JP4231928B2 - 氷核蛋白質の配列を含む不凍蛋白質 - Google Patents

Description

本発明は、氷核蛋白質の繰り返し配列の一部を利用して設計し、新たに調製して得られた不凍蛋白質またはペプチドに関するもので、さらに該蛋白質またはペプチドの製造方法、その用途、該蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および該ベクターを含む形質転換体に関する。

不凍蛋白質は、１）温度ヒステリシス、２）氷の再結晶阻害、３）氷結晶形状の制御等の特性を示すため、保冷により周囲の水分子が付着再結晶することで風味や味が損なわれるアイスクリームへの添加や、細胞や臓器の冷凍保存剤に用いることが提案されている（Ｇｒｅｆｆｉｔｈ Ｍ ａｎｄ Ｅｗａｒｔ ＫＶ，１９９５．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅ １３：３７５−４０２）。また、氷スラリーを使用する冷熱供給システムまたは冷熱蓄熱等において、氷の再結晶による配管系の閉塞を解消し得る有効な添加剤としても期待されている。これまでは、動植物由来の不凍蛋白質を用いてアイスクリーム等の冷凍食品の品質保持、血液や細胞、卵子や精子、移植臓器の冷凍保存耐性の向上、冷熱供給システムまたは冷熱蓄熱等への応用が試みられている。
しかし、現状では不凍蛋白質類は、極地方に生息する特定の魚種にしか見いだされておらず、また、冬季間にしか大量には発現されないので、年間を通して安定にかつ大量に生産することができない。また、魚類からの不凍蛋白質の回収においては漁獲した時期および場所、ならびに個体により不凍蛋白質の発現量が異なるためにロット間の品質のばらつきを生じる等の問題がある。
前述のとおり不凍蛋白質は魚や菌類など多くの生物から発見されている。これらの中でも特に幅広く研究が行われている不凍蛋白質として、北極海や南極海に生息する魚類由来の不凍蛋白質が挙げられる。
不凍蛋白質における、１）温度ヒステリシス、２）氷の再結晶阻害、３）氷結晶形状の制御等の特性は、不凍蛋白質が氷表面に結合することにより新たな水分子の結合を阻害し氷核の成長を妨げることによるものと考えられている。そして、魚類由来の不凍蛋白質はその構造により４種類に分類されている。Ｉ型の不凍蛋白質はＡｌａ残基を多く含みＴｈｒ残基とＡｓｐ残基が等間隔で配置されたアルファ・ヘリックス型の蛋白質である。ＩＩ型の不凍蛋白質はジスルフィド結合を含みＣ型−レクチン様の蛋白質である。ＩＩＩ型の不凍蛋白質は特徴的な構造モチーフから成る球状蛋白質である。ＩＶ型の不凍蛋白質はＧｌｎ残基を多く含み立体構造未知の蛋白質である。また、近年明らかにされたチャイロコメノゴミムシダマシ由来の不凍蛋白質（Ｌｉｏｕ Ｙ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ，４０６：３２２−３２４；Ｇｒａｅｔｈｅｒ ＳＰ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ．４０６：３２５−３２８）は、ベータ・シート構造からなる蛋白質である。このように、不凍蛋白質の構造にはバリエーションがあり、このことが不凍蛋白質の氷結晶結合とその成長抑制メカニズムの理解を困難にしている。
不凍蛋白質が氷の結晶成長を抑制するのに対して、氷核蛋白質は氷の結晶成長を促進する蛋白質である。このため、氷核蛋白質と不凍蛋白質はともに凍結状態にある水分子と結合できる構造を有すると考えられている。氷核菌の一種であるシュウドモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の氷核蛋白質はおよそ１２００残基の膜蛋白質であり、Ｎ末端領域（〜１９ｋＤａ）、中心領域（〜９４ｋＤａ）、Ｃ末端領域（〜７ｋＤａ）の３つの領域から構成される。これら３つの領域のうち、中心領域は特徴的な繰り返しアミノ酸配列から構成されており、この配列が氷結晶との結合に関わる部位と考えられている（Ａｂｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５８：２９７−３００；Ｇｒｅｅｎ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，２１５，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１５：１６５−１７２；Ｃｏｒｏｔｔｏ ＬＶ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＥＭＢＯ Ｊ．，５：２３１−２３６）。従って、本発明者らは、この氷核蛋白質の中心領域の配列を参考にして不凍蛋白質と同程度の大きさをもつペプチドを人工的に合成した場合、そのペプチドは、不凍蛋白質のような氷結晶成長抑制機能を有すると考えた。
これまで、主に植物、魚類由来の不凍蛋白質を用いてアイスクリーム等の冷凍食品の品質保持、細胞の冷凍保存耐性の向上が試みられてきたが実用化には至っていない。また、冷熱供給システム、冷熱蓄熱等を含め、その期待される有効性の高さにもかかわらず実用化に結びつかない主な理由は、不凍蛋白質が北極や南極に生息する魚類の血液等から得られる極めて高価な抽出物であること、およびこれらを安定的に生産する技術が存在しないことである。

本発明は、このような従来の問題を解決しようとするものであり、遺伝子発現、化学合成などにより、年間を通じて安定的に生産可能であって、不凍能力を有する蛋白質またはペプチドを新たに提供するものである。
