JP4226476B2 - 環状化可能プローブを用いた複数の標的配列の分析と検出 - Google Patents

Description

発明の分野

本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。具体的には、本発明は、ヌクレオチド配列を高スループットに分離及び検出する方法、一塩基多型等の標的配列の識別と同定における該方法の使用を提供する。本発明は、さらに、目的の標的配列にハイブリダイズすることができるプローブ、ライゲーションされたプローブを増幅するためのプライマー、多岐にわたる遺伝形質に関連するヌクレオチド配列や遺伝子の同定及び／又は検出におけるこれらのプローブとプライマーの使用、並びに本発明の方法で使用するのに適したプライマー及び／又はプローブのキットを提供する。

発明の背景

特定の核酸配列を検出することに対する関心が急速に高まりつつある。このような関心は、近年公開されたヒトゲノムのドラフトヌクレオチド配列やヒトゲノムおよび他の多くの生物のゲノム中に存在する多量の一塩基多型（ＳＮＰ）のみならず、ＡＦＬＰなどのマーカー技術から生じたものである。遺伝子中に存在する単一ヌクレオチド置換（および小さな挿入／欠失（インデル）など、その他のタイプの遺伝的多型）から多様な情報が得られるという認識も、このような関心の高まりにつながっている。現在では、これらの単一ヌクレオチド置換が、例えばヒトにおける極めて多くの一遺伝子および多遺伝子的遺伝病の主原因の一つであるか、あるいは、植物や家畜種の性能形質のような複雑な表現型の発生に関わっていることが一般に認識されている。このように、単一ヌクレオチド置換は、多くの場合、ヒト、植物、および動物種における重要な形質にも関連しており、少なくとも重要な形質の指標となる。

これらの単一ヌクレオチド置換およびインデルの解析によって、最も広義の医学及び農学に対して波及的な示唆を与える多くの価値ある情報がもたらされるであろう。例えば、このような発展によって患者に特異的な医療がもたらされると一般に想定されている。これらの遺伝的多型を解析するために、得られたデータの質を大きく損なわずに、高スループットに多数の試料と（主として）多数のＳＮＰを取り扱うことができる適切で、信頼性が高く、且つ迅速な方法がますます求められている。

現在でも、ＳＮＰ用の様々な高スループット検出プラットフォーム（蛍光光度計、ＤＮＡマイクロアレイ、質量分析計、キャピラリー電気泳動装置など）が存在するが、コスト効率の高い高スループット検出を実現する上での主たる制約は、現時点では、これらのプラットフォームを効率的に利用するために、ＳＮＰを無作為的に選択する強力かつ効率的な多重増幅技術が存在しないことであり、このために、これらの強力な検出プラットフォームが十分に活用できず、及び／又はデータポイント当りのコストが高くなっている。本明細書で使用する「スループット」とは、単位時間当たりに分析できる試料及び標的配列の数を表す相対的パラメータを意味する。

具体的には、ＰＣＲ技術等の一般的な増幅技術を用いて、単回増幅反応中に対応するプライマー対を加えることにより、限られた数の標的配列を増幅することが可能であるが、同時に増幅できる標的配列の数は少なく、各標的配列の増幅効率を同様にするためには、大規模な最適化を行う必要があるであろう。多重増幅を行うための解決策の一つは、全ての標的配列を増幅するために単一のプライマー対を用いることであるが、このためには、全ての標的が対応するプライマー結合部位を含有していなければならない。この原理は、ＡＦＬＰ技術の中に取り込まれている（ＥＰ−Ａ ０，５３４，８５８号）。ＡＦＬＰを用いれば、１以上の制限酵素による標的核酸（すなわち、全ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）の消化の後、アダプターをライゲーションすることによって、プライマー結合部位が生じる。ＡＦＬＰは、本質的に、標的核酸中に含有されている配列の無作為な選別を目標としている。ＡＦＬＰを用いると、増幅プライマーに対して完全に相補的なプライマー結合領域を含有する標的配列の数に応じて、事実上無限の数の標的配列を単回の反応で増幅できることが示されている。ＳＮＰ標的を選択するための非無作為法と組み合わせて増幅に単一プライマー対を使用し、高スループット検出プラットフォームを効率的に使用することを開拓すれば、ＳＮＰの遺伝子タイピングの効率が著しく増大すると思われるが、このような技術は未だ本分野において実現していない。

公知の配列を有する核酸を分析するために用いられる主要な方法の一つでは、２つのプローブを標的配列にアニーリングさせて、プローブが標的配列に隣接してハイブリダイズしたときに、プローブをライゲーションするという方法をとっている。特に、米国特許第４，９８８，６１７号（Ｌａｎｄｅｒｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．）には、ＯＬＡ方式（オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ）が記載されている。本文献は、公知の変異を有していると思われる公知の核酸配列の領域中の核酸配列を決定するための方法を開示している。変異を検出するために、決定すべき配列のセグメントのすぐ隣にアニールするように、オリゴヌクレオチドが選択される。選択したオリゴヌクレオチドプローブの一つは終末領域を有しており、終末領域のヌクレオチドの一つが公知の核酸配列中の対応する位置にある正常なヌクレオチド又は変異を受けたヌクレオチドのうち何れかと相補的である。正しく塩基対を形成し、互いにすぐ隣に位置したら、２つのプローブを共有結合で連結するリガーゼを与える。連結されたプローブの有無が、公知の配列及び／又は変異の存在の指標となる。

Ａｂｂｏｔらは、国際特許公開第９６／１５２７１号の中で、隣接プローブのハイブリダイゼーションとライゲーションを行う多重ライゲーション増幅手法を開発した。これらのプローブには、延長されたセグメントが付与されるが、Ａｂｂｏｔらによれば、セグメントの配列は重要でない。長さを意図的に異ならせることによって、ゲルを用いた技法で断片長を基礎とした区別を容易にすることを意図している。

国際特許公開第９７／４５５５９号（Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．）は、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を併用することによって、核酸配列の差を検出する方法を記載している。開示されているのは、対立遺伝子特異的なプローブのセットを標的配列にアニーリングさせた後、続いて、熱安定性リガーゼを用いてライゲーションを行い、その後、必要に応じて、ライゲーションを行わなかったプライマーをエキソヌクレアーゼにより除去する方法である。蛍光標識されたプライマーを用いて、ライゲーションされた産物を増幅することによって、蛍光標識された増幅産物が得られる。産物の検出は、サイズ若しくは電気泳動の移動度による分離か、又はアドレス可能なアレイを基礎として行われる。

増幅されたプローブの検出は、捕捉オリゴヌクレオチドを含有するアドレス可能な万能アレイ上で行われる。これらの捕捉オリゴヌクレオチドは、増幅されたプローブ中の所定領域にアニーリングすることができる領域（いわゆる、ＺＩＰ領域又はＺＩＰコード）を含有する。増幅された各プローブは異なるＺＩＰコードを含有しており、各ＺＩＰコードはアレー上の対応する捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。アレイ上の位置と併せて標識を検出することにより、試料中の標的配列の存在に関する情報が得られる。この方法によって、試料中に存在する多数の核酸配列の検出が可能となる。しかしながら、増幅されたプローブを検出するためのアレイのデザイン、検証、常用には、数多くの工程（ライゲーション、増幅、必要に応じて、増幅された物質の精製、アレイの製造、ハイブリダイゼーション、洗浄、スキャン、データの定量）が含まれており、その中には自動化が困難なもの（特に、ハイブリダイゼーションと洗浄）もある。従って、アレーを用いた検出は、多数の試料について多数のＳＮＰを解析するには、労力を要し、コストがかかる。

所定のセットに含まれるＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブが特有の長さの産物を生成し、このため、サイズに基づいて他の産物から区別できるようになることがある。増幅のために、プライマーのうちの一つが標識を含有しているプライマーセットが付与される。産物が区別できるようにするために、異なる標識を有する異なるプライマーを与えることもできる。

Ｂａｒａｎｙらによって記載された方法と様々な実施形態には、幾つかの欠点が見出される。大きな欠点の一つは、本方法は、原理的に、獲得したデータの質とプロセスの効率を損なわずに、信頼性のある確かな方法を用いて、短時間に多数の標的配列を測定するための真に高スループットなプロセスを提供するものではないということである。

より具体的には、Ｂａｒａｎｙらによって開示された手段及び方法の欠点の一つは、特に対立遺伝子特異的なプローブセットの長さに基づいて識別が為される場合に、多重処理能が制限されることに存する。相対的に小さな長さの相違のみによって区別可能な配列を識別することは、一般には容易でなく、所望の分解能を達成するためには、注意深く最適化した条件が必要となるであろう。さらに大きく長さが異なる配列を識別することは、一般に、これより容易である。これにより、同一試料中で分析できる配列数が増加するであろう。しかし、必要とされる長いヌクレオチドプローブを準備することが、さらなるハードルとなる。本分野では、加えたヌクレオチド当り約９８．５％の収率で、段階的な旧来の化学的オリゴヌクレオチド合成によって、合成ヌクレオチド配列が作製されている。長いプローブ（約６０ヌクレオチドを超える）を合成すると、一般に収率は低下し、合成によって作製した配列の信頼性と純度が問題となり得る。

国際特許公開第９７／４５５５９号やその他の文献に開示されているオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイに基づく方法のこのような欠点やその他の欠点に鑑み、本発明者らは、これらの文献中に記載された方法は、各々が多数の配列を含む多数の試料を取り扱うことができる高プロトコールに適合させるには好ましくないという結論に至った。

長いプローブを準備することに存する具体的な課題は、Ｓｃｈｏｕｔｅｎらによって解決された（国際特許公開第０１／６１０３３号）。国際特許公開第０１／６１０３３号は、ライゲーション−増幅アッセイで使用するための長いプローブの調製を開示している。彼らは、スラブゲル又はキャピラリー電気泳動を用いて長さを基礎として増幅産物を識別することに伴う問題を回避するために、従来の化学合成法によって得られるものよりもかなり長いを準備した。すなわち、ＯＬＡプローブが化学的手段によって合成されたときに、最大１ｋｂ長という検出ウィンドウ／分離能のうち、ごく一部のみを使用している。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの場合、現在の技術水準では、約１００−１５０塩基が事実上の上限なので、最大３００塩基対未満、多くの場合はこれよりずっと短い増幅産物が得られる（Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．参照）。このような長いプローブ（約１５０ヌクレオチド超）を化学的手段によって十分な純度と収率で生成することの困難さは、例えば、Ｍ１３ファージ等の適切な細胞中におけるＤＮＡポリメラーゼの作用による、インビボでの酵素的テンプレート誘導重合によってプローブを取得する方法を用い、Ｓｃｈｏｕｔｅｎらによって、克服された。

しかし、このような生物的プローブの製造と精製には、望ましい長さの変動を与えるＭ１３ファージを含有した適切な宿主細胞株を収集し、化学的に合成された短い複数のオリゴヌクレオチドをこのプロセスで使用することが必要であるため、それらの使用には極めて労力と時間を要し、このため、コストがかかり、高スループットアッセイの開発には適していない。さらに、相対的に長いプローブを使用し、増幅可能な標的配列間の長さの差を相対的に大きくすると、増幅効率に差が生じ、短い標的配列が優先されることがある。これは、データの総合的な質に悪影響を与え、真に高スループットな方法を開発する障害となる。このため、多重増幅を行った後、続いて、高スループット処理のために長さを基礎とした検出を行うための信頼性とコスト効率の高い解決策がなお求められている。

環状（南京錠）プローブをローリングサークル増幅（ＲＣＡ）等の等温増幅と組み合わせて用いるなどの本分野で提案されている他の解決法は、環状プローブのハイブリダイゼーション特性の向上とＲＣＡの等温特性故に、有益だと考えられている。

ローリングサークル増幅とは、ライゲーション又は連結された環状プローブに第一のプライマーをハイブリダイズさせる増幅法である。続いて、ストランド置換活性を有するポリメラーゼを用いてプライマーを伸長させると、連結された環状プローブが複数含まれた長いポリヌクレオチド鎖が形成される。このような連結されたプローブの長鎖コンカテマーは、続いて、ハイブリダイゼーションプローブを用いることによって検出される。これらのプローブには、標識を施すことができる。ライゲーションされたプローブは、コンカテマーのストランドにハイブリダイズした後、伸長される第二のプライマーのハイブリダイゼーションによって指数関数的に増幅させることができる。（指数関数的）ローリングサークル増幅（（Ｅ）ＲＣＡ）は、とりわけ、米国特許第５，８５４，０３３号、米国特許第６，１４３，４９５号、国際特許公開第９７／１９１９３号、「Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（３）：２２５−２３２（１９９８）」に記載されている。

Ｚｈａｎｇらの米国特許第５，８７６，９２４号、国際特許公開第９８／０４７４５号、及び国際特許公開９８／０４７４６号には、２つの隣接するプローブを用いたライゲーション反応が記載されており、前記プローブのうち１つは、ビオチン等の結合要素を有する捕捉プローブである。ライゲーション後に、ライゲーションされなかったプローブを取り除き、リガンド（ビオチン）結合成分を有する常磁性ビーズを用いて、ライゲートされた被捕捉プローブを検出する。Ｚｈａｎｇは、ＰＣＲプライマーをローリングサークル増幅に用いる環状プローブの増幅法であって、ストランド置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて、第一のプライマーの伸長から開始して、環状プローブの長いコンカテマーを生成する増幅法も開示している。続いて、第二のＰＣＲプライマーを前記長いコンカテマーにハイブリダイズさせ、これを伸長させることによって、コンカテマーの二度目の生成が行われ、指数関数的な増幅が促進される。検出は、一般に標識されたプローブのハイブリダイゼーションを基礎として行われる。

しかしながら、これらの方法は、高スループット様式にはあまり適していないことが明らかとなっている。理由の１つは、長さの識別を基礎とした高スループット法の場合には、（Ｅ）ＲＣＡの使用によって長いコンカテマーが形成されるということである。これらのコンカテマーは、高スループット検出に適していないので問題がある。

米国特許第６，２２１，６０３号は、制限部位を含有する環状プローブを開示している。本プローブは、（Ｅ）ＲＣＡを用いて増幅され、生じたコンカテマーは、制限部位において制限切断される。次いで、長さによって制限断片を分離し、検出する。分離と検出は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入できるＭｅｇａＢＡＣＥ装置等のキャピラリー電気泳動プラットフォーム上で行われる。検出のためには、増幅が行われている間に、標識されたｄＮＴＰを断片中に取り込ませてもよいし、染色又は標識された検出プローブによって断片を検出してもよい。しかしながら、制限酵素による部分消化は、本方法の信頼性に影響を及ぼすことがある。さらに、米国特許第６，２２１，６０３号に開示されている断片の標識法は、複数の色素を同時検出するＭｅｇａＢＡＣＥの性能を十分に活用することができない。

本発明者らは、その有利な点を維持するのみならず、前記技術を改善させながら、従来技術に存する課題を解決し、少なくとも欠点を小さくすることを目指した。従来技術に存するその他の課題や本発明によって与えられる解決策は、本明細書の記述、図面、及び様々な実施形態と実施例を通じて明らかとなるであろう。

発明の説明

本発明は、複数の配列の高スループットな分離および検出法に関する。本方法は、本分野において従来直面してきた多くの課題を解決する。より具体的には、本発明は、好ましくは複数の配列を含有する複数の試料の迅速且つ高スループットな分析が可能となる複式ライゲーション及び増幅アッセイを提供する。本発明は、長さの差と標識の組合せに基づいて、複数のヌクレオチド配列を高スループットに識別し検出する方法も提供する。本発明は、幾つかの方法の利点を兼ね備えると同時に、様々な技法に伴う欠点を回避することにより、信頼性と再現性が高く、高スループット検出法に適した標的配列を検出する改良法が提供される。

発明の詳細な説明

第一の側面において、本発明は、必要に応じて複数の試料中に存在する複数の標的配列を高スループットに分離及び検出する方法であって、各試料をライゲーション依存的な増幅アッセイに供することを備えた方法に関する。

前記方法は、好ましくは、試料中の少なくとも１つの標的配列（２）の有無を判定する方法であって、
（ａ）前記試料中の検出すべき各標的配列に対する少なくとも１つの環状プローブ（２６）を核酸試料に加える工程であって、前記プローブは標的配列の第一の部分（５）と相補的な第一の標的特異的区画（４）を５’末端に有し且つ前記標的配列の第二の部分（７）と相補的な第二の標的特異的区画（６）を３’末端に有しており、前記標的配列の前記第一及び第二の部分が互いに隣接した位置にあり、前記プローブは前記標的配列と実質的に非相補的なタグ区画（８、９）をさらに備え、該タグ区画はスタッファー配列（１０、１１）を備えてもよく、前記タグ区画が少なくとも１つのプライマー結合配列（１２、１３）を備える工程と、
（ｂ）前記環状プローブの前記第一及び第二の標的特異的区画を標的配列の前記第一及び第二の部分にアニールさせて、前記プローブの前記第一及び第二の標的特異的区画を前記標的配列上で隣接してアニールさせる工程と、
（ｃ）前記標的配列に隣接してアニールした前記第一及び第二の標的特異的区画を連結させる手段を与え、前記第一及び第二の標的特異的区画を連結させて、前記試料中の標的配列に対応する連結された環状プローブ（２８）を得る工程と、
（ｄ）第一のプライマー結合配列（１２）に相補的な第一のプライマー（１６）を含むプライマー対、ポリメラーゼ酵素、および必要に応じて第二のプライマー結合配列（１３）に相補的な第二のプライマー（１７）を提供する工程と、
（ｅ）得られた混合物を増幅して、前記連結された環状プローブを直鎖状にしたアンプリコン（２０）を含む増幅された試料（１９）を得る工程と、
（ｆ）前記対応するアンプリコンの有無を検出することによって、試料中に標的配列が存在するか否かを判定する工程と、を備えた方法である。

