昇させることによって行われ得る。検出はパルスドアンペロメトリー（ダイオネックス社製）を用いて行われ得る。本酵素によりリン酸化糖の６位結合リン酸が脱リン酸される。脱リン酸により生じた反応液中のマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースといった中性糖をキトパールを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去したのち、脱塩、凍結乾燥することにより１個のグルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオースとリン酸化マルトペンタオースの混合粉末物を得た。
【００４３】
（実施例３）
２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２００μｌ、実施例２に記載のリン酸化少糖の３％溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で調製）２００μｌに、本酵素溶液１００μｌと３０Ｕ／ｍｌの糖化型α−アミラーゼ（ナガセ生化学、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）溶液１００μｌを添加して３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液を実施例１と同様にＨＰＡＥＣで分析した。その結果を図６に示す。本酵素によりリン酸化糖の６位結合リン酸が脱リン酸される。脱リン酸により生じた反応液中の中性糖をキトパールを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去したのち、脱塩、凍結乾燥することにより１個のグルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースの粉末物を得た。
【００４４】
（実施例４）
２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２００μｌ、実施例２に記載のリン酸化少糖の３％溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で調製）２００μｌに、本酵素溶液１００μｌと３０Ｕ／ｍｌのネオプルラナーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、Ｋｕｒｉｋｉら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３，６１４７−６１５２（１９９１））溶液１００μｌを添加して３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液を実施例１と同様にＨＰＡＥＣで分析した。その結果を図７に示す。本酵素によりリン酸化糖の６位結合リン酸が脱リン酸される。脱リン酸により生じた反応液中の中性糖をキトパールを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去したのち、脱塩、凍結乾燥することにより１個のグルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオースの粉末物を得た。
【００４５】
（実施例５）
０．３５規定酢酸溶液に実施例２に記載のリン酸化少糖を添加して１％溶液１ｍｌを作成し、１００℃で８時間反応させる。反応終了後、反応液を実施例１と同様にＨＰＡＥＣで分析した。その結果を図８に示す。この反応によりリン酸化糖の３位結合リン酸が脱リン酸される。脱リン酸により生じた反応液中の中性糖をキトパールを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去したのち、脱塩、凍結乾燥することにより１個のグルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオース、リン酸化マルトテトラオースおよびリン酸化マルトペンタオースの混合粉末物を得た。
【００４６】
（実施例６）
０．３５規定酢酸溶液に実施例２に示したリン酸化少糖を添加して１％溶液１ｍｌを作成し、１００℃で８時間反応させる。反応終了後、１規定の水酸化ナトリウム溶液で中和し、糖化型α−アミラーゼ溶液およびグルコアミラーゼ溶液各１０μｌを添加して３７℃で１６時間反応させる。その後、反応液を実施例１と同様にＨＰＡＥＣで分析した。その結果を図９に示す。この反応によりリン酸化糖の３位結合リン酸が脱リン酸される。脱リン酸により生じた反応液中の中性糖をキトパールを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去したのち、脱塩、凍結乾燥することにより１個のグルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースとリン酸化マルトースの混合粉末物を得た。
【００４７】
（実施例７）
５％のショ糖溶液を対照とし、これに０．５％のリン酸化糖を添加した試料溶液１）について甘味の変化を官能検査により調べた。評価は対照を０として、試料溶液がさわやかに感じる度合いを「さわやかでない」を−２、「さわやかである」を２として−２から２までの５段階で実施した。その結果、表１の１）に示すように０．５％リン酸化糖を添加した試料溶液では１２人中１０人がプラスの評価を出し、ショ糖の甘味をより好適に改善する効果が認められた。
【００４８】
（実施例８）
５％の食塩溶液を対照とし、これに０．５％のリン酸化糖を添加した試料溶液２）について塩味の変化を官能検査により調べた。評価は対照を０として、試料溶液の塩味の強弱を「弱い」を−２、「強い」を２とする５段階で実施した。その結果、表１の２）に示すように０．５％リン酸化糖を添加した試料溶液では１２人中８人がプラスの評価を出し、塩味を増強する効果が認められた。
【表１】

【００４９】
（実施例９）
２００ｍＭグリシン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）２ｍｌ、重合度３〜５のリン酸化糖混合物の３％溶液（２００ｍＭグリシン- 塩酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）で調製）２ｍｌに、実施例１に記載の本酵素溶液２ｍｌを添加して３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液のうち１ｍｌを用いて、本酵素の作用により６位リン酸化糖から生じた無機リン酸酸量をバナド・モリブデン酸法により測定し、残り５ｍｌを１００℃で８時間処理したのち、生じた６位リン酸化糖由来の無機リン酸量を同様に定量した。その結果を表２に示す。このようにリン酸化糖のリン酸基の３位および６位の結合割合を簡便に推測できた。
【表２】

【００５０】
（実施例１０）
実施例２から６で得たリン酸化糖１％溶液１ｍｌに対して、２０Ｕのシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（天野製薬製、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓ由来）を添加し、５０℃で４８時間反応させた。反応溶液は５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で行った。そして、沸騰湯浴中で５分間処理することで反応停止した。各反応液２μｌを用いて薄層クロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ製、シリカゲルプレート）で分析した。展開溶媒は、エタノール：酢酸：脱塩水＝７０：２：３０を用いて、室温で１回展開した。展開後、プレートを乾燥し、硫酸：メタノール＝１：１溶液を噴霧し、１３０℃のオーブンで３分間焼成した。その結果、図１０に示したようにリン酸化マルトペンタオースの基質において明らかに転移反応が確認され、分子内に複数個のリン酸基を有する３位リン酸化糖あるいは６位リン酸化糖が生成していた。
【００５１】
（実施例１１）
実施例３と６のリン酸化マルトトライオースの２ｍＭ溶液６０μｌに対して、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中に溶解させた３％の水素化ホウ素ナトリウム溶液５μｌを添加した。本溶液を４０℃で１時間処理した。本処理後、０．７Ｎ塩酸溶液中で１００℃、４時間処理した。本酸加水分解処理溶液中の生じたソルビトール、グルコース、グルコース−６−リン酸をそれぞれ分析定量した。ソルビトール、グルコース、グルコース−６−リン酸は、それぞれＭａｎｎｅｒｓらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１７巻、１０９−１１４頁、１９７１年）、Ｍｉｗａらの方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，、３７巻、５３８−５４０頁、１９７２年）、Ｈｉｚｕｋｕｒｉらの方法（Ｓｔａｒｃｈ，２２巻、３３８−３４３頁、１９７０年）で定量した。その結果、表３に示したように、分子内にもとのリン酸化マルトトライオースと等モルのソルビトールが検出され、リン酸化糖アルコールの生成が確認された。つまり、３位リン酸化マルトトライトールと６位リン酸化マルトトライトールが生成していた。
【表３】

Ａ．グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトトライオース
Ｂ．グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトライオース
表の数値は１モルのリン酸化マルトトライオースから生成したモル数
【００５２】
（実施例１２）
カルシウム、鉄、マグネシウムとの複合体形成能力については、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いる釜阪らのリン酸化糖に関する特許願（特開平８−１０４６９６）に記載の方法に基づいて実施した。結果、実施例２から６あるいは実施例１０、１１で得られたリン酸化糖が、中性ｐＨ以上において、カルシウム、鉄、マグネシウムと結合することで、リン酸化糖単独時よりも高分子側に溶出され、複合体を形成していることが確認できた。
【００５３】
（実施例１３）
カルシウム、マグネシウムおよび鉄等の金属の可溶化効果については、カルシウムリン酸沈殿阻害効果測定方法として、釜阪らのリン酸化糖に関する特許願（特開平８−１０４６９６）に記載の方法に基づいて実施した。結果、実施例２から６あるいは実施例１０，１１で得られたリン酸化糖についてカルシウム、マグネシウムおよび鉄等の金属の可溶化効果があるとの結果が得られた。
【００５４】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はｐＨ２における本酵素活性を１００％としたときの相対活性と、ｐＨとの関係を示した図である。
【図２】図２はｐＨ９で６０分間処理した後の残存活性を１００％としたときの各ｐＨにおける相対残存活性と、ｐＨとの関係を示した図である。
用いた緩衝液；グリシン−塩酸緩衝液（○；ｐＨ１．２−３．０）、酢酸緩衝液（●；ｐＨ３．０−６．０）、ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（△；ｐＨ６．０−７．０）、トリス−塩酸緩衝液（▲；ｐＨ７．０−９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（◇；ｐＨ９．０−１０．６）
【図３】図３は６０℃における本酵素活性を１００％としたときの相対活性と、温度との関係を示した図である。
【図４】図４は４℃で３０分間処理した後の残存活性を１００％としたときの各温度における相対残存活性と、温度との関係を示した図である。
【図５】本酵素によるリン酸化少糖への作用を示す。
図５−９の記号の説明
Ｇ３；マルトトリオース
Ｇ４；マルトテトラオース
Ｇ５；マルトペンタオース
Ｈ；グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオース
Ｊ；グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオース
Ｋ；グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトペンタオース
Ｌ；グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオース
Ｍ；グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオース
Ｎ；グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトペンタオース
Ｐ；グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトース
【図６】本酵素と糖化型α−アミラーゼによるリン酸化少糖類への作用を示す。
【図７】本酵素とネオプルラナーゼによるリン酸化少糖類への作用を示す。
【図８】酢酸加熱処理によるリン酸化少糖類への作用を示す。
【図９】酢酸加熱処理と糖化型α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼによるリン酸化少糖類への作用を示す。
【図１０】糖転移酵素であるシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによるリン酸化糖への転移作用を示す。
図の説明
１、グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオース
２、グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオース
３、グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトペンタオース
４、グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオース
５、グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオース
６、グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオース
Ｍ１、グルコース，標準マルトオリゴ等（Ｇ２−Ｇ６）、グルコース−６−リン酸、グルコース−１，６−２リン酸、各１．５％、１μｌ
