JP4260244B2 - Bacterial cell concentration reagent - Google Patents

Description

ハイドロキシアパタイトは、陽イオン交換、陰イオン交換の両方の性質を持つイオン担体である。ところで、微生物表面のアミノ基などの塩基性基は、ハイドロキシアパタイト表面の負の電荷を帯びたリン酸イオンと吸着し、また微生物表面のカルボキシル基などの酸性基は、ハイドロキシアパタイト表面の正の電荷を帯びたカルシウムイオンと吸着することによって、幅広い種類の微生物の吸着が可能である。また、これらの吸着はイオンの電荷による吸着のため、単なる物理吸着より吸着強度が高いという吸着特性を有する。
【００１５】
しかしながら、微生物との吸着は吸着剤の固体表面でのみ起こる反応であるため、吸着剤の表面積により吸着できる微生物の量は制限されてしまう。吸着容量を向上させるためには吸着剤の表面積を増やすことが必要であり、多孔質化あるいは三次元に架橋した網目構造化などの努力が行われているが限界がある。また、これらの特殊な形態を作るためには特殊な製造技術が必要であり、製造経費の増大を招くことから、結果として高価なものになってしまっている。これらの点は、吸着剤を用いた微生物菌体の濃縮法の共通の課題でもある。
【００１６】
そこで本発明は、上記した従来の菌体濃縮技術の問題点を解決し、結核菌等の抗酸菌を簡単な手段で効率よく濃縮するための菌体濃縮試薬を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
前記した課題を解決するための本発明の菌体濃縮試薬は、水難溶性物質を生成するオキソ酸イオンと陽イオンとを別体にて組み合わせてなるものであり、抗酸菌菌体を濃縮するために使用される。
本発明の菌体濃縮試薬は、前記構成において、さらに、脂肪酸塩を含んでもよい。該脂肪酸塩には、オレイン酸ナトリウム及びオレイン酸カリウムから選ばれた１種以上の塩であることが好ましい。
さらに別の態様の本発明の菌体濃縮試薬は、水難溶性物質を生成するオキソ酸イオンと、陽イオンと、溶解剤を各々別体にて組み合わせてなるものであり、抗酸菌菌体を濃縮するために使用される。
本発明の菌体濃縮試薬を用いる菌体濃縮方法は、抗酸菌菌体が含まれる水性媒体に対して、陰イオンと陽イオンを同時に存在させて水難溶性物質を生成しながら、生成した水難溶性物質に抗酸菌菌体を吸着させる工程を含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明の菌体濃縮試薬を用いる別の態様の抗酸菌菌体の濃縮方法は、抗酸菌菌体が含まれる水性媒体に対して、陰イオンと陽イオンを同時に存在させて水難溶性物質を生成しながら、生成した水難溶性物質に抗酸菌菌体を吸着させる工程、及び抗酸菌菌体が吸着している水難溶性物質を回収する工程を含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明の菌体濃縮試薬を用いるさらに別の態様の抗酸菌菌体の濃縮方法は、抗酸菌菌体が含まれる水性媒体に対して、陰イオンと陽イオンを同時に存在させて水難溶性物質を生成しながら、生成した水難溶性物質に抗酸菌菌体を吸着させる工程、抗酸菌菌体が吸着している水難溶性物質を回収する工程、及び該水難溶性物質を溶解剤により溶解する工程を含むことを特徴とする。前記溶解剤には好ましくは酸が使用できる。
【００２２】
本発明の菌体濃縮試薬において、前記オキソ酸イオンは、リン酸イオン（ＰＯ₄ ^3-）、ケイ酸イオン（ＳｉＯ₄ ^4-）、炭酸イオン（ＣＯ₃ ^2-）、硫酸イオン（ＳＯ₄ ^2-）及びホウ酸イオン（ＢＯ₃ ^3-）から選ばれた１種類以上が使用できる。前記オキソ酸イオンは、それぞれリン（Ｐ）、ケイ素（Ｓｉ）、炭素（Ｃ）、イオウ（Ｓ）、ホウ素（Ｂ）のオキソ酸である。
【００２３】
オキソ酸とは、無機酸のうち中央原子に結合している原子がすべて酸素であって、水溶液中で酸の性質を示すものの総称である。オキソ酸には、上記の他に硝酸、塩素酸、ひ酸、ヨウ素酸、アンチモン酸などがあるが、アルカリ土類金属との間に水難溶性物質を形成しずらいので、好適ではない。オキソ酸イオンの供給源としては特に制限はないが、カリウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩などの水溶性の塩及び溶液があげられる。
【００２４】
本発明の菌体濃縮試薬において、前記陽イオンは、マグネシウムイオン（Ｍｇ²⁺）、カルシウムイオン（Ｃａ²⁺）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ²⁺）及びバリウムイオン（Ｂａ²⁺）から選ばれたアルカリ土類金属イオンが使用できる。アルカリ土類金属イオンの供給源としては特に制限はないが、塩化物、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、グルコン酸塩などの水溶性の塩及び溶液があげられる。
【００２５】
本明細書で「イオンを存在させる」とは、添加等の積極的な手段により、水性媒体中に陽イオンと陰イオンの両イオンを加えることを意味する。
【００２６】
上記のオキソ酸イオンとアルカリ土類金属イオンの組み合わせにより生ずる塩の水に対する溶解性について確認した結果を下記の表１に示す。表１においては、水に対する溶解度の異なる様々な組成の塩の中に難溶性の塩がある場合を、不溶と評価した。
【００２７】
【表１】

