JP4161103B2 - 小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーター及びその遺伝子、及びその機能特定を可能にした融合タンパク質作製によるトランスポーターの機能解析法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、小型中性アミノ酸及びその類似物質のナトリウム非依存的な輸送に関与するタンパク質、その融合タンパク質、及びそれらのタンパク質をコードする遺伝子に関する。また、本発明は、小型中性アミノ酸及びその類似物質のナトリウム非依存的な輸送に関与するタンパク質、その融合タンパク質、それらの特異抗体、又はそれらの機能促進物質若しくは機能抑制物質を用いて、該タンパク質が有する小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、細胞増殖を制御し、薬物や毒物や外来性の異物の体内動態を変更させる方法、及びこれらの物質を含有してなる小型中性アミノ酸及びその類似物質の輸送能力制御剤に関する。
さらに、本発明は、外来性遺伝子発現系において細胞膜へ移行しないため機能の同定できないトランスポータータンパク質について、細胞膜移行を推進するタンパク質との融合タンパク質を作製することにより、細胞膜へ移行させ、トランスポーターの機能の解析を行う方法などに関する。
背景技術
細胞は、栄養としてアミノ酸を常時取り込むことを必要するが、この機能は細胞膜に存在する膜タンパク質であるアミノ酸トランスポーターによって担われている。また、アミノ酸トランスポーターは、多細胞生物においては各組織の中で特定の部位に配置され、各組織の特異機能の発現に重要な役割を果たしている。
輸送系ａｓｃは、アラニン、セリン、システインを中心とする小型の中性アミノ酸を輸送するアミノ酸輸送系であり、もともとは赤血球膜において記載された。その後、培養細胞においてもその存在が確認されている［Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．、第７０巻、４３頁、１９９０年］。輸送系ａｓｃは、ナトリウム非依存的な、すなわちその機能にナトリウムイオンを必要としないトランスポーターである。その輸送基質選択性や輸送特性は、細胞や動物種により多少の差異があることが知られていた。
輸送系ａｓｃは、アラニン、セリン、システインなどの輸送基質に対して高親和性を示すが、これと類似の輸送系として、同様にアラニン、セリン、システインなどの小型中性アミノ酸を輸送基質とするが、輸送基質に対し低親和性の示す輸送系Ｃがある［Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第１５４巻、４３頁、１９７６年；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第１６２巻、３３頁、１９７７年］。輸送系Ｃは、輸送系ａｓｃの亜系と考えられている。輸送系Ｃを遺伝的に欠損したヒツジが見い出され、その赤血球においてはグルタチオン含量が低下していることが示され、グルタチオン生成における細胞膜を介するシステイン取り込みの重要性が立証されている［Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、第２５４巻、１５６頁、１９７５年］。
しかし、従来の方法では、アミノ酸輸送系ａｓｃを介するアミノ酸及びその類似物質の輸送の詳細や、生体内での機能的役割を解析することは困難であり、アミノ酸輸送系ａｓｃの機能を担う中性アミノ酸トランスポーターの遺伝子を単離して詳細な機能解析を可能とすることが望まれていた。
また、小型中性アミノ酸トランスポーターとしては、ＡＳＣＴ１およびＡＳＣＴ２がクローニングされている［Ｋａｎａｉ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、第９巻、５６５頁、１９９７年］。しかし、これらは、ナトリウム依存的なトランスポーターであり、ナトリウム非依存的なアミノ酸輸送系ａｓｃとは根本的に異なっている。また、グリシントランスポーターとプロリントランスポーターがクローニングされているが、それぞれナトリウム依存的にグリシン及びプロリンのみを輸送し、輸送系ａｓｃとは異なる［Ａｍａｒａ ａｎｄ Ｋｕｈａｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、第１６巻、７３頁、１９９３年］。
トランスポーター自体ではないが、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられている膜貫通構造を一回しか持たない二型膜糖タンパク質であるｒＢＡＴ及び４Ｆ２ｈｃのｃＤＮＡがクローニングされており、それらをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させると中性アミノ酸とともに塩基性アミノ酸の取り込みを活性化することが知られている［Ｐａｌａｃｉｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、第１９６巻、１２３頁、１９９４年］。
中性アミノ酸を選択的に輸送するトランスポーターとして、輸送系Ｌに相当する中性アミノ酸トランスポーター ＬＡＴ１［Ｋａｎａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７３巻、２３６２９−２３６３２頁、１９９８年］、及びＬＡＴ２［Ｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７４巻、１９７４５−１９７５１頁、１９９９年］がクローニングされた。また、ＬＡＴ１及びＬＡＴ２は、１回膜貫通型タンパク質である補助因子４Ｆ２ｈｃと共存することによってのみ機能することが示された。両者はＮａ^＋に依存せず、ＬＡＴ１はロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ヒスチジンなど大型の中性アミノ酸を輸送する交換輸送活性を示し、ＬＡＴ２は、大型の中性アミノ酸に加えグリシン、アラニン、セリン、システイン、スレオニンなどの小型の中性アミノ酸も輸送とする広い基質選択性を有する。しかし、これらもアミノ酸輸送系ａｓｃとは基質選択性が異なっている。
中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２の類似蛋白質として、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸を輸送する輸送系ｙ^＋Ｌの機能を有するｙ^＋ＬＡＴ１とｙ^＋ＬＡＴ２がクローニングされた［Ｔｏｒｒｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７３巻、３２４３７−３２４４５頁、１９９８年］。また、ｙ^＋ＬＡＴ１、ｙ^＋ＬＡＴ２共に補助因子４Ｆ２ｈｃと共存することによってのみ機能することが示された。ｙ^＋ＬＡＴ１とｙ^＋ＬＡＴ２は、中性アミノ酸としてはグルタミン、ロイシン、イソロイシンを主に輸送し、アミノ酸輸送系ａｓｃとは基質選択性が異なっている。
機能発現に補助因子４Ｆ２ｈｃを要求するトランスポーターとして、中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２の類似蛋白質であるｘＣＴがクローニングされた［Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１４５５−１１４５８，１９９９］。ｘＣＴはシスチンとグルタミン酸を輸送し、アミノ酸輸送系ａｓｃとは基質選択性が異なっている。
また、４Ｆ２ｈｃと類似構造を持つ他の補助因子ｒＢＡＴを機能発現に要求するトランスポーターとして、中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２の類似蛋白質であるＢＡＴ１がクローニングされた［Ｃｈａｉｒｏｕｎｇｄｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８８４５−２８８４８，１９９９］。ＢＡＴ１は、シスチン、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸を輸送し、アミノ酸輸送系ａｓｃとは基質選択性が異なっている。
以上のように、４Ｆ２ｈｃ及びｒＢＡＴと連結することによって機能するトランスポーターの分子的実体が明かにされ、二型糖タンパク質と分子複合体を形成することによって輸送機能を発揮する一群のトランスポーターが存在することが明かにされた。
さらに、機能発現に補助因子４Ｆ２ｈｃを要求するトランスポーターとして、中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２の類似蛋白質であるＡｓｃ−１がクローニングされた［Ｆｕｋａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：９６９０−９６９８，２０００］。Ａｓｃ−１は、アラニン、セリン、システイン、スレオニン、グリシン等を選択的に輸送し、アミノ酸輸送系ａｓｃの基質選択性を示し、輸送系ａｓｃの第一のアイソフォームであることが明らかにされた。
Ａｓｃ−１は、Ｌ−アミノ酸の他、アラニン、セリン、システイン、スレオニンのＤ−体及びα−アミノイソ酪酸（α−ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、β−アラニンも輸送する点で、赤血球膜で記述された古典的な輸送系ａｓｃと異なった性質を示す。従って、Ａｓｃ−１以外に古典的な輸送系ａｓｃに相当するトランスポーターが存在すると考えられていた。