Ｍ２、結合リン酸基を１個有するリン酸化マルトトライオースからマルトペンタオースまでの混合物（ＰＯ−１）、結合リン酸基を２個有するマルトペンタオースからマルトオクタオースまでの混合物（ＰＯ−２）、各１．５％、１μｌ[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a phosphoryl group at the 6-position among the phosphate groups bonded to the 6- and 3-positions of the glucose residue of a saccharide in which glucan and phosphoric acid are ester-bonded (abbreviated as phosphorylated saccharide in the present invention). Phosphatase KU-8 that specifically dephosphorylates acid groups (hereinafter referred to as the present enzyme), and oligosaccharides and polysaccharides in which the site to which the phosphate is bound is only the 3-position of the constituent glucose molecule (this enzyme is used) (Hereinafter referred to as the 3-position phosphorylated saccharide) and the 3-position phosphorylated saccharide. In addition, the present invention is a treatment for dephosphorylating only the 3-linked phosphate group of the 6- and 3-linked phosphate groups of the glucose residue of the phosphorylated saccharide, and phosphoric acid using this treatment is bound. The present invention relates to a method for producing oligosaccharides and polysaccharides having a 6-position of a constituent glucose molecule (hereinafter referred to as 6-position phosphorylated sugar) and the 6-position phosphorylated sugar. Furthermore, the present invention relates to a phosphorylated sugar alcohol in which the reducing end of the 3-position or 6-position phosphorylated sugar is reduced to form a sugar alcohol (hereinafter referred to as the 3-position or 6-position phosphorylated sugar alcohol), the 3-position or 6-position phosphorus The present invention relates to a phosphorylated sugar derivative that is a complex of oxidized sugar and protein or peptide, or a phosphorylated sugar derivative that is a conjugate of 3-position or 6-position phosphorylated sugar or phosphorylated sugar derivative and alkaline earth metal or iron.
[0002]
These 3- or 6-position phosphorylated saccharides or phosphorylated saccharide derivatives have an alkaline earth metal such as calcium or iron precipitation inhibitory effect (hereinafter referred to as solubilization) or an absorption promoting action such as calcium. Yes. Furthermore, 3rd-position or 6-position phosphorylated saccharide is indigestible and can be expected to have an intestinal regulating action as well as being low in calories. Therefore, the present invention provides an alkaline earth metal such as calcium or iron contained in or contained in foods, beverages, feeds, or fertilizers, or promotes absorption of iron into a living body, or contains an indigestible sugar. When ingested, it is useful as a raw material, a composition for food and drink, a composition for food addition, a composition for pharmaceuticals, or a feed for promoting various human health and animal health to prevent various diseases.
[0003]
In addition, the product of the present invention has an effect of improving taste quality by changing the sweetness of food to a refreshing sweetness or enhancing the salty taste, and can be effectively added to foods in anticipation of this effect. The present invention also relates to a fertilizer raw material and composition that promotes the absorption of calcium into plants and improves the longevity of plants or fruit trees. Furthermore, the product of the present invention has a caries-preventing effect, and can be added to oral compositions such as toothpastes, mouthwashes, and troches as well as foods, beverages and feeds. The present invention can be used as a scale inhibitor that can prevent or suppress the generation of various scales, particularly calcium-based and magnesium-based scales. In addition, it has this metal chelating action, pH buffering action, and moisturizing action, and is useful not only as a hair washing composition such as shampoo and rinse, but also as a cosmetic and hair styling composition.
[0004]
In products using phosphorylated sugar, if it is not preferable that browning occurs due to aminocarbonyl reaction during the production or storage process, use phosphorylated sugar alcohol with a reducing end reduced. Can do.
[0005]
[Prior art]
In most starches stored by plants, phosphoric acid is partially ester-linked to glucose constituting starch. The amount of phosphoric acid in starch is very small but not zero. In particular, potato starch is relatively high. Among them, potato starch contains many phosphate groups and has a very high phosphate content. (Toshihiro Yagi et al., Starch Science, 20, 51, 1973). In potato starch, it is known that a relatively large number of phosphate groups are ester-bonded to the glucose residues constituting this starch, and it is known that 99% or more of them are bonded to the 6- or 3-position. ing. (Takeda & Hizukuri, Carbohydrate Research, 102, 321-327, 1982). When such starch is decomposed using an amylase or other amylolytic enzyme, the enzyme cannot act in the vicinity of the glucose residue where the phosphate group in the starch structure is ester-linked, and this part is phosphorylated. It is known to remain undegraded in the form of sugar. The technology related to phosphorylated saccharides of Kamasaka et al. (Japanese Patent Laid-Open No. 8-104696) is based on these characteristics and has established an efficient production method by utilizing saccharolytic enzymes, as summarized below. In addition, a new application technology for food and its peripheral uses was established.
[0006]
Among nutrients to be taken from food, minerals are indispensable for maintaining the functions of living bodies. However, this mineral tends to be deficient in the current diet, and health effects are a problem. For example, the average daily intake of calcium does not reach the nutritional requirement of 600 mg (Ministry of Health and Welfare, 1997 National Nutrition Survey). Calcium easily binds to inorganic phosphate and easily forms an insoluble precipitate, and the intestinal tract, which is the site of calcium absorption, is slightly alkaline, and it is difficult to absorb because this insolubilization of calcium is promoted. is there. It is also true that calcium is abundant in bones and teeth and is in high demand in the living body, and it is also known that calcium deficiency leads to the onset of various diseases such as osteoporosis (Reiko Ezawa, Japan Nutrition Foods) Academic Journal, 49, 247-257, 1996). Similarly, the poor absorption of iron and magnesium is known, and as with calcium, inadequate intake is associated with various diseases (RD Baynes, Annu. Rev. Nutr., 10). 133-138, 1990). Insufficient intake is a problem, especially in growing children and pregnant women. Furthermore, today, diet and unbalanced diets are also a major problem, and foods that take into account the effective absorption of iron and magnesium into the body as well as calcium are expected in preference foods, and the development of a well-balanced intake method is important. It is a problem.
In the livestock industry, rapid growth is required for broilers and pigs in order to improve productivity, and bone growth does not catch up with problems such as leg weakness and malformation. Calcium is especially supplied for the purpose of improving bones and eggshell quality, fortifying calcium in milk, and preventing bending of the bones of the rabbit, but the poor utilization rate of calcium is a major problem. In addition, it is known that sufficient supplementation of calcium affects the quality of products even in the cultivation of pearls and the like. Calcium is also an important factor for plants, and administration of chelated calcium such as EDTA-calcium is known to enhance aging and improve shelf life by strengthening cell walls or suppressing ethylene gas generation (Tanaka). Et al., J. Japan. Soc. Hort. Sci., 61, 183-190, 1992).