【００２８】
表１によれば、硫酸イオンとマグネシウムイオンの組み合わせ以外のオキソ酸イオンとアルカリ土類金属イオンの組み合わせは、水に難溶性の塩をつくる。
【００２９】
本発明において水に不溶性の塩の形態は、水にもやもやとした懸濁した状態から、大きな粒子を形成して沈殿した状態のものである。しかしながら、水に懸濁していても時間の経過と共に沈殿物が形成される。
【００３０】
１種類のオキソ酸イオンと１種類のアルカリ土類金属イオンの混合においても、ｐＨ、温度、濃度などの条件により水に対する溶解度の異なる様々な組成の塩を作る可能性がある。
【００３１】
水難溶性物質を生成するオキソ酸イオンとアルカリ土類金属を混合し生成させた、水に難溶性のアルカリ土類金属のオキソ酸塩は、リン酸カルシウム系化合物であるハイドロキシアパタイトと同様に抗酸菌を吸着することができる。しかしながら、従来のハイドロキシアパタイトを用いた吸着方法とは異なり、目的とする抗酸菌の存在する場（水溶液中）で、水に難溶性のアルカリ土類金属塩のオキソ酸塩を生成させることによって下記の１）〜３）の効果が生ずる。
【００３２】
１）本発明の菌体濃縮試薬によれば、抗酸菌の表面上で水に難溶性のアルカリ土類金属のオキソ酸塩が生成するために、吸着効率が良い。その結果、目的とする抗酸菌の回収率が向上する。
【００３３】
これは、イオンから担体を生成させること、また担体の生成と同時に抗酸菌の吸着が起こるために、抗酸菌を吸着する時の担体の大きさが極限的に小さく広大な表面積を得ることができ、その結果吸着容量が向上したものと理解される。また、抗酸菌の表面構造の凹凸に入り込んで担体の生成が起こるため、従来の粒状担体が吸着部位として使用できない凹内部の負あるいは正に帯電した部位をも吸着部位として利用できるためと理解される。
【００３４】
２）本発明の菌体濃縮試薬によれば、既に製品化された吸着担体を利用するのではなく、自らアルカリ土類金属イオンとオキソ酸イオンから吸着担体を作成するため、吸着担体の製造コストを削減できる。したがって、安価に抗酸菌の吸着分離を行うことができる。
【００３５】
３）本発明の菌体濃縮試薬によれば、穏和な吸着、分離条件で抗酸菌を吸着、分離することができるので、活性を保持した生菌の状態で目的とする抗酸菌を、分離回収することが可能である。しかしながら、この特徴点は、本発明において、分離回収する抗酸菌を生菌あるいは死菌に制限するものではない。
【００３６】
本発明の菌体濃縮試薬を用いた菌体濃縮法において、オキソ酸イオンと陽イオンとの好ましい組み合わせの本発明の態様は、抗酸菌菌体が含まれる水性媒体に対して、オキソ酸イオンとしてリン酸イオンを選択し、これとアルカリ土類金属イオンを存在させて水難溶性物質を生成しながら、生成した水難溶性物質に抗酸菌菌体を吸着させる工程を含む菌体濃縮方法である。このような、リン酸イオンとアルカリ土類金属イオンを組み合わせた場合には、抗酸菌を吸着させたアルカリ土類金属のリン酸塩を溶解させることによって、培養による分離検出法、生化学的試験による検出法、あるいは核酸の検出などに簡便に供試することが可能になる。
【００３７】
通常、水に難溶性であるアルカリ土類金属のリン酸塩は、ｐＨを酸性にすることによって水に対する溶解性が急激に増加する。この現象を利用して抗酸菌を吸着させたアルカリ土類金属のリン酸塩を、通常の分離技術、例えばろ過、自然沈降分離、遠心沈降分離などにより回収し、これに酸を添加しアルカリ土類金属のリン酸塩を溶解する。溶解に用いる酸には、特に制限はなく、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、ギ酸、コハク酸、クエン酸およびこれらの塩が用いられる。
【００３８】
オキソ酸イオンとしてリン酸イオンを、アルカリ土類金属イオンとしてカルシウムイオンを用いる場合、リン酸カルシウム塩の生成と抗酸菌の吸着は下記のｐＨ、及びイオン濃度の条件下で行われることが望まれる。
【００３９】
ｐＨ：
ｐＨの下限について、リン酸イオンとカルシウムイオンの混合により水に難溶性のリン酸カルシウム塩を生成させるためには、ｐＨは５以上とすることが好ましく、さらに好ましくは６以上である。ｐＨが５未満であるとリン酸カルシウムゲルの水に対する溶解度が増加し好ましくないからである。
【００４０】
ｐＨの上限について、抗酸菌の種類によって大きく異なるため特定できない。通常、生菌を対象とする場合には、抗酸菌に対して殺菌効果を示さない範囲のｐＨが好ましい。
【００４１】
濃度：
抗酸菌菌体を生菌として濃縮し取得する目的のためには、菌体濃縮プロセスにおけるリン酸イオンの最終濃度は、好ましくは０．００１Ｍ〜０．２５Ｍ、さらに好ましくは０．００５Ｍ〜０．１Ｍであり、また、同様にカルシウムイオンの最終濃度は、好ましくは０．５ｍＭ〜５０ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ〜２５ｍＭである。リン酸イオンとカルシウムイオンの当量比は、カルシウムイオン１当量に対してリン酸イオンが、好ましくは０．０５〜２５当量、さらに好ましくは０．１〜１０当量である。
【００４２】
以上に述べた本発明の菌体濃縮試薬が適用される抗酸菌には、例えば、結核菌等の抗酸菌が好ましく適用できる。
【００４３】
抗酸菌菌体に本発明の菌体濃縮試薬を適用するに際して、抗酸菌菌体が含まれる水性媒体に対して、リン酸イオン、アルカリ土類金属イオン、脂肪酸塩を同時に存在させて水難溶性物質を生成しながら、生成した水難溶性物質に抗酸菌菌体を吸着させる工程を含む菌体濃縮方法が好ましい。該脂肪酸塩には、オレイン酸ナトリウム及びオレイン酸カリウムから選ばれた１種以上の塩が好ましく適用できる。
【００４４】
脂肪酸の添加は、細胞表面の疎水性が大きい抗酸菌を濃縮する場合、水難溶性物質への抗酸菌菌体の吸着効率を向上させる。この吸着率向上は次のような理由と考えられる。即ち、脂肪酸塩は、疎水基と親水基の両方を分子内に持つ界面活性剤の１種であり、親水基は水溶液中でイオン化し、負の電荷を示す。したがって、抗酸菌菌体が含まれる試験液中において、オキソ酸イオン、アルカリ土類金属イオンとともに添加された脂肪酸塩は、一方では、疎水性の大きな細胞表面を持つ抗酸菌菌体に対して脂肪酸塩の疎水基は疎水性相互作用により吸着するとともに、他方では、アルカリ土類金属イオンに対して脂肪酸塩の親水基を結合させることによって、水難溶性物質であるアルカリ土類金属のオキソ酸塩と疎水性の大きな細胞表面を持つ抗酸菌菌体との吸着を補助するためと理解される。
【００４５】
このような抗酸菌の細胞表面は疎水性が大きく、例えば、ヒトに肺結核を発症させるヒト型結核菌が挙げられる。
【００４６】
ヒト型結核菌が含まれる検体を試験液として調製する場合には、検体をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ溶液などの前処理液で調製することができる。
【００４７】
本発明の菌体濃縮試薬は、医薬品工業、診断や治療分野、食品工業等における抗酸菌菌体を濃縮、分離取得するため、特に、臨床検査分野、環境検査分野、食品検査分野、及びその他の微生物検査分野における試験液からの抗酸菌菌体を分離取得するために有用である。
【００４８】
【実施例】
〔実施例１〕
供試菌株としてEscherichia coli(ATCC l1775)（一般名：大腸菌）、Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853)（一般名：緑膿菌）、Staphylococcus aureus(ATCC 25923) （一般名：黄色ブドウ球菌）、Mycobacterium smegmatis(ATCC 14468) 、Candida albicans(ATCC 18804)をそれぞれ１０⁶ 個／ｍｌに調整した菌液０．４ｍｌに、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍｌおよび０．５Ｍ塩化カルシウム溶液０．３５ｍｌを添加し、十分に撹拌した。これを一定時間静置し、 生成したカルシウムゲルを沈殿させた後、 上澄み液中の菌数を測定した。
【００４９】
次にリン酸カルシウムゲルを回収し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍｌで２回洗浄した。洗浄後、回収したリン酸カルシウムゲルを液体培地に接種し、微生物が発育するまでの時間を測定した。なお、比較として洗浄操作を省いた試験も行った。初発菌数は、菌液にリン酸緩衝液を添加した後, 測定した。 初発菌数と上澄み液中の菌数との結果を下記の表２に示し、発育検出時間を下記の表３に示す。
【００５０】
【表２】