トランスポーターと他のタンパク質との融合タンパク質の作製は、ｂ^０．＋ＡＴとその細胞膜移行のための１回膜貫通型補助因子ｒＢＡＴとの間で試みられている［Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：４１３５−４１４７，１９９９］。しかし、これはｂ^０．＋ＡＴとｒＢＡＴという本来の組み合わせに従って作製された融合タンパク質であり、補助因子が不明なため細胞膜への機能発現が不能なトランスポータータンパク質を強制的に細胞膜に発現させ、その機能を同定する目的で行われたものではない。
発明の開示
本発明の目的は、ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送し、赤血球膜で記述された古典的な輸送系ａｓｃの機能を示すトランスポーターの遺伝子及びその遺伝子がコードするポリペプチドであるナトリウム非依存性小型中性アミノ酸トランスポーターを提供することにある。加えて、このトランスポーターとの融合タンパク質を作製することにより、外来性遺伝子発現系において細胞膜へ移行しないためにその機能を同定することができないトランスポータータンパク質の機能解析を行う方法を提供することにある。
その他の目的については、以下の記載より明らかである。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、ＬＡＴ１のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を用いてＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）データベースを検索し、ＬＡＴ１と類似の塩基配列を同定した。それに相当するｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定し、それが新規タンパク質をコードすることを明らかにした。さらに、この遺伝子の翻訳産物と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質を作製し、アフリカツメガエルの卵母細胞の細胞膜に発現させた。これにより、この遺伝子の翻訳産物の機能は、中性アミノ酸輸送系ａｓｃに相当し、すでに知られているＡｓｃ−１とは異なり、かつて赤血球膜で記述された古典的輸送系ａｓｃに相当するものであることを明らかにし、本発明を完成するにいたった。
すなわち、本発明は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質である。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質。
また、本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
また、本発明は、外来性遺伝子発現系において細胞膜へ移行しないため機能の同定できないトランスポータータンパク質について、配列番号３で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質（４Ｆ２ｈｃ）又は配列番号５で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質（ｒＢＡＴ）との融合タンパク質を作製することにより、細胞膜へ移行させ、トランスポーターの機能解析を行う方法である。
本発明のナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を有する新規タンパク質、すなわちアミノ酸トランスポーターＡｓｃ−２（ａｓｃ−ｔｙｐｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２）は、４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質を作製することにより、細胞膜に発現し、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニンなどの小型中性アミノ酸を高親和性に輸送する（取り込む）能力を有する。さらに、Ｌ−メチオニオン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニンを低親和性に輸送する。
また、本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２は、生体内においては腎臓、胎盤、骨格筋に主に発現している。さらに、脾臓及肺に弱い発現が認められる。
後記する配列表の配列番号１は、マウス由来の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーター（マウスＡｓｃ−２）のアミノ酸配列を表し、配列番号２はその遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約１．８ｋｂｐ）及びその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列（４６５アミノ酸）を表わす。
配列番号１に示されるアミノ酸配列又は配列番号２に示される塩基配列について、既知ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）及びプロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に含まれるすべての配列に対してホモロジー検索を行った結果、一致するものはなく、この配列は新規なものであると考えられる。
本発明のタンパク質としては、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば配列番号１で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、中性アミノ酸輸送活性が失われない程度であればよく、通常１〜約９３個、好ましくは１〜約４７個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
また、本発明の遺伝子としては、配列番号２で示された塩基配列を有するもののほか、配列番号２で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質が中性アミノ酸を輸送する能力を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号１で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７−４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーター遺伝子は、適当な哺乳動物の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジークローニング法などにより好適に実施できる。
例えば、マウスあるいはヒト腎を遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ）を調製する。これからｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）データベースの検索によって得られるＬＡＴ１類似配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｓｋ^ＴＭ／ＥＢＩ／ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＩ８７５５５５）に相当するプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってＡｓｃ−２遺伝子のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
得られたｃＤＮＡについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、すなわち、Ａｓｃ−２のアミノ酸配列を決定することができる。
得られたｃＤＮＡが、小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーター、すなわちはｃＤＮＡにコードされた遺伝子産物が小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。すなわち、得られたＡｓｃ−２遺伝子のｃＤＮＡをもとにして、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを作製し、これから調整した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）（キャプ化されたもの）を卵母細胞内に導入して発現させ、中性アミノ酸を細胞内へ輸送する（取り込む）能力を、適当な中性アミノ酸を基質とする通常の取り込み試験（Ｋａｎａｉ ａｎｄ Ｈｅｄｉｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、第３６０巻、４６７−４７１貢、１９９２年）により、細胞内への基質の取り込みを測定することにより確認できる。
得られたＡｓｃ−２遺伝子のｃＤＮＡから調整した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を用いて、インビトロ翻訳法［Ｈｅｄｉｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１０６４巻、３６０頁、１９９１年］により、ａｓｃ−１タンパク質を合成し、電気泳動によりタンパク質のサイズ、糖付加の有無等を検討することができる。
４Ｆ２ｈｃの遺伝子のｃＤＮＡはすでに報告されている［Ｆｕｋａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：９６９０−９６９８，２０００］ので、この配列情報から、ＰＣＲ法などを用いて、容易に４Ｆ２ｈｃの遺伝子を得ることが可能である。