[0007]
A substance capable of forming a compound with calcium has been developed and used for the purpose of efficiently absorbing calcium from the intestine by preventing calcium from being insolubilized in the intestine. For example, a technique for adding casein phosphopeptide (CPP) to a beverage or food (Japanese Patent Laid-Open Nos. 3-240470 and 5-284939), a calcium solubilizing effect of a calcium citrate / calcium malate complex ( JP-A 56-97248) Bone strength enhancing action of calcium pectate (JP-A-6-7116) is known. These compounds are already used in some foods. However, use is limited depending on the application, and it is not always satisfactory. For example, casein phosphopeptides are relatively well used in foods, but they are very expensive because they are produced by enzymatic treatment of milk proteins, and those with low purity are bitter and limited in use. There is a problem. In addition, the calcium citrate / calcium malate complex also has a sour taste, which limits its use.
[0008]
Against this background, Kamasaka et al. Prepare phosphorylated saccharide from potato starch and use it for food (Japanese Patent Laid-Open No. 8-104696). Since this phosphorylated saccharide is inexpensive and tasteless and odorless, a wide range of its use is expected. In addition, it is expected to have a caries-preventing effect and an action as an indigestible sugar, and its versatility is attracting attention.
[0009]
However, this ground-breaking material is also mixed with the 3- or 6-position phosphorylated saccharide, and it has not been possible to extract only the 3- or 6-position phosphorylated saccharide. Since the 3-position phosphorylated saccharide and the 6-position phosphorylated saccharide are expected to show different behaviors due to differences in their binding stability and the like, it is desired to separate them. This is also desirable in developing the research by obtaining a substrate for studying the difference in properties between the 3-position phosphate and the 6-position phosphate. In addition, a simple method for quantitative determination of each bound phosphorus content is also desired for development and use.
[0010]
On the other hand, research itself on phosphatases that dephosphorylate phosphate esters has long been conducted. For example, a report by Shimada et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 480, 417-427, 1977), a report by Zyla et al. (J. Sci. Food Agric. 49, 315, 1989) and a report by Zyla (World) of Microbiology and Biochemistry, Vol. 9, pages 117-119, 1993) describes the contents of acid phosphatase derived from Aspergillus niger (EC 3.1.3.2). In addition, for example, in the report of Faulker (Biochem. J. 60, 590-596, 1995), glucose-1-phosphatase specific to glucose-1-phosphate (EC 3.1.3.10). Mizushima's report (Protein Nucleic Acid Enzyme 22: 1524-1529, 1977) reported glucose-6-phosphatase (EC 3.1.3 acting on glucose-6-phosphate). 9) has been reported.
[0011]
As described above, phosphatases having different actions depending on the binding positions of phosphate groups of monosaccharide phosphates have been reported. However, there have been no reports on phosphatases that recognize the difference in the binding position of phosphate groups in phosphorylated saccharides other than monosaccharides. Furthermore, there is no known phosphatase that selectively dephosphorylates only one of the bonds of 3-position phosphate and 6-position phosphate regardless of monosaccharide, oligosaccharide, or polysaccharide. In addition, some commercially available phosphatases (from wheat embryo, milk, bovine prostate and E. coli) have been found to selectively dephosphorylate by recognizing the difference in the binding position of phosphate groups in phosphorylated sugar. Not.
[0012]
By the way, it is said that about 60 to 70% of the ester-linked phosphate groups in potato starch are bonded to the 6-position and 30 to 40-% of the glucose residue, respectively (Hizukuri et al., Starch, 22: 338-343, 1970). However, there has been no report that the phosphorylated saccharides phosphorylated only at the 3rd position or the 6th position have been separated.
[0013]
To date, no method has been reported for fractionating only the 3- or 6-position phosphorylated saccharide from such phosphorylated oligosaccharides or phosphorylated polysaccharides. However, for phosphorylated oligosaccharides, the present inventor used a phosphorylated oligosaccharide solution in an appropriate liquid chromatography, such as High-performance anion exchange chromatography (HPAEC, Dionex DX-300, CarboPac PA-100 column, Dionex). A method of fractionating a very small amount of time and effort using a HPLC (Daiso Pack SP-120-5-ODS-BP column) or the like. However, in this method, large-scale preparation is practically extremely difficult.
[0014]
Although some studies have been made on the properties of the 1-position phosphate bond and the 6-position phosphate bond of the glucose residue, the research on the nature of the 3-position phosphate bond has not progressed. Glucose-1-phosphate and glucose-6-phosphate, monosaccharide phosphates, are also sold as reagents, but sugars with phosphate bound to the 3-position are monosaccharides and oligosaccharides. This is probably because the standard could not be obtained. In that sense, it was expected that a sugar preparation phosphorylated only at the 3-position could be obtained efficiently. In addition, glucose-6-phosphate has been studied as a 6-position phosphate-linked carbohydrate, but there is no report on phosphorylated oligosaccharides or phosphorylated polysaccharides phosphorylated only at the 6-position. .
Furthermore, as described above, it is difficult to separate the 3-position or 6-position-linked carbohydrate, and a separate quantitative analysis method has been desired.
[0015]
In addition, caries, commonly referred to as caries, is one of the two major causes of human loss of teeth along with periodontal disease, and is a multifactorial disease in which various factors are involved in the complexities. However, it is also one of the diseases for which a complete prevention method does not yet exist (Toshiki Nishizawa, FoodStyle21, Vol. 1, pages 50-55, 1997). In addition, many sugars that are difficult to become caries have been developed and applied to foods. For example, sugar alcohol, coupling sugar, palatinose, and the like (Okada Shigetaka, Dental World Prospects, 90, 889-891, 1997). These are characterized in that they are not assimilated by the causative bacteria of caries and do not produce acid. However, in actual sweet foods, it is rarely used alone because it has a good taste and does not reach sugar, and since it is used in combination with sugar and glucose, acid is generated and caries cannot be avoided.
[0016]
[Problems to be solved by the present invention]
The present invention relates to a novel phosphatase that recognizes the binding position of a phosphate group of a phosphorylated saccharide and dephosphorylates the phosphate group bonded to the 6-position of a glucose residue and does not act on the phosphate group bonded to the 3-position. And a method for efficiently and easily obtaining the 3-position phosphorylated saccharide by using this enzyme from the phosphorylated saccharide, and also by performing a heat treatment using a dilute acid solution on the phosphorylated saccharide efficiently. An object is to provide a method for easily obtaining a 6-position phosphorylated saccharide.
[0017]
The phosphorylated oligosaccharides referred to in this patent are liquefied α-amylase (EC 3.2.1.1) and glucoamylase (EC 3) which are amylolytic enzymes for various starches. 2.1.3), and α-1,4-glucan obtained by acting one or more amylases such as pullulanase (EC 3.2.1.41), α-1,4 An oligosaccharide comprising 2 to 10 linked glucoses, and having at least one phosphate group ester-bonded to the 6- or 3-position of one or more glucose residues of the glucan Say.
If these amylases are allowed to act at a higher concentration for a longer time and fractionated, finally 2 to 5 glucoses are α-1,4 linked and one or more phosphate groups are bound to obtain a oligosaccharide. Can do.
In addition, by allowing cyclodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19), which is a glycosyltransferase, to act on the phosphorylated saccharide, 7 to 12 glucoses are α-1, 4 linked. In addition, oligosaccharides and polysaccharides to which two or more phosphate groups are bonded can be obtained.
[0018]
The phosphorylated polysaccharide referred to in this patent is a polysaccharide in which 11 or more glucoses are α-1,4 bonds or α-1,6 bonds, including various starches and degradation products thereof. A group in which an ester bond is formed at the 3rd or 6th position of a glucose residue.
[0019]
And by removing the heat-labile 3-position phosphorylated saccharide and providing the 6-position phosphorylated saccharide alone, during the production process of foods, beverages, feeds or pharmaceuticals, cosmetics, oral compositions, etc. The object is to provide a product with improved bound phosphorus stability and reduced free inorganic phosphate content. On the other hand, it is also an object to provide only the 3-position phosphorylated saccharide that can be used for a reagent for researching the binding mode of carbohydrate and phosphate.
Further, it is also an object to easily quantitatively analyze the content of each using the production technique of phosphorylated saccharide only at the 3rd or 6th position. In particular, in the phosphate buffer most commonly used as a buffer solution, the presence of phosphate ions makes it impossible to determine the amount of inorganic phosphate produced by releasing phosphate groups from phosphorylated sugars. In the present application, it is also an object to overcome this problem and measure the phosphoric acid content in the phosphorylated saccharide.