かかる状況において、本発明者らは、ベーター・シート構造から構成される不凍蛋白質の片面に−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−のアミノ酸配列からなる部分が存在し、更にこのＴｈｒの水酸基が氷結晶面と水素結合を形成できる位置に規則的に配置されているという知見を基に、−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−の配列をふくむ蛋白質が他に存在するか否かを検討してきた。その結果、−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−の配列が氷核蛋白質の中心領域に存在することを見出した。この領域の配列を含むようなペプチドを遺伝子工学的手法により合成し、得られたペプチドが実際に不凍機能を有することを確認して、本発明を完成させるに至ったものである。
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
（１）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、不凍機能を有する蛋白質またはペプチド。
（２）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、不凍機能を有する蛋白質またはペプチド。
（３）配列番号１２または１３で表されるアミノ配列が複数回繰り返されているアミノ酸配列を含む（２）に記載の蛋白質またはペプチド。
（４）次の（Ａ）または（Ｂ）で表される蛋白質またはペプチド。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質またはペプチド。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有する蛋白質またはペプチド。
（５）氷核蛋白質における繰り返しアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる不凍機能を有する蛋白質またはペプチド。
（６）氷核蛋白質を化学的または生化学的に部分分解することを含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の蛋白質またはペプチドの製造方法。
（７）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ断片。
（８）（７）に記載のＤＮＡ断片を含むベクター。
（９）ベクターが発現ベクターである（８）に記載のベクター。
（１０）（８）〜（９）のいずれか１項に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
（１１）宿主が大腸菌である（１０）に記載の形質転換体。
（１２）（１０）または（１１）に記載の形質転換体を培養して不凍機能を有する蛋白質またはペプチドを産生せしめ、該蛋白質またはペプチドを採取することを特徴とする不凍機能を有する蛋白質またはペプチドの製造方法。
（１３）蛋白質またはペプチドをペプチド合成機により化学的に合成することを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の蛋白質またはペプチドの製造方法。
（１４）（１）〜（５）のいずれかに記載の蛋白質またはペプチドを含むことを特徴とする氷再結晶防止剤または凝固点降下剤。
（１５）（１）〜（５）のいずれかに記載の蛋白質またはペプチドを含むことを特徴とする氷スラリー。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
まず、不凍蛋白質または不凍ペプチドの機能について述べる。ここで、ペプチドとは、アミノ酸が２個以上ペプチド結合で連結した物質のことであり（岩波書店発行「理化学辞典」（第５版）、第１２５４頁、右欄（１９９８年２月２０日））、蛋白質もペプチドの一種である。ここでは、慣例に従い、３０残基程度の小さいペプチドをペプチドと称し、それ以上の大きなペプチドを蛋白質と称することにする。すなわち、不凍能力を有する蛋白質を不凍蛋白質と呼び、不凍能力を有するペプチドを不凍ペプチド呼んで区別する。また、簡略化の為に、これらをまとめて「不凍蛋白質類」と呼称する。
通常の場合、氷結晶は、水溶液中において氷核が表れると、まず扁平な六角の板状に成長する。板状平面に対し垂直方向への成長は、板状平面方向に対する成長に比べ１００倍程度遅い。これに対して、不凍蛋白質（ＡＦＰ）が存在すると円盤平面方向への氷晶の成長は阻止され、最初に形成された板状体を基底面として、この基底面に対し垂直方向に、順次、より小さい板状体が積み重ねられていき、最終的には図１に示すようなピラミッドを二つ重ねたバイピラミッド型の氷晶にゆっくりと成長していく。
したがって、注目する検体中にＡＦＰが存在している場合に限り、検体液を０℃以下にした場合、その検体液中には図１に示すようなバイピラミッド型氷結晶、結晶学的には六方両錐体とよばれる氷結晶が顕微鏡下に観測される。ＡＦＰが有する氷結晶上の１２枚の氷層平面に特異的に結合する能力の結果として、このようなバイピラミッド型氷結晶が生成する。このことが、巨視的には、検体の非凍結現象（不凍活性）として観測される。この現象は、浸透圧計（オスモメーター）を用いることにより検体液の凝固点降下または温度ヒステリシスとして定量化することもできる。凝固点降下の測定法を用いて不凍活性を評価する為には、高純度のＡＦＰの水溶液を得る必要がある。これに対してバイピラミダル氷結晶観測による不凍活性評価法は、ＡＦＰさえ存在していれば観測される。つまり、検体すなわち注目する蛋白質の水溶液中にＡＦＰが存在するか否かを評価する為のもっとも簡便で迅速な手法は、検体液のバイピラミッド型氷結晶を観測することである。
