JP4241929B2 - Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
発明の分野
本明細書中に記載および請求する発明は、（例えば咽喉スワブ、組織サンプル、体液および培養物からの）試験サンプル中の細菌種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉからの核酸を検出するための核酸プローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドの設計および使用に関する。
発明の背景
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉは、結核に似た慢性の肺病の原因となる、ゆっくりと増殖する光色原体細菌である（Ｗａｙｎｅ，Ｌ．Ｇ．およびＧ．Ｐ．Ｋｕｂｉｃａ、１９９６、”Ｔｈｅ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ”，１４３５−１４５７、Ｓｎｅａｔｈら編、”Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｅｒｉｏｌｏｇｙ”、第２巻、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ａｖｉｕｍの複合株以外のミコバクテリアの中で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉは、最も頻繁に単離される種の一つである。
Ｍ．Ｋａｎｓａｓｉｉのような非結核性ミコバクテリアを原因とする播種性感染は、ＡＩＤＳに感染した個体の数の増加と同様に、公衆衛生への関心を増加させる。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉは、ＨＩＶに感染した患者の（Ｍ．ａｖｉｕｍ複合後の）播種性疾病の原因となる最も一般的な第二の非結核性ミコバクテリウムである。
ミコバクテリアを同定するための古典的方法には、様々な生化学的技術、抗酸性染色、細胞形態学およびＨＰＬＣ分析が含まれる。Ｍ．Ｋａｎｓａｓｉｉ細胞は、長さが中程度から長い桿菌である。コロニーは、平らから盛り上がったおよび滑らかから粗いコロニーの型の範囲である。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのコロニーは、暗中で増殖した場合に、典型的には着色していないが、光に晒すと黄色に変わる（光色原性）。生化学試験では、硝酸還元、ｔｗｅｅｎおよび尿素加水分解、カタラーゼ活性およびナイアシン生成が陽性であることが含まれる。このような同定法を用いたミコバクテリア単離物の分化には、数ヶ月かかる。
Ｍ．ｋａｎｎｓａｓｅｉｉのある種の亜種は、非定型である。例として、Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｃｌｉｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０，２９３０−２９３３、１９９２、を参照のこと。これらの非定型亜種は、それらの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に変異を持ち、それ故、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型株から誘導された２３Ｓ ｒＲＮＡに関連するプローブでは、必ずしも検出可能ではない。しかしながら、これらの不定型株は、感染の原因作因としてかかわり、それ故、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉとしての不定型株を同定できることが重要である。それ故、本明細書中に用いられている用語Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉは、生物体の定型株および非定型株の両方をさす。
それ故、本発明の目的は、試験サンプル、特にヒトの臨床検体内のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを迅速且つ特異的に検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供することにある。さらに、本発明の目的は、以前には検出できなかったＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの亜種の検出を可能にするプローブを提供することにある。
本明細書中に用いられるように、用語「試験サンプル」とは、予期される標的核酸を含むと予想される任意のサンプルを意味するつもりであり、限定するわけではないが、生物サンプル、体液または滲出液（尿、血液、乳、脳骨髄液、痰、唾液、大便、肺気息音、咽喉あるいは生殖器スワブなど）、一つあるいはそれより多くの前述のものを含む臨床検体、環境サンプル、食物サンプルおよび研究室サンプルを含む。
核酸ハイブリダイゼーションは、完全にまたは部分的に相補的なヌクレオチド配列を持つ２つの核酸鎖が前もって決められた反応条件下で一緒になって、特定の水素結合を持つ安定な二本鎖のハイブリッドを形成することによる方法である。核酸鎖は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれかであって良く；従って、ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含むことができる。
このように、本明細書中に用いられているように、用語「ハイブリダイゼーション」は、逆平行方向で一緒になり二本鎖領域を持つ安定な構造を形成する、２つの完全または部分的に相補的な核酸一本鎖の能力をさす。この二本鎖構造の２つの構成鎖は、時にはハイブリッドとも呼ばれ、水素結合で一緒に保たれている。これらの水素結合は、アデニンおよびチミンあるいはウラシル（ＡおよびＴあるいはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）塩基を含むヌクレオチド間で最も一般的に形成されるが、塩基対は、これらの「認知された」対のメンバーでない塩基の間でも形成することができる。非認知塩基対も、この技術分野では良く知られている。例えば、”Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”（Ａｄａｍｓら編、１９９２）を参照のこと。
核酸ハイブリダイゼーションは、特定のヌクレオチド配列を持つ標的核酸を検出または定量するための一般的方法である。そのような方法は、多数のその他の目的の内、微生物の同定および分類、感染性疾病および遺伝子異常の診断、食物および薬剤の試験、ならびに犯罪容疑者の確認に有用である。典型的には、核酸ハイブリダイゼーションアッセイには、標的配列に相補的である核酸配列を持つ標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブが用いられる。そのような標識は、この技術分野では良く知られており、放射活性アイソトープ、酵素、または蛍光、発光、または化学発光基を含む；出願者らは、標識として化学発光アクリジニウムエステルの使用を好む。Ａｒｎｏｒｄら、合衆国特許第５，１８５，４３９号（本明細書と共通の所有権を享受し、本明細書中に参照として採用される）を参照のこと。プローブは、相補領域中の水素結合による二本鎖のアニーリングを可能にするのに適当なハイブリダイゼーション条件下で標的配列を持つ核酸を含むと予想されるサンプルと混合される。次いで、プローブは、サンプル内に存在する標的核酸とハイブリダイズする。得られたハイブリッド二本鎖は、ヒドロキシアパタイト吸着のような、この技術分野で周知の様々な技術によって検出することができる。また、これらの技術には、Ａｒｎｏｌｄら、合衆国特許第５，２８３，１７４号（本明細書と共通の所有権を享受し、ここに参照として採用する）に開示したように、ハイブリダイズしなかったプローブ上に存在する標識を選択的に分解し、次いで残留するハイブリダイズしたプローブと関連する標識の量を測定することを含む技術が含まれる。この後者の技術は、ハイブリダイゼーション防御アッセイ（ＨＰＡ）とも呼ばれ、現在のところ、出願者らによって選択されている。
試験サンプルは、時には、用いた特定の標識の感受性の限度によっては、核酸ハイブリダイゼーションによる直接的な検出または数量化を可能にするための充分な核酸分子数を含まないであろう。そのような場合には、核酸ハイブリダイゼーションを用いて試験サンプル内のその存在または量を同定する前に、検出可能な標的ヌクレオチド配列の量を増加させる。この方法は、核酸増幅とも呼ばれ、標的核酸の量を増加させる方法は、標的核酸または標的ヌクレオチド配列を増幅させることをさす。
増幅方法は、核酸ポリマー化反応の鋳型として標的ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの核酸鎖を用いて標的ヌクレオチド配列を含む相補的二本鎖を作成することを含む。増幅は、標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸分子のセンスおよびアンチセンス鎖の両方で行うことができる。この方法を繰り返し、以後のサイクルの鋳型として核酸生成物を用いることによって、標的ヌクレオチド配列を持つ核酸分子の数は迅速に増加する。
数多くの増幅法が記載されており、これらの中には、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、合衆国特許第４，６８３，１９５号を参照のこと）および方法の一つあるいはそれより多くの段階の中にインビトロでの転写（ＲＮＡ合成）を用いる方法（例えば、Ｍｕｒａｋａｗａら、ＤＮＡ，７，２８７−２９５；Ｂｕｒｇら、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０５０；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５；ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ、欧州特許出願第８９３１３１５４号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０３４７２；Ｋａｃｉａｎら、ＰＣＴ出願９３／２２４６１；およびＤａｔｔａｇｕｐｔａら、合衆国特許出願番号０８／２１５，１８１、１９９４年３月１６日、合衆国に出願：を参照のこと）の様々な実施態様がある。これらの参考文献の開示は、ここに参照として採用し、これらの参照の最後の２つは、本明細書と共通の所有権を享受する。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、予想される標的核酸の存在を検出、指示および／または定量化するために用いられ；そのようなプローブは、通常、放射活性またはは発光原子または化学発光部の様な検出可能な化学基で標識される。出願者らは、標識化試薬としてアクリジニウムエステル誘導体を用いることを好む。しかしながら、また、標識したプローブを用いなくても、予想される標的核酸の存在を検出することもできる。例えば、プローブおよび標的核酸の間に形成されたハイブリッドは、ヒドロキシアパタイトまたはゲルろ過を用いて単離することができ、また、未変性のゲル電気泳動を用いることによって可視化することもできる。時には、予想される標的核酸は、通常、生物起源から誘導されたヌクレオチド配列を持つ異なる核酸分子の任意の集団を含むかもしれない。単に例として、さらに、制限としてではなく、標的ヌクレオチド配列は、（属の外側の生物体の核酸によってではなく）、生物体の一つの属内の核酸、所望の任意の検出によって分けることができる。また、標的ヌクレオチド配列は、生物体の種またはその種の株に対してユニークであっても良い。
すべてのプローブが、検出可能であることを必ずしも意図しているわけではない。いくつかのハイブリダイゼーションプローブは、「ヘルパーオリゴヌクレオチド」または「ヘルパープローブ」と呼ばれ、その標識ヌクレオチド配列と結合するセパレートアッセイプローブの能力を促進するように設計される。理論による結合を望むわけではないが、ヘルパープローブは、標的核酸内の分子内水素結合の量を局所的に減少させることによってアッセイプローブとの結合を促進し、こうして、標的ヌクレオチド配列を標識プローブとの特異的ハイブリダイゼーションにより利用しやすくすると、出願者らは考えている。標的プローブの結合部位の位置および標的核酸の二次構造によって、ヘルパープローブは、標識プローブ結合部位に近いヌクレオチド配列領域と関係するか、または、結合部位から遠いが、それにもかかわらずプローブ結合に影響を与えるヌクレオチド領域と関係する。ヘルパープローブは、本出願と共通の所有権を享受する、Ｈｏｇａｎら、合衆国特許第５，０３０，５５７号に記載されており、ここに参照として採用する。
特定の核酸配列の存在を検出する核酸ハイブリダイゼーションの用途の記載は、Ｋｏｈｎｅ、合衆国特許第４，８５１，３３０号、およびＨｏｇａｎら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００９に与えられており、これらの参考文献は両方とも、本出願と共通の所有権を享受し、ここに参照として採用される。Ｈｏｇａｎは、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、サンプル（例えば、痰、尿、血液および組織切片、食物、よだれおよび水）中の非ウイルス性生物体または非ウイルス生物体のグループの存在を検出する方法について記載している。
また、Ｈｏｇａｎ（上記）は、特定の生物体または生物体のグループに属する標的化リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ヌクレオチド配列のみを特異的に検出する数多くのハイブリダイゼーションプローブについて記載している。
発明の要約
特徴ある本発明は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡあるいはそれをコードするＤＮＡの特定領域、またはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡあるいはｒＤＮＡヌクレオチド配列、を含む、から主になる、またはからなる、オリゴヌクレオチドまたは核酸、に相補的であるように設計される、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドを開示し請求する。
本発明のハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸の選択的検出を可能にする条件下で、特異的な標的ヌクレオチド配列を持つ分子の領域内で標的核酸にハイブリダイズするように設計される。
このように、本発明のハイブリダイゼーションプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドの基礎的および新規の特徴は、適当な限定されたハイブリダイゼーション反応条件下で、標的でない核酸または核酸領域以上に、標的Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸の前もって決定された領域と優先的にハイブリダイズする、それらの能力である。この特異性は、標的核酸の領域のヌクレオチド配列および水素結合したハイブリダイゼーション複合体内に含まれるハイブリダイゼーションプローブの間の相補性の程度、ならびにハイブリダイゼーションの反応条件、の作用による。
また、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブおよびそれらの特異的標的核酸の間に形成される二本鎖核酸ハイブリッド分子を開示し請求する。アッセイプローブおよび標的核酸分子の間に形成されるハイブリッドの構造はハイブリダイゼーション反応後にハイブリダイズしなかったアッセイプローブから物理的にまたは化学的に識別することができるので、前記ハイブリッドは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出および／または定量に有用である。例えば、アッセイプローブおよび標的核酸分子の間に形成されるハイブリッドは、ヒドロキシアパタイト、ゲルろ過、ゲル電気泳動、およびその他の関連する方法論の使用を通して、ハイブリダイズしなかったアッセイプローブから分離することができる。標識したアッセイプローブを用いる場合、アッセイプローブ上に存在する標識をハイブリッド部分として検出することができ、その結果、ハイブリッド上の標識は、原サンプル内に標的核酸が存在することを示す。標識されていないアッセイプローブを用いる場合、ハイブリッドの存在は、分光光度計、染料の結合、およびその他の周知の方法を通して検出することができる。
代わりに、標識したアッセイプローブを用いると、ハイブリダイズしなかった標識したプローブからハイブリッドを物理的に分離する必要なしに、ハイブリッドの存在を検出することができる。Ａｒｎｏｌｄら、合衆国特許第５，２８３，１７４号（以前に参照として採用した）に開示したように、ハイブリダイズしなかったプローブ上に存在する標識の分解は選択的である。この後者の技術は、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）と呼ばれ、現在のところ、出願者に好まれている。
このように、本発明の目的は、訓験サンプル中で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉをその他の微生物から識別する能力を持つオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供することにある。これらのプローブは、Ｍ．ｋｓｎｓａｓｉｉ核酸に高度の特異性を持ち、そして、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの様な密接に関連する生物体からの核酸に同一プローブがハイブリダイゼーションしないハイブリダイゼーション条件下で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸とハイブリダイズするであろう。従って、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの使用は、これらの生物体を含む試験サンプル内でのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの特異的検出または定量を可能にする。これらのプローブは、ハイブリダイゼーションアッセイ内で単独で用いるか、または、その他のアッセイプローブおよび／またはヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒に用いることができる。ハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いると、増幅していない標的核酸を直接検出するか、または、核酸増幅を通して得られたＭ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ核酸を検出することができる。