[0020]
[Means for Solving the Problems]
A phosphorylated oligosaccharide or phosphorylated polysaccharide in which phosphate binding sites are in the 3rd and 6th positions are recognized and the binding position of the phosphate group of the phosphorylated sugar is recognized and bound to the 6th position of the glucose residue. A novel phosphatase that dephosphorylates only the phosphate group is allowed to act. Alternatively, the phosphorylated oligosaccharide or phosphorylated polysaccharide is heated in a dilute acid, preferably an acetic acid solution. By the former treatment, only the phosphate group bonded to the 6-position of the phosphorylated oligosaccharide or phosphorylated polysaccharide is cleaved. Only the phosphate group bonded to the 3-position is cleaved by the latter treatment. The means for purifying the 3-position or 6-position phosphorylated saccharide thus obtained is membrane dialysis according to the molecular weight of dextrin, or various ion exchange chromatography (for example, anion exchange chromatography using Chitopearl manufactured by Fujibo Co., Ltd.). If an electrodialysis apparatus (for example, Asahi Kasei's microacylizer) or the like is used, it is relatively easy and mass production is possible.
Aspergillus niger is preferred as the strain used for producing the 3-position phosphorylated saccharide.
[0021]
1.3 Production of enzymes used to produce phosphorylated saccharide
Aspergillus niger KU-8 (Deposited as Biotechnology Deposit P-16248) Is cultured in a medium. The nutrient source of the medium is not particularly limited as long as this strain grows well and produces the target enzyme smoothly. Examples of the carbon source include glucose, sucrose, maltose, corn starch, dextrin, and examples of the nitrogen source include polypeptone, casein, and yeast extract. In addition, inorganic salts such as calcium ion, sodium ion, magnesium ion and various vitamins can be used. The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture, and the medium is adjusted to a pH range of 3 to 8, preferably a pH range of 4 to 7, and the culture temperature is 10 ° C to 50 ° C, preferably 20 ° C. Culturing is performed at about -40 ° C for 1 to 10 days, preferably about 2 to 7 days. After culturing, the enzyme is collected from the culture.
[0022]
The cells are collected from the culture thus obtained, and after crushing, extraction is performed using water, a buffer solution, or the like, and the solid content is removed to obtain a culture extract. The phosphatase is purified from the culture extract thus obtained to obtain the phosphatase of the present invention. In order to purify phosphatase from the culture extract, for example, ammonium sulfate salting-out, hydrophobic chromatography using a phenyl sepharose column (Pharmacia), ion exchange chromatography using a Q-Sepharose or Source-Q column (both Pharmacia) Any one of a chromatography process, a gel filtration chromatography process using a Superdex G-200 column (manufactured by Pharmacia), an ion exchange chromatography process using a TSK gel Super Q-5PW column (manufactured by Tosoh Corporation), and the like were combined as necessary. A phosphatase purified to a high purity is obtained by performing a treatment and performing a lyophilization treatment as necessary.
[0023]
2. Action of phosphatase KU-8
Various phosphoric esters, pyrophosphoric acid and polyphosphoric acid are dephosphorylated by hydrolysis. If the 3-position phosphorylated saccharide and the 6-position phosphorylated saccharide are mixed, the 6-position phosphate group of the 6-position phosphorylated saccharide is specifically dephosphorylated. Not only phosphorylated oligosaccharides but also phosphorylated polysaccharides whose glucose bonds are partially α-1,6 bonds are considered to have the property of specifically dephosphorylating the 6-position phosphate group .
[0024]
3. Enzymatic properties of phosphatase KU-8
(1) Optimum pH
The optimum pH of action of this enzyme is pH 1.5 to 3.0 as shown in FIG.
(2) pH stability
Even after this enzyme was treated at 37 ° C. for 1 hour at each pH, it was stable in the range of pH 2 to 10 as shown in FIG.
(3) Optimum temperature of action
The optimum temperature for the action of this enzyme is 60 ° C. as shown in FIG.
(4) Temperature stability
It can be said that it is stable up to 50 ° C. from the residual activity after 30 minutes treatment at each temperature shown in FIG.
(5) Molecular weight
About 66,000 daltons as a monomer (by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis). The molecular weight by gel filtration is a tetramer of about 260,000 daltons.
(6) Enzyme activity measurement method
Phosphatase activity is measured as follows.
125 μl of enzyme solution kept at 37 ° C., 250 μl of 200 mM glycine-HCl buffer solution (pH 2.0) and 125 μl of 20 mM glucose-6-phosphate solution (adjusted to pH 2.0 with 200 mM glycine-HCl buffer solution) And react for 15 minutes at 37 ° C. To this reaction solution, 50 μl of 10 N perchloric acid, 150 μl of 20 mM ammonium vanadate solution containing 4% of 10 N perchloric acid, and 300 μl of 3.53% ammonium molybdate solution were added and stirred at room temperature for 30 minutes. Leave for a minute. The absorbance of this solution at 420 nm was measured to determine the activity. Monopotassium phosphate was used as a standard substance.
One unit of phosphatase activity is the amount of enzyme that liberates 1 μmol of phosphorus per minute under the above conditions.
[0025]
4. Method for producing 3-position phosphorylated saccharide (1)
Α-Amylase (EC 3.2.2.1), glucoamylase (EC 3.2.1.3), pullulanase (EC 3.2.1) was added to the swollen potato starch. .41) is allowed to act sufficiently, and then an appropriate amount of the enzyme is added to a phosphorylated saccharide solution prepared by removing the generated neutral sugar (hereinafter referred to as potato phosphorylated saccharide solution) at 37 ° C. Allow enough reaction. By this reaction, the 6-position phosphate group of the phosphorylated saccharide is dephosphorylated. Depending on the molecular weight of dextrin, the 3-position phosphorylated saccharide can be purified by membrane dialysis or electrodialysis. Note that the present enzyme used for producing these 3-position phosphorylated saccharides does not necessarily have to be purified in a single manner, and the culture extract can also be used as a crude enzyme solution.
[0026]
5. Method for producing phosphorylated saccharide at position 3 (2)
An appropriate amount of this enzyme is added to a potato phosphorylated saccharide solution and allowed to react sufficiently at 37 ° C. By this reaction, the 6-position phosphate group of the phosphorylated saccharide is dephosphorylated. In addition to neutral oligosaccharides such as maltotriose, maltotetraose and maltopentaose, phosphorylated maltotetraose and phosphorylated with a phosphate group bonded to the 3rd position of the second glucose residue from the non-reducing end A 3-position phosphorylated saccharide such as maltopentaose is produced. The generated neutral oligosaccharide and 3-position phosphorylated saccharide are fractionated by using various ion exchange chromatography, for example, using anion exchange resin such as Chito Pearl (Fujibo Co., Ltd.) or by electrodialysis. The 3-position phosphorylated saccharide can be produced. Note that the present enzyme used for producing these 3-position phosphorylated saccharides does not necessarily have to be purified in a single manner, and the culture extract can also be used as a crude enzyme solution.
[0027]
6. Method for producing 3-position phosphorylated saccharide (3)
Appropriate amounts of the present enzyme and saccharified α-amylase (EC 3.2.1.1) are added to a potato phosphorylated saccharide solution and allowed to react sufficiently at 37 ° C. By this reaction, a neutral sugar mainly composed of glucose and maltose and phosphorylated maltotriose in which one phosphate group is bonded to the 3-position of the glucose residue at the center of maltotriose are generated. This neutral sugar and phosphorylated maltotriose thus produced are fractionated using various ion exchange chromatography or electrodialysis to phosphorylate maltotriose phosphorylated at the 3-position of the central glucose residue. Can be manufactured. The order in which this enzyme and saccharified α-amylase are allowed to act is not limited. Moreover, the present enzyme used for producing the above phosphorylated maltotetraose does not necessarily need to be purified to a single purity, and the culture extract can be used as a crude enzyme solution.
[0028]
7. Method for producing 3-position phosphorylated saccharide (4)
Appropriate amounts of the present enzyme and neopullulanase (EC 3.2.1.135) are added to a potato phosphorylated saccharide solution and allowed to react sufficiently at 37 ° C. By this reaction, a neutral sugar mainly composed of glucose and maltose, and phosphorylated maltotetraose having one phosphate group bonded to the 3-position of the second glucose residue from the non-reducing end side of maltotetraose, Produces. The phosphorylated maltotetraose can be produced by fractionating the produced neutral sugar and phosphorylated maltotetraose using various ion exchange chromatography or electrodialysis. The order in which this enzyme and neopullulanase are allowed to act is not limited. Further, the present enzyme used for producing phosphorylated maltotetraose does not necessarily need to be purified to a single purity, and the culture extract can also be used as a crude enzyme solution.
