JP4035759B2 - Aminoalcohol phosphate compound, production method, and method of use thereof - Google Patents

Description

についてはその役割が未知であったが、近年、SPN-1Pを内因性リガンドとするオーファン受容体endothelial differentiation gene (Edg)が見出され、生理作用が次第に明らかになってきた。
【０００４】
Edgは1990年にオーファン受容体として遺伝子がクローニングされた[ Edg - 1 (J B C, `90, 265, p. 9308)]が、その後、 Edg - 1のホモログとして、Edg - 3( BB R C, `96, 227, p. 608) 、Edg - 5 (AGR 16 / H 218)(J C B, `96, 135, p. 1071)が得られたものの、その生理的役割は不明だった。ところが、`98年、SPN- 1PがEdg - 1の内因性リガンドとなっている可能性が示唆され (Science, `98, 279, p. 1552)、その後、Edg - 3、及びEdg - 5もSPN - 1 P特異的受容体である事が示された (BBRC `99, 260, p. 263、 J B C `99, 274, p. 18997)。
【０００５】
血管内皮細胞上の Edg - 1が SPN - 1Pの刺激によって、カドヘリンなど接着タンパク質をアップレギュレートし (Science, `98, 279, p. 1552)、Tリンパ球由来株化細胞が、SPN - 1Pの刺激によって、in vitro疑似血管モデルでの血管層侵入を増長する (EMBO J., `98, vol. 17, No. 14, p. 4066)。また、岡島らは Edg - 1、或いは Edg - 3を強制発現させた CHO細胞を用い、疑似血管遊走試験を行ったところ、どちらの場合も、SPN - 1P濃度依存的に遊走が促進した（`99年日本生化学会大会要旨集 p. 883）。一方、五十嵐らは、がん細胞株 F10が疑似血管モデルにてSPN - 1 P 10^-8〜10^-6 Mにて濃度依存的に最大80%ほど遊走抑制を受ける事を示したが、F10細胞では Edg - 1、或いは Edg - 3は殆ど発現しておらず、Edg - 5が発現していた（`99年日本生化学会）。発現亜種が異なる事が原因となって、SPN - 1Pが遊走抑制を示した可能性が指摘されている（`99年生化学会大会要旨集 p. 675、883）。
【０００６】
血管平滑筋細胞 (Eur. J. Biochem. `98, 257, p. 403)、或いは気道平滑筋細胞 (Biochem. J. `99, 338, p. 643)で、どちらも、SPN - 1 P応答性にMAPキナーゼ活性化が観察されており、SPN - 1Pが血管平滑筋増殖の方向に作用する可能性が指摘されている。
【０００７】
杉山らは、ラットにSPN - 1Pを尾静脈経路で投与し血行動態を観察したところ、収縮期血圧、及び左心室圧時間微分の二指標の有意な低下を観察し、SPN - 1Pが、in vivoにおいて、心機能低下の方向に作用している可能性を示した（`00年薬理学会要旨集 P. 127）。モルモット、マウス、及びヒトの冠動脈平滑筋培養細胞において、ムスカリン受容体内向き K<sup>+</sup>整流を、 Edg - 3経由で SPN - 1Pが活性化し、SPN - 1Pが呼吸困難などを引き起こす迷走神経を刺激している可能性が指摘されている (Mollecular Pharmacology, '00, 58, 449)。また、ウサギ洞房細胞の培養において、自発的ペースメーカーの周期を SPN - 1 Pが伸長する事より、SPN - 1 Pが心臓の拍動周期に対し負の作用を示している可能性が示唆されている (Pfuger Arch - Eur J Physiol '99, 438, 642)。
【０００８】
血管内皮細胞に及ぼすSPN - 1Pの作用を、血管新生動物モデルを用いて検討した結果、VEGFやFGF - 2などの増殖因子による血管新生を、SPN - 1Pが Edg - 1、Edg - 3と結合する事によって相乗的に促進させ、Edgがリウマチ、固形がんや糖尿病性網膜症の進行に作用している可能性が指摘されている (Cell `99, p. 301)。
【０００９】
SPN - 1PとEdg受容体の結合によって引き起こされる過剰な炎症や気道のリモデリングの結果、肺炎、慢性閉塞性気道疾患 (COPD: chronic obstructive airway disease)、呼吸器系高血圧が進行する可能性が指摘されている (Pulmonary Pharmacology & Therapeutics, 2000, 13, p. 99)。
【００１０】
原虫トリパノゾーマの撲滅薬、スラミンが Edg - 3特異的な拮抗性を示し、SPN- 1Pと Edgの結合のシグナルを阻止する事が報じられている(J. B. C. `99, 274, 27, p. 18997)。スラミンは動脈硬化病態モデルに治癒的に奏効する事が示されている（Circulation, ` 99, 100, p. 861、 Cardiovascular Res., `94, 28, p. 1166）が、この薬効の機作にEdg拮抗性が絡んでいる可能性が考えられる。
【００１１】
以上の知見を総合すると、SPN - 1Pが Edgと結合すると、炎症性細胞活性化や血管平滑筋細胞増殖、血行動態悪化など動脈硬化促進的に作用する。また、血管新生を促進し、リウマチ、固形ガン、糖尿病性網膜症の進行の方向に作用する可能性が示されている事になる。即ち、Edgに拮抗する物質が、抗動脈硬化性、抗心臓疾患性などの抗循環器系疾患性、抗リウマチ性、抗ガン性、抗糖尿病性網膜症性及び抗呼吸器系疾患性を示す可能性が考えられる。したがって、スフィンゴ脂質類を各種合成し、Edg拮抗活性を有する物質を見出すことはこれらの疾患の治療薬を創製する上で極めて重要である。しかしながら、スフィンゴ脂質類の合成には多くの段階を要するため、これまで構造活性相関研究はほとんどなされていない。
【００１２】
これまでは主に天然型基本骨格として最も多く存在する３位水酸基の立体異性体に相当するＤ−エリスロ型（2S, 3R体）スフィンゴシンの化学合成法が研究され、多くの報告がなされている。しかしながら、天然型とは立体配置の異なるＬ−スレオ型（2S, 3S体）を選択的に合成することは以下に説明するように容易ではなく、また、そのリン酸化体は合成されていなかった。
【００１３】