チャイロコメノゴミムシダマシ由来のベーター・シート型不凍蛋白質の構造モデルを図２に示し、同蛋白質の氷結晶面結合モデルを図３に示す。これらの分子表面には−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−なる氷結晶結合部位が存在する。この面は氷結晶の表面と相補的な構造を有し、Ｔｈｒの水酸基は氷結晶面上に規則的に配列する酸素原子との間で水素結合を形成する。図４および配列番号１４に、グラム陰性菌の一種であるシュウドモナス・シリンガエが有する氷核蛋白質のアミノ酸配列を示す。該氷核蛋白質は分子量約１２０ｋＤａの膜蛋白質であり、Ｎ末端領域（〜１９ｋＤａ）、中心領域（〜９４ｋＤａ）、Ｃ末端領域（〜７ｋＤａ）の３つの領域から構成されている。なお、これらの各アミノ酸配列は、図４のほか配列表の配列番号１〜３にも記載した（Ｎ末端領域−配列番号１、中心領域−配列番号２、Ｃ末端領域−配列番号３）。
図４の中心領域のアミノ酸配列から明らかなように、氷核蛋白質の中心領域においては、４８アミノ酸残基からなる同一または類似する配列が２０回繰り返されている繰り返しアミノ酸配列が存在する。また、この４８アミノ酸残基の繰り返しは、１６アミノ酸残基（配列番号１３）の３回の繰り返しから構成されている。この配列の中の配列番号１２で表されるアミノ酸配列は、チャイロコメノゴミムシダマシ由来不凍蛋白質の氷結晶結合に関与するアミノ酸配列である−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−を含んでいる（図４中の２重下線部）。
本発明者は、上記の知見に基づき、氷核蛋白質の中心領域の−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−を含むアミノ酸配列部分が、チャイロコメノゴミムシダマシ由来の不凍蛋白質と同様に、氷結晶表面に結合できるのではないかと予測した。この予測に基づき、図４中の一重下線部の９６アミノ酸残基からなる配列を有する蛋白質（ＩＮＰ９６；配列番号４に記載）を遺伝子組み換え手法を用いて合成した。この９６残基の合成蛋白質の水溶液中には、図１０に示すように、バイピラミッド型の氷結晶が生成した。こうして、氷核蛋白質の中心領域を構成する配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、不凍機能を有することが示された。
したがって、本発明における蛋白質は、少なくとも配列番号１２で表されるアミノ酸配列、または配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有し、かつ不凍機能を有する蛋白質またはペプチドを包含し、さらには配列番号１３で表されるアミノ酸配列が複数回繰り返されている蛋白質またはペプチド、および配列表の配列番号４に示される上記９６アミノ酸残基からなる蛋白質を包含する。また。この９６アミノ酸残基からなる蛋白質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたものであっても、不凍機能を有する蛋白質は本発明に含まれる。
例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列の１〜７個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失してもよく、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列の１〜７個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が付加してもよく、または、配列番号４で表されるアミノ酸配列の１〜７個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていてもよい。
図５と配列番号１５および図６と配列番号１６はチャイロコメノゴミムシダマシ由来不凍蛋白質およびＩＮＰ９６の配列を示すが、どちらの蛋白質においても−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−の配列が４回繰り返されていることがわかる。また、近年の研究から氷結晶と不凍蛋白質の結合において、不凍蛋白質と氷結晶面上の酸素原子との間の水素結合よりは、むしろ氷結晶面と不凍蛋白質表面の形状の相補性の方が優性であることが示されており、不凍蛋白質の氷結晶結合面に存在する水素結合性残基をＶａｌに置換しても不凍活性はほとんど変化しないことが示されている（Ｈａｙｍｅｔ ＡＤＪ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４３０：３０１−３０６；Ｃｈａｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１４６５２−１４６６０）。それゆえ、−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−の配列中のＴｈｒをＶａｌに置換しても−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−の場合と同様の活性を示す。