[0029]
8. Method for producing phosphorylated saccharide at position 6 (1)
A commercial dextrin solution is heated by adding a weak acid solution, preferably dilute acetic acid. The type of dilute acid is not limited to acetic acid, and lactic acid and citric acid are also preferably used. However, if the action of the acid is too strong, the bonds between glucose are also cleaved, so that the phosphorylated saccharide 3-position phosphate, 6-position phosphate, glucose α-1,4 bond and α-1,6 bond Among them, the type, concentration, reaction temperature, and reaction time of a weak acid that only cleaves 3-position phosphoric acid should be set. For example, the 6-position phosphorylated polysaccharide can be produced by boiling with 0.05-0.7 N acetic acid for 30 minutes or more or heating at 80-100 ° C. Even when lactic acid or citric acid is used, the 6-position phosphorylated polysaccharide can be produced by the same heat treatment at a concentration of about 0.05M to 0.5M. Depending on the molecular weight of the dextrin, the 6-position phosphorylated saccharide can be purified by membrane dialysis or electrodialysis.
[0030]
9.6 Method for producing phosphorylated saccharide (2)
A weak acid solution, preferably dilute acetic acid, is added to the potato phosphorylated saccharide solution, followed by heat treatment. The type of dilute acid is not limited to acetic acid, and lactic acid and citric acid are also preferably used. However, if the action of the acid is too strong, the bonds between glucose are also cleaved, so that the phosphorylated saccharide 3-position phosphate, 6-position phosphate, glucose α-1,4 bond and α-1,6 bond Among them, the type, concentration, reaction temperature, and reaction time of a weak acid that only cleaves 3-position phosphoric acid should be set. For example, the 3-position phosphate group of phosphorylated saccharide is dephosphorylated by boiling in 0.1-0.7 N acetic acid for 30 minutes or more or heating at 80-100 ° C. Even when lactic acid or citric acid is used, the 6-position phosphorylated saccharide can be produced by the same heat treatment at a concentration of about 0.05 M to 0.5 M. In addition to neutral oligosaccharides such as maltotriose, maltotetraose and maltopentaose, phosphorylated maltotriose, phosphorylated maltotetraose and phosphorylated maltopentaose in which a phosphate group is bonded to the 6-position of the glucose residue A 6-position phosphorylated saccharide is produced. By fractionating the produced neutral oligosaccharide and 6-position phosphorylated saccharide using various ion exchange chromatography, for example, anion exchange resin such as Chito Pearl (manufactured by Fuji Boseki Co., Ltd.) or by electrodialysis. The 6-position phosphorylated saccharide can be produced. Further, by using glucoamylase in combination, all the neutral sugars are changed to glucose, and only the 6-position phosphorylated sugar can be easily obtained by a simple method such as ethanol precipitation or activated carbon column.
[0031]
Method for producing 10.6-phosphorylated sugar (3)
An appropriate amount of saccharified α-amylase or neopullulanase is added to the potato phosphorylated saccharide solution before and after the dilute acid heat treatment and reacted at 37 ° C. By this reaction, in addition to neutral sugars mainly composed of glucose, phosphorylated maltotriose and phosphorous having a phosphate group bonded to the 6-position of one glucose residue of maltotriose or maltotetraose in the former. Oxidized maltotetraose is produced, and only phosphorylated maltotriose is produced in the latter. The resulting neutral sugar, phosphorylated maltotriose and phosphorylated maltotetraose are fractionated using various ion exchange chromatography or electrodialysis to phosphorylate the 6-position of the glucose residue. Oxidized maltotriose and phosphorylated maltotetraose can be produced. The order of the acid heat treatment and the saccharification type α-amylase treatment or neopullulanase treatment does not matter. However, when saccharified α-amylase or neopullulanase is allowed to act, it is desirable to set the pH and the like to suitable conditions for this enzyme.
[0032]
Method for producing 11.6 position phosphorylated saccharide (4)
An appropriate amount of saccharified α-amylase and glucoamylase, or neopullulanase and glucoamylase is added to the potato phosphorylated saccharide solution before and after the dilute acid heat treatment, and the mixture is sufficiently reacted at 37 ° C. By this reaction, in addition to neutral sugars mainly composed of glucose and maltose, in the former case, phosphorylated maltotriose and phosphorous having one phosphate group bonded to the 6-position of one glucose residue of maltotriose or maltose. Oxidized maltose is produced. In the latter, only phosphorylated maltose is produced. This neutral sugar, phosphorylated maltotriose and phosphorylated maltose are fractionated using various ion exchange chromatography or electrodialysis to phosphorylate malt phosphorylated at the 6-position of the glucose residue. Triose and phosphorylated maltose can be produced. The order in which acid heat treatment and saccharified α-amylase and glucoamylase or neopullulanase and glucoamylase are allowed to act is not limited. However, when saccharifying α-amylase and glucoamylase or neopullulanase and glucoamylase are allowed to act, it is desirable to set the conditions suitable for the enzyme.
[0033]
As described above, phosphorylated saccharide can be prepared from potato starch, but the raw material starch is not particularly limited. In addition to potato starch, plant-derived combined phosphorus-containing starches such as cassava starch, rice starch, and edible canna starch are preferably used, and chemically phosphorylated starch can also be suitably used.
[0034]
From the phosphorylated saccharide of the present invention, a complex with a protein or peptide, which is one of the derivatives of phosphorylated saccharide, can be produced. Complex formation using Maillard reaction with carbohydrate protein has been performed for a long time. This Maillard reaction is a reaction that occurs even during normal food preparation, and the reaction product is extremely safe for the living body. The reaction occurs by dehydration condensation of the reducing end of the carbohydrate to the amino group of the protein. In the case of polysaccharides, 1 to 2 molecules can be bound to one protein molecule, and in the case of monosaccharides, sugars can be bound to the amino groups of most proteins (Kato et al., Microemulsions and emulsions in Food, American Chemical Society). Edit, Chapter 16, pp. 213-229, 1991). Further, as its function, it has been reported that the heat stability and pH stability of the protein are improved, emulsification properties are imparted, or the water-insoluble protein is solubilized (Kato et al., J. Agric. Food Chem., 39). Vol., Pp. 1053-1056, 1991). Recently, by binding glucose-6-phosphate to a protein (Aoki et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1727-1728, 1994) or by binding potato starch-derived phosphorylated oligosaccharides It has also been found that a calcium solubilizing effect can be obtained (Japanese Patent Laid-Open No. 8-104696). However, monosaccharides are highly reactive and have defects that tend to cause protein denaturation. Phosphorylated oligosaccharides are a mixture of 3rd and 6th phosphorylated saccharides, and no reports have been made on each pure product. . In the case of oligosaccharides, the reaction proceeds slowly, has fewer side reactions to proteins than monosaccharides, and is an excellent method for binding organic ligands to proteins. The protein to be used is not particularly limited, but a protein that can be obtained inexpensively and is safe as a food is desirable. Examples of such proteins include ovalbumin, wheat protein, and soy protein. Peptides obtained by hydrolyzing them are also preferably used.
[0035]
In general, sugar alcohols are produced by a method in which raw sugar is hydrogenated at high temperature and pressure under a nickel catalyst. At the laboratory level, it can be easily prepared by coexisting with sodium borohydride for about 1 hour at room temperature. The phosphorylated saccharide of the present invention can be changed to a phosphorylated saccharide alcohol by the same common-sense treatment. This reaction does not remove the phosphate ester bond. Further, by combining with the method for producing a phosphorylated saccharide of the present invention, a 3- or 6-position phosphorylated saccharide alcohol can be prepared. The phosphorylated sugar alcohol thus obtained does not cause an aminocarbonyl reaction, that is, is unlikely to cause browning in food.