本発明のプローブは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ株に特異的であるかまたは非特異的であるかのいずれかであることができる。上記のように、２３Ｓ ｒＲＮＡ内に異なる核酸配列を持つＭ．ｋａｎｎｓａｓｉｉの不定型変異体が存在する。２つのそのような不定型の亜種は、本明細書中で”ＢＯＶ”および”ＣＯＵ”亜種と同定されたが、以下の方法に従って同定される。プローブは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型および不定型亜種の両方を包括するように、または一つの亜種を排除するように、設計することができる。このように、本発明の目的は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉでない生物体からＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体（定型および不定型）のすべてを識別する能力を持つオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび／またはプローブ混合物を提供することにある。さらに、本発明の目的は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体の一つの亜種を検出し同定する能力を持つオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供することにある。このプローブ内には、定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＢＯＶ亜種、およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＣＯＵ亜種に特異的なプローブが含まれる。
本発明のもう一つの目的は、すべてのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体を検出する方法、およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉでない生物体からＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを識別するための方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、定型、ＢＯＶおよびＣＯＵの様なＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの亜種を互いに識別する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、咽喉スワブまたはその他のサンプルから誘導された試験サンプル内のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの迅速、特異的、且つ再現可能な同定を、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸と関係するハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドを用いることによって可能にすることにある。
本発明のもう一つの目的は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ−特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブが標的核酸にハイブリダイゼーションする速度を増加させ、さらに、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸にハイブリダイズする能力を持つヘルパーオリゴヌクレオチドを用いることによって、形成されたハイブリッドの安定性を増加させ、それによってＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの標的への標識プローブの結合を促進する、組成物を提供することにある。
発明の詳細な説明
本発明は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの不定型株から得られた核酸を含む、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸の特異的検出に用いられるハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドと関連する。ここ開示されたおよび請求されたすべてのオリゴヌクレオチドは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸のそれと相補的な少なくとも一つのヌクレオチド配列領域を含むという事実を共有する。
定義
以下の用語は、別に特に示さない限り、明細書に示した意味を持つ。
「標的核酸」とは、標的ヌクレオチド配列を持つ、一本鎖または二本鎖の核酸を意味する。
「オリゴヌクレオチド」とは、長さが２より大きいヌクレオチド、好ましくは、長さが１０および１００の間のヌクレオチド、最も好ましくは１２および５０の間のヌクレオチド、の一本鎖ヌクレオチドポリマーを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって、ホスホロチオエート結合によって、またはその他の稀な、あるいは天然発生でない結合によって、連結することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）（ｃｉｔｅ）を含むことができる。さらに、オリゴヌクレオチドは、２’メトキシ−または２’ハロゲン化−リボピラノシル部分のような一般的でないヌクレオチドまたはヌクレオチドでない部分を持つことができる。ここに定義されたオリゴヌクレオチドは、核酸、好ましくはＤＮＡであるが、ＲＮＡであっても良く、または、共有結合したリボ−およびデオキシリボ−ヌクレオチドの組み合わせを持っていても良い。稀なあるいは天然発生でない結合および／または一般的でないヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分で置換しても、標的配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を干渉してはならない。限定された配列のオリゴヌクレオチドプローブは、化学的または生化学的合成のように、当業者らに既知の技術によって、および、組換え核酸分子、例えば細菌またはレトロウイルスベクター、からのインビトロまたはインビボで発現させることによって、作成することができる。この開示から予期されるように、オリゴヌクレオチドは、染色体ＤＮＡまたはそのインビボでの転写生成物からなるものではない。
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または「標的配列」とは、一本鎖の標的核酸分子のヌクレオチド配列、およびそれと完全に相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、の全体または一部分を含む特定の所望のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
「実質的に類似する」ヌクレオチド配列は、特定の同定された核酸配列と比較して、（ＲＮＡまたはＤＮＡと等価のヌクレオチドを除いて）同一、または２０％より多くないミスマッチ、あるいは内部欠失および／または付加を持つ、ヌクレオチド配列である。対照核酸内で同定された配列と実質的に類似したヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドは、その対照核酸の選択的ハイブリダイゼーション能力を分かち持つ。さらに、実質的に類似したヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で同定された配列と完全に相補的なヌクレオチド配列を持つ核酸と、安定で、検出可能なハイブリッドを形成することができるが、非標的核酸配列とは安定で検出可能なハイブリッドを形成しないであろう。これらの実質的に類似した配列は、同定された配列の３’末端および／または５’末端にさらなるヌクレオチドを持つことができる。
「ストリンジェント」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブが標的核酸（好ましくはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）とハイブリダイズすることができ、その他の微生物（例えば、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）またはヒトのいずれかから誘導された試験サンプル内に存在するその他の核酸とは、有意にハイブリダイズしない。これらの条件は、ＧＣ含量およびプローブの長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、および求められるハイブリダイゼーション特異性の程度を含む因子に依存して変えることができることが認識されているであろう。具体的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、以下の開示に提供される。
「プローブ」とは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でそれと安定にハイブリダイズさせる目的で、検出しようとする核酸配列と部分的または完全に相補的である配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。属または種−特異的プローブの場合、プローブは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸と安定にハイブリダイズする能力を持つが、系統発生論的に属または種の外側の生物体からの核酸のような、非標的核酸とはハイブリダイズする能力を持たない。プローブは、必要なわけではないが、そのような配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でプローブの望ましい特異性を実質的に変えることがない限りにおいて、標的配列と相補的でない領域を持つことができる。そのような非相補的領域が存在するならば、それらは、５’プロモーター配列および／またはＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、プローブの固定化を可能にする非選択的配列、または、特定の第二の標的核酸とハイブリダイゼーションするための結合部位を含むことができるか、または、触媒活性部位、またはプローブ上、標的核酸上あるいはその両方上のヘアピン構造のような所望の二次または三次構造を授与するであろう配列を含むことができる。プローブは、プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを検出または確認するために用いることのできる、酵素またはその他のリガンドと共に、ラジオアイソトープ、蛍光または化学発光部の様なレポーター基部で標識することができる。プローブの一つの用途は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとしてであり；また、プローブをは、インビボまたはインビトロでの治療用オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス薬剤として用いて、病気になった、感染した、または病原性の細胞内の遺伝子転写、ｍＲＮＡスプライシングまたは翻訳をブロックするまたは阻害することもできる。
本開示に用いられる、特異的配列のグループ「から選択された配列から主になる核酸配列を持つプローブ（またはオリゴヌクレオチド）」と言う句は、基礎的および新規の特徴を持つようなプローブが、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で列挙された核酸配列のグループの一つと正確に相補性であるヌクレオチド配列を持つヌクレオチド配列領域内で核酸と安定で検出可能なハイブリッドを形成するであろうことを意味する。この定義下での正確な補体は、関連するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」とは、好ましくは長さが１０および１００の間のヌクレオチド、より好ましくは、長さが約１２および５０の間のヌクレオチドの、二本鎖の水素結合領域を含む核酸構造を意味し、そのそれぞれの鎖が他の鎖と相補性であり、そしてその中の領域がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で充分に安定であり、限定するわけではないが、化学発光または蛍光検出、オートラジオグラフ、またはゲル電気泳動を含む手段によって検出される。そのようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡの二本鎖分子を含むことができる。
「相補的」とは、２つの一本鎖核酸の類似領域、または同一の一本鎖核酸の異なる領域のヌクレオチド配列が、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で一本鎖を安定な二本鎖水素結合領域に共にハイブリダイズすることを可能にする、ヌクレオチド塩基組成物を持つことを意味している。一つの一本鎖領域のヌクレオチドの隣接配列が、ＡはＵまたはＴと対になり、そしてＣはＧと対になると言ったような、その他の一本鎖領域の類似ヌクレオチド配列と一連の「規範的な」水素結合塩基対を形成することができる場合、ヌクレオチド配列は、「完全に」相補的である。
「保守的に修飾された変異体」とは、第一の核酸の第一のヌクレオチド配列領域に相補的であるヌクレオチド配列を持つ核酸またはオリゴヌクレオチドであって、第一のヌクレオチド配列領域が第二の「対照」核酸内に含まれる第二のヌクレオチド配列領域と完全に相補的である、上記の核酸またはオリゴヌクレオチドを意味する。保守的に修飾された変異体は、８より多くない付加ヌクレオチドを持ち、そして、対照核酸より８より多くない数で少ないヌクレオチドを持つ。そのような保守的に修飾された変異体は、対照ヌクレオチド配列より長いプローブを与える５’−および３’−に非相補的ヌクレオチドを持つことができることを、理解するであろう。保守的に修飾された変異体は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ標的核酸領域と安定で検出可能なハイブリッドを形成するが、非標的ヌクレオチドとは、安定で検出可能なハイブリッドを形成しないであろう。
「核酸増幅」または「標的増幅」とは、少なくとも一つの標的核酸配列を持つ核酸分子の数を増やすことを意味している。
「ヘルパーオリゴヌクレオチド」とは、標識されたハイブリダイゼーションアッセイプローブの座とは異なる座で標的核酸とハイブリダイズするように設計された常態では標識されていない核酸プローブであって、それによって標識されたプローブのハイブリダイゼーション速度を増加させるか、あるいは標的：標識化プローブハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を高めるかのいずれか、またはその両方の、上記核酸プローブを意味する。
ハイブリダイゼーションの条件およびプローブ／プライマーの設計
ハイブリダイゼーション反応条件（その最も重要なものはハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション溶液内の塩濃度である）は、本発明のハイブリダイゼーションプローブが、試験サンプル内に存在すると予想される他の非標的ヌクレオチド以上に、標的Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ核酸と好んでハイブリダイズすることを可能にするように選択することができる。塩濃度を減少および／または温度を上昇（ストリンジェンシーの増加と呼ばれる）させると、二本鎖ハイブリッド分子内で対になったヌクレオチド塩基間の水素結合が崩壊するので、核酸ハイブリダイゼーションの程度は減少する；このプロセスを「融解」と呼ぶ。
一般的に言えば、最も安定なハイブリッドは、最も大きい数の連続的に完全に調和した（即ち水素結合した）ヌクレオチド塩基対を持つそれらである。従って、そのようなハイブリッドは、通常、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシを増加させると最後に融解すると期待される。しかしながら、一つまたはそれより多くのミスマッチ、「非規範的」または不完全塩基対を含む二本鎖核酸領域は、（結果として核酸のヌクレオチド配列内のその位置で弱い塩基対を生じるか、または塩基対を生じないが）試験サンプル内に存在する他の非標的核酸と交差反応することなくハイブリダイゼーションアッセイで核酸ハイブリッドを検出することを可能にする比較的高いストリンジェンシー条件下で、なお充分に安定であることができる。
それ故、一方では、標的生物体の核酸および非標的であるが密接に関連した生物体の核酸の間の配列の変異の程度、ならびに、他方では、特定のハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列および標的核酸のヌクレオチド配列との間の相補性の程度の両方によって、プローブおよび標的の間の一つまたはそれより多くのミスマッチは、非標的核酸以上に標的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を必ずしも負かすものではない。
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔm、与えられた反応混合物内で可能性のある二本鎖分子の半分が一本鎖、変性常態である温度と定義される）、ならびに、プローブおよび試験サンプル内に存在すると予想される系統分類学的に最も密接に関連する生物体のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの間に形成されたミスマッチハイブリッドのＴm、の間の差異を最大にするように、選ばれ、選択され、および／または設計されたが、検出されるようにしたわけではない。標識されてない増幅オリゴヌクレオチドおよびヘルパーオリゴヌクレオチドは、本発明に有用な標識されたハイブリダイゼーションアッセイプローブのように極端に高度の特異性を持つ必要はないが、それらは、一般的には、その他の核酸以上に一つまたはそれより多くの生物体の標的核酸と優先的にハイブリダイズするように類似の様式で設計される。
核酸配列
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、ならびに、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒｅのように密接に関連する生物体、のｒＲＮＡの核酸配列は、公表された起源から得られるか、または、この技術分野で周知の核酸配列決定技術を用いて出願者らが独立的に決定することもできる。例えば、Ｌａｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，６９５５、１９８５を参照のこと。
これらの様々な生物体のｒＲＮＡ配列をアラインすることによって、出願者らは、種間相対変動性（relative interspecies variability）を持つ特異的識別領域を発見した。標的生物体（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）および非標的生物体（例えば、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）の間で最も多くのヌクレオチド配列変動性を示すそれらの領域を、種特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計するための潜在的標的領域として選んた。