後記する配列表の配列番号３は、マウス由来の４Ｆ２ｈｃのアミノ酸配列（５２６アミノ酸）を表し、配列番号４はその遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約１．８ｋｂｐ）及びその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列を表わす。
ｒＢＡＴの遺伝子のｃＤＮＡもすでに報告されている［Ｓｅｇａｗａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２８：６５７−６６４，２０００］ので、この配列情報から、ＰＣＲ法などを用いて、容易にｒＢＡＴの遺伝子を得ることが可能である。
後記する配列表の配列番号５は、マウス由来のｒＢＡＴのアミノ酸配列（６８５アミノ酸）を表し、配列番号６はその遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約２．３ｋｂｐ）及びその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列を表わす。
Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡは、Ａｓｃ−２遺伝子のｃＤＮＡ、４Ｆ２ｈｃ遺伝子のｃＤＮＡ、あるいはｒＢＡＴ遺伝子のｃＤＮＡをもとにして、ＰＣＲ法などを用いて、容易に作製できる。
また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、Ａｓｃ−２の特性、例えば、Ａｓｃ−２がアミノ酸の交換輸送型と促通拡散型の混在した輸送を行っているという特性や、Ａｓｃ−２の基質選択性、ｐＨ依存性などを調べることができる。
得られたＡｓｃ−２遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号２に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、サムブルックらの「分子クローニング」（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓより１９８９に発刊］）に記載の方法により調整することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーター及びその遺伝子（Ａｓｃ−２）は、例えば、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、Ａｓｃ−２をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチド生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳類細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞及び哺乳類細胞を用いることが好ましい。
また、本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターと４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質及びその遺伝子（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃあるいはＡｓｃ−２−ｒＢＡＴ）は、例えば、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃあるいはＡｓｃ−２−ｒＢＡＴをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチド生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳類細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞及び哺乳類細胞を用いることが好ましい。
例えば、ポリペプチドを哺乳類細胞で発現させる場合には、本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２、あるいはＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、アデノウイルス系ベクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター、各種のプラスミド等）中の適当なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０ プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１ａ プロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、又はヒトＨｅＬａ細胞などの細胞株などが挙げられる。
したがって、本発明は、前記した本発明の遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、好ましくは発現ベクター、及び当該ベクターを用いて形質転換された宿主細胞（形質転換体）を提供する。
小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることができるほか、前記のｃＤＮＡ配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２頁（１９８４年）］等によって実施できる。
小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質及（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃあるいはＡｓｃ−２−ｒＢＡＴ）をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号２で示される塩基配列及び配列番号４で示される塩基配列あるいは配列番号６で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いて作製することができるほか、前記のｃＤＮＡ配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２頁（１９８４年）］等によって実施できる。
したがって、本発明は、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上、好ましくは２０塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを提供するものである。
本発明のヌクレオチドは、ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用することができ、また、当該タンパク質をコードする遺伝子やそれと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子などを入手する際のプライマーとして使用することができ、さらに、そのアンチセンス鎖などによりナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用することもできる。
本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーター又はこれと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することができる。抗体は、小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターの検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーター、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチドなどを抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
したがって、本発明は、前記した本発明タンパク質に対する抗体、好ましくは当該タンパク質に対する特異抗体を提供するものである。
本発明のタンパク質は、ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を有するものであり、この能力は種々の物質の存在下に強い影響を受ける。この能力を阻害する物質や、促進する物質をスクリーニングすることにより、本発明のタンパク質の物質の輸送の能力を制御することができる。
したがって、本発明は、前記した本発明のタンパク質を用いて、該タンパク質の有するナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出する方法を提供する。
また、本発明のタンパク質により輸送されるアミノ酸類は、細胞の増殖や成長、生命維持に不可欠の物質であり、これらの物質の細胞内への取り込みを制御することにより、細胞の増殖や成長などを制御することができる。したがって、本発明は、前記した本発明のタンパク質、その特異抗体、又はその機能促進物質若しくは機能抑制物質を用いて、該タンパク質が有する小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、細胞増殖を制御する方法を提供するものである。
本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質の遺伝子およびその発現細胞は、Ａｓｃ−２が存在する細胞膜や、Ａｓｃ−２が存在すると予想される部位での物質透過効率についての、インビトロでの試験に使用できる。また、小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質の遺伝子およびその発現細胞は、Ａｓｃ−２が存在する細胞膜や、Ａｓｃ−２が存在すると予想される部位を効率良く透過する化合物の開発に使用できる。さらに、小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質の遺伝子およびその発現細胞は、Ａｓｃ−２が存在する細胞膜や、Ａｓｃ−２が存在すると予想される部位での薬物間相互作用のインビトロでの試験に使用できる。
