JP4040834B2

JP4040834B2 - Method for analyzing double-stranded DNA

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Publication number: JP4040834B2
Application number: JP2000332249A
Authority: JP
Inventors: 幸夫須藤; 快彦牧野
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2000-10-31
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2020-10-31
Also published as: JP2002139491A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中に存在する２本鎖核酸（特には、２本鎖ＤＮＡ）を分析する方法に関し、検体中に存在する２本鎖核酸の存在量を定量する方法にも関する。また、本発明は、遺伝子解析に応用された場合、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）等の遺伝子多型の分析及び解析にも利用できる。また、本発明は、検体中に存在するウイルス、菌体などに由来する外来遺伝子群を検出する手法にも利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
標的となる核酸試料、または標的核酸試料と相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ断片である核酸プローブのいずれか一方を固相に固定し、これとの間でハイブリダイゼーション反応を行う方法は、１９７５年にE.M.Southernにより開発され、いわゆるサザンブロッティング法として多用されてきている(J.Mol.Biol 98,503(1975))。サザンブロッティング法では、核酸試料を電気泳動した後にニトロセルロースやナイロン膜などに固定し、相補的な配列をもつ核酸プローブと接触することになる。
【０００３】
この方法とは逆に、核酸プローブを固定化し、標的核酸と接触させることにより、標的核酸量を測定する方法も開発され、遺伝子解析や、遺伝子診断等に利用されてきている。また、Southern等は多数の核酸プローブをアレイ状に支持体に固定化したＤＮＡアレイを開発し、ガラス支持体上のＤＮＡがその相補的なＤＮＡと結合することを実証した。また、Affymax社は、Southernの考え方と、Photoresist法によるＤＮＡ固相合成技術の組み合わせによりＤＮＡアレイの高密度化技術の開発に成功し、GeneChipの形で商品化されるに至っている(S. Fodor; Science 277, 393(1997)、Nature Genetics Supplement 21,20(1999))。
【０００４】
このように、ハイブリダイゼーションを用いるＤＮＡの検出方法は、大きく進歩してきている。しかしながら、上記した分析方法は、ｍＲＮＡ等の１本鎖核酸の検出には極めて有効であるものの、２本鎖核酸を検出するためには、ハイブリダイゼーション前に検体中の２本鎖核酸を熱変性し、１本鎖にするという煩雑な操作が必要となる。
【０００５】
例えば、分析の対象がゲノム中のＤＮＡである場合、対象ＤＮＡは２本鎖を形成している。例えば、P.N.Gillies等は電気アドレス法で(Nature Biotechnology,17,365(1999))、また、R.J.Cho等は高密度オリゴＤＮＡアレイにより(Nature Genetics 23,203(1999))、ＳＮＰの検出を行っている。しかし、いずれの場合も、ＤＮＡの測定のためには、検体中の標的ＤＮＡ部分をＰＣＲで増幅したのち、熱変性により１本鎖に変性するという煩雑な操作を行う必要がある。
【０００６】
一方、２本鎖ＤＮＡを検出する方法として、インターカレーターが知られている。特許第２５７３４４３号公報には、インターカレーターを用いるＤＮＡの検出方法が開示されているが、この方法でも、固定化されたＤＮＡと反応させるために２本鎖ＤＮＡを予め１本鎖に変性する必要があった。
【０００７】
上記欠点を改良する技術として、２本鎖核酸を直接検出する技術が開発された。（特願２０００−３２５１３６号）。この発明では支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質に検体を接触させ、該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡを測定することにより、２本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま分析することが可能になることを見出している。しかしながら、この方法を用いても、反応時間をさらに短縮する必要が生じることがあった。
【０００８】
固定化された１本鎖ＤＮＡを溶液中の検体ＤＮＡと反応させるいわゆるＤＮＡハイブリダイゼーション法による検出法において、反応速度を促進する方法はすでに開発されている。例えば、反応場に電場をかけハイブリダイゼーション速度を促進できることは、米国特許４７８７９６３号明細書、国際公開ＷＯ９８／１０２７３号公報に開示されている。また、ポリエチレングリコールの添加も反応速度の促進に効果のあることも知られている。
しかしながら、２本鎖核酸を直接検出する反応を加速させる技術は開発されておらず、その開発が必要であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、２本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま分析するための方法において、その反応速度を促進する方法を提供することを課題とした。
本発明はまた、簡便かつ高感度かつ迅速な２本鎖ＤＮＡの分析方法を提供することを解決すべき課題とした。
【００１０】
さらに本発明は、短時間かつ高感度で、ある遺伝子およびその多型を検出する目的に利用できる２本鎖ＤＮＡの分析方法を提供することを解決すべき課題とした。
さらに本発明は、２本鎖認識物質周辺に移送された非特異吸着性２本鎖ＤＮＡを除去することにより、シグナル／ノイズ比を向上させる方法を提供することを解決すべき課題とした。
さらに本発明は、２本鎖認識物質との結合能力の弱い２本鎖ＤＮＡを、２本鎖ＤＮＡ認識物質より引き剥がすことによりＳＮＰ等の解析精度を向上させる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質に検体を接触させ、さらに該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と検体を含む溶液との間に電場をかけることにより支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の２本鎖ＤＮＡとの結合を促進し、その後に該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡを測定することにより、２本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま、かつ反応速度を促進して、２本鎖ＤＮＡを分析することが可能になることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１２】
さらに本発明者らは、２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡの量は、ＤＮＡインターカレーターのような２本鎖挿入剤を用いることにより、高感度で検出することができることを見出した。
さらに本発明者らは、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と該検体との間に電場をかけて支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の２本鎖ＤＮＡとの結合を促進した後に、上記電場とは逆向きの電場をかけることにより、非特異吸着ＤＮＡ及び２本鎖ＤＮＡ認識物質との結合が弱いＤＮＡを除去し、これによりシグナル／ノイズ比を向上できることも見出している。
【００１３】
即ち、本発明によれば、検体中の２本鎖ＤＮＡの分析方法であって、
（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と該検体とを接触させる工程、
（２）検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と該検体との間にかける工程、及び
（３）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡを測定する工程、
を含む上記の分析方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、検体中の２本鎖ＤＮＡの分析方法であって、
（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と該検体とを接触させる工程、
（２）検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と該検体との間にかける工程、
（３）工程（２）における電場とは逆向きの電場をかける工程、及び
（４）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡを測定する工程、
を含む上記の分析方法が提供される。
【００１５】
好ましくは、２本鎖ＤＮＡ認識物質は２本鎖ＤＮＡ認識抗体、ＤＮＡ転写因子、Ｚｎフィンガーモチーフ又はリングフィンガーモチーフを有するタンパク質、あるいはペプチド核酸である。
【００１６】
好ましくは、該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡを測定する工程においては、反応系にＤＮＡ２本鎖を認識する挿入剤を添加し、該２本鎖ＤＮＡに挿入された挿入剤を検出することにより、該検体中の該２本鎖ＤＮＡが測定される。
【００１７】
好ましくは、該挿入剤はＤＮＡインターカレーターである。
好ましくは、該ＤＮＡインターカレーターは電気化学的活性を有し、該ＤＮＡインターカレーターを電気化学的手法により検出することにより、該検体中の該２本鎖ＤＮＡが測定される。
好ましくは、ＤＮＡインターカレーターを、蛍光法、発光法または表面プラズモン法により検出する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による検体中の２本鎖ＤＮＡの分析方法は、
（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と該検体とを接触させる工程、
（２）検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と該検体との間にかける工程、及び
（３）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡを測定する工程、
を含むことを特徴とする。
【００１９】
本明細書で言う「検体」の種類は２本鎖ＤＮＡを含むものであればその種類は特に制限されず、例えば、末梢静脈血のような血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他核酸を含有する任意の試料を用いることができる。検体は上記のような組織細胞などの試料をそのまま使用してもよいが、好ましくは、検体試料中の細胞を破壊して２本鎖ＤＮＡを遊離させたものを検体として使用する。検体試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Triton-X、Tween-20等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。核酸抽出溶液を用いて核酸を溶出する場合には、３７℃以上の温度でインキュベ−トすることにより反応を促進することができる。
【００２０】
本発明では、支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質を使用する。本発明で用いる支持体としては、以下に説明する２本鎖ＤＮＡ認識物質を固定できるものであれば特に制限されない。好ましい支持体の例としては、ガラス、石英、プラスチック、電極等の非多孔性支持体を好ましく用いることができる。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、金もしくはグラシーカーボンを用いることが特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分子によって被覆されていても、単分子膜によって被覆されていてもよい。
また、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜などの多孔性支持体を使用してもよく、非多孔性支持体と多孔性支持体の複合体を使用することもできる。
【００２１】
本発明で用いる２本鎖ＤＮＡ認識物質としては、２本鎖ＤＮＡを認識し、特異的に結合する物質を示す。２本鎖ＤＮＡ認識物質の具体例としては、ＤＮＡ転写因子、ミスマッチ修復タンパク質、２本鎖ＤＮＡ認識抗体、又はペプチド核酸などを挙げることができる。