図１は、定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ、ならびに、”ＣＯＵ”および”ＢＯＶ”と名付けられた２つの不定型変異体株の２３Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチドの６２２および６８０（大腸菌２３Ｓ ｒＲＮＡ；「６５０領域」と番号付けた）の間の共通配列を示している。配列番号１は、定型株からのものであるが、配列番号２は、ＢＯＶ株から、そして配列番号３はＣＯＵ株からのものである。
稀に同定される推定のユニークな潜在的標的ヌクレオチド配列は、機能的な種特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブをその配列を含むＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとハイブリダイズするように作ることを保証しない。様々なその他の要素が、種特異的プローブの標的部位としての核酸座の適合性を決定するであろう。例として、可能性のある標的ヌクレオチド配列の（およびこのような二本鎖プローブ：標的ハイブリッドの）ＧＣ含量の増加は、一般的にハイブリッドの安定性およびＴmを増加させる。一つまたはそれより多くの「非標的」生物体と同一であるその配列領域内で隣接するヌクレオチドの数もまた、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡと完全に相補的なプローブおよび非標的生物体または生物体類のｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ核酸の間の部分的ミスマッチを持つハイブリッドの安定性およびＴmに影響を与える。従って、２つのハイブリッドの融解温度の差が、充分な大きさ、常態で少なくとも２−５℃、でない場合、プローブは、ユニークな領域を標的としても、種特異的とはならないかも知れない。
ハイブリダイゼーションの好ましい温度および（塩濃度のような）ハイブリダイゼーション溶液組成は、二本鎖ハイブリッドの安定性に主な影響を与える２つの条件である；これらの条件は、属−または種−に特異的なプローブの構築において考慮されなばならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオン強度と共に増加する。他方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコールのように、水素結合を崩壊させる化学薬品は、ハイブリッドの熱安定性を大きく減少させることができる。
その標的へのプローブの特異性を最大にするために、本発明の主題のプローブは、高いストリンジェンシー条件下でそれらの標的とハイブリダイズするように設計された。そのような条件下では、高度の相補性を持つ一本鎖の核酸のみが、互いにハイブリダイズするであろう；そのような高度の相補性を持たない一本鎖の核酸は、ハイブリッドを形成しないように企てられるであろう。従って、アッセイ条件（例えば、温度およびイオン強度）のストリンジェンシーから、ハイブリッドを形成するために２つの核酸鎖間に存在しなければならない相補性の量を決定することができる。本発明に関連して、ストリンジェンシーは、プローブおよび標的核酸間に形成されたハイブリッドならびにプローブおよび存在する任意の一本鎖非標的核酸間に形成される可能性のあるハイブリッドとの間の安定性の差異を最大にするように選択される。
適当なプローブ特異性は、非標的生物体の配列と完全に相補的であるヌクレオチド配列を持つプローブの長さを最少にすることによって、非標的配列と相同のＧおよびＣを多く含む領域を避けることによって、および可能な限り多くの非標的配列との不安定なミスマッチを含むプローブを構築することによって、設計することができる。
標的核酸配列の長さ、およびプローブ配列の全体の長さもまた、特異性に重要である可能性がある。ある場合には、種特異的プローブ標的として用いることのできる、位置および長さの異なる、特定の「可変」領域内にいくつかのヌクレオチド配列が存在することもある。ある場合には、種特異的プローブを特定のｒＲＮＡ可変領域に対して設計することができない。その理由は、配列領域がプローブに接近しにくいか、またはその他の理由によるかのいずれかである。ハイブリダイズする完全に相補的でない核酸も可能ではあるが、最も長く伸長した完全に相同な塩基配列が、一般的に、ハイブリッド安定性を決定するであろう。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを用いることもできる。
ハイブリダイゼーションを阻害する強い分子内構造を形成する標的領域は、あまり好ましくない標的領域である。同様に、結果として広範な自己相補性を生ずるプローブ設計もまた、避けられるべきである。上に説明したように、ハイブリダイゼーションは、水素結合した二本鎖ハイブリッドを形成する相補的核酸の２つの一本鎖の連合である。このように、２つの鎖の一つまたは両方が、分子内または分子間結合に全体的にまたは部分的に含まれるならば、それが、新しい分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成に預かる可能性はほとんどない。例えば、リボソームＲＮＡ分子は、水素結合によって非常に安定な分子内ヘリックスおよび二次構造を形成することが知られている。実質的な標的配列部分がプローブとのハイブリダイゼーションまで一本鎖状態で残るようなハイブリダイゼーションアッセイを設計することによって、プローブと標的の間のハイブリダイゼーション速度および範囲を大きく増加させることができる。これを達成できる一つの方法は、標的ヌクレオチド配列として、細胞内水素結合に比較的含まれない配列を選ぶことによる方法である。代わりにまたはさらに、ハイブリダイゼーションアッセイプローブを、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとのハイブリダイゼーションをより可能にしやすい標的部位を作ることのできるヘルパーオリゴヌクレオチドを持つプローブ混合物内で用いることもできる。そのようなヘルパープローブは一般に記載されている。
それらの標的核酸と完全にマッチしたオリゴヌクレオチドの融解温度を概算する数多くの式が手に入る。
そのような式の一つ；
Ｔm＝81.5＋16.6（log10［Na+］＋0.41（フラクションG+C）−（600／N）
（式中、Ｎ＝ヌクレオチド数中のオリゴヌクレオチドの長さ）；は、長さが約１４および７０の間のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのＴｍに関して、良好な概算を提供する。そのような計算から、続いて行う実験に基づくＴmの証明または「微細チューニング」は、スクリーニング技術を用いて行うことができる。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブのさらなる情報に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９（ここに１１章を参照として採用する）を参照のこと。この参考文献は、また、ハイブリッドのＴmとのミスマッチの影響の評価を提供する。
オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドは、共に共有結合したヌクレオチドサブユニットから作られる。ヌクレオチドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボースまたはＯ−メチルリボースあるいは２’ハロゲン化リボースのようなそれから修飾された誘導体であることができる。ヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合の様な結合、修飾された結合、またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない非ヌクレオチド部分によって、多分結合するであろう。修飾された結合には、標準ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合のような別の結合と置き換えるそれらの結合が含まれる。上記のように、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとして用いた場合、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、その標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの同定を助ける、アクリジニウムエステルまたはラジオアイソトープのようなレポーター基を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドはすべて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブであろうとヘルパーオリゴヌクレオチドであろうと、それらの性能を強化する、または増幅生成物の特徴を促進するために、化学基で修飾することができる。例えば、あるポリメラーゼのヌクレオリティック（nucleolytic）活性に耐性なオリゴヌクレオチドを減少させるホスホロチオエートまたはメチルホスホネート基をもつそれらの様な骨格−修飾オリゴヌクレオチドは、増幅またはその他の反応へのそのような酵素の使用を可能にする。修飾のもう一つの例としては、ヌクレオチド間またはハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸長を妨げないオリゴヌクレオチド鎖の末端に取り入れられた、非ヌクレオチドリンカーを用いる（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、欧州特許出願８８３０８７６６−０、ここに参照として採用する）ことが含まれる。
上に開示したように、オリゴヌクレオチドの５’末端は、いくつかの核酸ポリメラーゼ内に存在する５’−エキソヌクレアーゼ活性に耐性であるように修飾することができる。そのような修飾は、Ａｒｎｏｌｄら、上記、「ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合試薬」（”Non-Nucleotid Linking Reagents for Nucleotide Probes”）（前もってここに参照として採用された）に記載されたそれらのような技術を用いて、プライマーの末端５’ヌクレオチドに非ヌクレオチド基を付加することによって、遂行することができる。
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡおよびｒＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ
ここに開示され請求されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、形態分類学上密接に関連する細菌種、好ましくは、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、の核酸以上に、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列を含む標的核酸と優先的にハイブリダイズすることができる。これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ変異体のｒＲＮＡを含むＭ．ｋａｎｓａｓｉｉと前記の形態分類学的に密接に関連した種とのリボソームＲＮＡの関連領域のヌクレオチド配列の比較に基づいて、設計され、選択され、および／または、選択された。
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、以下の標的ｒＲＮＡヌクレオチド配列：
および、チミンをウラシルの代わりに用いたそのＤＮＡ版：
または、これらの配列と完全に相補的であるヌクレオチド配列；と相補的である。
ハイブリダイゼーションプローブは、１０、１１、１２、１３、１４または１５から１００までのヌクレオチドの長さで変化させることができ、好ましくは、１０および５０の間のヌクレオチドの長さである。プローブは、上記のように、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で同定された標的領域とハイブリダイズする能力を持たねばならない。そのように、それらは、一つの標的領域の少なくとも１０ヌクレオチドの隣接する領域と少なくとも７５％の相補性を持たねばならない。好ましくは、相補性は少なくとも８０％であり、８５％、９０％、９５％またはそれより多くのプローブが最も好ましいが、７５％から完全に相同の範囲内のぐらいの相補性を持つプローブがここでは有用である。隣接領域は、１０より多いヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドまたはそれより多く、であることができる。さらに、隣接領域へのハイブリダイゼーションは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸と検出可能なハイブリッドを作り出さねばならず、そして、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、または、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの核酸のような非標的核酸と検出可能なハイブリッドを形成する能力を持っていてはならない。
これらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列：
および、ウラシルをチミンの代わりに用いた、そのＲＮＡ版：
または、それと完全に相補的なヌクレオチド配列、を持つ。
これらの好ましいオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブのコア配列は、ヌクレオチド配列：
を持つ。
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、単独で、または組み合わせのいずれかで、用いることができる。配列番号７と関連するプローブおよびそれらの関連するプローブは、定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出に用いることができ；配列番号８と関連するプローブおよびそれらの関連するプローブは、不定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＢＯＶ株の検出に用いることができ；配列番号９および配列番号１０と関連するプローブおよびそれらの関連プローブは、不定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＣＯＵ株の検出に用いることができる。これらのプローブの組み合わせは、関連する組み合わせのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ株の検出に用いることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブが標的配列にハイブリダイズしたことを検出または確認するために用いることのできる酵素またはその他のリガンドと共に、ラジオアイソトープ、蛍光または化学発光部のような検出可能な標識で標識することが好ましい。出願者らは、化学発光アクリジニウムエステルを標識として用いることを選択する。Ａｒｎｏｌｄら、合衆国特許第５，１８５，４３９号（本出願と共通の所有権を享受し、ここに参照として採用する）を参照のこと。相補性領域内の水素結合によって２つの鎖のアニーリングを可能にするに適当なハイブリダイゼーション条件下で、アッセイプローブを、標的配列を持つ核酸を含むと予想されるサンプルと混合する。
また、プローブまたはプローブ類を、一つまたはそれより多くの非標識ヘルパーオリゴヌクレオチドと結合させると、標的Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ核酸との結合を促進することができる。次いで、プローブは、サンプル中に存在する標的核酸とハイブリダイズし；得られたハイブリッド二本鎖を、ヒドロキシアパタイト吸着および放射活性のモニタリングのような、この技術分野で周知の様々な技術によって、分離し検出することができる。また、これらの技術には、Ａｒｎｏｌｄら、合衆国特許第５，２８３，１７４号（本出願と共通の所有権を享受し、ここに参照として採用する）に開示したような、ハイブリダイズしなかったプローブ上に存在する標識を選択的に分解し、次いで残留したハイブリダイズプローブと関連する標識の量を測定することを含むそれらが含まれる。出願者らは、現在のところ、後者の技術を選択している。
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出において用いられるヘルパーオリゴヌクレオチド
特定のヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを促進した。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、本出願人に共通に所有される、ＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎ、米国特許５，０３０，５５７（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの特異的検出を促進する特定のヘルパーオリゴヌクレオチドは、以下のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＲＮＡヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する：
およびウラシルがチミンで置換されているそのＤＮＡ版：
またはこれらに完全に相補的なヌクレオチド配列。
これらのヘルパーオリゴヌクレオチドの好ましい態様は、以下のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである：
および、チミンがウラシルで置換されているそのＲＮＡ版；
またはこれらに完全に相補的なヌクレオチド配列。
ヘルパーオリゴヌクレオチドは、一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で用いることができるが、その選択性に関しては種特異的である必要はない。すなわち、ヘルパーオリゴヌクレオチドのための標的ヌクレオチド配列は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ種に独特である必要はない。好ましくは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出のために、ハイブリダイゼーションアッセイプローブをヘルパーオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いる。
以下の本発明の種々の態様の例は、例示のためのみのものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
実施例１
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの種々の株の２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲ増幅およびサイクルシークエンシングを用いて得た。