プローブ
本発明で用いられる環状オリゴヌクレオチドプローブは、試料中の各標的配列に対して工程（ａ）で与えられる単一の直鎖オリゴヌクレオチドプローブである。この単一の直鎖オリゴヌクレオチドプローブは、アニールされた相補的区画が連結されたときに、前記２つの標的特異的区画を結合させて、工程（ｃ）で環状化される単一分子を与える。このように、前記単一の直鎖プローブの末端には、標的に対して相補的な区画が各々存在している。末端に位置する前記相補的区画の間には、プライマー結合配列として機能することがある配列が介在しており、さらに、様々な長さのスタッファー配列が介在していることがある。環状プローブ中にこのような機能団を配置する場合の一例としては、（標的相補的区画１−スタッファー配列１、プライマー結合配列１−プライマー結合配列２−スタッファー配列２−標的相補的区画２）がある。当業者であれば、環状プローブを合成し、直鎖型として与えられること、及び適切な標的配列にアニーリングしながら、プローブの末端にある２つの相補的区画が連結された（ライゲーションされた）場合にのみ環状となることが理解できるであろう。このように、本明細書で使用する「環状プローブ」という用語は、標的配列依存的な連結（ライゲーション）によって環状化される直鎖分子を実際には意味する。本明細書においては、「連結された環状プローブ」という用語のみが、真正な環状型の分子を表す。

前記オリゴヌクレオチドプローブの相補的区画は、試料中の各標的配列に対してプローブ、好ましくは特異的プローブが与えられるように設計されており、前記プローブは、各々標的配列の一部に相補的な区画を両末端に含有し、標的配列の対応する相補的部分は互いに実質的に隣接した位置に配置される。環状オリゴヌクレオチドプローブの中では、標的配列の第一の部分と相補的な区画が５’末端に存在し、標的配列の第二の部分と相補的な区画が３’末端に存在する。このため、環状プローブが標的配列の相補的部分にアニールすると、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端は、オリゴヌクレオチドプローブの３’に実質的に隣接し、プローブの各末端はライゲーションされて、ホスホジエステル結合を形成し、環状プローブとなる。

両方の標的相補的区画が同一分子中に含有されているので、環状プローブはライゲーション工程（ｃ）において有利となる。特に、国際特許公開第９７／４５５５９号に開示されているような従来の直鎖プローブと比べて、このことは、２つの標的特異的区画が等モル量存在し、互いに近接していることを意味している。第一の標的相補的区画が標的にハイブリダイズすることによって、第二の標的相補的区画のハイブリダイゼーションが促進され、逆もまた同様なので、このようなプローブは、それぞれの標的配列にハイブリダイズする可能性が高い。さらに、第一のプローブと第二のプローブが同じ環状分子の一部であると、形成され得るライゲーション産物の組合せ数が少なくなるために、環状プローブの使用によって、異なる標的配列のプローブ間でライゲーションが行われるによって生じる誤ったライゲーション産物が形成される機会が減少する。

南京錠プローブの特徴、設計、構造、使用、及び利点に関する詳細については、特に以下の文献、「Ｍ．Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐａｄｌｏｃｋ Ｐｒｏｂｅｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：２０８５−８８（１９９４）；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，ｖｏｌ．３０」、ｅ６０−米国特許第５，８５４，０３３号、米国特許第５，９１２，１２４号；国際特許公開第０２／０６８６８３号、国際特許公開第０１／０６０１２号、国際特許公開００７７２６０号、国際特許公開第０１／５７２５６号を参照されたい。これらの文献の内容は、参考文献として本明細書に援用される。

試料中に存在するか否かを決定すべき各標的配列に対して、各標的配列の隣接する相補的部分に相補的な区画を有する特異的なオリゴヌクレオチドプローブが設計される。このように、本発明の方法では、試料中に存在する各標的配列について、対応する（特異的な）アンプリコンを増幅された試料中に得ることができる。試料中に存在する複数の標的配列に対して相補的な複数のオリゴヌクレオチドプローブを与えることが好ましい。試料中のある標的配列に対するオリゴヌクレオチドプローブは、他の標的配列に対するプローブと少なくともヌクレオチド配列が異なっているはずであり、他の標的に対するプローブと長さも異なっていることが好ましく、さらに好ましくは、以下に記載されているように、ある標的に対するプローブは、試料中の他の標的に対応する連結されたプローブと長さが異なる連結されたプローブ及び／又はアンプリコンを生成する。あるいは、例えば、以下に記載されているように、例えば異なる標識等の他の方法で区別できるのであれば、異なる標的に対応するアンプリコンは同じ長さを有していてもよい。

タグ及びプライマー結合部位
前記オリゴヌクレオチドプローブは、さらに、実質的に標的配列に非相補的であるタグを含有する。このタグは、好ましくは少なくとも上記アニーリング条件下以外では、試料中の標的配列のうち何れにも、好ましくは試料中の何れの配列にもハイブリダイズしないか又は顕著にハイブリダイズしない。前記タグは、少なくとも１つ、好ましくは２つのプライマー結合部位を備えていることが好ましく、様々な長さのスタッファー配列及び／又はブロッキング区画を１つ以上必要に応じて備えてもよい（下記参照）。

スタッファー（Stuffers）
オリゴヌクレオチドプローブのタグは、長さが異なる１以上のスタッファー配列を備えてもよい。スタッファーの長さは、０乃至５００、好ましくは０乃至１００、より好ましくは１乃至５０である。タグの長さは、１５乃至５４０、好ましくは１８乃至１４０、より好ましくは２０乃至７５の範囲で変動する。スタッファーは、「Ｉａｎｎｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３９：ｐｐ．１３１−１４０」に記載されているようなＺｉｐコード配列として知られるユニークな配列であってもよい。

ブロッキング区画
別の実施形態では、前記環状プローブは、ブロッキング区画を含有することができる（２７）。ブロッキング区画は、プライマーの伸長を遮断する。ブロッキング区画は、２つのプライマー結合部位の間に配置することが好ましい。好ましくは、フォワードプライマーの３’末端に実質的に隣接し且つリバースプライマー結合部位の５’末端に実質的に隣接するように、ブロッキング区画を配置するのが好ましい。図１４も参照されたい。環状プローブ中に機能団を配置する場合の一例は、（標的相補的区画１−スタッファー配列１−、プライマー結合配列１−ブロッキング区画−プライマー結合配列２−スタッファー配列２−標的相補的区画２）である。このブロッキング区画は、増幅時のプライマーの伸長を効果的に抑制することにより、連結された環状プローブを直鎖状の形態とする。好ましくは、ブロッキング区画が増幅から除外されるように、ブロッキング区画自体は、２つのプライマー結合部位間に配置するのが好ましい。ブロッキング区画は、ＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール）等の非ヌクレオチドポリマーを備えることができる。ＨＥＧ基等のブロッキング区画が存在するのであれば、ブロッキング区画は長いコンカテマーの形成を抑えると思われるので、用いるＤＮＡポリメラーゼはストランド置換活性を有していてもよい。

別の実施形態では、ブロッキング区画を有するライゲーション又は連結された環状プローブは、一つのプライマー、好ましくはフォワードプライマーのみを用いて増幅することもできる。この増幅によって、各増幅操作ごとに、アンプリコンが比例的に蓄積するであろう。この場合には、プライマーが１つしか与えられていない限り、環状プローブは１以上のプライマー結合部位を含有してもよい。

ブロッキング区画は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位の形態であってもよい。ライゲーションを行った後、前記連結された環状プローブを適切な制限エンドヌクレアーゼで制限消化して、直鎖状となった連結された環状プローブを与えることができる。制限消化を促進するために、制限エンドヌクレアーゼを用いて制限消化することができる二本鎖配列を局所的に生成するための適切なオリゴヌクレオチドを与えてもよい。連結された環状プローブは、増幅工程の前に制限消化するのが好ましい。

増幅工程の前に環状プローブを制限消化することによって得られる利点は、残余のものであると否とを問わず、ポリメラーゼがストランド置換活性を有する場合に、（長い）コンカテマーの形成が抑えられることである。（長い）コンカテマーが存在しないか、存在量が減少していると、生じた検出すべき試料が所定サイズ内の長さのオリゴヌクレオチドを含有しているので、長さを基礎とした分離に有利であり、本発明の検出工程に使用する場合などに好ましい。２以上の試料を引き続き分析する時間間隔を減らすので、これにより、高スループット能力が増大する。ライゲーションされた環状プローブのうち制限消化が不完全なものを含む試料（すなわち、環状化されたプローブが試料中に残存している）は、検出工程に著しい影響を与えないか、低い程度の影響しか与えない。より具体的には、試料中の残存環状プローブは、増幅後の制限消化工程の実施が不完全であった場合に（長い）コンカテマーが及ぼす影響ほどには、連続注入された試料間の分離時間（２３）に影響を与えないか、さほどの影響を与えない。別の利点は、短いストランドの増幅は、一般に長いストランドの形成よりも信頼性があるということである。アンプリコンを生成するために複数の短いストランドを増幅することは、一般に１つの長いコンカテマーを生成するよりも信頼性が高く、時間もかからない。これは、本発明の方法が高スループット様式において信頼性が高いためである。続いて、直鎖状となったこれらの連結された環状プローブは、実質的に本明細書に記載されているとおりに、１又は２つのプライマーを用いて増幅することができる。前記制限エンドヌクレアーゼは、任意の制限エンドヌクレアーゼであり得る。ＭｓｅＩ等の単純で安価なエンドヌクレアーゼであることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドプローブの配列は、このエンドヌクレアーゼに対する制限部位をさらに全く含有していないことが好ましい。別の方法としては、ブロッキング区画の当該位置に少なくとも１つのＲＮＡを取り込ませた後に、ＲＮＡｓｅで制限消化することである。

連結された環状プローブ、アンプリコンを直鎖状にすることにより、長いコンカテマーの問題を克服することが可能であり、本方法が真に高スループットな電気泳動技術に適する方法となる。本明細書に上記されているブロッキング区画を用いて、短いストランドのオリゴヌクレオチドのみを増幅することによって、又はストランド置換活性を欠いたポリメラーゼと組み合わせて少なくとも１つのプライマーを用いることによって、試料を構成するアンプリコンのセットを得ることが可能であり、このアンプリコンは、プローブのデザインに基づいて所定の範囲内で別々の長さを有する。続いて電気泳動装置にローディングすると、アンプリコンが迅速に分離されるであろう。

ハイブリダイゼーション
工程（ａ）では、複数の異なる標的配列、すなわち少なくとも２つの異なる標的配列を、ハイブリダイジング条件下で、複数の特異的なオリゴヌクレオチドプローブと接触させる。続いて、試料中の前記複数の標的配列の隣接する相補的部分に該オリゴヌクレオチドプローブをアニールさせる。相補的な標的配列にオリゴヌクレオチドプローブを特異的にアニールさせる方法と条件は、本分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ （２００１） ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。一般には、オリゴヌクレオチドプローブと標的配列を混合した後、低塩緩衝液（例えば、塩を全く含有しないか、又は１０ｍＭ ＮａＣｌに等しいイオン強度を下回る塩を含有する緩衝液）中で、短時間の間（例えば、３０秒乃至５分）インキュベートする（一般には、９４℃乃至９６℃で）ことによって核酸を変性させる。次いで、プローブと標的配列を特異的にアニールするために、変性したプローブと標的配列を含有する試料を最適なハイブリダイゼーション温度に冷却するが、この温度は、プローブの相補的区画と（標的配列中の）その相補的配列間のハイブリッドの融点より約５℃下回るのが通常である。前記２つのプローブ区画、すなわち試料中のプローブ区画のうち１つが複数の標的配列と非特異的（ａｓｐｅｃｉｆｉｃ）又は不十分なハイブリダイゼーションを行わないようにするために、１つの試料中では、標的配列に相補的な前記プローブの区画の融点を該試料中の異なる標的配列の間で同様にする、好ましくは同一にすることが好ましい。このため、プローブの前記相補的区画は、融点が２０℃、１５℃、１０℃、５℃、又は２℃未満であることが好ましい。これは、同じような長さと同じようなＧ／Ｃ含量を有するプローブの相補的区画を用いることによって容易となる。このため、相補的区画の長さの差は２０、１５、１０、５、又は２ヌクレオチド未満であることが好ましく、Ｇ／Ｃ含量の差は３０、２０、１５、１０、又は５％未満であることが好ましい。本明細書で使用する「相補的」とは、通常のストリンジェンシー条件下で、第一のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることが可能であることを意味する。別のヌクレオチド配列に対して相補的と考えられるヌクレオチド配列に含まれるミスマッチの量は少ない（すなわち、好ましくは、２０、１５、１０、５又は２％未満）ものと思われる。あるいは、例えば、ＥＰ−Ａ９７４，６７２号（参考文献として本明細書中に援用する）に記載されているような、いわゆるユニバーサルヌクレオチドを取り込むことによって、又は適切な立体配置拘束型核酸（ＬＮＡ、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を用いることによってミスマッチを補償する必要があるかもしれない。標的配列へのプローブのアニーリングは濃度依存的なので、少容量（すなわち、１０μｌ未満）でアニーリングを行うのが好ましい。これらのハイブリダイゼーション条件下では、標的配列へのプローブのアニーリングは、通常迅速であり、５、１０、又は１５分間を超えて進行しないが、非特異的なアニーリングを避けるために、ハイブリダイゼーション温度を維持できる限り、これより長いアニーリング時間を用いてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、一晩のハイブリダイゼーションや１時間を超えるハイブリダイゼーションといった長期のハイブリダイゼーション時間によって、素晴らしい結果が得られている。ハイブリダイゼーション効率の差に起因するシグナルの差が減少するので、長期のハイブリダイゼーション時間は、これらのアッセイにおいて有利なことがあり、標的配列が存在する全てのプローブの完全なハイブリダイゼーションとライゲーションを達成することが望ましいと考えられる。本明細書に記載された熱安定性リガーゼを用いたハイブリダイゼーション−ライゲーションの複合工程によって、素晴らしい結果が得られている。本実施形態では、ハイブリダイゼーション−ライゲーションは、熱安定性リガーゼの存在下でプローブを１時間ハイブリダイズさせた後、変性工程を行うことによって実施された。これらの工程を少なくとも２回繰り返すことによって、良好な結果が得られた。これらの工程を１０回繰り返すことによって、素晴らしい結果が得られた。

変性及びアニーリング時の蒸発を避けるために、反応容器の壁と蓋（すなわち、チューブ又はマイクロタイターのウェル）も反応混合物と同じ温度に加熱してもよい。好ましいオリゴヌクレオチドプローブでは、前記相補的な区画の長さは、好ましくは少なくとも１５、１８、又は２０ヌクレオチドであり、好ましくは、３０、４０、又は５０ヌクレオチドを超えず、前記プローブは、少なくとも５０℃、５５℃、又は６０℃の融点を有することが好ましい。

ハイブリダイズされなかったプローブ
標的配列の一部と相補的でないプローブ又は余りにも多くのミスマッチを含有するプローブは、試料をハイブリダイゼーション条件に供したときに、標的配列にハイブリダイズしないか、僅かにハイブリダイズするにすぎないであろう。従って、ライゲーションが起こる可能性は低い。従って、これらのプローブから得られる誤ったライゲーション産物の数は一般に十分でなく、真のライゲーション産物よりずっと少なく、その後の多重増幅時には問題とならなくなる。その結果、誤った産物は検出されないか、ごく僅か検出されるにすぎない。

ライゲーション
標的配列の相補的部分に実質的に隣接してアニールしたオリゴヌクレオチドプローブの各５’及び３’末端は、工程（ｃ）で連結されて、本分野で公知の任意の適切な手段によって、共有結合を形成する。前記プローブの末端は、リガーゼ、好ましくはＤＮＡリガーゼによって、酵素的にホスホジエステル結合として連結させることができる。ＤＮＡリガーゼとは、相補鎖上の隣接部位に結合した２つのポリヌクレオチド鎖（の末端）間にホスホジエステル結合の形成を触媒することができる酵素である。一般に、ＤＮＡリガーゼは、二本鎖ＤＮＡ中のニックを埋めるために、補酵素としてＡＴＰ（ＥＣ６．５．１．１）又はＮＡＤ（ＥＣ６．５．１．２）を必要とする。本発明に使用するのに適したＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、又は好ましくは、例えばＴｈｅｒｍｕｓ Ａｑｕａｔｉｃｕｓ（ＴＡＱ）リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡリガーゼ、又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＤＮＡリガーゼのような熱安定性リガーゼである。あるいは、標的配列の相補的部分上に位置する隣接部位でアニールした２つのオリゴヌクレオチドプローブをライゲーションするために、修飾されたポリヌクレオチド末端の化学的な自己ライゲーションを用いることもできる（Ｘｕ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２７：８７５−８８１）。

化学的ライゲーション及び酵素的ライゲーションともに、ライゲーション部位で又はライゲーション部位の近くでプローブの末端の一方又は双方が標的配列とミスマッチを形成する複合体に比べて、完全にマッチしたプローブ−標的配列複合体に対する効率がずっと高い（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ ７６：２４５−２５４；Ｘｕ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，上記）。ライゲーションの特異性、すなわち、ミスマッチがあるオリゴヌクレオチドに対する完全にマッチしたオリゴヌクレオチドの相対的ライゲーション効率を増加させるために、ライゲーションは高い温度で行うことが好ましい。このため、本発明の好ましい実施形態では、５０−６５℃では長期にわたって活性な状態を保っているが、さらに高い温度（例えば、ＰＣＲにおける変性工程で使用される温度、通常は９０−１００℃）で容易に不活化されるＤＮＡリガーゼが用いられる。このようなＤＮＡリガーゼの１つは、国際特許公開第０１／６１０３３号に記載されているグラム陽性細菌（菌株ＭＲＣＨ０６５）から得られるＮＡＤ要求性ＤＮＡリガーゼである。本リガーゼは、「リガーゼ６５」と称され、ＭＲＣ オランダ、アムステルダムから市販されている。

