JP4041701B2 - Method for determining susceptibility to hypertension or proteinuria related diseases - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検者の遺伝子多型を解析し、解析結果に基づいて、被検者の高血圧症又は蛋白尿関連疾患に対する易罹患性を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高血圧症患者に著効を示す降圧剤が開発され、従来血圧コントロールが困難であった悪性高血圧などの重症高血圧の治療が比較的容易にできるようになった。ところが、本態性高血圧等では降圧剤の使用を中止すると、直ちに元の血圧に戻ってしまい、一般に他の病気に対する治療剤のような治癒効果を有するものではない。一方で、高血圧患者は食塩の摂取量を減らすことが血圧を下げる上で極めて有効であることが広く知られており、減塩食事療法が降圧剤の使用と併用されることも多い。特に、軽症の高血圧症の場合には、薬物療法によらず減塩食事療法のみによっていることが多い。いくつかの治療試験によれば、軽度の食塩制限によっても有効な降圧効果をもたらすことが確認されている。このため、高血圧症の場合には食塩の摂取量を制限するような食事をすることが常識となっている。
【０００３】
ただ、減塩食の効果については、減塩をうける患者側の食塩感受性の問題があり、例えば食塩量１日0.5ｇ以下という厳しい減塩療法においても、約２／３の患者では有効であっても、残りの１／３の患者では降圧が認められなかったという報告もある。同じ本態性高血圧症の患者のなかにも、血圧が食塩摂取量の変化に影響されやすい人とそうでない人がいる。影響されやすい人では、腎臓のナトリウム排泄能力が低下していたり、あるいは腎臓におけるナトリウム再吸収能力が高いため、食塩負荷により体内にナトリウムが貯留する結果、血圧が上昇すると考えられている。これらナトリウム排泄・再吸収能力の差異は、その全貌が明らかとなったわけではないが、究極的には各人の遺伝子多型（各人のゲノムを構成する塩基配列の微小な違い）に基づいてかなりの部分を説明できるものと考えられる。
【０００４】
前記遺伝子多型は、最近の急速なゲノム解析進歩に伴って明らかとなったものである。遺伝子多型には、２〜数個の塩基がまとまって挿入又は欠失しているタイプや、さらに長鎖のDNA断片が挿入又は欠失しているタイプのものがあるが、最近特に注目されているものは、一つの塩基が別の塩基への置換されておこる、いわゆる一塩基多型（SNP）と呼ばれるタイプである。ヒトのゲノム上には、約300万のSNPが存在すると言われている。SNPの中には、既に疾患感受性との関連が指摘されたものもあり、SNPは、各人に最適の医療（テーラーメイド医療）実現のための診断指標として重要視されてきている。例えば、高血圧症関連では、アンジオテンシノーゲン（AGT）遺伝子の第二エクソンに存在するMet235Thr多型は、69論文のメタアナリシスでAGTのThr／Thrホモは、Met／Metホモよりも31％高血圧になり易く[Staessen J. A. et al.:J. Hypertens. 17:9-17(1999)]、その強弱が食塩摂取量に依存していることが報告されている。従って、Thr／Thrホモ多型の高血圧患者に対しては、減塩療法が有効であると考えられる。しかし、高血圧等の生活習慣病は多因子疾患であり、一つの遺伝子多型で説明できるものではない。今後、高血圧のテーラーメイド医療実現のためにも、高血圧発症の遺伝的素因となっている遺伝子多型の全貌を明らかにすることが極めて重要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトSCNN1A遺伝子の多型を解析し、解析結果に基づいて、被検者の高血圧症又は蛋白尿関連疾患に対する易罹患性を判定する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ヒトSCNN1A遺伝子に存在する特定の多型が、血圧及び尿のタンパク量に影響を与えていることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の(1)〜(3)である。
(1) 被検者の高血圧症への易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料中のゲノムDNA上に存在するヒトSCNN1A遺伝子のプロモーター領域を含む配列番号１で表される塩基配列の第2139番目の塩基に相当する位置の塩基の種類を決定する工程、及び
(c) 工程(b)において得られた結果に基づいて、当該被検者の高血圧症への易罹患性を判定する工程、
を包含することを特徴とする前記高血圧症への被検者の易罹患性判定方法。
(2) 被検者の高血圧症への易罹患性の判定を、ヒトSCNN1A遺伝子の配列番号１の塩基配列で表される第2139番目の塩基の種類がGA型又はGG型である場合には、当該被検者は高血圧症に罹患し易いと判定し、当該塩基の種類がAA型である場合には、当該被検者は高血圧症に罹患し難いと判定する判定基準に基づいて行なうことを特徴とする上記(1)の高血圧症への被検者の易罹患性判定方法。
(3) 配列番号２５の塩基配列を含むプライマー、配列番号２６の塩基配列を含むプライマー、配列番号２７の塩基配列を含むＡ型検出用蛍光標識プローブ及び配列番号２８の塩基配列を含むＧ型検出用蛍光標識プローブを主要構成要素として含有してなる、ヒトSCNN1A遺伝子のプロモーター領域を含む配列番号１で表される塩基配列の第2139番目の位置の一塩基多型タイピング用キット。
【０００７】
(4) 被検者の蛋白尿関連疾患への易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料中のゲノムDNA上に存在するヒトSCNN1A遺伝子のプロモーター領域を含む配列番号１で表される塩基配列の第2139番目の塩基に相当する位置の塩基の種類を決定する工程、及び