これまでの合成例としては不斉アルドール型反応を利用する方法（伊藤ら, Tetrahedron Lett., 1988, Vol. 29, p. 239; E. J. Coreyら, Tetrahedron Lett., 2000, Vol. 41, p. 2765）等が報告されているが、途中の工程で用いる試薬が特殊である、あるいは煩雑な操作を要するなどの問題点があった。また天然エリスロ型の３位水酸基を反転させる方法も知られているが、隣接した４位に二重結合があるため位置異性体を生じやすいなどの問題点があった。
【００１４】
アミノ酸Ｌ−セリンを出発原料としてスレオ型スフィンゴシンを製造する方法も知られている(P. Herold, Helv. Chim. Acta, 1988, Vol. 71, p. 354; I. Van Overmeireら, J. Med. Chem., 1999, Vol. 42, p. 2697）が、この方法ではスレオ型のプロパルギルアルコール類を得てから、三重結合を還元してアルケン（二重結合）化しており、簡便とはいえない。
【００１５】
アルデヒド化合物に対して直接、アルケニル化剤（アルケニル化金属試薬）を作用させて、保護されたスフィンゴシンの３位水酸基に関する２つの立体異性体、エリスロ体とスレオ体を生成する方法は知られている。しかし、これらの異性体の生成比は金属種、溶媒、添加する触媒、反応温度等により変化しやすいため選択的に異性体を製造するための条件設定がむずかしく、また、クロマトグラフィー等による異性体の分離が困難である。さらに、エリスロ選択的に得られる方法は知られているが（特開平７−291904号公報、J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1994, p. 1257）、スレオ選択的に得られる方法は知られていない。したがって、スレオ体を立体選択性の高い反応により得る簡便な方法が望まれる。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Edg受容体拮抗活性を有する新規なアミノアルコールリン酸化合物、その簡便な製造方法及び利用方法を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、スレオ型アミノアルコール化合物はEdg受容体拮抗作用がないにもかかわらず、そのリン酸体である以下の一般式Ｉ化合物（以下、「本発明化合物」という）がEdg受容体拮抗作用を有すること、また、その化合物を立体選択性に優れた合成経路により簡便に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
本発明は、下記一般式Ｉ
【化１１】

（式中、Ｒは、置換されてもよい直鎖状または分岐鎖状のＣＨ₃Ｃ_nＨ_(2n-2m)−（ｎは、２から１９の間のいずれかの整数であり、ｍは、不飽和数を表し、０から３の間のいずれかの整数である）または置換されてもよいアリール基である）で表される、スレオ型（2S, 3S）アミノアルコール−１−リン酸化合物またはその製薬学的に許容される塩に関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
前記一般式Ｉにおける置換基について説明する。
「置換されてもよいＣＨ₃Ｃ_nＨ_(2n-2m)−」の置換されたＣＨ₃Ｃ_nＨ_(2n-2m)−とは、例えば、水酸基、ハロゲン原子、炭素数 1から 10の直鎖でも分岐鎖でもよいアルキル基若しくはアルコキシ基及びアリール基からなる群から選択される１つ以上で置換されたＣＨ₃Ｃ_nＨ_(2n-2m)−をいう。
「アリール基」の具体例としては、フェニル基、１−ナフチル基および２−ナフチル基などがあげられる。
「置換されてもよいアリール基」の置換されたアリール基とは、例えば、炭素数 1から 10の直鎖でも分岐鎖でもよいアルキル基若しくはアルコキシ基、ニトロ基及びハロゲン原子からなる群から選択される１つ以上で置換されたアリール基をいう。
【００２０】
Ｒの好ましい態様としては、以下のものがあげられる。
ｎは、好ましくは５−１６であり、さらに好ましくは9−１２である。
ｍは、好ましくは０−１であり、さらに好ましくは０である。
不飽和結合の位置は、ｎが１２のとき、８位が好ましい。
【００２１】
本発明の式Ｉ化合物の特に好ましい化合物を以下にあげる。
【化１２】

【化１３】

【化１４】

【００２２】
本発明の化合物の塩としては、製薬学的に許容されるものであれば特に制限されず、例えば、メタンスルホン酸塩、トリフロオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩などの低級アルキルスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などのアリールスルホン酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などのカルボン酸塩、グリシン塩、アラニン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などのアミノ酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩などがあげられる。
【００２３】
本発明化合物はいずれも内皮分化遺伝子（Ｅｄｇ）受容体拮抗性を示し、Edgに対するSPN - 1 PなどのＥｄｇ受容体作動物質の結合に拮抗し、これらによる細胞内シグナル伝達系を阻止することができる。
また、本発明化合物は、これらを医薬の必須成分として使用した場合、医薬の通常の他の成分と配合しても、前記特性が有効に発現することが認められた。
従って、本発明は、本発明化合物を有効成分として含有する、内皮分化遺伝子（Ｅｄｇ）受容体に拮抗する医薬を提供する。
また、本発明は、炎症性細胞活性化や血管平滑筋増殖、血行動態悪化、さらに血管新生によって生じる疾患、例えば、循環器系疾患（例えば、動脈硬化、心臓疾患（例えば、心筋梗塞、不整脈））、リウマチ（例えば、慢性関節リウマチ）、がん、糖尿病性網膜症、呼吸器系疾患（例えば、肺炎、慢性閉塞性気道疾患、呼吸器系高血圧）を予防若しくは治療するための上記医薬を提供する。
ここで、「循環器系疾患」とは、血液、リンパなどの循環状態が障害され、組織や細胞に障害をおこしている疾患をいい、例としては、動脈硬化性疾患（例えば、アテローム（粥状）硬化症）、心臓疾患（例えば、心筋梗塞、不整脈）がある。
