JP4117359B2

JP4117359B2 - Novel extracellular matrix protein specifically expressed in hair follicle placode and gene thereof

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Publication number: JP4117359B2
Application number: JP2002272055A
Authority: JP
Inventors: 大慈淨住; 明子岡田; 清俊関口; 亜樹長田; 俊夫今井; 雄一尾野
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Eisai R&D Management Co Ltd; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Eisai R&D Management Co Ltd; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-09-18
Filing date: 2002-09-18
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2022-09-18
Also published as: JP2004105086A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、毛包プラコードに発現する新規細胞外マトリックスタンパク質、およびその遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
毛包は、毛根を鞘状に取り囲んでいる組織で、毛根を保護し、毛の伸長の経路となる。毛包の発生には、他の多くの器官と同様に上皮−間葉系細胞（間質）間の相互作用が重要な役割を果たしている。
【０００３】
例えば、マウス頬髭の場合には、上記上皮−間質間の相互作用の過程で、胎齢１２日の上皮にプラコード（毛包上皮原基）が形成される。毛包形成期のプラコードは、間質細胞に働きかけ、プラコード直下の間質に間充織の誘導を促す。そして、上記上皮−間質間の相互作用により毛包が形成されることになる。それゆえ、プラコードに特異的に発現する因子は、毛包形成に重要な働きをすると考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記プラコードに特異的に発現し、毛包の形成に関与すると考えられる因子はすでにいくつか同定されており、これら因子を用いて毛包形成の分子メカニズムの解明が図られている。しかしながら、現時点では、毛包を人工的に作り出すまでには至っていない。これは、毛包形成の分子メカニズムにおいて、未知の因子が存在することを示唆しており、この未知の因子の同定は、上記分子メカニズムの解明と、毛包の人工的な作製に重要であると考えられる。
【０００５】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は、毛包の形成を調節する新規な因子及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、マウス毛包形成期のプラコードを含む組織よりＲＮＡを抽出して毛包プラコードに特異的に発現するｃＤＮＡを選別し、これを用いてタンパク質を発現させ、その機能を解析した。その結果、得られたタンパク質が細胞接着及び伸展活性を有する新規な細胞外マトリックスタンパク質であり、毛包の形成を調節する新規な因子であると推測されること等を見出すとともに、さらに、上記マウスのｃＤＮＡの塩基配列を利用して、ヒトにおいて相同なｃＤＮＡの塩基配列を決定し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明に関わるタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であり、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
【０００８】
（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【０００９】
（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【００１０】
また、本発明に係る他のタンパク質は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であり、本発明に係る他の遺伝子は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１１】
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸からなるタンパク質。
【００１２】
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【００１３】
上記（ａ）のタンパク質は、本発明者らが、今回新たにマウスから毛包プラコードに発現する新規な細胞外マトリックスタンパク質として単離、同定したものである。本発明にかかるタンパク質は、N末端側に予想分泌シグナル配列を有しているが、膜貫通ドメインがなく、分泌タンパク質であると推測される。
【００１４】
上記（ｃ）のタンパク質は、本発明者らによって、上記マウスQBRICKタンパク質に対応するヒトの相同タンパク質として同定されたものであり、後述するように、上記マウスQBRICKタンパク質と相同性を有している。
【００１５】
本発明に係る組み換え発現ベクターは、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１に示される遺伝子が挿入された組み換え発現ベクターが挙げられる。組み換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることが出来るが、特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されたことを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織、器官のみならず、動物個体（マウスやラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として、広く用いられており、ノックアウトマウス等は、細胞外マトリックス因子の、機能解析、同因子が関係する病気の病態解析やその病気の診断法、診断薬、治療法の開発などに有用である。
【００１７】
本発明に係る抗体は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質、又はその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００１８】
後述するように、本発明に係る遺伝子は、胎齢１２日のマウスでは毛包プラコードに特異的に強い発現が見られること、本発明に係るタンパク質はその生理活性として細胞接着及び伸展活性を有することなどから、新たな毛包形成調節因子である可能性が高い。それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、抗体等は、毛包形成促進剤の開発に応用することが可能である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
本発明は、毛包プラコードに発現する新規な細胞外マトリックスとこれをコードする遺伝子とを見出すとともに、これら遺伝子及びタンパク質の機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明の遺伝子、タンパク質の配列、構造について説明し、ついでこれら遺伝子、タンパク質の機能、利用方法等について説明することとする。
【００２１】
（１）本発明に係る遺伝子及びタンパク質の配列、構造
本発明者は、胎齢１２日のマウス胎仔頬上皮由来のｃＤＮＡから、ＲＤＡ法（Lisitsyn, Lysitsyn, Wigler, Science 259, 946-951 (1993)他）を用いて、頬上皮に特異的に発現していると考えられるｃＤＮＡの断片を得た。その配列情報を利用して胎齢１２日マウス胎仔頬由来ＲＮＡより、ＰＣＲ法及び５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法を用いて２種類の全長ｃＤＮＡ配列を決定し、さらにこれら２種類のｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ決定した。
【００２２】
これら新規タンパク質の構造解析の結果、第１の新規ｃＤＮＡを「QBRICK遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「QBRICKタンパク質」と称して説明する。第２の新規ｃＤＮＡは、上記QBRICK遺伝子の選択的スプライシングアイソフォームと考えられるが、この第２のｃＤＮＡを「QBRICK-S遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「QBRICK-Sタンパク質」と称して説明する。
【００２３】
さらに、本発明者らは、上記QBRICK遺伝子と相同性を有する核酸配列をヒトゲノム配列と比較することから、ヒトQBRICKタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を決定し、さらにこのｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を決定した。そこで、以下の説明では、ヒト由来の新規ｃＤＮＡ配列を「ヒトQBRICK遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「ヒトQBRICKタンパク質」と称して説明する。
【００２４】
なお、以下の説明では、特に断りのない限り、QBRICK遺伝子又はQBRICKタンパク質とは、それぞれマウス由来の上記第１の新規ｃＤＮＡ又はそれにコードされるタンパク質を指し、ヒト由来のものは、必ず「ヒトQBRICK遺伝子」又は「ヒトQBRICKタンパク質」と称して説明する。
【００２５】
本発明に係る遺伝子は、前述のように、（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号１に示される塩基配列のうち、５２７〜７０４５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（QBRICK遺伝子）、▲２▼配列番号３に示される塩基配列のうち、１〜９５１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（QBRICK-S遺伝子）、▲３▼これらｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子はマウス（Mus musculus）由来である。
【００２６】
また、本発明に係る他の遺伝子は、前述のように、（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子であればよいが、本実施の形態では、▲４▼配列番号５に示される塩基配列のうち、１〜６５７９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（ヒトQBRICK遺伝子）、▲５▼このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子はヒト由来である。
【００２７】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。またＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）或いは（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２８】
一方、本発明に係るタンパク質は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しており、２１７２のアミノ酸残基からなるQBRICKタンパク質、及び、▲２▼配列番号４に示されるアミノ酸配列を有しており、３１６のアミノ酸残基からなるQBRICK-Sタンパク質が例示される。
【００２９】
また、本発明に係る他のタンパク質は、前記（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有しており、２１９２のアミノ酸残基からなるヒトQBRICKタンパク質が例示される。
【００３０】
このQBRICKタンパク質は、後述する実施例で説明するように、新たな毛包形成調節因子である可能性が高い。それゆえ、本発明に係るタンパク質に含まれる上記（ｂ）のタンパク質とは、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／又は付加されたアミノ酸配列からなる毛包形成調節因子（タンパク質）であればよい。
【００３１】
ここで、上記（ｂ）のタンパク質における「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」とは、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３２】
上記変異を持つタンパク質には、野生型の活性、すなわち毛包形成調節因子の機能等に異常を持つ変異タンパク質（機能欠失型の変異タンパク質と称する）が含まれてもよい。このような機能欠失型の変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、上記機能欠失型の変異タンパク質をコードする遺伝子が含まれても良い。このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
【００３３】
本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡ（hemagglutinin）やFLAG等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。またN-glycosylationなどの各種修飾を受けていてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。
【００３４】
次に、本発明に係る上記３種類の遺伝子及びタンパク質について個別に説明する。
【００３５】
＜QBRICK遺伝子及びタンパク質＞
上記QBRICKタンパク質は、図１（ａ）・（ｂ）に示すように、Ｎ末端に２９アミノ酸残基からなる分泌シグナル配列（図中Ｓ）を持ち、膜貫通ドメインは存在しないことがその一次構造から推定されるため、細胞外分泌タンパク質であると予測される。
【００３６】
また、上記QBRICKタンパク質は、図１（ａ）・（ｃ）に示すように、N末端側に、２つの繰り返し配列と推定される配列（N-terminal repeat(2)）を有している。図１（ｃ）では、FirstがN末端側からの最初の繰り返し配列を示し、Secondが二番目の繰り返し配列を示し、図中下線のアミノ酸残基は同一の残基であるか、またはその化学的性質が類似したアミノ酸残基であることを示す。そして、二番目の繰り返し配列には、図中二重下線で示すように、細胞外マトリックスタンパク質の多くが共有する細胞接着シグナルの一つとして知られているＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列が含まれている。
【００３７】
さらに、図１（ａ）及び図２に示すように、上記QBRICKタンパク質は、１２のタンデム繰り返し配列を有している。図２では、First, Second, Third・・・の順でそれぞれ１２の繰り返し配列のN末端側からの順序を示し、図中下線のアミノ酸残基は同一の残基であるか、またはその化学的性質が類似したアミノ酸残基であることを示す。
【００３８】
また、図１（ａ）及び図３（ａ）に示すように、上記QBRICKタンパク質は、上記１２のタンデム繰り返し配列に続いて、Calx-βドメインを有している。
【００３９】
さらに、図１（ａ）及び図３（ｃ）に示すように、QBRICKタンパク質はＣ末端にタイプＣ−レクチン様ドメインを有している。なお、図１（ａ）におけるCalx-βドメインとタイプＣ−レクチン様ドメインとの間の配列を図３（ｂ）に示す。
【００４０】
上記QBRICKタンパク質と相同性を有するタンパク質としては、図８〜図１５及び図１６に示すように、ＥＣＭ３タンパク質とＮＧ２タンパク質が存在する。
【００４１】
図８〜図１５では、MmQBRICKがマウスのQBRICKタンパク質を、LvECM3がウニのＥＣＭ３タンパク質を、HsECM3がヒトのＥＣＭ３タンパク質を、RnNG2がラットのＮＧ２タンパク質を示す。図８〜図１５から明らかなように、ＥＣＭ３タンパク質及びＮＧ２タンパク質の何れもQBRICKタンパク質と相同性を示す領域を含んでいる。
【００４２】
上記ＥＣＭ３タンパク質については、ウニにおいて、中胚葉細胞の移動に関与することが知られている。また、ＮＧ２タンパク質については、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）による刺激を、ＰＤＧＦ受容体とともに働いて受容することが知られており、また、オリゴデンドロサイト前駆細胞の細胞表面マーカーとして利用されている。
【００４３】
また、図１６に示すように、本発明に係るQBRICKタンパク質、ＥＣＭ３タンパク質及びＮＧ２タンパク質は、何れも１０以上の繰り返し配列（図中repeat domain）を有している。具体的にはQBRICKタンパク質は上述したように１２の繰り返し配列を有しており、ＥＣＭ３タンパク質も１２の繰り返し配列を有しており、ＮＧ２タンパク質は１５の繰り返し配列を有している。
【００４４】
また本発明に係るQBRICKタンパク質は、ＥＣＭ３タンパク質と同様に、Calx-βドメインを繰り返し配列のＣ末端側に有している。
【００４５】
これに対して、ＥＣＭ３タンパク質及びＮＧ２タンパク質は、何れもＣ末端側に膜貫通ドメイン（図中transmembrane domain）を有しているが、本発明に係るQBRICKタンパク質は、上述したように膜貫通ドメインを有しておらず、上記タイプC−レクチン様ドメイン（図中C-lectin like domain）を有している。また、ＮＧ２タンパク質はＮ末端側に２つのラミニンＧドメインを有しているが、本発明に係るQBRICKタンパク質は、ラミニンＧドメインを有していない。
【００４６】
＜QBRICK-S遺伝子及びタンパク質＞
QBRICK-S遺伝子は本発明に係る第２の新規ｃＤＮＡとして見出されたものであり、図４（ａ）・（ｂ）に示すように、QBRICK-Sタンパク質は、QBRICKタンパク質と同様、N末端の２９アミノ酸残基からなる分泌シグナル配列（図中Ｓ）、及び、図４（ａ）・（ｃ）に示すように、ＲＧＤ配列を含む、２つの繰り返し配列と推定される配列（N-terminal repeat(2)）を有している。
【００４７】
しかしながら、図１６にも示すように、QBRICK-Sタンパク質は、１２のタンデム繰り返し配列、Calx-βドメイン、及びタイプＣ−レクチン様ドメインを完全に欠損していることから、QBRICKタンパク質の選択的スプライシングアイソフォームをコードしていると考えられる。なお、図４（ａ）におけるN-terminal repeat(2)に続く配列を図４（ｄ）に示す。
【００４８】
＜ヒトQBRICK遺伝子及びタンパク質＞
ヒトQBRICK遺伝子は、その塩基配列が上記マウスQBRICK遺伝子と高い相同性を有しており、同じく、ヒトQBRICKタンパク質は、図８〜図１５に示すように、マウスQBRICKタンパク質と高い相同性を有している。図５（ａ）〜（ｃ）、図６、及び図７（ａ）〜（ｃ）に示すように、ヒトQBRICKタンパク質は、マウスQBRICKタンパク質と同様、分泌シグナル配列、２つの繰り返し配列と推定される配列、ＲＧＤ配列、１２のタンデム繰り返し配列、Calx-βドメイン、及びタイプＣ−レクチン様ドメインを有している。加えて、図７（ｂ）に下線で示すように、ヒトQBRICKタンパク質は、Calx-βドメインとタイプＣ−レクチン様ドメインの間に、第２のＲＧＤ配列を有している。
【００４９】
また、図１６に示すように、本発明に係るヒトQBRICKタンパク質は、QBRICKタンパク質と同様に、１２の繰り返し配列を有しており、ＥＣＭ３タンパク質やＮＧ２タンパク質と類似する構造を有している。
【００５０】
（２）本研究に係る新規細胞外マトリックスタンパク質の機能