[0036]
The phosphorylated saccharide of the present invention can promote the absorption of calcium in the intake of fertilizers, feeds, pharmaceuticals, or foods. In addition, phosphorylated saccharide forms a compound or complex with an alkaline earth metal such as calcium and magnesium and a trace metal element such as iron and zinc, and it is possible to promote their absorption into the living body. Therefore, prevention of various diseases such as osteoporosis circulatory diseases caused by these mineral deficiencies (Yoshinori Itokawa, Masahiko Yoshida, Mg and cardiovascular diseases, Medical Tribune, 1986) can be expected. Furthermore, today, there are great problems of diet and uneven diet, and products that take into consideration the effective absorption of iron and magnesium into the living body as well as calcium are expected in preference foods. The phosphorylated saccharide or derivative thereof of the present invention is safe, indigestible, and low in calories. This phosphorylated saccharide is also expected to have moisturizing action, bifidobacteria growth action, bowel regulation action, lipid improvement action, blood pressure lowering action, immunostimulatory action, etc. as reported for many oligosaccharides (Hidaka Et al., Japanese Agricultural Chemistry Magazine, 61, 915-923, 1987) (Shigeo Sakai, Monthly Food Chemical, 4, 81-88, 1995). Furthermore, a complex with iron is formed, and this complex can also be expected to have an antioxidant effect. It is also known that the effect of suppressing the generation of active oxygen by the metal chelate action has an effect of suppressing carcinogenesis and aging in the living body (E. Graf et al., Cancer, Vol. 56, pages 717-718). 1985) (Junji Terao, Science of Nutrition and Health, Vol. 21, pp. 21-25, 1996). In addition, sugars and flavones that have been used in foods for these purposes (Fight Chemicals Subcommittee Research Report, Food Forum / Tsukuba / Fight Chemicals Subcommittee, 1998), polyphenols (Kondo, In combination with Lancet, 344, 1152, 1994), a synergistic effect can be expected.
[0037]
Furthermore, the phosphorylated saccharide of the present invention does not become a nutrient source for mutans bacteria (Okahashi et al., Microorganisms, Vol. 4, pp. 209-217, 1988) that cause caries, and does not produce acid or water-insoluble glucan. It is a carbohydrate. Therefore, plaque does not occur and tooth demineralization does not occur. Rather, taking into account the high affinity with calcium, dental remineralization is also expected (Matsukubo et al., Journal of Oral Hygiene, 46, 442-443, 1996). In addition, the phosphorylated saccharide has a buffering action and has an effect of preventing a decrease in pH. Therefore, for example, sugar and glucose coexist, and even if acid fermentation by caries fungi such as mutans bacteria occurs, there is an effect of preventing a decrease in pH and suppressing the generation of caries. This effect is synergistic with the combination with carbohydrates that are unlikely to become caries and with the combination of fluorine with a caries preventive effect (Sugawara et al., Journal of Oral Hygiene, 46, 632-633, 1996), etc. Furthermore, it can be expected to be effective for caries. Thus, phosphorylated saccharide can be used in almost all food-drinking compositions or food additive compositions. The food and drink composition is a generic term for human food, animal or fish shell feed, and pet food. That is, coffee, cola, black tea, Japanese tea, oolong tea, juice, processed milk, sports drinks, energy drinks, soups and other liquid and powdered beverages, breads, cookies, crackers, biscuits, cakes, pizzas, pie and other bakery Seasonings such as pasta such as seafood, spaghetti, macaroni, noodles such as udon, soba, ramen, sauce, soy sauce, ketchup, sauce, soup stock, stew, curry, noodle soup, dressing, mayonnaise Confectionery such as confectionery, gum, caramel, candy, chocolate, snack confectionery such as rice cake, potato chips, snacks, frozen confectionery such as ice cream, sorbet, dairy products such as cream, cheese, powdered milk, condensed milk, milk drinks, jelly, Western confectionery such as pudding, mousse, yogurt, bun, iro, mochi, Japanese confectionery such as hagi, dumplings, curry, stew, hayashi, soup, retort or canned food such as bowls, frozen foods such as ham, hamburger, meatballs, croquettes, dumplings, pilaf, rice balls, refrigerated foods, chikuwa, It can also be used effectively for fishery products such as kamaboko, bento rice, and sushi. In addition, for infant formula, baby food, baby food, pet food, animal feed, sports drinks, intestinal preparations, cold medicines, nutritional supplements and beverages, and other oral compositions such as toothpastes, mouthwashes, troches, etc. It can be suitably added. Further, the pH adjusting action and the metal adsorbing action can be suitably used for cosmetics such as a hair washing composition such as shampoo and rinse, and a hair styling composition, in addition to the above uses.
[0038]
The phosphorylated saccharide of the present invention can also be used for drugs such as swallows and bathing agents containing calcium, iron, magnesium and the like.
[0039]
In addition, by using the acid phosphatase used in the practice of the present invention, only the 6-position linked phosphorus is liberated, so the 6-position linked phosphate content is converted to glucose using a method for quantifying inorganic phosphate or neutral sugars using glucoamylase. By performing quantitative analysis of glucose by decomposing to 3%, it is possible to easily perform quantitative analysis even if 3-position binding phosphorus is present. The quantitative analysis method of inorganic phosphoric acid or glucose is not particularly limited, but the former is preferably the vanad-molybdic acid method (Itaya, Clin. Chem. Acta, 14, 361-366, 1966). For the latter, the glucose oxidase method (Biochemical Experimental Method 1, Society Press Center, pages 143-150, 1990) is preferably used. Similarly, when the phosphorylated saccharide of the present invention is acid-treated, only the 3-position linked phosphorus is released, so that the 3-position bound content can be determined using a method for determining inorganic phosphate, or the neutral sugar can be converted to glucoamylase. By using it to decompose to glucose and performing quantitative analysis of glucose, quantitative analysis can be easily performed even if 6-linked phosphorus exists. In addition, by quantifying the amount of inorganic phosphorus released in this way as the amount of glucose, the amount of inorganic phosphorus released easily can be quantified even if a phosphate salt is present in the sample solution in advance. Of course, the phosphorylated saccharide remaining without liberating phosphorus can also be analyzed using liquid chromatography.
[0040]
Specifically, a phosphate group is added to the 3-position of the central glucose residue of maltotriose by further allowing saccharified α-amylase, glucoamylase, and neopullulanase to sufficiently act on a potato phosphorylated saccharide solution. A solution containing two types of phosphorylated maltose having one phosphate group bonded to the 6-position of the glucose residue at the non-reducing end of maltose and one phosphorylated maltotriose bonded to each other is obtained. This solution is designated as sample solution A. 6-position binding of glucose residues by quantifying the free phosphate content of a solution (referred to as sample solution B) obtained by adding an appropriate amount of the acid phosphatase of the present invention to sample solution A and sufficiently reacting at 37 ° C. The phosphoric acid content can be measured. Alternatively, when glucoamylase sufficiently acts on the sample solution B, glucose is generated because glucoamylase can act on dephosphorylated maltose. By quantifying the generated glucose content (the free phosphorus content is ½ of the generated glucose content), it is possible to measure the generated free phosphate content even if phosphate is present in the solution.
In addition, by adding acetic acid to the sample solution A to a final concentration of 0.35 N and quantifying the free phosphoric acid content of a solution treated at 100 ° C. for 8 hours (referred to as sample solution C), The 3-position phosphate content can be measured. Alternatively, when glucoamylase sufficiently acts on the sample solution C, glucose is generated because glucoamylase can act on dephosphorylated maltotriose. By quantifying the produced glucose content (the free phosphorus content is 1/3 of the produced glucose content), the produced free phosphate content can be measured even if phosphate is present in the solution. By the above operation, both the 3rd and 6th linked phosphoric acid contents in potato starch can be measured. Furthermore, if the sample solution A is wet or dry ashed, all bound phosphoric acid is liberated. In this way, the other content can be calculated only by quantifying one of the 3-position and 6-position phosphate contents. Alternatively, the total bound phosphate content can also be quantified by allowing sample solution A to sufficiently react with alkaline phosphatase (derived from Escherichia coli).
By appropriately combining these quantitative analysis methods, the abundance ratio of the 3-position or 6-position phosphorylated saccharide in starches of various origins can be easily calculated.