【００２２】
ＤＮＡ転写因子は、遺伝子上のプロモーター領域に結合して、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を制御する物質である（田村隆明著：転写因子（羊土社１９９５年））。従って、転写因子は特定の配列の２本鎖ＤＮＡに特異的に結合することが知られている。
【００２３】
多数ある転写因子のうち、Zinc Finger ProteinつまりZinc FingerやRing Fingerモチーフをもつ転写因子群は、真核生物における出現率は非常に高く、ゲノム中の１％はこれをコードしているらしい。Pabo等はZinc Figerモチーフの３次構造を解析、ＤＮＡと結合するメカニズムの解明した（Science,252, 809(1991)）。さらに、Choo等は、遺伝子組換法により、特定の配列に結合する自然界にはないZinc Finger Protein群を作製することに成功している(Nature 372,642[1994],PNAS91,11163(1994))。さらに、Scripps Research InstituteのグループはPhage Displayにより新規なZinc Finger Protein群の作製に成功している（PNAS95,2812,[1998]：96,2758(1999)）。このように、Zinc Finger Proteinに代表されるＤＮＡ転写因子群は、本来２本鎖ＤＮＡと結合する性質をもっており、かつ近年の研究によれば、任意のＤＮＡ配列を認識する組換体の作製も可能となってきている。このような、タンパク質を固定化することにより、２本鎖ＤＮＡを効率良く支持体上に捕捉することが可能である。
【００２４】
ミスマッチ修復タンパク質とは、ＤＮＡ２本鎖の間に生じた不適正塩基対（不正またはミス対合）の修復を行う酵素である。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの場合、１０⁸塩基対に１箇所程度の頻度で鋳型ＤＮＡの塩基と対を成さないヌクレオチドを取り込むが、ミスマッチ修復酵素によりこれが修復される。ミスマッチ修復酵素は細胞内で複製直後のＤＮＡに結合して、ミスマッチ塩基対を含む部分のヌクレオチドを除去する。本発明ではミスマッチ修復タンパク質が２本鎖ＤＮＡに結合する性質を利用することにより、該タンパク質を２本鎖ＤＮＡ認識物質として使用することができる。
【００２５】
２本鎖ＤＮＡを認識する抗体が、全身性エリトマトーデスの患者血清中に出現することは良く知られている。抗体作製技術、遺伝子組換技術の進歩により、このような２本鎖ＤＮＡ認識モノクローナル抗体の作製が可能となってきている(Suzuki etal,Int J Mol Med 3,385,1999,Barry etal,J Biol Chem 269,3623(1994))。このような、２本鎖ＤＮＡ認識抗体は、本発明の２本鎖ＤＮＡ認識タンパク質として使用することができる。
【００２６】
ペプチド核酸は、ＤＮＡの骨格構造である糖、リン酸部分をポリアミド骨格で置き換えたもので、ＤＮＡ等と特異的にハイブリダイズし、２本鎖を形成することが知られている（P.E.Nielesen et al, Science, 254, 1497(1991)；遺伝子とバイオテクノロジー：杉本直己著丸善株式会社刊、１９９９年）。ペプチド核酸は機能的にはＤＮＡと殆ど変わりがないが、その構造は全く異なり、ポリアミド骨格を基本としてその分子中に糖及びリン酸を含まない。さらに、ペプチド核酸は、ＤＮＡ−ＤＮＡ鎖内に入りこみ３重鎖を形成することが可能である。本発明ではペプチド核酸のこの性質を利用することにより、ペプチド核酸を２本鎖ＤＮＡ認識物質として使用することができる。
【００２７】
上記した２本鎖ＤＮＡ認識物質は、そのまま支持体上に固定化することができる。具体的には、２本鎖ＤＮＡ認識物質を含む溶液を支持体上に点着し、一定時間放置することにより、２本鎖ＤＮＡ認識物質を支持体上に固定化することができる。
【００２８】
本発明の方法は、（２）検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と該検体との間にかける工程、を含む。
【００２９】
電場をかける方法は特に限定されないが、検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるような向きの電場をかけることが必要である。このような電場をかけることにより、支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の２本鎖ＤＮＡとの結合が促進される。２本鎖ＤＮＡは通常マイナスの電荷を帯びていることから、２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体側に陽極を設置するか、支持体自体を陽極とし、２本鎖ＤＮＡを含む検体（好ましくは、検体は溶液である）中に陰極を設置し、上記陽極と上記陰極の間に電場をかけることにより、支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の２本鎖ＤＮＡとの結合を促進することができる。
【００３０】
検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場の電位差は０〜＋２Ｖの範囲（即ち、支持体側の方が検体液よりも０〜＋２Ｖ電位が高い）であることが好ましい。
本発明の好ましい実施態様の一つとしては、２本鎖ＤＮＡと結合する物質を固定化した電極を作成し、該電極と検体液を接触させ、その後、該電極と検体液の間に電場（電位差）をかける手法が挙げられる。
【００３１】
好ましい一態様によれば、本発明の方法は、
（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と該検体とを接触させる工程、
（２）検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と該検体との間にかける工程、及び
（３）工程（２）における電場とは逆向きの電場をかける工程、
を含む。
ここで工程（２）は上記と同様に行なうことができる。
【００３２】
工程（３）は、工程（２）における電場とは逆向きの電場をかける工程である。即ち、２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体側に陰極を設置するか、または支持体自体を陰極とし、２本鎖ＤＮＡを含む検体（好ましくは、検体は溶液である）中に陽極を設置し、上記陽極と上記陰極の間に電場をかけることにより、支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質周辺の２本鎖ＤＮＡを支持体より除去することができる。このように、上記工程（３）を採用することにより、非特異吸着ＤＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡ認識物質との結合が弱いＤＮＡを支持体より除去することができ、これによりシグナル／ノイズ比を向上させることができる。
【００３３】
逆向きの電位の電位差は０〜−２Ｖの範囲（即ち、該支持体側の方が検体液よりも０〜＋２Ｖ電位が低い）であることが好ましい。
本発明の好ましい実施態様の一つとしては、２本鎖ＤＮＡと結合する物質を固定化した電極を作成し、該電極と検体液を接触させ、その後、該電極と検体液の間に電位をかけ、さらにその後前記電位とは逆向きの電位をかけ、不必要なＤＮＡ分子を除く手法が挙げられる。
【００３４】
検体中の標的ＤＮＡは、ＰＣＲ法などで増幅することなく直接検出するのが好ましいが、予め増幅したのちに検出してもよい。
標的ＤＮＡまたはその増幅体は、予め標識しておくことにより容易に検出可能である。ＤＮＡを標識するには、酵素(Reverse Transcriptase,DNApolymerase RNAPolymerase,Terminaldeoxytransferaseなど)を用いる方法がよく用いられるが、化学反応により、直接標識物質を結合させてもよい。このような標識方法については、公知の技術として成書に記載されている（野村慎太郎著脱アイソトープ実験プロトコール１、秀潤社１９９４年、脱アイソトープ実験プロトコール２、秀潤社１９９８年、村松正明著ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法標識物質秀潤社２０００年）。標識物質は、検出可能なシグナルを作ることの可能な物質であることが好ましい。標識物質が、酵素や触媒のような、シグナルの増幅能力のある物質である場合、ＤＮＡの検出感度は大きく向上する。該標識物質はまた、ビオチン−アビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗体のような特異結合対の片方であって、その結合相手を介して標識物質を標的ＤＮＡに結合させてもよい。
【００３５】
しかしながら、前述の標識操作は、一般的に煩雑であるので、さらに好ましい検出方法としては、検体中のＤＮＡを予め標識せずに測定する方法を挙げることができる。これには、例えば２本鎖ＤＮＡを認識するＤＮＡ挿入剤、いわゆるＤＮＡインターカレーターを用いることができる。ＤＮＡインターカレーターの使用により、検出操作が簡単になるだけではなく、検出感度も向上する。例えば、１０００ｂｐのＤＮＡを検出する場合、いわゆる標識法は多くとも数個の標識物質しか導入できないのであるが、インターカレーターを使用する場合は１００個以上の標識物質を導入することが可能である。
２本鎖ＤＮＡ挿入剤（ＤＮＡインターカレーター）は、検体である２本鎖ＤＮＡが支持体上の２本鎖ＤＮＡ認識物質と反応した後に添加してもよいし、同時に加えてもよい。
【００３６】
ＤＮＡインターカレーターは、そのもの自体が検出可能なシグナルを形成できる物質であってもよいが、その側鎖にシグナル形成物質を結合していたり、ビオチン−アビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗体のような特異結合対を介してインターカレーターに結合していてもよい。
本発明における、検出可能なシグナルは、例えば、蛍光検出、発光検出、化学発光検出、生物発光検出、電気化学発光検出、放射能検出、電気化学検出、比色検出により検出可能なシグナルであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
好ましいＤＮＡインターカレーターの例として、蛍光性色素のようにインターカレーター自身がシグナル形成能力をもっていてもよいが、インターカレーターとシグナル形成物質との複合体であってもよい。インターカレーターとシグナル形成物質との複合体は、例えば、下記一般式（１）、（２）のようなものをあげることができる
一般式（１）Ｘ−Ｌ１−Ｉ−Ｌ２−Ｙ
一般式（２）Ｘ−Ｌ１−Ｉ
（一般式（１）、（２）において、Ｉは２本鎖ＤＮＡに挿入される物質を示し、Ｌ１，Ｌ２はリンカー配列を示し、Ｘ及びＹは、検出可能な分子を示す。）
【００３８】
一般式（１）及び（２）においてＩで示される２本鎖ＤＮＡに挿入される物質は、好ましくは、分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が２本鎖ＤＮＡの塩基対と塩基対の間に介入することによって、２本鎖ＤＮＡと結合することができる物質を言う。
【００３９】
一般式（１）及び（２）においてＬ１，Ｌ２で示されるリンカー配列は特に限定されず、例えば、アルキレン基、−Ｏ−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−基又はこれらの組み合わせから成る基などを例示することができる。
【００４０】
一般式（１）及び（２）においてＸ，Ｙが示す検出可能な分子の具体例としては、Fluorescein、Rhodamin、Cy5、Cy3、Texas Red、ルテニウム錯体等に代表される蛍光色素団、ビオチン−アビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗体のような特異結合対を形成する物質、フェロセン誘導体に代表される電気化学的検出可能な物質、ルシゲニン誘導体、ルミノール誘導体のような発光性の物質、またいわゆるＥＩＡ（酵素免疫測定法）で使用しているような酵素等を挙げることができる。
【００４１】
Ｘ，Ｙが特異結合対を形成する物質である場合、Ｘ，Ｙを介してFluorescein、Rhodamin、Cy5、Cy3、Texas Red、ルテニウム錯体等に代表される蛍光色素団、フェロセン誘導体に代表される電気化学的検出可能な物質、ルシゲニン誘導体、ルミノール誘導体のような発光性の物質、またいわゆるＥＩＡ（酵素免疫測定法）で使用しているような酵素等を結合させることができる。
【００４２】
本発明で用いる電気化学的、光化学的に活性な挿入剤は特に限定されるものではなく、例えばエチジウム、エチジウムブロマイド、アクリジン、アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、ビスベンチミド、ジアミノフェニルインドール、プロフラビン、エリブチシン、アクチノマイシンＤ、チアゾール、クロモマイシン、ドーノマイシン、マイトマイシンＣ、並びにこれらの誘導体等を用いることができる。また、その他の使用可能な挿入剤としては、特開昭62-282599 号公報に記載されたものが挙げられる。
さらに本発明で用いることができる挿入剤の具体例を示す。
【００４３】
【化１】