また、Ｓｐｒｕｃｅ Ｂｕｄｗｏｒｍにおいては配列中に含まれる−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−（ＴｈｒをＶａｌに置換されているものも含む）の回数が４〜６回のアイソマーが数種類見つかっており（Ｄｏｕｃｅｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７：６０８２−６０８８；Ｌｅｉｎａｌａ ＥＫ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３３３４９−３３３５２）、それらがいずれも不凍活性を有していることが示されており、−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−（ＴｈｒをＶａｌに置換されているものも含む）の回数が４回に限定されたものではなく、複数回繰り返されていれば不凍活性を有することが示されている。また、−Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−（ＴｈｒをＶａｌに置換されているものも含む）の回数を増やすことで不凍活性が強くなることが示されており（Ｄｏｕｃｅｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７：６０８２−６０８８；Ｌｅｉｎａｌａ ＥＫ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３３３４９−３３３５２）、配列番号１３で表されるアミノ酸配列の繰り返しの回数を変えることで、任意の強さの不凍活性を有する不凍蛋白質の作成が可能である。
これら蛋白質またはペプチドを製造するには、常法の遺伝子組み換え技術を用いることができる。すなわち、これら蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを発現ベクターに導入し、このベクターを用いて大腸菌等の適当な宿主を形質転換し、この形質転換体を培養することにより上記不凍機能を有する蛋白質またはペプチドを得ることができる。
また、他の製造方法としては、ペプチド合成機を用いて本発明の蛋白質またはペプチドを合成してもよいし、氷核蛋白質またはそのＣ末端ドメインペプチダーゼまたは酸、アルカリ等の加水分解試薬を用いて限定的に部分分解することによっても製造しうる。なお、この部分分解を行う場合においては、不凍機能を有する蛋白質のほかに不凍機能を有しないペプチドも同時に生成しうるが、少なくとも一定長以上の長さを有し、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は不凍機能を有する蛋白質と見なしうる。該蛋白質を常法により精製してもよいが、これ以外の蛋白質またはペプチドを含有していてもよく、特に精製しなくとも不凍機能を発揮しうる。
この際、得られる蛋白質等が不凍機能を有するか否かは、上記したように、これら蛋白質等の水溶液において、凍結温度で上記バイピラミッド型氷結晶の有無を観察することにより、簡単迅速にスクリーニングすることができる。ＩＮＰ９６の不凍活性は、再結晶阻害活性を顕微鏡で観察すること、または、凝固点降下度を氷点降下法浸透圧計で測定することにより確認できる。
また、本発明の不凍蛋白質またはペプチドは、前述したように、氷の再結晶化防止剤ないしは凝固点降下剤として使用できる。具体的な用途としては、例えばアイスクリームまたは冷凍食品などに混入することによりその品質を持続させるために使用できる。さらに、近年、エネルギー密度が大きい氷スラリーを熱媒体として使用する冷熱供給システムまたは冷熱蓄熱等が提案されているが、これらにおいては、氷の再結晶による配管系の閉塞の問題があり、本発明の不凍蛋白質は氷の再結晶化を有効に防ぐものであるから、この問題を解決するために有望な手段となりうる。このほか卵子や精子などの細胞の低温長期保存も応用技術として期待できる。
また、本発明の不凍蛋白質遺伝子の応用としては植物および魚類などへの不凍蛋白質遺伝子の組込みにより、それらの耐冷性を向上させることが期待される。

図１は、バイピラミッド型氷結晶の模式図である。
図２は、チャイロコメノゴミムシダマシ由来不凍蛋白質の立体構造モデルを示した図である。
図３は、チャイロコメノゴミムシダマシ由来不凍蛋白質の氷結晶面結合モデルを示した図である。
図４は、氷核蛋白質ｉｎａＺのＮ末端領域、中心領域およびＣ末端領域の各アミノ酸配列、ならびに該中心領域中のＩＮＰ９６部分（下線部）を示す図である。
図５は、ＩＮＦ９６のアミノ酸配列を示す図である。下線部はＴＸＴ配列の部分を示す。
図６は、チャイロコメノゴミムシダマシ由来不凍蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。下線部はＴＸＴ配列の部分を示す。
図７は、ＩＮＰ９６のＤＮＡ配列を示す図である。
図８は、キチンカラムにおけるＩＮＰ９６の溶出パターンを示すクロマトグラムである。
図９は、キチンカラムにおけるＩＮＰ９６の溶出フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
図１０は、ＩＮＰ９６の９ｍｇ／ｍｌ水溶液について観測されたバイピラミッド型氷結晶の写真である。
図１１は、ニワトリ卵白リゾチームとＩＮＰ９６についての凝固点の濃度依存性のの測定結果を示す図である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００３−０３８７５１号の明細書に記載された内容を包含する。

以下、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれにより限定されるものではない。
実施例１ 不凍活性の確認
（１）検体試料（不凍蛋白質ＩＮＰ９６の調製）
（ａ）プラスミドｐＴＹＢ１２ＩＮＰ９６の調製
