JP4261047B2 - 皮膚試験用診断キット及びその実施方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒトパピローマウイルスに対する免疫状態を判定するための皮膚試験に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトパピローマウイルス(HPV)は肛門性器路、特に子宮頚部、外陰部、陰茎及び肛門管の悪性腫瘍に密接な関係を持つ。HPV16のような「ハイリスク」タイプのHPVはそれに含まれるウイルス性腫瘍蛋白 （oncoprotein）E6 及び E7が腫瘍サプレッサー蛋白を不活化することによりケラチノサイトを形質転換させる。2つの腫瘍蛋白 E6 及び E7は協同して不死化に関与していると考えられている（ホーレイ-ネルソン (Hawley-Nelson), EMBO J., 8, 3905 (1989)）。
【０００３】
HPVにより形質転換された癌細胞は進行した段階の腫瘍においてもウイルス性蛋白 E6 及び E7を発現する。これらの蛋白に対する自発的又はワクチン接種により誘導される免疫反応がHPVにより生じる腫瘍を退行させることがあると考えられている。インビトロでの細胞防御反応の検査には非常に時間がかかり、それにもかかわらず比較的低い感度しか示さないという事実により、これまでのところ、病気の自発的退行を示す患者は調べられていなかった。HPVが関与した病変に対してワクチン接種した場合における細胞性免疫学的応答の役割は不明である。
【０００４】
皮膚試験はアレルギー学の臨床分野や感染症に対してはすでに一部（主に、既知のTINE試験の形で結核の判定に）用いられている。しかしながら、これまでのところウイルス学上の問題や癌の研究においては実際に具体的な使用例はなかった。
【０００５】
皮膚試験は科学的な問題に対する優れた手法でもあり、インビボにおける複雑な細胞免疫反応の迅速で実用的な検出に適している。「ハイリスク」HPVに対する細胞免疫反応を調べるための皮膚試験は従来技術においてすでに知られている。癌関連ウイルスに対する免疫反応を判定するのに皮膚試験を初めて用いたこの例は「ハイリスク」HPVタイプ16（実用モデルG9106105.9）の外殻蛋白L1を用いて行なわれ、その後動物モデルに適用された。
【０００６】
マウスにおける皮膚試験のモデルもある：このケースでは移植された抗原に対する免疫反応が調べられた（マクリーンら (Mc Lean et al.), J. Gen. Virol. 74, 239-245 (1993)）。
【０００７】
この既知の皮膚試験はHPV感染に対する体液性の免疫学的応答は検出しなかった。細胞性防御とは対照的に、体液性免疫反応の検出は実験室では血清学的試験により比較的容易に行なうことができる。ウイルス外殻蛋白の三次元的な完全構造に対する抗体はパピローマウイルスを中和化できることは証明済みと考えられている（クリステンセンら (Christensen et al.), J. Gen. Virol. 75, 2271(1994)）。初期蛋白E6 及び E7に対する抗体は子宮頚部の悪性腫瘍に関係している（ジョクムス−クディエルカら (Jochmus-Kudielka et al.), J. Natl. Cancer Inst. 81, 1698 (1989)）。
【０００８】
外殻蛋白から成る「ウイルス様粒子」による予防ワクチン接種はHPV感染とそれに伴う癌の危険を予防的に低下させる。しかしながら、HPVに対する体液性免疫学的応答は既存の病変の退行について何らの役割を演じることはない。そのため血清学的検討が疫学上重要となる。
【０００９】
要約すると、動物モデル及び女性患者での実験ではウイルス蛋白に対する細胞性免疫反応は皮膚試験により検出可能であることが示されている。そのデータの結果、進行した病変では完全なウイルス粒子はそれ以上形成されないために外殻蛋白L1に対する免疫反応は退行とは関係ないと考えることができる。従って、形質転換性ウイルス蛋白E6 及び E7は「治癒」免疫反応のゴールと考えられるものである。それゆえに、ウイルス外殻蛋白によって予防的効果に加えて治療的効果も得られるとするならばこれらの腫瘍抗原はワクチン開発の有力な候補となり得る。このようなワクチン接種は持続感染性器病変に対する細胞傷害性T細胞及びTヘルパー細胞の活性化を引き起こすと考えられる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、E6及び／又はE7に対するこのようなワクチン接種の成功を検出するための、ワクチン接種に対する反応としての免疫系の細胞防御反応を用いたインビボ試験はこれまでのところ知られていない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明が解決すべき目的は、パピローマウイルスのE6及び／又はE7蛋白に対する免疫状態をインビボで容易に検出できる試験を提供することにある。本発明によれば、独立請求項１に記載の皮膚試験用診断キット及び独立請求項１０に記載の皮膚試験を実施する方法を提供することによりこの目的は解決される。本発明のさらに有利な態様及び側面は従属項及び明細書の詳細な説明から明らかである。