【００４４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００４５】
【実施例】
実施例１
（１）抗体の固定化
２本鎖認識抗体を含むＰＢＳ溶液（フナコシ社製、１μｇ／ｍｌ）１μｌを、表面にイオウ原子（Ｓ）を介してサクシイミド基を導入した、平板上に配置された、金電極（２．５ｍｍφ）に点着し、１２時間放置した。さらにこの金電極表面を、０．５ＭのGlycineホウ酸に３０分間浸漬したのちＰＢＳにより洗浄した。
【００４６】
（２）サンプルの調製
Human alpha 2-HS-glycoprotein（HSGP）の翻訳領域（ＯＲＦ）をpBluescriptIISK-のマルチクローニングサイトのNotI、XhoIサイト間にクローニングした。このベクターを鋳型にして、HSGP cDNAをＰＣＲ法により増幅した。
【００４７】
（３）反応
ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡをＴＥに溶解し、０．１μＭ溶液を調製し、これをサンプルとした。
サンプルを１０μｌ上記の（１）で作製した２本鎖認識抗体固定化金電極表面に点着し、その後この金電極表面に１．５Ｖの電圧を印加し、１５分間放置後、ＴＥ溶液により洗浄した
【００４８】
（４）測定
さらに、この金電極をSybrGreen溶液（Molecular Probe社、１０００倍希釈ＴＥ溶液）に２０分間浸漬したのち、ＴＥにより洗浄した。洗浄済み金電極を風乾後、ＦＬＡ２０００（富士写真フイルム株式会社製）により６３３ｎｍ励起による蛍光強度を測定した。
【００４９】
（比較例１）
実施例１の（３）において、金電極表面に１．５Ｖの電圧を印加することを行わない以外は、同様にして蛍光強度を測定した。実施例１と比較例１の結果を以下に示す。
【００５０】