まずＩＮＰ９６をコードするＤＮＡをデザインした。氷核蛋白質の繰り返し配列中に現れる９６残基のアミノ酸配列をそれに対応する塩基配列に変換した。この際、大腸菌の繁用コドンを参考にした（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，ＪＬ，Ｈａｌｌ，ＢＤ，Ｃｏｄｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，３０２６−３０３１（１９８２））。このようにデザインしたＩＮＰ９６のアミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡの塩基配列を図７、配列番号１７および配列番号５に示す。このＤＮＡを全合成することは困難であったため、互いに一部相補的な４本のＤＮＡに分割し、ＤＮＡ自動合成機によってＩＮＰ９６ａａ１ｆ（配列番号６）、ＩＮＰ９６ａａ１ｒ（配列番号７）、ＩＮＰ９６ａａ２ｆ（配列番号８）およびＩＮＰ９６ａａ２ｒ（配列番号９）を合成した。
次いで、これら４本の合成ＤＮＡをその相補的領域でアニールさせると共に、結合させるためにＰＣＲ反応を行った。この反応は、ＩＮＰ９６ａａ１ｆとＩＮＰ９６ａａ２ｒ ６００ｎＭ、ＩＮＰ９６ａａ１ｒとＩＮＰ９６ａａ２ｆ １ｎＭ、ｄＮＴＰ（４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液）２００ｍＭ、エクスパンド・ハイ・ヒィデリティＰＣＲシステム（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｒｏｃｈｅ）に添付されたバッファー（１Ｘ）、エクスパンド・ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ ＨｉＦｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１．３Ｕを含む反応溶液５０ｍｌで行った。この反応溶液を０．２ｍｌのＰＣＲ反応用チューブに６本作り、タカラＰＣＲサーマル サイクラーＭＰ（Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ）を用いて、第一ステップ：９４℃で２分、第二ステップ：９４℃で３０秒（変性）、スロープを設定して１分かけて６５℃まで温度を下げ、６５℃で３０秒（アニーリング）、７２℃で１．５分（伸長）のサイクルを３５回、第三ステップ：７２℃で５分でＰＣＲ反応を行った。
次いで互いに連結させることによって作製した二本鎖ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）と連結し、該ベクターを用いて大腸菌ＤＨ５ａ（（独）産業技術総合研究所・生物機能工学研究部門で保存）を形質転換した。１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．０２％ Ｘ−Ｇａｌ、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートに形質転換体を塗布し、３７℃でおよそ２０時間培養した。出現した白色のコロニーの内８コロニーを１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌで３７℃で一晩試験管で培養した後、クオンタムプレプ・プラスミド・ミニプレプ・キット（ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素による切断パターンから目的のＤＮＡを含んでいると思われるプラスミドを保有した形質転換体３個を判別した。これらについて、ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディー・リアクション・キット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）ｖｅｒ．２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を確認した。その結果、合成一本鎖ＤＮＡ中の合成ミスまたはＰＣＲ中の誤りによると考えられる塩基置換が認められたので、これを２回目のＰＣＲによって修正した。
２回目のＰＣＲ反応に利用したプライマーの配列はＩＮＰ９６ｆ２（配列番号１０）およびＩＮＰ９６ｒ２（配列番号１１）である。
このＰＣＲ反応では、ＰＣＲ反応中にエラーが起こる可能性をできるだけ低くするためにエラー頻度が低いことが知られているＫＯＤポリメラーゼ（ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（東洋紡社）を用いた。ＰＣＲは５０００倍に希釈した上記のプラスミド溶液、ｄＮＴＰ ２００ｍＭ、塩化マグネシウム１ｍＭ、ＩＮＰ９６ｆ２、ＩＮＰ９６ｒ２それぞれ３００ｎＭ、ＫＯＤ−プラスー（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−）に添付されたバッファー（１Ｘ）、ＫＯＤ−プラス−ポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１Ｕを含む反応溶液５０ｍｌで行った。この反応溶液を０．２ｍｌのＰＣＲ反応用チューブに２本作り、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ ＭＰを用いて、第一ステップ：９４℃で２分、第二ステップ：９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分（伸長）のサイクルを３０回、第三ステップ：６８℃で５分でＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応液を用いてヌシーブＧＴＧアガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ）（タカラ社）を用いたアガロース電気泳動を行い、およそ３００ｂｐの位置に出現したＤＮＡのバンドをアガロースゲルから回収した。