ギャップライゲーション
別の実施形態、例えばインデルを同定することを目的とした実施形態では、ギャップが残存するように、各末端をアニールさせることがある。このギャップは、適切なオリゴヌクレオチドを用いることによって埋めて、ライゲートすることができる。このような方法は本分野において「ギャップライゲーション」として知られており、特に国際特許公開第００／７７２６０号に開示されている。このギャップを埋めるための別の方法としては、必要に応じて、Ａ、Ｔ、Ｃ、若しくはＧ、又はジオリゴヌクレオチド若しくはトリヌクレオチド若しくはその他の小さなオリゴヌクレオチドから予め選択した単一ヌクレオチドとともに、ポリメラーゼとリガーゼを用いて、プローブの一方端を伸長させることが考えられる。

プライマー
連結されたプローブは、プライマー結合部位に対応するプライマーの対を用いて増幅される。好ましい実施形態では、少なくとも１つのプライマー又は同じプライマーのセットを用いて、試料中に存在する２以上の異なる連結されたプローブを増幅し、好ましくは、試料中に存在する全ての連結されたプローブを増幅する。このようなプライマーは、対応するユニバーサルプライマー結合部位を含有する全てのプローブの増幅を開始させて、その結果、ユニバーサルプライマー結合部位を含有するライゲーションされた全てのプローブを増幅することができるので、ユニバーサルプライマーと称されることがある。工程（ｄ）での増幅で使用される異なったプライマーは、アニーリング効率とプライミング効率が実質的に等しいことが好ましい。このため、試料中の前記プライマーの融点の差は、２０℃、１５℃、１０℃、５℃、又は２℃未満であることが好ましい。これは、オリゴヌクレオチドプローブの相補性区画について概説したのと同じように実施することができる。相補的区画の配列とは異なり、プライマーの配列は、標的配列によって読み取られない。従って、各テトラマーが１つのＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧを含有するヌクレオチドのテトラマーから得られる配列を集合させることによって、又はプライマーのＧ／Ｃ含量と融点が同一になるか又は極めて似通っていることが確保されるその他の方法によって、プライマー配列を設計することが便利であろう。プライマーの長さ（及びプローブのタグ中の対応するプライマー結合部位）は、好ましくは少なくとも１２、１５、又は１７ヌクレオチドであり、好ましくは、２５、３０、４０ヌクレオチドを超えない。

好ましい実施形態では、試料中に存在する少なくとも２つの異なる標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも２つは、単一のプライマー配列に相補的なプライマー結合部位を備えたタグ配列を有している。このため、好ましくは、プライマー対中の前記第一及び第二のプライマーのうち少なくとも１つは、試料中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する連結されたプローブを増幅するために用いられ、より好ましくは、試料中の全ての標的配列に対応する連結されたプローブを増幅するために用いられる。好ましくは、全ての連結されたプローブを増幅するために、単一の第一のプライマーのみが使用され、幾つかの実施形態では、単一の第一のプライマーと単一の第二のプライマーのみが用いられる。複数の異なる断片を増幅するために共通のプライマーを用いることは、増幅工程の効率を向上させる上で有利である。

隣接してアニールされたプローブ区画のライゲーションによって得られた前記連結されたプローブは、好ましくは試料中の連結されたプローブのそれぞれに対するプライマー対からなるプライマーセットを用いて、工程（ｄ）において増幅される。前記プライマー対には、前記連結されたプローブ中に存在するプライマー結合配列に相補的なプライマーが含まれる。プライマー対には、第一のプライマーと少なくとも第二のプライマーとが含まれるのが通常であるが、両方向に増幅を開始させる単一のプライマーのみからなることもある。特にＥＰ ５３４，８５８号及び「Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５、ｖｏｌ．２３， ４４０７−４４０１４」に開示されているものなどの本分野でＡＦＬＰプライマーとして知られるプライマーを用いると、素晴らしい結果が得られた。

選択的プライマー
特に好ましい実施形態では、本発明の増幅工程において用いられる１以上のプライマーは選択的プライマーである。本明細書において選択的プライマーとは、プローブ中のプライマー結合部位と相補的なユニバーサル配列に加えて、いわゆる「選択的ヌクレオチド」を含んだ領域を含有するプライマーとして定義される。選択的ヌクレオチドを含有する領域は、ユニバーサルプライマーの３’末端に位置する。

選択的ヌクレオチドの原理は、特にＥＰ ５３４，８５８号及び「Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５、ｖｏｌ．２３， ４４０７−４４０１４」に開示されている。選択的ヌクレオチドは、プライマー配列に隣接して位置する（ライゲーションされた）プローブ中のヌクレオチドに対して相補的である。選択的ヌクレオチドは、プライマー配列として表される（ライゲーションされた）プローブ中の領域の一部を構成しないのが通常である。選択的ヌクレオチドを含有するプライマーは、＋Ｎと表され、ここで、Ｎはプライマーの３’末端に存在する選択的ヌクレオチドの数を表している。Ｎは、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧの中から選択するのが好ましい。

Ｎは、様々なヌクレオチド代替物（すなわち、ＡＣＴＧヌクレオチドの挙動を模倣することができるが、これに加えて、ＡＣＴＧヌクレオチドに比べて向上したハイブリダイゼーション能力又はハイブリダイゼーションから生じた二本鎖の安定性を改変する能力などの他の特性を有する化合物）から選択してもよい。それらの例は、ＰＮＡ、ＬＮＡ、イノシン等である。２つのプライマーを用いるＰＣＲなどのように、２以上のプライマーを用いて増幅を行う場合には、プライマーの一方又は双方に選択的ヌクレオチドを装備させることができる。選択的ヌクレオチドの数は、種その他の当業者が決定できる他の要因に応じて変化させることができる。一般に、選択的ヌクレオチドの数は１０を超えず、好ましくは少なくとも５、好ましくは４、より好ましくは３、最も好ましくは２であり、特に好ましいのは１個の選択的ヌクレオチドである。

このように、＋１プライマーは選択的ヌクレオチドを１つ含有し、＋２プライマーは２つの選択的ヌクレオチドを含有する（以下同じ）。選択的ヌクレオチドを含まないプライマー（すなわち、通常のプライマー）は、＋０プライマーと表される（選択的ヌクレオチドが加えられていない）。特定の選択的ヌクレオチドが付加されるときには、＋Ａ又は＋Ｃ等の表記で表される。

選択的プライマーを用いて（ライゲーションされた）プローブのセットを増幅することによって、（ライゲーションされた）プローブのサブセットが得られるが、但し、選択的プライマーを用いて選択的に増幅されることが予期される所望のプローブ中の適切な位置に、相補的塩基が取り込まれる。例えば、＋１プライマーを用いると、増幅前のライゲーションされたプローブの混合物に比べて、増幅混合物の多重度は４桁減少する。複数の選択的ヌクレオチドを有するプライマーを用いることによって、さらに大きな減少が得られる。すなわち、２つの選択的ヌクレオチドを用いることによって、本来の多重比率が１６分の１に減少する。

ライゲーション後に、選択的に増幅すべきアッセイを開発するときには、前記プローブは、プライマー結合配列に隣接する相補的ヌクレオチドを含有していることが好ましい。これによって、選択的に増幅すべきライゲーションされたプローブを予め選択することが可能となる。

後に特定の部分だけが分析される、高多重比率を有するライゲーションベースのアッセイを開発するときには、本発明に選択的プライマーを使用することが有利であることが明らかとなっており、データポイント当りのライゲーション反応のコストがさらに低くなる。隣接する選択的ヌクレオチドとともにプライマーを設計することによって、前もって、試料の増幅すべき特定の部分を別個に選択することができる。

これが有用で有利な例の１つは、ごく微量のＤＮＡを含有する試料を分析する場合、及び／又は異なる（菌株の）病原体を同定する場合である。例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の様々な菌株を検出するためのアッセイでは、菌株のそれぞれに対して、各プローブのセットが設計される。本発明の方法のハイブリダイゼーション工程とライゲーション工程の後に、かかるライゲーションされたプローブのセット（又は特徴を有する部分）の有無を検出することは、当該菌株の同定に役立つであろう。特異的に設計されたプライマーによる選択的増幅によって（各選択的プライマーは、特定の菌株に連結されている）、様々な菌株を選択的に増幅させることができ、それらの菌株の同定が可能となる。例えば、＋Ａプライマーを用いて増幅すると、菌株Ｘに対するライゲーションされたプローブが選択的に増幅され、＋Ｇプライマーは菌株Ｙに対するライゲーションされたプローブを選択的に増幅する。所望であれば、例えば、試料ＤＮＡが少量の場合、＋０プライマーにより必要に応じて第一の増幅を行えば、ライゲーションされたプローブの量が増大し、それにより選択的増幅が促進されるであろう。

例えば、２０ヌクレオチドのユニバーサルプライマーは、選択的ヌクレオチドの１つを３’末端に付加することによって選択的プライマーとなり、これにより、プライマーの全長は２１ヌクレオチドとなる。図１５も参照されたい。あるいは、付加した選択的ヌクレオチドの数だけ、ユニバーサルプライマーの５’末端を短縮することもできる。例えば、プライマー配列の３’末端に２つの選択的ヌクレオチドを付加するとともに、元のユニバーサルプライマーに比べて、ユニバーサルプライマーの５’末端から２つのヌクレオチドを喪失（又は除去）させることができる。このように、２０ヌクレオチドのユニバーサルプライマーは、２０ヌクレオチドの選択的プライマーによって置換される。これらのプライマーは、本出願を通じて、「ネステッドプライマー」と称される。ユニバーサルプライマーが基礎となった選択的プライマーを使用することには、異なる選択的プライマーにを用いた増幅について、ストリンジェンシーや温度等の増幅パラメータが実質的に同じとなるか、僅かな違いにとどめることができるという利点がある。選択的増幅は、非選択的増幅に比べてストリンジェンシーが増加した条件下で行うのが好ましい。ストリンジェンシーが増加したとは、増幅工程で用いられるポリメラーゼによって完全にマッチした選択的プライマーのみが伸長できるように、ライゲーションされたプローブにプライマーをアニールするための条件を意味する。完全にマッチしたプライマーのみを特異的に増幅するには、原理的には、プライマーアニーリング工程中の温度を例えば０．５℃ずつ段階的に低くして、プライマーを完全にアニールさせる、いわゆるタッチダウンＰＣＲ方式を使用する。適切なストリンジェンシー条件は、例えば、ＥＰ ５３４，８５８号及び「Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５、ｖｏｌ．２３， ４４０７−４４０１４」でＡＦＬＰ増幅に関して記載されている条件である。当業者であれば、本発明の本質から逸脱することなく、指示に従って、具体的な必要性に適合するようにストリンジェンシー条件を適合させる方途を見出すことができるであろう。

ライゲーションされたプローブを選択的に増幅させるさらなる利点の１つは、低い多重比率が好まれる方法又はプラットフォーム上で検出できるように、高い多重比率を有するアッセイを容易に改変できることである。

多くの例の１つとしては、ＭｅｇａＢＡＣＥ上で又はＬａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ等のナノテクノロジーを用いて行われる電気泳動、好ましくはキャピラリー電気泳動等の長さの差に基づく検出がある。

増幅
本発明の方法の工程（ｄ）では、（検出可能な）増幅した連結されたプローブ（アンプリコン）（本分野で公知の任意の適切な核酸増幅法によって、連結された環状プローブを直鎖状にしたもの）を作製するために、前記連結されたプローブを増幅する。核酸増幅法では、２つのプライマーｄＮＴＰと（ＤＮＡ）ポリメラーゼを利用するのが通常である。好ましい増幅法は、ＰＣＲである。「ＰＣＲ」、すなわち「ポリメラーゼ連鎖反応」とは、インビトロで特定のＤＮＡセグメントを酵素的に増幅する迅速な手法である。増幅すべきＤＮＡは、試料を加熱することによって変性される。ＤＮＡポリメラーゼと過剰のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下では、標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが新しいＤＮＡの合成を開始させる。ポリメラーゼは、ストランド置換活性を発現しないか、少なくとも著しい活性を発現しないＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。これらのポリメラーゼの一例は、ＡｍｐｌｉｔａｑとＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（販売者、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及びＡｃｃｕｐｒｉｍｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。合成が一巡すると、親鎖と同様に、変性及びアニーリング時にプライマーにハイブリダイズすることができる規定の長さの新しい鎖が得られる。変性、アニーリング、合成操作の二巡目では、両者で別個の二本鎖産物を構成する２つの一本鎖産物が得られ、長さは正確にプライマー末端の間に等しい。この別個の産物は、連続して増幅を行うごとに指数関数的に蓄積する。約２０乃至３０サイクルを行う間に、前記別個の断片を何百万倍にも増幅することができる。ＰＣＲプロトコールは本分野において周知であり、標準的な実験書例えば、「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９９５）」に記載されている。本発明の方法においてＰＣＲを使用するための適切な条件は、ＥＰ−Ａ ０，５３４，８５８号及び「Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５、ｖｏｌ．２３， ４４０７−４４１４」に記載されており、この場合、７０乃至７００のヌクレオチドを有し、同一のプライマー結合配列を含有している複数のＤＮＡ断片が、１つのプライマー対を用いて、ほぼ等しい効率で増幅される。使用可能なその他の多重増幅法及び／又は等温増幅法としては、例えば、ＬＣＲ、自己維持的配列増幅（３ＳＲ、ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、Ｑ−β−レプリカーゼによるＲＮＡ増幅、又はストランド置換増幅（ＳＤＡ、ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。以下に記載されているように、それらが直鎖増幅産物（すなわち、長さが異なり、且つ前記環状プローブの長さに対応する）をもたらす限り、幾つかの例では、適切な（ＲＮＡ）ポリメラーゼ結合部位によって、前記プローブのタグ中にあるプライマー結合部位を置換する必要があるかもしれない。

本明細書に記載されているように、連結された環状プローブを直鎖状にするには、ストランド置換活性を有しないか、あるいはストランド置換活性が著しくないポリメラーゼを用いて、２つのプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）により環状プローブを指数関数的に増幅させることによって行うことができる。フォワードプライマーによる増幅における最初のプライマー伸長では、フォワードプライマーの５’末端に到達するまで、オリゴヌクレオチド産物が生成される。用いるポリメラーゼにはストランド置換活性が実質的にないため、プライマーの伸長はそこで終了し、連結された環状プローブと実質的に同一の長さを有する伸長されたプライマーが残される。フォーワードプライマーの場合、変性、プライマーハイブリダイゼーション、及びプライマー伸長の２サイクル目では、最初のプライマー伸長の場合と同一の鎖が生成されるが、リバースプライマーは、最初のプライマー伸長から得られるオリゴヌクレオチド産物にハイブリダイズすることにより、相補鎖を生成するので、環状プローブが指数関数的に増幅されて長さが異なるアンプリコン（連結された環状オリゴヌクレオチドプローブから得られる）が生じることになる。

アンプリコン
本明細書で使用するアンプリコンという用語は、連結されたプローブ又はライゲーションされたプローブを増幅する工程から得られる産物を意味する。このように、本明細書で使用する「アンプリコン」という用語は、連結されたプローブが増幅されたものを意味する。２つの標的特異的区画をリガーゼによって連結するライゲーション工程の後に、前記連結又はライゲーションされたプローブを１以上のプライマーおよびポリメラーゼと混ぜて、プローブを増幅する。ライゲーションされたプローブ、プライマー、ポリメラーゼ、及び／又は他のパラメータ及び変数は、増幅によって、環状プローブが直鎖状になるように選択する。本発明では、前記アンプリコンは、環状プローブの長さを著しく超えない長さを有する直鎖オリゴヌクレオチドである。前記アンプリコンの最少の長さは、少なくとも２つの標的相補的区画の長さを合算した長さである。アンプリコンの長さは環状プローブの長さに相当することが好ましい。アンプリコンの長さは対応する環状プローブのライゲーションの指標となることがさらに好ましい。アンプリコンには、前記環状プローブの区画を反復して含有しないことが好ましい。すなわち、アンプリコンは、コンカテマー又は環状プローブの多量体（すなわち環状プローブが多量体化されたもの）でないことが好ましい。アンプリコンは、連結された環状プローブが直鎖化された単量体の形態であることが好ましい。

環状プローブを直鎖アンプリコンに変換することによって得られる利点は、環状プローブの有利な特性（「南京錠」コンフォメーションの形成による、反応速度の向上、標的ストランドへのハイブリダイゼーションの増加）が用いられるが、得られたアンプリコンは長さが異なるため、その後に制限消化や標識といった工程を付け加えることなく検出を行うことができるところにある。図１４は、環状プローブとアンプリコンを模式的に示した図である。本発明の様々な実施形態から、この点に関する詳細がさらに明らかとなるであろう。

検出
標識、分離された試料の検出は、検出データを与える検出器によって行われる。検出器は、もちろん、分離を行う一般的なシステム（キャピラリー電気泳動、スラブゲル電気泳動、固定検出器−連続ゲル電気泳動）によって異なるとともに、蛍光又は放射性標識等のプライマー上に存在する標識によっても異なる。

試料中のアンプリコンは、電気泳動装置上で分析するのが好ましい。電気泳動装置は、増幅された試料中の異なるアンプリコンを長さに基づいて分離するのが好ましく、分離されたアンプリコンは、その後、以下の記載のように検出することができる。適切な電気泳動装置は、例えば、慣用の（ポリアクリルアミド）スラブゲル電気泳動又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手できるＭｅｇａＢＡＣＥ装置を一例とするキャピラリー電気泳動等のゲル電気泳動装置であり得る。あるいは、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐとして知られるナノサイズのキャピラリー電気泳動装置を用いてもよい。電気泳動用装置は、複数のチャネル中で複数の試料が同時並行的に電気泳動されるマルチチャネル装置であることが好ましい。電気泳動装置は、電気泳動すべき増幅された試料を加える（ローディング）するための試料添加部位（チャネルごとに）と、電気泳動によって試料中の断片がその上を遊走する分離領域とを有しており、前記試料添加部位から離れた検出部位に位置した検出装置も有することも好ましい。検出装置は、蛍光、リン光、又は化学発光を検出するための光増倍機を備えているのが通常である。あるいは、ゲル電気泳動の場合、分離された断片は、例えば、オートラジオグラフィー又はフルオログラフィーによってゲルの中で検出してもよい。