(c) 工程(b)において得られた結果に基づいて、当該被検者の蛋白尿関連疾患への易罹患性を判定する工程、
を包含することを特徴とする前記蛋白尿関連疾患への被検者の易罹患性判定方法。
(5) 被検者の蛋白尿関連疾患への易罹患性の判定を、ヒトSCNN1A遺伝子の配列番号１の塩基配列で表される第2139番目の塩基の種類がGA型又はGG型である場合には、当該被検者は蛋白尿関連疾患に罹患し易いと判定し、当該塩基の種類がAA型である場合には、当該被検者は蛋白尿関連疾患に罹患し難いと判定する判定基準に基づいて行なうことを特徴とする上記(4)の蛋白尿関連疾患への被検者の易罹患性判定方法。
(6) 蛋白尿関連疾患が、腎臓病である上記(4)又は(5)の蛋白尿関連疾患への被検者の易罹患性判定方法。
(7) 腎臓病が、腎炎、ネフローゼ症候群、腎硬化症、糸球体腎炎、膜性腎症又は腎腫瘍である上記(6)の蛋白尿関連疾患への被検者の易罹患性判定方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の検出法は、ヒトSCNN1A遺伝子の特定の多型を解析し、解析結果に基づいて被検者の高血圧症又は蛋白尿関連疾患ヘの易罹患性を判定することを特徴とする。ここで、「ヒトSCNN1A遺伝子」とは、アミロライド感受性上皮ナトリウムチャネルのαサブユニットをコードし、ヒト第12番染色体の13.3の位置にマップされ、GenBankアクセッションナンバーAF060910として登録されている塩基配列を含む遺伝子をいう。「蛋白尿関連疾患」とは、その疾患に罹患した場合に、尿中に異常と判定される程度の量の蛋白が出る疾患（例えば、腎炎、ネフローゼ症候群、腎硬化症、糸球体腎炎、膜性腎症等の腎腫瘍腎臓病）をいう。「易罹患性」とは、それぞれの疾患への罹り易さをいう。
【０００９】
本発明において、高血圧症又は蛋白尿関連疾患ヘの易罹患性判定の基準となる多型は、SCNN1A遺伝子のプロモーター領域を含む配列番号１で表される塩基配列の第2139番目の塩基に相当する位置の一塩基多型（第2139番塩基G/A多型ともいう）である。なお、SCNN1A遺伝子における第2139番塩基G/A多型の存在部位を図１に模式的に示した。図１に示したように第2139番塩基G/A多型は、SCNN1A遺伝子のプロモーター領域に存在する。この部位の塩基は、現在のところ、アデニン（A）又はグアニン（G）であることが確認されている。ヒト染色体DNAは、両親から由来する各一対が存在するので、被検者の第2139番塩基G/A多型には、両染色体のSCNN1A遺伝子ともアデニンであるAA型（Ａのホモ接合型）、一方の染色体はアデニンでもう一方の染色体はグアニンであるAG型（ＡとＧのヘテロ接合型）、そして両染色体ともグアニンであるGG型（Ｇのホモ接合型）の３つのタイプが存在する。SCNN1A遺伝子の第2139番目の塩基がアデニンである場合の全長配列を配列番号１に示した。
【００１０】
SCNN1A遺伝子多型の解析方法は、上記の多型の判別ができる限り、特に限定されず、公知の様々な遺伝子多型解析方法を採用することができる。例えば、被検者から採取した血液細胞及び口腔内粘膜細胞等の試料から、染色体DNAを抽出し、これを鋳型として、目的の多型を含む部分を増幅できるように設計したプライマーを用いてPCRを行い、得られたPCR産物の塩基配列を解析する方法や、その他、PCRプライマーの3’末端にミスマッチがあるとプライマーとして機能しないため増幅が起きないことを利用したアレル特異的PCR法[Wu,D.Y., et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86: 2757-2760(1989)]、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaqDNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用したTaqMan PCR法等によって、遺伝子多型解析を行なうことができる。
【００１１】
例えば、アレル特異的PCRを用いて、SCNN1A遺伝子の多型解析を行う場合を以下に説明する。本方法は、より詳細にはプライマーの3’末端に一塩基のミスマッチがあるとプライマーのアニーリングが良好に起こらなくなり、結果としてPCRによる増幅が生じないことを利用した方法である。この方法の成否に大きな影響を及ぼすのは、プライマーの3’末端のミスマッチである。そこで、プライマーを3’末端に変異がくるように設計することで、アレルの型により増幅の可否が決定されるため、アレル特異的PCRによれば増幅産物の有無によりアレルの型が確認できる。アレル特異的PCRにおけるこのようなプライマーの設計は、ヒトSCNN1A遺伝子の公知の塩基配列に基づいて行うことができる。ヒトSCNN1A遺伝子の第2139番目の塩基が、アデニン及びグアニンのいずれであるのかタイピングする場合のプローブ及びプライマーの例としては、5’-cagcgctggccacatcctccctgca-3’（配列番号２）及び5’-cagcgctggccacatcctccctgcg-3’（配列番号３）に示す塩基配列を有するものが挙げられる。配列番号２及び配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーはその3’末端の塩基が相違している。これらのプライマーと、適宜選択した逆方向のプライマー、例えば、5’-ctggtccctcctctttcctgctgat-3’（配列番号４）に示す塩基配列を有するプライマーとを組合わせてPCRを行い、配列番号２及び配列番号４のプライマーでPCRを行った場合のみ300bpの増幅産物が確認された場合はAA型、配列番号３及び配列番号４のプライマーでPCRを行った場合のみ300bpの増幅産物が確認された場合はGG型、両方の場合で増幅産物が確認された場合はAG型と判定することができる。