【００５１】
【表３】

【００５２】
表２によれば、供試したすべての微生物が沈殿してカルシウムゲルに移行したことが分かる。
【００５３】
表３によれば、リン酸カルシウムゲルを添加した液体培地において菌の発育が認められたことから、微生物は生きた状態でリン酸カルシウムゲルに吸着されたことがわかる。 また、 洗浄したリン酸カルシウムゲルを添加した液体培地でも同様の発育が認められたことから、 リン酸カルシウムゲルと微生物の吸着は強固なものであると考えられる。この結果から本発明の方法は、液体中の微生物の濃縮および回収に有効であることが分かる。
【００５４】
〔実施例２〕
供試菌株としてStaphylococcus aureus(ATCC 25923) （一般名：黄色ブドウ球菌）及びMycobacterium smegmatis(ATCC 14468) をそれぞれ１０⁶ 個／ｍｌに調整した菌液０．１ｍｌに対して、それぞれリン酸イオン、ケイ酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、ホウ酸イオン溶液（５ｍＭ）５．０ｍｌと、下記の陽イオン溶液（０．１Ｍ）０．５ｍｌを添加し, 十分に撹拌した。これを一定時間静置し、 生成したゲルを沈殿させた後、 上澄み液中の菌数を測定した。 初発菌数は、 菌液に陰イオン溶液を添加した後、 測定した。
【００５５】
陰イオンとしては、リン酸イオンＰＯ₄ ^3- 、ケイ酸イオンＳｉＯ₄ ^4- 、炭酸イオンＣＯ₃ ^2- 、硫酸イオンＳＯ₄ ^2- 及びホウ酸イオンＢＯ₃ ^3- から選ばれたものを使用し、陽イオンとしては、マグネシウムイオンＭｇ²⁺、カルシウムイオンＣａ²⁺、ストロンチウムイオンＳｒ²⁺及びバリウムイオンＢａ²⁺から選ばれたものを使用し、下記表４に示す陰イオンと陽イオンの組み合わせで（○印の組み合わせ）実施した。
【００５６】
【表４】

【００５７】
その結果をStaphylococcus aureus(ATCC 25923) については下記の表５に、Mycobacterium smegmatis(ATCC 14468) については下記の表６に示す。
【００５８】
【表５】

【００５９】
【表６】

【００６０】
表５及び表６によれば、リン酸カルシウムゲルだけでなく, 上記イオンの混合により生じたゲルによっても、微生物菌体が吸着されることが分かる。
【００６１】
〔実施例３〕
供試菌株としてEscherichia coli(ATCC l1775)（一般名：大腸菌）、Klebsiella pneumoniae(ATCC 13883) 、Staphylococcus aureus(ATCC 25923) （一般名：黄色ブドウ球菌）、Mycobacterium smegmatis(ATCC 14468) 、Candida albicans(ATCC 18804)を用い、本発明によるリン酸カルシウムゲルによる吸着と、比較のために従来のハイドロキシアパタイトによる吸着を下記のように行った。
（１）リン酸カルシウムゲルによる吸着
上記各微生物をそれぞれ１０⁶ 個／ｍｌに調整した菌液０．１ｍｌに、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５．０ｍｌを添加した。これに０．５Ｍ塩化カルシウム溶液を最終濃度が０．０４％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）になるように添加し、十分に撹拌した。これを一定時間静置し、生成したリン酸カルシウムゲルを沈殿させた後, 上澄み液中の菌数を測定した。
【００６２】
初発菌数は、菌液にリン酸緩衝液を添加した後、測定した。
（２）ハイドロキシアパタイトによる吸着
上記各微生物をそれぞれ１０⁶ 個／ｍｌに調整した菌液０．１ｍｌに、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５．０ｍｌを添加した。これに５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（生化学工業社製) をリン酸緩衝液添加後の微生物懸濁液に対して、 ０．２％（ｗ／ｖ）、１．０％（ｗ／ｖ）、５．０％（ｗ／ｖ）になるように添加し、十分に撹拌した。これを一定時間静置し、 ハイドロキシアパタイトを沈殿させた後、上澄み液中の菌数を測定した。
【００６３】
初発菌数は、菌液にリン酸緩衝液を添加した後、 測定した。
【００６４】
微生物のリン酸カルシウムゲルおよびハイドロキシアパタイトに対する吸着率は、次の数式によって求めた。
【００６５】
【数１】