（ＬＡＵは蛍光強度に比例する単位）
実施例１と比較例１との結果より、本発明の方法により、反応を促進して２本鎖ＤＮＡを検出できることが示された。
【００５１】
（実施例２）
（１）抗体の固定化、（２）サンプルの調製、（３）反応までは実施例１と同様に行った。その後、特願平１１−３４９２８６号に記載の方法で合成した、下記式で表される電気化学活性を有するインターカレーター（５０ｍＭ）を含む０．１Ｍ酢酸−酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．６）−０.１Ｍ塩化カリウム水溶液の混合液に、上記の（１）〜（３）までの操作を行った金電極（作用極）、白金（対極）および銀／塩化銀参照電極を浸漬して三極電極を形成させ、ＣＶ５０Ｗ（ＢＡＳ社製）を用いて、デファレンシャルパルスボンランメトリ−（ＤＰＶ）測定を行った。そして、そのＤＰＶより、印加電圧２６０ｍＶにおけるピ−ク電流値を求めた。
【００５２】
【化２】

【００５３】
（比較例２）
実施例２において、金電極表面に１．５Ｖの電圧を印加することを行わない以外は、同様にしてＤＰＶ測定を行い、印加電圧２６０ｍＶにおけるピ−ク電流値を求めた。実施例２と比較例２の結果を以下に示す。
【００５４】

