JP4217922B2

JP4217922B2 - Thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophyllus, gene encoding the enzyme, and use thereof

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Publication number: JP4217922B2
Application number: JP06311296A
Authority: JP
Inventors: 小松原　　秀介; 和巳山本; 川上　　文清; 川村　　良久; 弘毅堀越
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-03-19
Filing date: 1996-03-19
Publication date: 2009-02-04
Anticipated expiration: 2016-03-19
Also published as: JPH09252776A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび該熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコ−ドする遺伝子、該遺伝子を含むＤＮＡ組換え発現ベクター、該組換え発現ベクターで形質転換された組換え宿主細胞ならびに該組換え宿主細胞を使用する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、大腸菌のような中温性細菌のＤＮＡポリメラーゼおよび中温性細菌に感染するファ−ジ由来のＤＮＡポリメラーゼに関しては、既に多くの研究がなされている。また、最近、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと略記する）等の核酸増幅を用いる組換えＤＮＡ技術に有用な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する研究も多くなされている。
ＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、主としてサーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のＤＮＡポリメラ−ゼ(Tth DNAポリメラーゼ) や、サーマス・アクアチカス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリメラ−ゼ(Taq DNAポリメラーゼ) などが用いられてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来から知られている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには、耐熱性を有するものの、その熱安定性や、有機溶媒に対する安定性に若干、問題を残しているものがある。また、核酸の取り込みの際の正確性に欠ける点も有し、ＤＮＡ配列決定やポリメラーゼ連鎖反応に、これらの酵素を用いるにあたり、解決すべき課題が残っている。そのため、これらの課題を解消する新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが待ち望まれていた。
【０００４】
また、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Pfuポリメラーゼ、WO92/09689、特開平 5-328969 号公報）、サーモコッカス・リトラリス(Termococcus litoralis) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ(Tliポリメラーゼ、特開平 6-7160 号公報）なども知られている。しかしながら、これらの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、核酸の取り込みの際の正確性はＴａｑＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈＤＮＡポリメラーゼに比べて優れているが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに比べて、合成速度が遅いなど、完全なものではなく、新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、熱安定性が高く、かつ、ＤＮＡ合成速度が高い熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを生産する新規な超好熱古細菌を得ることに成功し、さらに、その遺伝子を解明して、本発明に到達した。
【０００６】
すなわち、本発明はサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。
【０００７】
また、本発明はサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡである。
【０００８】
さらに、本発明はサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターである。
【０００９】
本発明は、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞である。
【００１０】
また、本発明はサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞を栄養培地で培養し、該培養物から熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの製造法である。
【００１１】
さらに、本発明はサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞を栄養培地で培養し、（ａ）該組換え宿主細胞を集めた後、破砕し、細胞抽出物を調製し、（ｂ）組換え宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する工程を含むことを特徴とする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法である。
【００１２】
【発明の実施態様】
本発明の好ましい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、超好熱古細菌の１種であるサーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ１（ＪＣＭ番号９６５３）または、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＳＭ−２（ＪＣＭ番号９６５４）から入手可能なＤＮＡポリメラーゼである。
【００１３】
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ１は伊豆小笠原沖の熱水鉱床から、また、サーモコッカス・ペプチトフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＳＭ−２は、南マリアナトラフの熱水鉱床から単離した菌株である。これら菌株の菌学的性質は、Arch Microbiol(1995) 164: 159-164, Gonzalez et al.に詳しく記載されている。また、これらの菌株は、ＪＣＭ（理化学研究所微生物系統保存施設）から入手可能である。
【００１４】
本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングは、以下の方法により行う。
クローニングの方法は、ＰｆｕＤＮＡポリメラ−ゼ（Nucleic Acids Research、1993, vol.21, 259-265)、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ（VentＤＮＡポリメラーゼ)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1992, vol.89, 5577-5581）の保存領域のアミノ酸配列に基づき、プライマーを設計し、合成する。
【００１５】
まず、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)の染色体ＤＮＡを鋳型に、上記調製したプライマー（例えば、配列番号６および７、８および９に記載）を用いて、ＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を増幅させる。増幅されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を決定し、当初設定したアミノ酸配列をコードしていることを確認した後、該ＤＮＡ断片をプローブとし、染色体ＤＮＡの染色体ＤＮＡの制限酵素分解産物に対し、サザンハイブリダイゼーションを実施する。目的とするＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のおおよその大きさを約４〜７Ｋｂｐに限定することが好ましい。
【００１６】
更に、約４〜７ＫｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、これを用いて、大腸菌にてＤＮＡライブラリーを作製し、上記したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブにしてプラークハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリダイゼーションを行い、クローン株を取得する。
【００１７】
本発明においてクローン化したサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ１株のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、２３２５塩基（推定アミノ酸７７４個）から構成されている（配列番号１）。また、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＳＭ−２は、３４９２塩基（推定アミノ酸１１６４個）から構成されている（配列番号３）。
ＳＭ−２株由来の遺伝子には介在配列が１個存在しており、かつ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が保存された形でつながっている。
他のＤＮＡポリメラーゼと比較したところ、これらの遺伝子には真核生物型であるα−ＤＮＡポリメラ−ゼの保存領域、Ｒｅｇｉｏｎ１〜５が存在している。また、これらの遺伝子のＮ末端側に３’→５’エキソヌクレアーゼモチーフであるＥＸＯ１〜３が存在している。
【００１８】
サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ−１株およびサーモコッカス・ペプチトフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を、同じサーモコッカス(Termococcus）属由来の既知酵素であるサーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来のＴｌｉ（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子と比較したところ、ＴｌｉＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子には、２種の介在配列が存在するが、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ−１株由来の遺伝子には、このような介在配列が存在せず、また、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株由来の遺伝子には介在配列が１個存在する。
【００１９】
本発明の遺伝子は、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡである。該ＤＮＡの一例は、配列番号２または５に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する。また、このようなＤＮＡは、配列番号１または３に記載される塩基配列またはその一部分を含有する。
本発明の１例であるサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを大腸菌で発現させるため、配列番号３に示される塩基配列の１６２１〜２７９０ｂｐの介在配列をＰＣＲ融合法により取り除き、完全な形のＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を構築する。具体的には、介在配列を含むクロ−ン化した遺伝子を２組のプライマ−の組み合わせによりＰＣＲを行い、介在配列により分断される２断片を増幅する。さらに各々断片を結合することによって、介在配列を含まない完全な形のサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株由来のＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を得る（配列番号４参照）。