【００６６】
その結果を下記の表７に示す。
【００６７】
【表７】

【００６８】
表７によれば、生成させた本実施例３のリン酸カルシウムゲルを用いた微生物菌体の吸着法は、 固形担体であるハイドロキシアバタイトを用いた方法に比べ、 吸着効率が良いことがわかる。
【００６９】
〔実施例４〕
供試菌株として抗酸菌群であるMycobacterium tuberculosis(ATCC 25177)( 一般名: 人型結核菌）、Mycobacterium intracellulare(ATCC 13950)、Mycobacterium fortuitum(ATCC 6481)をそれぞれ１０⁶ 個／ｍｌに調整した菌液０．０５ｍｌに、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５．０ｍｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）オレイン酸ナトリウム溶液０．５ｍｌ、および０．１Ｍ塩化カルシウム溶液０．５ｍｌを添加し、 十分に撹拌した。 これを一定時間静置し、生成したゲルを沈殿させた後、 上澄み液中の菌数を測定した。
【００７０】
比較のために、 オレイン酸ナトリウム無添加の系における試験も行った。 また、 初発菌数は、 菌液にリン酸緩衝液を添加した後、 同様に測定した。
【００７１】
抗酸菌群のリン酸カルシウムゲルおよびハイドロキシアバタイトに対する吸着率は、 前記数式によって求めた。
【００７２】
各供試菌株についての測定結果を下記の表８、表９、表１０に示す。
【００７３】
【表８】

【００７４】
【表９】

【００７５】
【表１０】

【００７６】
表８、表９、表１０によれば、オレイン酸ナトリウムを添加することによって、結核菌を含む抗酸菌群の吸着率が向上したことが分かる。
【００７７】
〔実施例５〕
供試菌株として抗酸菌群であるMycobacterium tuberculosis(ATCC 25177)( 一般名: 人型結核菌）、Mycobacterium intracellulare(ATCC 13950)、Mycobacterium fortuitum(ATCC 6481)をそれぞれ１０⁶ 個／ｍｌに調整した菌液０．０５ｍｌに, ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５．０ｍｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）オレイン酸ナトリウム溶液０．５ｍｌ、および０．１Ｍ塩化カルシウム溶液０．５ｍｌを添加し、 十分に撹拌した。 これを一定時間静置し、生成したゲルを沈殿させた後、 ゲルを回収した。このゲルを液体培地に接種し、抗酸菌群が発育するまでの時間を測定した。各供試菌株についての測定結果を下記の表１１に示す。
【００７８】
【表１１】

【００７９】
表１１によれば、回収したゲルを添加した液体培地において菌の発育が認められたことから、 抗酸菌群は生きた状態でゲルに吸着されたことが分かる。この結果から本発明の菌体濃縮方法は、液体中の微生物の濃縮および回収に有効であることが分かる。
【００８０】
【発明の効果】
本発明の菌体濃縮試薬によれば、抗酸菌菌体が含まれる水性媒体に対して、水難溶性物質を生成するオキソ酸イオンと陽イオンを存在させて抗酸菌菌体の表面上で水難溶性物質を生成させ、抗酸菌菌体を吸着させているので、抗酸菌菌体の吸着効率が良い。その結果、目的とする抗酸菌菌体の回収率が向上する。
【００８１】
本発明の菌体濃縮試薬によれば、既に製品化された吸着担体を利用するのではなく、菌体濃縮プロセスにおいて、水難溶性物質を生成するオキソ酸イオンと陽イオンから吸着担体を作成するため、吸着担体の製造コストを削減できる。したがって、安価に抗酸菌菌体の吸着分離を行うことができる。
【００８２】
本発明の菌体濃縮試薬によれば、穏和な吸着、分離条件で抗酸菌菌体を吸着、分離することができるので、活性を保持した生菌の状態で目的とする抗酸菌菌体を、分離回収することが可能である。
【００８３】
リン酸カルシウムゲルを用いた場合の本発明の菌体濃縮試薬によれば、固形担体であるハイドロキシアパタイトを用いた方法に比べ、吸着効率が良い。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a microbial cell concentration reagent and a microbial cell concentration method for concentrating microbial cells such as bacteria, yeast, and viruses in the pharmaceutical industry, diagnosis and treatment fields, food industry, and the like. The present invention also relates to a bacterial cell concentration reagent and a bacterial cell concentration method for separating and acquiring microorganisms from test solutions in the clinical test field, environmental test field, food test field, and other microbiological test fields. Furthermore, the present invention relates to a bacterial cell concentration reagent and a bacterial cell concentration method suitable for Mycobacterium tuberculosis.
[0002]
[Prior art]
Concentration of microbial cells such as bacteria, yeast, and viruses is useful for information on acquired microbial cells, specifically, diagnosis and treatment for pathogenic microorganisms or useful microorganisms. It is an important means for obtaining information on properties etc., etc., and in the case of useful microorganisms, in order to separate and remove the concentrated microbial cells to obtain useful components in the supernatant, or It is also an important means for obtaining concentrated useful cells.
[0003]
On the other hand, in the conventional microbial tests in the clinical test field, the environmental test field, the food test field, etc., in order to confirm the presence of microorganisms in the test solution, a separation detection method by culture, a detection method by biochemical test, or a nucleic acid Detection is performed. In these tests, the amount of test solution varies from a small amount to a large amount, but the amount of solution usually used for each inspection is extremely small, and only a part of the test solution is collected and inspected. Not too much.
[0004]
For this reason, centrifugation and filtration using organic polymer fiber filters such as cellulose, nylon, and polyester have long been used to concentrate microbial cells from the test solution. A simple cell concentration means alone is inefficient.
[0005]
In recent years, microbial adsorbents have attracted attention in order to efficiently concentrate microbial cells. Known microbial adsorbents include porous granular materials such as activated carbon, silica gel and zeolite, ion exchange resins based on synthetic polymers or natural polymers such as cellulose, chitosan, and hydroxyapatite. For example, in Japanese Patent Laid-Open Nos. 9-136030 and 9-169794, an aqueous medium containing microbial cells is contacted with a solid adsorbent such as hydroxyapatite, and the microbial cells or microbial cells are adsorbed by adsorption. Concentration and removal of the contained protein was performed.
[0006]
  Next, focusing on specific microorganisms, other common bacteria are included in the sputum of tuberculosis patients in addition to the target tuberculosis bacteria. In the examination of tuberculosis bacteria, it is important to remove these general bacteria and concentrate them so that only the tuberculosis bacteria survive. In recent years, the N-acetyl-L-cysteine method (NALC method as an abbreviation) is known as a method for separating Mycobacterium tuberculosis.HaveThe N-acetyl-L-cysteine (abbreviated as NALC) is also known as a soot dissolving agent for salmon, and it dissolves salmon mucus by combining NALC and alkaline solution (sodium hydroxide aqueous solution). At the same time, there is a method for killing other bacteria by suppressing the death of M. tuberculosis. It is based on the fact that Mycobacterium tuberculosis is resistant to alkalis and other general bacteria cannot survive on the alkali side. However, the test solution containing M. tuberculosis treated as described above cannot be directly inoculated into the medium because of its strong alkalinity. For this reason, usually, a test solution containing a strongly alkaline tuberculosis bacterium is diluted with a large amount of phosphate buffer to neutralize the pH, and then concentrated by centrifugation using a centrifuge. Mycobacterium tuberculosis is collected as sediment. By adding a phosphate buffer to the resulting sediment and resuspending the sediment, genetic testing, staining / microscopic observation, inoculation to a liquid medium, inoculation to a solid medium, and the like are performed.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, the conventional cell concentration means has the following problems.
[0008]
When concentrating microbial cells by centrifugation, the problem of requiring high centrifugal force to settle microscopic microbial cells by centrifugal force, the problem of requiring processing time, In the case of sex microorganisms, there is a problem that the apparatus becomes large in order to prevent biohazard.
[0009]
The technology for concentrating and separating microbial cells by filtration using an organic polymer fiber filter is merely for selecting a substance having a physical size based on the pore size of the filter, and specifically selecting microorganisms. There was a problem that it was not a thing.
[0010]
When a porous granular material is used as the microbial cell concentration means as the adsorbent, the principle of concentration is physical adsorption by capillary action that occurs in fine gaps. Therefore, since the target microorganisms are separated by taking them into the pores of the porous granular material, there is a problem that microorganisms larger than the pore diameter are not adsorbed. Moreover, since this adsorption | suction is physical adsorption | suction, there existed a problem that adsorption power was weak.
[0011]
When an ion exchange resin is used as the microbial cell concentration means as the adsorbent, the principle of concentration is that the ion exchange group is bonded to a polymer substrate having a three-dimensionally crosslinked network structure. Therefore, in an aqueous solution, the negatively charged microorganism is adsorbed by an anion exchange reaction. However, since the adsorption force in this case depends on the intensity of the negative charge on the surface of the microorganism, it exhibits a strong adsorption characteristic only for a specific microorganism and is not a universal method.
[0012]
When the chitosan is used as an adsorbent for the cell concentration means, the principle of concentration is that the positively charged amino group of chitosan binds to the surface of the microorganism. Chitosan is a basic polysaccharide in which the acetyl group is removed from chitin, which is abundant in shellfish such as shrimp and crab, and insects. Although it is inexpensive because it uses shrimp and crab shells that have been discarded in the past, it is not useful for the purpose of obtaining and separating microorganisms in order to exhibit antibacterial properties that suppress the growth of microorganisms.
[0013]
Hydroxyapatite as the adsorbent is a calcium phosphate-based compound, and its production method is one extracted from natural materials, synthesized by a wet method, hydrothermal method, etc., and further synthesized crystals are calcined at high temperature. It is a compound represented by the composition formula of the following formula (1).
[0014]
[Chemical 1]