【００１２】
本発明の皮膚試験はパピローマウイルス癌腫前駆体(CIN)の自発的退行の検出にも使用できる。
さらに別の一面として、本発明の皮膚試験はHPVにより生じた病変の退行のメカニズムを調べるための研究分野において使用することもできる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に、実施例を用いて本発明を説明するが、そこではワクチン接種の成功を調べるのに実際に皮膚試験が適していることが、ワクチン接種を受けたことがないのに子宮頚癌及びその前駆体の自発的退行、すなわちワクチン接種の成功と同じことである特徴を部分的に示した女性患者によって示される。HPV16-E6又は-E7に対する皮膚試験には合成ペプチドを使用した。天然の蛋白又は融合蛋白の使用と比較して、合成ペプチドには問題となるようなDNAの混入が絶対にないためにDNA混入の可能性が排除できるという利点がある。
【００１４】
腫瘍蛋白HPV16-E7に対するペプチド抗原を用いた皮膚試験を実例として患者に実施した。驚くべきことに、第一に、インビボでウイルス性腫瘍蛋白HPV16-E7に対する細胞性免疫反応を検出することができ、第二に、合成ペプチドを皮膚試験用の蛋白に代用できることを示すことができた。第三に、子宮頚癌前駆体の退行を伴う「遅延型過敏症」という意味での陽性の皮膚試験反応の付随が観察できた。このような相関は以前は知られていない。この観察は抗原HPV16-E7が治療上効果的なワクチンにおいて重要性を持つ可能性を実証しており、本発明の皮膚試験がE6及びE7に関する免疫状態の判定に適用できることを示している。
【００１５】
本発明の実施例を行うにあたり、腫瘍蛋白HPV16-E7のためにそれぞれ30アミノ酸から成る5個の比較的長いペプチドを使用した。これらのペプチドは互いにオーバーラップしていた。また、同じ長さでランダムな配列の対照ペプチドを用いた。HPV16-E7蛋白の98アミノ酸に対する配列は公知である（シードルフら(Seedorf et al.), J. Gen. Virol., 71, 2719 (1990)）。上記のペプチドはDep. IHB/AZL (ライデン、オランダ)で「マルチプル・ペプチド・シンセサイザー」により製造された。これらのペプチドは「Fmoc」技術を用いて合成し、トリフルオロ酸からエーテルにより沈殿させた後に凍結乾燥した。ペプチドの純度は「逆相高速液体クロマトグラフィー」により確認した。もっとも、本発明の皮膚試験に用いるペプチドは当業者に周知の他のいずれの方法で製造してもよい。
【００１６】
試験した個々のペプチドの配列を一文字コードで表示すると以下のようになる：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLND
DLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRA
PAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQ
CDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIV
STHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
また、対照ペプチドは以下である：
SENKELKKAIDGLQGLLLGLRQRIETLEGK
アミノ酸の一文字コードは例えば、Georg Thieme Verlag, Stuttgartにより出版されている Rompps Chemie Lexikon、第1巻、160-161頁 (1989)に説明されている。
【００１７】
この皮膚試験では、無菌試験及び発熱性試験の後、上記ペプチドを70%グリセリン中に1 mg/mlの濃度に溶解し、この溶液の約 0.01 mlを被験者の上皮及び表皮中に厳密な皮内注射法により注入した。各ペプチドは別々に使用した（5個のHPV16-E7ペプチド＋1個の対照ペプチド）。しかしながら、もちろん、それらのペプチド間、及び／又はHPV E6の各ペプチドとの組み合わせでも使用できる。E7抗原による皮膚試験と平行して、ほとんどの例で古典的なリコール抗原に対する一般的な防御条件を、免疫ブロック、例えば、Serotherapeutisches Institut Wien GmbH が Pasteur Merieux S.V., Lyon, Franceのライセンス下で製造している Merieux マルチ試験"Sero"、すなわち7個の抗原と1個の対照により細胞が介在する免疫の状態を測定する試験系を用いて測定した。最低 2 mmの直径の赤い丘疹の形成を伴う反応を陽性と評価した。