【００２０】
本発明において使用するベクターは、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよびその発現を可能とするものであれば、いかなるものでもよく、たとえばファージまたはプラスミドがあげられる。プラスミドとしてはｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＬＥＤ−Ｍ１、ｐ７３、ｐＧＷ７、ｐＥＴ３Ａ、ｐＥＴ８ｃなどがあげられる。ファージとしてはたとえばλｇｔ１１、λＺＡＰＩＩなどがあげられる。
【００２１】
本発明において使用する宿主細胞としては、大腸菌、酵母などがあげられる。大腸菌としては、例えばＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＰＲ１、ＬＥ３９２、ＢＬ２１（ＤＥ３）などがあげられる。
本発明では上記サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を上記ベクターに挿入して組換え発現ベクターとし、さらにこの組換え発現ベクターにて宿主細胞を形質転換する。
【００２２】
本発明の製造方法では、上記組換え宿主細胞を培養して、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を誘導発現させる。組換え宿主細胞の培養に使用する培地ならびに条件は常法に従う。
具体例としては、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ−１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、またはサーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＳＭ−２株由来の介在配列を含まない完全な形のＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を含むｐＬＥＤ−Ｍ１プラスミドにより形質転換された大腸菌を、例えばＴＢ培地にて培養する。
【００２３】
本発明の製造法の１つでは、（ａ）組換え宿主を集めた後、破砕し、細胞抽出物を調製し、（ｂ）宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する工程を含む。
組換え宿主細胞より産出された耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは、宿主菌体を培地で培養後、培養液から遠心分離等にて分離・回収する。該菌体を緩衝液に再懸濁した後、超音波処理・ダイノミル・フレンチプレンス等により菌体を破砕する。次いで、熱処理を実施し、上清より耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを回収する。菌体破砕方法は、超音波処理・ダイノミル・フレンチプレス法などが好ましい。
宿主由来の不純蛋白質を除去する工程の１つとして、熱処理が好ましい。熱処理条件は、７０℃以上、好ましくは８５℃以上である。他の不純タンパク質の除去法としては各種クロマトグラフィーなどを実施する。
【００２４】
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ−１由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、下記理化学的性質を有する。
作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触媒する。
（２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
熱安定性：１００℃、３０分間処理で約６０％の残存活性を有する。
分子量：約８６〜９２ＫＤａ
至適ｐＨ：約６．５〜９
至適温度：約７０〜８０℃
ＤＮＡ合成速度：約６０塩基／秒以上である。
【００２５】
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptono philus）ＳＭ−２由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、下記理化学的性質を有する。
作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触媒する。
（２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
熱安定性：１００℃、３０分間処理で約６０％の残存活性を有する。
分子量：約８６〜９２ＫＤａ
至適ｐＨ：約６．５〜９
至適温度：約７０〜８０℃
ＤＮＡ合成速度：約４０塩基／秒以上である。
【００２６】
【発明の効果】
本発明のサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラ−ゼは、１００℃、３０分の処理で、６０％以上の残存活性を示し、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などに適した酵素である（図３参照）。
【００２７】
【実施例】
次に本発明を実施例を用いて説明する。
実施例１サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus ）ＯＧ−１株由来ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子のクロ−ニング
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ−１株（ＪＣＭ番号９６５３）を８５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従い、染色体ＤＮＡを調製した（Arch Microbiol(1995) 164: 159-164, Gonzalez et al.参照）。
【００２８】
ＰｆｕＤＮＡポリメラ−ゼ、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼの保存領域のアミノ酸配列に基づき、４種のプライマ−（配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９）を合成した。このプライマーの配列番号６、配列番号７および配列番号８、配列番号９をそれぞれ１組とし、調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ（９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７５℃、２分３０秒、２５サイクル。プライマー１００ピコモル、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇ使用した。酵素はＴａｑｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）５ユニット用いた）を行った。
その結果、配列番号６および配列番号７を用いた場合、約７４０ｂｐの予想された長さの増幅産物、配列番号８および配列番号９を用いた場合、約４００ｂｐの予想された長さの増幅産物が得られた。
【００２９】
このＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の部分的な塩基配列を決定し、目的とする領域の増幅産物であることを確認し、この増幅断片をプロ−ブとして、制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡製）で処理した該染色体ＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼ−ションを行った結果、約４．４ｋｂの断片中にＤＮＡポリメラ−ゼをコ−ドする断片が存在することを確認した。
更に、この大きさのＤＮＡ断片をアガロ−スゲルから回収し、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）に挿入し、これらの混合物により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１ｂｌｕｅ）に形質導入し、ライブラリ−を作製した。
【００３０】
次にサザンハイブリダイゼ−ションで使用したプロ−ブを用いて、プラークハイブリダイゼ−ションを行った。約５０００個のプラークをスクリーニングした結果、１０個のポジティブクローンが得られた。ポジティブクローンからヘルパーファージＲ４０８を用いて常法に従い、プラスミドをレスキューし、部分的に塩基配列を決定したところ、ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子の５’側をコードするクローン（ｐＯ５’１、挿入断片約４．４ｋｂｐ）と３’側をコードするクローン（ｐＯＧ７、挿入断片４．４ｋｂｐ）を取得した。
【００３１】
実施例２組換え発現ベクターの構築
完全なＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を作製するため、上記で得られた２種のクローンのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコード部分を図１に示した構築図に従い連結した。ｐＯ５’１を制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分画した後、約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次にｐＯＧ７を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分画した後、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。得られた２種類の断片を制限酵素ＳａｌＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（ストラタジーン社製）に連結し、完全なＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を含有する発現組換えベクターｐＯＧＳＢ（６．６４ｋｂ）を得た。
【００３２】
実施例３クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例２で取得したプラスミドＤＮＡｐＯＧＳＢを大量調製し、常法に従い塩基配列の決定を行った。更に、求められた塩基配列よりアミノ酸配列を推定した（配列表１、配列表２）。サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ−１株由来ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子は２３２５塩基からなり、７７４個のアミノ酸がコ−ドされていた。アミノ酸配列から推定されるタンパク質の分子量は約９００００ダルトンであった。
【００３３】
実施例４形質転換体の作製
大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを実施例２で作製したｐＯＧＳＢで形質転換し、形質転換体大腸菌ＪＭ１０９（ｐＯＧＳＢ）を得た。
【００３４】
実施例５サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ−１株由来のＤＮＡポリメラ−ゼの活性確認
滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（Molecular Cloning 、p.A. 2に記載）５ｍｌを２０ｍｌ容の試験管に分注した。この培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ギブコ社製）で生育させた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＯＧＳＢ）を１白金時接種し、３５℃で１６時間振蕩培養した。この培養培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに移し、遠心分離により菌体を回収した。この菌体を、０．６ｍｌの破砕緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 80mM KCl, 5mM 2-メルカプトエタノール、1mM EDTA) に懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞抽出物を得た。更に、宿主細胞由来のＤＮＡポリメラーゼを不活化するために、細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した。遠心処理にて不溶画分を除去し、以下に示す方法にて熱処理液のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。
【００３５】