したがって、本発明は、前記した本発明のタンパク質、その特異抗体、又はその機能促進物質若しくは機能抑制物質を用いて、該タンパク質が有する中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送される薬物、毒物又は外来性異物の体内動態を変更する方法を提供する。
このように、本発明のタンパク質はナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を有するものであり、この能力は細胞に存在するタンパク質の数によるだけでなく、各種の物質の存在下で抑制（機能抑制物質などのの存在下で）することもでき、また促進（機能促進物質などのの存在下で）させることもできることから、本発明は、前記した本発明のタンパク質、その特異抗体、又はその機能促進物質若しくは機能抑制物質を含有してなる、該タンパク質が有する小型中性アミノ酸及びその類似物質の輸送能力制御剤を提供するものである。
本発明の輸送能力制御剤は、細胞の増殖や成長などを制御できることから細胞増殖制御剤や、また薬物、毒物又は外来性異物の体内動態を変調、制御することができることから薬物、毒物又は外来性異物の体内動態制御剤として使用することができる。
本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２を抑制することにより、Ａｓｃ−２を発現する細胞膜や、Ａｓｃ−２が存在すると予想される部位の特定の化合物の透過を制限することができる。また、本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質の遺伝子およびその発現細胞は、Ａｓｃ−２により輸送される化合物の、細胞膜通過や、Ａｓｃ−２が存在すると予想される部位の透過を制限する薬物（Ａｓｃ−２の特異的なインヒビター等）の開発に使用できる。
したがって、本発明は、外来性遺伝子発現系において細胞膜へ移行しないために機能を同定することができないタンパク質について、当該タンパク質を細胞膜移行を推進するタンパク質との融合タンパク質にして細胞膜へ移行させることからなるトランスポータータンパク質の機能を解析する方法を提供するものである。本発明の細胞膜移行を推進するタンパク質としては、配列番号３若しくは５で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質、又はこれらのタンパク質の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。また、外来性遺伝子発現系において細胞膜へ移行しないために機能を同定することができないタンパク質としては、トランスポーターが好ましいがこれに限定されるものではない。
また、本発明は、配列番号３若しくは５で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質が、タンパク質の細胞膜移行推進作用を有することを見いだしたものであり、したがって、本発明は、配列番号３若しくは５で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質、又はこれらのタンパク質の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を含有してなる、タンパク質の細胞膜移行推進剤を提供するものである。本発明の細胞膜へ移行されるタンパク質としては、外来性遺伝子発現系において細胞膜へ移行しないために機能を同定することができないトランスポータータンパク質が好ましい。
実施例
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、サムブルックら「分子クローニング」（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓより１９８９に発刊］）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
実施例１
（１）小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターのマウスｃＤＮＡの同定
ラットＬＡＴ１［Ｋａｎａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２３６２９−２３６３２，１９９８］の翻訳領域の塩基配列を用いたＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）データベースの検索によって得られた、ラットＬＡＴ１と類似のマウス由来の塩基配列ＧｅｎＢａｎｓｋ^ＴＭ／ＥＢＩ／ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＩ８７５５５５に相当するｃＤＮＡクローンをＩＭＡＧＥ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）より購入し（ＩＭＡＧＥ ｃｌｏｎｅ Ｉ．Ｄ．：１９７２３７２）、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、ｃＤＮＡの全長の塩基配列を決定した。また、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により解析して、ｃＤＮＡの翻訳領域とそこにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定した。
このアミノ酸配列を後記配列表の配列番号１に、塩基配列を配列番号２にそれぞれ示した。
Ａｓｃ−２は、中性アミノ酸輸送系Ｌに相当するラットトランスポーターＬＡＴ１と３４％、ＬＡＴ２と３３％のアミノ酸配列の相同性を有していた。また、Ａｓｃ−２は、中性および塩基性アミノ酸輸送系ｙ^＋Ｌに相当するラットトランスポーターｙ^＋ＬＡＴ１と３４％、ヒトトランスポーターｙ^＋ＬＡＴ２と３２％の相同性を有していた。さらに、Ａｓｃ−２は、シスチン及び酸性アミノ酸輸送系ｘ⁻Ｃに相当するマウストランスポーターｘＣＴと３４％、シスチン及び中性及び塩基性アミノ酸輸送系ｂ^０．＋に相当するラットトランスポーターＢＡＴ１と３５％のアミノ酸配列の相同性を有していた。さらに、Ａｓｃ−２は、塩基性アミノ酸輸送系ｙ^＋に相当するマウス及びヒトトランスポーターＣＡＴ１〜４と２８〜２９％の相同性を有していた。
Ａｓｃ−２とマウスＡｓｃ−１、ラットＬＡＴ１、ラットｙ^＋ＬＡＴ１、ヒトｙ^＋ＬＡＴ２、マウスｘＣＴ及びラットＢＡＴ１のアミノ酸配列の比較を第１図に示した。
ＳＯＳＵＩアルゴリズム［Ｈｉｒｏｋａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第１４巻、第３７８頁（１９９８年）］により、Ａｓｃ−２のアミノ酸配列を解析した結果、第１図に示したように、１２個の膜貫通領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）が予想された。第３の親水性ループに、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、Ａｓｃ−２、ｙ^＋ＬＡＴ１、ｙ^＋ＬＡＴ２、ｘＣＴ及びＢＡＴ１との間に保存されたシステイン残基があった。このシステイン残基を介して、Ａｓｃ−２は、未知の補助因子とジスルフィド結合を介して連結することが予想された。また、第６の親水性ループにｃＡＭＰ依存性のリン酸化部位と考えられる部位があった。
（２）インビトロ翻訳による、Ａｓｃ−２タンパク質の解析
インビトロ翻訳法［Ｈｅｄｉｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１０６４巻、３６０頁、１９９１年］により、Ａｓｃ−２ｃＲＮＡ及びマウス４Ｆ２ｈｃのｃＲＮＡからＡｓｃ−２及び４Ｆ２ｈｃタンパク質を合成し、電気泳動を行った。
その結果を第２図に図面に代わる写真で示す。この結果、５５ｋＤａのバンドが得られ、糖付加酵素群を含むイヌ膵臓ミクロゾーム画分の存在下でも糖付加を受けず、糖付加部位を持たないタンパク質であることが示された（第２図参照）。これに対して、糖付加反応の対照として行ったマウス４Ｆ２ｈｃのｃＲＮＡのインビトロ翻訳では、６５ｋＤａのバンドが得られ、イヌ膵臓ミクロゾーム画分の存在下で８０ｋＤａのバンドが出現した。このバンドは、糖鎖分解酵素エンドグリコキダーゼＨ（ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｈ）により、６５ｋＤａに復帰した。
（３）マウスの種々の組織におけるＡｓｃ−２遺伝子の発現（ノーザンブロッティングによる解析）
Ａｓｃ−２遺伝子の第１３５−７３５塩基対に相当するｃＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、^３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしてプローブとして用いて、マウスの種々の組織から抽出したＲＮＡに対してノーザンブロッティングを以下のようにして行った。３μｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動したのち、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを４２℃で、^３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＡｓｃ−２のｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液で１晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