ここで、「呼吸器系疾患」とは、気管、気管支、肺などの呼吸器が障害されている疾患及びそれに関連した症候をいい、例としては、喘息（即時型、遅発型、アレルギー性喘息等）、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、好酸球浸潤、気管支炎（慢性気管支炎等）、気道炎症、肺気腫、肺炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群、呼吸器系高血圧、呼吸困難、疼痛、咳、痰、嘔吐、息切れがある。
【００２４】
本発明の化合物を医薬として用いるためには、固体組成物、液体組成物、及びその他の組成物のいずれの形態でもよく、必要に応じて最適のものが選択される。医薬組成物は、本発明の化合物に製薬学的に許容されるキャリヤー、すなわち常用の賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、 pH調整剤、溶解剤、などを添加し、常用の製剤技術によって、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、粉剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、などに調製する事ができる。賦形剤、増量剤としては、たとえば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげる事ができる。
製剤の酸化を防止するためには、酸化防止剤（トコフェロール等）を添加したり、シクロデキストリン等の包接剤で包接したり、ゼラチン等の皮膜でカプセル化することができる。
更に、前記化合物を、乳化剤として、リン脂質あるいは非イオン界面活性剤を用いて、Ｏ／Ｗ型製剤として、特開平６−２９８６４２に記載のように調製することができる。乳化剤は、単独あるいは２種以上組み合わせて使用でき、添加量は、適宜でよいが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）である。
リン脂質としては、大豆由来リン脂質、卵黄由来リン脂質、リゾレシチン、フォスファチジルコリン（レシチン）、フォスファチジルセリンなどの単独あるいは組み合わせが使用可能である。非界面活性剤としては、分子量５００〜１５０００のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体（例えば、プルロニックＦ−６８）、分子量１０００〜１００００のポリアルキレングリコール、分子量１０００〜２００００のポリオキシアルキレン共重合体、硬化ヒマシ油ポリオキシアルキレン誘導体、ヒマシ油ポリオキシアルキレン誘導体、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ショ糖脂肪酸エステルなどの単独あるいは組み合わせが好適に用いられるがこれに限定されない。
本発明に於ける各化合物の配合量は医薬を基準として 約0.0001〜約100 mg / kg体重／日を１日１回又は数回に分けて経口又は非経口で投与することができる。この投与量は、疾患の種類、患者の年齢、体重、症状により適宜増減することができる。
【００２５】
本発明の化合物は、以下の製造法によって製造することができる。
式Ｉの化合物の製造法について、反応原料の調製例を含めて以下に説明する。
（１）反応原料の調製例
（Ａ）アルケニル化剤の合成
一般式Ｖ
【化１５】

（式中、Ｒは、置換されてもよい直鎖状または分岐鎖状のＣＨ₃Ｃ_nＨ_(2n-2m)−（ｎは、２から１９の間のいずれかの整数であり、ｍは、不飽和数を表し、０から３の間のいずれかの整数である）または置換されてもよいアリール基であり、Cpはシクロペンタジエニル基を表す）で表される有機ジルコニウム化合物に、ジアルキル亜鉛を以下のように作用させてアルケニル化剤を調製する。
【化１６】

上記反応は、一般式Ｖで表される有機ジルコニウム化合物に対し、好ましくは当モル量のジアルキル亜鉛を用いて行うことができる。
ジアルキル亜鉛としては低級ジアルキル亜鉛（例えば、ジメチル亜鉛またはジエチル亜鉛）が好適である。
一般式Ｖで表される有機ジルコニウム化合物は、公知の方法（J. Schwartzら, Org. Synth., 1992, Vol. 71, p. 83）により、水素化ジルコノセンクロリドと１−アルキンまたはアリールアセチレン類を有機溶媒中で作用させることにより調製される。
一般式Ｖで表される有機ジルコニウム化合物の生成に用いる水素化ジルコノセンクロリドは市販品を用いることができ、また公知の方法（S.L. Buchwaldら, Org. Synth., 1992, Vol. 71, p. 77）により安価な二塩化ジルコノセンから調製することもできる。
一般式Ｖで表される有機ジルコニウム化合物の生成に用いる１−アルキンは炭素数５から２２の直鎖状または分岐状のものを用いることができ、また分子内に二重結合が含まれていてもよい。具体的には１−オクチン、１−ドデシン、１−ペンタデシン等であり、特に炭素数１５の１−ペンタデシンの場合は天然物中に最も多いＣ18スフィンゴシンが得られる。
また、アリールアセチレン類を用いることもでき、アリール上に置換基を有してもよい。具体的には、フェニルアセチレン、４−クロロフェニルアセチレン、１−ナフチルアセチレン等である。
【００２６】
（Ｂ）Ｎ−保護した（Ｓ）−ホルミルオキサゾリジン誘導体の合成
下記式ＩＩＩのＮ−保護した（Ｓ）−ホルミルオキサゾリジン誘導体は従来法で合成することができ、例えば、（Ｓ）−セリンからGarnerらの方法（J. Org. Chem., 1987, Vol. 52, 2361, Org. Synth., 1991, Vol. 70, p. 18） によって合成することができ、また市販品を用いることもできる。
【化１７】

（式中ＡはＮの保護基であり、Ｂ及びＣはアルキル基（例えば、メチル基、エチル基など）または、Ｂ及びＣはこれらが結合する炭素原子と一緒になって環状アルキル基（例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基など）を形成してもよい）
ここで、Ｎの保護基Ａとしては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボニルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、などの基が挙げられる。好ましくは、Ｂｏｃが用いられる。
【００２７】
（２）式Ｉの化合物の合成
式Ｉの化合物の合成スキームを以下に示す。
【化１８】

【００２８】
第１工程： 上記（１）（Ａ）で得たアルケニル化剤と、上記（１）（Ｂ）で得た式ＩＩＩのＮ−保護した（Ｓ）−ホルミルオキサゾリジン誘導体とを反応させて、式ＩＩのスレオ体を選択的に得る。
【化１９】