【００３６】
（方法）
Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液の各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記熱処理液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり、１０ナノモル（ｎＭ）の全ヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００３７】
上記方法により熱処理液の酵素活性を測定したところ、熱処理液１ｍｌあたり７５単位のＤＮＡポリメラーゼ活性が得られた。この力価は培養液１ｍｌあたり３０単位のＤＮＡポリメラーゼが発現したことを示す。比較として熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードしていないベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を上記と同様の操作に供し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定したが検出できなかった。
【００３８】
実施例６サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ−１株由来のＤＮＡポリメラ−ゼの精製
滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（Molecular Cloning 、p.A.2 に記載）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ５０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、ギブコ社製）で３０℃、１６時間培養した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＯＧＳＢ）（５００ｍｌ坂口フラスコ使用）を接種し、３５℃で１２時間通気攪拌培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、実施例５で使用した破砕緩衝液４００ｍｌに懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。
【００３９】
次に細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。さらにポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安分画、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（50mM Tris-pH8.0, 50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1%Ｔｗｅｅｎ20、0.1%ノニデエトＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、高度に精製されたサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ−１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを得た。
上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性は実施例５と同様の操作で行った。また、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行った。
【００４０】
実施例７サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株由来ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子のクロ−ニング
サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株（ＪＣＭ番号９６５４）を８５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従い、染色体ＤＮＡを調製した（Arch Microbiol(1995) 164: 159-164, Gonzalez et al.参照）。
調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、実施例１で用いたプライマーで、ＰＣＲを行った。その結果、配列番号６、配列番号７を用いた場合、約７４０ｂｐの予想された長さの増幅産物、配列番号８、配列番号９を用いた場合、約４００ｂｐの予想された長さの増幅産物が得られた。
【００４１】
このＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の部分的な塩基配列を決定し、目的とする領域の増幅産物であることを確認し、この増幅断片をプロ−ブとして、制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡製）で処理した該染色体ＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼ−ションを行った結果、約５ｋｂｐの断片中にＤＮＡポリメラ−ゼをコ−ドする断片が存在することを確認した。更に、この大きさのＤＮＡ断片をアガロ−スゲルから回収し、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）に挿入し、これらの混合物により大腸菌(E.coli ＸＬ１ｂｌｕｅ）に形質導入し、ライブラリ−を作製した。
次にサザンハイブリダイゼ−ションで使用したプロ−ブを用いて、プラークハイブリダイゼ−ションを行った。約５０００個のプラークをスクリーニングした結果、８個のポジティブクローンが得られた。ポジティブクローンからヘルパーファージＲ４０８を用いて常法に従いプラスミドをレスキューし、部分的に塩基配列を決定したところ。プローブに用いた領域をカバーしているクローン（ｐＳＭ３、挿入断片約５ｋｂｐ）が得られた。しかしながらこのクローンはＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子の３’端約１００ｂｐがカバーできていなかった。
【００４２】
そこで実施例２で得られたｐＯＧＳＢのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子領域をプローブとして再度プラークハイブリダイゼ−ションを行い上記と同様の操作を行った結果、ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子の３’側をカバーするクローン（ｐＳ３’１挿入断片約３ｋｂ）を取得した。
【００４３】
実施例８クロ−ン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例７で取得したプラスミドＤＮＡｐＳＭ３及びｐＳ３’１を大量調製し、常法に従い、ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子領域の塩基配列の決定を行った。更に、求められた塩基配列よりアミノ酸配列を推定した（配列表３、配列表４、配列表５）。サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株由来ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子は３４９２塩基（推定アミノ酸１１６４個）から構成されている。ＳＭ−２株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は介在配列（ｉｖｓ２）が１個存在しており、かつオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が保存された形でつながっていた。アミノ酸配列から推定される完全な形のＤＮＡポリメラーゼタンパク質の分子量は約９００００ダルトンであった。
【００４４】
実施例９組換え発現ベクターの構築
完全なＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を作製するため、図２に示したフローに従い介在配列を取り除いた組換え発現ベクターｐＳｐｏｌＭＴを構築した。ｐＳＭ３を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分画した後、約３．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、セルフ・ライゲーションさせ、プラスミドｐｏｌＶを構築した。次にｐＳＭ３’の挿入断片約３ｋｂをｐｏｌＶのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐｏｌＥＶを構築した。挿入断片及び挿入方向は部分的に塩基配列を決定し、確認した。
【００４５】
次にｐＳＭ３を鋳型として配列番号１０及び配列番号１１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。この増幅産物を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＶで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分画し、約１. ６ｋｂｐのDNA を回収した。次にｐｏｌＥＶを鋳型として配列番号１２および配列番号１３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。この増幅産物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた平滑化処理及び、制限酵素ＳａｌＩで切断しアガロースゲル電気泳動によって分画し、約０．７ｋｂｐのＤＮＡを回収した。ＰＣＲはＰＣＲ中の変異を抑えるため、鋳型ＤＮＡを１μｇ使用し、サイクル数は１０回行った。
【００４６】
上記で得られた２つのＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩで切断したプラスミドベクターｐＬＥＤ−Ｍ１に連結し、完全なＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を含有する発現組換えベクターｐＳｐｏｌＭＴ（５．０２ｋｂ）を得た。
【００４７】
実施例１０形質転換体の作製
大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを実施例９で作製したｐＳｏｌＭＴで形質転換し、形質転換体大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳｐｏｌＭＴ）を得た。
【００４８】
実施例１１サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus ) ＳＭー２株由来のＤＮＡポリメラ−ゼの活性確認
滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（Molecular Cloning 、p.A.2 に記載）５ｍｌを２０ｍｌの試験管に分注した。この培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ギブコ社製）で生育させた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳｐｏｌＭＴ）を１白金時接種し、３５℃で１６時間振蕩培養した。この培養培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに移し、遠心分離により菌体を回収した。この菌体を、０．６ｍｌの破砕緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 80mM KCl, 5mM 2-メルカプトエタノール）に懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞抽出物を得た。更に、宿主細胞由来のＤＮＡポリメラーゼを不活化するために、細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した。遠心処理にて不溶画分を除去し、実施例５と同様の方法で熱処理液のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。
【００４９】
上記方法により熱処理液の酵素活性を測定したところ熱処理液１ｍｌあたり１００単位のＤＮＡポリメラーゼ活性が得られた。この力価は培養液１ｍｌあたり４０単位のＤＮＡポリメラーゼが発現したことを示す。比較として熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードしていないベクターｐＬＥＤ−Ｍ１で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を上記と同様の操作に供し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定したが検出できなかった。
【００５０】
実施例１２サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus ) ＳＭー２株由来のＤＮＡポリメラ−ゼの精製
滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（Molecular Cloning 、p.A.2 に記載）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ５０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、ギブコ社製）で３０℃１６時間培養した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳｐｏｌＭＴ）（５００ｍｌ坂口フラスコ使用）を接種し３５℃で１２時間通気攪拌培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００ｍｌの実施例５で使用した破砕緩衝液に懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。さらにポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安分画、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（50mM Tris-pH8.0, 50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1%Ｔｗｅｅｎ20、0.1%ノニデエトＰ４０）に置換し、高度に精製されたサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭー２由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを得た。
【００５１】
実施例１３熱安定性の確認
実施例５及び実施例１２に記載のごとく精製したサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)のＤＮＡポリメラ−ゼの熱安定性を以下の方法で測定した。
精製したサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭー２株およびサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ−１株由来のＤＮＡポリメラ−ゼ（それぞれＳＭ−２ポリメラーゼ及びＯＧ−１ポリメラーゼと称する）各５単位を１００μｌの緩衝液（20mM Tris-HCl, pH8.8, 25℃、10mM塩化カリウム、10mM硫酸アンモニウム、2mM 硫酸マグネシウム、0.1% Triton X-100, 0.1mg/ml BSA, 5mm 2- メルカプトエタノール）に混合し、１００℃でプレインキュベーとした。この混合液から経時的に試料を採取し、実施例５記載の方法にてポリメラーゼ活性を測定した。比較として、Ｔａｑポリメラーゼ（東洋紡製）およびＴｌｉポリメラーゼ（Ventポリメラーゼ、ＮＥＢ社製）も同様の操作を行った。
図４に示したように、ＳＭ−２ポリメラーゼ及びＯＧ−１ポリメラーゼはＴｌｉポリメラーゼと同様、１００℃、３０分の処理で６０％以上活性が残存していたのに対し、Ｔａｑポリメラーゼは５％しか活性が残存していなかった。
【００５２】
実施例１４ＤＮＡ合成速度測定
サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)のＤＮＡポリメラ−ゼのＤＮＡ合成速度を以下の方法で測定した。
ＳＭ−２ポリメラーゼおよびＯＧ−１ポリメラーゼ５単位を１０μｌの反応液(20mM Tris-HCl, (pH7.5), 8mM塩化マグネシウム, 7.5mM ジチオスレイトール、 100μg/ml BSA, 0.1mM dNTP、0.2 μCi [α-³²P]dCTP)で０．２μｇの配列番号１４のプライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で３０秒、６０秒、９０秒間反応させた。反応停止は等量の反応停止液（50mM 水酸化ナトリウム、10mM EDTA 、5%フィコール、0.05% ブロムフェノールブルー）を加えることにより行なった。
【００５３】
上記ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行った。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ／ＨｉｎｄIII を用いた。このマーカーのバンドを指標として、合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、ＤＮＡ合成速度を求めた。
その結果、ＳＭー２ポリメラーゼは約４０塩基／秒、ＯＧ−１ポリメラーゼは約６０塩基／秒の合成速度を有していた。これは同じサーモコッカス(Thermococcus)属のＴｌｉポリメラーゼの約２倍の速度であった。
【００５４】
【配列表】