次いで、回収したＤＮＡを、あらかじめＥｃｏ ＲＶで切断したｐＺＥｒＯ２ベクター（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）と連結し、該ベクターを用いて大腸菌ＤＨ５ａを形質転換した。１ｍＭ ＩＰＴＧ、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＳ−ＬＢ（１％トリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎ）、０．５％イースト・エキストラクト（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）、０．５％塩化ナトリウム）プレートに形質転換体を塗布し、３７℃でおよそ２０時間培養した。出現したコロニーの内８コロニーを５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＳ−ＬＢ培地３ｍｌで３７℃で一晩試験管で培養した後、クオンタムプレプ・プラスミド・ミニプレプ・キット（ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素による切断パターンから目的のＤＮＡを含んでいると思われるプラスミドを保有した形質転換体３個を判別した。これらについて、ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディー・リアクション・キットｖｅｒ．２．０を用いて塩基配列を確認した。その結果、図７に示した目的の塩基配列を有するＤＮＡが挿入されたプラスミド（ｐＺＥｒＯ２ＩＮＰ９６）を得ることができた。次に該プラスミドを保持する形質転換体を５０ｍｌの培養液で培養し、クオンタムプレプ・プラスミド・ミニプレプ・キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてプラスミドを調製した。
次に、得られたＤＮＡを用いてＩＮＰ９６を大腸菌で発現させるために、ＩＭＰＡＣＴ−ＣＮシステム（ｓｙｓｔｅｍ ＩＭＰＡＣＴ−ＣＮ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いた。該システムでは、目的の蛋白質をキチン結合蛋白質、プロテアーゼであるインテインとの融合蛋白質として生産する。このため、該システムで用いられる発現ベクターにはあらかじめ、発現蛋白質の精製を容易にするキチン結合ドメインをコードする塩基配列、および目的の蛋白質を切り離すための自己消化プロテアーゼ・インテインをコードする塩基配列が組み込まれてある。ｐＺＥｒＯ２ＩＮＰ９６をＮｄｅ ＩとＥｃｏ ＲＩで切断し、およそ３００ｂｐのＩＮＰ９６をコードするＤＮＡをヌシーブＧＴＧアガロースを用いたアガロース電気泳動により分離・回収した。一方、該システムに含まれている発現ベクターｐＴＹＢ１２をＮｄｅ ＩとＥｃｏ ＲＩで切断した。両者をタカラ・ＤＮＡ・リゲイション・キット（Ｔａｋａｒａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（タカラ社）を用いて、添付のプロトコルに従って連結し、大腸菌ＤＨ５ａを形質転換した。１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートに形質転換体を塗布し、３７℃でおよそ１８時間培養した。出現したコロニーの内１８コロニーを１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌで３７℃で一晩試験管で培養した後、クオンタムプレプ・プラスミド・ミニプレプ・キットを用いてプラスミドを調製し、制限酵素による切断パターンから目的のＤＮＡを含んでいると思われるプラスミドを保有した形質転換体１０個を判別した。これらのうち１つの形質転換体を５０ｍｌの培養液で培養し、クオンタムプレプ・プラスミド・ミニプレプ・キットを用いてプラスミドを調製した。さらに、ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レデイー・リアクション・キットｖｅｒ．２．０を用いて塩基配列を確認した。その結果、図７に示した目的の塩基配列を有するＤＮＡがｐＴＹＢ１２に挿入されたプラスミド（ｐＴＹＢ１２ＩＮＰ９６）を得ることができた。
（ｂ）大腸菌によるＩＮＰ９６の発現
ＩＮＰ９６はキチン結合ドメインおよびインテインとの融合蛋白質として大腸菌体内に発現させた。プラスミドｐＴＹＢ１２ＩＮＰ９６で大腸菌ＥＲ２５６６（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）を形質転換した。プラスミドｐＹＴ１２ＩＮＰ９６にはアンピシリン耐性遺伝子が導入されているため、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地に大腸菌を広げ、一晩３７℃でインキュベートすることで形質転換体を選択した。形成されたコロニーの一つを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地１５ｍｌに植え２８℃で一晩培養した。