【００１８】
上記の皮膚試験を、前癌状態又は悪性のHPVによる病変を持つ全部で19名の女性患者に実施した。このような疾患がHPVタイプ16に起因する可能性は約50%である；さらに40%の症例では他の「ハイリスク」HPVタイプによるものと考えられる。
12 名の女性患者には比較的重症の子宮頚部上皮内新生物形成 (ZIN III)が見られ、そのうち4名は試験時に退行を示していた（Pap III DからPap IIへの自発的退行）。
7 名の女性患者は子宮頚癌であった。
このように、19名の女性患者を試験し、そのうち4名は退行期、15名は進行期にあった。
HPV16感染に関する兆候が全く無い2名の男性を対照者とした。
【００１９】
さらに、当業者に通常知られている方法で、皮膚試験を受けた人を、HPV 16に対する中和抗体についての抗原として「ウイルス様粒子(VLPs)」を用いたELISAにより血清学的に調べた。血清学試験は実際の皮膚試験そのものには必要ないが、結果の科学的意味を増加させるようにこの実施例では行なった。病変のスメア又は生検試料をその後のPCRによるウイルスのタイピングのために-80℃で保存した；最初に、HPV-6/11、-16/18及び -31/33/35についてドットブロットによる検査を行なった(ViraType, Digene Diagnostics, Silver Spring, MD)。リンパ球バンクを別のインビトロ試験用に作製した。
【００２０】
女性の退行期患者(4/4)は腫瘍蛋白E7の個々のペプチドに対してわずかな（1例）ないし強い（3例）免疫反応を示した。15名の女性の進行期患者及び2名の対照者はこの皮膚試験で明確な反応性は示さなかった。古典的なツベルクリン反応と比べて、この皮膚試験反応の経過は明らかに遅かった。従って、ほとんどの症例で判断に最も適した時期は試験後1週間の時点であった。対照ペプチドへの反応はどの症例にも見られなかった。
【００２１】
反応は写真で記録し、1つの反応については生検にかけて組織学的に検査した。先のL1による皮膚試験で既に得られた観察と同様に、リンパ球性浸潤物が見られ、これは「遅延型過敏症反応」と矛盾しないものと考えられた。HPV16-L1に対する抗体は子宮頚癌の7名の女性患者のうちの4名とCINの女性患者1名にのみ見られた。要約すると、このようにHPV16-L1-VLPに対する抗体検出は進行期の方により多く関係していることは明白で、一方皮膚試験のHPV16-E7に対する細胞性免疫反応は前癌性子宮頚部病変の退行期に関係していた。
【００２２】
上記の結果は、HPV16-E7に対する細胞性免疫反応を敏感に検出するのにこの皮膚試験の有効性を証明しており、検査した症例では細胞性免疫反応はHPVが関係した癌前駆体病変の自発的退行に関係していた。
【００２３】
上述の皮膚試験により癌前駆体病変の退行に関係する免疫反応が検出されたため、この皮膚試験はE6及び／又はE7に対するワクチン接種の成功をコントロールするための道具として使用することもできる。免疫学が介在する腫瘍退行のメカニズムを明らかにするために皮膚試験による幅広いスクリーニングをすることも可能である。インビトロの実験に非常に費用がかかるために、実験室的試験により多数の患者の細胞性免疫を試験することはほとんど不可能である。腫瘍蛋白HPV16-E7に対する免疫感作によって子宮頚癌に対して治療上有効と考えられるワクチン接種に関する今後の研究において、本発明の皮膚試験は実用的で感度が高いために、ワクチン接種に対する細胞性免疫系の所望の反応を検出するための理想的方法と言える。
【００２４】
上記の実施例では、使用するペプチドは70%グリセリンに溶解した。グリセリンは皮内投与に適した粘性を持ち、さらに消毒作用を持つために好ましい。本発明では、しかしながら、他の適当な溶媒を用いることもできる；あるいは、ペプチドの溶解特性によっては、特別に適合させた溶液に溶かさなければならない。他に乳化剤、キレート化剤、消毒剤等の添加物を本発明で用いる溶媒に加えることもできる。
【００２５】
上記の皮膚試験は有効量の溶解したE6及び／又はE7抗原をシリンジで皮内注射することにより行なうことができる。従って、本診断キットは1個以上のアンプル、シリンジ及びカニューレを含むことになる。本発明では、皮膚試験に特に適合したアプリケーターを使用することも可能であり、それが好ましく、例えばSero-Merieuxのマルチ試験"SERO"試験スタンプ（上記参照）又はTINE試験用のスタンプが挙げられる。従って、本発明の診断キットは抗原（類）の入ったアンプル及び／又はアプリケーターを含んでいてもよい。