種々のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを含む、いくつかの密接に関連する系統学的近縁種のものと比較した。Ｅ．ｃｏｌｉのヌクレオチド６５０付近の領域に対応する領域が、プローブ設計に用いることができる種特異的変異を有することが見いだされた。プローブ配列番号：７、プローブ配列番号：８およびプローブ配列番号：９が、非定型変種を含むＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡ配列と他の密接に関連する生物との間を最もよく区別しうるものとして選択された。
実施例２
この実験においては、密接に関連する生物であるＭ．ｇａｓｔｒｉおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対するハイブリダイゼーションにより、配列番号：８のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブの特異性を試験した。配列番号：１３の配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを促進した。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＡＴＣＣタイプ株を用いた。生物を適当な固体培地に植菌し、対数期まで増殖させた。各培養物からの１μｌ白金耳の増殖物を、ガラスビーズ、および５％ソルビトール、２．８５ｍＭアジ化ナトリウム、３．７ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．０３５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭコハク酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、および６００ｍＭ ＬｉＣｌからなる２００μｌの溶解溶液を含む細菌溶解管に加えた。管を室温で１５分間超音波処理して生物を溶解させ、次に、９５℃±５℃で１０分間不活性化させた。
プローブはアクリジニウムエステルで標識した。各プローブについて、約２．５ｘ１０6ＲＬＵ（相対光単位；ルミノメーターにより検出された光子の数の測定値）を用いた。ハイブリダイゼーションは、０．０５Ｍコハク酸リチウム（ｐＨ５）、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０ｍＭエチレングリコールビス（ベータアミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）を含む溶液を用いて、６０℃で１５分間実施した。０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１％ＴＲＩＴＯＮRＸ−１００を含む３００μｌの溶液を各管に加え、各反応液を６０℃で８分間インキュベートし、室温に冷却した。ハイブリダイゼーションの検出は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲRＩルミノメーター（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で分析した。ルミノメーターは、２種類の試薬を自動的に注入する；第１の試薬は１ｍＭ硝酸および０．１％過酸化水素を含み、第２の試薬は１Ｎ水酸化ナトリウムを含む。アッセイの結果はＲＬＵで表した。３０，０００ＲＬＵより大きいＲＬＵ値は、陽性反応であると考えられた。これらの実験について、各反応は二重に実施した。結果を以下に示す。
実施例３
この実験においては、配列番号：８および配列番号：９のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブの特異性を、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型株に対するこれらのプローブのハイブリダイゼーションにより試験した。株１−９はＢＯＶ株と分類され、株１０−１１はＣＯＵ株と分類された。細胞増殖および溶解、ハイブリダイゼーションおよび検出は、実施例２に記載のとおり行った。各ハイブリダイゼーション反応において、ヘルパープローブを用いることによりハイブリダイゼーションを促進した。配列番号：８のヌクレオチド配列のプローブについては、配列番号：１４および配列番号：１５のヌクレオチド配列のヘルパープローブを用い、配列番号：９のヌクレオチド配列のプローブについては、配列番号：１４および配列番号：１３のヌクレオチド配列のヘルパープローブを用いた。結果は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの２種類の変異株に対するプローブの特異性を示した。
実施例４
この実験においては、多数の異なる密接に関連する生物とのハイブリダイゼーションにより、配列番号：７のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブの特異性を示す。細胞増殖および溶解は、１つのコロニーまたは１０8個以上の生物から放出されたＲＮＡを用いて、実施例２に記載のとおり行った。ハイブリダイゼーションは、配列番号：１３および配列番号：１４のヌクレオチド配列を有するヘルパープローブを用いて、実施例２に記載のとおり行った。検出は、実施例２に記載のとおり行った。
実施例５
この実験においては、生物の広範な系統発生学的横断（ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）に対するハイブリダイゼーションにより、配列番号：７のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブの特異性をさらに示す。細胞の増殖および溶解は、実施例４に記載のとおり行った。ハイブリダイゼーションおよび検出は、同じヘルパープローブを用いて、実施例４に記載のとおり行った。
実施例６
この実験においては、細菌の標準株について、３つの設計されたプローブ（配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９）および両方のヘルパープローブ（配列番号：１３および配列番号：１４）をすべて含むプローブミックスの特異性を試験した。全部で５５種のミコバクテリウムのＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）参照株を評価した。これらの株は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉに最も密接に関連する生物を代表するものであった。標準的な特異性試験は、活発に増殖しているＡＴＣＣ株の培養物から得た増殖物を用いて実施した。ただし、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍについては、細胞は入手できなかった。そのかわりに、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ ｒＲＮＡを、増殖している細胞培養物から得ることができるものと等しい濃度で用いた。細胞増殖および溶解は、実施例２に記載のとおり行った。ハイブリダイゼーションおよび検出もまた実施例２に記載のとおり行った。密接に関連するすべてのミコバクテリウムは、３０，０００ＲＬＵカットオフより十分に低い陰性の結果を生じた。
実施例７
この実験においては、実施例６において用いたプローブとヘルパーとのミックスの特異性を、細菌の標準株に対して試験した。合計６８種のＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）参照株を評価した。これらの株は、生物の系統発生学的横断を代表するものであった。標準的な特異性試験は、活発に増殖しているＡＴＣＣ株の培養物から得た増殖物を用いて実施した。細胞増殖および溶解は、実施例２に記載のとおり行った。ハイブリダイゼーションおよび検出もまた、実施例２に記載のとおり行った。すべての系統発生学的横断生物は、３０，０００ＲＬＵカットオフより十分に低い陰性の結果を生じた。
実施例８
ハイブリダイゼーションプローブ（実施例６に示される）のミックスを、７種のミコバクテリウムを表す５８種の臨床単離物に対するＭ．ｋａｎｓａｓｉｉへの特異性について試験した。細胞の培養および増殖、およびハイブリダイゼーションは、実施例２に記載のとおり行った。密接に関連する臨床単離物について交差反応は観察されなかった。
実施例９
この実験においては、定型および非定型Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡを用いて、プローブ・ヘルパーミックス（実施例６に示される）の感度を試験した。ｒＲＮＡは、０、０．１、０．２５、０．５および１ｎｇ／μｌの濃度で用いた。試験は各濃度およびｒＲＮＡの各タイプについて二重に実施した。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型株、ＢＯＶ非定型株またはＣＯＵ非定型株のいずれかからの１００μｌのｒＲＮＡを、実施例２に記載のとおり、凍結乾燥したプローブおよびハイブリダイゼーション試薬を含有する管に加えた。反応液をボルテックスし、６０℃で１５分間ハイブリダイズさせた。検出は、実施例２に記載のとおり行った。結果は、プローブが高感度であり、低レベルの量のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型および非定型ｒＲＮＡを検出しうることを示した。
実施例１０
この実験では、非標的細胞のｒＲＮＡおよびｒＤＮＡを有する非標的細胞の存在下における、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡの検出についての、実施例６のプローブ／ヘルパーミックスの感度を試験した。．Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、およびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの細胞を、実施例２に記載のとおり増殖させ溶解した。試料は、溶解した非標的細胞と、指示どおりの０ｎｇから１００ｎｇのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡとの適当なミックスを用いて調製し、ハイブリダイゼーションおよび検出は、実施例２に記載されるように実施した。結果は、多数（約１．５ｘ１０7個）の非標的細胞の存在下で、優れたシグナル回復を示した。
上述の種々の例において示される態様は、本発明に記載されるオリゴヌクレオチドが、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸を検出することができ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉをその既知の最も近い系統発生学的近縁類から区別するアッセイにおいて用いることができることを示す。本明細書に記載されるいずれの例も、本発明を前述の開示の態様に限定することを意図するものではなく、追加の態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【配列表】
本明細書中に記載および請求する発明は、（例えば咽喉スワブ、組織サンプル、体液および培養物からの）試験サンプル中の細菌種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉからの核酸を検出するための核酸プローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドの設計および使用に関する。
発明の背景
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉは、結核に似た慢性の肺病の原因となる、ゆっくりと増殖する光色原体細菌である（Ｗａｙｎｅ，Ｌ．Ｇ．およびＧ．Ｐ．Ｋｕｂｉｃａ、１９９６、”Ｔｈｅ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ”，１４３５−１４５７、Ｓｎｅａｔｈら編、”Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｅｒｉｏｌｏｇｙ”、第２巻、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ａｖｉｕｍの複合株以外のミコバクテリアの中で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉは、最も頻繁に単離される種の一つである。
Ｍ．Ｋａｎｓａｓｉｉのような非結核性ミコバクテリアを原因とする播種性感染は、ＡＩＤＳに感染した個体の数の増加と同様に、公衆衛生への関心を増加させる。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉは、ＨＩＶに感染した患者の（Ｍ．ａｖｉｕｍ複合後の）播種性疾病の原因となる最も一般的な第二の非結核性ミコバクテリウムである。
ミコバクテリアを同定するための古典的方法には、様々な生化学的技術、抗酸性染色、細胞形態学およびＨＰＬＣ分析が含まれる。Ｍ．Ｋａｎｓａｓｉｉ細胞は、長さが中程度から長い桿菌である。コロニーは、平らから盛り上がったおよび滑らかから粗いコロニーの型の範囲である。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのコロニーは、暗中で増殖した場合に、典型的には着色していないが、光に晒すと黄色に変わる（光色原性）。生化学試験では、硝酸還元、ｔｗｅｅｎおよび尿素加水分解、カタラーゼ活性およびナイアシン生成が陽性であることが含まれる。このような同定法を用いたミコバクテリア単離物の分化には、数ヶ月かかる。
Ｍ．ｋａｎｎｓａｓｅｉｉのある種の亜種は、非定型である。例として、Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｃｌｉｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０，２９３０−２９３３、１９９２、を参照のこと。これらの非定型亜種は、それらの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に変異を持ち、それ故、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型株から誘導された２３Ｓ ｒＲＮＡに関連するプローブでは、必ずしも検出可能ではない。しかしながら、これらの不定型株は、感染の原因作因としてかかわり、それ故、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉとしての不定型株を同定できることが重要である。それ故、本明細書中に用いられている用語Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉは、生物体の定型株および非定型株の両方をさす。
それ故、本発明の目的は、試験サンプル、特にヒトの臨床検体内のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを迅速且つ特異的に検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供することにある。さらに、本発明の目的は、以前には検出できなかったＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの亜種の検出を可能にするプローブを提供することにある。
本明細書中に用いられるように、用語「試験サンプル」とは、予期される標的核酸を含むと予想される任意のサンプルを意味するつもりであり、限定するわけではないが、生物サンプル、体液または滲出液（尿、血液、乳、脳骨髄液、痰、唾液、大便、肺気息音、咽喉あるいは生殖器スワブなど）、一つあるいはそれより多くの前述のものを含む臨床検体、環境サンプル、食物サンプルおよび研究室サンプルを含む。
核酸ハイブリダイゼーションは、完全にまたは部分的に相補的なヌクレオチド配列を持つ２つの核酸鎖が前もって決められた反応条件下で一緒になって、特定の水素結合を持つ安定な二本鎖のハイブリッドを形成することによる方法である。核酸鎖は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれかであって良く；従って、ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含むことができる。
このように、本明細書中に用いられているように、用語「ハイブリダイゼーション」は、逆平行方向で一緒になり二本鎖領域を持つ安定な構造を形成する、２つの完全または部分的に相補的な核酸一本鎖の能力をさす。この二本鎖構造の２つの構成鎖は、時にはハイブリッドとも呼ばれ、水素結合で一緒に保たれている。これらの水素結合は、アデニンおよびチミンあるいはウラシル（ＡおよびＴあるいはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）塩基を含むヌクレオチド間で最も一般的に形成されるが、塩基対は、これらの「認知された」対のメンバーでない塩基の間でも形成することができる。非認知塩基対も、この技術分野では良く知られている。例えば、”Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”（Ａｄａｍｓら編、１９９２）を参照のこと。
核酸ハイブリダイゼーションは、特定のヌクレオチド配列を持つ標的核酸を検出または定量するための一般的方法である。そのような方法は、多数のその他の目的の内、微生物の同定および分類、感染性疾病および遺伝子異常の診断、食物および薬剤の試験、ならびに犯罪容疑者の確認に有用である。典型的には、核酸ハイブリダイゼーションアッセイには、標的配列に相補的である核酸配列を持つ標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブが用いられる。そのような標識は、この技術分野では良く知られており、放射活性アイソトープ、酵素、または蛍光、発光、または化学発光基を含む；出願者らは、標識として化学発光アクリジニウムエステルの使用を好む。Ａｒｎｏｒｄら、合衆国特許第５，１８５，４３９号（本明細書と共通の所有権を享受し、本明細書中に参照として採用される）を参照のこと。プローブは、相補領域中の水素結合による二本鎖のアニーリングを可能にするのに適当なハイブリダイゼーション条件下で標的配列を持つ核酸を含むと予想されるサンプルと混合される。次いで、プローブは、サンプル内に存在する標的核酸とハイブリダイズする。得られたハイブリッド二本鎖は、ヒドロキシアパタイト吸着のような、この技術分野で周知の様々な技術によって検出することができる。また、これらの技術には、Ａｒｎｏｌｄら、合衆国特許第５，２８３，１７４号（本明細書と共通の所有権を享受し、ここに参照として採用する）に開示したように、ハイブリダイズしなかったプローブ上に存在する標識を選択的に分解し、次いで残留するハイブリダイズしたプローブと関連する標識の量を測定することを含む技術が含まれる。この後者の技術は、ハイブリダイゼーション防御アッセイ（ＨＰＡ）とも呼ばれ、現在のところ、出願者らによって選択されている。