【００５５】

【００５６】

【００５７】

【００５８】

【００５９】
配列番号６
配列の長さ：２３
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列の特徴
配列
CCITTCGCIA AGCGITA(CT)CT CAT 23
【００６０】
配列番号７
配列の長さ：２３
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
AG(CT)TACCACT CIACIAGGTT ICC 23
【００６１】
配列番号８
配列の長さ：２６
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTIAGGCGIG ACTGGAG(CT)GA (AG)ATIGC 26
【００６２】
配列番号９
配列の長さ：２３
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ACIGCIGGCA IAAC(CT)TGGTT (CT)TC 23
【００６３】
配列番号１０
配列の長さ:23
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GGTGTCCCAT ATGATCCTCG ACA 23
【００６４】
配列番号１１
配列の長さ：２４
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
CGTAACGATA TCAGCGTACA GCAG 24
【００６５】
配列番号１２
配列の長さ：２６
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成DNA
配列
ACAGACGGTT TCTTCGCGAC AATACC 26
【００６６】
配列番号１３
配列の長さ：２４
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成DNA
配列
GGGTCGTCGA CGGATTTCTA GTTC 24
【００６７】
配列番号１４
配列の長さ：２４
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成DNA
配列
CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＯＧＳＢの構築図である。
【図２】ｐＳｐｏｌＭＴの構築図である。
【図３】サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼの１００℃における熱安定性を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus, a gene encoding the thermostable DNA polymerase, a recombinant DNA expression vector containing the gene, and the recombinant expression vector And a method for producing a thermostable DNA polymerase using the recombinant host cell.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, many studies have already been made on DNA polymerases of mesophilic bacteria such as E. coli and DNA polymerases derived from phages that infect mesophilic bacteria. Recently, much research has been conducted on thermostable DNA polymerases useful for recombinant DNA technology using nucleic acid amplification such as polymerase chain reaction (abbreviated as PCR).
Thermostable DNA polymerase used for PCR is mainly DNA polymerase (Tth DNA polymerase) derived from Thermus thermophilus, DNA polymerase (Taq DNA polymerase) derived from Thermus aquaticus, etc. Has been used.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, although conventionally known heat-resistant DNA polymerases have heat resistance, some of them have some problems in their thermal stability and stability with respect to organic solvents. In addition, there is a lack of accuracy at the time of nucleic acid incorporation, and problems remain to be solved in using these enzymes in DNA sequencing and polymerase chain reaction. Therefore, a new thermostable DNA polymerase that solves these problems has been awaited.
[0004]
Further, a thermostable DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus (Pfu polymerase, WO92 / 09689, JP-A-5-328969), a thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus litoralis (Termococcus litoralis) Tli polymerase, JP-A-6-7160) and the like are also known. However, these thermostable DNA polymerases are superior to Taq DNA polymerase and Tth DNA polymerase in the accuracy of nucleic acid incorporation, but are not perfect, such as a slower synthesis rate than Taq DNA polymerase. A new thermostable DNA polymerase has been desired.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have succeeded in obtaining a novel hyperthermophilic archaea that produces a thermostable DNA polymerase having a high thermostability and a high DNA synthesis rate. As a result, the present invention has been reached.
[0006]
That is, the present invention is a thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus.
[0007]
The present invention also relates to an isolated DNA encoding a DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus.
[0008]
Furthermore, the present invention is a recombinant DNA expression vector in which an isolated DNA encoding a DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus is inserted into a vector.
[0009]
The present invention is a recombinant host cell transformed with a recombinant DNA expression vector in which an isolated DNA encoding a DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus is inserted into the vector.
[0010]
In addition, the present invention also provides a recombinant host cell transformed with a recombinant DNA expression vector obtained by inserting an isolated DNA encoding a DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus into a vector in a nutrient medium. A method for producing a thermostable DNA polymerase, comprising culturing and collecting thermostable DNA polymerase from the culture.
[0011]
In addition, the present invention provides a recombinant host cell transformed with a recombinant DNA expression vector in which an isolated DNA encoding a DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus is inserted into the vector in a nutrient medium. Culturing, and (a) collecting the recombinant host cells, crushing them, preparing a cell extract, and (b) removing the impure protein derived from the recombinant host cells. It is a method for producing a sex DNA polymerase.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
A preferred thermostable DNA polymerase of the present invention is Thermococcus peptonophilus OG1 (JCM No. 9653) or Thermococcus peptonophilus SM-2 (JCM), which is one of the hyperthermophilic archaea. No. 9654).
[0013]
Thermococcus peptonophilus OG1 is a strain isolated from the hydrothermal deposit off Izu Ogasawara, and Thermococcus peptonophilus SM-2 is a strain isolated from the hydrothermal deposit of Southern Mariana Trough. The bacteriological properties of these strains are described in detail in Arch Microbiol (1995) 164: 159-164, Gonzalez et al. These strains are available from JCM (RIKEN Microbial System Storage Facility).
[0014]
The thermostable DNA polymerase gene of the present invention is cloned by the following method.
Cloning methods include Pfu DNA polymerase (Nucleic Acids Research, 1993, vol. 21, 259-265), Tli DNA polymerase (Vent DNA polymerase) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 5577- Based on the amino acid sequence of the conserved region of 5581), a primer is designed and synthesized.
[0015]
First, PCR is performed using the chromosomal DNA of Thermococcus peptonophilus as a template and the primers prepared above (for example, described in SEQ ID NOs: 6, 7, 8, and 9) to amplify the DNA fragment. After determining the DNA sequence of the amplified DNA fragment and confirming that it encodes the initially set amino acid sequence, the DNA fragment is used as a probe, and the restriction enzyme degradation product of the chromosomal DNA is subjected to Southern high digestion. Perform hybridization. It is preferable to limit the approximate size of the DNA fragment containing the DNA polymerase gene of interest to about 4-7 Kbp.
[0016]
Further, a DNA fragment of about 4 to 7 Kbp was recovered from the gel, and a DNA library was prepared in E. coli using this, and plaque hybridization or colony hybridization was performed using the PCR amplified DNA fragment as a probe, Acquire a clone strain.
[0017]
The DNA polymerase gene of Thermococcus peptonophilus OG1 cloned in the present invention is composed of 2325 bases (presumed 774 amino acids) (SEQ ID NO: 1). Thermococcus peptonophilus SM-2 is composed of 3492 bases (1164 deduced amino acids) (SEQ ID NO: 3).
There is one intervening sequence in the gene derived from the SM-2 strain, and the open reading frame (ORF) is conserved.
Compared with other DNA polymerases, these genes have regions 1-5 of the eukaryotic α-DNA polymerase conserved region. Further, EXO1 to 3 ′ → 5 ′ exonuclease motifs exist on the N-terminal side of these genes.
[0018]
Thermococcus peptonophilus OG-1 strain and Thermococcus peptonophilus SM-2 strain thermostable DNA polymerase gene is thermococcus which is a known enzyme from the same genus Thermococcus (Termococcus) -When compared with the Tli (Vent) DNA polymerase gene derived from Litoralis (Thermococcus litoralis), the TliDNA polymerase gene has two kinds of intervening sequences, but Thermococcus peptonophilus OG- There is no such intervening sequence in the gene derived from one strain, and there is one intervening sequence in the gene derived from the Thermococcus peptonophilus SM-2 strain.
[0019]
The gene of the present invention is DNA encoding a DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus. An example of the DNA contains a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 5. Moreover, such DNA contains the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3 or a part thereof.
In order to express a thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus SM-2 strain, which is an example of the present invention, in Escherichia coli, an intervening sequence of 1621 to 2790 bp of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 is used. The complete DNA polymerase gene is constructed by removing by PCR fusion method. Specifically, PCR is performed on a cloned gene containing an intervening sequence using a combination of two sets of primers, and two fragments separated by the intervening sequence are amplified. Further, by joining each fragment, a complete DNA polymerase gene derived from Thermococcus peptonophilus SM-2 strain containing no intervening sequence is obtained (see SEQ ID NO: 4).