長さの識別
試料中の異なる標的配列を識別するためには、対応する各アンプリコンの長さの相違を用いることが好ましい。長さに基づいてアンプリコンを分離することによって、試料中の対応する標的ヌクレオチド配列の存在を決定することができる。従って、本発明の好ましい実施形態では、試料中の異なる標的配列に由来するアンプリコンの識別は、試料中又は増幅された試料中の異なる標的配列に対応する各アンプリコン間の長さの相違に基づいて行われる。

好ましくは、長さの相違は、オリゴヌクレオチドプローブ中のスタッファー配列の長さに由来することが好ましい。各オリゴヌクレオチド中に所定の長さのスタッファーを含めることによって、工程（ｄ）で得られたアンプリコンの長さの相違に基づいて十分に識別可能となるように、増幅された試料中の各アンプリコンの長さを調節することができる。本発明に係るプローブの好ましい実施形態では、前記スタッファーは、標的配列に対して相補的なプローブの区画とプライマー結合配列との間に配置される。プローブの両端に位置する２つの標的特異的区画と２つのプライマー結合部位とが存在するので、２つのスタッファーは、プローブ中でその間に取り込むことができる。このように、スタッファーの全長は、プローブ中に存在する第一のスタッファーと第二のスタッファーの長さの総計として与えられる。従って、好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは非標的相補的なタグの中に、２つのスタッファーを有する。図１４には、これらがグラフとして図示されている。

試料中の標的配列から得られたアンプリコン間の長さの相違は、長さに基づいてアンプリコンを区別できるように選択することが好ましい。これは、電気泳動装置上で区別し得る明確な長さの相違を（両者で）もたらすスタッファー配列又はスタッファー配列の組合せを使用することによって実現することができる。このように、分離能の観点からは、異なるアンプリコン間の長さの差（スタッファーによって生じたものであり得る）は、できるだけ大きいことが好ましい。しかしながら、前に記したような他の幾つかの重要な事項を考慮すると、異なるアンプリコン間の長さの差は、できるだけ小さいことが好ましい。（１）化学的に合成されたプローブの長さに関していえば、現実には、最大で約１００乃至１５０塩基という上限が存在する、（２）断片が大きくなるほど増幅効率が低下する、（３）長さの相違が大きい断片の増幅効率には差が出る確率が増大する、（４）検出装置に検出用試料を複数回注入する場合には、狭い長さの範囲に断片が収まっていると最高の結果が得られる。決定すべき配列間に存在し、スタッファーによって与えられる長さの差は、実質的に全てのアンプリコンを識別可能とするのに少なくとも十分であることが好ましい。当然のことながら、化学的、酵素的、生物的な核酸合成操作に基づくと、増幅された試料中の異なるアンプリコン間に存在する使用可能な最少のサイズ差は一塩基であるが、このサイズ差は、（特に、小さめのサイズ範囲では）多くの電気泳動装置によって分離可能である。このように、上記の記述に基づけば、長さの差が単一塩基（対）である増幅産物が得られる多重アッセイを使用するのが好ましい。好ましい実施形態では、増幅された試料中の異なるアンプリコン間の長さの差は少なくとも２つのヌクレオチドである。本発明の特に好ましい実施形態では、試料中の異なる標的配列に対応するアンプリコンの長さの差は、２ヌクレオチドである。

標識
好ましい実施形態では、試料中の前記第一及び第二のオリゴヌクレオチドプローブのプライマー結合部位に相補的なプライマーのうち少なくとも１つは標識を備えており、第二のプライマーが標識を備えることが好ましい。前記標識は、とりわけ色素、発色団、又は酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、リン光発光団、放射性標識、化学発光部分、又は電気化学的検出成分などの蛍光及び／又はリン光成分などの大きな群から選択することができる。好ましくは、前記標識は蛍光又はリン光色素であり、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＥＤ、及び（ＥＴ−）ＲＯＸの群から選択することがより好ましい。ＮＥＮ Ｇｌｏｂｅｒ ＩＲ^２プラットフォームに対して使用する場合、ＦＩＴＣ、Ｃｙ２、テキサスレッド、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８^ＴＭ、Ｂｏｄｉｐｙ^ＴＭ ＦＬ、ローダミン１２３、Ｒ６Ｇ、Ｂｏｄｉｐｙ ５３０、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ^ＴＭ ５３２、及びＬｉｃｏｒのＩＲＤｙｅｓ^ＴＭ等の色素も本発明において用いるのに適している。前記標識は、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＥＤ、ＨＥＸ、及び（ＥＴ−）ＲＯＸ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ２、テキサスレッド、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８^ＴＭ、Ｂｏｄｉｐｙ^ＴＭ ＦＬ、ローダミン１２３、Ｒ６Ｇ、Ｂｏｄｉｐｙ ５３０、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ^ＴＭ ５３２、及びＩＲＤｙｅｓ^ＴＭからなる群に属する蛍光色素又はリン光色素から選択するのが好ましいであろう。

標識が異なるプライマーを含んだプライマーセットを用いることによって、加えた標識ごとに、試料中の識別可能な連結されたプローブの数を二倍にすることができ、従って、試料中の標的配列の数を二倍にすることができる。このため、試料中で用いられる標識が追加されるごとに、試料中の分析できる標的配列の数が倍加する。高スループット法において、一つの試料中に用いることができる標識の最大数は、多くは、利用可能な検出プラットフォームの検出能の制約によって支配される。現在では、最も頻繁に用いられるプラットフォームの１つ（ＭｅｇａＢＡＣＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ−Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．）を使用すれば、最大４つの蛍光色素（ＦＡＭ、ＪＯＥ、又はＨＥＸ、ＮＥＤ、（ＥＴ−）ＲＯＸを同時検出することが可能となる。しかし、別のキャピラリー電気泳動装置も適しており、ＡＢＩ３１０、ＡＢＩ３１００、ＡＢＩ３７００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．）、ＣＥＱ２０００ ＸＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）その他が含まれる。スラブゲルをベースとした電気泳動装置の非限定的な例には、ＡＢＩ３７７（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．）、および米国、ネブラスカ州、リンカーンのＬＩ−ＣＯＲから入手できるグローバルＩＲ^２自動ＤＮＡ配列決定システムが含まれる。

長さと標識
スループットは、複数の標識されたプライマーを用いることによって増加させることができる。１つの試料中で異なる試料を用いることに伴う問題の１つは、クロストーク又は残留クロストークである。本明細書で使用するクロストーク又は残留クロストークとは、異なる（蛍光）標識の発光スペクトル間の重複を意味する。例えば、蛍光色素を使用する場合、各色素は異なる発光（及び吸収）スペクトルを有する。１つの試料中に２つの色素が存在する場合、これらのスペクトルは重複し、シグナルを妨害して、得られたデータの質を落とすことがある。特に、試料中の検出すべき２つのヌクレオチド断片が異なる標識で標識されており、一方の断片が大量に存在しているのに対して、他方が少量しか存在しない場合には、少量しか存在しない断片について測定されたシグナルの多くは、同じサイズを有する別の試料の断片中に豊富に含有される重複した発光スペクトルを有する別の標識の発光から由来するものであるということが、残留クローストーク（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｃｒｏｓｓ ｔａｌｋ）によって引き起こされる場合がある。他の色素の相反的効果も起こり得るが、それぞれの色素で標識されたアンプリコン間の量差故に、この例では、その効果はおそらく弱まるであろう。

Ｃｈｅｈａｂら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９１７８−９１８２（１９８９））は、１つの色素の発光のピークが実質的に他の色素の発光のボトムと一致するように、標識の組合せを選択することによって、単一の反応チューブで競合する対立遺伝子に異なる蛍光色素を付着させて、対立遺伝子を識別しようと試みた。しかし、とりわけ試料が複数の色素を含有するときには、ある色素の吸収が最大となる波長において、試料中に存在する別の色素による吸収が常に幾らか残存している。

スペクトルを分離できる色素は相対的に少ないので、多重分析のためのかかるアプローチは、規模の上で制限されることが明らかとなった。複数の色素を用いることに伴う主要な問題の１つは、異なる蛍光標識の発光スペクトルは重複することが多いということである。得られた生のデータシグナルは、クロストーク補正と呼ばれるプロセスによって、同時に検出され、別の蛍光色素が標識された同じようなサイズの断片の寄与について補正しなければならない。クロストーク補正は、検出装置から「生」データを収集した後、両色素の公知の理論的吸収スペクトルに基づいて、数学的手段によって実施するのが一般である。数学的補正は、理論的スペクトルに基づき、標識の発光スペクトルが鋭敏であることを無視しており、検出試料の組成によって影響を受けることが多い。これらの感受性は、発光の明度及び／又は波長に影響を与えることがある。このことは、ｐＨ、温度、励起光の強度、非共有性相互作用、塩濃度、イオン強度などのパラメータが、得られた発光スペクトルに強く影響することを意味している。特に、試料中に塩が残存すると、色素によって発せられた蛍光シグナルに影響が及び、動電注入を用いたキャピラリー電気泳動による検出の場合、注入効率にも影響を与えるので、重要な要素であることが知られている。このように、異なる蛍光色素を用いた多重検出の場合には、スペクトルの重複はデータの質に悪影響を与えるエラーの原因となる可能性がある。

本発明は、データの品質に著しい影響を与えないように同一試料中で、重複するスペクトルを有する２つ（又はそれ以上の）標識を使用できるように、この問題に対する解決策を与える。長さの差と標識を予め定めて組み合わせることによって、データの品質を少なくとも一定に保ちながら、試料中の検出可能な標的ヌクレオチド配列数を増加させることができる。本発明の好ましい実施形態では、２つの配列の長さを異ならせることによって、標識が異なる２つの配列間のスペクトルの重複を減少させる。標識に関連するこのような長さの差は、本明細書に記載されているスタッファー配列の長さによって与えることが可能である。本方法において、同一試料中で使用できる異なる標識の数は、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つである。標識の最大数は、許容される最少のスペクトル重複の関数として制約され、これは、多くの使用例で、真のシグナルの１５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは真のシグナルの１％未満であるのが通例である。

好ましい実施形態において、重複する発光スペクトルを有する複数の蛍光色素で異なる試料が標識されており、同じ長さの断片を同じ操作中で同時に検出する場合に、データの質に対する残留クロストークが及ぼし得る影響を避けるためには、１つの多重セット内でアンプリコンの塩基対が少なくとも２つ異なり、且つ重複するスペクトルを持つ異なる色素で標識された多重セット間で単一の塩基対が異なるように、スタファー配列を選択することが好ましい。このようにすることによって、各色素で標識された断片の長さは、断片サイズと標識色素の組合せが一意的に規定されるので、データの質に対して及ぼす可能性がある残留クロストークの影響が回避されるように選択される（図３）。

本発明の特に好ましい実施形態は、アンプリコンを含む飼料が複数の標的配列に由来する方法である。これらのアンプリコンは、異なる標識が施されることによって、同じ標識を担持するアンプリコンのグループが規定される。各グループ内では、スタッファーによって、少なくとも２つ、好ましくは２ヌクレオチドの長さが異なることになる。スペクトルが重複する標識を有する２つのグループ間では、１ヌクレオチドの長さの差がスタッファーによって与えられるので、上述のように、偶数個のヌクレオチドを有するグループと奇数個のヌクレオチドを有するグループとが効果的に得られる。

１つの側面において、本発明は、試料中の標的配列をより良好に識別および検出する方法であって、２グループ以上のオリゴヌクレオチドプローブを与えることを備え、異なるオリゴヌクレオチドプローブのグループを有するアンプリコンは異なる標識を有し、あるグループ内の増幅連結された各プローブ標識配列は実質的に同一の標識を有しており、標識が同じアンプリコンのグループ内では、当該グループ内の標識が同一の各プローブは長さが異なっており、前記第一のグループと第二のグループ間では、増幅された試料中の増幅連結された各プローブが配列の長さと標識の組合せによって特定されるように、さらに長さが異ならせてある、方法に関する。

本発明の本方法の好ましい実施形態では、少なくとも２グループのオリゴヌクレオチドプローブが試料に与えられ、各オリゴヌクレオチドプローブのグループは少なくとも１つのグループ特異的プライマー結合部位を備えたタグ配列を有している。各グループの連結されたプローブは、前記第一及び第二のプライマーのうち少なくとも１つが前記グループ特異的プライマー結合部位に相補的なプライマー対から増幅され、あるグループの前記第一及び第二のプライマーのうち少なくとも１つはグループ特異的な標識を備えている。各グループにおいて、前記試料中の異なる標的配列に対応するアンプリコンは、前記試料中の異なる標的配列に対応するアンプリコントと長さが異なる。グループ特異的標識は、検出装置が異なるグループ特異的標識を区別できるようにすることが好ましい。長さの差は、スタッファー配列の長さによって与えられることが好ましい。本発明の本方法の該実施形態では、好ましくは、前記グループの第一の部分は偶数個のヌクレオチドを有するアンプリコンを有しており、前記グループの第二の部分は奇数個のヌクレオチドを有するアンプリコンを有している。偶数個のヌクレオチドを有するアンプリコンのグループと奇数個のヌクレオチドを有するアンプリコンのグループには、発光スペクトルの重複が最も少ない（蛍光）標識を施すことが好ましい。このため、各グループが奇数個のヌクレオチドを有する２グループのアンプリコンには、発光スペクトルの重複が最少の標識を施す。各グループが偶数個のヌクレオチドを有する２グループのアンプリコンについても、同じことが当てはまる。一方のグループが奇数個のヌクレオチドを有し、他方のグループが偶数個のヌクレオチドを有する２グループのアンプリコンには、発光スペクトルの重複がより大きな標識が施される。本明細書において使用される「発光スペクトルの重複が最少」および「発光スペクトルの重複がより大きい」という相対的概念は、本発明で使用するために標識を選択することができる標識のグループを意味する。この標識のグループは、用いる検出プラットフォームや本明細書において以下に記載されているものなどの他の因子によって変わるであろう。本方法の特に好ましい実施形態では、偶数個のヌクレオチドを有するアンプリコンの第一及び第二のグループと奇数個のヌクレオチドを有する接続された増幅プローブの第三及び第四のグループとが作製され、前記第一及び第二のグループがＦＡＭとＮＥＤでそれぞれ標識され且つ前記第三及び第四のグループが（ＥＴ−）ＲＯＸ及びＪＯＥ若しくはＨＥＸの何れかでそれぞれ標識されるか、又は前記第一及び第二のグループが（ＥＴ−）ＲＯＸ及びＪＯＥ若しくはＨＥＸの何れかでそれぞれ標識され且つ前記第三及び第四のグループがＦＡＭとＮＥＤでそれぞれ標識される。このように、これらの実施形態では、偶数個のヌクレオチド又は奇数個のヌクレオチドのうち何れかを有する断片を両アンプリコンのグループが含有しており、発光スペクトルの重複が最少となる標識を有しているため、異なるグループに属するアンプリコンの検出で生じ得るクロストークが可及的に回避できるので、アンプリコンのグループが併走するように蛍光標識が選択される（以下も参照）。

クロストークを回避するための好ましい実施形態では、従って、１セットのアンプリコンを分析するときには、重複する発光スペクトルを有する色素で標識されたアンプリコン間の長さを異ならせることによって、データの質に対するスペクトルの重複の影響が回避されるように、長さを異ならせるとともに、標識も異ならせることが望ましい。

各標的配列に由来する前記連結されたプローブの長さ及び／又は標識、又は好ましくは長さと標識の組合せが、前記試料中に存在する他の全ての連結されたプローブとは異なることが好ましい。長さが異なるアンプリコンを十分に分離するためには、２つの異なる連結されたプローブ間の長さの差を少なくとも２ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドとする。多型を検出する場合には、２以上の（ＳＮＰ）多型の対立遺伝子における長さの差は２以下であることが好ましく、これにより、異なる対立遺伝子間又は同じ型の多型間で、増幅の効率が同様となることが保証される。このことは、好ましくは両対立遺伝子が同一のプライマー対で増幅され、従って、同一の色素で標識されることを示唆している。

好ましい実施形態、例えば、複数の遺伝子坐の異なる対立遺伝子を検出するための実施形態では、あるグループ内の奇数／偶数長の分布は以下のように設定することができる。２つの遺伝子坐Ｌ１、Ｌ２は、それぞれ、Ｌ１の場合にはＡ１１、Ａ１２、Ｌ２の場合にはＡ２１、Ａ２２という二つの対立遺伝子によって占められる。様々な対立遺伝子の長さ（又はこれらの対立遺伝子に相当するライゲーションされて増幅されたプローブ）は、Ａ１１＞Ａ１２＞Ａ２１＞Ａ２２、Ａ１２−Ａ１１＝２、Ａ２２−Ａ２１＝２、Ａ１２−Ａ２１＝３となるようにする。スペクトル中に重複を有することがある標識を担持するグループＧ１とＧ２の間では、長さの差は１ヌクレオチドとすることができる。このため、Ｇ１（Ａ１１）−Ｇ２（Ａ１１）＝１となり、このため、前記グループは、偶数長又は奇数長で始まる。

この配分は、本明細書に記載されているより高密度に充填した配分に比べて幾つかの著しい利点を有している。同じ長さの異なる配列は、コンフォメーションの差のために、一般に電気泳動の移動度が異なることが知られている。長さの相違が１ヌクレオチドにすぎない場合には、配列の移動度が極めて異なれば、これによってピークが重なる可能性がある。例えば、１つの遺伝子坐を有する２つの対立遺伝子（Ａ１１、Ａ１２）間の移動度の差は、異なる遺伝子坐に由来する２つの対立遺伝子（Ａ１２、Ａ２１）間の移動度の差より小さいものと思われる。Ａ１２とＡ２１間の移動度の差が顕著であれば、このために、検出の信頼性が低くなる可能性がある。本明細書の開示に従って長さの配分を作出することによって、これを回避することができる。次いで、検出の信頼性に対して、低スループットを重み付けする。