この培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシドを含んだＴＢ培地１．５ｌに植え継ぎし、さらに２８℃で一晩培養した。培養液を３６００×ｇ、４℃で１５分遠心分離し、菌体を回収した。菌体を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニナトリウム（ｐＨ８．０）に懸濁し、氷中で超音波破砕した。これを１１９００×ｇ、４℃で６０分遠心分離し、可溶性画分と不溶性画分に分離した。
（ｃ）ＩＮＰ９６の精製
可溶性画分から抽出したキチン結合ドメインおよびインテインとの融合蛋白質の状態のＩＮＰ９６は２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニナトリウム／０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ８．０）で緩衝化したキチンカラムに吸着させた。カラムボリュームの２０倍量の２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニナトリウム／０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ８．０）を流し、その後、カラムボリュームの３倍量の２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニナトリウム／０．５Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ β−メルカプトエタノール水溶液（ｐＨ８．０）を流し、室温で４８時間以上放置し、ＩＮＰ９６と、キチン結合ドメインおよびインテインからなるタグの部分とを切断した。その後、３倍量の２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニナトリウム／０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ８．０）を流しＩＮＰ９６を溶出させた。この際、タグが切断されたＩＮＰ９６のみが溶出してくる。図８にクロマトグラムを示した。各フラクッションのボリュームは約１．５〜２ｍｌである。
（ｄ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
一般的な手順に従い、電気泳動装置（ＡＴＴＯ）用いて精製したＩＮＰ９６を１５％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。分子量測定のためブロード・レンジＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓｔａｎｄａｒｄ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を同時に泳動した。サンプル緩衝液は、０．０６５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）／２％ドデシル硫酸ナトリウム／１０％ショ糖／５％β−メルカプトエタノール／０．００１％ブロモフェノールブルーを用いた。濃縮ゲルは０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．７５ｍｌ、３０％アクリルアミド／ビス（３７．５：１）混合液０．４５ｍｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム０．１２ｍｌ、蒸留水１．７８ｍｌを混合して作製し、分離ゲルは１．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２．２５ｍｌ、３０％アクリルアミド／ビス（３７．５：１）混合液４．５ｍｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム０．３６ｍｌ、蒸留水１．８９ｍｌを混合して作製した。泳動用緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．０３ｇ、グリシン１４．４ｇおよびドデシル硫酸ナトリウム１ｇを合計１１の蒸留水中に溶解させたものを用いた。ゲルの染色はメタノール２０ｍｌ、硫酸アンモニウム１２．５ｇ、リン酸２．５ｍｌ、０．０４％クマシーブリリアントブルーＧ−２５０を１００ｍｌの蒸留水の溶液に溶かした染色液を用いて一晩行い、蒸留水で脱染色した。図９より、分子量１１ＫＤａのＩＮＰ９６が純度高く精製されているのが確認できる。
（２）バイピラミダル氷結晶の観察
（ａ）ＩＮＰ９６を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニナトリウム／０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ８．０）に対して透析し、緩衝液置換を行った後に９ｍｇ／ｍｌになるまで限外濾過により濃縮を行った。なお、注目する検体液が不凍活性を有するか否かの評価は、わずか１ｕｌの液に対しても低温顕微鏡下でのバイピラミッド型氷結晶観察実験をすることで行い得る。