【００２６】
上記の実施例では、本発明の皮膚試験の方法をHPV16-E7について述べた。しかしながら、E6を用いることもできる。他のHPVタイプのE6及び／又はE7を使用する皮膚試験を用いてこれらの株についての免疫学的応答を検出することも可能である。種々のHPVタイプの類縁関係が近いために、種々のHPVタイプ間の交差反応を利用して種々のHPVタイプに対して同時に行なえる、より万能な皮膚試験を提供することも最終的には可能である。
【００２７】
免疫反応が目に見えるようにするために使用すべき抗原の量はさまざまな要因に依存する。そこで、本発明では抗原量は、1回使用ごとに0.01から10μgの間、好ましくは0.05から5μgの間の範囲とすることができる。この場合、診断キット用の抗原溶液を調製する際に、その溶液の一部のみが皮内領域に入るのであって、他の一部は被験者の皮膚上で失われたり溶液アンプル中に残ったままとなりうることを考慮しなければならない。
【００２８】
【配列表】
【００２９】
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒトパピローマウイルスに対する免疫状態を判定するための皮膚試験に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトパピローマウイルス(HPV)は肛門性器路、特に子宮頚部、外陰部、陰茎及び肛門管の悪性腫瘍に密接な関係を持つ。HPV16のような「ハイリスク」タイプのHPVはそれに含まれるウイルス性腫瘍蛋白 （oncoprotein）E6 及び E7が腫瘍サプレッサー蛋白を不活化することによりケラチノサイトを形質転換させる。2つの腫瘍蛋白 E6 及び E7は協同して不死化に関与していると考えられている（ホーレイ-ネルソン (Hawley-Nelson), EMBO J., 8, 3905 (1989)）。
【０００３】
HPVにより形質転換された癌細胞は進行した段階の腫瘍においてもウイルス性蛋白 E6 及び E7を発現する。これらの蛋白に対する自発的又はワクチン接種により誘導される免疫反応がHPVにより生じる腫瘍を退行させることがあると考えられている。インビトロでの細胞防御反応の検査には非常に時間がかかり、それにもかかわらず比較的低い感度しか示さないという事実により、これまでのところ、病気の自発的退行を示す患者は調べられていなかった。HPVが関与した病変に対してワクチン接種した場合における細胞性免疫学的応答の役割は不明である。
【０００４】
皮膚試験はアレルギー学の臨床分野や感染症に対してはすでに一部（主に、既知のTINE試験の形で結核の判定に）用いられている。しかしながら、これまでのところウイルス学上の問題や癌の研究においては実際に具体的な使用例はなかった。
【０００５】
皮膚試験は科学的な問題に対する優れた手法でもあり、インビボにおける複雑な細胞免疫反応の迅速で実用的な検出に適している。「ハイリスク」HPVに対する細胞免疫反応を調べるための皮膚試験は従来技術においてすでに知られている。癌関連ウイルスに対する免疫反応を判定するのに皮膚試験を初めて用いたこの例は「ハイリスク」HPVタイプ16（実用モデルG9106105.9）の外殻蛋白L1を用いて行なわれ、その後動物モデルに適用された。
【０００６】
マウスにおける皮膚試験のモデルもある：このケースでは移植された抗原に対する免疫反応が調べられた（マクリーンら (Mc Lean et al.), J. Gen. Virol. 74, 239-245 (1993)）。
【０００７】
この既知の皮膚試験はHPV感染に対する体液性の免疫学的応答は検出しなかった。細胞性防御とは対照的に、体液性免疫反応の検出は実験室では血清学的試験により比較的容易に行なうことができる。ウイルス外殻蛋白の三次元的な完全構造に対する抗体はパピローマウイルスを中和化できることは証明済みと考えられている（クリステンセンら (Christensen et al.), J. Gen. Virol. 75, 2271(1994)）。初期蛋白E6 及び E7に対する抗体は子宮頚部の悪性腫瘍に関係している（ジョクムス−クディエルカら (Jochmus-Kudielka et al.), J. Natl. Cancer Inst. 81, 1698 (1989)）。
【０００８】
外殻蛋白から成る「ウイルス様粒子」による予防ワクチン接種はHPV感染とそれに伴う癌の危険を予防的に低下させる。しかしながら、HPVに対する体液性免疫学的応答は既存の病変の退行について何らの役割を演じることはない。そのため血清学的検討が疫学上重要となる。