【００１２】
また、TaqMan PCR法の原理を図２に示した。TaqMan PCR法は蛍光標識したアレル特異的オリゴ（TaqManプローブともいう）とTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である。TaqMan PCR法で用いるアレル特異的オリゴは約20塩基程度の長さであり、5’末端はFAMやTETやVIC等の蛍光レポーター色素（R）によって標識され、一方3’末端はクエンチャー（Q）によって標識されている。この状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出できない。本法ではPCR反応を同時に行なうが、TaqManプローブの3’末端はリン酸化されているためTaqManプローブからのDNA鎖伸長は起こらない。しかし、このTaqManプローブをSNPを含む領域を増幅するように設計したプライマーとTaqDNAポリメラーゼとともにPCR反応を行なうと、まずTaqManプローブが鋳型DNAの特異的な配列にハイブリダイゼーションし、同時にPCRプライマーから伸長反応が起こる。しかしこの際、TaqDNAポリメラーゼは5’ヌクレアーゼ活性を有しているため、PCRプライマーの伸長反応が進む際にハイブリダイゼーションをしたTaqManプローブを切断する。TaqManプローブが切断されると蛍光色素がクエンチャーの影響を受けなくなり蛍光を検出できるようになる。
【００１３】
例えば、図２のように、SNP部位がアデニン（Ａ）のアレル１とグアニン（Ｇ）のアレル２が存在する場合、アレル１に特異的なTaqManプローブはFAM（Ｒ1）で、アレル２に特異的なTaqManプローブはTET（Ｒ2）で標識する。この２種類のアレル特異的オリゴをPCR試薬に同時に添加し、タイピングの対象となる鋳型とTaqManPCR反応を行なう。その後、蛍光検出器にてFAM及びTETの蛍光強度を測定する。その結果、鋳型がアレル１のホモ接合型ならばFAMの強い蛍光強度が検出され、TETの蛍光は殆ど検出されない。アレル１とアレル２のヘテロ接合体ならば、FAMとTET両者の蛍光が検出される。アレル２のホモ接合型ならばTETの強い蛍光強度が検出でき、FAMの蛍光は殆ど検出されない。このようにして対象サンプルのSNPタイピングをすることができる。
【００１４】
解析の結果、ヒトSCNN1A遺伝子中の配列番号１の塩基配列で表される第2139番目の塩基の種類がAG型又はGG型である場合には、当該被検者は高血圧症又は
蛋白尿関連疾患に罹患し易いと判定することができ、当該塩基の種類がAA型である場合には、当該被検者は高血圧症又は蛋白尿関連疾患に罹患し難いと判定することができる。腎臓に障害が加わった場合（慢性糸球体腎炎など）、食塩感受性が高いと考えられるAG型又はGG型のヒトでは、糸球体内圧が上昇しやすく、結果として、蛋白尿に代表される腎機能障害が顕在化しやすいといえる。また、AG型又はGG型のヒトでは利尿薬による降圧効果、あるいは減塩による降圧効果があると考えられ、一方、AA型のヒトに利尿剤を投与すると脱水や電解質異常などの副作用が出やすいといえる。
【００１５】
上記のヒトSCNN1A遺伝子のプロモーター領域の前記第2139番塩基G/A多型をタイピングするためのプライマー及び蛍光標識プライマーを主要構成要素として含むキットも本発明の好ましい実施態様である。以下に、多型タイピング用キットの具体的構成例を示した。
〔第2139番塩基G/A多型タイピング用キット〕
▲１▼ 配列番号２５の塩基配列を含むプライマー
▲２▼ 配列番号２６の塩基配列を含むプライマー
▲３▼ 配列番号２７の塩基配列を含むＡ型検出用蛍光標識プローブ
▲４▼ 配列番号２８の塩基配列を含むＧ型検出用蛍光標識プローブ
以上の構成要素には、さらに必要に応じて、各ヌクレオチド混液、酵素反応停止溶液、希釈溶液等を追加補充することができる。
【００１６】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕 ヒトSCNN1A遺伝子中の多型の検出
白血球由来のDNAは、1996年５月から1998年２月までの間に国立循環器病センターを訪れたヒトから集めた血液から抽出した。ここで、血液を提供したヒトは全て日本人であり、アミロライド感受性ナトリウムチャネル遺伝子の遺伝子解析に書面で同意した（インフォームドコンセントを得た）ヒトのみについて以下の解析を行った。
【００１７】
まず、ヒトSCNN1A遺伝子中の多型の検出を試みた。インフォームドコンセントを得た32人（高血圧の24人と高血圧ではない８人）の白血球から常法に従ってDNAを採取した。得られたDNAサンプルを鋳型とし、表１のプライマーを用いて各領域をPCRにより増幅した。
【表１】
得られた増幅産物は、モデルABI3700遺伝子アナライザーにより、塩基配列の決定を行った。その結果、表２に記載の多型が検出された。
【表２】
表２において、アレル頻度は32人分のシークエンスに基づいて計算したものである。表２に示したように、SCCN1A遺伝子のプロモーター領域に４つの多型、エクソン領域に３つの多型、イントロンに１つの多型が見出された。G2139アレルは、32人分のシークエンスによれば、G2765アレルと完全に一致しており、連鎖不平衡していることが判明した。また、G(2139)A多型はG(3091)A多型と強い連鎖不均衡していることも判明した。また、第１エクソンのG(3091)A多型はｍRNAの5'非コード化領域にあり、第1イントロンのG(3134)A多型は第1エクソンのスプライスドナー部位から5bp離れた位置に存在していた。
【００２０】
〔実施例２〕 アソシエーションスタディー