Hydroxyapatite is an ion carrier having both cation exchange and anion exchange properties. By the way, basic groups such as amino groups on the microorganism surface adsorb negatively charged phosphate ions on the hydroxyapatite surface, and acidic groups such as carboxyl groups on the microorganism surface are positive charges on the hydroxyapatite surface. Adsorption of a wide variety of microorganisms is possible by adsorbing with calcium ions. Moreover, since these adsorption | suction is adsorption | suction by the charge of ion, it has the adsorption | suction characteristic that adsorption | suction intensity | strength is higher than mere physical adsorption.
[0015]
However, since adsorption with microorganisms is a reaction that occurs only on the solid surface of the adsorbent, the amount of microorganisms that can be adsorbed is limited by the surface area of the adsorbent. In order to improve the adsorption capacity, it is necessary to increase the surface area of the adsorbent, and efforts such as making it porous or forming a network structure that is three-dimensionally cross-linked are limited. Moreover, in order to produce these special forms, a special manufacturing technique is required, which causes an increase in manufacturing costs, and as a result, has become expensive. These points are also common problems in the method of concentrating microbial cells using an adsorbent.
[0016]
  Therefore, the present inventionSolve the above-mentioned problems of conventional bacterial cell concentration technology, and acid-fast bacteria such as Mycobacterium tuberculosisConcentrate efficiently with simple meansRutaIt aims at providing the microbial cell concentration reagent for this.
[0019]
[Means for Solving the Problems]
  The bacterial cell concentration reagent of the present invention for solving the aforementioned problems isProduces poorly water-soluble substancesIt is a combination of oxoacid ion and cation separately and is used to concentrate mycobacterial cells.
  The bacterial cell concentration reagent of the present invention may further include a fatty acid salt in the above configuration. The fatty acid salt is preferably at least one salt selected from sodium oleate and potassium oleate.
  In still another aspect, the bacterial cell concentration reagent of the present invention comprises:Produces poorly water-soluble substancesAn oxoacid ion, a cation, and a solubilizing agent are separately combined, and are used for concentrating mycobacteria cells.
  The bacterial cell concentration method using the bacterial cell concentration reagent of the present invention is the method of producing a water-soluble substance while producing a poorly water-soluble substance in the presence of an anion and a cation simultaneously in an aqueous medium containing acid-fast bacterial cells. It includes a step of adsorbing acid-fast bacilli on soluble substances.
[0020]
  Another embodiment of the acid-fast bacterium using the bacterial cell concentration reagent of the present inventionThe method for concentrating cells isMycobacteriaIn an aqueous medium containing bacterial cells, an anion and a cation are simultaneously present to produce a poorly water-soluble substance.MycobacteriaA step of adsorbing bacterial cells, andMycobacteriaIt includes a step of recovering a poorly water-soluble substance adsorbed by bacterial cells.
[0021]
  Another embodiment of the acid-fast bacterium using the microbial cell concentration reagent of the present inventionThe method for concentrating cells isMycobacteriaIn an aqueous medium containing bacterial cells, an anion and a cation are simultaneously present to produce a poorly water-soluble substance.MycobacteriaA process of adsorbing bacterial cells,MycobacteriaIt includes a step of recovering a poorly water-soluble substance adsorbed by bacterial cells, and a step of dissolving the poorly water-soluble substance with a solubilizer. An acid can be preferably used as the solubilizer.
[0022]
  Of the present inventionIn the bacterial cell concentration reagent,Oxo acidIon is phosphate ion (PO_Four ^3-), Silicate ions (SiO_Four ^Four-), Carbonate ion (CO_Three ^2-), Sulfate ion (SO_Four ^2-) And borate ion (BO)_Three ^3-1 type or more selected fromAbove isCan be used. The oxo acid ions are phosphorus (P), silicon (Si), carbon (C), sulfur (S) and boron (B) oxo acids, respectively.
[0023]
Oxo acid is a general term for inorganic acids that show oxygen properties in an aqueous solution in which all atoms bonded to the central atom are oxygen. In addition to the above, oxoacids include nitric acid, chloric acid, arsenic acid, iodic acid, antimonic acid, etc., but are not suitable because they hardly form a water-insoluble substance with alkaline earth metals. The source of the oxo acid ion is not particularly limited, and examples thereof include water-soluble salts and solutions such as potassium salts, sodium salts, and ammonium salts.
[0024]
  The present inventionFungusIn the body concentration reagent, the cation is magnesium ion (Mg).²⁺), Calcium ion (Ca²⁺), Strontium ions (Sr²⁺) And barium ions (Ba²⁺Alkaline earth metal ions selected from The source of alkaline earth metal ions is not particularly limited, and examples thereof include water-soluble salts and solutions such as chlorides, nitrates, sulfates, acetates, and gluconates.
[0025]
In the present specification, “the presence of ions” means that both positive ions and negative ions are added to the aqueous medium by aggressive means such as addition.
[0026]
The results of confirming the solubility of the salt produced by the combination of the oxo acid ion and the alkaline earth metal ion in water are shown in Table 1 below. In Table 1, the case where there were hardly soluble salts among the salts having various compositions having different solubility in water was evaluated as insoluble.
[0027]
[Table 1]