本発明に係るQBRICKタンパク質は、分泌シグナル配列を有しており、何れも細胞外分泌型のタンパク質（分泌タンパク質）であることが予測される。しかも、本発明に係るQBRICK遺伝子は、ホールマウントin situハイブリダイゼーションの結果から、胎齢１２日のマウス胎仔において、頬髭の毛包プラコードに特異的に発現が見られること（後述の実施例２及び図１７参照）、さらにＲＴ−ＰＣＲによる解析の結果から、QBRICK ｍＲＮＡの発現が皮膚で見られること（後述の実施例５及び図１８参照）から本発明に係るQBRICK遺伝子及びQBRICKタンパク質が、毛包形成に大きく関与していることが示唆される。また、細胞接着アッセイの結果から、QBRICKタンパク質が細胞接着活性を有すること（後述の実施例７及び図２０参照）、及び細胞伸展アッセイの結果から、QBRICKタンパク質が細胞伸展活性を有すること（後述の実施例６及び図１９参照）から、QBRICK遺伝子及びQBRICKタンパク質が、毛包形成に関与した細胞内シグナル伝達に機能している可能性が考えられる。
【００５１】
さらに、上記ヒトQBRICKタンパク質は、マウスQBRICKタンパク質と高い相同性を有しているため、上記QBRICKタンパク質と同様の機能を有すると考えられる。
【００５２】
また、QBRICK-S遺伝子は、前述したように、QBRICKタンパク質の選択的スプライシングフォームをコードしていると考えられるため、QBRICK-S遺伝子及びQBRICK-Sタンパク質は、上記QBRICK遺伝子及びQBRICKタンパク質と一部共通の機能を有していることが予測される。
【００５３】
（３）本発明に係るタンパク質、及びその遺伝子の利用法
上記のように、本発明に係るタンパク質は、本発明者によって初めて明らかにされた新規な細胞外マトリックスタンパク質であり、毛包プラコードに特異的に発現する細胞外マトリックスタンパク質であると予測される。したがって、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は以下の有用性を有する。
【００５４】
まず、毛包形成に大きく関与していると推定されることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、毛包形成に異常をきたす疾患の診断、治療へ応用することが可能であるとともに、毛包形成の異常により引き起こされる疾患等の診断、治療への応用、並びに治療薬探索の標的タンパク質として利用が可能である。
【００５５】
また、細胞外マトリックスは、細胞の増殖、分化、移動など細胞の諸活動に大きな影響を与え、その結果、発生、加齢、疾患などに重要な働きを持つことが明らかになっている。
【００５６】
それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、及びその抗体等は、受精、胚発生、形態形成、さらには細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾病を研究する上で大変有用な道具となり得る。また、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断薬や、その治療効果を検査するための検査薬として有効に用いることが出来る。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質などは、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に応用可能である。
【００５７】
また、前述したように、細胞外マトリックスの多くは細胞接着、伸展活性を持ち、組織での細胞の接着を支持することにより細胞の形態を規定する物理的作用のほかに、細胞表面レセプターを介して細胞に生存、増殖、分化等細胞の生命活動を支配する細胞内シグナルを伝達する。個々の細胞外マトリックス因子は異なる細胞内シグナルを伝達し、これによって細胞、及びその集合体である組織の形成、機能を緻密に制御している。本発明に係るタンパク質は、新たな細胞機能制御因子として、これら制御に関わっていることが十分予測される。
【００５８】
従って、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、例えば生体内において罹患時や術後の組織修復の促進もしくはその制御にも有用であると考えられる。
以下では、本発明に係る遺伝子、タンパク質等の具体的な利用法について説明する。
【００５９】
本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、各種ホスト細胞中に導入して、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質又はその変異タンパク質を発現させることが出来る。導入された本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、ホスト細胞中でベクターとして存在してもいいし、ホスト細胞のゲノムＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、ホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定のホスト細胞のゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加してホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００６０】
上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけではなくターミネーター配列を含めても良い。
【００６１】
また、上記遺伝子又は変異遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いても良い。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターとともにホスト細胞へ導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することが出来る。あるいは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質のＧＦＰ融合タンパク質を発現させても良い。
【００６２】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることが出来る。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）や分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞、各種哺乳動物の培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００６３】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００６４】
前述したように、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、研究用の各種試薬だけでなく、細胞外マトリックスの関与する病気の診断や治療、治療効果の検査等に用いられる各種薬剤に応用することが可能となる。
【００６５】
本発明に係る遺伝子やタンパク質等の薬剤化については、従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば研究用試薬の場合、本発明に係る遺伝子を形質転換キット化したり、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質を異種発現系で大量生産し精製したりすればよい。
【００６６】
同様に、本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、本発明に係るQBRICKタンパク質及びQBRICK-Sタンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることが出来る。
【００６７】
また、本発明に係る遺伝子又はタンパク質は、毛包形成調節因子と推定されることから、毛包形成促進剤として利用できる可能性がある。このような毛包形成促進剤として利用する場合、その具体的な組成は、本発明に係る遺伝子またはタンパク質が含まれていれば特に限定されるものではない。具体的には、使用対象の動物個体の種類に応じて、毛包形成の促進のために、本発明に係る遺伝子またはタンパク質の機能が発揮出来るような緩衝液等が含まれていればよい。
【００６８】
また、本研究に係る遺伝子の一部配列をプローブやプライマーとして用いることが出来る。上記一部配列とは、上記QBRICK遺伝子及びQBRICK-S遺伝子に含まれる特徴的・特異的な配列であればよい。このようにプローブとして用いる場合としては、例えば、本発明に係る遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査、診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００６９】
（４）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係る上記QBRICK遺伝子、QBRICK-S遺伝子、及びヒトQBRICK遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記QBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、又はヒトQBRICKタンパク質をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを作製し、ヒトやマウスなどのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記QBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、又はヒトQBRICKタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００７０】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作製及びその塩基配列の決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むDNA断片を取得したか容易に確認することができる。
【００７１】
また、上記プローブの配列を、上記QBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、又はヒトQBRICKタンパク質をコードするｃＤＮＡの機能上重要と考えられる領域（例えば、分泌シグナル配列、ＲＧＤ配列、１２の繰り返し配列、Calx-βドメイン、タイプＣ−レクチン様ドメイン等）の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、QBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、又はヒトQBRICKタンパク質と同等の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００７２】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記QBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、又はヒトQBRICKタンパク質のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト・マウスなどのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含む断片を大量に取得できる。
【００７３】
本発明に係るタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記QBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、又はヒトQBRICKタンパク質、あるいはその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を導入した組み換え発現ベクター作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞等に組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記QBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、又はヒトQBRICKタンパク質等の本発明に係るタンパク質を容易に取得する事が出来る。
【００７４】
上記QBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、又はヒトQBRICKタンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275(1995)他）、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの公知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することが出来る。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００７５】
【実施例】
以下の実施例では、本発明に係るQBRICK遺伝子、及びQBRICK-S遺伝子をマウスから取得した具体的な方法、並びにヒトQBRICK遺伝子をヒトから取得した具体的な方法、及び本発明に係るQBRICK遺伝子の発現を調べた結果、さらにはQBRICKタンパク質の生理活性を調べた結果について、順番に説明する。
【００７６】
〔実施例１〕：QBRICK ｃＤＮＡのクローニング
胎齢１２日（Ｅ１２）のマウス胎仔頬上皮由来ｃＤＮＡより、ＲＤＡ法を用いて頬上皮に特異的に発現していると考えられるｃＤＮＡの断片を得た。さらに、これらのｃＤＮＡ断片の配列情報を利用して、胎齢１２日マウス胎仔頬上皮由来ＲＮＡより、ＰＣＲ法、５’ＲＡＣＥ法、及び３’ＲＡＣＥ法を用いて全長ｃＤＮＡを合成し、その塩基配列を決定した。
【００７７】
その結果、配列番号１に示すように、全長が９３２８塩基で、２１７２のアミノ酸よりなるタンパク質をコードしていると推定されるQBRICK遺伝子が得られた。
【００７８】
また、アミノ酸配列の解析から、図１〜図３に示すように、Ｎ末端に２９アミノ酸よりなる分泌シグナル配列を有するが、膜貫通ドメインが無いことから、分泌タンパク質であると推定されること、分子内に１２のタンデム繰り返し配列があること、ＲＧＤ配列が含まれること、Calx-βドメインを有すること、タイプC−レクチン様ドメインを有すること、図８〜図１５に示すように、ウニの細胞外マトリックスタンパク質の１種であるＥＣＭ３タンパク質やラットのプロテオグリカンの1種であるＮＧ２タンパク質に対し高い相同性を示すことが明らかとなった。
【００７９】
〔実施例２〕：QBRICK-S ｃＤＮＡのクローニング
胎齢１３日（Ｅ１３）の胎仔より、常法により全ＲＮＡを抽出した。それぞれの全ＲＮＡ１５０ｎｇをoligo dT primer（Invitrogen社製）及びSuperscript II （Invitrogen社製）を用いて、Superscript II添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、配列番号７に示すフォワードプライマーと、配列番号８に示すリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行った。
【００８０】
GCAGATCTCCACCATGCACTCTCCAGGCTGCAC (配列番号７)
ATCAGTTTCCTTGAGCACACAAA (配列番号８)
具体的には、全ＲＮＡ１５０ｎｇより得られたｃＤＮＡに対して、硫酸マグネシウム１ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ＫＯＤ -Plus-（東洋紡社製）２Ｕ、フォワードプライマー０．５μＭ、リバースプライマー０．５μＭ、ＰＣＲ buffer for ＫＯＤ -Plus-（東洋紡社製）を加えてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃にて２分反応させた後、９４℃にて１５秒、５５℃にて３０秒、６８℃にて７分を１サイクルとして５サイクル行い、その後さらに、９４℃にて１５秒、６０℃にて３０秒、６８℃にて７分を１サイクルとして２６サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をpGEM-T Easyクローニングベクターに組み込んだ。このＰＣＲ産物を含むクローニングベクターを精製し、その塩基配列を常法により決定した。
【００８１】
その結果、３１６アミノ酸よりなるQBRICK-Sタンパク質をコードする、全長６５６４塩基よりなるQBRICK-S遺伝子が得られた。QBRICK-S遺伝子は、QBRICK遺伝子の５２７番目から７０４１番目の塩基に相当するが、QBRICK遺伝子の１３７３番目から１３７６番目の塩基に相当する４塩基が欠失していること、またQBRICK遺伝子の４９６６番目と４９６７番目の塩基の間に相当する部位に、５３塩基が挿入されていることから、QBRICKタンパク質の選択的スプライシングアイソフォームをコードしていると考えられる。
【００８２】
〔実施例３〕：ヒトQBRICK ｃＤＮＡの塩基配列の決定
マウスQBRICK遺伝子の塩基配列を用いてＮＣＢＩホームページのBLASTnを用いて相同性検索を行った。その結果、ｇｉ番号で示す、以下の塩基配列を得た。
【００８３】
20539842 全長４９３５塩基
21410277 全長２４３９塩基
マウスQBRICK遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列に基づき、20539842の１〜４７９０塩基までに続いて、21410277の４４９〜２４３９塩基までを結合し、新たに６７８１塩基からなる塩基配列を得た。この塩基配列を用いてBLASTnでヒトＥＳＴに対して相同性検索を行い、相同なヒトＥＳＴを得た。得られたヒトＥＳＴと前述の塩基配列を比較したところ、６５６０番目の塩基「ｇ（グアニン）」については、以下に示す１７のヒトＥＳＴ（ｇｉ番号で示す）
5855633，6570054，4664863，1424166，4283047，
5234111，5592769，4186708，5444708，13729865，
5874723，5367873，4174947，3539030，734654，
2106943，6700680，5877489，3871704，20999982，
13748543，1281309
においてはそこに相当する塩基はいずれも「ｔ（チミン）」であるため、６５６０番目の塩基は「ｔ」に修正した。この方法で得られた塩基配列のうち、1〜６７５３塩基までがヒトQBRICK遺伝子の１〜６７５３塩基に相当する。
【００８４】
また、ヒトQBRICK遺伝子における６７５４〜６８１８塩基については、以下に示す１５のヒトＥＳＴ（同じくｇｉ番号で示す）
5855633，6570054，4664863，5234111，5592769，
4186708，5444708，5874723，5367873，4174947，
3539030，2106943，6700680，5877489，3871704
の間で完全に一致する、６５塩基からなる塩基配列を用いた。
【００８５】
その結果、最終的に、配列番号５に示すように、全長が６８１８塩基で、２１９２のアミノ酸よりなるタンパク質をコードしていると推定される新規ヒトQBRICK遺伝子が得られた。
【００８６】
〔実施例４〕：ホールマウントin situハイブリダイゼーションによる各組織での遺伝子発現解析
得られたQBRICK遺伝子における塩基配列９７４〜１４７６番目、２６５３〜３２０６番目、４６２７〜５１２６番目、５９２７〜６４２６番目、及び６７９７〜７３２６番目の配列をもとに、アンチセンスプローブ及びセンスプローブをジゴキシゲニンラベリングキット（Roche社製）を用いて作製した。これら５つのプローブを混合したもので、胎齢１２日（Ｅ１２）のマウス胎仔を用いて、常法により、ホールマウントin situハイブリダイゼーションを行った。発現解析はジゴキシゲニン同定キット（Roche社製）を用いて行った。その結果、図１７に示すように、頬髭毛包のプラコード特異的に遺伝子発現が認められた。
【００８７】
〔実施例５〕：ＲＴ−ＰＣＲによる組織での遺伝子発現解析
各胎齢の胎仔及び成体のマウスからそれぞれの器官或いは胎仔を取り出し、常法によりそれぞれ全ＲＮＡを抽出した。それぞれの全ＲＮＡ１５０ｎｇをrandom primer（Invitrogen社製）及びSuperscript II（Invitrogen社製）を用いて、Superscript II添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、配列番号９に示すフォワードプライマーと、配列番号１０に示すリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行った。