ノーザンブロッティングの結果を第３図に図面に代わる写真で示す。この結果、腎において１．７ｋｂ付近にバンドが検出された。さらに、さらに、腎と胎盤に４．０ｋｂ付近のバンドが検出された。加えて、７．５ｋｂ付近の薄いバンドが、肺と脾臓検出された。また、骨格筋には、０．５ｋｂと１．０ｋｂ付近の短いバンドが検出された。
さらに、Ａｓｃ−２が赤血球に発現するかどうかを検討する目的で、ハラらの方法［Ｈａｒａ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｇａｗａ，Ｍ．：Ａｍ Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１：４５３−４５８，１９７６］に従い、雄ＩＣＲマウスに１−アセチル−２−フェニルヒドラジン（１−ａｃｅｔｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｓｚｉｎｅ）（６０ｍｇ／ｋｇ体重）を第０日、１日及び３日に投与し溶血性貧血を起こさせることによって、脾造血を起こさせ、第６日に脾臓を回収した。この脾臓から抽出した３μｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを、無処置雄ＩＣＲマウス由来の脾臓のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ（３μｇ）とともに１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動したのち、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを４２℃で、^３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＡｓｃ−２のｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液で１晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。同時に、^３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたマウスＡｓｃ−１のｃＤＮＡ断片をプローブとしたノーザンハイブリダイゼーションを行った。
このノーザンブロッティングの結果を第４図に図面に代わる写真で示す。この結果、無処置マウス脾臓、１−アセチル−２−フェニルヒドラジン（１−ａｃｅｔｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｓｚｉｎｅ）処理マウス脾臓ともに、７．５ｋｂ付近にバンドが検出された。１−アセチル−２−フェニルヒドラジン（１−ａｃｅｔｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｓｚｉｎｅ）処理マウスでは、無処置マウスに比して、発現が３．２±０．６（平均±標準誤差、ｎ＝３）倍高かった。従って、Ａｓｃ−２は、赤血球に発現することが示唆された。これに対して、Ａｓｃ−１は、脳のみの発現が見られ、無処置マウス、１−アセチル−２−フェニルヒドラジン（１−ａｃｅｔｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｓｚｉｎｅ）処理マウスともに、脾臓には発現が検出されなかった。
（４）マウス赤血球及びマウス腎におけるＡｓｃ−２蛋白の発現
マウスＡｓｃ−２の４５５−４６５に相当する合成オリゴペプチド［ＳＰＳＥＤＰＥＥＱＫＮＣ］（Ｃ−末端のシステン残基はＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）とのコンジュゲーションのために導入）に対する特異抗体をアルトマン（Ａｌｔｍａｎ）らの方法に準じて作製した［Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８１巻、２１７６−２１８０頁、１９８４年］。
マウス赤血球及び腎の膜画分をトレンス（Ｔｈｏｒｅｎｓ）らの方法［Ｔｈｏｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ第５５巻、２８１−２９０頁、１９８８］に従って調整した。タンパク試料は、５％の２−メルカプトエタノール存在下（還元条件下）あるいは非存在下（非還元条件下）で１００℃で５分間処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ ＰＶＤＶトランスファー膜にブロッティングし、抗Ａｓｃ−２アフィニティー精製抗体（１：５，０００）で処理した。
結果を第５図に図面に代わる写真で示す。マウス赤血球では、抗Ａｓｃ−２抗体によって第５図に示すように、非還元条件下において８０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２５０ｋＤａ付近にバンドが検出された。マウス腎では、９０ｋＤａ付近にバンドが検出された。還元条件下では、赤血球、腎ともに、６０ｋＤａ付近にバンドにが検出された。これらの結果より、Ａｓｃ−２は、何らかのタンパク質とジスルフィド結合により連結していることが示唆される。さらに、赤血球と腎では、異なったタンパク質がＡｓｃ−２と連結していることが示唆される。
実施例２．小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質の作製とその機能の解析
（１）小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質の作製
Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）を作製するために、合成オリゴＤＮＡプライマー５’−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＧＧ−３’（Ａｓｃ−２のｃＤＮＡの第１７−３６塩基対に相当する配列に、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ切断部位に相当する配列と５’−側にＧＣＧＣを加えたもの）及び５’−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴ−３’（Ａｓｃ−２のｃＤＮＡの第１４９１−１５１０塩基対に相当する配列に、ＳｐｅＩとＥｃｏＲＩ切断部位に相当する配列と５’−側にＧＣＧＣを加えたもの）を用いて、Ａｓｃ−２のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断し、哺乳類細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位にライゲーションした。さらに、合成オリゴＤＮＡプライマー５’−ＧＣＧＣＡＴＣＧＡＴＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号６で示されるマウスｒＢＡＴの翻訳開始コドンＡＴＧの直後より２０塩基対に相当する配列に、ＥｃｏＲＩ切断部位に相当する配列と５’−側にＧＣＧＣを加えたもの）及び５’−ＧＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＧＴＡ−３’（配列番号６で示されるマウスｒＢＡＴの２２４０−２２５９塩基対に相当する配列に、ＮｏｔＩ切断部位に相当する配列と５’−側にＧＣＧＣを加えたもの）を用いて、ｒＢＡＴのｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断し、上記Ａｓｃ−２のＰＣＲ産物を組み込んだ哺乳類細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位へライゲーションすることにより、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを得た（第６図参照）。
（２）卵母細胞を用いた^１４Ｃ−セリンの取り込みの結果を第７図に示す。^１４Ｃ−セリンの取り込みは、Ａｓｃ−２のみを発現させた卵母細胞及びＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃを共発現させた卵母細胞では、対照として水を注入した卵母細胞と同レベルであったが、Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴあるいはＡｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃを発現させた卵母細胞では大きなセリンの取り込みを示した。
ｒＢＡＴあるいは４Ｆ２ｈｃが、Ａｓｃ−２の直接の補助因子とはならないことを、ＣＯＳ−７細胞を用いて検討した。Ａｓｃ−２のｃＤＮＡ、ｒＢＡＴのｃＤＮＡあるいは４Ｆ２ｈｃのｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ（各１μｇ）を、ミゾグチら［Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．：Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５９：１８２１−１８３３，２００１］の方法に従って、リポフェクタミン２０００試薬（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いてＣＯＳ−７細胞に導入した。導入後、細胞は２４穴プレートで２日間培養し、^１４Ｃ−セリン（１０μＭ）の取り込みを測定した。取り込み測定は、ミゾグチら［Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．：Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５９：１８２１−１８３３，２００１］の方法に従い、培養液を取り除き、^１４Ｃ−セリンを含むデュルベッコのＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製））を添加することにより開始し、それを取り除き氷冷デュルベッコのＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ）により洗浄することにより終了した。洗浄後、０．１Ｎ ＮａＯＨで溶解し、液体シンチレーションカウンターにより放射活性を測定した。