上記反応溶媒としては、スレオ体を選択的に得るためには塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素が好適である。反応温度は−30〜30℃、特に−20〜０℃が好ましい。反応時間は数時間程度で十分である。
これにより天然型と水酸基の立体配置が異なるスレオ体ＩＩが選択的（スレオ／エリスロ＝９／１以上）に得られる。
【００２９】
次に、式ＩＩ化合物に対し、下記に示す第２−４工程に対応する、▲１▼アセタール型保護基の除去、▲２▼１級水酸基の選択的リン酸エステル化、▲３▼全保護基の除去、の３工程の順序で行うことによりスレオ体を得る簡便な製造法が本発明により確立された。以下に詳しく説明する。
なお、特表平８−500816号公報、Bioorg. Med. Chem. Lett., 1992, Vol. 2, p. 973記載のエリスロ体を製造する方法と同様の方法を用いることにより化合物ＩＩからスレオ型式Ｉを製造することができるが、この方法では２級水酸基の保護を要するため５工程であり、各工程間でクロマトグラフィーによる精製を要し、操作が極めて煩雑であるので、下記の方法のほうが簡便である。
【００３０】
第２工程： 化合物ＩＩのオキサゾリンを開環してアセタール型保護基を除去し、一般式ＶＩ
【化２０】

（式中のＲ及びＡは前記と同じ）で表されるアミノ基が保護されたアルコール化合物を得る。
反応は溶媒中で塩酸、p-トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、強酸性イオン交換樹脂等の酸を用いて、−２０〜１００℃において、数十分から数十時間で行うことができる。ただし、アミノの保護基が除去されないような反応条件を選ぶことが重要である。約９０％酢酸水溶液中で約50℃に加熱して行うのが特に好ましく、数時間で反応が完了する。
【００３１】
第３工程： 第２工程で得られたアミノ基が保護されたアルコール化合物（化合物ＶＩ）から下記の1-リン酸類縁体（化合物ＶＩＩ）へ変換する。
【化２１】

（式中Ｒ及びＡは前記と同じ、Ｒ'は低級アルキル基（例えば、メチル基又はエチル基）である）
上記反応は、化合物ＶＩの２つの水酸基のうち１級水酸基を選択的に反応させるために有効な公知のリン酸化剤を用いて行うことができる。
最も簡便で好ましい方法は、以下に詳細を説明する、A. Bielawskaらにより報告された方法（Tetrahedron Lett., 2000, Vol. 41, p. 7821）である。
なお、選択的リン酸化法としてホスホロアミダイト法も提案されている（A. Boumendjelら, J. Lipid. Res., 1994, Vol. 35, p. 2305）が、リン試薬を調製する必要があること、酸化の工程が必要であるので、下記方法の方が好ましい。
A. Bielawskaらの方法によれば、化合物ＶＩに対して亜リン酸トリアルキルと四臭化炭素を有機塩基（例えば、ピリジン）中で作用させる。
リン酸化剤としては亜リン酸トリメチルまたは亜リン酸トリエチルが好適であり、使用量は化合物ＶＩに対し１〜３当量で十分である。また四臭化炭素の使用量もＶＩに対し１〜３当量が好適である。反応は、−２０℃〜５０℃、好ましくは０℃〜室温で、数十分間から十数時間で行うことができる。
【００３２】
第４工程： 化合物ＶＩＩのアミノ基及びリン酸基の各保護基を除去する。
第４工程の反応は溶媒中、酸性物質を作用させて行うことができる。酸性物質としては、臭化トリメチルシラン、ヨウ化トリメチルシラン、又は塩化トリメチルシランとヨウ化ナトリウムの組み合わせ等が好適であり、使用量はＶＩＩに対し３〜10当量、特に５〜６当量が好適である。溶媒としては塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素が好適である。反応温度は、室温〜４０℃が好ましい。
また、リン酸基上の保護基が、用いる酸性物質によって他の基（例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）基）に変換される場合には、変換された基は、反応溶媒を留去した後、反応液を酸性にし、加水分解することにより、除去することができる。
最後に、濃縮後、揮発性酸性物質を共沸留去し再結晶（例えば、THF−水混合溶媒等から）することにより、純粋な化合物Ｉを得ることができる。結晶が析出し難い場合は、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製を行い、必要があればさらに再結晶を行う。
【００３３】
【実施例】
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、これは本発明の技術範囲を限定するものではない。
（実施例１）スレオ−Ｃ15−スフィンゴシン−１−リン酸（化合物Ｉにおいて、Ｒ＝n-C₁₀H₂₁）の合成
１．スレオ−Ｃ15−N-Boc-N,1O-イソプロピリデン−スフィンゴシン（化合物ＩＩにおいてＲ＝n-C₁₀H₂₁、Ａ＝Ｂｏｃ、Ｂ＝ＣＨ₃、Ｃ＝ＣＨ₃）の合成
アルゴン雰囲気下、水素化塩化ジルコノセン490mg (1.8 mmol)を塩化メチレン２ mlに懸濁させ、氷冷しながら、１−ドデシン（Ｒ＝n-C₁₀H₂₁）310 mg (1.8 mmol)の塩化メチレン溶液２ mlを加え、室温下１時間攪拌して化合物Ｖを調製した。この反応液を−20℃に冷却した後、ジエチル亜鉛の1.0 Mヘキサン溶液1.8 ml (1.8 mmol)を加え、約10分間攪拌した。そこへアルデヒド化合物ＩＩＩ（Ａ＝Ｂｏｃ、Ｂ＝ＣＨ₃、Ｃ＝ＣＨ₃）118 mg (1.0 mmol)の塩化メチレン溶液２ mlを加え、−20〜０℃で３時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルを加えてしばらく攪拌した。生じた沈殿を濾過し、酢酸エチルにて洗浄した。層を分離し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、水層をまとめて酢酸エチルで２回抽出した。有機層をまとめて無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥し、濾過・濃縮乾固を行うと淡黄色オイルが600mg残った。これをシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９：１→６：１→４：１）で精製することにより標題化合物を無色油状物質として350 mg(収率88％)得た。
[α]_D −41.4°(c 1.26, CHCl₃)