インフォームドコンセントを得た男女30歳〜79歳の3989人から採取した血液由来のDNAサンプルを用いて、実施例１において検出された多型のうち、プロモーター領域に存在する第1144番塩基A/G多型及び第2139番塩基G/A多型、第１エクソン上に存在する第3091番塩基G/A多型、第１イントロン上に存在する第3134番塩基G/C多型、第６エクソン上に存在する第1193番塩基G/A多型、及び第13エクソン上に存在する第1529番塩基G/A多型のSNPタイピングを行った。なお、SNPタイピングは、表３に記載のプローブセット及びプライマーセットを用い、TaqManシステム（PEアプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。
【表３】
一方、各被検者の生理生化学的パラメーターは以下のようにして求めた。まず、血圧は座位で最低10分間休息後測定した。収縮期、拡張期の血圧値は二人の医師による測定結果の平均とした（３分の間隔を空けた）。尿蛋白の検出限界は30mg/dlであった。「高血圧である」とは、収縮期血圧が140mmHg以上又は拡張期血圧が90mmHg以上、あるいは抗高血圧薬を服用していることと定義した。また、「糖尿病である」とは、空腹時血糖が140mg/dl以上、あるいは血糖降下薬を服用していることと定義した。表４に全被験者の生理生化学的パラメーターを示した。
【表４】
BMI、年齢、アルコール消費量を独立変数として含む被験者のデータを多重算定解析した。その結果、G(1144)A、G(3134)C、G(1193)AおよびG(1529)A多型の血圧への明らかな影響はなかった。しかしながら、G(2139)AとG(3091)A多型は明らかに血圧に影響を及ぼしていた。血圧とG(3091)A多型の関係は、G(2139)AとG(3091)A多型間にある強い連鎖不均衡に由来するものと推測される。従って、被験者全員のG(2139)A多型を調べた。
【００２３】
表４から明らかなように、G(2139)A多型（AA=1、GA+GG=2）は、肥満指数（BMI）、ウエスト／ヒップ比（W/H）、降圧剤の治療を受けている人の割合（AHT）、収縮期及び拡張期血圧に影響を与えることが判明した。すなわち、G(2139)AのG/A多型（第2139番塩基G/A多型）がAG型又はGG型の人は、AA型の人に比べて、AHTが高値を示した。さらに、第2139番塩基G/A多型は尿蛋白と密接に関わっていることが分かった。すなわち、第2139番塩基G/A多型がAG型又はGG型の人は、AA型の人に比べて、蛋白尿が出やすいことが判明した。
【００２４】
一般的に、高齢層の表現型は環境因子に強く影響を受け、遺伝的影響は若年層の方が明らかであることから、若年層についての遺伝子型の影響を解析した。表５は、年齢60歳未満の被験者の生理生化学的パラメーターを第2139番塩基G/A多型の各型ごとに示したものである。
【表５】
表５から明らかなように、第2139番塩基G/A多型は、収縮期及び拡張期血圧に影響を及ぼしていることが判明した。すなわち、第2139番塩基G/A多型が、AG型又はGG型の人は、AA型の人よりも、収縮期及び拡張期血圧が高いことが判明した。特に、年齢、性別、G(2139)AのA/G多型を独立変数として含む多重算定解析によると、G(2139)AのA/G多型がAG型又はGG型である被検者の高血圧についてのオッズ比は2.15であった。これは、G(2139)AのA/G多型がAG型又はGG型である人は、AA型である人に比べて2.15倍高血圧症に罹患し易いことを意味している。また、前記のように、第2139番塩基G/A多型は蛋白尿と強い相関が見られた（P＜0.0001）。以上より、第2139番塩基G/A多型を指標として、高血圧症及び蛋白尿関連疾患への易罹患性を判定することが可能であることが判明した。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、高血圧症又は蛋白尿関連疾患に対する易罹患性の判定方法が提供される。本判定方法は、生活習慣病発症の予防に有用である。
【００２７】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号１０：合成DNA
配列番号１１：合成DNA
配列番号１２：合成DNA
配列番号１３：合成DNA
配列番号１４：合成DNA
配列番号１５：合成DNA
配列番号１６：合成DNA
配列番号１７：合成DNA
配列番号１８：合成DNA
配列番号１９：合成DNA
配列番号２０：合成DNA
配列番号２１：合成DNA
配列番号２２：合成DNA
配列番号２３：合成DNA
配列番号２４：合成DNA
配列番号２５：合成DNA
配列番号２６：合成DNA
配列番号２７：合成DNA
配列番号２８：合成DNA
配列番号２９：合成DNA
配列番号３０：合成DNA
配列番号３１：合成DNA
配列番号３２：合成DNA
配列番号３３：合成DNA
配列番号３４：合成DNA
配列番号３５：合成DNA
配列番号３６：合成DNA
配列番号３７：合成DNA
配列番号３８：合成DNA
配列番号３９：合成DNA
配列番号４０：合成DNA
配列番号４１：合成DNA
配列番号４２：合成DNA
配列番号４３：合成DNA
配列番号４４：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトSCNN1A遺伝子における第2139番塩基G/A多型の位置を示した模式図である。
【図２】 TaqManPCRによるSNPタイピングの原理を示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for analyzing a genetic polymorphism of a subject and determining a subject's susceptibility to hypertension or a proteinuria-related disease based on the analysis result.