【０００９】
要約すると、動物モデル及び女性患者での実験ではウイルス蛋白に対する細胞性免疫反応は皮膚試験により検出可能であることが示されている。そのデータの結果、進行した病変では完全なウイルス粒子はそれ以上形成されないために外殻蛋白L1に対する免疫反応は退行とは関係ないと考えることができる。従って、形質転換性ウイルス蛋白E6 及び E7は「治癒」免疫反応のゴールと考えられるものである。それゆえに、ウイルス外殻蛋白によって予防的効果に加えて治療的効果も得られるとするならばこれらの腫瘍抗原はワクチン開発の有力な候補となり得る。このようなワクチン接種は持続感染性器病変に対する細胞傷害性T細胞及びTヘルパー細胞の活性化を引き起こすと考えられる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、E6及び／又はE7に対するこのようなワクチン接種の成功を検出するための、ワクチン接種に対する反応としての免疫系の細胞防御反応を用いたインビボ試験はこれまでのところ知られていない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明が解決すべき目的は、パピローマウイルスのE6及び／又はE7蛋白に対する免疫状態をインビボで容易に検出できる試験を提供することにある。本発明によれば、独立請求項１に記載の皮膚試験用診断キット及び独立請求項１０に記載の皮膚試験を実施する方法を提供することによりこの目的は解決される。本発明のさらに有利な態様及び側面は従属項及び明細書の詳細な説明から明らかである。
【００１２】
本発明の皮膚試験はパピローマウイルス癌腫前駆体(CIN)の自発的退行の検出にも使用できる。
さらに別の一面として、本発明の皮膚試験はHPVにより生じた病変の退行のメカニズムを調べるための研究分野において使用することもできる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に、実施例を用いて本発明を説明するが、そこではワクチン接種の成功を調べるのに実際に皮膚試験が適していることが、ワクチン接種を受けたことがないのに子宮頚癌及びその前駆体の自発的退行、すなわちワクチン接種の成功と同じことである特徴を部分的に示した女性患者によって示される。HPV16-E6又は-E7に対する皮膚試験には合成ペプチドを使用した。天然の蛋白又は融合蛋白の使用と比較して、合成ペプチドには問題となるようなDNAの混入が絶対にないためにDNA混入の可能性が排除できるという利点がある。
【００１４】
腫瘍蛋白HPV16-E7に対するペプチド抗原を用いた皮膚試験を実例として患者に実施した。驚くべきことに、第一に、インビボでウイルス性腫瘍蛋白HPV16-E7に対する細胞性免疫反応を検出することができ、第二に、合成ペプチドを皮膚試験用の蛋白に代用できることを示すことができた。第三に、子宮頚癌前駆体の退行を伴う「遅延型過敏症」という意味での陽性の皮膚試験反応の付随が観察できた。このような相関は以前は知られていない。この観察は抗原HPV16-E7が治療上効果的なワクチンにおいて重要性を持つ可能性を実証しており、本発明の皮膚試験がE6及びE7に関する免疫状態の判定に適用できることを示している。
【００１５】
本発明の実施例を行うにあたり、腫瘍蛋白HPV16-E7のためにそれぞれ30アミノ酸から成る5個の比較的長いペプチドを使用した。これらのペプチドは互いにオーバーラップしていた。また、同じ長さでランダムな配列の対照ペプチドを用いた。HPV16-E7蛋白の98アミノ酸に対する配列は公知である（シードルフら(Seedorf et al.), J. Gen. Virol., 71, 2719 (1990)）。上記のペプチドはDep. IHB/AZL (ライデン、オランダ)で「マルチプル・ペプチド・シンセサイザー」により製造された。これらのペプチドは「Fmoc」技術を用いて合成し、トリフルオロ酸からエーテルにより沈殿させた後に凍結乾燥した。ペプチドの純度は「逆相高速液体クロマトグラフィー」により確認した。もっとも、本発明の皮膚試験に用いるペプチドは当業者に周知の他のいずれの方法で製造してもよい。
【００１６】
試験した個々のペプチドの配列を一文字コードで表示すると以下のようになる：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLND
DLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRA
PAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQ
CDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIV
STHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
また、対照ペプチドは以下である：
SENKELKKAIDGLQGLLLGLRQRIETLEGK
アミノ酸の一文字コードは例えば、Georg Thieme Verlag, Stuttgartにより出版されている Rompps Chemie Lexikon、第1巻、160-161頁 (1989)に説明されている。
【００１７】
この皮膚試験では、無菌試験及び発熱性試験の後、上記ペプチドを70%グリセリン中に1 mg/mlの濃度に溶解し、この溶液の約 0.01 mlを被験者の上皮及び表皮中に厳密な皮内注射法により注入した。各ペプチドは別々に使用した（5個のHPV16-E7ペプチド＋1個の対照ペプチド）。しかしながら、もちろん、それらのペプチド間、及び／又はHPV E6の各ペプチドとの組み合わせでも使用できる。E7抗原による皮膚試験と平行して、ほとんどの例で古典的なリコール抗原に対する一般的な防御条件を、免疫ブロック、例えば、Serotherapeutisches Institut Wien GmbH が Pasteur Merieux S.V., Lyon, Franceのライセンス下で製造している Merieux マルチ試験"Sero"、すなわち7個の抗原と1個の対照により細胞が介在する免疫の状態を測定する試験系を用いて測定した。最低 2 mmの直径の赤い丘疹の形成を伴う反応を陽性と評価した。
【００１８】
上記の皮膚試験を、前癌状態又は悪性のHPVによる病変を持つ全部で19名の女性患者に実施した。このような疾患がHPVタイプ16に起因する可能性は約50%である；さらに40%の症例では他の「ハイリスク」HPVタイプによるものと考えられる。
12 名の女性患者には比較的重症の子宮頚部上皮内新生物形成 (ZIN III)が見られ、そのうち4名は試験時に退行を示していた（Pap III DからPap IIへの自発的退行）。
7 名の女性患者は子宮頚癌であった。
このように、19名の女性患者を試験し、そのうち4名は退行期、15名は進行期にあった。
HPV16感染に関する兆候が全く無い2名の男性を対照者とした。
【００１９】
さらに、当業者に通常知られている方法で、皮膚試験を受けた人を、HPV 16に対する中和抗体についての抗原として「ウイルス様粒子(VLPs)」を用いたELISAにより血清学的に調べた。血清学試験は実際の皮膚試験そのものには必要ないが、結果の科学的意味を増加させるようにこの実施例では行なった。病変のスメア又は生検試料をその後のPCRによるウイルスのタイピングのために-80℃で保存した；最初に、HPV-6/11、-16/18及び -31/33/35についてドットブロットによる検査を行なった(ViraType, Digene Diagnostics, Silver Spring, MD)。リンパ球バンクを別のインビトロ試験用に作製した。
【００２０】
女性の退行期患者(4/4)は腫瘍蛋白E7の個々のペプチドに対してわずかな（1例）ないし強い（3例）免疫反応を示した。15名の女性の進行期患者及び2名の対照者はこの皮膚試験で明確な反応性は示さなかった。古典的なツベルクリン反応と比べて、この皮膚試験反応の経過は明らかに遅かった。従って、ほとんどの症例で判断に最も適した時期は試験後1週間の時点であった。対照ペプチドへの反応はどの症例にも見られなかった。
【００２１】
反応は写真で記録し、1つの反応については生検にかけて組織学的に検査した。先のL1による皮膚試験で既に得られた観察と同様に、リンパ球性浸潤物が見られ、これは「遅延型過敏症反応」と矛盾しないものと考えられた。HPV16-L1に対する抗体は子宮頚癌の7名の女性患者のうちの4名とCINの女性患者1名にのみ見られた。要約すると、このようにHPV16-L1-VLPに対する抗体検出は進行期の方により多く関係していることは明白で、一方皮膚試験のHPV16-E7に対する細胞性免疫反応は前癌性子宮頚部病変の退行期に関係していた。
【００２２】
上記の結果は、HPV16-E7に対する細胞性免疫反応を敏感に検出するのにこの皮膚試験の有効性を証明しており、検査した症例では細胞性免疫反応はHPVが関係した癌前駆体病変の自発的退行に関係していた。
【００２３】
上述の皮膚試験により癌前駆体病変の退行に関係する免疫反応が検出されたため、この皮膚試験はE6及び／又はE7に対するワクチン接種の成功をコントロールするための道具として使用することもできる。免疫学が介在する腫瘍退行のメカニズムを明らかにするために皮膚試験による幅広いスクリーニングをすることも可能である。インビトロの実験に非常に費用がかかるために、実験室的試験により多数の患者の細胞性免疫を試験することはほとんど不可能である。腫瘍蛋白HPV16-E7に対する免疫感作によって子宮頚癌に対して治療上有効と考えられるワクチン接種に関する今後の研究において、本発明の皮膚試験は実用的で感度が高いために、ワクチン接種に対する細胞性免疫系の所望の反応を検出するための理想的方法と言える。