【００８８】
TCTGATGTGGACACCCCGCTAGA (配列番号９)
CGCTGTCTGCATCAGTAGCGGAAA (配列番号１０)
具体的には、全ＲＮＡ１５０ｎｇより得られたｃＤＮＡに対して、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ExTaq DNAポリメラーゼ（TaKaRa ExTaq、宝酒造社製）２Ｕ、フォワードプライマー０．５μＭ、リバースプライマー０．５μＭ、ExTaqバッファー（宝酒造社製）を加えてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応条件は、９６℃にて２分反応させた後、９６℃にて３０秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて１分を１サイクルとして３２サイクル行った。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲルを用いて電気泳動し、ＤＮＡを染色することにより確認した。
【００８９】
その結果、図１８に示すように、本発明に係るQBRICK ｍＲＮＡは、胎仔期（胎齢１０日〜１８日の胎仔）では恒常的に発現しており、成体の組織では、眼、卵巣、腎臓などで強い発現が認められた。なお、図１８の電気泳動図における“skin（皮膚）”では、QBRICK ｍＲＮＡのバンドが見え難くなっているが、実際には発現している。
【００９０】
〔実施例６〕：QBRICKタンパク質の細胞伸展活性のアッセイ
QBRICKタンパク質のＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−Ｎ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼにQBRICKタンパク質のアミノ酸残基２３〜２８０を含む断片を融合させたタンパク質）、及びＧＳＴ−ＮにおいてQBRICKタンパク質の２０７番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸残基をグルタミン酸に置換した変異体ＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅを大腸菌に発現させ精製した。
【００９１】
９６穴のマイクロタイタープレートを１ウェル当たり１０μｇ／ｍｌ，５０μｌのＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｎ或いはＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅを用いて４℃にて一晩インキュベートし、プレートをコーティングした。コーティングしたウェルをＰＢＳで二度洗浄した後、５０μｌの１％牛血清アルブミンを用いて室温で３０分間ブロッキングした。
【００９２】
牛血清アルブミン溶液を除去後、ＤＭＥ培地、或いは１ｍｇ／ｍｌのＧＲＧＤＳＰ又はＧＲＧＥＳＰペプチドを添加したＤＭＥ培地に対し、２×１０⁵／ｍｌの濃度となるように懸濁したHeLa細胞を１００μｌ添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、伸展した細胞の割合を測定した。
【００９３】
その結果、図１９に示すように、ＧＳＴと比較した場合、ＧＳＴ−Ｎでは顕著な細胞伸展が認められた。この細胞伸展は、ＧＲＧＤＳＰペプチドの添加によって阻害されたが、ＧＲＧＥＳＰペプチドでは阻害されなかった。一方、ＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅでは顕著な細胞伸展は認められなかった。以上の結果から、QBRICKタンパク質は、そのＲＧＤ配列に依存した細胞伸展活性を有することが明らかとなった。
【００９４】
〔実施例７〕：QBRICKタンパク質の細胞接着活性のアッセイ
ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＮおよびＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅを大腸菌に発現させ精製した。９６穴のマイクロタイタープレートを1ウェル当たり０，１，２，５，１０，２０μｇ／ｍｌ，５０μｌの精製ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＮあるいはＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅで４℃、一晩インキュベートし、プレートをコーティングした。コーティングしたウェルをＰＢＳで二度洗浄した後、５０μｌの１％牛血清アルブミンを用いて室温で３０分ブロッキングした。
【００９５】
牛血清アルブミン溶液を除去後、０．１％牛血清アルブミンを含むＤＭＥ培地に対し２×１０⁵／ｍｌに懸濁したHeLa細胞を１００μｌ添加した。３７℃で１時間インキュベート後、ＤＭＥ培地でウェルを洗浄し、接着した細胞数を測定した。
【００９６】
その結果、図２０に示すように、ＧＳＴと比較した場合、ＧＳＴ−Ｎでは、コーティング濃度に依存した顕著な細胞接着が認められた。一方、ＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅでは顕著な細胞接着は認められなかった。以上の結果から、QBRICKタンパク質は、そのＲＧＤ配列に依存した細胞接着活性を有することが明らかとなった。
【００９７】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、毛包形成に大きく関与していることが示唆されるため、毛包形成の異常をきたす疾患の診断、治療へ応用することが可能であるとともに、毛包形成の異常により引き起こされる疾患等の診断、治療への応用、並びに治療薬探索の標的タンパク質として利用が可能であるという効果を奏する。
【００９８】
また、本発明に係るタンパク質は細胞外マトリックスタンパク質であると推定されるため、細胞外マトリックスの機能解析等の研究に利用できるばかりでなく、細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常に起因する疾患、疾病の診断薬、治療薬、治療効果を検査するための検査薬の開発等に有効利用できるという効果を奏する。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に利用できるという効果を奏する。
【００９９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は、本発明にかかるQBRICKタンパク質の一次構造の概略を示す模式図であり、（ｂ）は、（ａ）に示すQBRICKタンパク質のシグナル配列を示すアミノ酸配列図であり、（ｃ）は、（ａ）に示すQBRICKタンパク質におけるＮ末端側の２つの繰り返し配列と推定される配列を示すアミノ酸配列図である。
【図２】図１（ａ）に示すQBRICKタンパク質における１２のタンデム繰り返し配列を示すアミノ酸配列図である。
【図３】（ａ）は、図１（ａ）に示すQBRICKタンパク質におけるＣ末端側のCalx-βドメインを示すアミノ酸配列図であり、（ｂ）は、図１（ａ）に示すQBRICKタンパク質におけるCalx-βドメインとタイプＣ−レクチン様ドメインとの間の配列を示すアミノ酸配列図であり、（ｃ）は、図１（ａ）に示すQBRICKタンパク質におけるＣ末端側のタイプＣ−レクチン様ドメインを示すアミノ酸配列図である。
【図４】（ａ）は、本発明にかかるQBRICK-Sタンパク質の一次構造の概略を示す模式図であり、（ｂ）は、（ａ）に示すQBRICK-Sタンパク質のシグナル配列を示すアミノ酸配列図であり、（ｃ）は、（ａ）に示すQBRICK-Sタンパク質における２つの繰り返し配列と推定される配列を示すアミノ酸配列図である。
【図５】（ａ）は、本発明にかかるヒトQBRICKタンパク質の一次構造の概略を示す模式図であり、（ｂ）は、（ａ）に示すヒトQBRICKタンパク質のシグナル配列を示すアミノ酸配列図であり、（ｃ）は、（ａ）に示すヒトQBRICKタンパク質におけるＮ末端側の２つの繰り返し配列と推定される配列を示すアミノ酸配列図である。
【図６】図１（ａ）に示すヒトQBRICKタンパク質における１２のタンデム繰り返し配列を示すアミノ酸配列図である。
【図７】（ａ）は、図５（ａ）に示すヒトQBRICKタンパク質におけるＣ末端側のCalx-βドメインを示すアミノ酸配列図であり、（ｂ）は、図５（ａ）に示すヒトQBRICKタンパク質におけるCalx-βドメインとタイプＣ−レクチン様ドメインとの間の配列を示すアミノ酸配列図であり、（ｃ）は、図５（ａ）に示すヒトQBRICKタンパク質におけるＣ末端側のタイプＣ−レクチン様ドメインを示すアミノ酸配列図である。
【図８】本発明に係るQBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、およびヒトQBRICKタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図９】本発明に係るQBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、およびヒトQBRICKタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図８の続きを示す。
【図１０】本発明に係るQBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、およびヒトQBRICKタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図９の続きを示す。
【図１１】本発明に係るQBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、およびヒトQBRICKタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図１０の続きを示す。
【図１２】本発明に係るQBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、およびヒトQBRICKタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図１１の続きを示す。
【図１３】本発明に係るQBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、およびヒトQBRICKタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図１２の続きを示す。
【図１４】本発明に係るQBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、およびヒトQBRICKタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図１３の続きを示す。
【図１５】本発明に係るQBRICKタンパク質、QBRICK-Sタンパク質、およびヒトQBRICKタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのアミノ酸配列の比較を示す図であり、図１４の続きを示す。
【図１６】本発明に係るQBRICK遺伝子が、胎齢１２日の胎仔マウスの組織で発現する状態を示す図である。
【図１７】本発明に係るｎＰＧタンパク質、ｎＰＧ−Ｓタンパク質、およびヒトｎＰＧタンパク質と、ＥＣＭ３タンパク質、およびＮＧ２タンパク質とのドメイン構造を比較する模式図である。
【図１８】本発明に係るQBRICK ｍＲＮＡにおける、胎仔および成体マウスの組織での発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す電気泳動図である。
【図１９】本発明に係るQBRICKタンパク質のＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−ＮおよびＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅを用いて、細胞伸展活性を検討した結果を示す図である。
【図２０】本発明に係るQBRICKタンパク質のＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−ＮおよびＧＳＴ−Ｎ−Ｄ２０７Ｅを用いて、細胞接着活性を検討した結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel extracellular matrix protein expressed in hair follicle placode, and a gene thereof.
[0002]
[Prior art]
The hair follicle is a tissue that surrounds the hair root in a sheath shape, protects the hair root, and provides a path for hair elongation. The interaction between epithelial-mesenchymal cells (stroma) plays an important role in the development of hair follicles, as in many other organs.
[0003]
For example, in the case of a mouse cheek fistula, a placode (hair follicle epithelial primordium) is formed in the epithelium at day 12 of gestation in the course of the above-mentioned interaction between the epithelium and stroma. Placode during hair follicle formation acts on stromal cells and promotes the induction of mesenchyme into the stroma immediately below the placode. A hair follicle is formed by the interaction between the epithelium and stroma. Therefore, it is considered that the factor specifically expressed in placode plays an important role in hair follicle formation.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Several factors that are specifically expressed in the placode and are thought to be involved in hair follicle formation have already been identified, and the molecular mechanism of hair follicle formation has been elucidated using these factors. However, at present, it has not yet been possible to artificially create hair follicles. This suggests that an unknown factor exists in the molecular mechanism of hair follicle formation, and the identification of this unknown factor is important for elucidation of the molecular mechanism and artificial production of hair follicles. it is conceivable that.
[0005]
The present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a novel factor that regulates the formation of hair follicles, a gene thereof, and an antibody thereof.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventor has extracted RNA from tissues containing placodes during the formation of mouse hair follicles and selected cDNAs specifically expressed in hair follicle placodes. The protein was expressed and its function was analyzed. As a result, it has been found that the obtained protein is a novel extracellular matrix protein having cell adhesion and spreading activity, and is presumed to be a novel factor that regulates the formation of hair follicles. Using the cDNA base sequence, the base sequence of cDNA homologous in humans was determined, and the present invention was completed.
[0007]
That is, the protein according to the present invention is the following protein (a) or (b), and the gene according to the present invention is a gene encoding the following protein (a) or (b).
[0008]
(A) A protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4.
[0009]
(B) An extracellular matrix protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4.
[0010]
The other protein according to the present invention is the following protein (c) or (d), and the other gene according to the present invention is a gene encoding the following protein (c) or (d). is there.
[0011]
(C) A protein consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 6.
[0012]
(D) An extracellular matrix protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
[0013]
The protein (a) above has been newly isolated and identified by the present inventors as a novel extracellular matrix protein that is newly expressed from mice in hair follicle placodes. The protein according to the present invention has a predicted secretory signal sequence on the N-terminal side, but has no transmembrane domain, and is presumed to be a secreted protein.
[0014]