[0041]
【Example】
(Example 1)
0.1% polyphosphoric acid, 0.5% glucose, 0.1% yeast extract, 0.5% polypeptone, 0.1% sodium chloride, 0.1% potassium chloride, 0.02% magnesium sulfate, 0.002 500 ml of a medium containing 1% ferrous sulfate (prepared to pH 6.5) was placed in a 2000 ml Sakaguchi flask, inoculated with KU-8 strain, and cultured with shaking at 37 ° C. for 4 days. The bacterial cells were collected and collected by filtration through a filter paper (Advantech NO.2), suspended by adding about 10 times volume of 10 mM acetate buffer (adjusted to pH 4.5, hereinafter referred to as A buffer in this Example), The culture extract was obtained by crushing with ultrasonic waves and centrifuging the crushing liquid (8,000 rpm, 30 minutes). Ammonium sulfate (ammonium sulfate) was added to the extract so as to be 80% saturation, and the mixture was left refrigerated overnight. The supernatant obtained by centrifuging (18,000 rpm, 30 minutes) was equilibrated with 10 mM acetate buffer containing 80% saturated ammonium sulfate (prepared to pH 4.5, hereinafter referred to as B buffer in this Example). The enzyme was adsorbed by hydrophobic chromatography using a modified phenyl sepharose column (26 × 100 mm, manufactured by Pharmacia). Then, stepwise elution was performed in the order of 100% B buffer, 50% B buffer, and 0% B buffer (= 100% A buffer). Fractions showing this enzyme activity (corresponding to 0% B buffer) were collected and dialyzed overnight against A buffer. The resulting dialyzed internal solution was subjected to ion exchange chromatography using a Q-Sepharose or Source-Q column (both 10 × 80 mm, manufactured by Pharmacia) equilibrated with A buffer to adsorb the enzyme. The gradient elution was then performed by linearly increasing the sodium chloride concentration in the A buffer to 0-300 mM. The fraction showing this enzyme activity (corresponding to a sodium chloride concentration of 50 to 200 mM) was dialyzed overnight against A buffer. The obtained dialysis internal solution was subjected to ion exchange chromatography using a TSK gel super Q-5PW column (8 × 75 mm, manufactured by Tosoh Corporation) equilibrated with A buffer to adsorb the enzyme. Subsequently, gradient elution was performed by linearly increasing the sodium chloride concentration in the A buffer to 0 to 300 mM to obtain an active fraction of the enzyme (corresponding to a sodium chloride concentration of 50 to 200 mM). This active fraction was subjected to gel filtration chromatography using a Superdex G-200 column (16 × 200 mm, manufactured by Pharmacia) equilibrated with A buffer containing 100 mM sodium chloride, and the purified fraction of the enzyme (180 U / mg protein). Phosphatase KU-8 purified according to this example is referred to as “this enzyme” and is used in Examples 2-4. When this purified fraction was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, it showed a single band, indicating that it was a single substance electrophoretically.
[0042]
(Example 2)
35% α-amylase (from Ueda Chemical, Bacillus subtilis) was allowed to act on a 1% potato starch solution at 50 ° C. for 30 minutes, and then 2 U pullulanase (from Hayashibara Biochemical Research Institute, Aerobacter aerogenes) and 6 U glucoamylase (Toyobo) , Rhizopus sp.) Were allowed to act simultaneously at 40 ° C. for 20 hours. In the following Examples, the activity of various amylase enzymes is defined as 1 U, which is an activity that cleaves 1 μmol of glucosyl bond per minute. The enzyme reaction is stopped by boiling for 5 minutes, neutral sugar is removed from the solution with an anion exchange resin (Chitopearl BCW2501), desalted and freeze-dried to obtain a phosphorylated oligosaccharide having a polymerization degree of 3 to 5. A mixed powder was obtained. Next, 200 μl of 200 mM glycine-hydrochloric acid buffer solution (pH 2.0), 200 μl of 3% solution of phosphorylated saccharide mixture having a polymerization degree of 3 to 5 (prepared with 200 mM glycine-hydrochloric acid buffer solution (pH 2.0)) 200 μl of the enzyme solution described in 1) was added and reacted at 37 ° C. for 16 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was analyzed by HPAEC. The result is shown in FIG. Analysis by HPAEC can be performed by increasing the concentration of 1M sodium acetate with 100 mM sodium hydroxide as the base solution. Detection can be performed using pulsed amperometry (Dionex). The 6-linked phosphate of phosphorylated saccharide is dephosphorylated by this enzyme. After removing neutral sugars such as maltotriose, maltotetraose, and maltopentaose in the reaction solution generated by dephosphorylation by anion exchange chromatography using chitopearl, desalting and freeze-drying A mixed powder of phosphorylated maltotetraose and phosphorylated maltopentaose phosphorylated at the 3-position of the glucose residue was obtained.
[0043]
(Example 3)
200 μl of 200 mM acetate buffer (pH 4.5), 200 μl of 3% solution of phosphorylated oligosaccharide described in Example 2 (prepared with 10 mM acetate buffer (pH 4.5)), 100 μl of the enzyme solution and 30 U / ml 100 μl of a saccharified α-amylase (Nagase Biochemical, from Bacillus subtilis) solution was added and reacted at 37 ° C. for 16 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was analyzed by HPAEC as in Example 1. The result is shown in FIG. The 6-linked phosphate of phosphorylated saccharide is dephosphorylated by this enzyme. The neutral sugar in the reaction solution produced by dephosphorylation was removed by anion exchange chromatography using chitopearl, and then desalting and lyophilization phosphorylated the 3-position of one glucose residue. A powder of phosphorylated maltotriose was obtained.
[0044]
(Example 4)
200 μl of 200 mM acetate buffer (pH 4.5), 200 μl of 3% solution of phosphorylated oligosaccharide described in Example 2 (prepared with 10 mM acetate buffer (pH 4.5)), 100 μl of the enzyme solution and 30 U / ml 100 μl of a neopullulanase (from Bacillus stearothermophilus, Kuriki et al., J. Bacteriol. 173, 6147-6152 (1991)) solution was added and reacted at 37 ° C. for 16 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was analyzed by HPAEC as in Example 1. The result is shown in FIG. The 6-linked phosphate of phosphorylated saccharide is dephosphorylated by this enzyme. The neutral sugar in the reaction solution produced by dephosphorylation was removed by anion exchange chromatography using chitopearl, and then desalting and lyophilization phosphorylated the 3-position of one glucose residue. A powder of phosphorylated maltotetraose was obtained.
[0045]
(Example 5)
The phosphorylated oligosaccharide described in Example 2 is added to a 0.35 N acetic acid solution to prepare 1 ml of a 1% solution, and reacted at 100 ° C. for 8 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was analyzed by HPAEC as in Example 1. The result is shown in FIG. By this reaction, the 3-position phosphoric acid of the phosphorylated saccharide is dephosphorylated. After removing the neutral sugar in the reaction solution produced by dephosphorylation by anion exchange chromatography using chitopearl, the 6-position of one glucose residue was phosphorylated by desalting and lyophilization. A mixed powder of phosphorylated maltotriose, phosphorylated maltotetraose and phosphorylated maltopentaose was obtained.
[0046]
(Example 6)
Phosphorylated oligosaccharide shown in Example 2 is added to a 0.35 N acetic acid solution to make 1 ml of a 1% solution and reacted at 100 ° C. for 8 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture is neutralized with 1N sodium hydroxide solution, 10 μl each of saccharified α-amylase solution and glucoamylase solution is added and reacted at 37 ° C. for 16 hours. Thereafter, the reaction solution was analyzed by HPAEC in the same manner as in Example 1. The result is shown in FIG. By this reaction, the 3-position phosphoric acid of the phosphorylated saccharide is dephosphorylated. After removing the neutral sugar in the reaction solution produced by dephosphorylation by anion exchange chromatography using chitopearl, the 6-position of one glucose residue was phosphorylated by desalting and lyophilization. A mixed powder of phosphorylated maltotriose and phosphorylated maltose was obtained.
[0047]
(Example 7)
The sample solution 1) in which 5% sucrose solution was used as a control and 0.5% phosphorylated saccharide was added thereto was examined for changes in sweetness by sensory test. The evaluation was carried out in five stages from -2 to 2, with the control being 0, the degree of feeling of the sample solution refreshing was -2 for "not refreshing", and 2 for "refreshing". As a result, as shown in 1) of Table 1, in the sample solution to which 0.5% phosphorylated saccharide was added, 10 out of 12 gave a positive evaluation, and the effect of improving the sweetness of sucrose more favorably was recognized. It was.
[0048]
(Example 8)
A 5% saline solution was used as a control, and a change in salty taste of the sample solution 2) obtained by adding 0.5% phosphorylated saccharide thereto was examined by a sensory test. The evaluation was performed in five stages, with the control being 0, the saltiness of the sample solution being “weak” -2 and “strong” being 2. As a result, as shown in 2) of Table 1, in the sample solution to which 0.5% phosphorylated saccharide was added, 8 out of 12 gave a positive evaluation, and the effect of enhancing the saltiness was recognized.
[Table 1]

[0049]
Example 9
As described in Example 1, 2 ml of 200 mM glycine-hydrochloric acid buffer solution (pH 2.0) and 2 ml of 3% solution of phosphorylated saccharide mixture having a polymerization degree of 3 to 5 (prepared with 200 mM glycine-hydrochloric acid buffer solution (pH 2.0)) 2 ml of this enzyme solution was added and reacted at 37 ° C. for 16 hours. After completion of the reaction, 1 ml of the reaction solution was used to measure the amount of inorganic phosphoric acid generated from the 6-position phosphorylated saccharide by the action of this enzyme by the vanado-molybdic acid method, and the remaining 5 ml was treated at 100 ° C. for 8 hours. Thereafter, the amount of inorganic phosphoric acid derived from the 6-position phosphorylated saccharide was quantified in the same manner. The results are shown in Table 2. Thus, it was possible to easily estimate the bonding ratios at the 3rd and 6th positions of the phosphate group of the phosphorylated saccharide.