¹H-NMR（C₆D₆, 80 ℃）:δ (ppm) 0.89 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.28 (16H, s), 1.40 (9H, s), 1.45 (3H, s), 1.64 (3H, s), 1.99 (2H, q, J = 6.7 Hz), 3.69 (1H, d, J = 6.3, 9.3 Hz), 3.90 (1H, dd, J = 1.8, 9.3 Hz), 3.95 (1H, dt, J = 1.5, 6.6 Hz), 4.41 (1H, t, J = 7.0 Hz), 5.53 (1H, dd, J = 7.1, 15.4 Hz), 5.71 (1H, dt, J = 6.7, 15.4 Hz),
m/z (CI): C₂₃H₄₄NO₄ (M+H)⁺としての計算値, 398.3200, 実測値 398.3212
【００３４】
２．スレオ−Ｃ15−Boc-スフィンゴシン（化合物ＶＩにおいてＲ＝n-C₁₀H₂₁、Ａ＝Ｂｏｃ）の合成
１で得られた化合物95mg（0.24 mmol）を酢酸0.9mlと水0.1mlに溶かし、50℃で５時間攪拌した。溶媒留去後、ヘプタン１mlを加えて濃縮乾固すると淡黄色オイルが残った。これをシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２：１→１：１）で精製することにより標題化合物を無色油状物質として70 mg（収率82%）得た。
[α]_D −1.6°(c 1.78, CHCl₃)
¹H-NMR（270 MHz, CDCl₃）:δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.7 Hz), 1.25 (14H, s), 1.34 (2H, m), 1.43 (9H, s), 2.02 (2H, q, J = 6.7 Hz), 2.82 (1H, ブロード), 3.61 (1H, m), 3.77 (2H, d-様, 3.7 Hz), 4.33 (1H, m), 5.18 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.50 (1H, dd, J = 6.3, 15.6 Hz), 5.74 (1H, dt, J = 6.7, 15.4 Hz)
¹³C-NMR (CDCl₃) 14.1, 22.6, 28.3, 28.4, 29.0, 29.2, 29.3, 29.5, 29.6, 31.9, 32.3, 55.5, 64.2, 73.4, 79.7, 128.9, 134.0, 156.6
元素分析値（C₂₀H₃₉NO₄として）
実測値（％）：C 67.08; H11.15; N 3.87
計算値（％）：C 67.19; H10.99; N 3.92
【００３５】
３．スレオ−Ｃ15−スフィンゴシン−１−リン酸エステル（化合物ＶＩＩにおいてＲ＝n-C₁₀H₂₁、Ａ＝Ｈ、Ｒ’＝ＣＨ₃）の合成
窒素雰囲気下、２で得られた化合物65 mg (0.18 mmol)と四臭化炭素135 mg（0.4 mmol）をピリジン1 mlに溶かし、冷却しながら亜リン酸トリメチル50 mg（0.4 mmol）を加え、室温下５時間攪拌した。そこへ飽和塩化アンモニウム水溶液と酢酸エチルを加えてしばらく攪拌した後、層を分離した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、水層をまとめて酢酸エチルで２回抽出した。有機層をまとめて無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥し、濾過・濃縮乾固を行うと淡黄色オイルが残った。これをシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：１→１：２）で精製することにより標題化合物が無色油状物として59 mg (収率70％）得られ、出発物質（２で得られた化合物）が9 mg（14％）回収された。
[α]_D −5.4°(c 1.4, CHCl₃)
¹H-NMR（270 MHz, CDCl₃）:δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.25 (14H, s), 1.33 (2H, m), 1.42 (9H, s), 2.02 (2H, q, J = 6.7 Hz), 3.77 (3H, d, J = 11.2 Hz), 3.78 (3H, d, J = 11.2 Hz), 3.79 (1H, m), 4.09 (2H, m), 4.33 (1H, m), 5.03 (d, J = 9.0 Hz), 5.46 (1H, dd, J = 6.0, 15.4 Hz), 5.76 (1H, dt, J = 6.7, 15.4 Hz)
¹³C-NMR (CDCl₃) 14.1, 22.7, 28.3, 29.1, 29.2, 29.3, 29.5, 29.57, 29.61, 29.7, 31.9, 32.3, 54.0, 54.4, 54.7, 66.1, 70.0, 79.7, 128.4, 134.0, 156.0 m/z (CI): C₂₂H₄₅NO₇P (M+H)⁺としての計算値, 466.2863, 実測値, 466.2855
【００３６】
４．スレオ−Ｃ15−スフィンゴシン−１−リン酸（化合物ＩにおいてＲ＝n-C₁₀H₂₁）の合成
３で得られた化合物23 mg（0.05 mmol）を塩化メチレン１mlに溶かして冷却し、臭化トリメチルシラン50 microL（0.3 mmol）を加え、室温下３時間攪拌した。この溶液を濃縮後、ジオキサン0.5 mlと水0.5 mlを加え、約２時間攪拌した。これを濃縮し、メタノール１mlを加え再び濃縮した。残さ20 mgをＴＨＦ−水（２：１）から再結晶することにより標題化合物を無色固体として12 mg（収率71％）得た。
¹H-NMR（270 MHz, CD₃OD-CD₃CO₂D, 3:1）:δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.7 Hz), 1.27 (14H, s), 1.39 (2H, m), 2.07 (2H, q, J =6.6 Hz), 3.41 (1H, m), 3.92 (1H, dd, J = 7.0, 12.1 Hz), 4.06 (1H, m), 4.17 (1H, t, J = 7.8 Hz), 5.45 (1H, dd, J = 7.7, 15.3 Hz), 5.86 (1H, dt, J=6.6, 15.1 Hz)
m/z (CI): C₁₅H₃₄NO₅P (M+H)⁺としての計算値, 338.2026, 実測値, 338.2051.