The protein (c) has been identified by the present inventors as a human homologous protein corresponding to the mouse QBRICK protein and has homology with the mouse QBRICK protein, as will be described later. .
[0015]
The recombinant expression vector according to the present invention comprises a gene encoding the protein (a), (b), (c) or (d). For example, a recombinant expression vector into which the gene shown in SEQ ID NO: 1 has been inserted can be mentioned. For the production of a recombinant expression vector, a plasmid, phage, cosmid or the like can be used, but it is not particularly limited.
[0016]
The transformant according to the present invention is a transformant into which a gene encoding the protein (a), (b), (c) or (d) is introduced. Here, “gene introduced” means that the gene has been introduced into a target cell (host cell) so as to be expressed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique). The “transformant” means not only cells / tissues and organs but also animals (transformed animals such as mice, rats, rabbits, pigs, monkeys). In particular, mice and rats are widely used as experimental animals and pathological model animals. Knockout mice, etc. are used for functional analysis of extracellular matrix factors, pathological analysis of diseases related to the same factors, and diagnostic methods for the diseases. It is useful for the development of diagnostics and therapeutic methods.
[0017]
The antibody according to the present invention is an antibody obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using the protein (a), (b), (c) or (d) or a partial peptide thereof as an antigen.
[0018]
As will be described later, the gene according to the present invention is specifically expressed in the hair follicle placode in 12 days old mice, and the protein according to the present invention has cell adhesion and spreading activities as its physiological activity. Therefore, there is a high possibility that it is a new regulator of hair follicle formation. Therefore, the gene, protein, antibody and the like according to the present invention can be applied to the development of a hair follicle formation promoter.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
An embodiment of the present invention will be described as follows. Note that the present invention is not limited to this.
[0020]
The present invention finds a novel extracellular matrix expressed in a hair follicle placode and a gene encoding the same, analyzes the functions of these genes and proteins, and proposes a method for using them. Therefore, in the following, the gene and protein sequences and structures of the present invention will be described, and then the functions and usage methods of these genes and proteins will be described.
[0021]
(1) Sequence and structure of gene and protein according to the present invention
The present inventor specifically expressed in the buccal epithelium from the cDNA derived from the fetal buccal epithelium of day 12 using the RDA method (Lisitsyn, Lysitsyn, Wigler, Science 259, 946-951 (1993), etc.). A cDNA fragment thought to be present was obtained. Using the sequence information, two full-length cDNA sequences were determined from RNA derived from fetal bovine day 12 mouse fetus using PCR method, 5'RACE method, and 3'RACE method, and these two types of cDNA were encoded. The amino acid sequence of each protein was determined.
[0022]
As a result of structural analysis of these novel proteins, the first novel cDNA is referred to as “QBRICK gene”, and the protein encoded by the gene is referred to as “QBRICK protein”. The second novel cDNA is considered to be an alternative splicing isoform of the above QBRICK gene. This second cDNA is referred to as “QBRICK-S gene”, and the protein encoded by the gene is referred to as “QBRICK-S protein”. Will be described.
[0023]
Further, the present inventors compare a nucleic acid sequence having homology with the above QBRICK gene with a human genome sequence, determine the cDNA sequence encoding the human QBRICK protein, and further determine the amino acid sequence of the protein encoded by this cDNA. Were determined. Therefore, in the following description, a novel human-derived cDNA sequence is referred to as “human QBRICK gene”, and a protein encoded by the gene is referred to as “human QBRICK protein”.
[0024]
In the following description, unless otherwise specified, the QBRICK gene or the QBRICK protein refers to the first novel cDNA derived from the mouse or the protein encoded by the mouse, respectively. This is referred to as “gene” or “human QBRICK protein”.
[0025]
As described above, the gene according to the present invention is (a) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, or (b) 1 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, Or any other gene that encodes a protein consisting of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted, and / or added, but in this embodiment, (1) the base represented by SEQ ID NO: 1 Among the sequences, cDNA (QBRICK gene) having the 527 to 7045th nucleotide sequence as an open reading frame, (2) Among the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3, the 1st to 951th nucleotide sequences are included as an open reading frame. cDNA (QBRICK-S gene), (3) mRNA having a base sequence corresponding to the base sequence of these cDNAs is exemplified . These genes are derived from mice (Mus musculus).
[0026]
In addition, as described above, the other gene according to the present invention is either (c) a gene encoding a protein consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 6, or (d) 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. Any gene may be used as long as it encodes an extracellular matrix protein consisting of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, but in this embodiment, it is represented by (4) SEQ ID NO: 5. Among the base sequences, cDNA (human QBRICK gene) having the 1st to 6579th base sequence as an open reading frame, and (5) mRNA having a base sequence corresponding to the base sequence of this cDNA are exemplified. These genes are derived from humans.
[0027]
The “gene” of the present invention includes RNA and DNA. RNA includes mRNA, and DNA includes, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning, chemical synthesis techniques, or a combination thereof. The DNA may be double-stranded or single-stranded, and the single-stranded DNA may be a coding DNA serving as a sense strand or an anti-coding strand serving as an antisense strand (the antisense strand may be used as a probe or an antisense drug). Available as). Furthermore, the “gene” of the present invention includes, in addition to the sequence encoding the protein (a) or (b) or (c) or (d), a sequence of an untranslated region (UTR) or a vector sequence (expression vector sequence). And the like.
[0028]
On the other hand, the protein according to the present invention may be the protein of (a) or (b) above, but in the present embodiment, it has the amino acid sequence represented by (1) SEQ ID NO: 2, Examples include QBRICK protein consisting of amino acid residues, and QBRICK-S protein consisting of 316 amino acid residues having the amino acid sequence shown in (2) SEQ ID NO: 4.
[0029]
In addition, the other protein according to the present invention may be the protein of (c) or (d), but in the present embodiment, the protein has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and 2192 amino acids. A human QBRICK protein consisting of residues is exemplified.
[0030]
The QBRICK protein is highly likely to be a new hair follicle formation regulator, as will be described in the examples described later. Therefore, the protein of (b) contained in the protein according to the present invention is a substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4. Any hair follicle formation regulator (protein) having the amino acid sequence thus prepared may be used.
[0031]
Here, “one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added” in the protein of (b) above is replaced by a known mutant protein production method such as site-directed mutagenesis. , Deletions, insertions, and / or additions (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and even more preferably 5 or less) of amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added. Means that. Thus, in other words, the protein of (b) is a mutant protein of the protein of (a), and the “mutation” referred to here was artificially introduced mainly by a known mutant protein production method. Although it means a mutation, it may be a product obtained by isolating and purifying a similar naturally occurring mutant protein.
[0032]
The protein having the mutation may include a mutant protein having an abnormality in wild-type activity, that is, the function of a hair follicle formation regulator (referred to as a loss-of-function mutant protein). Such a loss-of-function mutant protein is useful in functional analysis of proteins, for example, by comparing the structure with a wild-type protein, a region essential for activity in the structure becomes clear. In addition, the gene according to the present invention may include a gene encoding the above-mentioned mutant protein with a loss of function. Such a gene is useful, for example, for creating a new transformant.
[0033]