[0028]
According to Table 1, combinations of oxo acid ions and alkaline earth metal ions other than the combination of sulfate ions and magnesium ions form salts that are sparingly soluble in water.
[0029]
In the present invention, the form of a salt that is insoluble in water is a state in which large particles are formed and precipitated from a suspended state in water. However, even when suspended in water, a precipitate is formed over time.
[0030]
Even when one kind of oxo acid ion and one kind of alkaline earth metal ion are mixed, salts having various compositions having different solubility in water may be produced depending on conditions such as pH, temperature, and concentration.
[0031]
  Produces poorly water-soluble substancesThe water-insoluble alkaline earth metal oxoacid salt formed by mixing oxoacid ions and alkaline earth metal can adsorb acid-fast bacteria in the same manner as hydroxyapatite, which is a calcium phosphate compound. However, unlike the conventional adsorption method using hydroxyapatite, by generating an oxoacid salt of an alkaline earth metal salt that is sparingly soluble in water in the presence of the desired acid-fast bacterium (in an aqueous solution). The following effects 1) to 3) occur.
[0032]
  1) The present inventionFungusAccording to the body concentration reagent,MycobacteriaSince an alkaline earth metal oxoacid salt hardly soluble in water is formed on the surface of the metal, the adsorption efficiency is good. As a result, aimMycobacteriaThe recovery rate is improved.
[0033]
  This is because the carrier is generated from the ions and at the same time the carrier is generated.MycobacteriaFor the adsorption ofMycobacteriaIt can be understood that the size of the carrier when adsorbing the water is extremely small and a large surface area can be obtained, and as a result, the adsorption capacity is improved. Also,MycobacteriaIt is understood that a negatively or positively charged portion inside a recess where a conventional granular carrier cannot be used as an adsorption site can be used as an adsorption site.
[0034]
  2) The present inventionFungusAccording to the body concentration reagent, the production cost of the adsorption carrier can be reduced because the adsorption carrier is created from the alkaline earth metal ion and the oxo acid ion itself instead of using the already produced adsorption carrier. Therefore, inexpensivelyMycobacteriaCan be adsorbed and separated.
[0035]
  3) The present inventionFungusAccording to the body concentration reagent, under mild adsorption and separation conditionsMycobacteriaCan be adsorbed and separated, so it can be used as a viable microorganism that retains its activity.MycobacteriaCan be separated and recovered. However, this feature is separated and recovered in the present invention.MycobacteriaIs not limited to live or dead bacteria.
[0036]
  Of the present inventionUsing bacterial cell concentration reagentIn the bacterial cell concentration method,Oxo acidEmbodiments of the present invention of preferred combinations of ions and cations include:MycobacteriaFor an aqueous medium containing bacterial cells,Oxo acidThe phosphate ion is selected as the ion, and this and the alkaline earth metal ion are present to produce the poorly water-soluble material.MycobacteriaIt is a microbial cell concentration method including the process which makes a microbial cell adsorb | suck. When combining such phosphate ions and alkaline earth metal ions,MycobacteriaBy dissolving the alkaline earth metal phosphate adsorbed with sucrose, it is possible to easily perform a separation detection method by culture, a detection method by a biochemical test, or detection of a nucleic acid.
[0037]
  Usually, alkaline earth metal phosphates that are sparingly soluble in water have a sharp increase in solubility in water by making the pH acidic. Using this phenomenonMycobacteriaThe alkaline earth metal phosphate that has adsorbed is recovered by ordinary separation techniques such as filtration, natural sedimentation separation, and centrifugal sedimentation, and then acid is added to dissolve the alkaline earth metal phosphate. To do. There is no restriction | limiting in particular in the acid used for melt | dissolution, For example, hydrochloric acid, a sulfuric acid, nitric acid, formic acid, a succinic acid, a citric acid, and these salts are used.
[0038]
  When using phosphate ions as oxoacid ions and calcium ions as alkaline earth metal ions,MycobacteriaIt is desirable that the adsorption of be carried out under the following pH and ion concentration conditions.
[0039]
pH:
Regarding the lower limit of pH, in order to produce a calcium phosphate salt that is sparingly soluble in water by mixing phosphate ions and calcium ions, the pH is preferably 5 or more, more preferably 6 or more. This is because if the pH is less than 5, the solubility of calcium phosphate gel in water increases, which is not preferable.
[0040]
  About the upper limit of pHMycobacteriaIt cannot be specified because it varies greatly depending on the type. Usually, when targeting live bacteria,MycobacteriaIn contrast, a pH in a range that does not show a bactericidal effect is preferable.
[0041]
  concentration:
  MycobacteriaFor the purpose of concentrating and obtaining cells as live cells, the final concentration of phosphate ions in the cell concentration process is preferably 0.001M to 0.25M, more preferably 0.005M to 0.1M. Similarly, the final concentration of calcium ions is preferably 0.5 mM to 50 mM, more preferably 1 mM to 25 mM. As for the equivalent ratio of phosphate ions to calcium ions, phosphate ions are preferably 0.05 to 25 equivalents, more preferably 0.1 to 10 equivalents with respect to 1 equivalent of calcium ions.
[0042]
  The present invention described aboveFungusBody concentration reagent is appliedMycobacteriaIn, ExampleFor example, acid-fast bacteria such as Mycobacterium tuberculosis can be preferably applied.
[0043]
  When applying the bacterial cell concentration reagent of the present invention to mycobacteria,MycobacteriaIn an aqueous medium containing bacterial cells, phosphate ions, alkaline earth metal ions, and fatty acid salts are simultaneously present to produce a poorly water-soluble material.MycobacteriaA bacterial cell concentration method including a step of adsorbing bacterial cells is preferable. As the fatty acid salt, one or more salts selected from sodium oleate and potassium oleate can be preferably applied.
[0044]
    Addition of fatty acid has high hydrophobicity on the cell surfaceMycobacteriaWhen concentratingMycobacteriaImprove bacterial cell adsorption efficiency. This improvement in the adsorption rate is considered as follows. That is, the fatty acid salt is one type of surfactant having both a hydrophobic group and a hydrophilic group in the molecule, and the hydrophilic group is ionized in an aqueous solution and exhibits a negative charge. Therefore,MycobacteriaFatty acid salts added with oxoacid ions and alkaline earth metal ions in a test solution containing bacterial cells, on the other hand, have a highly hydrophobic cell surfaceMycobacteriaThe hydrophobic group of the fatty acid salt is adsorbed by the hydrophobic interaction to the fungus body. On the other hand, the hydrophilic group of the fatty acid salt is bonded to the alkaline earth metal ion, so that the alkaline earth is a poorly water-soluble substance. Has metal oxoacid salt and large hydrophobic cell surfaceMycobacteriaIt is understood to assist the adsorption with the microbial cells.
[0045]
  like thisMycobacteriaCell surfaceIsHigh hydrophobicityTheFor example, HiMycobacterium tuberculosis causing pulmonary tuberculosisIs mentioned.
[0046]
When preparing a sample containing M. tuberculosis as a test solution, the sample can be prepared with a pretreatment solution such as a NALC-NaOH solution.
[0047]
  The present inventionFungusBody concentration reagents are used in the pharmaceutical industry, diagnostic and therapeutic fields, food industry, etc.Mycobacteria cellsConcentrate from the test solution in the clinical test field, environmental test field, food test field, and other microbiological test fields.Mycobacteria cellsUseful for getting separated.
[0048]
【Example】
[Example 1]
As a test strainEscherichia coli(ATCC l1775) (generic name: E. coli),Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853) (generic name: Pseudomonas aeruginosa),Staphylococcus aureus (ATCC 25923) (generic name: Staphylococcus aureus),Mycobacterium smegmatis (ATCC 14468),Candida albicans(ATCC 18804) 10 each⁶40 ml of 5 mM phosphate buffer (pH 7.0) and 0.35 ml of 0.5 M calcium chloride solution were added to 0.4 ml of the bacterial solution adjusted to the number of cells / ml, and stirred sufficiently. This was allowed to stand for a certain period of time, and after the precipitated calcium gel was precipitated, the number of bacteria in the supernatant was measured.
[0049]
Next, the calcium phosphate gel was recovered and washed twice with 40 ml of 5 mM phosphate buffer (pH 7.0). After washing, the recovered calcium phosphate gel was inoculated into a liquid medium, and the time until the microorganisms grew was measured. For comparison, a test in which the washing operation was omitted was also performed. The initial bacterial count was measured after adding a phosphate buffer to the bacterial solution. The results of the initial bacterial count and the bacterial count in the supernatant are shown in Table 2 below, and the growth detection time is shown in Table 3 below.
[0050]
[Table 2]