[0002]
[Prior art]
An antihypertensive agent that is highly effective for hypertensive patients has been developed, and it has become relatively easy to treat severe hypertension such as malignant hypertension, which has been difficult to control. However, in the case of essential hypertension or the like, if the use of the antihypertensive agent is stopped, the blood pressure immediately returns to the original blood pressure, and generally does not have a curative effect like a therapeutic agent for other diseases. On the other hand, it is widely known that in patients with hypertension, reducing salt intake is extremely effective in lowering blood pressure, and a low-salt diet is often used in combination with the use of antihypertensive drugs. In particular, in the case of mild hypertension, only low-salt diet therapy is often used regardless of drug therapy. Several therapeutic trials have confirmed that even mild salt restriction can produce an effective antihypertensive effect. For this reason, in the case of hypertension, it has become common knowledge to eat to limit the intake of salt.
[0003]
However, the effect of a low-salt diet has a problem of salt sensitivity on the side of patients receiving low-salt. For example, even in severe salt-reduction therapy with a salt amount of 0.5 g or less per day, it is effective in about 2/3 patients. However, there is also a report that antihypertensive was not observed in the remaining 1/3 patients. Among the same patients with essential hypertension, there are those whose blood pressure is sensitive to changes in salt intake and those who are not. In people who are easily affected, the sodium excretion ability of the kidney is reduced, or the sodium reabsorption ability in the kidney is high, so it is thought that blood pressure rises as a result of sodium accumulation in the body due to salt loading. These differences in sodium excretion / reabsorption ability are not completely revealed, but ultimately based on individual genetic polymorphisms (small differences in the base sequences that make up each person's genome) It is thought that a considerable part can be explained.
[0004]
The gene polymorphism has been clarified with the recent rapid progress in genome analysis. Among gene polymorphisms, there are a type in which 2 to several bases are inserted or deleted together, and a type in which a long DNA fragment is inserted or deleted. What is called is a type called so-called single nucleotide polymorphism (SNP) in which one base is substituted with another base. There are about 3 million SNPs on the human genome. Some SNPs have already been associated with disease susceptibility, and SNP has been regarded as important as a diagnostic index for realizing optimal medical care (tailor-made medicine) for each person. For example, in relation to hypertension, the Met235Thr polymorphism in the second exon of the angiotensinogen (AGT) gene is a meta-analysis of 69 articles. It is easy to become [Staessen JA et al .: J. Hypertens. 17: 9-17 (1999)], and it has been reported that the strength depends on the intake of salt. Therefore, it is considered that salt reduction therapy is effective for Thr / Thr homopolymorphic hypertensive patients. However, lifestyle-related diseases such as hypertension are multifactorial diseases and cannot be explained by a single genetic polymorphism. In the future, in order to realize tailor-made medical care for hypertension, it is extremely important to clarify the whole picture of genetic polymorphisms that are genetic predisposing factors for the development of hypertension.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for analyzing a human SCNN1A gene polymorphism and determining a subject's susceptibility to hypertension or proteinuria-related diseases based on the analysis result.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a specific polymorphism present in the human SCNN1A gene has an effect on blood pressure and urine protein content, and the present invention It came to be completed.
That is, the present invention includes the following (1) to (3).
(1) A method for determining a subject's susceptibility to hypertension, the following steps:
(a) collecting a biological sample containing genomic DNA from the subject,
(b) a base at a position corresponding to the 2139th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 including the promoter region of the human SCNN1A gene present on the genomic DNA in the biological sample obtained in step (a) Determining the type of
(c) determining the susceptibility to hypertension of the subject based on the result obtained in step (b),
A method for determining the susceptibility of a subject to hypertension, comprising:
(2) When determining the subject's susceptibility to hypertension when the type of the 2139th base represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the human SCNN1A gene is GA type or GG type The subject is determined to be susceptible to hypertension, and if the base type is AA type, the subject should be determined based on the criteria for determining that the subject is unlikely to suffer from hypertension. (1) The method for determining the susceptibility of a subject to hypertension according to (1) above.
(3) Primer containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25, primer containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26, fluorescent labeling probe for type A detection containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27, and G-type detection containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 A kit for single nucleotide polymorphism typing at position 2139 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 containing the promoter region of the human SCNN1A gene, comprising a fluorescent labeled probe for use as a main component.
[0007]
(4) A method for determining a subject's susceptibility to proteinuria-related diseases, comprising the following steps:
(a) collecting a biological sample containing genomic DNA from the subject,
(b) a base at a position corresponding to the 2139th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 including the promoter region of the human SCNN1A gene present on the genomic DNA in the biological sample obtained in step (a) Determining the type of
(c) based on the result obtained in step (b), determining the susceptibility of the subject to proteinuria-related diseases,
A method for determining the susceptibility of a subject to a proteinuria-related disease.
(5) When determining the susceptibility of a subject to proteinuria-related disease, when the type of the 2139th base represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the human SCNN1A gene is GA type or GG type The subject is determined to be susceptible to proteinuria-related diseases, and if the base type is AA type, the subject is determined to be less likely to suffer from proteinuria-related diseases. (4) The method for determining the susceptibility of a subject to a proteinuria-related disease according to (4), which is performed based on a criterion.
(6) The method for determining the susceptibility of a subject to a proteinuria-related disease according to (4) or (5) above, wherein the proteinuria-related disease is kidney disease.