（ｂ）上記のように調製した試料溶液１ｕｌをライカ社製ＤＭＬＢ１００型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢ １００ ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）の直径１６ｍｍのカバーガラス上に滴下した。これをそのままもう１枚の直径１２．５ｍｍのカバーガラスによりはさみ、これをＤＭＬＢ１００型顕微鏡のステージ部に設置した冷却箱内にセットした。冷却箱の上下には直径１ｍｍの光取り入れ穴をあけ、顕微鏡光源からの光は下側の穴から箱内を通り上側の穴を抜けてレンズに入光させるようにした。この上下の穴により規定される光軸上に検体液をセットすることで、光軸上にある検体液中の物質を顕微鏡観察することができる。検体液がセットされた冷却箱の中の温度は、リンカム社製ＬＫ６００温度制御装置（Ｌｉｎｋａｍ ＬＫ６００ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）により＋／−０．１℃の誤差で制御される。室温下で検体液をセットした後、温度制御装置により冷却箱内の温度を毎秒０．２℃で−２２℃まで下降させた。およそ−１４℃から−２２℃の間の温度のどこかで検体液の全体が凍結する。凍結の後に毎秒０．２℃で冷却箱内温度を上昇させ零度で上昇を停止し、そのまま１〜１０秒程度の間、−３℃を維持していると凍結が溶け、無数のきれつの入った氷結晶状態を経たのちに、数えられる程度の氷結晶が水中に浮かぶのが観測された。その瞬間に、冷却箱内の温度を−２℃〜３℃程度に下降させて止め、氷結晶の形状を観察した。観察結果を図１０に示す。試験に使用したＩＮＰ９６においてバイピラミッド型の氷晶が観察され、この蛋白質は不凍活性を有することが確認された。
（ｃ）２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニナトリウム／０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ８．０）に対して透析し、緩衝液置換を行った後に１９ｍｇ／ｍｌになるまで限外濾過により濃縮を行った。様々な濃度に希釈したＩＮＰ９６のサンプル５０μｌを用いて総浸透圧値を氷点降下法浸透圧計（ＶＯＧＥＬ）を用いて測定し、凝固点を算出した（図１１）。
図１１において対照化学物質であるニワトリ卵白リゾチームは０．０２℃の範囲内で直線的な凝固点降下を示しており、これは一般的な化学物質のモル凝固点降下現象に起因している。一方、ＩＮＰ９６については０．１２℃までの非直線的な凝固点降下を示しており、これは水溶液中の不凍蛋白質が特異的に氷結晶表面と相互作用をする場合にのみ観測される。この実験により、ＩＮＰ９６が不凍蛋白質様の凝固点降下活性を示すことが確認された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。

産業上の利用の可能性

本発明は、氷核蛋白質の構造に基づいて、不凍蛋白質を設計、創出してそれらを供給するものである。そして、本発明においては不凍蛋白質または不凍ペプチドを、ペプチド合成法、遺伝子工学または氷核蛋白質の部分分解等により生産することにより、これらを容易にかつ大量に供給できる。さらに、季節による品質のばらつきがなく、一定の品質の不凍蛋白質または不凍ペプチドを供給することができる。したがって、本発明は、不凍蛋白質または不凍ペプチドの安定的な供給、ならびに不凍蛋白質またはペプチドについての利用促進および応用研究の発展に大いに寄与するものである。

配列番号５：ＩＮＰ９６ａａをコードＤＮＡ配列
配列番号６：ＩＮＰ９６ａａ１ｆをコードＤＮＡ配列を構築するためのプライマー
配列番号７：ＩＮＰ９６ａａ１ｒをコードＤＮＡ配列を構築するためのプライマー
配列番号８：ＩＮＰ９６ａａ２ｆをコードＤＮＡ配列を構築するためのプライマー
配列番号９：ＩＮＰ９６ａａ２ｒをコードＤＮＡ配列を構築するためのプライマー
配列番号１０：ＩＮＰ９６ｆ２をコードＤＮＡ配列を構築するためのプライマー
配列番号１１：ＩＮＰ９６ｒ２をコードＤＮＡ配列を構築するためのプライマー
配列番号１２：Ｘａａは任意のアミノ酸残基を示す。
配列番号１３：Ｘａａは任意のアミノ酸残基を示す。
配列番号１５：合成アミノ酸配列
配列番号１６：合成アミノ酸配列
配列番号１７：合成配列

Claims (11)

1. 次の（Ａ）または（Ｂ）で表される蛋白質またはペプチド。
   （Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質またはペプチド。
   （Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有する蛋白質またはペプチド。
2. 氷核蛋白質を化学的または生化学的に部分分解することを含む、請求の範囲第１項に記載の蛋白質またはペプチドの製造方法。
3. 請求の範囲第１項に記載の蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ断片。
4. 請求の範囲第３項に記載のＤＮＡ断片を含むベクター。
5. ベクターが発現ベクターである請求の範囲第４項に記載のベクター。
6. 請求の範囲第４項または第５項に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
7. 宿主が大腸菌である請求の範囲第６項に記載の形質転換体。
8. 請求の範囲第６項または第７項に記載の形質転換体を培養して不凍機能を有する蛋白質またはペプチドを産生せしめ、該蛋白質またはペプチドを採取することを特徴とする不凍機能を有する蛋白質またはペプチドの製造方法。
9. 蛋白質またはペプチドをペプチド合成機により化学的に合成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の蛋白質またはペプチドの製造方法。
10. 請求の範囲第１項に記載の蛋白質またはペプチドを含むことを特徴とする氷再結晶防止剤または凝固点降下剤。
11. 請求の範囲第１項に記載の蛋白質またはペプチドを含むことを特徴とする氷スラリー。

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