試験サンプルは、時には、用いた特定の標識の感受性の限度によっては、核酸ハイブリダイゼーションによる直接的な検出または数量化を可能にするための充分な核酸分子数を含まないであろう。そのような場合には、核酸ハイブリダイゼーションを用いて試験サンプル内のその存在または量を同定する前に、検出可能な標的ヌクレオチド配列の量を増加させる。この方法は、核酸増幅とも呼ばれ、標的核酸の量を増加させる方法は、標的核酸または標的ヌクレオチド配列を増幅させることをさす。
増幅方法は、核酸ポリマー化反応の鋳型として標的ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの核酸鎖を用いて標的ヌクレオチド配列を含む相補的二本鎖を作成することを含む。増幅は、標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸分子のセンスおよびアンチセンス鎖の両方で行うことができる。この方法を繰り返し、以後のサイクルの鋳型として核酸生成物を用いることによって、標的ヌクレオチド配列を持つ核酸分子の数は迅速に増加する。
数多くの増幅法が記載されており、これらの中には、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、合衆国特許第４，６８３，１９５号を参照のこと）および方法の一つあるいはそれより多くの段階の中にインビトロでの転写（ＲＮＡ合成）を用いる方法（例えば、Ｍｕｒａｋａｗａら、ＤＮＡ，７，２８７−２９５；Ｂｕｒｇら、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０５０；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５；ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ、欧州特許出願第８９３１３１５４号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０３４７２；Ｋａｃｉａｎら、ＰＣＴ出願９３／２２４６１；およびＤａｔｔａｇｕｐｔａら、合衆国特許出願番号０８／２１５，１８１、１９９４年３月１６日、合衆国に出願：を参照のこと）の様々な実施態様がある。これらの参考文献の開示は、ここに参照として採用し、これらの参照の最後の２つは、本明細書と共通の所有権を享受する。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、予想される標的核酸の存在を検出、指示および／または定量化するために用いられ；そのようなプローブは、通常、放射活性またはは発光原子または化学発光部の様な検出可能な化学基で標識される。出願者らは、標識化試薬としてアクリジニウムエステル誘導体を用いることを好む。しかしながら、また、標識したプローブを用いなくても、予想される標的核酸の存在を検出することもできる。例えば、プローブおよび標的核酸の間に形成されたハイブリッドは、ヒドロキシアパタイトまたはゲルろ過を用いて単離することができ、また、未変性のゲル電気泳動を用いることによって可視化することもできる。時には、予想される標的核酸は、通常、生物起源から誘導されたヌクレオチド配列を持つ異なる核酸分子の任意の集団を含むかもしれない。単に例として、さらに、制限としてではなく、標的ヌクレオチド配列は、（属の外側の生物体の核酸によってではなく）、生物体の一つの属内の核酸、所望の任意の検出によって分けることができる。また、標的ヌクレオチド配列は、生物体の種またはその種の株に対してユニークであっても良い。
すべてのプローブが、検出可能であることを必ずしも意図しているわけではない。いくつかのハイブリダイゼーションプローブは、「ヘルパーオリゴヌクレオチド」または「ヘルパープローブ」と呼ばれ、その標識ヌクレオチド配列と結合するセパレートアッセイプローブの能力を促進するように設計される。理論による結合を望むわけではないが、ヘルパープローブは、標的核酸内の分子内水素結合の量を局所的に減少させることによってアッセイプローブとの結合を促進し、こうして、標的ヌクレオチド配列を標識プローブとの特異的ハイブリダイゼーションにより利用しやすくすると、出願者らは考えている。標的プローブの結合部位の位置および標的核酸の二次構造によって、ヘルパープローブは、標識プローブ結合部位に近いヌクレオチド配列領域と関係するか、または、結合部位から遠いが、それにもかかわらずプローブ結合に影響を与えるヌクレオチド領域と関係する。ヘルパープローブは、本出願と共通の所有権を享受する、Ｈｏｇａｎら、合衆国特許第５，０３０，５５７号に記載されており、ここに参照として採用する。
特定の核酸配列の存在を検出する核酸ハイブリダイゼーションの用途の記載は、Ｋｏｈｎｅ、合衆国特許第４，８５１，３３０号、およびＨｏｇａｎら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００９に与えられており、これらの参考文献は両方とも、本出願と共通の所有権を享受し、ここに参照として採用される。Ｈｏｇａｎは、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、サンプル（例えば、痰、尿、血液および組織切片、食物、よだれおよび水）中の非ウイルス性生物体または非ウイルス生物体のグループの存在を検出する方法について記載している。
また、Ｈｏｇａｎ（上記）は、特定の生物体または生物体のグループに属する標的化リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ヌクレオチド配列のみを特異的に検出する数多くのハイブリダイゼーションプローブについて記載している。
発明の要約
特徴ある本発明は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡあるいはそれをコードするＤＮＡの特定領域、またはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡあるいはｒＤＮＡヌクレオチド配列、を含む、から主になる、またはからなる、オリゴヌクレオチドまたは核酸、に相補的であるように設計される、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドを開示し請求する。
本発明のハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸の選択的検出を可能にする条件下で、特異的な標的ヌクレオチド配列を持つ分子の領域内で標的核酸にハイブリダイズするように設計される。
このように、本発明のハイブリダイゼーションプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドの基礎的および新規の特徴は、適当な限定されたハイブリダイゼーション反応条件下で、標的でない核酸または核酸領域以上に、標的Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸の前もって決定された領域と優先的にハイブリダイズする、それらの能力である。この特異性は、標的核酸の領域のヌクレオチド配列および水素結合したハイブリダイゼーション複合体内に含まれるハイブリダイゼーションプローブの間の相補性の程度、ならびにハイブリダイゼーションの反応条件、の作用による。
また、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブおよびそれらの特異的標的核酸の間に形成される二本鎖核酸ハイブリッド分子を開示し請求する。アッセイプローブおよび標的核酸分子の間に形成されるハイブリッドの構造はハイブリダイゼーション反応後にハイブリダイズしなかったアッセイプローブから物理的にまたは化学的に識別することができるので、前記ハイブリッドは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出および／または定量に有用である。例えば、アッセイプローブおよび標的核酸分子の間に形成されるハイブリッドは、ヒドロキシアパタイト、ゲルろ過、ゲル電気泳動、およびその他の関連する方法論の使用を通して、ハイブリダイズしなかったアッセイプローブから分離することができる。標識したアッセイプローブを用いる場合、アッセイプローブ上に存在する標識をハイブリッド部分として検出することができ、その結果、ハイブリッド上の標識は、原サンプル内に標的核酸が存在することを示す。標識されていないアッセイプローブを用いる場合、ハイブリッドの存在は、分光光度計、染料の結合、およびその他の周知の方法を通して検出することができる。
代わりに、標識したアッセイプローブを用いると、ハイブリダイズしなかった標識したプローブからハイブリッドを物理的に分離する必要なしに、ハイブリッドの存在を検出することができる。Ａｒｎｏｌｄら、合衆国特許第５，２８３，１７４号（以前に参照として採用した）に開示したように、ハイブリダイズしなかったプローブ上に存在する標識の分解は選択的である。この後者の技術は、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）と呼ばれ、現在のところ、出願者に好まれている。
このように、本発明の目的は、訓験サンプル中で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉをその他の微生物から識別する能力を持つオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供することにある。これらのプローブは、Ｍ．ｋｓｎｓａｓｉｉ核酸に高度の特異性を持ち、そして、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの様な密接に関連する生物体からの核酸に同一プローブがハイブリダイゼーションしないハイブリダイゼーション条件下で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸とハイブリダイズするであろう。従って、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの使用は、これらの生物体を含む試験サンプル内でのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの特異的検出または定量を可能にする。これらのプローブは、ハイブリダイゼーションアッセイ内で単独で用いるか、または、その他のアッセイプローブおよび／またはヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒に用いることができる。ハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いると、増幅していない標的核酸を直接検出するか、または、核酸増幅を通して得られたＭ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ核酸を検出することができる。
本発明のプローブは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ株に特異的であるかまたは非特異的であるかのいずれかであることができる。上記のように、２３Ｓ ｒＲＮＡ内に異なる核酸配列を持つＭ．ｋａｎｎｓａｓｉｉの不定型変異体が存在する。２つのそのような不定型の亜種は、本明細書中で”ＢＯＶ”および”ＣＯＵ”亜種と同定されたが、以下の方法に従って同定される。プローブは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型および不定型亜種の両方を包括するように、または一つの亜種を排除するように、設計することができる。このように、本発明の目的は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉでない生物体からＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体（定型および不定型）のすべてを識別する能力を持つオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび／またはプローブ混合物を提供することにある。さらに、本発明の目的は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体の一つの亜種を検出し同定する能力を持つオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供することにある。このプローブ内には、定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＢＯＶ亜種、およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＣＯＵ亜種に特異的なプローブが含まれる。
本発明のもう一つの目的は、すべてのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体を検出する方法、およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉでない生物体からＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを識別するための方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、定型、ＢＯＶおよびＣＯＵの様なＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの亜種を互いに識別する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、咽喉スワブまたはその他のサンプルから誘導された試験サンプル内のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの迅速、特異的、且つ再現可能な同定を、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸と関係するハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドを用いることによって可能にすることにある。
本発明のもう一つの目的は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ−特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブが標的核酸にハイブリダイゼーションする速度を増加させ、さらに、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸にハイブリダイズする能力を持つヘルパーオリゴヌクレオチドを用いることによって、形成されたハイブリッドの安定性を増加させ、それによってＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの標的への標識プローブの結合を促進する、組成物を提供することにある。
発明の詳細な説明
本発明は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの不定型株から得られた核酸を含む、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸の特異的検出に用いられるハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドと関連する。ここ開示されたおよび請求されたすべてのオリゴヌクレオチドは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸のそれと相補的な少なくとも一つのヌクレオチド配列領域を含むという事実を共有する。
定義
以下の用語は、別に特に示さない限り、明細書に示した意味を持つ。
「標的核酸」とは、標的ヌクレオチド配列を持つ、一本鎖または二本鎖の核酸を意味する。
「オリゴヌクレオチド」とは、長さが２より大きいヌクレオチド、好ましくは、長さが１０および１００の間のヌクレオチド、最も好ましくは１２および５０の間のヌクレオチド、の一本鎖ヌクレオチドポリマーを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって、ホスホロチオエート結合によって、またはその他の稀な、あるいは天然発生でない結合によって、連結することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）（ｃｉｔｅ）を含むことができる。さらに、オリゴヌクレオチドは、２’メトキシ−または２’ハロゲン化−リボピラノシル部分のような一般的でないヌクレオチドまたはヌクレオチドでない部分を持つことができる。ここに定義されたオリゴヌクレオチドは、核酸、好ましくはＤＮＡであるが、ＲＮＡであっても良く、または、共有結合したリボ−およびデオキシリボ−ヌクレオチドの組み合わせを持っていても良い。稀なあるいは天然発生でない結合および／または一般的でないヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分で置換しても、標的配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を干渉してはならない。限定された配列のオリゴヌクレオチドプローブは、化学的または生化学的合成のように、当業者らに既知の技術によって、および、組換え核酸分子、例えば細菌またはレトロウイルスベクター、からのインビトロまたはインビボで発現させることによって、作成することができる。この開示から予期されるように、オリゴヌクレオチドは、染色体ＤＮＡまたはそのインビボでの転写生成物からなるものではない。
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または「標的配列」とは、一本鎖の標的核酸分子のヌクレオチド配列、およびそれと完全に相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、の全体または一部分を含む特定の所望のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
「実質的に類似する」ヌクレオチド配列は、特定の同定された核酸配列と比較して、（ＲＮＡまたはＤＮＡと等価のヌクレオチドを除いて）同一、または２０％より多くないミスマッチ、あるいは内部欠失および／または付加を持つ、ヌクレオチド配列である。対照核酸内で同定された配列と実質的に類似したヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドは、その対照核酸の選択的ハイブリダイゼーション能力を分かち持つ。さらに、実質的に類似したヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で同定された配列と完全に相補的なヌクレオチド配列を持つ核酸と、安定で、検出可能なハイブリッドを形成することができるが、非標的核酸配列とは安定で検出可能なハイブリッドを形成しないであろう。これらの実質的に類似した配列は、同定された配列の３’末端および／または５’末端にさらなるヌクレオチドを持つことができる。