(7) The method for determining the susceptibility of a subject to a proteinuria-related disease according to (6) above, wherein the kidney disease is nephritis, nephrotic syndrome, nephrosclerosis, glomerulonephritis, membranous nephropathy or renal tumor.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The detection method of the present invention is characterized by analyzing a specific polymorphism of the human SCNN1A gene and determining the subject's susceptibility to hypertension or proteinuria-related diseases based on the analysis results. Here, the “human SCNN1A gene” encodes the α subunit of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel, is mapped to the position of 13.3 of human chromosome 12, and is registered as GenBank accession number AF060910. A gene that contains. “Proteinuria-related disease” refers to a disease in which an amount of protein determined to be abnormal in the urine when the disease occurs (eg, nephritis, nephrotic syndrome, nephrosclerosis, glomerulonephritis, membrane Renal tumors such as nephropathy). “Susceptibility” refers to the susceptibility to each disease.
[0009]
In the present invention, the polymorphism serving as a reference for determining susceptibility to hypertension or proteinuria-related diseases corresponds to the 2139th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 containing the promoter region of the SCNN1A gene. It is a single nucleotide polymorphism at the position (also called the 2139th nucleotide G / A polymorphism). In addition, the existence site of the 2139th base G / A polymorphism in the SCNN1A gene is schematically shown in FIG. As shown in FIG. 1, the 2139th nucleotide G / A polymorphism is present in the promoter region of the SCNN1A gene. The base at this site is currently confirmed to be adenine (A) or guanine (G). Since human chromosomal DNA has each pair derived from parents, the 2nd nucleotide base G / A polymorphism in the subject is AA type (A homozygous type of A) where both SCNN1A genes of both chromosomes are adenine. There are three types, one is adenine and the other is guanine, AG type (A and G heterozygous type), and both chromosomes are guanine GG type (G homozygous type) . SEQ ID NO: 1 shows the full-length sequence when the 2139th base of the SCNN1A gene is adenine.
[0010]
The SCNN1A gene polymorphism analysis method is not particularly limited as long as the above polymorphism can be distinguished, and various known gene polymorphism analysis methods can be employed. For example, chromosomal DNA is extracted from samples such as blood cells and oral mucosa cells collected from a subject, and PCR is performed using primers designed to amplify a portion containing the target polymorphism using this as a template. Allele-specific PCR method using the method of analyzing the nucleotide sequence of the obtained PCR product and other methods that do not function as a primer if there is a mismatch at the 3 'end of the PCR primer [Wu , DY, et al .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86: 2757-2760 (1989)], by TaqMan PCR method using fluorescence-labeled allele-specific oligo and PCR reaction with TaqDNA polymerase, etc. Genetic polymorphism analysis can be performed.
[0011]
For example, the case where polymorphism analysis of the SCNN1A gene is performed using allele-specific PCR is described below. More specifically, this method is based on the fact that primer annealing does not occur satisfactorily when there is a single-base mismatch at the 3 ′ end of the primer, resulting in no PCR amplification. It is a mismatch at the 3 ′ end of the primer that greatly affects the success or failure of this method. Therefore, by designing the primer so that the mutation is at the 3 ′ end, whether or not amplification is possible is determined by the allele type. Therefore, according to the allele-specific PCR, the allele type can be confirmed by the presence or absence of the amplification product. Such primer design in allele-specific PCR can be performed based on the known nucleotide sequence of the human SCNN1A gene. Examples of probes and primers for typing whether the 2139th base of the human SCNN1A gene is adenine or guanine include 5'-cagcgctggccacatcctccctgca-3 '(SEQ ID NO: 2) and 5'-cagcgctggccacatcctccctgcg-3 One having a base sequence represented by '(SEQ ID NO: 3) is exemplified. Primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 are different in the base at the 3 ′ end. PCR is carried out by combining these primers with a primer of an appropriately selected reverse direction, for example, a primer having the base sequence shown in 5′-ctggtccctcctctttcctgctgat-3 ′ (SEQ ID NO: 4). SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 When a 300 bp amplification product is confirmed only when PCR is performed with the primers of No. AA, and when a 300 bp amplification product is confirmed only when PCR is performed with the primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, the GG type is obtained. When the amplification product is confirmed in both cases, it can be determined as AG type.
[0012]
The principle of the TaqMan PCR method is shown in FIG. The TaqMan PCR method uses a fluorescently labeled allele-specific oligo (also referred to as TaqMan probe) and a PCR reaction with Taq DNA polymerase. The allele-specific oligo used in TaqMan PCR has a length of about 20 bases, the 5 'end is labeled with a fluorescent reporter dye (R) such as FAM, TET, or VIC, while the 3' end is a quencher (Q ). In this state, fluorescence cannot be detected because the quencher absorbs fluorescence energy. In this method, the PCR reaction is carried out at the same time. However, since the 3 ′ end of the TaqMan probe is phosphorylated, DNA chain elongation from the TaqMan probe does not occur. However, if this TaqMan probe is PCR-combined with a primer designed to amplify the SNP-containing region and TaqDNA polymerase, the TaqMan probe will first hybridize to a specific sequence of the template DNA and simultaneously extend from the PCR primer. Happens. However, since Taq DNA polymerase has 5 ′ nuclease activity at this time, the hybridized TaqMan probe is cleaved when the PCR primer extension reaction proceeds. When the TaqMan probe is cleaved, the fluorescent dye is not affected by the quencher and fluorescence can be detected.
[0013]
For example, as shown in FIG. 2, when allele 1 of the adenine (A) and allele 2 of guanine (G) are present in the SNP site, the TaqMan probe specific to allele 1 is FAM (R1) and specific to allele 2 A typical TaqMan probe is labeled with TET (R2). These two types of allele-specific oligos are simultaneously added to the PCR reagent, and a TaqMan PCR reaction is performed with the template to be typed. Thereafter, the fluorescence intensity of FAM and TET is measured with a fluorescence detector. As a result, if the template is a homozygous type of allele 1, the strong fluorescence intensity of FAM is detected, and the fluorescence of TET is hardly detected. If it is a heterozygote of allele 1 and allele 2, the fluorescence of both FAM and TET is detected. If allele 2 is homozygous, strong fluorescence intensity of TET can be detected, and FAM fluorescence is hardly detected. In this way, the target sample can be SNP typed.