[0020]
The vector used in the present invention may be any vector as long as it enables cloning and expression of a thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus, and includes, for example, a phage or a plasmid. Examples of the plasmid include pUC18, pBR322, pBluescript, pLED-M1, p73, pGW7, pET3A, pET8c and the like. Examples of the phage include λgt11 and λZAPII.
[0021]
Examples of host cells used in the present invention include Escherichia coli and yeast. Examples of E. coli include JM109, HB101, XL1Blue, PR1, LE392, BL21 (DE3).
In the present invention, a gene encoding a thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus is inserted into the vector to form a recombinant expression vector, and a host cell is transformed with the recombinant expression vector.
[0022]
In the production method of the present invention, the above-described recombinant host cell is cultured to induce and express a thermostable DNA polymerase gene derived from Thermococcus peptonophilus. The medium and conditions used for culturing the recombinant host cells are in accordance with conventional methods.
Specific examples include a pBluescript plasmid containing a DNA polymerase gene derived from Thermococcus peptonophilus OG-1 strain, or a complete form that does not contain intervening sequences from Thermococcus peptonophilus SM-2. Escherichia coli transformed with the pLED-M1 plasmid containing the DNA polymerase gene is cultured in a TB medium, for example.
[0023]
One of the production methods of the present invention includes the steps of (a) collecting recombinant hosts and then crushing them to prepare a cell extract, and (b) removing impure proteins derived from the host cells.
The thermostable DNA polymerase produced from the recombinant host cells is separated and collected from the culture solution by centrifugation or the like after culturing the host cells in the medium. After the cells are resuspended in a buffer solution, the cells are disrupted by ultrasonic treatment, dynomill, French prince, or the like. Next, heat treatment is performed, and the heat-resistant DNA polymerase is recovered from the supernatant. As the cell disruption method, ultrasonic treatment, dynomill, French press method and the like are preferable.
Heat treatment is preferred as one of the steps for removing host-derived impure proteins. The heat treatment condition is 70 ° C. or higher, preferably 85 ° C. or higher. Various chromatographies are carried out as other methods for removing impure proteins.
[0024]
The thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus OG-1 has the following physicochemical properties.
Action: (1) Catalyze a polymerase reaction that forms a nucleic acid strand complementary to a nucleic acid template strand from a nucleoside triphosphate.
(2) It has 3′-5 ′ exonuclease activity.
Thermal stability: about 60% residual activity after treatment at 100 ° C. for 30 minutes.
Molecular weight: about 86-92 KDa
Optimum pH: about 6.5-9
Optimal temperature: about 70-80 ° C
DNA synthesis rate: about 60 bases / second or more.
[0025]
A thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptono philus SM-2 has the following physicochemical properties.
Action: (1) Catalyze a polymerase reaction that forms a nucleic acid strand complementary to a nucleic acid template strand from a nucleoside triphosphate.
(2) It has 3′-5 ′ exonuclease activity.
Thermal stability: about 60% residual activity after treatment at 100 ° C. for 30 minutes.
Molecular weight: about 86-92 KDa
Optimum pH: about 6.5-9
Optimal temperature: about 70-80 ° C
DNA synthesis rate: about 40 bases / second or more.
[0026]
【The invention's effect】
The thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus of the present invention exhibits a residual activity of 60% or more after treatment at 100 ° C. for 30 minutes, and is suitable for polymerase chain reaction (PCR) and the like. A suitable enzyme (see FIG. 3).
[0027]
【Example】
Next, the present invention will be described using examples.
Example 1 Cloning of DNA polymerase gene derived from Thermococcus peptonophilus OG-1 strain
After culturing Thermococcus peptonophilus OG-1 strain (JCM No. 9653) at 85 ° C., the cells were collected. Chromosomal DNA was prepared from the obtained bacterial cells according to a conventional method (see Arch Microbiol (1995) 164: 159-164, Gonzalez et al.).
[0028]
Four primers (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9) were synthesized based on the amino acid sequences of the conserved regions of Pfu DNA polymerase and TliDNA polymerase. SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 9 of this primer were each set, and PCR (94 ° C, 30 seconds, 55 ° C, 30 seconds, 75 ° C, 2 ° C, 2 ° C) was prepared using the prepared chromosomal DNA as a template. Min 30 sec, 25 cycles, 100 pmol of primer and 100 ng of template DNA were used, and 5 units of Taqplus (Stratagene) were used as the enzyme).
As a result, when SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 were used, an amplification product of an expected length of about 740 bp, and when SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 were used, an amplification product of an expected length of about 400 bp was gotten.
[0029]
The partial nucleotide sequence of this PCR-amplified DNA fragment was determined, confirmed to be an amplification product of the target region, and the chromosome treated with restriction enzyme EcoRI (manufactured by Toyobo) using this amplified fragment as a probe. As a result of Southern hybridization to DNA, it was confirmed that a fragment encoding DNA polymerase was present in a fragment of about 4.4 kb.
Furthermore, a DNA fragment of this size was recovered from an agarose gel, inserted into λZAPII (manufactured by Stratagene), and E. coli XL1blue was transduced with these mixtures to prepare a library.
[0030]
Next, plaque hybridization was performed using the probe used in Southern hybridization. As a result of screening about 5000 plaques, 10 positive clones were obtained. When a plasmid was rescued from a positive clone using helper phage R408 according to a conventional method and the nucleotide sequence was partially determined, a clone encoding the 5 ′ side of the DNA polymerase gene (pO5′1, about 4 inserts) .4 kbp) and a 3 ′ clone (pOG7, insert 4.4 kbp) were obtained.
[0031]
Example 2 Construction of recombinant expression vector
In order to produce a complete DNA polymerase gene, the coding portions of the DNA polymerase genes of the two clones obtained above were linked according to the construction diagram shown in FIG. pO5′1 was cleaved with restriction enzymes SalI and EcoRI and fractionated by agarose gel electrophoresis, and then a DNA fragment of about 2 kbp was recovered. Next, pOG7 was cleaved with restriction enzymes EcoRI and BglII and fractionated by agarose gel electrophoresis, and then a DNA fragment of about 1.8 kbp was recovered. The obtained two kinds of fragments were ligated to a plasmid vector pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene) cleaved with restriction enzymes SalI and BamHI, and an expression recombinant vector pOGSB containing a complete DNA polymerase gene (6 .64 kb) was obtained.
[0032]
Example 3 Determination of the base sequence of the cloned DNA fragment
A large amount of the plasmid DNApOGSB obtained in Example 2 was prepared, and the base sequence was determined according to a conventional method. Furthermore, the amino acid sequence was estimated from the obtained base sequence (Sequence Listing 1, Sequence Listing 2). The DNA polymerase gene derived from Thermococcus peptonophilus OG-1 strain was composed of 2325 bases, and 774 amino acids were encoded. The molecular weight of the protein deduced from the amino acid sequence was about 90,000 daltons.
[0033]
Example 4 Production of transformants
E. coli JM109 competent cells were transformed with pOGSB prepared in Example 2 to obtain transformant E. coli JM109 (pOGSB).
[0034]
Example 5 Confirmation of DNA polymerase activity from Thermococcus peptonophilus OG-1 strain
5 ml of a sterilized TB medium (described in Molecular Cloning, pA 2) containing 100 μg / ml ampicillin was dispensed into a 20 ml test tube. This medium was grown on an LB agar medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 1.5% agar, Gibco) containing 100 μg / ml ampicillin. E. coli JM109 (pOGSB) was inoculated at 1 platinum and cultured with shaking at 35 ° C. for 16 hours. 1.5 ml of this culture medium was transferred to an Eppendorf tube and the cells were collected by centrifugation. This cell is suspended in 0.6 ml of disruption buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 80 mM KCl, 5 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM EDTA), and then disrupted by sonication. A cell extract was obtained. Furthermore, in order to inactivate the host cell-derived DNA polymerase, the cell disruption solution was treated at 85 ° C. for 30 minutes. The insoluble fraction was removed by centrifugation, and the DNA polymerase activity of the heat treatment solution was measured by the following method.
[0035]