その結果を第８図に示す。セリンの取り込みは、Ａｓｃ−２のみを発現させた卵母細胞、Ａｓｃ−２とｒＢＡＴを共発現させた卵母細胞及びＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃを共発現させた卵母細胞では、対照として水を注入した卵母細胞と同レベルであり、ｒＢＡＴあるいは４Ｆ２ｈｃが、Ａｓｃ−２の直接の補助因子とはならないことが確認された。
（３）小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）の卵母細胞細胞膜への発現の蛍光免疫法による同定
卵母細胞にＡｓｃ−２を発現させた場合は機能しないが、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）は機能活性を示したが、これは、Ａｓｃ−２は細胞膜へ輸送されないが、Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃは細胞膜に輸送されるためであるかどうかを、蛍光免疫法によって検討した。
Ａｓｃ−２遺伝子ｃＲＮＡ２５ｎｇあるいはＡｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃとの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）遺伝子ｃＲＮＡ２５ｎｇを卵母細胞に注入することによって発現させ３日間培養後、卵母細胞を４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で固定し、常法に従いパラフィン切片（３μｍ）を作製した。脱パラフィン後、切片を０．１％のトュウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む０．０５Ｍトリス緩衝生食液中で、５％ヤギ血清でブロッキングし、アフィニティー精製した抗Ａｓｃ−２抗体、あるいはアフィニティー精製した抗４Ｆ２ｈｃ抗体［Ｆｕｋａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：９６９０−９６９８，２０００］で処理した。その後、切片は、Ｃｙ３−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処理し、０．１％のトュウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む０．０５Ｍトリス緩衝生食液で洗浄後、オリンパスフルオビュー（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ（ＦＶ ５００））共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス）を用いて観察した。グリーンハネレ（Ｇｒｅｅｎ Ｈｅｎｅｒｅ）レーザーにより５４３ｎｍで励起し、ＢＡ５６０ＩＦフィルターを用いてＣｙ３からの蛍光を検出した。
その結果を第９図に図面に代わる写真で示す。Ａｓｃ−２を発現させた卵母細胞では、抗Ａｓｃ−２抗体で検出されるＡｓｃ−２タンパク質は細胞膜には存在せず、細胞質内に留まっている（第９図ｄ参照）が、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）を発現させた卵母細胞では、抗４Ｆ２ｈｃ抗体（第９図ｅ参照）、抗Ａｓｃ−２抗体（第９図ｆ参照）ともに細胞膜に発現したＡｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ融合タンパク質を検出した。対照として水を注入した卵母細胞では、抗４Ｆ２ｈｃ抗体（第９図ａ参照）あるいは抗Ａｓｃ−２抗体（第９図ｂ参照）による特異的な発色は見られなかった。従って、卵母細胞にＡｓｃ−２を発現させた場合は機能せず、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）が機能活性を示したことは、Ａｓｃ−２は単独では細胞膜へ輸送されないが、４Ｆ２ｈｃとの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）は細胞膜に輸送されるためであることが確認された。
（４）Ａｓｃ−２の輸送活性の塩依存性
Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃあるいはＡｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるセリン取り込み実験において培地に添加する塩の影響を調べた。
セリンの取り込み実験は、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃあるいはＡｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例２（２）記載の方法に準じて実施した。但し、取り込み用溶液は、ナトリウムイオンの影響をみる場合は、ナトリウムフリー取り込み溶液（Ｎａ^＋−ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にかえて、標準取り込み溶液（ｕｐｔａｋｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１００ｍＭ塩化コリンを１００ｍＭ塩化ナトリウムに変えたもの）を用いた。塩素イオンの影響をみる場合は、標準取り込み溶液（ｕｐｔａｋｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にかえて、グルコン酸取り込み溶液（１００ｍＭ塩化ナトリウムを１００ｍＭグルコン酸ナトリウムに変えたもの）を用いた。
その結果を第１０図に示す。細胞外のコリンをナトリウムに変えても、細胞外の塩素イオンをグルコン酸イオンに変えても、セリン取り込みに何ら影響を与えなかった。このことから、Ａｓｃ−２はナトリウムイオン及び塩素イオンに非依存的に働くトランスポーターであることが示された。
（５）Ａｓｃ−２のミカエリス−メンテン動力学試験
小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーターＡｓｃ−２のミカエリス−メンテン動力学試験を行った。基質セリンの濃度の違いによるセリン取り込み率の変化を調べることにより、Ａｓｃ−２のミカエリス−メンテン動力学試験を行った。
セリンの取り込み実験は、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃあるいはＡｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例２（２）記載の方法に準じて実施した。その結果を第１１図に示す。Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴのセリン輸送のＫｍ値は２．８８±０．３７μＭ（平均±標準誤差、ｎ＝３）であった。Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃのセリン輸送のＫｍ値は２．１０μＭであった。
セリン以外のＡｓｃ−２の基質となるアミノ酸においても同様にミカエリス−メンテン動力学試験を行い、Ｋｍ値とＶｍａｘ値を算出し、次の表１に示した。

表１中の各々のＶｍａｘ値は、アラニンのとＶｍａｘ値を１．００とした場合の比率で示した。個々の値は、平均±標準誤差（ｎ＝３）を示す。
（６）Ａｓｃ−２を介するアミノ酸の放出試験
Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを共に注入した卵母細胞において、前負荷した^１４Ｃ−セリンのＡｓｃ−２を介する放出を調べた。
Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞に１００ｎｌの６００μＭ^１４Ｃ−セリン（〜１０ｎＣｉ）を注入し、氷冷のセリンを含まないナトリウムフリー取り込み溶液（Ｎａ^＋−ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄した後、室温（１８℃−２２℃）のセリン（１００μＭ）添加あるいは未添加のナトリウムフリー取り込み溶液（Ｎａ^＋−ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に移し、細胞外に放出される^１４Ｃ−セリンの量を測定した。
その結果を第１２図に示す。Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴにおいては、細胞外にセリンを添加しない場合においても^１４Ｃ−セリンの有意な放出が観察され、その放出は細胞外にセリンを添加することによってさらに増加した（第１２図参照）。従って、Ａｓｃ−２は交換輸送と促通拡散型輸送が混在するトランスポーターであることがわかった。
Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）遺伝子ｃＲＮＡを共に注入した卵母細胞においても、Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴの場合と同様にして、前負荷した^１４Ｃ−セリンのＡｓｃ−２を介する放出を調べた。
その結果、Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃにおいても、Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴの場合と同様に、細胞外にセリンを添加しない場合においても^１４Ｃ−セリンの有意な放出が観察され、その放出は細胞外にセリンを添加することによってさらに増加した。
（７）Ａｓｃ−２の基質選択性（アミノ酸及びその類似物質添加による阻害実験）
Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるセリンの取り込み実験において、系への各種アミノ酸及びその類似物質添加の影響を調べた。
セリンの取り込み実験は、Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例２（２）記載の方法に準じて実施した。但し、ナトリウムフリー取り込み溶液（Ｎａ^＋−ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用い、５００μＭの各種化合物（非標識）の存在下及び非存在下で、^１４Ｃ−セリン（５μＭ）の取り込みを測定した。
その結果を第１３図に示す。各種の中性Ｌ−アミノ酸で、ｃｉｓ−阻害効果が観察された。特に、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、システインはＡｓｃ−２−ｒＢＡＴを介した^１４Ｃ−セリンの取り込みを強く阻害した。
酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、輸送系Ｌ特異的抑制薬２−アミノ−２−ノルボルナンカルボン酸（２−ａｍｉｎｏ−２−ｎｏｒｂｏｒｎａｎｅ−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＢＣＨ）、γ−アミノイソブチル酸、及びα−アミノメチルイソブチル酸は、Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴを介した^１４Ｃ−セリンの取り込みに影響を与えなかった（第１３図参照）。
Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）遺伝子ｃＲＮＡを共に注入した卵母細胞においても、Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴの場合と同様にして、卵母細胞によるセリンの取り込み実験において、系への各種アミノ酸及びその類似物質添加の影響を調べた。
その結果、Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃにおいても、Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴの場合と同様な結果が得られ、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴとの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃあるいはＡｓｃ−２−ｒＢＡＴ）においては、４Ｆ２ｈｃあるいはｒＢＡＴの部分は基質結合部位の特性には影響せず、融合タンパク質で得られた基質選択性に関する情報は、Ａｓｃ−２そのものも輸送特性を反映することが示された。
（８）Ａｓｃ−２の基質選択性（各種アミノ酸及びその類似物質を基質とする取り込み試験）
各種アミノ酸及びその類似物質を基質として、Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による取り込みを調べた。
各種アミノ酸及びその類似物質の取り込み実験は、Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例２（２）記載の方法に準じて実施した。但し、基質としては、^１４Ｃ−セリンに変えて、放射能ラベルされた各種の化合物を用いた。
その結果を第１４図に示す。グリシン（^１４Ｃ化合物）、Ｌ−アラニン（^１４Ｃ化合物）、Ｌ−セリン（^１４Ｃ化合物）、Ｌ−スレオニン（^１４Ｃ化合物）（以上第１４図参照）を基質とした場合に、卵母細胞への大きな取り込みが認められた。
実施例３ マウス腎におけるＡｓｃ−２蛋白の免疫組織化学的解析
常法に従い、マウスの腎パラフィン切片をアフィニティー精製した抗Ａｓｃ−２抗体（１：１００）で処理後、ジアミノベンチジンで発色した。また、染色の特異性を検討する目的で、２００μｇ／ｍｌの抗原ペプチドの存在下で抗ＡＧＴ１抗血清（１：１００）で処理する実験も行った。
その結果、第１５図ａに示すように、マウス腎では、髄質外層から髄質内層にかけての集合管に強い染色が見られた。この染色は、抗原ペプチドの存在下で抗Ａｓｃ−２抗血清を作用させた場合には検出されず、染色の特異性が示された（第１５図ｂ）。さらに強拡大で観察することにより、皮質部集合管（第１５図ｃ）及び髄質外層集合管（第１５図ｄ）、髄質内層集合管（第１５図ｅ及びｆ）の管腔側膜及び基底側膜にＡｓｃ−２タンパク質が存在することが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明の小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーター及びその遺伝子は、当該トランスポーターの発現箇所での小型中性アミノ酸の及び外来性異物も含めたアミノ酸類似化合物の輸送のインビトロでの検討や、それを基にしたそれら化合物の体内動態のインビトロでの予測を可能とする。さらに、当該トランスポーターの発現箇所を効率良く透過する薬物の開発に有用と考えられる。また、当該トランスポーターの有する小型中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、細胞増殖を制御する方法の開発に利用できる。本発明の融合タンパク質作製によるトランスポーターの機能解析法は、細胞膜膜移行に必要な補助因子が不明なため、細胞膜に発現させられないために機能を特定できないトランスポーターの機能解析を可能とする手法であり、機能が未同定の多くのトランスポーターの機能の特定に有用な方法である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、マウスＡｓｃ−２とマウスＡｓｃ−１、ラットＬＡＴ１、ラットｙ^＋ＬＡＴ１、マウスｘＣＴ及びラットＢＡＴ１のアミノ酸配列の比較を示す図である。予想される膜貫通部位の１２カ所を付線で示した。保存されているシスチン残基を＊で、予想されるｃＡＭＰ依存性のリン酸化部位を＃で示した。
第２図は、Ａｓｃ−２（図左）及びマウス４Ｆ２ｈｃ（図右）のインビトロ翻訳の結果を示す図面に代わる写真である。Ａｓｃ−２（図左）のインビトロ翻訳では、５５ｋＤａのバンドが得られ、イヌ膵臓ミクロゾーム画分（Ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ）の存在下で糖付加を受けず、糖鎖分解酵素エンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）によってバンドのサイズは変化しなかった。これに対して、４Ｆ２ｈｃ（図右）のインビトロ翻訳では、６５ｋＤａのバンドが得られ、イヌ膵臓ミクロゾーム画分の存在下で８０ｋＤａのバンドが出現した。このバンドは、糖鎖消化酵素エンドグリコシダーゼＨにより、６５ｋＤａに復帰した。
第３図は、マウスの各臓器組織におけるＡｓｃ−２遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示す図面に代わる写真である。図の左から、脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、骨格筋、腎臓、小腸、結腸、睾丸、及び胎盤をそれぞれ示す。左側の数値は分子量マーカーの位置を示す。
第４図は、マウス脳、正常マウス脾臓、及び溶血性貧血マウス脾臓における、Ａｓｃ−２遺伝子ｍＲＮＡの発現（第４図ａ）とＡｓｃ−１遺伝子ｍＲＮＡの発現（第４図ｂ）をノーザンブロッティングにより解析した結果を示す図面に代わる写真である。Ａｓｃ−２遺伝子ｍＲＮＡの発現は、正常マウス脾臓に比較して溶血性貧血を起こさせたマウスの脾臓（ａｎｅｍｉｃ ｓｐｌｅｅｎ）に強く発現し、脳には見られなかった（第４図ａ）。これに対して、Ａｓｃ−１遺伝子ｍＲＮＡの発現は、脳のみに見られ、正常マウス脾臓、溶血性貧血マウス脾臓ともに検出されなかった（第４図ｂ）。
第５図は、マウス赤血球膜標本（第５図ａ）及び、マウス腎膜標本（第５図ｂ）における抗Ａｓｃ−２抗体によるウェスタンブロット解析の結果を示す図面に代わる写真である。両者とも非還元条件下（−）及び還元条件下（＋）で行った。
第６図は、Ａｓｃ−２とｒＢＡＴ又は４Ｆ２ｈｃを連結させて作製した融合タンパク質の構造を模式的に示したものである。筒状の部分は膜貫通領域を示す。Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ融合タンパク質及びＡｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ融合タンパク質の連結部分のアミノ酸配列及び遺伝子塩基配列を第６図の下段に示した。