【００３７】
（実施例２）スレオ−Ｃ18−スフィンゴシン−１−リン酸（化合物Ｉにおいて、Ｒ＝n-C₁₃H₂₇）の合成
１．スレオ−Ｃ18−N-Boc-N,1O-イソプロピリデン−スフィンゴシン（化合物ＩＩにおいて、Ｒ＝n-C₁₃H₂₇、Ａ＝Ｂｏｃ、Ｂ＝ＣＨ₃、Ｃ＝ＣＨ₃）の合成
実施例１の１と同様に合成した。無色油状物。収率86％
[α]_D −37.8°(c 0.84, CHCl₃)
¹H-NMR（C₆D₆, 80 ℃）:δ (ppm) 0.89 (3H, t, J = 6.7 Hz), 1.31 (22H, s), 1.40 (9H, s), 1.45 (3H, s), 1.64 (3H, s), 1.99 (2H, q, J = 6.8 Hz), 3.69 (1H, dd, J = 6.3, 9.0 Hz), 3.90 (1H, dd, J = 1.5, 9.3 Hz), 3.95 (1H, dt, J = 1.5, 6.6 Hz), 4.41 (1H, t, J = 7.0 Hz), 5.53 (1H, dd, J = 6.8, 15.3 Hz), 5.71 (1H, dt, J = 6.7, 15.4 Hz), ¹³C-NMR (C₆D₆) 14.1, 23.0, 24.3, 27.1, 28.4, 28.5, 29.5, 29.6, 29.7, 29.9, 30.1, 32.3, 32.6, 62.5, 64.8, 74.8, 80.3, 94.6, 130.6, 134.0, 156.6 m/z (CI): C₂₆H₅₀NO₄ (M+H)⁺としての計算値: 440.3670, 実測値:440.3652
【００３８】
２．スレオ−Ｃ18−Boc-スフィンゴシン（化合物ＶＩにおいて、Ｒ＝n-C₁₃H₂₇、Ａ＝Ｂｏｃ）の合成
実施例１の２と同様に合成した。無色固体。収率80％
融点：58〜60℃
[α]_D −0.7°(c 1.6, CHCl₃)
¹H-NMR（270 MHz, CDCl₃）:δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.7 Hz), 1.25 (20H, s), 1.34 (2H, m), 1.44 (9H, s), 2.03 (2H, q, J = 6.8 Hz), 2.60 (1H, ブロード), 3.61 (1H, m), 3.78 (2H, d-様, 3.7 Hz), 4.34 (1H, dd, J = 2.9, 6.1 Hz), 5.18 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.50 (1H, dd, J = 6.5, 15.5 Hz), 5.74 (1H, dt, J = 6.8, 15.4 Hz)
¹³C-NMR (CDCl₃) 14.1, 22.7, 28.3, 28.4, 29.0, 29.2, 29.3, 29.5, 29.58, 29.63, 29.7, 31.9, 32.3, 55.5, 64.3, 73.4, 79.7, 128.9, 134.0, 156.6
元素分析値（C₂₃H₄₅NO₄として）
実測値（％）：C 69.22; H11.45; N 3.47
計算値（％）：C 69.13; H11.35; N 3.51
【００３９】
３．スレオ−Ｃ18−スフィンゴシン−１−リン酸エステル（化合物ＶＩＩにおいて、Ｒ＝n-C₁₃H₂₇、Ａ＝Ｈ、Ｒ’＝ＣＨ₃）の合成
実施例１の３と同様に合成した。無色油状物。収率65％
[α]_D −3.5°(c 1.0, CHCl₃)
¹H-NMR（270 MHz, CDCl₃）:δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.25 (22H, s), 1.42 (9H, s), 2.02 (2H, q, J = 6.7 Hz), 3.77 (3H, d, J = 11.2 Hz), 3.78 (3H, d, J = 11.2 Hz), 3.79 (1H, m), 4.09 (2H, m), 4.33 (1H, m), 5.03 (d, J = 9.0 Hz), 5.46 (1H, dd, J = 6.0, 15.4 Hz), 5.76 (1H, dt, J = 6.7, 15.4 Hz)
¹³C-NMR (CDCl₃) 14.1, 22.7, 28.3, 29.1, 29.2, 29.3, 29.4, 29.5, 29.58, 29.63, 29.7, 31.9, 32.3, 54.3, 54.5, 54.6, 66.2, 70.1, 79.7, 128.4, 134.0, 156.0 m/z (CI): C₂₅H₅₁NO₇P (M+H)⁺としての計算値, 508.3333, 実測値, 508.3335
【００４０】
４．スレオ−Ｃ18−スフィンゴシン−１−リン酸（化合物Ｉにおいて、Ｒ＝n-C₁₃H₂₇）の合成
実施例１の４と同様に合成した。無色固体。収率62％
¹H-NMR（270 MHz, CD₃OD-CD₃CO₂D, 3:1）:δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.26 (20H, s), 1.38 (2H, m), 2.06 (2H, q, J =6.6 Hz), 3.37 (1H, m), 3.95 (1H, dd, J = 7.0, 12.1 Hz), 4.07 (1H, m), 4.19 (1H, t, J = 7.8 Hz), 5.44 (1H, dd, J = 7.7, 15.3 Hz), 5.86 (1H, dt, J = 6.6, 15.2 Hz)