[0036]
(Method)
25 μl of solution A, 5 μl of each of solution B and solution C, and 10 μl of sterilized water are added to an Eppendorf tube and mixed with stirring. Then, 5 μl of the heat treatment solution is added and reacted at 75 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture is ice-cooled, 50 μl of E solution and 100 μl of D solution are added, and after stirring, the mixture is further ice-cooled for 10 minutes. This solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter), thoroughly washed with solution D and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard) to incorporate nucleotides into the template DNA. It was measured. One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that incorporated 10 nanomoles (nM) of all nucleotides into the acid-insoluble fraction per 30 minutes under these conditions.
[0037]
When the enzyme activity of the heat treatment solution was measured by the above method, 75 units of DNA polymerase activity per 1 ml of the heat treatment solution was obtained. This titer indicates that 30 units of DNA polymerase were expressed per ml of culture. For comparison, Escherichia coli JM109 transformed with a vector pBluescript SK (−) that does not encode a thermostable DNA polymerase was subjected to the same operation as described above, and DNA polymerase activity was measured but could not be detected.
[0038]
Example 6 Purification of DNA polymerase from Thermococcus peptonophilus OG-1 strain
6 L of TB medium (described in Molecular Cloning, pA2) containing 100 μg / ml ampicillin that had been sterilized was dispensed into a 10 L jar fermenter. This medium was cultured at 30 ° C. for 16 hours in 50 ml of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, Gibco) containing 100 μg / ml ampicillin in advance. E. coli JM109 (pOGSB) (using a 500 ml Sakaguchi flask) was inoculated and cultured with aeration and stirring at 35 ° C. for 12 hours. The cells were collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 400 ml of the disruption buffer used in Example 5, and then disrupted by ultrasonic treatment to obtain a cell disruption solution.
[0039]
Next, the cell lysate was treated at 85 ° C. for 30 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Furthermore, denucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate fractionation, heparin sepharose chromatography was performed, and finally storage buffer (50 mM Tris-pH8.0, 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween20, 0.1% nonideoto) P40, 50% glycerin), and a highly purified thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus OG-1 was obtained.
The DNA polymerase activity in the purification step was performed in the same manner as in Example 5. When the enzyme activity was high, the sample was diluted with a storage buffer and measured.
[0040]
Example 7 Cloning of DNA polymerase gene from Thermococcus peptonophilus SM-2 strain
After culturing Thermococcus peptonophilus SM-2 strain (JCM No. 9654) at 85 ° C., the cells were collected. Chromosomal DNA was prepared from the obtained bacterial cells according to a conventional method (see Arch Microbiol (1995) 164: 159-164, Gonzalez et al.).
PCR was performed using the prepared chromosomal DNA as a template and the primers used in Example 1. As a result, when SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 were used, an amplification product with an expected length of about 740 bp, and when SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 were used, an amplification product with an expected length of about 400 bp. was gotten.
[0041]
The partial nucleotide sequence of this PCR-amplified DNA fragment was determined, confirmed to be an amplification product of the target region, and the chromosome treated with restriction enzyme EcoRI (manufactured by Toyobo) using this amplified fragment as a probe. As a result of Southern hybridization for DNA, it was confirmed that a fragment encoding DNA polymerase was present in a fragment of about 5 kbp. Furthermore, a DNA fragment of this size was recovered from the agarose gel, inserted into λZAPII (manufactured by Stratagene), and E. coli XL1blue was transduced with these mixtures to prepare a library.
Next, plaque hybridization was performed using the probe used in Southern hybridization. As a result of screening about 5000 plaques, 8 positive clones were obtained. The plasmid was rescued from a positive clone using helper phage R408 according to a conventional method, and the nucleotide sequence was partially determined. A clone (pSM3, insert of about 5 kbp) covering the region used for the probe was obtained. However, this clone could not cover about 100 bp of the 3 ′ end of the DNA polymerase gene.
[0042]
Accordingly, as a result of plaque hybridization again using the DNA polymerase gene region of pOGSB obtained in Example 2 as a probe and the same operation as described above, a clone covering the 3 ′ side of the DNA polymerase gene ( A pS3′1 insert of about 3 kb) was obtained.
[0043]
Example 8 Determination of nucleotide sequence of cloned DNA fragment
Plasmid DNAs pSM3 and pS3′1 obtained in Example 7 were prepared in large quantities, and the base sequence of the DNA polymerase gene region was determined according to a conventional method. Furthermore, the amino acid sequence was estimated from the determined base sequence (Sequence Listing 3, Sequence Listing 4, Sequence Listing 5). The DNA polymerase gene derived from Thermococcus peptonophilus SM-2 strain is composed of 3492 bases (1164 predicted amino acids). The SM-2 strain-derived DNA polymerase gene had one intervening sequence (ivs2) and was linked in a conserved form of the open reading frame (ORF). The molecular weight of the complete DNA polymerase protein deduced from the amino acid sequence was about 90,000 daltons.
[0044]
Example 9 Construction of recombinant expression vector
In order to produce a complete DNA polymerase gene, a recombinant expression vector pSpolMT from which the intervening sequence was removed was constructed according to the flow shown in FIG. After cutting pSM3 with the restriction enzyme EcoRV and fractionating by agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 3.5 kbp was recovered and self-ligated to construct plasmid polV. Next, about 3 kb of insert fragment of pSM3 ′ was inserted into the EcoRI site of polV to construct polEV. The insert fragment and the insert direction were confirmed by partially determining the base sequence.