（バックグラウンドは、サンプルを反応させる前の金電極でＤＰＶ測定した際のピ−ク電流）
実施例２と比較例２との結果より、本発明の方法により、反応を促進して２本鎖ＤＮＡを検出できることが示された。
【００５５】
【発明の効果】
本発明により、反応速度を促進して、２本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま分析することが可能になった。また本発明の方法によれば、簡便かつ迅速、高感度に２本鎖ＤＮＡを分析することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for analyzing double-stranded nucleic acid (particularly, double-stranded DNA) present in a specimen, and also relates to a method for quantifying the amount of double-stranded nucleic acid present in a specimen. Further, when applied to gene analysis, the present invention can also be used for analysis and analysis of gene polymorphisms such as SNP (Single Nucleotide Polymorphism). The present invention can also be used for a technique for detecting a foreign gene group derived from a virus, a microbial cell or the like present in a specimen.
[0002]
[Prior art]
A method of fixing a nucleic acid probe that is a target nucleic acid sample or a nucleic acid probe that is a DNA or RNA fragment containing a base sequence complementary to the target nucleic acid sample to a solid phase and performing a hybridization reaction therewith, Developed by EM Southern in 1975, it has been widely used as a so-called Southern blotting method (J. Mol. Biol 98 , 503 (1975)). In the Southern blotting method, a nucleic acid sample is electrophoresed and then immobilized on a nitrocellulose or nylon membrane and brought into contact with a nucleic acid probe having a complementary sequence.
[0003]
Contrary to this method, a method for measuring the amount of target nucleic acid by immobilizing a nucleic acid probe and bringing it into contact with the target nucleic acid has been developed and used for gene analysis, genetic diagnosis, and the like. Southern et al. Also developed a DNA array in which a large number of nucleic acid probes were immobilized on a support in an array, and demonstrated that DNA on a glass support binds to its complementary DNA. In addition, Affymax has succeeded in developing a technology for increasing the density of DNA arrays by combining the Southern concept and DNA solid phase synthesis technology using the Photoresist method, and has been commercialized in the form of GeneChip (S. Fodor Science 277, 393 (1997), Nature Genetics Supplement 21, 20 (1999)).
[0004]
Thus, DNA detection methods using hybridization have greatly advanced. However, although the analysis method described above is extremely effective for detecting single-stranded nucleic acids such as mRNA, in order to detect double-stranded nucleic acids, the double-stranded nucleic acids in the specimen are thermally denatured before hybridization. In addition, a complicated operation of making a single strand is required.
[0005]
For example, when the analysis target is DNA in the genome, the target DNA forms a double strand. For example, PNGillies and the like detect SNPs using an electrical address method (Nature Biotechnology, 17,365 (1999)), and RJCho and others detect high density oligo DNA arrays (Nature Genetics 23,203 (1999)). However, in any case, in order to measure DNA, it is necessary to perform a complicated operation in which a target DNA portion in a specimen is amplified by PCR and then denatured into a single strand by thermal denaturation.
[0006]
On the other hand, an intercalator is known as a method for detecting double-stranded DNA. Japanese Patent No. 2573443 discloses a method for detecting DNA using an intercalator, but even in this method, it is necessary to denature double-stranded DNA into a single strand in advance in order to react with the immobilized DNA. was there.
[0007]
As a technique for improving the above drawbacks, a technique for directly detecting double-stranded nucleic acids has been developed. (Japanese Patent Application No. 2000-325136). In this invention, a double-stranded DNA is denatured by contacting a specimen with a double-stranded DNA recognition substance immobilized on a support and measuring the double-stranded DNA bound to the double-stranded DNA recognition substance. It has been found that it is possible to analyze as it is. However, even when this method is used, it may be necessary to further shorten the reaction time.
[0008]
In the detection method by the so-called DNA hybridization method in which the immobilized single-stranded DNA is reacted with the sample DNA in the solution, a method for accelerating the reaction rate has already been developed. For example, it is disclosed in US Pat. No. 4,787,963 and International Publication WO98 / 10273 that an electric field can be applied to the reaction field to accelerate the hybridization rate. It is also known that the addition of polyethylene glycol is effective in promoting the reaction rate.
However, a technique for accelerating the reaction for directly detecting a double-stranded nucleic acid has not been developed, and the development thereof is necessary.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above-described problems of the prior art. That is, an object of the present invention is to provide a method for accelerating the reaction rate in a method for directly analyzing double-stranded DNA without denaturation.
Another object of the present invention is to provide a simple, highly sensitive and rapid method for analyzing double-stranded DNA.
[0010]
Furthermore, another object of the present invention is to provide a method for analyzing double-stranded DNA that can be used for the purpose of detecting a gene and its polymorphism in a short time and with high sensitivity.
Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for improving the signal / noise ratio by removing the nonspecifically adsorbable double-stranded DNA transferred around the double-stranded recognition substance.
Furthermore, the present invention should solve the problem of providing a method for improving the analysis accuracy of SNP or the like by stripping double-stranded DNA having a weak binding ability with a double-stranded recognition substance from the double-stranded DNA recognition substance. It was an issue.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have brought a specimen into contact with a double-stranded DNA recognition substance immobilized on a support, and the support on which the double-stranded DNA recognition substance is further immobilized. The binding of the double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support and the double-stranded DNA in the sample is promoted by applying an electric field between the sample and the solution containing the sample, and then the double-stranded DNA recognition By measuring the double-stranded DNA bound to the substance, it was found that the double-stranded DNA can be analyzed as it is without denaturing the double-stranded DNA and without increasing the reaction rate. The present invention has been completed based on these findings.
[0012]
Furthermore, the present inventors have found that the amount of double-stranded DNA bound to a double-stranded DNA recognition substance can be detected with high sensitivity by using a double-stranded intercalator such as a DNA intercalator. It was.
Furthermore, the present inventors have applied the electric field between the support on which the double-stranded DNA recognition substance is fixed and the specimen to fix the double-stranded DNA recognition substance fixed on the support and the two in the specimen. After promoting the binding with the stranded DNA, by applying an electric field opposite to the above electric field, the non-specifically adsorbed DNA and the DNA having a weak binding with the double-stranded DNA recognition substance are removed, and thereby the signal / noise ratio is reduced. It has also been found that can be improved.
[0013]
That is, according to the present invention, there is provided a method for analyzing double-stranded DNA in a specimen,
(1) a step of contacting the specimen with a double-stranded DNA recognition substance immobilized on a support;
(2) An electric field for directing the double-stranded DNA in the specimen toward the double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support, the support on which the double-stranded DNA recognition substance is immobilized, and the specimen A process between
(3) a step of measuring the double-stranded DNA bound to the double-stranded DNA recognition substance,
The above analysis method is provided.
[0014]
According to another aspect of the present invention, there is provided a method for analyzing double-stranded DNA in a specimen, comprising:
(1) a step of bringing the specimen into contact with a double-stranded DNA recognition substance immobilized on a support;
(2) An electric field for directing the double-stranded DNA in the specimen toward the double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support, the support on which the double-stranded DNA recognition substance is immobilized, and the specimen The process between
(3) applying an electric field opposite to the electric field in step (2); and
(4) a step of measuring the double-stranded DNA bound to the double-stranded DNA recognition substance,
The above analysis method is provided.
[0015]
Preferably, the double-stranded DNA recognition substance is a double-stranded DNA recognition antibody, a DNA transcription factor, a protein having a Zn finger motif or a ring finger motif, or a peptide nucleic acid.
[0016]
Preferably, in the step of measuring the double-stranded DNA bound to the double-stranded DNA recognition substance, an insertion agent that recognizes the double-stranded DNA is added to the reaction system, and the insertion agent is inserted into the double-stranded DNA. By detecting this, the double-stranded DNA in the sample is measured.
[0017]
Preferably, the intercalating agent is a DNA intercalator.
Preferably, the DNA intercalator has electrochemical activity, and the double-stranded DNA in the specimen is measured by detecting the DNA intercalator by an electrochemical technique.
Preferably, the DNA intercalator is detected by a fluorescence method, a luminescence method, or a surface plasmon method.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
The method for analyzing double-stranded DNA in a specimen according to the present invention includes:
(1) a step of bringing the specimen into contact with a double-stranded DNA recognition substance immobilized on a support;
(2) An electric field for directing the double-stranded DNA in the specimen toward the double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support, the support on which the double-stranded DNA recognition substance is immobilized, and the specimen A process between
(3) a step of measuring the double-stranded DNA bound to the double-stranded DNA recognition substance,
It is characterized by including.
[0019]
The type of “specimen” in the present specification is not particularly limited as long as it contains double-stranded DNA. For example, blood such as peripheral venous blood, white blood cells, serum, urine, feces, semen, saliva , Cultured cells, tissue cells such as various organ cells, and other samples containing nucleic acids can be used. As the specimen, a sample such as the above-described tissue cell may be used as it is, but preferably, a specimen obtained by destroying cells in the specimen sample and releasing double-stranded DNA is used as the specimen. The destruction of the cells in the specimen sample can be performed by a conventional method. For example, physical action such as shaking and ultrasonic waves can be applied from the outside. In addition, nucleic acid can be liberated from cells using a nucleic acid extraction solution (for example, a solution containing a surfactant such as SDS, Triton-X, Tween-20, or saponin, EDTA, protease, etc.). . When nucleic acid is eluted using a nucleic acid extraction solution, the reaction can be promoted by incubation at a temperature of 37 ° C. or higher.
[0020]
In the present invention, a double-stranded DNA recognition substance immobilized on a support is used. The support used in the present invention is not particularly limited as long as it can fix a double-stranded DNA recognition substance described below. As an example of a preferable support, a non-porous support such as glass, quartz, plastic, or electrode can be preferably used. The electrode materials include carbon electrodes such as graphite and glassy carbon, noble metal electrodes such as platinum, gold, palladium and rhodium, oxide electrodes such as titanium oxide, tin oxide, manganese oxide and lead oxide, Si, Ge, ZnO Examples thereof include semiconductor electrodes such as CdS and electron conductors such as titanium, but it is particularly preferable to use gold or glassy carbon. These electronic conductors may be coated with a conductive polymer or a monomolecular film.
In addition, a porous support such as a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, or a PVDF membrane may be used, and a composite of a nonporous support and a porous support can also be used.
[0021]