元素分析値（C₁₈H₃₈NO₅Pとして）
実測値（％）：C 56.82; H11.35; N 3.57
計算値（％）：C 56.97; H10.09; N 3.69
【００４１】
（実施例３）スレオ−２−アミノ−３−シンナミル−１，３−ジオール−１−リン酸（化合物Ｉにおいて、Ｒ＝C₆H₅）の合成
１． スレオ−シンナミルアルコール誘導体（化合物ＩＩにおいて、Ｒ＝C₆H₅、Ａ＝Ｂｏｃ、Ｂ＝ＣＨ₃、Ｃ＝ＣＨ₃）の合成
フェニルアセチレン103 mg (1.0 mmol)、水素化塩化ジルコノセン265 mg (1.0 mmol)、ジエチル亜鉛1.0 Mヘキサン溶液0.9 ml (0.9 mmol)、アルデヒド化合物ＩＩＩ（Ａ＝Ｂｏｃ、Ｂ＝ＣＨ₃、Ｃ＝ＣＨ₃）135 mg (0.6 mmol)を用いて実施例１の１と同様に合成したところ、標題化合物が無色油状物質として180 mg（収率92％）得られた。
[α]_D −89.1°(c 1.48, CHCl₃)
¹H-NMR（C₆D₆, 80 ℃）:δ (ppm) 1.39 (9H, s), 1.42 (3H, s), 1.59 (3H, s), 3.67 (1H, dd, J = 6.3, 9.3 Hz), 3.94 (1H, dd, J = 2.0, 9.3 Hz), 4.02 (1H, dt, J = 2.0, 6.4 Hz), 4.60 (1H, t, J = 6.7 Hz), 6.22 (1H, dd, J = 7.1, 15.9 Hz), 6.62 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.00-7.15 (3H, m), 7.26 (2H, m)¹³C-NMR (C₆D₆, 80 ℃) 24.3, 27.1, 28.5, 62.5, 64.5, 74.4, 80.4, 94.6, 127.0, 127.1, 128.8, 128.9, 129.9, 132.7, 156.6
m/z (CI): C₁₉H₂₈NO₄ (M+H)⁺としての計算値：334.1948, 実測値：334.1962
【００４２】
２．シンナミル型スレオ−Ｂｏｃアミノアルコール誘導体（化合物ＶＩにおいて、Ｒ＝C₆H₅、Ａ＝Ｂｏｃ）の合成
実施例１の２と同様に合成した。化合物ＩＩ（Ｒ＝C₆H₅）84 mg (0.25mmol)から標題化合物が無色固体として66 mg（収率89％）得られた。
融点：78〜80℃
[α]_D ＋11.3°(c 1.32, CHCl₃)
¹H-NMR（270 MHz, CDCl₃）:δ (ppm) 1.43 (9H, s), 2.03 (2H, q, J = 6.8 Hz), 3.75 (1H, ブロード), 3.79 (1H, m), 3.85 (2H, ), 4.64 (1H, m), 5.37 (1H, d, J = 8.3 Hz), 6.27 (1H, dd, J = 5.9, 15.9 Hz), 6.69 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.22-7.42 (5H, m)
¹³C-NMR (CDCl₃) 28.2, 55.6, 63.5, 72.6, 79.9, 126.5 (2C), 127.7, 128.5 (2C), 128.8, 131.4, 136.5, 156.6
元素分析値（C₁₆H₂₃NO₄として）
実測値（％）：C 65.24; H 8.03; N 4.67
計算値（％）：C 65.51; H 7.90; N 4.77
【００４３】
３．シンナミル型スレオ−Ｂｏｃアミノアルコールリン酸エステル（化合物ＶＩＩにおいて、Ｒ＝C₆H₅、Ａ＝Ｈ、Ｒ’＝ＣＨ₃）の合成
実施例１の３と同様に合成した。無色油状物。収率65％
[α]_D +0.9°(c 0.9, CHCl₃)
¹H-NMR（270 MHz, CDCl₃）:δ (ppm) 1.37 (9H, s), 3.76 (3H, d, J = 11.2 Hz), 3.78 (3H, d, J = 11.1 Hz), 3.93 (1H, m), 4.15 (2H, m), 4.58 (1H, m), 5.12 (d, J = 8.3 Hz), 6.20 (1H, dd, J = 5.4, 16.0 Hz), 6.70 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.18-7.40 (5H, m)
¹³C-NMR (CDCl₃) 28.2, 54.3, 54.5, 54.6, 66.0, 66.9, 79.8, 126.5 (2C), 127.6, 128.3, 128.5 (2C), 131.6, 136.6, 156.0
m/z (CI): C₁₈H₂₉NO₇P (M+H)⁺としての計算値：402.1611, 実測値：402.1632
【００４４】
４．スレオ−２−アミノ−３−シンナミル−１，３−ジオール−１−リン酸（化合物Ｉにおいて、Ｒ＝C₆H₅）の合成
実施例１の４と同様に合成した。反応後の濃縮物からは結晶化できなかったため、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：n-ブタノール／酢酸／水＝６：１：１）により精製した。無色固体。収率41％
¹H-NMR（270 MHz, CD₃OD-CD₃CO₂D, 4:1）:δ (ppm) 3.65 (1H, m), 4.03 (1H, m), 4.14 (2H, m), 6.22 (1H, dd, J = 6.0, 16.0 Hz), 6.80 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.22-7.40 (5H, m)