[0045]
Next, PCR was performed using pSM3 as a template and primers of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11. This amplified product was cleaved with restriction enzymes NdeI and EcoRV, and fractionated by agarose gel electrophoresis to recover about 1.6 kbp of DNA. Next, PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 using polEV as a template. The amplified product was blunted with T4 DNA polymerase, cut with the restriction enzyme SalI, and fractionated by agarose gel electrophoresis to recover about 0.7 kbp of DNA. In PCR, in order to suppress mutation during PCR, 1 μg of template DNA was used and the number of cycles was 10 times.
[0046]
The two DNA fragments obtained above were ligated to a plasmid vector pLED-M1 cleaved with restriction enzymes NdeI and SalI to obtain an expression recombinant vector pSpolMT (5.02 kb) containing a complete DNA polymerase gene. .
[0047]
Example 10 Production of transformants
E. coli JM109 competent cells were transformed with the pSolMT prepared in Example 9 to obtain transformant E. coli JM109 (pSpolMT).
[0048]
Example 11 Confirmation of DNA polymerase activity from Thermococcus peptonophilus SM-2 strain
5 ml of sterilized TB medium (described in Molecular Cloning, pA2) containing 100 μg / ml ampicillin was dispensed into a 20 ml test tube. This medium was grown on an LB agar medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 1.5% agar, Gibco) containing 100 μg / ml ampicillin. E. coli JM109 (pSpolMT) was inoculated at 1 platinum, and cultured with shaking at 35 ° C. for 16 hours. 1.5 ml of this culture medium was transferred to an Eppendorf tube and the cells were collected by centrifugation. The cells are suspended in 0.6 ml of disruption buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 80 mM KCl, 5 mM 2-mercaptoethanol), and then disrupted by sonication to obtain a cell extract. Got. Furthermore, in order to inactivate the host cell-derived DNA polymerase, the cell disruption solution was treated at 85 ° C. for 30 minutes. The insoluble fraction was removed by centrifugation, and the DNA polymerase activity of the heat treatment solution was measured in the same manner as in Example 5.
[0049]
When the enzyme activity of the heat treatment solution was measured by the above method, 100 units of DNA polymerase activity per 1 ml of the heat treatment solution was obtained. This titer indicates that 40 units of DNA polymerase were expressed per ml of culture. For comparison, Escherichia coli JM109 transformed with a vector pLED-M1 that does not encode a thermostable DNA polymerase was subjected to the same operation as described above, and DNA polymerase activity was measured but could not be detected.
[0050]
Example 12 Purification of DNA polymerase from Thermococcus peptonophilus SM-2 strain
6 L of TB medium (described in Molecular Cloning, pA2) containing 100 μg / ml ampicillin that had been sterilized was dispensed into a 10 L jar fermenter. Escherichia coli cultured for 16 hours at 30 ° C. in 50 ml of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, Gibco) containing 100 μg / ml ampicillin in advance JM109 (pSpolMT) (using a 500 ml Sakaguchi flask) was inoculated and cultured with aeration and stirring at 35 ° C. for 12 hours. The cells were collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 400 ml of the disruption buffer used in Example 5, and then disrupted by ultrasonic treatment to obtain a cell disruption solution. Next, the cell lysate was treated at 85 ° C. for 30 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Furthermore, denucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate fractionation, heparin sepharose chromatography was performed, and finally storage buffer (50 mM Tris-pH8.0, 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween20, 0.1% nonideoto) P40) to obtain a highly purified thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus peptonophilus SM-2.
[0051]
Example 13 Confirmation of thermal stability
The thermal stability of Thermococcus peptonophilus DNA polymerase purified as described in Example 5 and Example 12 was measured by the following method.
5 units each of purified DNA polymerases from Thermococcus peptonophilus SM-2 and Thermococcus peptonophilus OG-1 (referred to as SM-2 polymerase and OG-1 polymerase, respectively) In 100 μl buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 25 ° C., 10 mM potassium chloride, 10 mM ammonium sulfate, 2 mM magnesium sulfate, 0.1% Triton X-100, 0.1 mg / ml BSA, 5 mm 2-mercaptoethanol) And pre-incubated at 100 ° C. A sample was collected over time from this mixed solution, and the polymerase activity was measured by the method described in Example 5. As a comparison, Taq polymerase (Toyobo) and Tli polymerase (Vent polymerase, NEB) performed the same operation.
As shown in FIG. 4, SM-2 polymerase and OG-1 polymerase, like Tli polymerase, remained at 60% or more after treatment at 100 ° C. for 30 minutes, whereas Taq polymerase was only 5%. No activity remained.
[0052]
Example 14 DNA synthesis rate measurement
The DNA synthesis rate of the DNA polymerase of Thermococcus peptonophilus was measured by the following method.
5 units of SM-2 polymerase and OG-1 polymerase were added in 10 μl of reaction solution (20 mM Tris-HCl, (pH 7.5), 8 mM magnesium chloride, 7.5 mM dithiothreitol, 100 μg / ml BSA, 0.1 mM dNTP, 0.2 μCi [ α- ³² P] dCTP) was reacted with M13mp181 single-stranded DNA annealed with 0.2 μg of the primer of SEQ ID NO: 14 at 75 ° C. for 30 seconds, 60 seconds, and 90 seconds. The reaction was stopped by adding an equal amount of a stop solution (50 mM sodium hydroxide, 10 mM EDTA, 5% Ficoll, 0.05% bromophenol blue).
[0053]
The gel was dried and autoradiography was performed. Labeled λ / HindIII was used as a DNA size marker. The DNA synthesis rate was determined by measuring the size of the synthesized DNA using the marker band as an index.
As a result, SM-2 polymerase had a synthesis rate of about 40 bases / second, and OG-1 polymerase had a synthesis rate of about 60 bases / second. This was about twice as fast as Tli polymerase from the same Thermococcus genus.
[0054]
[Sequence Listing]