異なる標識のスペクトルが重なり合うという問題は、十分に回避される。これは、表Ａに模式的に図示されている。

表Ａ プローブの標識と長さの分配スキームの別例

本発明の１つの実施形態では、１つのグループ内のアンプリコン間に２及び３個のヌクレオチド長の差が交替で出現するように長さを異ならせる（例えば、０、２、５、７、１０、１２）。この場合、別のグループは、長さの差は１、３、６、８、１１、１３等とする。

標的配列
再広義の定義では、前記標的配列は、対象とする任意のヌクレオチド配列であり得る。前記標的配列は、好ましくは、多型を含有し、提示し、又は多型を伴うヌクレオチド配列である。本明細書において、多型という用語は、遺伝学的に確定された２以上の異なる配列又は対立遺伝子が集団中に出現することを意味する。多型マーカー又は多型部位とは、発散が生じる遺伝子坐である。好ましいマーカーは少なくとも２つの対立遺伝子を有しており、各対立遺伝子は、選択した集団の１％超、より好ましくは１０％又は２０％超の頻度で生じる。多型遺伝子坐は、最少１塩基対であってもよい。多型マーカーには、制限断片長多型、可変数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、単純配列リピート、Ａｌｕ等の挿入エレメントが含まれる。最初に同定された対立遺伝子の型は適宜基準型と称され、他の多型遺伝子の型は選択的又は可変的対立遺伝子と称される。特定集団中に最も頻出する対立遺伝子の型は、野生型と称されることがある。二倍体の生物体は、対立遺伝子の形態がホモ接合又はヘテロ接合となり得る。二対立遺伝子多型は２つの型を有する。三対立遺伝子多型は３つの型を有する。一塩基多型は単一ヌクレオチドによって占められる多型部位（対立遺伝子の配列間で変動する部位）に生じる。本部位の前後には、対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、配列の変化が集団中の構成員の１／１００又は１／１０００未満にしか生じない）が存在するのが通常である。一塩基多型は、多型部位に位置する１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されることによって生じるのが通常である。一塩基多型は、基準対立遺伝子からヌクレオチドが欠失し又は基準対立遺伝子にヌクレオチドが挿入されることによって生じることもある。他の多型には、数個のヌクレオチドが少数欠失又は挿入されるものが含まれ、インデルと称される。好ましい標的配列は、ＡＦＬＰマーカー（登録商標）を伴う標的配列、すなわちＡＦＬＰ（登録商標）で検出可能な多型である。

ＤＮＡ
前記核酸試料では、標的を含む前記核酸は、対象とすべき任意の核酸であり得る。前記試料中の核酸はＤＮＡの形態であるのが通常であるとしても、前記試料中に含有されるヌクレオチド配列の情報は、例えば、ＲＮＡ、ポリＡ^＋ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアのＤＮＡ又はクロロプラストのＤＮＡ等のオルガネラＤＮＡ、合成核酸、ＤＮＡライブラリー、クローンバンク、又はこの中から任意に選択し若しくは組み合わせたものを含む任意の核酸源に由来するものであり得る。核酸試料中のＤＮＡは、二本鎖、一本鎖、及び一本鎖ＤＮＡに変性される二本鎖ＤＮＡであり得る。二本鎖配列の変性によって２つの一本鎖断片が生じ、一本鎖断片の一方又は双方は各ストランドに対して特異的なプローブによって分析することができる。好ましい核酸試料は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、制限断片、アダプターをライゲートした制限断片、アダプターをライゲートした増幅された制限断片上に標的配列を備えている。ＡＦＬＰ断片又は断片がＡＦＬＰテンプレート前増幅で得られる。

試料
試料は、２以上の異なる標的配列を含有していることが好ましい（すなわち、２以上とは、試料中の標的配列の量ではなく同一性のことを意味している）。特に、前記試料は少なくとも２つの異なる標的配列を備えており、具体的には少なくとも１０、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも５０、より具体的には少なくとも１００、好ましくは少なくとも２５０、より好ましくは少なくとも５００、最も好ましくは少なくとも１０００の標的配列が加えられている。実際には、標的配列の数は、とりわけ、連結された環状プローブの数によって制約を受ける。例えば、試料中の異なるオリゴヌクレオチドプローブの数が多すぎると、多重増幅工程の信頼性が損なわれることがある。

例えば、１回の注入で電気泳動装置によって分離できる試料中の断片数によっても、制約が生じる。それぞれ、標的配列の数は、生物のゲノムサイズ又はＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を取得した細胞種のトランスクリプトームの複雑さによっても制約を受けることがある。

複数回注入
本発明の好ましい実施形態では、複数の試料の高スループット法を実現するために、複数の試料を同じように処理することにより、複数の増幅された検出試料を生成し、次いで、この試料は標識及び／又は長さの差を少なくとも検出可能なマルチチャネル装置に上で分析することができる。適切な装置は、本明細書に記載されている。

電気泳動プラットフォーム上でのスループットを増加させるために、本出願に記載されている、一般に複数回注入と呼ばれる方法が開発された。同一の電気泳動マトリックス及び／又は短い連続する走行路中に、所定の長さが異なる断片を含有する複数試料を注入することによって、スループットを増加させることができる。全ての検出可能な断片は、１つの試料中で検出することができる、特定範囲内の長さと限られた数の断片のみを有することが好ましく、このため、増幅工程で前記連結されたプローブのサブセットを選択して、アンプリコンのサブセットを得ることによって多重比率を減少させるのに、選択的増幅は有利である。

本発明の方法の工程（ａ）乃至（ｅ）は、各々が２以上の異なる標的核酸を含有する２以上の核酸試料に対して行うことができ、アンプリコンの有無を分析される２以上の増幅された試料を与える。

本発明の方法に従って増幅された試料の多重分析では、続いて分離及び検出を行うために、増幅された試料の少なくとも一部を電気泳動にかける。好ましくは、このような増幅された試料は、増幅された連結プローブを含有するか、少なくとも含有すると考えられており、これは、標的配列が与えられたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし、連結されるように相補的な標的配列上でプローブが隣接してアニーリングしたこと（すなわち、ライゲートされたこと）の指標となる。続いて、次の増幅された試料を加える前に、一定の時間、増幅された試料を分離工程に供する。

本発明の方法では、２以上の異なる増幅された試料（の一部）が、電気泳動装置の同じチャネルに連続して供される（図８）。電気泳動の条件に応じて、連続して与えた２つ（又はそれ以上）の増幅された試料の時間間隔（２３）は、増幅された試料中の増幅された連結プローブ（１９）の中で最も移動度が遅いものが、続いて与えられる増幅試料の中で最も移動度が速い増幅連結されたプローブが検出位置（２４）で検出される前に検出位置（２４）で検出されるようにする。このように、前記装置の１つのチャネルで引き続き複数回注入するときの時間間隔は、連続して与える試料が分離後に検出地点で重ならないように選択される。

好ましい実施形態では、本発明の方法は、さらに、以下の工程
（ｅ１）工程（ａ）乃至（ｅ）を繰り返して、少なくとも２つの増幅された試料を得る工程と、
（ｅ２）工程（ｅ）及び（ｅ１）で得た増幅された試料の少なくとも一部を電気泳動装置のチャネルの試料添加部位に連続して加え、前記増幅された試料中のアンプリコンを電気泳動により分離し、前記チャネルの前記試料添加部位から離れた場所に位置する検出位置において前記分離されたアンプリコンを検出する工程であって、連続して加えられる前記増幅された試料の時間間隔は、増幅された試料中の増幅された連結プローブの中で最も移動度が遅いものが、続いて加えられる増幅された試料の中で最も移動度が速い増幅された連結プローブが検出位置で検出される前に、検出位置で検出されるようにする工程と
を備える。

増幅された試料の連続注入によって各々が複数の異なる標的配列を備え、キャピラリー電気泳動装置等のマルチチャネル電気泳動装置のチャネル中において、前記試料中の標的配列に対応するアンプリコンを備えた複数の試料の高スループット分析が、本発明の方法によって可能となる。本発明の方法は、複数のチャネル上で複数の試料中の複数の標的配列を分析することが可能であり、ヌクレオチド配列を分析するための従来法に比べて、一定の時間枠内に分析可能な試料数のスループットが著しく増加する。本方法では、サイズ範囲が異なる検出すべきアンプリコンを含有する試料が得られるので、コンカテマー（の残り）が存在する方法と比べて、連続注入の時間間隔（２３）を著しく減らすことができる。

前記所定の時間間隔を置くことによって、連続的に与えられた試料中のアンプリコンが分離後に検出点において重複することが避けられる。前記所定の時間間隔は、１）アンプリコンの長さ、２）アンプリコン中の長さの変動、及び３）検出装置とその動作状況によって影響を受ける。同一チャネルに試料を加え、連続的に加えた試料を分離する操作は、好ましくは１つのチャネル中で複数の試料を連続的に電気泳動で分離できるようにするため、及び／又は複数チャネル上で複数の試料を同時分析できるようにするため、及び／又は複数のチャネル上で複数の試料の同時分析を連続的に実行できるようにするため１以上のチャネルで反復して、好ましくは同時に実行してもよい。図８には、このような操作がグラフで図示されている。

増幅された２つの試料を連続的にロードする時間の間隔は、本方法を実行する前に実験的に決定することができる。この時間間隔は、増幅された試料の特徴（特に、増幅された試料中に存在する最も短いアンプリコンと最も長いアンプリコンの長さの差、並びにゲル（マトリックス）及び／又は緩衝液濃度、イオン強度等の他の実験的因子）が与えられれば、試料を与えた試料添加部位とは反対側（遠位）に位置する検出部位において、試料中の異なるアンプリコンを各々別個に検出できる程度に、増幅された試料中の断片が分離されるように選択する。増幅された最終試料を添加した後も、この最終試料のアンプリコンが分離検出できるようにするために、延長時間を設けて分離を継続してもよい。２つの連続した試料を添加する所定の時間間隔と必要に応じて設けられる前記延長時間とは、単一試料内の異なるアンプリコン間に存在する長さの相違が限定的であっても、連続して添加した試料中の異なるアンプリコンが検出位置でそれぞれ検出できるよう分離されるように選択される。このように、様々に異なる長さの断片を含有する試料を電気泳動装置上に連続して添加する（注入する）と、移動パターンの重複が回避される。

本発明の方法を用いる場合、原理的には、試料を連続的に添加し、ロードし、又は注入することが可能であり、このようにすることが好ましい。前記装置は、例えば、プログラム可能なコンピュータによって自動制御された動作を実行できることが好ましい。前記マルチチャネル装置は、このような操作に適していることが好ましく、あるいは、緩衝液、パーツ等の交換のような保守を行わずに長期間作動させるための装備を少なくとも備えていることが好ましい。しかし、現実的には、一般的にこのようなことが当てはまるとは限らない。最終試料を添加したときには、前記最終試料の最後の断片が検出できるまで時間を延長して分離を継続しなければならないのが一般的である。本発明の好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドプローブのタグ中に存在するスタッファーは、増幅された連結プローブ間に長さの差（すなわち、０乃至５００ヌクレオチド塩基又は塩基対）を与えるために使用される。アンプリコンの全長と長さの変動は、これらの断片を分析する技術によって概ね決定される。本発明の方法の高スループット複数回注入法では、増幅された試料中のアンプリコンの長さの範囲は、慣用の（キャピラリー）電気泳動プラットフォームの場合、４０、６０、８０、又は１００ヌクレオチド、塩基、又は塩基対を下限とし、１２０、１４０、１６０、又は１８０ヌクレオチド、塩基、又は塩基対を上限とする。アンプリコンの長さの範囲は、１００乃至１４０ヌクレオチドの範囲を変動することが特に好ましい。しかしながら、これらの数値は、公知の技術による制約を強く受ける。その他の状況が許容されれば、当業者は、本発明によって与えられる知識に基づいて、これらのパラメータを適宜調節することができる。

増幅された連結プローブの長さの変動を制約することによって、多重増幅の信頼性はさらに向上する。複数注入をさらに効率的に使用し、大きめの連結プローブと競合する増幅反応において小さなアンプリコンが優先的に増幅されるのを低減するために、アンプリコンの長さの変動に制限を設けることが好ましい。これによって、本発明の高スループット法の信頼性が向上する。本明細書に開示されている複数回注入プロトコールとともに、これらの措置は、単独で又は複合して、従来技術に比べてスループットを著しく増加させる。試料中に存在する異なるアンプリコンの数を制限することによって、高スループット能は、さらに向上する。複数回注入プロトコールを導入するとともに、ライゲーション／増幅工程の多重能を制限することが、より効率的且つ経済的であると考えられる。本発明の最も有利な側面の１つは、多重ライゲーション、多重増幅を、好ましくは、各々複数の連結プローブを増幅する単一のプライマー対及び／又は複数のプライマー対、反復注入、並びに異なる標識の多重検出と組み合わせることに存する。本発明のさらに有利な点の１つは、各連結プローブ（従って、１つの試料内の各標的配列）が一意的な長さと標識の組合せによって特定できるように、長さと（重複する）標識の両者を異ならせるところにある。これによって、標的配列の分析効率が顕著に向上するのみならず、分析される各標的に対するコストを著しく低減させることが可能となる。

複数回注入プロトコールは、様々な方法で行うことができる。１つの方法は、同一マトリックス中に２以上の試料を複数回ローディングすることである。短い操作を連続して実施してマトリックスが再使用されるために、効率とスループットが増加するので、これは有利であると考えられる。別の方法は、同じ操作において同一マトリックス中に２以上の試料を複数回ローディングすることである。短い操作を連続的に行うことによって、マトリックスを再使用することが好ましい。本実施形態では、第一の試料を注入し、分離する。最後の断片が検出されたら即座に、次の試料をロードする。好ましくは、これらの連続して行われる短い２回の操作の間には、前記操作が同一マトリックス中で行われるように、マトリックスは交換されない。マトリックスの変化が生じることが少ないので、これによって、効率性がさらに増大し、経済性が向上するため、この種の分析で消費される物質（すなわち、緩衝液等）の量を減らすことができ、データ点当りのコストが減る。さらに、時間がかかるマトリックスの交換を大幅に回避することができるので、本方法の効率性はさらに増加する。

それ自体、米国特許第６、１５６，１７８号と国際特許公開第０１／０４６１８号には、複数回ローディング又は複数回注入の諸側面が記載されている。後者の文献には、時間を隔てた複数回注入を用いて、小化合物を分析するスループットが増加した装置及び方法が開示されている。本文献は、１つのヌクレオチド（単一ヌクレオチドプライマー伸長又はＳｎｕＰＥ（ミニシークエンシングとしても知られる））によって伸長されるプライマーを含む試料が、キャピラリー電気泳動装置に対して時間を隔てて複数回注入することにより検出可能なことを開示している。ミニシークエンシングは、予め増幅した標的配列に対して、相補的プライマーをアニールさせることに立脚している。続いて、別個に与えられる標識ヌクレオチドを用いてプライマーを伸長させることによって、プライマーに隣接するヌクレオチドが同定される。原理的には、プライマー伸長産物は、一定の長さを有している。スループットを増加させるためには、操作ごとに、同一長さを有する伸長産物を連続注入することが考えられる。スループットをさらに増加させるためには、異なる長さ（典型的には、１５乃至２５ヌクレオチドの範囲で変動する）のプライマーを使用してもよい。これに対して、本発明では、典型的には、５０乃至１５０ヌクレオチドの間で長さが変動する、多重増幅産物自体を直接分析することを想定している。複数の標的配列が単一の反応で増幅されるのに対して、ミニシークエンシング又はＳｎｕＰＥ増幅を用いると、各標的配列に対する増幅が個別的に行われるので、この方法は、先述したミニシークエンシング又はＳｎｕＰＥより著しく経済的である。さらに、長さが異なり、標的配列に相補的なプライマーを用いると、本発明の方法で必要とされるその後の増幅工程の効率が損なわれる。これらの方法では、多重度が高い試料の高スループット検出に伴う課題が解決されないのが一般的であるし、それに対する解決策も提供しない。

エキソヌクレアーゼ
本発明の好ましい方法は、標的配列にアニールされないオリゴヌクレオチドプローブ、及び／又は連結／ライゲーションされないオリゴヌクレオチドプローブを除去する工程をさらに備える。このようなプローブは、好ましくは増幅前に、好ましくはエキソヌクレアーゼによる消化によって除去される。連結／ライゲートしていないオリゴヌクレオチドプローブを除去／消去することによって、ライゲーションとは無関係な（誤った）標的の増幅をかなり削減することができ、信号対雑音比が高くなる。連結したプローブの情報内容を損なわずに、非連結／ライゲーション成分を１以上消去するための解決法の１つとして、非連結／ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを消化するエキソヌクレアーゼを使用することである（ｉｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）。ブロッキング基には、主鎖中にチオリン酸基及び／又は２−Ｏ−メチルリボース糖基の使用が含まれる。エキソヌクレアーゼとしては、Ｅｘｏ Ｉ（３’−５’活性）、Ｅｘｏ ＩＩＩ（３’−５’活性）及びＥｘｏ ＩＶ（５’−３’と３’−５’の両方の活性）などがある。本発明の環状プローブは、ライゲーションされた後は、ライゲーションされなかった環状プローブとは逆にエキソヌクレアーゼによる切断を受けない。これは、本発明の南京錠プローブを使用する別の利点である。

エキソヌクレアーゼ、例えば、Ｅｘｏ Ｉ（一本鎖特異的）とＥｘｏ ＩＩＩ（二本鎖特異的）を併用することの利点は、実質的に消化されないライゲーション産物配列を残しながら、標的配列と非ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブの両方を破壊できることである。増幅前にエキソヌクレアーゼ処理を使用することによって、各セットのオリゴヌクレオチドプローブを実質的に削減し、したがって、残存するライゲーションされなかったオリゴヌクレオチドプローブと（エキソヌクレアーゼ処理によってやはり実質的に削減された）最初の標的ＤＮＡとのハイブリッド形成、及びオリゴヌクレオチドプライマーセットによってＰＣＲ増幅させるのに適切な基質であるライゲーション産物配列の形成が実質的に減少し、それによって、信号対雑音比が向上する。