The double-stranded DNA recognition substance used in the present invention is a substance that recognizes and specifically binds to double-stranded DNA. Specific examples of the double-stranded DNA recognition substance include a DNA transcription factor, a mismatch repair protein, a double-stranded DNA recognition antibody, or a peptide nucleic acid.
[0022]
A DNA transcription factor is a substance that binds to a promoter region on a gene and controls transcription from DNA to mRNA (Tamura Takaaki: Transcription factor (Yodosha 1995)). Therefore, it is known that a transcription factor specifically binds to a double-stranded DNA having a specific sequence.
[0023]
Among many transcription factors, Zinc Finger Protein, that is, transcription factors having Zinc Finger or Ring Finger motif, has a very high appearance rate in eukaryotes, and 1% in the genome seems to encode it. Pabo et al. Analyzed the tertiary structure of the Zinc Figer motif and elucidated the mechanism of binding to DNA (Science, 252, 809 (1991)). Furthermore, Choo et al. Succeeded in producing a Zinc Finger Protein group that does not exist in nature and binds to a specific sequence by gene recombination (Nature 372, 642 [1994], PNAS 91, 11163 (1994)). Furthermore, the Scripps Research Institute group has succeeded in producing a new Zinc Finger Protein group by Phage Display (PNAS95,2812, [1998]: 96,2758 (1999)). Thus, the DNA transcription factor group represented by Zinc Finger Protein originally has the property of binding to double-stranded DNA, and according to recent research, it is possible to produce recombinants that recognize any DNA sequence. It has become. By immobilizing such a protein, it is possible to efficiently capture double-stranded DNA on a support.
[0024]
A mismatch repair protein is an enzyme that repairs an inappropriate base pair (incorrect or mismatched pair) generated between DNA double strands. For example, in the case of E. coli DNA polymerase, 10 ⁸ Nucleotide that does not pair with the base of the template DNA is incorporated into the base pair at a frequency of about one place, but this is repaired by the mismatch repair enzyme. The mismatch repair enzyme binds to the DNA immediately after replication in the cell, and removes a portion of the nucleotide containing the mismatched base pair. In the present invention, the mismatch repair protein can be used as a double-stranded DNA recognition substance by utilizing the property of binding to double-stranded DNA.
[0025]
It is well known that antibodies that recognize double-stranded DNA appear in the serum of patients with systemic lupus erythematosus. Advances in antibody production technology and gene recombination technology have made it possible to produce such double-stranded DNA-recognizing monoclonal antibodies (Suzuki etal, Int J Mol Med 3,385, 1999, Barry etal, J Biol Chem 269 3623 (1994)). Such a double-stranded DNA recognition antibody can be used as the double-stranded DNA recognition protein of the present invention.
[0026]
Peptide nucleic acids are those in which the sugar and phosphate portions of the DNA backbone structure are replaced with polyamide backbones, and are known to specifically hybridize with DNA and the like to form double strands (PENielesen et al Science, 254, 1497 (1991); Genes and Biotechnology: Naomi Sugimoto, published by Maruzen Co., Ltd. (1999). Peptide nucleic acid is functionally almost the same as DNA, but its structure is completely different and based on a polyamide backbone, it does not contain sugar and phosphate in its molecule. Furthermore, peptide nucleic acids can penetrate into the DNA-DNA strand to form a triplex. In the present invention, by utilizing this property of peptide nucleic acid, the peptide nucleic acid can be used as a double-stranded DNA recognition substance.
[0027]
The above-mentioned double-stranded DNA recognition substance can be immobilized on the support as it is. Specifically, the double-stranded DNA recognition substance can be immobilized on the support by spotting a solution containing the double-stranded DNA recognition substance on the support and allowing it to stand for a certain period of time.
[0028]
In the method of the present invention, (2) an electric field for directing double-stranded DNA in a specimen toward a double-stranded DNA recognition substance immobilized on a support is fixed to the double-stranded DNA recognition substance. Applying between the support and the specimen.
[0029]
The method for applying the electric field is not particularly limited, but it is necessary to apply an electric field in such a direction as to direct the double-stranded DNA in the specimen toward the double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support. By applying such an electric field, the binding between the double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support and the double-stranded DNA in the specimen is promoted. Since double-stranded DNA is usually negatively charged, an anode is placed on the side of the support on which the double-stranded DNA recognition substance is immobilized, or a specimen containing double-stranded DNA with the support itself as the anode ( Preferably, the specimen is a solution), and a double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support and the double strand in the specimen are placed by applying an electric field between the anode and the cathode. Binding to DNA can be promoted.
[0030]
The potential difference of the electric field for directing the double-stranded DNA in the sample toward the double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support is in the range of 0 to +2 V (that is, the support side is 0 more than the sample solution). ~ 2V potential is high).
As one of the preferred embodiments of the present invention, an electrode on which a substance that binds to double-stranded DNA is immobilized is prepared, the electrode and the sample liquid are brought into contact, and then an electric field ( (Potential difference) is applied.
[0031]
According to one preferred aspect, the method of the invention comprises:
(1) a step of bringing the specimen into contact with a double-stranded DNA recognition substance immobilized on a support;
(2) An electric field for directing the double-stranded DNA in the specimen toward the double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support, the support on which the double-stranded DNA recognition substance is immobilized, and the specimen A process between
(3) applying an electric field opposite to the electric field in step (2);
including.
Here, step (2) can be performed in the same manner as described above.
[0032]
Step (3) is a step of applying an electric field opposite to the electric field in step (2). That is, a cathode is installed on the side of the support on which the double-stranded DNA recognition substance is fixed, or the support itself is used as a cathode, and the anode is placed in a sample containing double-stranded DNA (preferably, the sample is a solution). By installing and applying an electric field between the anode and the cathode, the double-stranded DNA around the double-stranded DNA recognition substance fixed on the support can be removed from the support. Thus, by adopting the above step (3), non-specifically adsorbed DNA and DNA that is weakly bound to the double-stranded DNA recognizing substance can be removed from the support, thereby increasing the signal / noise ratio. Can be improved.
[0033]
The potential difference between the opposite potentials is preferably in the range of 0 to -2V (that is, the potential on the support side is 0 to + 2V lower than the sample liquid).
As one of the preferred embodiments of the present invention, an electrode on which a substance that binds to double-stranded DNA is immobilized is prepared, the electrode and the sample liquid are brought into contact, and then a potential is applied between the electrode and the sample liquid. And then applying a potential opposite to the potential to remove unnecessary DNA molecules.
[0034]
The target DNA in the sample is preferably detected directly without being amplified by a PCR method or the like, but may be detected after amplification in advance.
The target DNA or amplified product thereof can be easily detected by labeling in advance. In order to label DNA, a method using an enzyme (Reverse Transcriptase, DNA polymerase RNA Polymerase, Terminal deoxytransferase, etc.) is often used, but a labeling substance may be directly bound by a chemical reaction. Such a labeling method is described in the book as a known technique (Shintaro Nomura, Deisotope Experiment Protocol 1, Shujunsha 1994, Deisotope Experiment Protocol 2, Shujunsha 1998, Masaaki Muramatsu DNA microarray and latest PCR labeling substance Shujunsha 2000). The labeling substance is preferably a substance capable of producing a detectable signal. When the labeling substance is a substance capable of amplifying a signal, such as an enzyme or a catalyst, the DNA detection sensitivity is greatly improved. The labeling substance may be one of specific binding pairs such as biotin-avidin, antigen-antibody, and hapten-antibody, and the labeling substance may be bound to the target DNA via the binding partner.
[0035]
However, since the above-described labeling operation is generally complicated, a more preferable detection method includes a method of measuring DNA in a sample without labeling in advance. For this, for example, a DNA intercalator that recognizes double-stranded DNA, a so-called DNA intercalator can be used. The use of a DNA intercalator not only simplifies the detection operation, but also improves the detection sensitivity. For example, when detecting 1000 bp DNA, the so-called labeling method can introduce only a few labeling substances, but when using an intercalator, it is possible to introduce 100 or more labeling substances.
The double-stranded DNA intercalating agent (DNA intercalator) may be added after the double-stranded DNA as a sample reacts with the double-stranded DNA recognition substance on the support or may be added simultaneously.
[0036]
A DNA intercalator may itself be a substance that can form a detectable signal, but it may have a signal-forming substance bound to its side chain, such as biotin-avidin, antigen-antibody, or hapten-antibody. The intercalator may be bound via a specific binding pair.
In the present invention, the detectable signal is, for example, a signal detectable by fluorescence detection, luminescence detection, chemiluminescence detection, bioluminescence detection, electrochemiluminescence detection, radioactivity detection, electrochemical detection, and colorimetric detection. However, it is not limited to these.
[0037]
As an example of a preferable DNA intercalator, the intercalator itself may have a signal forming ability like a fluorescent dye, but may be a complex of an intercalator and a signal forming substance. Examples of the complex of the intercalator and the signal-forming substance include the following general formulas (1) and (2).
General formula (1) X-L1-I-L2-Y
General formula (2) X-L1-I
(In general formulas (1) and (2), I represents a substance inserted into double-stranded DNA, L1 and L2 represent linker sequences, and X and Y represent detectable molecules.)
[0038]
The substance inserted into the double-stranded DNA represented by I in the general formulas (1) and (2) preferably has a plate-like insertion group such as a phenyl group in the molecule, and the insertion group is double-stranded. A substance that can bind to double-stranded DNA by intervening between DNA base pairs.
[0039]
The linker sequence represented by L1 and L2 in the general formulas (1) and (2) is not particularly limited. For example, a group consisting of an alkylene group, —O— group, —CO— group, —NH— group, or a combination thereof. Etc. can be illustrated.
[0040]
Specific examples of detectable molecules represented by X and Y in the general formulas (1) and (2) include fluorescent chromophores represented by Fluorescein, Rhodamin, Cy5, Cy3, Texas Red, ruthenium complexes, etc., biotin-avidin , A substance that forms a specific binding pair such as an antigen-antibody or a hapten-antibody, an electrochemically detectable substance typified by a ferrocene derivative, a luminescent substance such as a lucigenin derivative or a luminol derivative, or a so-called EIA ( Enzymes such as those used in enzyme immunoassays.
[0041]
When X and Y are substances that form a specific binding pair, via X and Y, fluorescent chromophores represented by Fluorescein, Rhodamin, Cy5, Cy3, Texas Red, ruthenium complexes, etc., electricity represented by ferrocene derivatives A chemically detectable substance, a luminescent substance such as a lucigenin derivative or a luminol derivative, or an enzyme used in a so-called EIA (enzyme immunoassay) can be bound.
[0042]
The electrochemically and photochemically active intercalating agent used in the present invention is not particularly limited. Mycin D, thiazole, chromomycin, donomycin, mitomycin C, and derivatives thereof can be used. Other usable intercalating agents include those described in JP-A-62-282599.
Furthermore, the specific example of the insertion agent which can be used by this invention is shown.
[0043]
[Chemical 1]