The protein according to the present invention may contain a known additional sequence such as HA (hemagglutinin) or FLAG at the end or may be a fusion protein in order to easily purify and detect the protein. Further, it may be subjected to various modifications such as N-glycosylation, and may form a dimer or higher multimer.
[0034]
Next, the three types of genes and proteins according to the present invention will be described individually.
[0035]
<QBRICK gene and protein>
As shown in FIGS. 1 (a) and 1 (b), the QBRICK protein has a secretory signal sequence consisting of 29 amino acid residues at the N-terminus (S in the figure) and has no transmembrane domain as its primary structure. Therefore, it is predicted to be an extracellular secreted protein.
[0036]
The QBRICK protein has a sequence (N-terminal repeat (2)) presumed to be two repeat sequences on the N-terminal side, as shown in FIGS. 1 (a) and 1 (c). In FIG. 1 (c), First indicates the first repetitive sequence from the N-terminal side, Second indicates the second repetitive sequence, and the underlined amino acid residues in the figure are the same residues or their chemistry The amino acid residues are similar in nature. The second repetitive sequence has an RGD (arginine-glycine-aspartic acid) sequence known as one of cell adhesion signals shared by many of the extracellular matrix proteins, as indicated by the double underline in the figure. It is included.
[0037]
Furthermore, as shown in FIG. 1A and FIG. 2, the QBRICK protein has 12 tandem repeat sequences. FIG. 2 shows the order from the N-terminal side of 12 repeat sequences in the order of First, Second, Third..., And the underlined amino acid residues in the figure are the same residues or their chemicals. Indicates that the amino acid residue has similar properties.
[0038]
As shown in FIGS. 1 (a) and 3 (a), the QBRICK protein has a Calx-β domain following the 12 tandem repeats.
[0039]
Furthermore, as shown in FIGS. 1 (a) and 3 (c), the QBRICK protein has a type C-lectin-like domain at the C-terminus. The sequence between the Calx-β domain and the type C-lectin-like domain in FIG. 1 (a) is shown in FIG. 3 (b).
[0040]
As proteins having homology with the above QBRICK protein, there are ECM3 protein and NG2 protein as shown in FIGS.
[0041]
8 to 15, MmQBRICK represents mouse QBRICK protein, LvECM3 represents sea urchin ECM3 protein, HsECM3 represents human ECM3 protein, and RnNG2 represents rat NG2 protein. As is clear from FIGS. 8 to 15, both the ECM3 protein and the NG2 protein include a region having homology with the QBRICK protein.
[0042]
The ECM3 protein is known to be involved in mesoderm cell migration in sea urchins. As for the NG2 protein, it is known to work with the PDGF receptor to receive stimulation by PDGF (platelet-derived growth factor), and is also used as a cell surface marker for oligodendrocyte progenitor cells.
[0043]
Further, as shown in FIG. 16, the QBRICK protein, ECM3 protein and NG2 protein according to the present invention all have 10 or more repeat sequences (repeat domain in the figure). Specifically, the QBRICK protein has 12 repeat sequences as described above, the ECM3 protein also has 12 repeat sequences, and the NG2 protein has 15 repeat sequences.
[0044]
Further, the QBRICK protein according to the present invention has a Calx-β domain on the C-terminal side of the repetitive sequence, like the ECM3 protein.
[0045]
On the other hand, both ECM3 protein and NG2 protein have a transmembrane domain (transmembrane domain in the figure) on the C-terminal side, but the QBRICK protein according to the present invention has a transmembrane domain as described above. It does not have, but has the type C-lectin-like domain (C-lectin like domain in the figure). The NG2 protein has two laminin G domains on the N-terminal side, but the QBRICK protein according to the present invention does not have a laminin G domain.
[0046]
<QBRICK-S gene and protein>
The QBRICK-S gene was found as the second novel cDNA according to the present invention, and as shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b), the QBRICK-S protein, like the QBRICK protein, is N-terminal. A secretory signal sequence consisting of 29 amino acid residues (S in the figure) and, as shown in FIGS. 4 (a) and 4 (c), a sequence (N-terminal) deduced as two repetitive sequences including the RGD sequence repeat (2)).
[0047]
However, as shown in FIG. 16, QBRICK-S protein is completely deficient in 12 tandem repeats, Calx-β domain, and type C-lectin-like domain, so that alternative splicing of QBRICK protein is possible. It is thought to encode an isoform. In addition, the arrangement | sequence following N-terminal repeat (2) in Fig.4 (a) is shown in FIG.4 (d).
[0048]
<Human QBRICK gene and protein>
The human QBRICK gene has a high homology with the mouse QBRICK gene in the base sequence. Similarly, the human QBRICK protein has a high homology with the mouse QBRICK protein as shown in FIGS. ing. As shown in FIGS. 5 (a) to (c), FIG. 6, and FIGS. 7 (a) to (c), human QBRICK protein is presumed to be a secretory signal sequence and two repetitive sequences in the same manner as mouse QBRICK protein. Sequence, RGD sequence, 12 tandem repeats, Calx-β domain, and type C-lectin-like domain. In addition, as indicated by the underline in FIG. 7 (b), the human QBRICK protein has a second RGD sequence between the Calx-β domain and the type C-lectin-like domain.
[0049]
Further, as shown in FIG. 16, the human QBRICK protein according to the present invention has 12 repetitive sequences like the QBRICK protein, and has a structure similar to the ECM3 protein and the NG2 protein.
[0050]
(2) Functions of novel extracellular matrix proteins related to this study
The QBRICK protein according to the present invention has a secretory signal sequence, and any of them is predicted to be an extracellular secreted protein (secreted protein). Moreover, the QBRICK gene according to the present invention is found to be specifically expressed in the hair follicle placode of the cheek fold in the fetal mouse of day 12 from the results of whole mount in situ hybridization (Example 2 described later). Furthermore, from the results of analysis by RT-PCR, the expression of QBRICK mRNA can be seen in the skin (see Example 5 and FIG. 18 described later), so that the QBRICK gene and the QBRICK protein according to the present invention are hairs. It is suggested that it is greatly involved in the formation of capsules. Further, from the results of the cell adhesion assay, the QBRICK protein has a cell adhesion activity (see Example 7 and FIG. 20 described later), and from the results of the cell extension assay, the QBRICK protein has a cell extension activity (described later). From Example 6 and FIG. 19), it is considered that the QBRICK gene and QBRICK protein may function in intracellular signal transduction involved in hair follicle formation.
[0051]
Furthermore, since the human QBRICK protein has high homology with the mouse QBRICK protein, it is considered to have the same function as the QBRICK protein.
[0052]
Since the QBRICK-S gene is considered to encode the alternative splicing form of the QBRICK protein as described above, the QBRICK-S gene and the QBRICK-S protein are partially combined with the QBRICK gene and the QBRICK protein. It is expected to have a common function.
[0053]
(3) Protein according to the present invention and method for using the gene
As described above, the protein according to the present invention is a novel extracellular matrix protein that has been revealed for the first time by the present inventor, and is predicted to be an extracellular matrix protein that is specifically expressed in the hair follicle placode. . Therefore, the gene, protein and the like according to the present invention have the following utility.
[0054]
First, since it is presumed to be greatly involved in hair follicle formation, the genes, proteins and the like according to the present invention can be applied to diagnosis and treatment of diseases that cause abnormal hair follicle formation, It can be used as a target protein for diagnosis and treatment of diseases caused by abnormal hair follicle formation, and for therapeutic drug search.
[0055]
In addition, it has been clarified that the extracellular matrix has a great influence on various cellular activities such as cell proliferation, differentiation, and migration, and as a result, plays an important role in development, aging, disease, and the like.
[0056]
Therefore, the gene, protein, and antibody thereof according to the present invention can be a very useful tool for studying diseases caused by fertilization, embryogenesis, morphogenesis, as well as dysplasia or metabolic abnormality of extracellular matrix. . In addition, the gene, protein, and the like according to the present invention can be effectively used as a diagnostic agent for diseases involving extracellular matrix and a test agent for examining the therapeutic effect. In addition, since the extracellular matrix is an extracellular environment that regulates tissue formation, the gene, protein, and the like according to the present invention can be applied to tissue regeneration in regenerative medicine and artificial tissue formation in vitro.
[0057]