[0014]
As a result of the analysis, when the type of the 2139th base represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the human SCNN1A gene is AG type or GG type, the subject is hypertensive or proteinuria related disease If the type of the base is AA type, it can be determined that the subject is unlikely to suffer from hypertension or proteinuria-related disease. When the kidneys are damaged (eg, chronic glomerulonephritis), the glomerular pressure tends to increase in AG or GG humans, which are considered to be highly salt-sensitive, and as a result, renal function typified by proteinuria It can be said that obstacles are easily manifested. In addition, anti-hypertensive effects due to diuretics or hypotensive effects due to salt reduction are considered to be effective in AG-type or GG-type humans, while side effects such as dehydration and electrolyte abnormalities are likely to occur when diuretics are administered to AA-type humans. It can be said.
[0015]
A kit comprising a primer for typing the 2139th base G / A polymorphism of the promoter region of the human SCNN1A gene and a fluorescently labeled primer as a main component is also a preferred embodiment of the present invention. A specific configuration example of the polymorphic typing kit is shown below.
[No. 2139 base G / A polymorphic typing kit]
(1) Primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 25 (2) Primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 26 (3) Fluorescent labeled probe for type A detection containing the base sequence of SEQ ID NO: 27 (4) Base of SEQ ID NO: 28 The components including the G-type detection fluorescently labeled probe including the sequence can be additionally supplemented with a mixture of nucleotides, an enzyme reaction stop solution, a diluted solution, or the like as necessary.
[0016]
【Example】
Examples of the present invention will be specifically described below, but the scope of the present invention is not limited thereto.
[Example 1] Detection of polymorphism in human SCNN1A gene DNA derived from leukocytes was extracted from blood collected from humans who visited the National Cardiovascular Center between May 1996 and February 1998. Here, all humans who donated blood were Japanese, and the following analysis was performed only for humans who agreed in writing to the gene analysis of the amiloride-sensitive sodium channel gene (obtained informed consent).
[0017]
First, detection of a polymorphism in the human SCNN1A gene was attempted. DNA was collected from white blood cells of 32 people (24 people with high blood pressure and 8 people without high blood pressure) who obtained informed consent according to a conventional method. Using the obtained DNA sample as a template, each region was amplified by PCR using the primers shown in Table 1.
[Table 1]
The obtained amplification product was subjected to nucleotide sequence determination using a model ABI3700 gene analyzer. As a result, the polymorphisms listed in Table 2 were detected.
[Table 2]
In Table 2, the allele frequency is calculated based on the sequence for 32 people. As shown in Table 2, four polymorphisms were found in the promoter region of the SCCN1A gene, three polymorphisms in the exon region, and one polymorphism in the intron. According to the sequence of 32 people, the G2139 allele was found to be in perfect agreement with the G2765 allele and to be in linkage disequilibrium. It was also found that the G (2139) A polymorphism is in strong linkage disequilibrium with the G (3091) A polymorphism. The G (3091) A polymorphism of the first exon is in the 5 'non-coding region of the mRNA, and the G (3134) A polymorphism of the first intron is 5 bp away from the splice donor site of the first exon. Existed.
[0020]
[Example 2] Among the polymorphisms detected in Example 1, using DNA samples derived from blood collected from 3989 men and women aged 30 to 79 who obtained association study informed consent. 1144 base A / G polymorphism and 2139 base G / A polymorphism, 3091 base G / A polymorphism present on the first exon, 3134 base G present on the first intron SNP typing of the / C polymorphism, the 1193th base G / A polymorphism present on the 6th exon, and the 1529th base G / A polymorphism present on the 13th exon was performed. SNP typing was carried out using the TaqMan system (PE Applied Biosystems) using the probe set and primer set shown in Table 3.
[Table 3]
On the other hand, physiological biochemical parameters of each subject were determined as follows. First, blood pressure was measured after a minimum of 10 minutes rest in the sitting position. The systolic and diastolic blood pressure values were the average of the results of measurements by two doctors (with an interval of 3 minutes). The detection limit of urine protein was 30 mg / dl. “High blood pressure” was defined as systolic blood pressure of 140 mmHg or higher, diastolic blood pressure of 90 mmHg or higher, or taking an antihypertensive drug. Also, “being diabetic” was defined as fasting blood glucose of 140 mg / dl or higher, or taking a hypoglycemic drug. Table 4 shows the physiological biochemical parameters of all subjects.
[Table 4]
Data on subjects including BMI, age, and alcohol consumption as independent variables were subjected to multiple calculation analysis. As a result, there was no obvious effect on the blood pressure of G (1144) A, G (3134) C, G (1193) A and G (1529) A polymorphisms. However, G (2139) A and G (3091) A polymorphisms clearly affected blood pressure. The relationship between blood pressure and the G (3091) A polymorphism is presumed to originate from a strong linkage disequilibrium between the G (2139) A and G (3091) A polymorphisms. Therefore, the G (2139) A polymorphism of all subjects was examined.