サイズラダー
試料は、長さが明らかな１つ以上のヌクレオチド断片を含むヌクレオチド断片サイズ標準とともに供給することができる。ヌクレオチドサイズ標準を調製し使用する方法は、当分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、２００１、同上参照）。このようなサイズ標準は、試料中の単位複製配列のサイズを適切に決定し、したがって、検出された断片を適切に同定する基礎を形成する。サイズ標準は、試料ごと及び／又は注入ごとに供給されることが好ましい。サイズ標準は、好ましくは分析される長さの範囲全体にわたって様々な長さを含むことが好ましい。本発明の特定の実施形態においては、単位複製配列サイズを内挿によって導出できる隣接サイズ標準を添加することが有利と考えられる。隣接サイズ標準は、好ましくは１つは最短の増幅連結プローブよりも少なくとも１塩基短く、好ましくは１つは最長の増幅連結プローブよりも少なくとも１塩基長い少なくとも２つの標識オリゴヌクレオチド配列を含むサイズ標準であって、内挿可能であり、試料にさらに長さの変化が導入されるのを最小限に抑えることができるサイズ標準である。好ましい隣接サイズ標準は、最短の増幅連結プローブよりも１ヌクレオチド短い１つのヌクレオチドと、最長の増幅連結プローブよりも少なくとも１塩基長い１つのヌクレオチドとを含み、試料中に含まれる単位複製配列を標識するために使用される標識と同じ少なくとも１つの色素で標識されている。

適切なサイズ標準を構築する好適な方法は、適切な標識で末端標識された適切な長さのオリゴヌクレオチドの（特別な）化学合成である。サイズ標準は、連続して適用された試料ごとに使用されて、装填した試料断片のサイズを決定する局部的なサイズ基準として役立つ。サイズ標準は、電気泳動装置の分析試料と同じチャネル又はレーンに使用することができ、すなわち、試料と一緒に使用することができ、又はマルチチャネル／レーン装置の並行チャネル又はレーンに使用することができる。隣接サイズ標準は、本方法で使用する任意の標識で標識することができる。サイズ標準が装置の同一チャネルに使用される場合、そのサイズ標準の断片は、試料中の単位複製配列を検出するのに使用する標識とは識別可能な標識で標識されることが好ましい。

プーリング
この技術の変形技術においては、複数の個体の出発（ＤＮＡ）材料がプールされて、この材料を含有する検出試料がより少量で検出装置に装填されるようになる。これは、出発試料の特定のプール、例えば特定の形質に対する表現型が異なる個体に由来する出発材料のプールに特異的である（ＳＮＰ対立遺伝子を表すものなどの）増幅連結プローブを同定することが目的である連鎖不平衡（ＬＤマッピング）の場合に有利になり得る。

用途
本発明の一側面は、様々な用途におけるこの方法の使用に関する。本発明による方法の用途は、遺伝子型の決定、転写物プロファイリング、遺伝地図、遺伝子発見、マーカーを用いた選択、種の品質管理、ハイブリッド選択、ＱＴＬマッピング、バルク分離個体分析、ＤＮＡフィンガープリント法、ミクロサテライト分析などの技術であるが、これらだけに限定されない。別の側面は、標的核酸配列の存在量の同時高スループット検出に関する。この手法は、バルク分離個体分析（ＢＳＡ、Ｂｕｌｋ Ｓｅｇｒｅｇａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）として一般に知られている。

一塩基多型の検出
本発明による高スループット法の特に好ましい１つの用途は、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出である。環状オリゴヌクレオチドプローブの第１の標的相補的部分は、好ましくは、多型部位、すなわち単一多型ヌクレオチドに隣接して位置する。第２の標的相補的部分は、その末端塩基が多型部位に位置するように、すなわち、単一多型ヌクレオチドに相補的であるように設計される。この末端塩基が、標的配列中の多型部位に存在するヌクレオチドに相補的である場合、標的配列にアニールされて、２つの標的相補的部分がライゲートされる。末端ヌクレオチド、すなわち対立遺伝子特異的ヌクレオチドが一致しないときには、ライゲーションが起こらないか、わずかにしか起こらず、多型の検出はなされない。

試料中の標的配列の１つが一塩基多型（ＳＮＰ）から誘導され、又は一塩基多型（ＳＮＰ）を含むとき、対立遺伝子に特異的なプローブに加えて、対立遺伝子の同定を可能にするだけでなく、ＳＮＰの可能な対立遺伝子の各々の同定も可能にする別のプローブを提供することができる（共優性スコアリング（ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｃｏｒｉｎｇ））。そのため、標的相補的部分の組合せ、すなわち、関連するすべての対立遺伝子で同一である１相補的部分と、対立遺伝子候補の各々に特異的であるもう一方の１つ以上の相補的部分とを提供することができる。これらの別のタイプの１つ以上の相補的部分は、基本的に同じ相補配列を含むが、それぞれが特定の対立遺伝子に対応するヌクレオチドを、好ましくはその末端に含む点で異なる。対立遺伝子に特異的な部分は、予想される異なる対立遺伝子の数に相当する数だけ提供することができる。その結果、対立遺伝子特異的プローブに、異なる長さのスタッファー配列（好ましい）又は異なる標識を組み込むことによって、１相補的部分と他の４つの（対立遺伝子特異的）相補的部分との組合せによって１つのＳＮＰを特徴づけることができ、４つの理論的に可能な対立遺伝子（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ１つずつ）のすべてを同定することができる。

好ましくは一塩基多型の同定を対象にする実施形態においては、オリゴヌクレオチドプローブの第１の相補的部分は、多型部位を含まない標的配列の一部を対象にし、オリゴヌクレオチドプローブの第２の相補的部分は、目的とする多型部位に相補的な１つ以上のヌクレオチドを、好ましくは第１の相補的部分から離れた末端に含む。隣接部分のライゲーション後、その連結プローブは、一塩基多型の対立遺伝子の１つに特異的である。

標的配列中の多型部位の対立遺伝子を同定するために、１セットのオリゴヌクレオチドプローブを与えることができ、この場合、１つの第１の相補的部分と１つ以上の第２の相補的部分が与えられる。次いで、第２の各相補的部分は、相補配列の末端、好ましくは３’末端に、既知の長さのスタッファーと組み合せられた特異的ヌクレオチドを含有する。例えば、Ａ／Ｃ多型の場合、第２の相補的部分は、２ヌクレオチドのスタッファー長と組み合せられた特異的ヌクレオチドＴを含み、この多型に対する別の第２の相補的部分では、Ｇと０のスタッファー長とを組み合せることができる。プライマーと、プローブの相補的部分は、好ましくは同じ長さであるので、得られる単位複製配列の長さの違いは２ヌクレオチドになる。多型部位の理論的に可能な４つのヌクレオチドすべてが存在すること及び／又は存在しないことが望ましい場合、スタッファーに特異的なヌクレオチドの組み合せをそれに応じて適合させることができる。同じ増幅プライマー対（したがって標識）で増幅された、又は発光スペクトルが重なった標識を有する複数の増幅プライマー対で増幅された複数の標的配列を含有する試料においては、結合スタッファー長は、すべての連結プローブが一義的な長さになるように選択される。図４に、２つの遺伝子座及び各遺伝子座に対する２つの対立遺伝子についてこの原理を図示する。好ましい実施形態においては、この原理は、１つの遺伝子座当たり少なくとも２つの対立遺伝子を含む少なくとも１０個の遺伝子座に拡張することができる。

特異的標的配列の検出
標的配列は、ゲノムに由来する既知のヌクレオチド配列を含む。このような配列は、必ずしも多型を含まないが、例えば、遺伝子、プロモーター、遺伝子移入セグメント、又は導入遺伝子に特異的であり、あるいは生産形質、耐病性、収率、雑種強勢に関する情報を含み、ヒト、動物及び植物における腫瘍又は他の疾患及び／又は遺伝子機能の指標である。このため、環状プローブの第１及び第２の相補的部分は、ゲノム中の所望の情報に関連する好ましくは一義的な標的配列に対応するように設計される。標的配列中の相補的部分は、互いに隣接して位置する。所望の標的配列が試料中に存在する場合、２つのプローブは、隣接してアニールされ、ライゲーション及び増幅後に検出することができる。

ＡＦＬＰマーカーの検出
ＡＦＬＰ、その応用及び技術は、Ｖｏｓ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．２３、（１９９５）、４４０７−４４１４並びに欧州特許公開第０ ５３４ ８５８号及び米国特許第６，０４５，９９４号に記載されており、すべてを参照により本明細書に援用する。ＡＦＬＰ、その利点、その実施形態、その技術、酵素、アダプター、プライマー、さらに、使用する化合物、ツール及び定義についてのさらに詳細な記述については、ＡＦＬＰに関連して本明細書で上述した出版物の関連する節に明記されている。ＡＦＬＰ及びその関連技術は、例えば特異的遺伝マーカー（いわゆるＡＦＬＰマーカー）を同定する強力なＤＮＡフィンガープリント技術であり、ある種の遺伝子又は遺伝形質の有無の指標となり、又は一般に、既知の起源又は制限パターンのＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ試料を比較するために使用することができる。ＡＦＬＰマーカーは、一般に、分析するヌクレオチド配列中の多型部位の有無に関連する。このような多型は、選択ヌクレオチド中の制限酵素切断部位に、例えばインデル若しくは置換体の形で、又は制限断片の残部に、例えばインデル若しくは置換体の形で存在し得る。ＡＦＬＰマーカーがそれ自体同定されると、ＡＦＬＰマーカーに関連する多型を同定することができ、本発明のライゲーションアッセイに使用するプローブを生成させることができる。

別の側面においては、本発明は、標的配列の対応する部分にハイブリダイズすることが可能である第１及び第２の部分を含み、さらに少なくとも１つ、好ましくは２つのプライマー結合配列及びスタッファーを含む環状核酸プローブに関する。本発明によるプローブの別の実施態様は、上述したとおりである。本発明は、２つ以上のプローブを含む１セットのプローブにも関し、各プローブは標的配列の一部に相補的である第１の部分と第２の部分を含み、その相補的な第１の部分と第２の部分は標的配列にハイブリダイズしたときに本質的に隣接して位置し、各プローブは、その相補的部分に本質的に隣接して位置するスタッファーと、そのスタッファーに本質的に隣接して位置する少なくとも１つ、好ましくは２つのプライマー結合配列とをさらに含む。

本発明は、別の側面において、少なくとも１つのヌクレオチド配列の分析、好ましくは一塩基多型の検出における環状プローブ又は１セットのプローブの使用に関し、このセットは、さらに、既知のＳＮＰ対立遺伝子に相補的であるヌクレオチドを含有する少なくとも１つの追加のプローブを含む。このセットは、特異的一塩基多型の各対立遺伝子に対するプローブを含むことが好ましい。１セットのプローブを使用することは、一塩基多型の高スループット検出方法においてはさらに好ましく、プローブ中のスタッファー長は一塩基多型の遺伝子座及び／又は対立遺伝子に特異的である。

本発明の別の側面は、プライマーに関し、より詳細には第１のプライマーと１つ以上の第２のプライマーとを含むプライマーセットに関し、第２の各プライマーは標識を含み、前記標識に特異的であるヌクレオチド配列を含む。

本発明には、キット形式の実施形態も含まれる。本発明によるキットは、例えばこの方法での使用に適したプローブを含むキット、並びにプライマーを含むキット、さらに、プライマー及びプローブを含む組み合せキットであり、好ましくはすべてが酵素緩衝剤などを適切に備える。

本発明の効率は以下のように説明することができる。４つの標識を同時に検出可能な９６チャネルのキャピラリー電気泳動装置を使用すると、本発明の方法を使用して、経験的に最適化された最少の注入間隔を選択し、１チャネル当たり１回の実行操作で１２回の注入を続けることができ、２０個の目的標的配列を含む試料では、９６（チャネル）＊１２（注入）＊２０（標的）＊４（標識）＝９２１６０標的配列の高スループット検出が可能になる。共優性ＳＮＰ検出の場合、４６０８０個のＳＮＰに関するデータを単一の実行操作で検出することができる。

本発明を、添付の図によって説明する。これらの図では、隣接してハイブリダイズする２本の直鎖プローブによって、本発明の多数の特徴が説明されている。当業者は、これらの特徴のほとんどが本明細書に開示する環状プローブなどの他の実施態様にも適用され、本願で提供する情報に基づいて、環状プローブなどの他の実施態様にこれらの特徴をどのように導入するかを理解するはずである。

Ｉ．スタッファー配列の設計
増幅産物の交差ハイブリッド形成を防止するために、スタッファー配列の配列が異なり、ヘアピンを形成しないことが好ましい。表１−５には、各蛍光色素用プローブの開発に使用可能であるスタッファー配列が示されており、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ バージョン２．０（（著作権）１９９０、１９９１、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてヘアピンが存在しないことを確認した。スタッファー配列は、１つのＧ、Ｃ、Ｔ及びＡを含む無作為に選択された四量体ブロックから構築され、したがって、必然的にＧＣ含量は５０％である。２つのＳＮＰ対立遺伝子に対する順方向ＯＬＡプローブ中のスタッファー配列は、優先的なＳＮＰ対立遺伝子増幅を防止するために同一なままであった。

ＩＩ．多重ライゲーションアッセイ及び検出の実施例
実施例１．生物学的材料及びＤＮＡ単離の説明
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓエコタイプのＣｏｌｏｍｂｉａとＬａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａの交雑種から発生したリコンビナント近交系（ＲＩ）系統（Ｌｉｓｔｅｒ及びＤｅａｎ、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、４、ｐｐ ７４５−７５０、（１９９３）を使用した。親系統及びＲＩ系統の種子をＮｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅから入手した。

それ自体既知の方法、例えば、基本的に欧州特許第０５３４８５８号に記載された方法を用いて個々の苗木の葉からＤＮＡを単離し、１Ｘ ＴＥ（１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）溶液に保存した。分光光度計（ＭＥＲＫ）のＵＶ測定を標準手順で実施して濃度を決定し、１Ｘ ＴＥを用いて１００ｎｇ／μｌに調整した。

実施例２．ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＮＰの選択
Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＴＡＩＲ）ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ＳＮＰｓ．ｈｔｍｌから選択したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＮＰを表６に要約する。

実施例３．オリゴヌクレオチドライゲーション反応用オリゴヌクレオチドプローブ設計
オリゴヌクレオチドプローブ（５’−３’配向）を選択して、実施例２に記載した１２個のＳＮＰ遺伝子座の各々に対するＳＮＰ対立遺伝子を識別した。ＰＣＲ結合領域を下線で、スタッファー配列を二重下線で示す。リバースプライマーは５’末端がリン酸化されている。ｐはリン酸化を示す。配列を表７に要約する。

実施例４．ＰＣＲ増幅プライマーの設計
ＰＣＲ増幅に使用したプライマーの配列は、実施例３に記載したライゲーションプローブに組み込まれたＰＣＲプライマー結合領域に相補的である。その配列は、いわゆるＭ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマーである。通常、フォワードプライマーは、検出プラットフォームに応じてＦＡＭ又は^３３Ｐ−ｄＡＴＰで標識される。５’−３’配向のプライマー配列は、
Ｍ１３フォワード：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC［配列番号３７］
Ｍ１３リバース：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA［配列番号３８］
である。
これらのオリゴの濃度を５０ｎｇ／μｌに調整した。

実施例５．緩衝剤及び試薬
緩衝剤組成は、以下のとおりであった。ハイブリッド形成緩衝剤（１Ｘ）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤ^＋ライゲーション緩衝剤（１Ｘ） ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、２５ｍＭ Ｋａｃ、１０ｍＭ ＭｇＡｃ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤ^＋、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００。ＰＣＲ緩衝剤（１０Ｘ）：１０ｘ ＰＣＲ緩衝剤（１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む）。（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）。ＰＣＲでは、添加剤を使用しなかった。

実施例６．ライゲーション及び増幅
ライゲーション反応：
ライゲーション反応を以下のように実施した：全体積５μｌの１００ｎｇゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌを１μｌ）を９４℃で５分間インキュベーションして熱変性させ、氷冷した。次に、実施例３に記載した各ＯＬＡフォワード及びリバースプローブ４ｆｍｏｌ（計３６オリゴヌクレオチド）を添加し、その混合物を６０℃で１６時間インキュベートした。次に、１単位のＴａｑリガーゼ（ＮＥＢ）を添加し、その混合物を６０℃で１５分間インキュベートした。
次に、リガーゼを９４℃で５分インキュベーションして熱失活させ、使用するまで−２０℃で保存した。

ＰＣＲ増幅：
ＰＣＲ反応混合物は、ライゲーション混合物１０μｌ、５０ｎｇ／μｌの（実施例４に記載した）（ＦＡＭ又は^３３Ｐ）標識Ｍ１３フォワード及びリバースプライマー１μｌ、各ｄＮＴＰ２００μＭ、２．５単位のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｑｉａｇｅｎ、１０Ｘ ＰＣＲ緩衝剤５μｌを全体積５０μｌ中に含んでいた。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９７００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）中でのサーマルサイクリングによって、以下のサーマルサイクリンプロファイルに従って増幅を実施した。

プロファイル１：初期変性／酵素活性化９４℃１５分、続いて９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分及び最終伸長７２℃２分を３５サイクル、４℃、そのまま維持。
プロファイル２：初期変性／酵素活性化９４℃１５分、続いて５ｓｅを３５サイクル。
^３３Ｐ末端標識Ｍ１３フォワードＰＣＲプライマーを使用する場合、Ｖｏｓ等、１９９５（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．２３：ｎｏ．２１、ｐｐ．４４０７−４４１４、１９９５及び欧州特許第０５３４８５８号）に記載のリン酸化によって標識した。