In addition, as described above, most of the extracellular matrix has cell adhesion and spreading activity. In addition to the physical action that regulates cell morphology by supporting cell adhesion in tissues, it is mediated through cell surface receptors. Intracellular signals governing the vital activities of cells such as survival, proliferation and differentiation. Individual extracellular matrix factors transmit different intracellular signals, thereby precisely controlling the formation and function of cells and their aggregated tissues. The protein according to the present invention is sufficiently predicted to be involved in these controls as a new cell function control factor.
[0058]
Therefore, the gene, protein, and the like according to the present invention are considered to be useful for, for example, promoting or controlling tissue repair at the time of illness or postoperative in vivo.
Below, the concrete usage method of the gene, protein, etc. which concern on this invention is demonstrated.
[0059]
The gene according to the present invention or a mutant gene thereof can be introduced into various host cells to express the extracellular matrix protein according to the present invention or a mutant protein thereof. The introduced gene of the present invention or a mutant gene thereof may exist as a vector in the host cell, or may be included as “external” DNA or “additional” DNA in the genomic DNA of the host cell. . As used herein, “external” DNA refers to DNA that has been inserted into the genome of the host cell. The “added” DNA means a DNA that is naturally present in the genome of a specific host cell, but is additionally inserted into the genome of the host cell as a result of artificial manipulation.
[0060]
The specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell may be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence may be appropriately selected in order to reliably express the gene, and this and the gene according to the present invention incorporated into various plasmids may be used as an expression vector. Furthermore, the expression vector may contain not only a promoter sequence but also a terminator sequence.
[0061]
In addition, various markers may be used to confirm whether or not the above gene or mutant gene has been introduced into the host cell, and whether or not the gene or mutant gene is reliably expressed in the host cell. For example, a gene deleted in the host cell is used as a marker, and a plasmid or the like containing this marker is introduced into the host cell together with an expression vector containing the gene according to the present invention. Thereby, the introduction of the gene according to the present invention can be confirmed from the expression of the marker gene. Alternatively, the GFP fusion protein of the extracellular matrix protein according to the present invention may be expressed using a green fluorescent protein (GFP) derived from Aequorea jellyfish as a marker.
[0062]
The host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used. Specifically, for example, bacteria such as Escherichia coli, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and fission yeast (Schizosaccharomyces pombe), Xenopus laevis oocytes, cultured cells of various mammals Insect cultured cells can also be mentioned, but are not particularly limited.
[0063]
A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. .
[0064]
As described above, the protein and gene thereof according to the present invention are applied not only to various reagents for research but also to various drugs used for diagnosis and treatment of diseases involving extracellular matrix, examination of therapeutic effect, and the like. It becomes possible.
[0065]
A conventionally known method can be applied to the pharmaceutical preparation of the gene or protein according to the present invention, and it is not particularly limited. For example, in the case of a research reagent, the gene according to the present invention may be converted into a transformation kit, or the extracellular matrix protein according to the present invention may be mass-produced in a heterologous expression system and purified.
[0066]
Similarly, a method for producing an antibody against the protein according to the present invention is not particularly limited. For example, a conventionally known method using the QBRICK protein and QBRICK-S protein according to the present invention or a partial peptide thereof as an antigen. Can be obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
[0067]
Moreover, since the gene or protein according to the present invention is presumed to be a hair follicle formation regulator, it may be used as a hair follicle formation promoter. When used as such a hair follicle formation promoter, its specific composition is not particularly limited as long as it contains the gene or protein according to the present invention. Specifically, a buffer solution or the like that can exhibit the function of the gene or protein according to the present invention may be included to promote hair follicle formation according to the type of animal individual to be used.
[0068]
In addition, a partial sequence of the gene related to this study can be used as a probe or primer. The partial sequence may be a characteristic / specific sequence contained in the QBRICK gene and the QBRICK-S gene. In this case, as a probe, for example, a partial sequence of the gene according to the present invention is fixed on a chip to constitute a DNA chip (including a microarray), and the DNA chip is used for various tests and diagnosis. Such a case is mentioned.
[0069]
(4) Protein and gene acquisition method according to the present invention
The method for obtaining the QBRICK gene, the QBRICK-S gene, and the human QBRICK gene according to the present invention is not particularly limited, and the gene sequence can be obtained by various methods based on the sequence information disclosed above. The containing DNA fragment can be isolated and cloned. For example, a probe that specifically hybridizes with a partial sequence of cDNA encoding the above QBRICK protein, QBRICK-S protein, or human QBRICK protein is prepared, and a genomic DNA library or cDNA library such as human or mouse is screened. do it. Such a probe may be any sequence as long as it specifically hybridizes to at least a part of the base sequence of cDNA encoding the QBRICK protein, QBRICK-S protein, or human QBRICK protein or its complementary sequence. -You may use the thing of length. Moreover, what is necessary is just to perform about each step in the said screening on the conditions used normally.
[0070]
The clone obtained by the above screening can be analyzed in more detail by preparing a restriction enzyme map and determining its sequencing (sequencing). By these analyses, it can be easily confirmed whether a DNA fragment containing the gene sequence according to the present invention has been obtained.
[0071]
In addition, the probe sequence is a region considered to be important for the function of the cDNA encoding the QBRICK protein, QBRICK-S protein, or human QBRICK protein (for example, secretory signal sequence, RGD sequence, 12 repetitive sequence, Calx- QBRICK protein, QBRICK-S protein, or human QBRICK protein can be selected by screening from human, mouse and other organism genomic DNA (or cDNA) libraries It is highly possible to isolate and clone a gene encoding a homologous molecule or a similar molecule having a function equivalent to that of.
[0072]
The method for obtaining the gene (polynucleotide) according to the present invention includes a method using an amplification means such as PCR in addition to the above screening method. For example, among the cDNA sequences of the above QBRICK protein, QBRICK-S protein, or human QBRICK protein, primers are prepared from the sequences of untranslated regions on the 5 ′ side and 3 ′ side (or their complementary sequences), respectively. PCR is performed using genomic DNA (or cDNA) such as human and mouse as a template using primers, and a DNA region sandwiched between both primers is amplified, so that a large amount of fragments containing the polynucleotide of the present invention can be obtained. You can get it.
[0073]
The method for obtaining the protein according to the present invention is not particularly limited. For example, the gene obtained as described above (the QBRICK protein, the QBRICK-S protein, the human QBRICK protein, or a homologous molecule thereof) A recombinant expression vector in which a cDNA or the like is introduced, and is incorporated into a microorganism such as Escherichia coli or yeast or an animal cell by a well-known method, and the protein encoded by the cDNA is expressed and purified as a transformant. Thus, the protein according to the present invention such as the above QBRICK protein, QBRICK-S protein, or human QBRICK protein can be easily obtained.
[0074]