[0051]
[Table 3]

[0052]
According to Table 2, it can be seen that all the microorganisms tested were precipitated and transferred to a calcium gel.
[0053]
According to Table 3, since the growth of bacteria was observed in the liquid medium to which the calcium phosphate gel was added, it can be seen that the microorganisms were adsorbed to the calcium phosphate gel in a living state. In addition, since the same growth was observed in the liquid medium to which the washed calcium phosphate gel was added, the adsorption of calcium phosphate gel and microorganisms is considered to be strong. From this result, it can be seen that the method of the present invention is effective for the concentration and recovery of microorganisms in a liquid.
[0054]
[Example 2]
As a test strainStaphylococcus aureus (ATCC 25923) (generic name: Staphylococcus aureus) andMycobacterium smegmatis (ATCC 14468) each 10⁶For 0.1 ml of the bacterial solution adjusted to the number of cells / ml, phosphate ion, silicate ion, carbonate ion, sulfate ion, borate ion solution (5 mM) 5.0 ml and the following cation solution (0. 1M) 0.5 ml was added and stirred thoroughly. This was allowed to stand for a certain period of time, and the produced gel was precipitated, and then the number of bacteria in the supernatant was measured. The initial bacterial count was measured after adding an anion solution to the bacterial solution.
[0055]
Anions include phosphate ion PO_Four ^3-, Silicate ion SiO_Four ^Four-, Carbonate ion CO_Three ^2-, Sulfate ion SO_Four ^2-And borate ion BO_Three ^3-As a cation, magnesium ion Mg is used.²⁺, Calcium ion Ca²⁺Strontium ion Sr²⁺And barium ion Ba²⁺A combination of anions and cations shown in Table 4 below (combination of ◯ marks) was used.
[0056]
[Table 4]

[0057]
The resultStaphylococcus aureus (For ATCC 25923), see Table 5 below.Mycobacterium smegmatis (ATCC 14468) is shown in Table 6 below.
[0058]
[Table 5]

[0059]
[Table 6]