【００２４】
上記の実施例では、使用するペプチドは70%グリセリンに溶解した。グリセリンは皮内投与に適した粘性を持ち、さらに消毒作用を持つために好ましい。本発明では、しかしながら、他の適当な溶媒を用いることもできる；あるいは、ペプチドの溶解特性によっては、特別に適合させた溶液に溶かさなければならない。他に乳化剤、キレート化剤、消毒剤等の添加物を本発明で用いる溶媒に加えることもできる。
【００２５】
上記の皮膚試験は有効量の溶解したE6及び／又はE7抗原をシリンジで皮内注射することにより行なうことができる。従って、本診断キットは1個以上のアンプル、シリンジ及びカニューレを含むことになる。本発明では、皮膚試験に特に適合したアプリケーターを使用することも可能であり、それが好ましく、例えばSero-Merieuxのマルチ試験"SERO"試験スタンプ（上記参照）又はTINE試験用のスタンプが挙げられる。従って、本発明の診断キットは抗原（類）の入ったアンプル及び／又はアプリケーターを含んでいてもよい。
【００２６】
上記の実施例では、本発明の皮膚試験の方法をHPV16-E7について述べた。しかしながら、E6を用いることもできる。他のHPVタイプのE6及び／又はE7を使用する皮膚試験を用いてこれらの株についての免疫学的応答を検出することも可能である。種々のHPVタイプの類縁関係が近いために、種々のHPVタイプ間の交差反応を利用して種々のHPVタイプに対して同時に行なえる、より万能な皮膚試験を提供することも最終的には可能である。
【００２７】
免疫反応が目に見えるようにするために使用すべき抗原の量はさまざまな要因に依存する。そこで、本発明では抗原量は、1回使用ごとに0.01から10μgの間、好ましくは0.05から5μgの間の範囲とすることができる。この場合、診断キット用の抗原溶液を調製する際に、その溶液の一部のみが皮内領域に入るのであって、他の一部は被験者の皮膚上で失われたり溶液アンプル中に残ったままとなりうることを考慮しなければならない。
【００２８】
【配列表】
Claims (10)
- ヒトパピローマウイルスタイプの腫瘍蛋白E6及び／又はE7に対する免疫反応を検出するための皮膚試験診断キットであって、有効量の腫瘍蛋白E6及び／若しくはE7、並びに／又はヒトパピローマウイルスタイプのE6及び／若しくはE7の少なくとも免疫学的に有効な部分を含む診断キット。
- 含まれる腫瘍蛋白部分がHPV16に由来するものであることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の診断キット。
- ヒトパピローマウイルスタイプの免疫学的に有効な部分が少なくとも1個の合成ペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第１項又は第２項に記載の診断キット。
- 含まれる腫瘍蛋白E7又はその免疫学的に有効な部分がHPV16に由来するものであることを特徴とする、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の診断キット。
- 含まれる腫瘍蛋白又はその免疫学上に有効な部分が溶媒に溶解していることを特徴とする、請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の診断キット。
- 溶媒が７０％グリセリンであることを特徴とする、請求の範囲第５項に記載の診断キット。
- 腫瘍蛋白の量又は免疫学上に有効な部分の量が、一回の使用量当たり0.01から10μgであることを特徴とする、請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の診断キット。
- 診断キットが有効量の腫瘍蛋白又はその免疫学的に有効な部分を皮内注射することができるアプリケーターをさらに含むことを特徴とする、請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の診断キット。
- アプリケーターがシリンジであることを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の診断キット。
- アプリケーターが、試験スタンプであることを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の診断キット。
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