The method for producing the above-mentioned QBRICK protein, QBRICK-S protein, or human QBRICK protein mutant protein is not particularly limited, and for example, site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271- 275 (1995) et al.) Using a known mutant protein production method such as a method for producing a mutant protein by introducing a point mutation into a base sequence using a PCR method or a method for producing a mutant strain by inserting a transposon. The base sequence of the gene obtained as described above can be prepared by modifying so that one or more bases are substituted, deleted, inserted, and / or added. Moreover, you may utilize a commercially available kit for preparation of a mutein.
[0075]
【Example】
In the following examples, a specific method for obtaining the QBRICK gene and the QBRICK-S gene according to the present invention from a mouse, a specific method for obtaining a human QBRICK gene from a human, and the QBRICK gene according to the present invention The results of examining the expression and further the results of examining the physiological activity of the QBRICK protein will be described in order.
[0076]
[Example 1]: Cloning of QBRICK cDNA
From the fetal mouse buccal epithelium-derived cDNA of embryonic day 12 (E12), a cDNA fragment considered to be specifically expressed in the buccal epithelium was obtained using the RDA method. Furthermore, using the sequence information of these cDNA fragments, full-length cDNA was synthesized from RNA derived from fetal bovine epithelium using the PCR method, 5′RACE method, and 3′RACE method, and its nucleotide sequence. It was determined.
[0077]
As a result, as shown in SEQ ID NO: 1, the QBRICK gene, which was estimated to encode a protein consisting of 2172 amino acids with a total length of 9328 bases, was obtained.
[0078]
From the analysis of the amino acid sequence, as shown in FIG. 1 to FIG. 3, it has a secretory signal sequence consisting of 29 amino acids at the N-terminus, but it is presumed that it is a secreted protein because it has no transmembrane domain There are 12 tandem repeats in the molecule, the RGD sequence is included, it has a Calx-β domain, it has a type C-lectin-like domain, sea urchin cells as shown in FIGS. It was revealed that ECM3 protein, which is one of outer matrix proteins, and NG2 protein, which is one of rat proteoglycans, show high homology.
[0079]
[Example 2]: Cloning of QBRICK-S cDNA
Total RNA was extracted from fetuses of embryonic day 13 (E13) by a conventional method. CDNA was synthesized from 150 ng of each total RNA using oligo dT primer (Invitrogen) and Superscript II (Invitrogen) according to the protocol attached to Superscript II. Using this cDNA as a template, PCR was performed using the forward primer shown in SEQ ID NO: 7 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 8.
[0080]
GCAGATCTCCACCATGCACTCTCCAGGCTGCAC (SEQ ID NO: 7)
ATCAGTTTCCTTGAGCACACAAA (SEQ ID NO: 8)
Specifically, with respect to cDNA obtained from 150 ng of total RNA, magnesium sulfate 1 mM, dNTP 0.2 mM, KOD-Plus- (manufactured by Toyobo) 2 U, forward primer 0.5 μM, reverse primer 0.5 μM, PCR buffer for KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.) was added to carry out the PCR reaction. PCR reaction conditions were 94 ° C. for 2 minutes, followed by 5 cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 7 minutes, then 94 ° C. 26 cycles were performed, with 15 seconds at 60 ° C, 30 seconds at 60 ° C, and 7 minutes at 68 ° C. The obtained PCR product was incorporated into a pGEM-T Easy cloning vector. The cloning vector containing this PCR product was purified, and its nucleotide sequence was determined by a conventional method.
[0081]
As a result, a QBRICK-S gene having a total length of 6564 bases encoding a QBRICK-S protein consisting of 316 amino acids was obtained. The QBRICK-S gene corresponds to the 527th to 7041th bases of the QBRICK gene, but 4 bases corresponding to the 1373rd to 1376th bases of the QBRICK gene are deleted, and the 4966th position of the QBRICK gene. Since 53 bases are inserted at a site corresponding to between the base No. 4967 and the 4967th base, it is considered to encode an alternative splicing isoform of QBRICK protein.
[0082]
[Example 3]: Determination of base sequence of human QBRICK cDNA
Using the mouse QBRICK gene base sequence, homology search was performed using BLASTn on the NCBI website. As a result, the following base sequence indicated by gi number was obtained.
[0083]
20539842 Total length 4935 bases
21410277 Total length 2439 bases
Based on the cDNA base sequence of the mouse QBRICK gene, the base sequence consisting of 20539842 to 1-4790 bases and then 21410277 to 449 to 2439 bases were combined to obtain a new base sequence consisting of 6781 bases. Using this base sequence, homology search was performed for human EST with BLASTn to obtain homologous human EST. When the obtained human EST was compared with the aforementioned base sequence, 17th human EST (shown by gi number) shown below was found for the 6560th base “g (guanine)”.
5855633,6570054,4664863,1424166,4283047,
5234111, 5592769, 4186708, 5444708, 13298865,
5874723, 5367873, 4174947, 3539030, 734654,
2106943, 6700680, 5877489, 3871704, 20999982,
13748543, 1281309
Since the base corresponding thereto is “t (thymine)”, the 6560th base was corrected to “t”. Of the base sequence obtained by this method, 1 to 6753 bases correspond to 1 to 6753 bases of the human QBRICK gene.
[0084]
As for 6754-6818 bases in the human QBRICK gene, the following 15 human ESTs (also indicated by gi numbers)
5855633,6570054,4664863,5234111,5592769,
4186708, 5444708, 5874723, 5367873, 4174947,
3539030, 2106943, 6700680, 5877489, 3871704
A base sequence consisting of 65 bases, which completely coincided with each other, was used.
[0085]
As a result, as shown in SEQ ID NO: 5, a novel human QBRICK gene, which was estimated to encode a protein consisting of 2181 amino acids with a total length of 6818 bases, was obtained.
[0086]
[Example 4]: Gene expression analysis in each tissue by whole mount in situ hybridization
A digoxigenin labeling kit comprising an antisense probe and a sense probe based on the nucleotide sequences 974 to 1476, 2653 to 3206, 4627 to 5126, 5927 to 6426, and 6797 to 7326 in the obtained QBRICK gene (Manufactured by Roche). A mixture of these five probes was used, and whole-mount in situ hybridization was performed by a conventional method using a fetal mouse 12 days (E12). Expression analysis was performed using a digoxigenin identification kit (Roche). As a result, as shown in FIG. 17, gene expression was recognized specifically in the cheek follicle follicle placode.
[0087]
[Example 5]: Gene expression analysis in tissue by RT-PCR
Each organ or fetus was taken out from each fetal age fetus and adult mouse, and total RNA was extracted by a conventional method. CDNA was synthesized from 150 ng of each total RNA using random primer (Invitrogen) and Superscript II (Invitrogen) according to the protocol attached to Superscript II. Using this cDNA as a template, PCR was performed using the forward primer shown in SEQ ID NO: 9 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 10.
[0088]
TCTGATGTGGACACCCCGCTAGA (SEQ ID NO: 9)
CGCTGTCTGCATCAGTAGCGGAAA (SEQ ID NO: 10)
Specifically, with respect to cDNA obtained from 150 ng of total RNA, dNTP 0.2 mM, ExTaq DNA polymerase (TaKaRa ExTaq, manufactured by Takara Shuzo) 2 U, forward primer 0.5 μM, reverse primer 0.5 μM, ExTaq buffer (Takara Shuzo) PCR product was added. PCR reaction conditions were 96 cycles at 96 ° C. for 2 minutes, followed by 32 cycles of 96 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute. The obtained PCR product was confirmed by electrophoresis using an agarose gel and staining the DNA.
[0089]
As a result, as shown in FIG. 18, the QBRICK mRNA according to the present invention is constantly expressed in the fetal period (fetus at 10 to 18 days of fetal age), and in adult tissues, the eyes, ovaries, kidneys, etc. Strong expression was observed. In addition, in the “skin (skin)” in the electropherogram of FIG. 18, the QBRICK mRNA band is difficult to see, but is actually expressed.
[0090]
[Example 6]: Assay of cell spreading activity of QBRICK protein
GST-N which is a GST fusion protein of QBRICK protein (protein in which a fragment containing amino acid residues 23 to 280 of QBRICK protein is fused to glutathione S-transferase), and the 207th aspartic acid of QBRICK protein in GST-N Mutant GST-N-D207E in which the corresponding amino acid residue was substituted with glutamic acid was expressed in E. coli and purified.
[0091]
A 96-well microtiter plate was incubated overnight at 4 ° C. with 10 μg / ml, 50 μl of GST, GST-N or GST-N-D207E per well to coat the plate. The coated wells were washed twice with PBS and then blocked with 50 μl of 1% bovine serum albumin for 30 minutes at room temperature.
[0092]
After removing the bovine serum albumin solution, 2 × 10 2 for DME medium or DME medium supplemented with 1 mg / ml GRGDSP or GRGESP peptide ^Five 100 μl of HeLa cells suspended to a concentration of / ml were added. After incubating at 37 ° C. for 1 hour, the percentage of cells that had spread was measured.
[0093]
As a result, as shown in FIG. 19, when GST-N compared with GST, remarkable cell extension was recognized. This cell spreading was inhibited by the addition of the GRGDSP peptide, but not with the GRGESP peptide. On the other hand, no significant cell extension was observed with GST-N-D207E. From the above results, it was revealed that QBRICK protein has cell spreading activity depending on its RGD sequence.