[0060]
According to Tables 5 and 6, it can be seen that microbial cells are adsorbed not only by the calcium phosphate gel but also by the gel produced by mixing the ions.
[0061]
Example 3
As a test strainEscherichia coli(ATCC l1775) (generic name: E. coli),Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883),Staphylococcus aureus (ATCC 25923) (generic name: Staphylococcus aureus),Mycobacterium smegmatis (ATCC 14468),Candida albicans(ATCC 18804) was used for adsorption with calcium phosphate gel according to the present invention and for comparison with conventional hydroxyapatite for comparison.
(1) Adsorption by calcium phosphate gel
10 each of the above microorganisms⁶5.0 ml of 5 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) was added to 0.1 ml of the bacterial solution adjusted to the number of cells / ml. Add 0.5M calcium chloride solution to this so that the final concentration is 0.04% (w / v), 0.1% (w / v), 0.2% (w / v) Stir. This was allowed to stand for a certain period of time, and after the precipitated calcium phosphate gel was precipitated, the number of bacteria in the supernatant was measured.
[0062]
The initial bacterial count was measured after adding a phosphate buffer to the bacterial solution.
(2) Adsorption by hydroxyapatite
10 each of the above microorganisms⁶5.0 ml of 5 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) was added to 0.1 ml of the bacterial solution adjusted to the number of cells / ml. 0.2% (w / v) of the microbial suspension after adding hydroxyapatite (Seikagaku Corporation) equilibrated with 5 mM phosphate buffer (pH 7.0) to the phosphate buffer , 1.0% (w / v), 5.0% (w / v), and stirred well. This was allowed to stand for a certain period of time to precipitate hydroxyapatite, and then the number of bacteria in the supernatant was measured.
[0063]
The initial bacterial count was measured after adding a phosphate buffer to the bacterial solution.
[0064]
The adsorption rate of microorganisms to calcium phosphate gel and hydroxyapatite was determined by the following formula.
[0065]
[Expression 1]

[0066]
The results are shown in Table 7 below.
[0067]
[Table 7]

[0068]
According to Table 7, it can be seen that the adsorption method of microbial cells using the produced calcium phosphate gel of Example 3 has better adsorption efficiency than the method using hydroxyabatite which is a solid carrier.
[0069]
Example 4
Mycobacteria group as test strainMycobacterium tuberculosis(ATCC 25177) (generic name: Mycobacterium tuberculosis),Mycobacterium intracellulare(ATCC 13950),Mycobacterium fortuitum (ATCC 6481) each 10⁶0.05 ml of a bacterial solution adjusted to 0.5 / ml, 5.0 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 ml of 0.001% (w / v) sodium oleate solution, and 0.1 M calcium chloride 0.5 ml of the solution was added and stirred well. This was allowed to stand for a certain period of time, and the produced gel was precipitated, and then the number of bacteria in the supernatant was measured.
[0070]
For comparison, a test was also conducted in a system without addition of sodium oleate. The initial bacterial count was measured in the same manner after adding phosphate buffer to the bacterial solution.
[0071]
The adsorption rate of the mycobacteria group to calcium phosphate gel and hydroxyabatite was determined by the above formula.
[0072]
The measurement results for each test strain are shown in Table 8, Table 9, and Table 10 below.
[0073]
[Table 8]

[0074]
[Table 9]

[0075]
[Table 10]

[0076]
According to Table 8, Table 9, and Table 10, it turns out that the adsorption rate of the acid-fast bacterium group containing tuberculosis bacteria improved by adding sodium oleate.
[0077]
Example 5
Mycobacteria group as test strainMycobacterium tuberculosis(ATCC 25177) (generic name: Mycobacterium tuberculosis),Mycobacterium intracellulare(ATCC 13950),Mycobacterium fortuitum (ATCC 6481) each 10⁶0.05 ml of bacterial solution adjusted to 0.5 / ml, 5.0 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 ml of 0.001% (w / v) sodium oleate solution, and 0.1 M calcium chloride 0.5 ml of the solution was added and stirred well. This was allowed to stand for a certain period of time, and the gel was collected after precipitation. This gel was inoculated into a liquid medium, and the time until the mycobacteria group developed was measured. The measurement results for each test strain are shown in Table 11 below.
[0078]
[Table 11]

[0079]
According to Table 11, since the growth of bacteria was observed in the liquid medium to which the recovered gel was added, it can be seen that the acid-fast bacteria group was adsorbed to the gel in a living state. From this result, it can be seen that the method for concentrating cells of the present invention is effective in concentrating and collecting microorganisms in a liquid.
[0080]
【The invention's effect】
  According to the bacterial cell concentration reagent of the present invention, the aqueous medium containing the acid-fast bacterial cell,Produces poorly water-soluble substancesSince the oxoacid ion and cation are present to form a poorly water-soluble substance on the surface of the acid-fast bacterium and the acid-fast bacterium is adsorbed, the adsorption efficiency of the acid-fast bacterium is good. As a result, the recovery rate of the target acid-fast bacterium is improved.
[0081]
  According to the bacterial cell concentration reagent of the present invention, instead of using an already produced adsorption carrier, in the bacterial cell concentration process,Produces poorly water-soluble substancesSince the adsorption carrier is prepared from the oxoacid ion and the cation, the production cost of the adsorption carrier can be reduced. Therefore, the acid-fast bacterium can be adsorbed and separated at low cost.
[0082]
  The present inventionFungusAccording to the body concentration reagent, under mild adsorption and separation conditionsMycobacteria cellsCan be adsorbed and separated, so it can be used as a viable microorganism that retains its activity.Mycobacteria cellsCan be separated and recovered.
[0083]
  The present invention when a calcium phosphate gel is usedFungusAccording to the body concentration reagent, the adsorption efficiency is better than the method using hydroxyapatite which is a solid carrier.

Claims (7)

A mycobacterial cell concentration reagent comprising a combination of an oxoacid ion and a cation that form a poorly water-soluble substance, separately. A mycobacterial cell concentration reagent comprising a combination of an oxoacid ion and a cation that form a poorly water-soluble substance, separately, and a fatty acid salt. The acid-fast bacterium concentration reagent according to claim 2, wherein the fatty acid salt is at least one salt selected from sodium oleate and potassium oleate. A mycobacterial cell concentration reagent comprising a combination of an oxoacid ion, a cation, and a solubilizing agent that form a poorly water-soluble substance . (1) The oxo acid ion is at least one oxo acid ion selected from phosphate ion, silicate ion, carbonate ion, sulfate ion and borate ion, and
(2) The acid-fast bacterium concentration reagent according to claim 1, wherein the cation is at least one alkaline earth metal ion selected from magnesium ion, calcium ion, strontium ion and barium ion. . The acid-fast bacterium concentration reagent according to claim 4, wherein the lysing agent is an acid. The acid-fast bacterium concentration reagent according to any one of claims 1 to 6, wherein the acid-fast bacterium is Mycobacterium tuberculosis.