「ストリンジェント」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブが標的核酸（好ましくはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）とハイブリダイズすることができ、その他の微生物（例えば、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）またはヒトのいずれかから誘導された試験サンプル内に存在するその他の核酸とは、有意にハイブリダイズしない。これらの条件は、ＧＣ含量およびプローブの長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、および求められるハイブリダイゼーション特異性の程度を含む因子に依存して変えることができることが認識されているであろう。具体的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、以下の開示に提供される。
「プローブ」とは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でそれと安定にハイブリダイズさせる目的で、検出しようとする核酸配列と部分的または完全に相補的である配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。属または種−特異的プローブの場合、プローブは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸と安定にハイブリダイズする能力を持つが、系統発生論的に属または種の外側の生物体からの核酸のような、非標的核酸とはハイブリダイズする能力を持たない。プローブは、必要なわけではないが、そのような配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でプローブの望ましい特異性を実質的に変えることがない限りにおいて、標的配列と相補的でない領域を持つことができる。そのような非相補的領域が存在するならば、それらは、５’プロモーター配列および／またはＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、プローブの固定化を可能にする非選択的配列、または、特定の第二の標的核酸とハイブリダイゼーションするための結合部位を含むことができるか、または、触媒活性部位、またはプローブ上、標的核酸上あるいはその両方上のヘアピン構造のような所望の二次または三次構造を授与するであろう配列を含むことができる。プローブは、プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを検出または確認するために用いることのできる、酵素またはその他のリガンドと共に、ラジオアイソトープ、蛍光または化学発光部の様なレポーター基部で標識することができる。プローブの一つの用途は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとしてであり；また、プローブをは、インビボまたはインビトロでの治療用オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス薬剤として用いて、病気になった、感染した、または病原性の細胞内の遺伝子転写、ｍＲＮＡスプライシングまたは翻訳をブロックするまたは阻害することもできる。
本開示に用いられる、特異的配列のグループ「から選択された配列から主になる核酸配列を持つプローブ（またはオリゴヌクレオチド）」と言う句は、基礎的および新規の特徴を持つようなプローブが、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で列挙された核酸配列のグループの一つと正確に相補性であるヌクレオチド配列を持つヌクレオチド配列領域内で核酸と安定で検出可能なハイブリッドを形成するであろうことを意味する。この定義下での正確な補体は、関連するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」とは、好ましくは長さが１０および１００の間のヌクレオチド、より好ましくは、長さが約１２および５０の間のヌクレオチドの、二本鎖の水素結合領域を含む核酸構造を意味し、そのそれぞれの鎖が他の鎖と相補性であり、そしてその中の領域がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で充分に安定であり、限定するわけではないが、化学発光または蛍光検出、オートラジオグラフ、またはゲル電気泳動を含む手段によって検出される。そのようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡの二本鎖分子を含むことができる。
「相補的」とは、２つの一本鎖核酸の類似領域、または同一の一本鎖核酸の異なる領域のヌクレオチド配列が、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で一本鎖を安定な二本鎖水素結合領域に共にハイブリダイズすることを可能にする、ヌクレオチド塩基組成物を持つことを意味している。一つの一本鎖領域のヌクレオチドの隣接配列が、ＡはＵまたはＴと対になり、そしてＣはＧと対になると言ったような、その他の一本鎖領域の類似ヌクレオチド配列と一連の「規範的な」水素結合塩基対を形成することができる場合、ヌクレオチド配列は、「完全に」相補的である。
「保守的に修飾された変異体」とは、第一の核酸の第一のヌクレオチド配列領域に相補的であるヌクレオチド配列を持つ核酸またはオリゴヌクレオチドであって、第一のヌクレオチド配列領域が第二の「対照」核酸内に含まれる第二のヌクレオチド配列領域と完全に相補的である、上記の核酸またはオリゴヌクレオチドを意味する。保守的に修飾された変異体は、８より多くない付加ヌクレオチドを持ち、そして、対照核酸より８より多くない数で少ないヌクレオチドを持つ。そのような保守的に修飾された変異体は、対照ヌクレオチド配列より長いプローブを与える５’−および３’−に非相補的ヌクレオチドを持つことができることを、理解するであろう。保守的に修飾された変異体は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ標的核酸領域と安定で検出可能なハイブリッドを形成するが、非標的ヌクレオチドとは、安定で検出可能なハイブリッドを形成しないであろう。
「核酸増幅」または「標的増幅」とは、少なくとも一つの標的核酸配列を持つ核酸分子の数を増やすことを意味している。
「ヘルパーオリゴヌクレオチド」とは、標識されたハイブリダイゼーションアッセイプローブの座とは異なる座で標的核酸とハイブリダイズするように設計された常態では標識されていない核酸プローブであって、それによって標識されたプローブのハイブリダイゼーション速度を増加させるか、あるいは標的：標識化プローブハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を高めるかのいずれか、またはその両方の、上記核酸プローブを意味する。
ハイブリダイゼーションの条件およびプローブ／プライマーの設計
ハイブリダイゼーション反応条件（その最も重要なものはハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション溶液内の塩濃度である）は、本発明のハイブリダイゼーションプローブが、試験サンプル内に存在すると予想される他の非標的ヌクレオチド以上に、標的Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ核酸と好んでハイブリダイズすることを可能にするように選択することができる。塩濃度を減少および／または温度を上昇（ストリンジェンシーの増加と呼ばれる）させると、二本鎖ハイブリッド分子内で対になったヌクレオチド塩基間の水素結合が崩壊するので、核酸ハイブリダイゼーションの程度は減少する；このプロセスを「融解」と呼ぶ。
一般的に言えば、最も安定なハイブリッドは、最も大きい数の連続的に完全に調和した（即ち水素結合した）ヌクレオチド塩基対を持つそれらである。従って、そのようなハイブリッドは、通常、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシを増加させると最後に融解すると期待される。しかしながら、一つまたはそれより多くのミスマッチ、「非規範的」または不完全塩基対を含む二本鎖核酸領域は、（結果として核酸のヌクレオチド配列内のその位置で弱い塩基対を生じるか、または塩基対を生じないが）試験サンプル内に存在する他の非標的核酸と交差反応することなくハイブリダイゼーションアッセイで核酸ハイブリッドを検出することを可能にする比較的高いストリンジェンシー条件下で、なお充分に安定であることができる。
それ故、一方では、標的生物体の核酸および非標的であるが密接に関連した生物体の核酸の間の配列の変異の程度、ならびに、他方では、特定のハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列および標的核酸のヌクレオチド配列との間の相補性の程度の両方によって、プローブおよび標的の間の一つまたはそれより多くのミスマッチは、非標的核酸以上に標的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を必ずしも負かすものではない。
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔm、与えられた反応混合物内で可能性のある二本鎖分子の半分が一本鎖、変性常態である温度と定義される）、ならびに、プローブおよび試験サンプル内に存在すると予想される系統分類学的に最も密接に関連する生物体のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの間に形成されたミスマッチハイブリッドのＴm、の間の差異を最大にするように、選ばれ、選択され、および／または設計されたが、検出されるようにしたわけではない。標識されてない増幅オリゴヌクレオチドおよびヘルパーオリゴヌクレオチドは、本発明に有用な標識されたハイブリダイゼーションアッセイプローブのように極端に高度の特異性を持つ必要はないが、それらは、一般的には、その他の核酸以上に一つまたはそれより多くの生物体の標的核酸と優先的にハイブリダイズするように類似の様式で設計される。
核酸配列
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、ならびに、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒｅのように密接に関連する生物体、のｒＲＮＡの核酸配列は、公表された起源から得られるか、または、この技術分野で周知の核酸配列決定技術を用いて出願者らが独立的に決定することもできる。例えば、Ｌａｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，６９５５、１９８５を参照のこと。
これらの様々な生物体のｒＲＮＡ配列をアラインすることによって、出願者らは、種間相対変動性（relative interspecies variability）を持つ特異的識別領域を発見した。標的生物体（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）および非標的生物体（例えば、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）の間で最も多くのヌクレオチド配列変動性を示すそれらの領域を、種特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計するための潜在的標的領域として選んた。
図１は、定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ、ならびに、”ＣＯＵ”および”ＢＯＶ”と名付けられた２つの不定型変異体株の２３Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチドの６２２および６８０（大腸菌２３Ｓ ｒＲＮＡ；「６５０領域」と番号付けた）の間の共通配列を示している。配列番号１は、定型株からのものであるが、配列番号２は、ＢＯＶ株から、そして配列番号３はＣＯＵ株からのものである。
稀に同定される推定のユニークな潜在的標的ヌクレオチド配列は、機能的な種特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブをその配列を含むＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとハイブリダイズするように作ることを保証しない。様々なその他の要素が、種特異的プローブの標的部位としての核酸座の適合性を決定するであろう。例として、可能性のある標的ヌクレオチド配列の（およびこのような二本鎖プローブ：標的ハイブリッドの）ＧＣ含量の増加は、一般的にハイブリッドの安定性およびＴmを増加させる。一つまたはそれより多くの「非標的」生物体と同一であるその配列領域内で隣接するヌクレオチドの数もまた、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡと完全に相補的なプローブおよび非標的生物体または生物体類のｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ核酸の間の部分的ミスマッチを持つハイブリッドの安定性およびＴmに影響を与える。従って、２つのハイブリッドの融解温度の差が、充分な大きさ、常態で少なくとも２−５℃、でない場合、プローブは、ユニークな領域を標的としても、種特異的とはならないかも知れない。
ハイブリダイゼーションの好ましい温度および（塩濃度のような）ハイブリダイゼーション溶液組成は、二本鎖ハイブリッドの安定性に主な影響を与える２つの条件である；これらの条件は、属−または種−に特異的なプローブの構築において考慮されなばならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオン強度と共に増加する。他方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコールのように、水素結合を崩壊させる化学薬品は、ハイブリッドの熱安定性を大きく減少させることができる。
その標的へのプローブの特異性を最大にするために、本発明の主題のプローブは、高いストリンジェンシー条件下でそれらの標的とハイブリダイズするように設計された。そのような条件下では、高度の相補性を持つ一本鎖の核酸のみが、互いにハイブリダイズするであろう；そのような高度の相補性を持たない一本鎖の核酸は、ハイブリッドを形成しないように企てられるであろう。従って、アッセイ条件（例えば、温度およびイオン強度）のストリンジェンシーから、ハイブリッドを形成するために２つの核酸鎖間に存在しなければならない相補性の量を決定することができる。本発明に関連して、ストリンジェンシーは、プローブおよび標的核酸間に形成されたハイブリッドならびにプローブおよび存在する任意の一本鎖非標的核酸間に形成される可能性のあるハイブリッドとの間の安定性の差異を最大にするように選択される。
適当なプローブ特異性は、非標的生物体の配列と完全に相補的であるヌクレオチド配列を持つプローブの長さを最少にすることによって、非標的配列と相同のＧおよびＣを多く含む領域を避けることによって、および可能な限り多くの非標的配列との不安定なミスマッチを含むプローブを構築することによって、設計することができる。
標的核酸配列の長さ、およびプローブ配列の全体の長さもまた、特異性に重要である可能性がある。ある場合には、種特異的プローブ標的として用いることのできる、位置および長さの異なる、特定の「可変」領域内にいくつかのヌクレオチド配列が存在することもある。ある場合には、種特異的プローブを特定のｒＲＮＡ可変領域に対して設計することができない。その理由は、配列領域がプローブに接近しにくいか、またはその他の理由によるかのいずれかである。ハイブリダイズする完全に相補的でない核酸も可能ではあるが、最も長く伸長した完全に相同な塩基配列が、一般的に、ハイブリッド安定性を決定するであろう。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを用いることもできる。
ハイブリダイゼーションを阻害する強い分子内構造を形成する標的領域は、あまり好ましくない標的領域である。同様に、結果として広範な自己相補性を生ずるプローブ設計もまた、避けられるべきである。上に説明したように、ハイブリダイゼーションは、水素結合した二本鎖ハイブリッドを形成する相補的核酸の２つの一本鎖の連合である。このように、２つの鎖の一つまたは両方が、分子内または分子間結合に全体的にまたは部分的に含まれるならば、それが、新しい分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成に預かる可能性はほとんどない。例えば、リボソームＲＮＡ分子は、水素結合によって非常に安定な分子内ヘリックスおよび二次構造を形成することが知られている。実質的な標的配列部分がプローブとのハイブリダイゼーションまで一本鎖状態で残るようなハイブリダイゼーションアッセイを設計することによって、プローブと標的の間のハイブリダイゼーション速度および範囲を大きく増加させることができる。これを達成できる一つの方法は、標的ヌクレオチド配列として、細胞内水素結合に比較的含まれない配列を選ぶことによる方法である。代わりにまたはさらに、ハイブリダイゼーションアッセイプローブを、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとのハイブリダイゼーションをより可能にしやすい標的部位を作ることのできるヘルパーオリゴヌクレオチドを持つプローブ混合物内で用いることもできる。そのようなヘルパープローブは一般に記載されている。
それらの標的核酸と完全にマッチしたオリゴヌクレオチドの融解温度を概算する数多くの式が手に入る。
そのような式の一つ；
Ｔm＝81.5＋16.6（log10［Na+］＋0.41（フラクションG+C）−（600／N）
（式中、Ｎ＝ヌクレオチド数中のオリゴヌクレオチドの長さ）；は、長さが約１４および７０の間のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのＴｍに関して、良好な概算を提供する。そのような計算から、続いて行う実験に基づくＴmの証明または「微細チューニング」は、スクリーニング技術を用いて行うことができる。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブのさらなる情報に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９（ここに１１章を参照として採用する）を参照のこと。この参考文献は、また、ハイブリッドのＴmとのミスマッチの影響の評価を提供する。
オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドは、共に共有結合したヌクレオチドサブユニットから作られる。ヌクレオチドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボースまたはＯ−メチルリボースあるいは２’ハロゲン化リボースのようなそれから修飾された誘導体であることができる。ヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合の様な結合、修飾された結合、またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない非ヌクレオチド部分によって、多分結合するであろう。修飾された結合には、標準ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合のような別の結合と置き換えるそれらの結合が含まれる。上記のように、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとして用いた場合、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、その標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの同定を助ける、アクリジニウムエステルまたはラジオアイソトープのようなレポーター基を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドはすべて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブであろうとヘルパーオリゴヌクレオチドであろうと、それらの性能を強化する、または増幅生成物の特徴を促進するために、化学基で修飾することができる。例えば、あるポリメラーゼのヌクレオリティック（nucleolytic）活性に耐性なオリゴヌクレオチドを減少させるホスホロチオエートまたはメチルホスホネート基をもつそれらの様な骨格−修飾オリゴヌクレオチドは、増幅またはその他の反応へのそのような酵素の使用を可能にする。修飾のもう一つの例としては、ヌクレオチド間またはハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸長を妨げないオリゴヌクレオチド鎖の末端に取り入れられた、非ヌクレオチドリンカーを用いる（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、欧州特許出願８８３０８７６６−０、ここに参照として採用する）ことが含まれる。
上に開示したように、オリゴヌクレオチドの５’末端は、いくつかの核酸ポリメラーゼ内に存在する５’−エキソヌクレアーゼ活性に耐性であるように修飾することができる。そのような修飾は、Ａｒｎｏｌｄら、上記、「ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合試薬」（”Non-Nucleotid Linking Reagents for Nucleotide Probes”）（前もってここに参照として採用された）に記載されたそれらのような技術を用いて、プライマーの末端５’ヌクレオチドに非ヌクレオチド基を付加することによって、遂行することができる。
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡおよびｒＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ
ここに開示され請求されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、形態分類学上密接に関連する細菌種、好ましくは、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、の核酸以上に、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列を含む標的核酸と優先的にハイブリダイズすることができる。これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ変異体のｒＲＮＡを含むＭ．ｋａｎｓａｓｉｉと前記の形態分類学的に密接に関連した種とのリボソームＲＮＡの関連領域のヌクレオチド配列の比較に基づいて、設計され、選択され、および／または、選択された。
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、以下の標的ｒＲＮＡヌクレオチド配列：
ハイブリダイゼーションプローブは、１０、１１、１２、１３、１４または１５から１００までのヌクレオチドの長さで変化させることができ、好ましくは、１０および５０の間のヌクレオチドの長さである。プローブは、上記のように、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で同定された標的領域とハイブリダイズする能力を持たねばならない。そのように、それらは、一つの標的領域の少なくとも１０ヌクレオチドの隣接する領域と少なくとも７５％の相補性を持たねばならない。好ましくは、相補性は少なくとも８０％であり、８５％、９０％、９５％またはそれより多くのプローブが最も好ましいが、７５％から完全に相同の範囲内のぐらいの相補性を持つプローブがここでは有用である。隣接領域は、１０より多いヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドまたはそれより多く、であることができる。さらに、隣接領域へのハイブリダイゼーションは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸と検出可能なハイブリッドを作り出さねばならず、そして、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、または、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの核酸のような非標的核酸と検出可能なハイブリッドを形成する能力を持っていてはならない。
これらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列：
これらの好ましいオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブのコア配列は、ヌクレオチド配列：
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、単独で、または組み合わせのいずれかで、用いることができる。配列番号７と関連するプローブおよびそれらの関連するプローブは、定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出に用いることができ；配列番号８と関連するプローブおよびそれらの関連するプローブは、不定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＢＯＶ株の検出に用いることができ；配列番号９および配列番号１０と関連するプローブおよびそれらの関連プローブは、不定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＣＯＵ株の検出に用いることができる。これらのプローブの組み合わせは、関連する組み合わせのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ株の検出に用いることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブが標的配列にハイブリダイズしたことを検出または確認するために用いることのできる酵素またはその他のリガンドと共に、ラジオアイソトープ、蛍光または化学発光部のような検出可能な標識で標識することが好ましい。出願者らは、化学発光アクリジニウムエステルを標識として用いることを選択する。Ａｒｎｏｌｄら、合衆国特許第５，１８５，４３９号（本出願と共通の所有権を享受し、ここに参照として採用する）を参照のこと。相補性領域内の水素結合によって２つの鎖のアニーリングを可能にするに適当なハイブリダイゼーション条件下で、アッセイプローブを、標的配列を持つ核酸を含むと予想されるサンプルと混合する。
また、プローブまたはプローブ類を、一つまたはそれより多くの非標識ヘルパーオリゴヌクレオチドと結合させると、標的Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ核酸との結合を促進することができる。次いで、プローブは、サンプル中に存在する標的核酸とハイブリダイズし；得られたハイブリッド二本鎖を、ヒドロキシアパタイト吸着および放射活性のモニタリングのような、この技術分野で周知の様々な技術によって、分離し検出することができる。また、これらの技術には、Ａｒｎｏｌｄら、合衆国特許第５，２８３，１７４号（本出願と共通の所有権を享受し、ここに参照として採用する）に開示したような、ハイブリダイズしなかったプローブ上に存在する標識を選択的に分解し、次いで残留したハイブリダイズプローブと関連する標識の量を測定することを含むそれらが含まれる。出願者らは、現在のところ、後者の技術を選択している。
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出において用いられるヘルパーオリゴヌクレオチド
特定のヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを促進した。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、本出願人に共通に所有される、ＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎ、米国特許５，０３０，５５７（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの特異的検出を促進する特定のヘルパーオリゴヌクレオチドは、以下のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＲＮＡヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する：
これらのヘルパーオリゴヌクレオチドの好ましい態様は、以下のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである：
ヘルパーオリゴヌクレオチドは、一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で用いることができるが、その選択性に関しては種特異的である必要はない。すなわち、ヘルパーオリゴヌクレオチドのための標的ヌクレオチド配列は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ種に独特である必要はない。好ましくは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出のために、ハイブリダイゼーションアッセイプローブをヘルパーオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いる。
以下の本発明の種々の態様の例は、例示のためのみのものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
実施例１
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの種々の株の２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲ増幅およびサイクルシークエンシングを用いて得た。
種々のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを含む、いくつかの密接に関連する系統学的近縁種のものと比較した。Ｅ．ｃｏｌｉのヌクレオチド６５０付近の領域に対応する領域が、プローブ設計に用いることができる種特異的変異を有することが見いだされた。プローブ配列番号：７、プローブ配列番号：８およびプローブ配列番号：９が、非定型変種を含むＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡ配列と他の密接に関連する生物との間を最もよく区別しうるものとして選択された。
実施例２
この実験においては、密接に関連する生物であるＭ．ｇａｓｔｒｉおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対するハイブリダイゼーションにより、配列番号：８のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブの特異性を試験した。配列番号：１３の配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを促進した。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＡＴＣＣタイプ株を用いた。生物を適当な固体培地に植菌し、対数期まで増殖させた。各培養物からの１μｌ白金耳の増殖物を、ガラスビーズ、および５％ソルビトール、２．８５ｍＭアジ化ナトリウム、３．７ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．０３５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭコハク酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、および６００ｍＭ ＬｉＣｌからなる２００μｌの溶解溶液を含む細菌溶解管に加えた。管を室温で１５分間超音波処理して生物を溶解させ、次に、９５℃±５℃で１０分間不活性化させた。
プローブはアクリジニウムエステルで標識した。各プローブについて、約２．５ｘ１０6ＲＬＵ（相対光単位；ルミノメーターにより検出された光子の数の測定値）を用いた。ハイブリダイゼーションは、０．０５Ｍコハク酸リチウム（ｐＨ５）、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０ｍＭエチレングリコールビス（ベータアミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）を含む溶液を用いて、６０℃で１５分間実施した。０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１％ＴＲＩＴＯＮRＸ−１００を含む３００μｌの溶液を各管に加え、各反応液を６０℃で８分間インキュベートし、室温に冷却した。ハイブリダイゼーションの検出は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲRＩルミノメーター（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で分析した。ルミノメーターは、２種類の試薬を自動的に注入する；第１の試薬は１ｍＭ硝酸および０．１％過酸化水素を含み、第２の試薬は１Ｎ水酸化ナトリウムを含む。アッセイの結果はＲＬＵで表した。３０，０００ＲＬＵより大きいＲＬＵ値は、陽性反応であると考えられた。これらの実験について、各反応は二重に実施した。結果を以下に示す。
この実験においては、配列番号：８および配列番号：９のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブの特異性を、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型株に対するこれらのプローブのハイブリダイゼーションにより試験した。株１−９はＢＯＶ株と分類され、株１０−１１はＣＯＵ株と分類された。細胞増殖および溶解、ハイブリダイゼーションおよび検出は、実施例２に記載のとおり行った。各ハイブリダイゼーション反応において、ヘルパープローブを用いることによりハイブリダイゼーションを促進した。配列番号：８のヌクレオチド配列のプローブについては、配列番号：１４および配列番号：１５のヌクレオチド配列のヘルパープローブを用い、配列番号：９のヌクレオチド配列のプローブについては、配列番号：１４および配列番号：１３のヌクレオチド配列のヘルパープローブを用いた。結果は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの２種類の変異株に対するプローブの特異性を示した。
この実験においては、多数の異なる密接に関連する生物とのハイブリダイゼーションにより、配列番号：７のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブの特異性を示す。細胞増殖および溶解は、１つのコロニーまたは１０8個以上の生物から放出されたＲＮＡを用いて、実施例２に記載のとおり行った。ハイブリダイゼーションは、配列番号：１３および配列番号：１４のヌクレオチド配列を有するヘルパープローブを用いて、実施例２に記載のとおり行った。検出は、実施例２に記載のとおり行った。
この実験においては、生物の広範な系統発生学的横断（ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）に対するハイブリダイゼーションにより、配列番号：７のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブの特異性をさらに示す。細胞の増殖および溶解は、実施例４に記載のとおり行った。ハイブリダイゼーションおよび検出は、同じヘルパープローブを用いて、実施例４に記載のとおり行った。
この実験においては、細菌の標準株について、３つの設計されたプローブ（配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９）および両方のヘルパープローブ（配列番号：１３および配列番号：１４）をすべて含むプローブミックスの特異性を試験した。全部で５５種のミコバクテリウムのＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）参照株を評価した。これらの株は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉに最も密接に関連する生物を代表するものであった。標準的な特異性試験は、活発に増殖しているＡＴＣＣ株の培養物から得た増殖物を用いて実施した。ただし、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍについては、細胞は入手できなかった。そのかわりに、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ ｒＲＮＡを、増殖している細胞培養物から得ることができるものと等しい濃度で用いた。細胞増殖および溶解は、実施例２に記載のとおり行った。ハイブリダイゼーションおよび検出もまた実施例２に記載のとおり行った。密接に関連するすべてのミコバクテリウムは、３０，０００ＲＬＵカットオフより十分に低い陰性の結果を生じた。
この実験においては、実施例６において用いたプローブとヘルパーとのミックスの特異性を、細菌の標準株に対して試験した。合計６８種のＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）参照株を評価した。これらの株は、生物の系統発生学的横断を代表するものであった。標準的な特異性試験は、活発に増殖しているＡＴＣＣ株の培養物から得た増殖物を用いて実施した。細胞増殖および溶解は、実施例２に記載のとおり行った。ハイブリダイゼーションおよび検出もまた、実施例２に記載のとおり行った。すべての系統発生学的横断生物は、３０，０００ＲＬＵカットオフより十分に低い陰性の結果を生じた。
ハイブリダイゼーションプローブ（実施例６に示される）のミックスを、７種のミコバクテリウムを表す５８種の臨床単離物に対するＭ．ｋａｎｓａｓｉｉへの特異性について試験した。細胞の培養および増殖、およびハイブリダイゼーションは、実施例２に記載のとおり行った。密接に関連する臨床単離物について交差反応は観察されなかった。