[0094]
[Example 7]: Assay of cell adhesion activity of QBRICK protein
GST, GST-N and GST-N-D207E were expressed in E. coli and purified. Incubate a 96-well microtiter plate with 0, 1, 2, 5, 10, 20 μg / ml, 50 μl of purified GST, GST-N or GST-N-D207E overnight at 4 ° C. to coat the plate did. The coated wells were washed twice with PBS and then blocked with 50 μl of 1% bovine serum albumin for 30 minutes at room temperature.
[0095]
After removing the bovine serum albumin solution, 2 × 10 2 for DME medium containing 0.1% bovine serum albumin. ^Five 100 μl of HeLa cells suspended in / ml was added. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, the wells were washed with DME medium, and the number of adherent cells was measured.
[0096]
As a result, as shown in FIG. 20, when compared with GST, remarkable cell adhesion depending on the coating concentration was observed in GST-N. On the other hand, no significant cell adhesion was observed with GST-N-D207E. From the above results, it was revealed that the QBRICK protein has cell adhesion activity depending on its RGD sequence.
[0097]
【The invention's effect】
As described above, since the genes, proteins, and the like according to the present invention are suggested to be greatly involved in hair follicle formation, they can be applied to the diagnosis and treatment of diseases that cause abnormal hair follicle formation. In addition, there is an effect that it can be used as a target protein for diagnosis and treatment of diseases caused by abnormal hair follicle formation, and for therapeutic drug search.
[0098]
In addition, since the protein according to the present invention is presumed to be an extracellular matrix protein, it can be used not only for researches such as functional analysis of the extracellular matrix but also diseases caused by abnormal formation or metabolic abnormality of the extracellular matrix, It has the effect that it can be effectively used for the development of diagnostic agents for diseases, therapeutic agents, and diagnostic agents for examining therapeutic effects. In addition, since the extracellular matrix is an extracellular environment that regulates tissue formation, the protein and its gene according to the present invention can be used for tissue regeneration in regenerative medicine and in vitro artificial tissue formation. Play.
[0099]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 (a) is a schematic diagram showing an outline of a primary structure of a QBRICK protein according to the present invention, and (b) is an amino acid sequence diagram showing a signal sequence of the QBRICK protein shown in (a). (C) is an amino acid sequence diagram showing sequences deduced as two N-terminal repeat sequences in the QBRICK protein shown in (a).
FIG. 2 is an amino acid sequence diagram showing 12 tandem repeat sequences in the QBRICK protein shown in FIG.
3A is an amino acid sequence diagram showing the C-terminal Calx-β domain in the QBRICK protein shown in FIG. 1A, and FIG. 3B is a diagram in the QBRICK protein shown in FIG. 1A. FIG. 2 is an amino acid sequence diagram showing a sequence between a Calx-β domain and a type C-lectin-like domain, and (c) shows a type C-lectin-like domain on the C-terminal side in the QBRICK protein shown in FIG. It is an amino acid sequence diagram shown.
4A is a schematic diagram showing an outline of the primary structure of a QBRICK-S protein according to the present invention, and FIG. 4B is an amino acid sequence showing a signal sequence of the QBRICK-S protein shown in FIG. It is a figure and (c) is an amino acid sequence diagram which shows the arrangement | sequence estimated with two repeating sequences in QBRICK-S protein shown to (a).
5A is a schematic diagram showing an outline of the primary structure of the human QBRICK protein according to the present invention, and FIG. 5B is an amino acid sequence diagram showing the signal sequence of the human QBRICK protein shown in FIG. 5A. (C) is an amino acid sequence diagram showing sequences deduced as two N-terminal repeat sequences in the human QBRICK protein shown in (a).
6 is an amino acid sequence diagram showing 12 tandem repeat sequences in the human QBRICK protein shown in FIG. 1 (a). FIG.
7 (a) is an amino acid sequence diagram showing the C-terminal Calx-β domain in the human QBRICK protein shown in FIG. 5 (a), and (b) is the human QBRICK shown in FIG. 5 (a). FIG. 6 is an amino acid sequence diagram showing a sequence between a Calx-β domain and a type C-lectin-like domain in a protein, and (c) is a type C-lectin on the C-terminal side in the human QBRICK protein shown in FIG. It is an amino acid sequence diagram showing a like domain.
FIG. 8 shows a comparison of amino acid sequences of QBRICK protein, QBRICK-S protein, and human QBRICK protein according to the present invention, and ECM3 protein and NG2 protein.
FIG. 9 is a diagram showing a comparison of amino acid sequences of the QBRICK protein, QBRICK-S protein, and human QBRICK protein according to the present invention with ECM3 protein and NG2 protein, and is a continuation of FIG.
10 is a view showing a comparison of amino acid sequences of the QBRICK protein, the QBRICK-S protein, and the human QBRICK protein according to the present invention with the ECM3 protein and the NG2 protein, and is a continuation of FIG.
11 is a view showing a comparison of amino acid sequences of the QBRICK protein, the QBRICK-S protein, and the human QBRICK protein according to the present invention with the ECM3 protein and the NG2 protein, and is a continuation of FIG.
12 is a view showing a comparison of amino acid sequences of the QBRICK protein, the QBRICK-S protein, and the human QBRICK protein according to the present invention with the ECM3 protein and the NG2 protein, and is a continuation of FIG.
13 is a view showing a comparison of amino acid sequences of the QBRICK protein, the QBRICK-S protein, and the human QBRICK protein according to the present invention with the ECM3 protein and the NG2 protein, and is a continuation of FIG.
14 is a view showing a comparison of amino acid sequences of the QBRICK protein, the QBRICK-S protein, and the human QBRICK protein according to the present invention with the ECM3 protein and the NG2 protein, and is a continuation of FIG.
FIG. 15 is a view showing a comparison of amino acid sequences of the QBRICK protein, the QBRICK-S protein, and the human QBRICK protein according to the present invention with the ECM3 protein and the NG2 protein, and is a continuation of FIG.
FIG. 16 is a view showing a state in which the QBRICK gene according to the present invention is expressed in the tissue of a fetal mouse of day 12 of gestation.
FIG. 17 is a schematic diagram comparing the domain structures of the nPG protein, nPG-S protein, and human nPG protein according to the present invention, and the ECM3 protein and NG2 protein.
FIG. 18 is an electrophoretogram showing the results of RT-PCR analysis of the expression of fetal and adult mouse tissues in the QBRICK mRNA according to the present invention.
FIG. 19 is a diagram showing the results of examining cell spreading activity using GST-N and GST-N-D207E, which are GST fusion proteins of the QBRICK protein according to the present invention.
FIG. 20 is a diagram showing the results of examining cell adhesion activity using GST-N and GST-N-D207E, which are GST fusion proteins of the QBRICK protein according to the present invention.

Claims

A gene encoding the following protein (a) or (b).
(A) A protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 .
(B) An extracellular matrix protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 .

The gene according to claim 1, which is derived from a mouse.

The gene according to claim 1 or 2, which has, as an open reading frame, a 527 to 7045th nucleotide sequence in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.

A gene encoding the following protein (c) or (d) .
(C) A protein consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 6.
(D) An extracellular matrix protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.

The gene according to claim 4, which is derived from human .

6. The gene according to claim 4 or 5, which has the 1st to 6579th base sequence as an open reading frame in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 .

A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

An extracellular matrix protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

The protein according to claim 7, which is an extracellular matrix protein.

The protein according to any one of claims 7 to 9, which is a secreted protein.

The protein according to any one of claims 7 to 10 , which is expressed in a hair follicle placode .

A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.

An extracellular matrix protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.

The protein according to claim 12, which is an extracellular matrix protein.

The protein according to any one of claims 12 to 14, which is a secreted protein .

A recombinant expression vector comprising the gene according to any one of claims 1 to 6.

A transformant into which the gene according to any one of claims 1 to 6 has been introduced.

The antibody with respect to the protein of any one of Claims 7-15.