[0044]
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0045]
【Example】
Example 1
(1) Immobilization of antibody
A gold electrode (2.5 mmφ) arranged on a flat plate in which 1 μl of a PBS solution containing a double-chain recognition antibody (manufactured by Funakoshi Co., Ltd., 1 μg / ml) is introduced on the surface via sulfur atoms (S) ) And left for 12 hours. Further, the gold electrode surface was immersed in 0.5 M Glycine boric acid for 30 minutes and then washed with PBS.
[0046]
(2) Sample preparation
The translation region (ORF) of human alpha 2-HS-glycoprotein (HSGP) was cloned between NotI and XhoI sites of the multi-cloning site of pBluescriptIISK-. HSGP cDNA was amplified by PCR using this vector as a template.
[0047]
(3) Reaction
CDNA amplified by PCR was dissolved in TE to prepare a 0.1 μM solution, which was used as a sample.
10 μl of the sample was spotted on the surface of the double-chain recognition antibody-immobilized gold electrode prepared in (1) above, and then a voltage of 1.5 V was applied to the gold electrode surface, left for 15 minutes, and then washed with a TE solution. did
[0048]
(4) Measurement
Further, the gold electrode was immersed in SybrGreen solution (Molecular Probe, 1000-fold diluted TE solution) for 20 minutes, and then washed with TE. The washed gold electrode was air-dried, and the fluorescence intensity by excitation at 633 nm was measured with FLA2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.).
[0049]
(Comparative Example 1)
In Example 1 (3), the fluorescence intensity was measured in the same manner except that a voltage of 1.5 V was not applied to the gold electrode surface. The results of Example 1 and Comparative Example 1 are shown below.
[0050]