この実験においては、定型および非定型Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡを用いて、プローブ・ヘルパーミックス（実施例６に示される）の感度を試験した。ｒＲＮＡは、０、０．１、０．２５、０．５および１ｎｇ／μｌの濃度で用いた。試験は各濃度およびｒＲＮＡの各タイプについて二重に実施した。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型株、ＢＯＶ非定型株またはＣＯＵ非定型株のいずれかからの１００μｌのｒＲＮＡを、実施例２に記載のとおり、凍結乾燥したプローブおよびハイブリダイゼーション試薬を含有する管に加えた。反応液をボルテックスし、６０℃で１５分間ハイブリダイズさせた。検出は、実施例２に記載のとおり行った。結果は、プローブが高感度であり、低レベルの量のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型および非定型ｒＲＮＡを検出しうることを示した。
この実験では、非標的細胞のｒＲＮＡおよびｒＤＮＡを有する非標的細胞の存在下における、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡの検出についての、実施例６のプローブ／ヘルパーミックスの感度を試験した。．Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、およびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの細胞を、実施例２に記載のとおり増殖させ溶解した。試料は、溶解した非標的細胞と、指示どおりの０ｎｇから１００ｎｇのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡとの適当なミックスを用いて調製し、ハイブリダイゼーションおよび検出は、実施例２に記載されるように実施した。結果は、多数（約１．５ｘ１０7個）の非標的細胞の存在下で、優れたシグナル回復を示した。
【配列表】
Claims (41)
- Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ ＢＯＶ株を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、前記プローブは、塩基配列が配列番号２又はその相補体内に含まれる配列と相補的であり、かつ、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：１７及び配列番号：５からなる配列群に属する配列の少なくとも１５の連続した塩基領域と塩基が１００％同一である領域を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記プローブはストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ ＢＯＶ株由来の標的核酸とハイブリダイズして検出可能なプローブ：標的デュープレックスを形成し、及び、前記プローブは、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来の核酸とはハイブリダイズせずに検出可能なプローブ：非標的デュープレックスを形成しない、前記プローブ。
- オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記配列群に属する配列からなるか、又は、前記配列群に属する配列内に含まれる、請求項１記載のプローブ。
- オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記配列群に属する配列と塩基が１００％同一である、請求項１記載のプローブ。
- プローブの塩基配列が、前記配列群に属する配列からなるか、又は、前記配列群に属する配列内に含まれる、請求項１記載のプローブ。
- プローブの塩基配列が、前記配列群に属する配列と塩基が１００％同一である、請求項１記載のプローブ。
- プローブが標識されている、請求項１〜５のいずれか１項記載のプローブ。
- 標識がアクリジニウムエステルである、請求項６記載のプローブ。
- 前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、請求項１〜７のいずれか１項記載のプローブと前記標的核酸との間に形成された核酸ハイブリッド分子。
- 試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉの存在を検出するための方法であって、以下の：
ａ）請求項１〜７のいずれか１項記載のプローブを、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、試料にもたらし；
ｂ）試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉの存在の指標として、前記検出可能なプローブ：標的デュープレックスが形成されるかを検出する；
ことを含む、前記方法。 - Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ ＣＯＵ株を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、前記プローブは、塩基配列が配列番号３又はその相補体内に含まれる配列と相補的であり、かつ、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：１８及び配列番号：６からなる配列群に属する配列の少なくとも１５の連続した塩基領域と塩基が１００％同一である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記プローブはストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ ＣＯＵ株由来の標的核酸とハイブリダイズして検出可能なプローブ：標的デュープレックスを形成し、及び、前記プローブは、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来の核酸とはハイブリダイズせずに検出可能なプローブ：非標的デュープレックスを形成しない、前記プローブ。
- オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記配列群に属する配列からなるか、又は、前記配列群に属する配列内に含まれる、請求項１０記載のプローブ。
- オリゴヌクレオチドの塩基配列が前記配列群に属する配列と塩基が１００％同一である、請求項１０記載のプローブ。
- プローブの塩基配列が、前記配列群に属する配列からなるか、又は、前記配列群に属する配列内に含まれる、請求項１０記載のプローブ。
- プローブの塩基配列が、前記配列群に属する配列と塩基が１００％同一である、請求項１０記載のプローブ。
- プローブが標識されている、請求項１０〜１４のいずれか１項記載のプローブ。
- 標識がアクリジニウムエステルである、請求項１５記載のプローブ。
- ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、請求１０〜１６のいずれか１項記載のプローブと標的核酸との間に形成される核酸ハイブリッド分子。
- 試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉの存在を検出するための方法であって、前記方法は以下の：
ａ）請求項１０〜１６のいずれか１項記載のプローブを、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、試料にもたらし；
ｂ）試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉの存在の指標として，
て、前記検出可能なプローブ：標的デュープレックスが形成されるかを検出する；
ことを含む前記方法。 - Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブミックスであって、
第１プローブであって、塩基配列が配列番号２又はその相補体内に含まれる配列と相補的であり、かつ、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：１７及び配列番号：５からなる配列群に属する配列の少なくとも１５の連続した塩基領域と塩基が１００％同一である領域を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記プローブはストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ ＢＯＶ株由来の標的核酸とハイブリダイズして検出可能なプローブ：標的デュープレックスを形成し、及び、前記プローブは、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来の核酸とはハイブリダイズせずに検出可能なプローブ：非標的デュープレックスを形成しない、前記プローブ；
第２プローブであって、塩基配列が配列番号３又はその相補体内に含まれる配列と相補的であり、かつ、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：１８及び配列番号：６からなる配列群に属する配列の少なくとも１５の連続した塩基領域と塩基が１００％同一である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記プローブはストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ ＣＯＵ株由来の標的核酸とハイブリダイズして検出可能なプローブ：標的デュープレックスを形成し、及び、前記プローブは、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来の核酸とはハイブリダイズせずに検出可能なプローブ：非標的デュープレックスを形成しない前記プローブ；並びに
第３プローブであって、塩基配列が配列番号１又はその相補体内に含まれる配列と相補的であり、かつ、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：１６及び配列番号：４からなる配列群に属する配列の少なくとも１５の連続した塩基領域と塩基が１００％同一である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記プローブはストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ定型株由来の標的核酸とハイブリダイズして検出可能なプローブ：標的デュープレックスを形成し、及び、前記プローブは、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来の核酸とはハイブリダイズせずに検出可能なプローブ：非標的デュープレックスを形成しない前記プローブ；
からなる群より選択される少なくとも２つのプローブを含む、前記プローブミックス。 - 請求項１９記載のプローブミックスであって、
オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記第１配列群に属する配列からなるか、又は、前記第１配列群に属する配列内に含まれ；
オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記第２配列群に属する配列からなるか、又は、前記第２配列群に属する配列内に含まれ；
オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記第３配列群に属する配列からなるか、又は、前記第３配列群に属する配列内に含まれる；
前記プローブミックス。 - 請求項２０記載のプローブミックスであって、
オリゴヌクレオチドの塩基配列が前記第１配列群に属する配列と塩基が１００％同一であり；
オリゴヌクレオチドの塩基配列が前記第２配列群に属する配列と塩基が１００％同一であり；
オリゴヌクレオチドの塩基配列が前記第３配列群に属する配列と塩基が１００％同一である；
前記プローブミックス。 - 請求項１９記載のプローブミックスであって、
第１プローブの塩基配列が、前記第１配列群に属する配列からなるか、又は、前記第１配列群に属する配列内に含まれ；
第２プローブの塩基配列が、前記第２配列群に属する配列からなるか、又は、前記第２配列群に属する配列内に含まれ；
第３プローブの塩基配列が、前記第３配列群に属する配列からなるか、又は、前記第３配列群に属する配列内に含まれる；
前記プローブミックス。 - 請求項１９記載のプローブミックスであって、
第１プローブの塩基配列が、前記第１配列群に属する配列と塩基が１００％同一であり；
第２プローブの塩基配列が、前記第２配列群に属する配列と塩基が１００％同一であり；
第３プローブの塩基配列が、前記第３配列群に属する配列と塩基が１００％同一である；
前記プローブミックス。 - 各プローブが標識されている、請求項１９〜２３のいずれか１項記載のプローブミックス。
- 標識がアクリジニウムエステルである、請求項２４記載のプローブミックス。
- 第１及び第２プローブを含む、請求項１９〜２５のいずれか１項記載のプローブミックス。
- 第１及び第３プローブを含む、請求項１９〜２５のいずれか１項記載のプローブミックス。
- 第２及び第３プローブを含む、請求項１９〜２５のいずれか１項記載のプローブミックス。
- 第１、第２及び第３プローブを各々含む、請求項１９〜２５のいずれか１項記載のプローブミックス。
- 試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉの存在を検出するための方法であって、前記方法は以下の：
ａ）請求項１９〜２９のいずれか１項記載のプローブミックスを、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、試料にもたらし；
ｂ）試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉの存在の指標として、前記検出可能なプローブ：標的デュープレックスが形成されるかを検出する；
ことを含む前記方法。 - 試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉの検出に用いるキットであって、
第１プローブであって、塩基配列が配列番号２又はその相補体内に含まれる配列と相補的であり、かつ、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：１７及び配列番号：５からなる配列群に属する配列の少なくとも１５の連続した塩基領域と塩基が１００％同一である領域を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記プローブはストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ ＢＯＶ株由来の標的核酸とハイブリダイズして検出可能なプローブ：標的デュープレックスを形成し、及び、前記プローブは、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来の核酸とはハイブリダイズせずに検出可能なプローブ：非標的デュープレックスを形成しない、前記プローブ；
第２プローブであって、塩基配列が配列番号３又はその相補体内に含まれる配列と相補的であり、かつ、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：１８及び配列番号：６からなる配列群に属する配列の少なくとも１５の連続した塩基領域と塩基が１００％同一である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記プローブはストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ ＣＯＵ株由来の標的核酸とハイブリダイズして検出可能なプローブ：標的デュープレックスを形成し、及び、前記プローブは、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来の核酸とはハイブリダイズせずに検出可能なプローブ：非標的デュープレックスを形成しない前記プローブ；並びに
第３プローブであって、塩基配列が配列番号１又はその相補体内に含まれる配列と相補的であり、かつ、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：１６及び配列番号：４からなる配列群に属する配列の少なくとも１５の連続した塩基領域と塩基が１００％同一である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記プローブはストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ定型株由来の標的核酸とハイブリダイズして検出可能なプローブ：標的デュープレックスを形成し、及び、前記プローブは、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来の核酸とはハイブリダイズせずに検出可能なプローブ：非標的デュープレックスを形成しない前記プローブ；
からなる群より選択される少なくとも２つのプローブを含む、前記キット。 - 請求項３１記載のキットであって、
オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記第１配列群に属する配列からなるか、又は、前記第１配列群に属する配列内に含まれ；
オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記第２配列群に属する配列からなるか、又は、前記第２配列群に属する配列内に含まれ；
オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記第３配列群に属する配列からなるか、又は、前記第３配列群に属する配列内に含まれる；
前記キット。 - 請求項３１記載のキットであって、
オリゴヌクレオチドの塩基配列が前記第１配列群に属する配列と塩基が１００％同一であり；
オリゴヌクレオチドの塩基配列が前記第２配列群に属する配列と塩基が１００％同一であり；
オリゴヌクレオチドの塩基配列が前記第３配列群に属する配列と塩基が１００％同一である；
前記キット。 - 請求項３１記載のキットであって、
第１プローブの塩基配列が、前記第１配列群に属する配列からなるか、又は、前記第１配列群に属する配列内に含まれ；
第２プローブの塩基配列が、前記第２配列群に属する配列からなるか、又は、前記第２配列群に属する配列内に含まれ；
第３プローブの塩基配列が、前記第３配列群に属する配列からなるか、又は、前記第３配列群に属する配列内に含まれる；
前記キット。 - 請求項３１記載のキットであって、
第１プローブの塩基配列が、前記第１配列群に属する配列と塩基が１００％同一であり；
第２プローブの塩基配列が、前記第２配列群に属する配列と塩基が１００％同一であり；
第３プローブの塩基配列が、前記第３配列群に属する配列と塩基が１００％同一である；
前記キット。 - 各プローブが標識されている、請求項３１〜３５のいずれか１項記載のキット。
- 標識がアクリジニウムエステルである、請求項３６記載のキット。
- 第１及び第２プローブを含む、請求項３１〜３７のいずれか１項記載のキット。
- 第１及び第３プローブを含む、請求項３１〜３７のいずれか１項記載のキット。
- 第２及び第３プローブを含む、請求項３１〜３７のいずれか１項記載のキット。
- プローブミックスが前記第１、第２及び第３プローブを各々含む、請求項３１〜３７のいずれか１項記載のキット。
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