[Table 2]

[0050]
(Example 10)
To 1 ml of the phosphorylated saccharide 1% solution obtained in Examples 2 to 6, 20 U of cyclodextrin glucanotransferase (manufactured by Amano Pharmaceutical, from Bacillus macerans) was added and reacted at 50 ° C. for 48 hours. The reaction solution was 50 mM acetate buffer (pH 5.5). And reaction was stopped by processing for 5 minutes in a boiling water bath. Using 2 μl of each reaction solution, analysis was conducted by thin layer chromatography (Merck, silica gel plate). The developing solvent was developed once at room temperature using ethanol: acetic acid: demineralized water = 70: 2: 30. After the development, the plate was dried, sprayed with a sulfuric acid: methanol = 1: 1 solution, and baked in an oven at 130 ° C. for 3 minutes. As a result, as shown in FIG. 10, a transfer reaction was clearly confirmed in the phosphorylated maltopentaose substrate, and a 3-position phosphorylated sugar or a 6-position phosphorylated sugar having a plurality of phosphate groups in the molecule was produced. Was.
[0051]
(Example 11)
To 60 μl of a 2 mM solution of phosphorylated maltotriose of Examples 3 and 6, 5 μl of a 3% sodium borohydride solution dissolved in 0.01 N sodium hydroxide solution was added. This solution was treated at 40 ° C. for 1 hour. After this treatment, it was treated in a 0.7N hydrochloric acid solution at 100 ° C. for 4 hours. The generated sorbitol, glucose, and glucose-6-phosphate in the acid hydrolysis solution were analyzed and quantified. Sorbitol, glucose, and glucose-6-phosphate are prepared by the method of Manners et al. (Carbohydr. Res., 17, 109-114, 1971), the method of Miwa et al. (Clin. Chim. Acta, 37, 538-540 (1972) and Hizukuri et al. (Starch, 22, 338-343, 1970). As a result, as shown in Table 3, the phosphorylated maltotriose and equimolar sorbitol were detected in the molecule, and the production of phosphorylated sugar alcohol was confirmed. That is, 3-position phosphorylated maltotritol and 6-position phosphorylated maltotritol were generated.
[Table 3]

A. Phosphorylated maltotriose phosphorylated at position 3 of the glucose residue
B. Phosphorylated maltotriose phosphorylated at position 6 of the glucose residue
The numbers in the table are the number of moles produced from 1 mole of phosphorylated maltotriose.
[0052]
Example 12
The ability to form a complex with calcium, iron, and magnesium was carried out based on the method described in the patent application (Japanese Patent Laid-Open No. 8-104696) relating to phosphorylated saccharide by Kamasaka et al. Using gel filtration chromatography. As a result, when the phosphorylated saccharide obtained in Examples 2 to 6 or Examples 10 and 11 is combined with calcium, iron, and magnesium at a neutral pH or higher, the phosphorylated saccharide is more on the polymer side than the phosphorylated saccharide alone. Elution was confirmed to form a complex.
[0053]
(Example 13)
The solubilizing effect of metals such as calcium, magnesium and iron was carried out based on the method described in the patent application relating to phosphorylated saccharide of Kamasaka et al. did. As a result, the result that the phosphorylated saccharide obtained in Examples 2 to 6 or Examples 10 and 11 has a solubilizing effect on metals such as calcium, magnesium and iron was obtained.
[0054]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between pH and relative activity when the enzyme activity at pH 2 is taken as 100%.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between relative residual activity at each pH and pH when the residual activity after treatment for 60 minutes at pH 9 is taken as 100%.
Buffers used: glycine-hydrochloric acid buffer (◯; pH 1.2-3.0), acetate buffer (●; pH 3.0-6.0), MES-sodium hydroxide buffer (Δ; pH 6.0) -7.0), Tris-hydrochloric acid buffer (▲; pH 7.0-9.0), glycine-sodium hydroxide buffer (◇; pH 9.0-10.6)
FIG. 3 is a graph showing the relationship between temperature and relative activity when the enzyme activity at 60 ° C. is taken as 100%.
FIG. 4 is a graph showing the relationship between temperature and relative residual activity at each temperature when the residual activity after treatment at 4 ° C. for 30 minutes is defined as 100%.
FIG. 5 shows the action of this enzyme on phosphorylated oligosaccharides.
Explanation of symbols in Figure 5-9
G3; Maltotriose
G4; Maltotetraose
G5; maltopentaose
H: Phosphorylated maltotriose phosphorylated at the 3-position of a glucose residue
J: Phosphorylated maltotetraose phosphorylated at the 3-position of the glucose residue
K: phosphorylated maltopentaose phosphorylated at the 3-position of the glucose residue
L: Phosphorylated maltotriose phosphorylated at the 6-position of a glucose residue
M: Phosphorylated maltotetraose phosphorylated at the 6-position of a glucose residue
N: Phosphorylated maltopentaose phosphorylated at the 6-position of a glucose residue
P: phosphorylated maltose in which the 6-position of a glucose residue is phosphorylated
FIG. 6 shows the action of this enzyme and saccharified α-amylase on phosphorylated oligosaccharides.
FIG. 7 shows the action of this enzyme and neopullulanase on phosphorylated oligosaccharides.
FIG. 8 shows the action on phosphorylated oligosaccharides by heat treatment with acetic acid.
FIG. 9 shows the action of phosphoric acid oligosaccharide by heat treatment with acetic acid and saccharified α-amylase and glucoamylase
FIG. 10 shows the transfer action to phosphorylated saccharide by cyclodextrin glucanotransferase, which is a glycosyltransferase.
Description of figure
1. Phosphorylated maltotriose in which 6-position of glucose residue is phosphorylated
2. Phosphorylated maltotetraose phosphorylated at position 6 of the glucose residue
3. Phosphorylated maltopentaose phosphorylated at position 6 of the glucose residue
4. Phosphorylated maltotriose phosphorylated at position 3 of the glucose residue
5. Phosphorylated maltotetraose phosphorylated at position 3 of the glucose residue
6. Phosphorylated maltotetraose phosphorylated at the 3-position of the glucose residue
M1, glucose, standard maltooligo etc. (G2-G6), glucose-6-phosphate, glucose-1,6-2 phosphate, 1.5% each, 1 μl
M2, a mixture of phosphorylated maltotriose to maltopentaose having one linked phosphate group (PO-1), a mixture of maltopentaose to maltooctaose having two linked phosphate groups (PO-2) ), 1.5% each, 1 μl

Claims

A 3-position bound phosphorus oxide saccharide preparation, method, 3-position phosphorylated saccharide solution containing binding phosphorylated saccharide and 6 binding phosphorylated saccharide is reacted by adding phosphatases, said 6 It is characterized by selectively dephosphorylating a 6-position phosphate group of a position-linked phosphorylated saccharide. The phosphatase is composed of glucose and is composed of only α-1,4 bonds, and has a polymerization degree of 2 Aspergillus niger KU-8 strain, which selectively acts on a linked phosphate group at the 6-position relative to a phosphorylated saccharide having a phosphate group at the 6-position and 3-position of a glucose residue in obtained from (raw Engineering Research deposit P-16248) or a culture thereof, Ru Oh with phosphatase, way.

A 3-position binding method for producing phosphorylated saccharide, 3-position bond and phosphatases in phosphorylated saccharide solution containing phosphorylated saccharide and 6 binding phosphorylated sugar, glycosylated α- amylase from neopullulanase and glucoamylase A 6-linked phosphate group of the 6-linked phosphorylated saccharide is selectively dephosphorylated by acting in combination with an enzyme selected from the group consisting of: 6-linked phosphate group compared to phosphorylated saccharide composed of only α-1,4 bonds in glucose and having a polymerization degree of 2 to 10 and having phosphate groups at 6- and 3-positions of glucose residues in a selective phosphatases that act, obtained from Aspergillus niger KU-8 strain (raw Engineering Research deposited P-16248) or cultures thereof, Ru Oh phosphatase, preparation of phosphorylated saccharide.

The production method according to claim 1 or 2 , wherein cyclodextrin glucanotransferase is allowed to act after the treatment with phosphatase.