(LAU is a unit proportional to fluorescence intensity)
From the results of Example 1 and Comparative Example 1, it was shown that double-stranded DNA can be detected by promoting the reaction by the method of the present invention.
[0051]
(Example 2)
(1) Immobilization of antibody, (2) Preparation of sample, and (3) Reaction were performed in the same manner as in Example 1. Then, 0.1 M acetic acid-potassium acetate aqueous solution (pH 5.6) -0 containing an intercalator (50 mM) having an electrochemical activity represented by the following formula, synthesized by the method described in Japanese Patent Application No. 11-349286. A gold electrode (working electrode), platinum (counter electrode) and silver / silver chloride reference electrode subjected to the above operations (1) to (3) are immersed in a mixed solution of 1M potassium chloride aqueous solution to obtain a triode electrode The differential pulse bon ranmetry (DPV) measurement was performed using CV50W (made by BAS). Then, a peak current value at an applied voltage of 260 mV was obtained from the DPV.
[0052]
[Chemical 2]

[0053]
(Comparative Example 2)
In Example 2, a DPV measurement was performed in the same manner except that a voltage of 1.5 V was not applied to the gold electrode surface, and a peak current value at an applied voltage of 260 mV was obtained. The results of Example 2 and Comparative Example 2 are shown below.
[0054]

(Background is peak current when DPV measurement is performed with a gold electrode before reacting the sample)
From the results of Example 2 and Comparative Example 2, it was shown that double-stranded DNA can be detected by promoting the reaction by the method of the present invention.
[0055]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to accelerate the reaction rate and analyze the double-stranded DNA as it is without denaturing it. Moreover, according to the method of the present invention, double-stranded DNA can be analyzed simply, rapidly and with high sensitivity.

Claims

A method for analyzing double-stranded DNA in a specimen,
(1) a step of contacting the specimen with a double-stranded DNA recognition substance immobilized on a support;
(2) An electric field for directing the double-stranded DNA in the specimen toward the double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support, the support on which the double-stranded DNA recognition substance is immobilized, and the specimen And (3) measuring the double-stranded DNA bound to the double-stranded DNA recognition substance,
Including the above analysis method.

A method for analyzing double-stranded DNA in a specimen,
(1) a step of contacting the specimen with a double-stranded DNA recognition substance immobilized on a support;
(2) An electric field for directing the double-stranded DNA in the specimen toward the double-stranded DNA recognition substance immobilized on the support, the support on which the double-stranded DNA recognition substance is immobilized, and the specimen The process between
(3) a step of applying an electric field opposite to the electric field in step (2), and (4) a step of measuring double-stranded DNA bound to the double-stranded DNA recognition substance,
Including the above analysis method.

The analysis method according to claim 1 or 2, wherein the double-stranded DNA recognition substance is a double-stranded DNA recognition antibody.

The analysis method according to claim 1 or 2, wherein the double-stranded DNA recognition substance is a DNA transcription factor.

The analysis method according to claim 1 or 2, wherein the double-stranded DNA recognition substance is a protein having a Zn finger motif or a ring finger motif.

The analysis method according to claim 1 or 2, wherein the double-stranded DNA recognition substance is a peptide nucleic acid.

In the step of measuring the double-stranded DNA bound to the double-stranded DNA recognition substance, an insertion agent that recognizes the double-stranded DNA is added to the reaction system, and the insertion agent inserted into the double-stranded DNA is detected. The analysis method according to any one of claims 1 to 6, wherein the double-stranded DNA in the specimen is measured.

The analysis method according to claim 7, wherein the intercalating agent is a DNA intercalator.

The analysis method according to claim 8, wherein the DNA intercalator has an electrochemical activity, and the double-stranded DNA in the specimen is measured by detecting the DNA intercalator by an electrochemical technique.

The analysis method according to claim 8, wherein the DNA intercalator is detected by a fluorescence method, a luminescence method, or a surface plasmon method.