[0023]
As is clear from Table 4, G (2139) A polymorphism (AA = 1, GA + GG = 2) is treated with body mass index (BMI), waist / hip ratio (W / H), antihypertensive agent The percentage of people who are affected (AHT), systolic and diastolic blood pressure was found to be affected. That is, the G / A polymorphism of G (2139) A (No. 2139 base G / A polymorphism) was AG type or GG type, and AHT was higher than that of AA type. Furthermore, the 2139th base G / A polymorphism was found to be closely related to urine protein. That is, it was found that the proteinuria is more likely to occur in the 2139th base G / A polymorphism of the AG type or GG type than in the AA type.
[0024]
In general, the phenotype of the elderly group is strongly influenced by environmental factors, and the genetic effect is clearer in the younger group, so we analyzed the effect of the genotype on the younger group. Table 5 shows the physiological biochemical parameters of subjects under the age of 60 for each type of the 2139th base G / A polymorphism.
[Table 5]
As is clear from Table 5, the 2139th base G / A polymorphism was found to affect systolic and diastolic blood pressure. That is, it was found that the 2139th base G / A polymorphism of AG type or GG type has higher systolic and diastolic blood pressure than AA type. In particular, according to multiple count analysis including age, gender, G (2139) A A / G polymorphism as an independent variable, subjects whose G (2139) A A / G polymorphism is AG type or GG type The odds ratio for hypertension was 2.15. This means that a person whose A / G polymorphism of G (2139) A is AG or GG is 2.15 times more susceptible to hypertension than a person who is AA. Further, as described above, the 2139th nucleotide G / A polymorphism was strongly correlated with proteinuria (P <0.0001). From the above, it was found that the susceptibility to hypertension and proteinuria-related diseases can be determined using the 2139th base G / A polymorphism as an index.
[0026]
【The invention's effect】
The present invention provides a method for determining susceptibility to hypertension or proteinuria-related diseases. This determination method is useful for preventing the development of lifestyle-related diseases.
[0027]
[Sequence Listing]
[Sequence Listing Free Text]
Sequence number 2: Synthetic DNA
Sequence number 3: Synthetic DNA
Sequence number 4: Synthetic DNA
Sequence number 5: Synthetic DNA
Sequence number 6: Synthetic DNA
Sequence number 7: Synthetic DNA
Sequence number 8: Synthetic DNA
Sequence number 9: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 10: synthetic DNA
SEQ ID NO: 11: synthetic DNA
SEQ ID NO: 12: synthetic DNA
SEQ ID NO: 13: synthetic DNA
SEQ ID NO: 14: synthetic DNA
SEQ ID NO: 15: synthetic DNA
SEQ ID NO: 16: synthetic DNA
Sequence number 17: Synthetic DNA
Sequence number 18: Synthetic DNA
Sequence number 19: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 20: synthetic DNA
SEQ ID NO: 21: synthetic DNA
Sequence number 22: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 23: synthetic DNA
SEQ ID NO: 24: synthetic DNA
SEQ ID NO: 25: synthetic DNA
SEQ ID NO: 26: synthetic DNA
SEQ ID NO: 27: synthetic DNA
SEQ ID NO: 28: synthetic DNA
SEQ ID NO: 29: synthetic DNA
SEQ ID NO: 30: synthetic DNA
SEQ ID NO: 31: synthetic DNA
SEQ ID NO: 32: synthetic DNA
SEQ ID NO: 33: synthetic DNA
SEQ ID NO: 34: Synthetic DNA
Sequence number 35: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 36: synthetic DNA
SEQ ID NO: 37: synthetic DNA
SEQ ID NO: 38: synthetic DNA
SEQ ID NO: 39: synthetic DNA
SEQ ID NO: 40: synthetic DNA
SEQ ID NO: 41: synthetic DNA
SEQ ID NO: 42: synthetic DNA
SEQ ID NO: 43: synthetic DNA
SEQ ID NO: 44: synthetic DNA
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the position of the 2139th nucleotide G / A polymorphism in the human SCNN1A gene.
FIG. 2 is a diagram showing the principle of SNP typing by TaqManPCR.
Claims (7)
（ａ）当該被検者由来のゲノムＤＮＡ上に存在する、ヒトＳＣＮＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域を含む配列番号１で表される塩基配列の第２１３９番目の塩基に相当する位置の塩基の種類を決定する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）において得られた結果に基づいて、当該被検者の高血圧症への易罹患性を判定する工程、
を包含することを特徴とする前記高血圧症への被検者の易罹患性判定方法。A method for determining the susceptibility of a subject to hypertension, the following steps:
(A) The kind of base at the position corresponding to the 2139th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 containing the promoter region of the human SCNN1A gene present on the genomic DNA derived from the subject is determined. Process, and
(B) a step of determining the subject's susceptibility to hypertension based on the result obtained in step (a) ,
A method for determining the susceptibility of a subject to hypertension, comprising:
（ａ）当該被検者由来のゲノムＤＮＡ上に存在する、ヒトＳＣＮＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域を含む配列番号１で表される塩基配列の第２１３９番目の塩基に相当する位置の塩基の種類を決定する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）において得られた結果に基づいて、当該被検者の蛋白尿関連疾患への易罹患性を判定する工程、
を包含することを特徴とする前記蛋白尿関連疾患への被検者の易罹患性判定方法。A method for determining a subject's susceptibility to a proteinuria-related disease, comprising the following steps:
(A) The kind of base at the position corresponding to the 2139th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 containing the promoter region of the human SCNN1A gene present on the genomic DNA derived from the subject is determined. Process, and
(B) based on the result obtained in step (a) , determining the susceptibility of the subject to a proteinuria-related disease,
A method for determining the susceptibility of a subject to a proteinuria-related disease.
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