第７図は、Ａｓｃ−２遺伝子ｃＲＮＡ、Ａｓｃ−２遺伝子ｃＲＮＡ及びマウス４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡ、Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ融合タンパク質遺伝子ｃＲＮＡ、並びにＡｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ融合タンパク質遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるセリン取り込み実験の結果を示す。左端の水（ｗａｔｅｒ）は対照として水を注入した場合を示し、縦軸はセリンの取り込み量（ｐｍｏｌ／卵母細胞／分）を示す。
第８図は、Ａｓｃ−２遺伝子、Ａｓｃ−２遺伝子及びマウスｒＢＡＴ遺伝子、並びにＡｓｃ−２遺伝子及びマウス４Ｆ２ｈｃ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞によるセリン取り込み実験の結果を示す。左端は対照試験（ｍｏｃｋ）の結果を示し、縦軸はセリンの取り込み量（ｐｍｏｌ／細胞／分）を示す。
第９図は、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）の卵母細胞細胞膜への発現の蛍光免疫法による結果を示す図面に代わる写真である。対照として水を注入した卵母細胞（第９図ａ及びｂ）、Ａｓｃ−２遺伝子ｃＲＮＡを注入して発現させた卵母細胞（第９図ｃ及びｄ）、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）遺伝子ｃＲＮＡを注入して発現させた卵母細胞（第９図ｅ及びｆ）において、抗４Ｆ２ｈｃ抗体（ａ、ｃ、及びｅ）、あるいは抗Ａｓｃ−２抗体（ｂ、ｄ及びｆ）を用いた。蛍光の検出された部分を矢印で示す。検出されたＡｓｃ−２タンパク質は細胞膜には存在せず、細胞質内に留まっている（第９図ｄ参照）が、Ａｓｃ−２と４Ｆ２ｈｃの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ）を発現させた卵母細胞では、抗４Ｆ２ｈｃ抗体（第９図ｅ参照）、抗Ａｓｃ−２抗体（第９図ｆ参照）ともに細胞膜に発現したＡｓｃ−２−４Ｆ２ｈｃ融合タンパク質を検出した。
第１０図は、Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるセリン取り込み実験において添加する塩の影響を調べた結果を示すものである。左から塩化ナトリウム、塩化コリン、グルコン酸ナトリウムをそれぞれ示す。縦軸はセリンの取り込み量（ｐｍｏｌ／卵母細胞／分）を示す。
第１１図は、Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるセリン取り込み実験において基質セリンの濃度の影響を調べた結果を示すものである。横軸はセリンの濃度（μＭ）を示し、縦軸はセリンの取り込み量（ｐｍｏｌ／卵母細胞／分）を示す。
第１２図は、Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞よる^１４Ｃ−セリンの放出を、細胞外に非標識セリン（１００μＭ）の存在下（＋）、あるいは非存在下（−）で調べた結果を示す図。縦軸は、放出された放射活性を卵母細胞に注入した放射活性に対する％で示す。黒塗りのカラムは、対照としてｃＲＮＡの代わりに水を注入した卵母細胞、斜線を施したカラムは、Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞。＊又は＊＊は有意差があったことを示す。
第１３図は、Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるセリン取り込み実験において、系への各種Ｌ−アミノ酸もしくはその類似化合物添加の影響を調べた結果を示す。第１３図の（−）は無添加の場合を示し、ＡＩＢはα−アミノイソブチル酸を示し、ＭｅＡＩＢはα−メチルアミノイソブチル酸を示し、ＧＡＢＡはγ−アミノ酪酸を示し、ＢＣＨは２−アミノ−２−ノルボルナンカルボン酸を示す。縦軸は無添加（−）の場合を１００％としたときの取り込み量の比を示す。
第１４図は、Ａｓｃ−２とｒＢＡＴの融合タンパク質（Ａｓｃ−２−ｒＢＡＴ）遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による放射能標識アミノ酸の取り込みを調べた結果を示す。ＡＩＢはα−アミノイソブチル酸を示し、ＭｅＡＩＢはα−メチルアミノイソブチル酸を示す。縦軸はセリンの取り込み量（ｐｍｏｌ／卵母細胞／分）を示す。
第１５図は、マウスの腎における抗Ａｓｃ−２抗体によるＡｓｃ−２の免疫組織化学的解析の結果を示した図面に代わる写真である。ａは弱拡大像である。髄質外層から髄質内層にかけての集合管に強い染色が見られた。ｂは抗原ペプチドによる吸収実験の結果である。ａで検出された染色は消失し、染色の特異性が示された。ｃは皮質部集合管の強拡大像である。集合管上皮細胞の染色が見られた。ｄは髄質外層集合管の強拡大像である。集合管上皮細胞の管腔側膜及び基底側膜の染色が見られた。ｅ及びｆは髄質内層集合管の強拡大像である。集合管上皮細胞の管腔側膜及び基底側膜の染色が見られた。第１５図中のＣは腎皮質、ＯＭは腎髄質外層、ＩＭは腎髄質内層をそれぞれ示している。

Claims (17)

1. 以下の（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択されるタンパク質。
   （Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送する能力を有するタンパク質。
2. 以下の（Ｃ）及び（Ｄ）からなる群から選択されるタンパク質。
   （Ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の融合タンパク質。
   （Ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の融合タンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送する能力を有するタンパク質。
3. 以下の（Ｅ）及び（Ｆ）からなる群から選択されるタンパク質。
   （Ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の融合タンパク質。
   （Ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の融合タンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送する能力を有するタンパク質。
4. マウス由来である請求項１〜請求項３のいずれかに記載のタンパク質。
5. 請求項１〜請求項４のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
6. 以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されるＤＮＡからなる遺伝子。
   （ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
   （ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
7. 以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択されるＤＮＡからなる遺伝子。
   （ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
   （ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の融合タンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
8. 以下の（ｅ）及び（ｆ）からなる群から選択されるＤＮＡからなる遺伝子。
   （ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
   （ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の融合タンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
9. マウス由来である請求項５〜請求項８のいずれかに記載の遺伝子。
10. 請求項５〜請求項９のいずれかの項に記載の遺伝子を含むベクター。
11. 発現ベクターである請求項１０記載のベクター。
12. 請求項１０又は請求項１１に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
13. ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用するための、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチド。
14. ナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用するための、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチド。
15. 請求項１〜請求項４のいずれかの項に記載するタンパク質に対する抗体。
16. 請求項１〜請求項４のいずれかの項に記載するタンパク質を用いて、該タンパク質の有するナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出する方法。
17. 請求項１〜請求項４のいずれかの項に記載するタンパク質を用いて、該タンパク質の有するナトリウム非依存的に小型中性アミノ酸を輸送する能力を阻害又は促進する物質をスクリーニングする方法。

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