[0055]

[0056]

[0057]

[0058]

[0059]
SEQ ID NO: 6
Sequence length: 23
Sequence type: Nucleic acid (DNA)
Number of chains: 1 strand
Sequence type: synthetic DNA
Sequence features
Array
CCITTCGCIA AGCGITA (CT) CT CAT 23
[0060]
SEQ ID NO: 7
Sequence length: 23
Sequence type: Nucleic acid (DNA)
Number of chains: 1 strand
Sequence type: synthetic DNA
Array
AG (CT) TACCACT CIACIAGGTT ICC 23
[0061]
SEQ ID NO: 8
Sequence length: 26
Sequence type: Nucleic acid (DNA)
Number of chains: 1 strand
Sequence type: synthetic DNA
Array
GTIAGGCGIG ACTGGAG (CT) GA (AG) ATIGC 26
[0062]
SEQ ID NO: 9
Sequence length: 23
Sequence type: Nucleic acid (DNA)
Number of chains: 1 strand
Sequence type: synthetic DNA
Array
ACIGCIGGCA IAAC (CT) TGGTT (CT) TC 23
[0063]
SEQ ID NO: 10
Array length: 23
Sequence type: Nucleic acid (DNA)
Number of chains: 1 strand
Sequence type: synthetic DNA
Array
GGTGTCCCAT ATGATCCTCG ACA 23
[0064]
SEQ ID NO: 11
Sequence length: 24
Sequence type: Nucleic acid (DNA)
Number of chains: 1 strand
Sequence type: synthetic DNA
Array
CGTAACGATA TCAGCGTACA GCAG 24
[0065]
SEQ ID NO: 12
Sequence length: 26
Sequence type: Nucleic acid (DNA)
Number of chains: 1 strand
Sequence type: Synthetic DNA
Array
ACAGACGGTT TCTTCGCGAC AATACC 26
[0066]
SEQ ID NO: 13
Sequence length: 24
Sequence type: Nucleic acid (DNA)
Number of chains: 1 strand
Sequence type: Synthetic DNA
Array
GGGTCGTCGA CGGATTTCTA GTTC 24
[0067]
SEQ ID NO: 14
Sequence length: 24
Sequence type: Nucleic acid (DNA)
Number of chains: 1 strand
Sequence type: Synthetic DNA
Array
CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a construction diagram of pOGSB.
FIG. 2 is a construction diagram of pSpolMT.
FIG. 3 is a graph showing the thermal stability at 100 ° C. of Thermococcus peptonophilus DNA polymerase, TliDNA polymerase and Taq DNA polymerase.

Claims

Thermostable DNA polymerase , 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 8 mM magnesium chloride, 7.5 mM dithiothreis, which consists of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 5, derived from Thermococcus peptonophilus. Tol, 100 μg / ml BSA, 0.1 mM dNTP) .

The composition according to claim 1, wherein the thermostable DNA polymerase has the following physicochemical properties.
Action: (1) Catalyze a polymerase reaction that forms a nucleic acid strand complementary to a nucleic acid template strand from a nucleoside triphosphate.
(2) It has 3′-5 ′ exonuclease activity.
Thermal stability: It has a residual activity of 60% or more after treatment at 100 ° C. for 30 minutes.
Molecular weight: 86-92 KDa

Thermococcus peptonophyllus is Thermococcus peptonophilus OG-1 or Thermococcus peptonophilus Peptonophyllus Peptonophyllus composition Peptonophilus Peptonophilus Peptonophilus Peptonophilus

The composition according to claim 1, wherein the Thermococcus peptonophilus is Thermococcus peptonophilus OG-1.

The composition according to claim 4, wherein the thermostable DNA polymerase has the following physicochemical properties.
Action: (1) Catalyze a polymerase reaction that forms a nucleic acid strand complementary to a nucleic acid template strand from a nucleoside triphosphate.
(2) It has 3′-5 ′ exonuclease activity.
Thermal stability: It has a residual activity of 60% or more after treatment at 100 ° C. for 30 minutes.
Molecular weight: 86-92 KDa
Optimum pH: 6.5-9
Optimum temperature: 70-80 ° C
DNA synthesis rate: 60 bases / second or more.

The composition according to claim 1, wherein the Thermococcus peptonophilus is Thermococcus peptonophilus SM-2.

The composition according to claim 6, wherein the thermostable DNA polymerase has the following physicochemical properties.
Action: (1) Catalyze a polymerase reaction that forms a nucleic acid strand complementary to a nucleic acid template strand from a nucleoside triphosphate.
(2) It has 3′-5 ′ exonuclease activity.
Thermal stability: It has a residual activity of 60% or more after treatment at 100 ° C. for 30 minutes.
Molecular weight: 86-92 KDa
Optimum pH: 6.5-9
Optimum temperature: 70-80 ° C
DNA synthesis rate: 40 bases / second or more.

The composition according to any one of claims 1 to 7, wherein the thermostable DNA polymerase is produced using a recombinant host cell.

Thermostable DNA polymerases from Thermococcus-Peputonofirasu (Thermococcus peptonophilus), comprising the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3, inserted DNA recombinant expressing isolated DNA encoding the DNA polymerase into a vector A recombinant host cell transformed with a vector is cultured in a nutrient medium, and the step of collecting a thermostable DNA polymerase from the culture is included in any one of claims 1 to 8. A process for producing the described composition .

The method for producing a composition according to claim 9 , wherein the vector is a vector derived from pLED-M1 or pBluescript.

The host cell is E. coli E. coli. A method for producing a composition according to claim 9 which is E. coli.

Harvesting the thermostable DNA polymerase from the culture, (a) collecting the recombinant host cells and then crushing to prepare a cell extract; (b) removing impure proteins from the recombinant host cells The method of manufacturing the composition of Claim 9 performed by including a process.

(B) The method for producing a composition according to claim 12 , wherein the step of removing the impure protein derived from the recombinant host cell is high-temperature heat treatment.

High-temperature heat treatment conditions, the method of producing the composition of claim 13 wherein the on 70 ° C. or more.