実施例７．１２個のＳＮＰＷａｖｅ産物の放射性検出
図１０に、実施例２で列挙した１２組のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＳＮＰの多重オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイの電気泳動ゲルを示す。本明細書で上述した手順に従って、Ｃｏｌｏｍｂｉａエコタイプ（Ｃ）、Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａエコタイプ（Ｌ）、又は等量の両エコタイプ（Ｃ＋Ｌ）の混合物のＤＮＡを出発材料として用いた。

図１０は、ＳＮＰ ＳＧＣＳＮＰ１６４、ＳＧＣＳＮＰ１１９、ＳＧＣＳＮＰ６９、ＳＧＣＳＮＰ２９、ＳＧＣＳＮＰ２７及びＳＧＣＳＮＰ１のＳＮＰの適切な対立遺伝子がＣｏｌｏｍｂｉａ試料中に明確に観察され、ＳＮＰ遺伝子座ＳＧＣＳＮＰ１６４、ＳＧＣＳＮＰ１１９、ＳＧＣＳＮＰ６９、ＳＧＣＳＮＰ２９、ＳＧＣＳＮＰ２７及びＳＧＣＳＮＰ１の適切なＳＮＰ対立遺伝子がＬａｎｄｓｂｅｒｇ試料中に明確に観察され、これらのＳＮＰ対立遺伝子すべてが両方の試料の混合物中に観察されることを示している。

この実施例は、多重ライゲーション／増幅手順を用いて、少なくとも６個のＳＮＰを同時にライゲートし増幅できることを示している。この実施例は、さらに、少なくとも１２個のＳＮＰを１つの試料中に検出できることを示している。結果を表８に示す。

実施例８．ゲル電気泳動
Ｖｏｓ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３（２１）、（１９９５）、４４０７−４４１４に記載のようにゲル電気泳動を実施した。乾燥ゲルをホスホイメージングスクリーン（富士写真フィルム、タイプＢＡＳ ＩＩＩ）に１６時間露出させた後、富士スキャナー（富士写真フィルム、Ｆｕｊｉｘ ＢＡＳ ２０００）を用いてスキャンして画像を得て、デジタル形式で保存した。

実施例９．キャピラリー電気泳動用オリゴヌクレオチドサイザー（sizer）
サイザー９４ｂｐ：
5’fam-
ACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCG［配列番号３９］
サイザー９５ｂｐ：
5’fam-
ACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGG［配列番号４０］
サイザー１３７ｂｐ：
5’fam-
ACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTC［配列番号４１］

実施例１０．増幅連結プローブの精製及び希釈
ＭｅｇａＢＡＣＥ １０００キャピラリー配列決定装置を用いた検出の場合、ＰＣＲ反応混合物の脱塩及び精製を、以下の手順を用いて、９６ウェル形式で実施した。

Ａ．９６ウェルＳｅｐｈａｄｅｘ精製プレートの調製
乾燥したＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−５０ ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、９６ウェルプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（商標）−ＨＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）のウェルに、４５マイクロリットルカラムローダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて以下のように充填した。

１．Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ ｓｕｐｅｒｆｉｎｅをカラムローダーに添加した。
２．カラムローダーの上部からスクレーパーを用いて過剰のＳｅｐｈａｄｅｘを除去した。
３．カラムローダーの上にＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶプレートを反転させて置いた。
４．Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶプレート及びカラムローダーをともに反転させた。
５．カラムローダーの上部又は側面を軽くたたいてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を投入した。

次に、以下のようにＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を膨潤させリンスした。
６．マルチチャネルピペッタを用いて１つのウェル当たり２００μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を添加した。
７．遠心アラインメントフレームを、標準９６ウェルマイクロプレートの上に置き、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶプレートを上に置き、９００ｇで５分間遠心機にかけてミニカラムを充填した。
８．９６ウェルプレートを空にし、元の位置に戻した。
９．工程５−７をもう１度繰り返した。
１０．２００μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を各ウェルに添加してＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を膨潤させ、２−３時間インキュベートした。時折、この段階で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ ｓｕｐｅｒｆｉｎｅの膨潤したミニカラムを含むＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶプレートをパラフィルムできつく密封し、使用するまで冷蔵庫に４℃で保存した。

１１．遠心アラインメントフレームを、標準９６ウェルマイクロプレート上に置き、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶプレートをその構築物の上に置き、９００ｇで５分間遠心機にかけてミニカラムに充填した。
１２．９６ウェルマイクロプレートを取り外した。
１３．増幅連結プローブを含む混合物を各ウェルの中心に慎重に添加した。
１４．遠心アラインメントフレームを使用して、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶプレートを新しい標準Ｕ底マイクロタイタープレートの上に置き、９００ｇで５分間遠心機にかけた。
１５．標準９６ウェルプレート中の溶出液（１つのウェル当たり約２５μｌ）は、精製された産物を含む。

Ｂ．精製産物の希釈
精製試料を、注入前にＭｉｌｌｉ−Ｑ水で２５−７５倍に希釈した。

実施例１１．ＭｅｇａＢＡＣＥ上のキャピラリー電気泳動
試料調製：
ＥＴ−９００ Ｒｏｘサイズ標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を水で８００倍に希釈した。希釈ＥＴ−９００ Ｒｏｘ８μｌを精製試料２μｌに添加した。泳動前に、サイズ標準を含む試料を９４℃で１分間インキュベーションし、その後氷上に置いた。

ＭｅｇａＢＡＣＥ上での検出：
ＭｅｇａＢＡＣＥキャピラリーに１Ｘ ＬＰＡマトリックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を製造者の指示に従って充填した。試料の動電注入のパラメータは以下のとおりであった：３ｋＶで４５秒。実行パラメータは、１０ｋＶで１１０分間であった。実行後、クロストーク補正、ピークのスムージング及びクロストーク補正を、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｅｒソフトウエア、バージョン１．０ ２０００１０１７作製（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて実行し、電気泳動図を作成した。

実施例１２．ＭｅｇａＢＡＣＥ上での反復注入
２つの連続注入試料を適切に分離させる最小時間間隔を、実施例８に記載したサイザー試料を注入して決定した。得られた時間間隔に、オリゴヌクレオチドアッセイから精製された増幅連結プローブを注入するときに、わずかな余裕を持たせて使用した。結果を図１１に示す。

Ａ．キャピラリー電気泳動装置（ＭＥＧＡＢａｃｅ）上のＣｏｌｏｍｂｉａ試料のＦＡＭ標識検出の部分電気泳動図。同じ多重混合物を２回注入した。（９７−１３４ｂｐのサイズの）増幅連結プローブ及び隣接サイザー断片（９４、９５及び１３７ｂｐ）はすべてＦＡＭで標識されている。
Ｂ．キャピラリー電気泳動装置（ＭＥＧＡＢａｃｅ）上のＬａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａ試料のＦＡＭ標識検出の部分電気泳動図。同じ多重混合物を２回注入した。（９７−１３４ｂｐのサイズの）増幅連結プローブ及び隣接サイザー断片（９４、９５及び１３７ｂｐ）はすべてＦＡＭで標識されている。

実施例１３．異なる長さのスタッファー配列を用いたクロストーク低減
この実験では、ＳＮＰマーカーのデータセットの優性評価（有り／無し）品質に対する不完全なクロストーク除去の悪影響を防止するための異なる長さと標識の組み合せの使用を実証する。スタッファー長さを、ＥＴ−ＲＯＸとＪＯＥ標識断片が同じサイズであり、ＦＡＭとＮＥＤ断片が同じサイズであるが、ＥＴ−ＲＯＸ及びＪＯＥ標識断片サイズとは１塩基対異なるように選択した。その結果、増幅産物の予想サイズが標識ごとにわかっているので、発光スペクトルが重なる色素間のクロストーク除去が不完全な場合でさえ、観測される信号が不正確な評価に至らない。したがって、真の信号の予想パターンを定義する長さと標識の組合せは、不完全なクロストーク補正に起因する信号である。結果を図１２及び１３に示す。

図１３に示す実施例：
Ａ）．特定サイズの断片をすべての標識と組み合せて観測し得る状況において、１２０塩基対のＥＴ−ＲＯＸ標識断片及び１２４塩基対のＮＥＤ標識断片を含む試料の場合のデータ品質に対する不完全なクロストーク除去の効果。この場合、１２０ｂｐにおけるＦＡＭチャネルへのＥＴ−ＲＯＸ信号クロストークの不完全な除去は、１２０塩基対のＦＡＭ断片（実際には、１２０塩基対のＥＴ−ＲＯＸ標識断片）の不正確な評価につながる。同様に、１２４ｂｐにおけるＪＯＥへのＮＥＤ信号クロストーク補正の不完全な除去は、正確な断片に加えて、１２４塩基対のＪＯＥ断片（実際には、１２４塩基対のＮＥＤ標識断片）の不正確な評価につながる。
Ｂ）．同じ長さのＥＴ−ＲＯＸ及びＦＡＭ標識断片などのクロストーク最適長さと標識の併用効果は、それらの発光スペクトルが重なるので、異なるスタッファー長さを選択することによっては避けられない。同様に、ＪＯＥ及びＮＥＤで標識された同じサイズの増幅連結プローブ断片も回避される。（上記Ａに記載のものと同一の）１２０ｂｐのＥＴ−ＲＯＸ標識断片及び１２４ｂｐのＮＥＤ標識断片を含む仮想試料の場合、不完全な（数学的）クロストーク補正後に残る小さいが検出可能な１２０ｂｐのＦＡＭと１２４ｂｐのＪＯＥの信号（ピーク）は、それぞれＥＴ−ＲＯＸ信号とＮＥＤ信号のクロストークから生じることがわかっているので評価されない。したがって、これらは、データ品質に影響を及ぼさず、両方の断片は正確に評価される。

実施例１４．ＳＮＰの同定
選択したＳＮＰを同定し表９に要約した。

実施例１５．オリゴヌクレオチドライゲーション反応用オリゴヌクレオチドプローブ設計
環状オリゴヌクレオチドプローブ（５’−３’配向）を選択して、実施例１４に記載したＳＮＰ遺伝子座の各々に対するＳＮＰ対立遺伝子を識別した。ＰＣＲ結合領域を下線で、スタッファー配列を二重下線で示す。リバースプライマーは５’末端がリン酸化されている。ｐはリン酸化を示す。配列を表１０に要約する。

実施例１６．ＰＣＲ増幅プライマーの設計
ＰＣＲ増幅に使用するプライマーの１つの配列は、実施例１５に記載したライゲーションプローブに組み込まれたＰＣＲプライマー結合領域に相補的である。第２のＰＣＲプライマーの配列は、プローブのＰＣＲプライマー結合領域に一致した。通常、フォワードプライマーを標識する。オリゴヌクレオチド濃度を５０ｎｇ／μＬに調整した。５’−３’配向のプライマー配列を表１１に示す。

実施例１７．ライゲーション及び増幅
ホモ接合のトマト系統の９つの試料（試料ｌ−９）（実施例１４）を、２０個の南京錠（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブ（セット４）の混合物を用いて、多重オリゴヌクレオチドライゲーション反応に供した。使用した条件は、体積１０μｌ中ｌｘ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ緩衝剤（ＮＥＢ）、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ０．２Ｕ／μｌ、及び各プローブ０．０５ｆｍｏｌ／μｌであった。サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて以下のサイクリング条件でライゲーションを実施した：９４℃２分＋１０＊（９４℃１５秒＋６０℃６０分）＋４℃維持。ライゲーション後、ライゲーション産物１０μｌを１ｘ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ緩衝剤３０μｌで希釈した。各反応物４０μｌを使用して、それぞれＭＯＯｋに結合した４つの異なる標識ＥＯＯｋプライマーを用いて増幅反応を４回実施した。ＥＴ−ＲＯＸ及びＪＯＥで標識されたＥＯＯｋプライマーを、ＦＡＭ及びＮＥＤで標識されたＥＯＯｋの長さよりも１ｂｐ余分に設計して、これらの産物をＭｅｇａＢＡＣＥで分析したときに起こり得る蛍光標識間のクロストークを防止した。使用した条件は、ＰＣＲ反応物２０μｌ中１０μｌ希釈ライゲーション産物に対して、標識ＥＯＯｋプライマー３０ｎｇ及びＭＯＯｋプライマー３０ｎｇ、ｌｘ Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ緩衝剤Ｉ、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．４μｌであった。サーモサイクラーを用いて以下のサイクリング条件でＰＣＲを実施した：９４℃２分＋３５＊（９４℃１５秒＋５６℃３０秒＋６８℃６０秒）＋４℃維持。ＰＣＲ産物をＳｅｐｈａｄｅｘ ５０を用いて精製し、ＭＱで８０倍に希釈した。希釈ＰＣＲ産物をＭｅｇａＢＡＣＥで分析した。様々な蛍光標識産物を別個に異なる組み合せ（２、３及び４蛍光色素）で分析した。結果を図１６に示す。

実施例１８：長さ／色素組み合せの使用及びＬＰＡマトリックスを再使用する反復注入の原理
運転中ＬＰＡマトリックスを変えずに連続運転してセット４の増幅産物を分析した。４０分の運転期間後マトリックスを変えずに増幅産物試料を注入した。結果を図１７に示す。マトリックスを変えず、データ品質をさほど落とさずに連続運転することができる。

実施例１９：多重ライゲーション試料の選択的増幅
この実験は、選択ヌクレオチドを含む（ＡＦＬＰ）増幅プライマーを用いて、形成されたライゲーション産物のサブセットの選択的増幅と組み合せた、多重度のより高いオリゴヌクレオチドライゲーションの可能性を実証する。
プライマーは、４つの設計プローブセットを用いて、セット１、２、４及び５をもとにするが、プローブ中のプライマー結合部位の３’に接して追加の選択ヌクレオチドを含む。
各セットは、別個に、他のセットと組み合せて、４セットのすべてをもとに最高４０の多重度でライゲートされた。異なる標識ＥＯＯｋプライマーを用いたＡＦＬＰ＋１／＋１増幅を下記に示すスキームによって実施した。

使用した条件は、体積１０μｌ中、ｌｘ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ緩衝剤（ＮＥＢ）、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ０．２Ｕ／μｌ、及び各プローブ０．０５ｆｍｏｌ／μｌであった。サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて以下のサイクリング条件でライゲーションを実施した：９４℃２分＋１０＊（９４℃１５秒＋６０℃６０分）＋４℃維持。ライゲーション後、ライゲーション産物１０μｌを１ｘ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ緩衝剤３０μｌで希釈した。
使用した条件は、ＰＣＲ反応物２０μｌ中１０μｌ希釈ライゲーション産物に対して、標識ＥＯＯｋプライマー３０ｎｇ及びＭＯＯｋプライマー３０ｎｇ、ｌｘ Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｉ、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．４μｌであった。サーモサイクラーを用いて以下のサイクリング条件でＰＣＲを実施した：９４℃２分＋３５＊（９４℃１５秒＋５６℃３０秒＋６８℃６分）＋４℃維持。ＰＣＲ産物をＳｅｐｈａｄｅｘ ５０を用いて精製し、ＭＱで８０倍に希釈した。希釈ＰＣＲ産物をＭｅｇａｂａｃｅで分析した。様々な蛍光標識産物を別個のキャピラリーで分析した。結果を図１８に示す。

緩衝剤組成：
ｌｘ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ緩衝剤
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
２５ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
１０ｍＭ ＤＴＴ
１ｍＭ ＮＡＤ
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
（ｐＨ７．６、２５℃）
１ｘＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝剤
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．４）
５０ｍＭ ＫＣｌ
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ
耐熱性ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）タンパク質
１０％グリセリン

増幅連結プローブを生じるオリゴヌクレオチドライゲーション−増幅アッセイの概略図。第１及び第２のプローブがそれぞれ相補的である区画（４）及び（６）でハイブリッド形成可能である第１の部分（５）及び第２の部分（７）を含む標的配列（２）。これらのプローブは、標的配列に相補的でないタグ配列（８、９）を含む。タグ配列は、スタッファー配列（１０、１１）及びプライマー−結合部位（１２、１３）を含むことができる。プローブハイブリッド形成及びライゲーション後、対応するプライマー結合部位にハイブリダイズ可能なプライマー（１６、１７）を用いて連結プローブ（１５）を増幅させることができる。プライマーの少なくとも１つは標識（Ｌ）を含む。増幅によって、単位複製配列（２０）を含む増幅試料が得られる。 ２つの連結プローブの概略図。 （ａ）１つのプローブのみがスタッファー（１０）とプライマー結合配列（１２、１３）を含む。 （ｂ）両方のプローブがスタッファー（１０、１１）とプライマー結合配列（１２、１３）を含む。 マルチチャネル装置の１チャネルにおける模式的な溶出プロファイルを含む異なる長さと標識の一義的な組み合せの概略図。 本発明のオリゴヌクレオチドライゲーション−ライゲーションアッセイの概略図。その原理を簡単にするために２つの遺伝子座１及び２、並びに各遺伝子座の２つの対立遺伝子の場合について示すが、各々２つの対立遺伝子を有する少なくとも１０遺伝子座に容易に拡張することができる。プライマーセットは、１つの第１のプライマー（太い実線）と１つの第２のプライマー（太い破線）とからなる。理論的に可能な連結プローブを、プライマーとともに模式的に略記する。連結プローブは長さが異なる。 本発明のオリゴヌクレオチドライゲーション−ライゲーションアッセイの概略図。２つの遺伝子座３及び４、並びに各遺伝子座の２つの対立遺伝子の場合についてその原理を示す。プライマーセットは、１つの第１のプライマーと２つの第２のプライマーとからなる。理論的に可能な連結プローブを、プライマーとともに模式的に略記する。連結プローブは長さと標識が異なる。 ８０個の増幅連結プローブを含む試料であって、 ・奇数の長さを有し標識１及び標識３で標識された増幅連結プローブの場合、長さの違いが１３５塩基対（ｂｐ）−９７ｂｐであり、 ・偶数の長さを有し標識２及び標識４で標識された増幅連結プローブの場合、長さの違いが１３４ｂｐ−９６ｂｐであり、 ・標識１、２、３又は４を有する９４／９５及び１３６／１３７（ｂｐ）のオリゴヌクレオチドを含む隣接サイズラダーを含む試料の結果の概略図。 標識１、２、３及び４で標識された複数の増幅連結プローブを含む１つの試料を投入した１つのチャネルにおける分離プロファイルの概略図。複数の標識増幅連結プローブが、検出点において検出可能に分離される。 １つのチャネルに試料を複数回注入する様子が模式的に示されている。引き続き試料を注入する時間間隔（２３）と最後の試料を加えた後に付加した時間（２５）がグラフで示されている。 最大４０遺伝子座のライゲーション、及び続いて行われる本方法の増幅工程と検出工程の概略図。分析する遺伝子座の複雑性及び数に応じて、その手順においてプーリングが企図されるポイントを随意の（点線の）特徴として示す。ここでの増幅は、１つの順方向プライマー（フォワード）、及び各標識に対して１つの（異なる標識の）逆方向プライマー（リバース１、２、３、４）を用いて実行される。ライゲーション（サブ）試料がプールされるときには、原則的に２つの増幅選択肢がある。例えば、ライゲーション前又はライゲーション後に遺伝子座１−１０に由来する（サブ）試料が遺伝子座１１−２０に由来する（サブ）試料とプールされる場合、プールされた（サブ）試料は、フォワードプライマーとリバースプライマー１及び２を用いて、１段又は２段で、最初にフォワードとリバース１、続いてフォワードとリバース２、又はその逆で増幅させることができる。検出も同様に実施することができ、両方の標識を同時に検出するか、最初に標識１、続いて標識２で検出し、必要に応じて２回注入して検出する。 Ｃｏｌｏｍｂｉａエコタイプ、Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａエコタイプ、及びＣｏｌｏｍｂｉａエコタイプとＬａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａエコタイプの５０／５０混合物に由来する１２個のＳＮＰの多重オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイのゲル。 Ａ．キャピラリー電気泳動装置（ＭＥＧＡＢａｃｅ）上のＣｏｌｏｍｂｉａ試料のＦＡＭ標識検出の部分電気泳動図。同じ多重混合物を注入した。９７−１３４ｂｐのサイズの増幅連結プローブ及び（Ｓと記された）隣接サイザー（ｓｉｚｅｒ）断片は、９４、９５及び１３７ｂｐである。プローブ及びサイザーはすべてＦＡＭで標識されている。 Ｂ．キャピラリー電気泳動装置（ＭＥＧＡＢａｃｅ）上のＬａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａ試料のＦＡＭ標識検出の部分電気泳動図。同じ多重混合物を注入した。９７−１３４ｂｐのサイズの増幅連結プローブ及び（Ｓで記された）隣接サイザー断片は、９４、９５及び１３７ｂｐである。プローブ及びサイザーはすべてＦＡＭで標識されている。 Ａ：１２０ｂｐ ＥＴ−ＲＯＸ標識断片及び１２４ｂｐ ＮＥＤ標識断片を含む試料の生トレースファイル。試料中の同じ長さの他の標識断片からのＦＡＭ及びＪＯＥ標識に注目されたい。ＦＡＭ及びＪＯＥは、蛍光スペクトルが重なり（ＥＴ−ＲＯＸとＦＡＭ、ＪＯＥとＮＥＤ）、同じ長さの配列と信号が重なる（クロストーク）。 Ｂ：処理してクロストーク補正されたトレースファイルを生じる数学的クロストーク補正。クロストークは減少するが、スペクトルの重なり（ＦＡＭ、ＪＯＥ）は残り、偽陽性（又は負の）信号を生じる。 Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ：数学的補正の残部（Ｄ、Ｅ）の存在を、正の信号（Ｃ、Ｆ）と比較して示す単一標識のプロット。 Ａ：理論的に予測されるデータと比較して不正確な評価データが得られる１２０ｂｐ ＥＴ−ＲＯＣ断片と１２４ｂｐ ＮＥＤ断片のクロストークの不完全な除去効果の表。 Ｂ：長さと標識の組み合せによるクロストーク補正を使用した効果を示す表。評価データ及び予測データは正確に解釈され、偽陽性又は偽陰性データは排除される。 プライマー結合部位を有する環状プローブ、プライマー及びオプションのブロッキング区画、並びに環状プローブにおけるそれらの相対的な位置の図。増幅後、環状プローブの単位複製配列が形成される。 連結環状プローブの試料の選択的増幅に使用される選択的プライマー又はネステッドプライマーの設計の図。連結環状プローブは、１つのプライマー結合部位及びＮで示す隣接ヌクレオチドを用いて模式的に描かれる。２４組のライゲーションアッセイの場合、１つの選択ヌクレオチドを用いた選択的増幅を使用して、６組の増幅及び検出アッセイへの縮小が視覚化される。 プライマーＥｏｏＫ＋Ｔ５’−ＪＯＥを用いた、試料２のセット４の１０組のライゲーション産物の増幅。Ｊｏｅチャネルの信号を示す。 Ａ．プライマーＥｏｏＫ＋Ｔ５’−ＪＯＥを用いた、試料２のセット４の１０組のライゲーションの増幅によって生じるＮＥＤチャネルのクロストーク（Ａ参照）。ＮＥＤ信号は省略した。 Ｂ．プライマーＥｏｏＫ＋Ｔ５’−ＪＯＥを用いた増幅、及び試料２のセット４の１０組のライゲーションのＮＥＤ標識ＥＯＯｋ増幅によって生じるＮＥＤチャネルの信号（Ａ参照）。ＮＥＤの５’＋Ｔ ＥＯＯｋ−Ｊｏｅ信号は１ｂｐ異なるので、この２つのピークは識別することができる。Ｘは、ＮｅｄチャネルにおけるＪｏｅ蛍光色素のクロストークを意味する（Ｂにおける信号に相当）。 Ｃ．試料２のセット４の１０組のライゲーションの増幅を、ＮＥＤ標識ＥＯＯｋ増幅プライマー及び５’＋Ｔ ＥＯＯｋ ＪＯＥ標識プライマーを用いて実施し、反応産物をＭｅｇａＢＡＣＥによる検出と結び付けた。ＮＥＤチャネルの未処理信号を示す。ＪＯＥ標識産物は長さが１ｂｐ異なるので、ＮＥＤとＪＯＥからのピークはＮＥＤチャネルにおいて識別することができる。 Ｄ．Ｃに示したのと同じであるが、生データの処理後、すなわち、クロストーク除去後の反応産物。５’Ｔ ＥＯＯｋ ＪＯＥ産物の１ｂｐのサイズの違いによって、図１６Ａ、Ｂ及びＣに示すＮＥＤチャネルへのＪＯＥ信号のクロストークに起因する評価ミスが防止される。 Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのすべての信号は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｙｎａｍｉｃｓのＧｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｅｒバージョン１ソフトウェアによって処理して得られた。Ｄに示す信号は、クロストークが補正されており、したがって、処理信号である。Ａ、Ｂ、及びＣにおける信号は、生データであり、クロストーク補正されていない。 Ａ．試料５（キャピラリーＧ０５）及び６（キャピラリーＧ０６）に対するセット４のライゲーション産物の５’＋Ｔ Ｊｏｅ及びＦＡＭ標識ＥＯＯｋ増幅の分析。分析時間は４０分であった。 Ｂ．試料５（キャピラリーＧ０５）及び６（キャピラリーＧ０６）に対するセット４のライゲーション産物の５’＋Ｔ Ｊｏｅ及びＦＡＭ標識ＥＯＯｋ増幅の第２の分析。この分析は、Ａに示した分析後に同じマトリックス上で直ちに実施された。分析時間は４０分であった。 試料３からのセット１、２、４及び５に対する１つの４０組のライゲーションのうちの３セットの選択的増幅。 Ａ．ＥＯｌｋ−Ｎｅｄ及びＭＯｌｋを用いたセット１の選択的増幅 Ｂ．Ｅ０３ｋ−５’＋Ｔ−ＪＯＥ及びＭ０４ｋを用いたセット２の選択的増幅 Ｃ．Ｅ０４ｋ−Ｆａｍ及びＭ０３ｋを用いたセット５の選択的増幅。 すべてのチャネルを見ることができる。より多数のセットに対する多重ライゲーション産物のうちの特定のセットを増幅できることは明白である。

Claims (31)

1. 核酸試料中の標的配列の有無を判定する方法であって、
   （ａ）前記試料中の検出すべき各標的配列に対する少なくとも１つの環状化可能プローブを核酸試料に与える工程であって、前記環状化可能プローブが、標的配列の第一の部分に相補的な第一の標的特異的区画をその５’末端に有し、且つ前記標的配列の第二の部分に相補的な第二の標的特異的区画をその３’末端に有しており、前記標的配列の前記第一及び第二の部分が互いに隣接した位置にあり、前記環状化可能プローブが、前記標的配列と実質的に非相補的なタグ区画をさらに備え、該タグ区画はスタッファー配列を備えてもよく、前記タグ区画が少なくとも１つのプライマー結合配列およびブロッキング区画を備えている、工程と、
   （ｂ）前記環状化可能プローブの前記第一及び第二の標的特異的区画を標的配列の前記第一及び第二の部分にアニールさせて、前記環状化可能プローブの前記第一及び第二の標的特異的区画を前記標的配列上で隣接してアニールさせる工程と、
   （ｃ）前記標的配列に隣接してアニールした前記第一及び第二の標的特異的区画を連結させる手段を与え、前記第一及び第二の標的特異的区画を連結させて、前記試料中の標的配列に対応する連結された環状プローブを得る工程と、
   （ｄ）第一のプライマー結合配列に相補的な第一のプライマーを含むプライマー対、ポリメラーゼ酵素、および必要に応じて第二のプライマー結合配列に相補的な第二のプライマーを提供する工程と、
   （ｅ）得られた混合物を増幅して、アンプリコンを含む増幅された試料を得る工程であって、ここにおいて、環状プローブ中のブロッキング区画は、前記連結された環状プローブにハイブリダイズした前記プライマーの伸長又は増幅を停止させ、それによって前記環状プローブを直鎖状にする工程と、
   （ｆ）前記対応するアンプリコンの有無を検出することによって、試料中の標的配列の有無を判定する工程と、
   を備えた方法。
2. 試料中の標的配列に対応する増幅された試料中のアンプリコンの長さが、前記試料中の異なる標的配列に対応する前記増幅された試料中のアンプリコンの長さと異なる、請求項１に記載の方法。
3. 前記アンプリコンが、前記連結された環状プローブの長さに対応する長さを有する、請求項１乃至２の何れか１項に記載の方法。
4. 前記スタッファー配列の長さによって、前記長さの差が生じる、請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
5. ２つの異なる環状化可能プローブが、単一のプライマー配列にハイブリダイズ可能な同一のプライマー結合部位を含有する、請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法。
6. 前記プライマーのうち少なくとも１つが標識を有する、請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法。
7. 前記プライマーのうち少なくとも１つが、その３’末端に少なくとも１つの選択的ヌクレオチドを含有する選択的プライマーである、請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法。
8. 請求項１に記載の方法であって、
   （ａ）少なくとも２グループの環状化可能オリゴヌクレオチドプローブが試料に与えられ、環状化可能オリゴヌクレオチドプローブの各グループが、少なくとも１つのグループ特異的なプライマー結合部位を有するタグ配列を有しており；
   （ｂ）各グループの連結された環状プローブをプライマー対から増幅し、２つのプライマーのうち少なくとも１つが、前記グループ特異的プライマー結合部位と相補的であり、あるグループの前記プライマーのうち少なくとも１つが、グループ特異的標識を備えており；
   （ｃ）各グループの中で、前記試料中の標的配列に対応する増幅された連結プローブの長さが、前記試料中の異なる標的配列に対応する増幅された連結プローブの長さと異なる、方法。
9. 前記グループの第一の部分では、偶数個のヌクレオチドを有する増幅された連結プローブが作られ、
   前記グループの第二の部分では、奇数個のヌクレオチドを有する増幅された連結プローブが作られる、請求項８に記載の方法。
10. 偶数個のヌクレオチドを有する連結増幅されたプローブの前記グループと奇数個のヌクレオチドを有する連結増幅されたプローブの前記グループとが、それらの発光スペクトル中に少なくとも重複部分を有する蛍光標識で標識されている、請求項９に記載の方法。
11. 偶数個のヌクレオチドを有する連結増幅されたプローブの第一及び第二のグループと、奇数個のヌクレオチドを有する連結増幅されたプローブの第三及び第四のグループとが作製され、前記第一及び第二のグループがＦＡＭ（登録商標）とＮＥＤ（登録商標）でそれぞれ標識され、且つ前記第三及び第四のグループが（ＥＴ−）ＲＯＸ（登録商標）及びＪＯＥ（登録商標）若しくはＨＥＸ（登録商標）の何れかでそれぞれ標識されるか；又は前記第一及び第二のグループが（ＥＴ−）ＲＯＸ（登録商標）及びＪＯＥ（登録商標）若しくはＨＥＸ（登録商標）の何れかでそれぞれ標識され、且つ前記第三及び第四のグループがＦＡＭ（登録商標）とＮＥＤ（登録商標）でそれぞれ標識される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記プライマーの伸長を停止させる前記ブロッキング区画が、ブロッキンググループを備え、該ブロッキンググループが、前記２つのプライマー結合部位の間に位置し、好ましくは、フォワードプライマー結合部位の３’末端に隣接し且つリバースプライマー結合部位の５’末端に隣接して位置し、前記プライマーの伸長又は増幅から前記ブロッキンググループが除外される、請求項１乃至１１の何れか１項に記載の方法。
13. 前記プローブが、ＲＮＡｓｅ又は制限エンドヌクレアーゼによって制限切断され得るＤＮＡ若しくはＲＮＡ制限部位又はＲＮＡヌクレオチドを前記ブロッキング区画の位置に含有する、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
14. 制限エンドヌクレアーゼを、必要に応じて該制限エンドヌクレアーゼの制限部位に相補的で該制限部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとともに用いて、これにより、前記制限エンドヌクレアーゼによる制限切断に適した二本鎖区画を作出して、前記連結されたプローブを、プライマー伸長又は増幅工程の前に制限切断する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ポリメラーゼが有意なストランド置換活性を発現しない、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
16. 請求項１に記載の方法であって、
    （ｅ１）工程（ａ）乃至（ｅ）を繰り返して、少なくとも２つの増幅された試料を得る工程と、
    （ｅ２）工程（ｅ）及び（ｅ１）で得た増幅された試料のうち少なくとも一部を電気泳動装置のチャネルの試料添加部位に連続して加え、前記増幅された試料中のアンプリコンを電気泳動により分離し、前記チャネルの前記試料添加部位から離れた場所に位置する検出位置において前記分離されたアンプリコンを検出する工程であって、連続して加えられる前記増幅された試料の時間間隔は、増幅された試料中の増幅された連結プローブの中で最も移動度が遅いものが、続いて加えられる増幅された試料の中で最も移動度が速い増幅された連結プローブが前記検出位置で検出される前に、前記検出位置で検出されるようにする工程と、
    をさらに備えた方法。
17. 前記標的ヌクレオチド配列が多型を含有する、請求項１乃至１６の何れか１項に記載の方法。
18. 前記標的ヌクレオチド配列が一塩基多型を含有する、請求項１乃至１６の何れか１項に記載の方法。
19. 前記標的ヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、制限断片、アダプターをライゲーションした制限断片、アダプターをライゲーションした増幅された制限断片、及びＡＦＬＰ（登録商標）断片からなる群から選択されるＤＮＡ分子である、請求項１乃至１８の何れか１項に記載の方法。
20. 複数の標的ヌクレオチド配列の、高スループット検出のための、請求項１乃至１９の何れか１項に記載される方法。
21. 多型を検出するための、請求項１乃至１９の何れか１項に記載される方法。
22. 一塩基多型を検出するための、請求項１乃至１９の何れか１項に記載される方法。
23. 転写産物プロファイリングのための、請求項１乃至１９の何れか１項に記載される方法。
24. 標的核酸配列の存在量を検出するための、請求項１乃至１９の何れか１項に記載される方法。
25. 遺伝子マッピング、遺伝子の発見、マーカー補助選抜法、種子品質管理、ハイブリッド選抜、ＱＴＬマッピング、バルク分離（bulked segregant）分析、ＤＮＡフィンガープリンティング、並びに形質、疾病耐性、収量、雑種強勢、及び／又は遺伝子機能に関する情報を明らかにするための、請求項１乃至１９の何れか１項に記載される方法。
26. 請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法で使用するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、標的配列の第一の部分に相補的な第一の標的特異的区画をその５’末端に有し、且つ前記標的配列の第二の部分に相補的な第二の標的特異的区画をその３’末端に有しており、前記標的配列の前記第一及び第二の部分が互いに隣接した位置にあり、前記プローブが、前記標的配列と実質的に非相補的なタグ区画をさらに備え、該タグ区画はスタッファー配列を備えてもよく、前記タグ区画が少なくとも１つのプライマー結合配列およびブロッキング区画を備えているオリゴヌクレオチドプローブ。
27. 請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法で使用するための、請求項２６に記載される２以上のオリゴヌクレオチドプローブのセット。
28. 前記セットが一塩基多型を有する各対立遺伝子に対するプローブを備える、２以上のオリゴヌクレオチドプローブのセットを使用する請求項１乃至１９の何れか１項に記載される方法。
29. 請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法での使用に適した請求項２６に記載されるオリゴヌクレオチドプローブを備えたキット。
30. 請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法で使用するためのプライマーを更に備えた請求項２９に記載のキット。
31. 請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法で使用するためのプライマーとオリゴヌクレオチドプローブを備えたキット。

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