【００４５】
（実施例４） Edg受容体応答性試験
HL 60細胞を細胞銀行より入手し、BBRC `98, 263, p. 253記載の方法に従って、10%ウシ胎児血清を含有したRPMI -1640培地 (Gibco)を用いて約50継代培養し、Edg受容体を細胞表面に発現している前骨髄芽腫細胞株 HL60を調製した。このEdg受容体を細胞表面に発現している HL60を用いて、被験物質の細胞応答性を検討した。細胞応答の指標として、細胞内Ca<sup>2+</sup>濃度の上昇を測定した。なお、HL60細胞表面上のEdg受容体は、SPN - 1 Pと結合すると、Gタンパク質をリン酸化し、IP<sub>3</sub>キナーゼを活性化した後に細胞内 Ca<sup>2+</sup>濃度が上昇する事が報告されている (FEBS Letter `96, 379, p. 260, BBRC `98, 253, p. 253)ので、細胞内 Ca²⁺濃度がEdg受容体応答性の指標となる。
Ca²⁺キレート試薬Fura - 2 AMをHL 60細胞に取り込ませた。
石英製セル内に細胞懸濁液 1.2 mlを充填し、蛍光光度計 LS - 50 B（パーキンエルマー、細胞測定用）に装着し、0.5秒毎に励起波長を340 nm（Ca²⁺をキレートしたFura - 2を励起）と380 nm（未反応Fura - 2を励起）に交互に切り替え、510 nmの蛍光光度を測定した。
被験物質（実施例１、２または３の化合物）を30 microM終濃度で、マイクロシリンジを用いて加えた後蛍光光度を追跡してCa²⁺が増加するかどうか検討した。また、被験物質添加後に 1 microMのSPN - 1Pを追加した際、Ca²⁺が増加するかどうか確認し、各物質のSPN - 1P拮抗性について検討した。
実施例１または２の化合物を添加した後、SPN - 1P追加による細胞内Ca²⁺濃度増加が阻止された事より、これらの物質が Edg拮抗性である可能性が示唆された。
次に、拮抗の可能性が示唆された実施例１、２または３の化合物による細胞内Ca²⁺増加阻止作用の用量依存性を検討した。対照として、既に拮抗作用が確認されているスラミンを用いた。実験手法は、各濃度の被験物質添加後 SPN - 1 P（1 micro M)を添加した以外は上述と同様に行った。また、Ca²⁺濃度増加は、陰性対照群（薬剤無添加）でのCa²⁺増加濃度に対する相対値として、Ca²⁺増加濃度%で評価した。
その結果、実施例１の化合物が0.003〜0.03 microM濃度において、実施例２の化合物および実施例３の化合物が0.01〜0.1 microM濃度において、用量依存的にSPN - 1PによるCa²⁺濃度増加を抑制した。その結果を図１に示す。
また、細胞内Ca²⁺増加の50%阻止濃度（ED₅₀値）が、実施例１の化合物で 0.015±0.007 microM、実施例２の化合物で 0.030±0.002 microM、実施例３の化合物で 0.037±0.014 microMであったが、既に Edg拮抗性が報告されているスラミンの ED₅₀値 1.8±0.1 microMと比較すると実施例１の化合物の作用強度は凡そ 100倍、実施例２の化合物の作用強度は凡そ 60倍強かった。その結果を表１に示す。
【表１】

【００４６】
（実施例５） 血管平滑筋に及ぼす作用
被験物質について血管平滑筋増殖への作用を検討した。
動脈硬化症の進行に伴って血管平滑筋細胞が収縮型から合成型に形質転換し、炎症性サイトカインを分泌しながら血管平滑筋細胞が増殖し動脈硬化巣が進展すると考えられている（ロスの仮説）。血管平滑筋細胞の表面には Edg受容体が発現している事が報告されており（ The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics' 00, Vol. 58, 449頁）、SPN - 1 Pと同様、Edg受容体に作動するスフィンゴシルフォスフォリルコリンに応答して血管平滑筋細胞が増殖する事が報じられている ( The American Physiological Society 98, C 1255頁)。
従って、今回、実施例 1の化合物による血管平滑筋増殖への作用を検討した。陽性対照として、Edg受容体拮抗性が確認されているスラミンを用いた。
ラット頚動脈内膜をバルーニングによって擦過し、 2週間後にエクスプラント法 (Explant culture)によって調製した血管平滑筋細胞を 10%牛胎児血清を含んだDMEM培地 (Gibco)にて培養し、数回継代し安定させた後、 5× 10³細胞 / cm²の細胞密度に蒔種し実験に用いた。
増殖因子スフィンゴシルフォスフォリルコリン ( 10 microM )と併せて実施例 1の化合物、或いはスラミンを上述細胞に添加し、24時間後、BrdUアッセイ (Science '82, 218, p.474)によって細胞密度を測定した。その結果、実施例 1の化合物は 0.3〜3 microM濃度において、用量依存的に血管平滑筋細胞増殖を抑制した。なお、陽性対照として用いたスラミンについては 30、 100 microM濃度において血管平滑筋細胞増殖を抑制した。その結果を図２に示す。
【００４７】
(実施例 ６) ³H - SPN - 1 Pを用いた競合実験
実施例４と同じＥｄｇ受容体を細胞表面に発現している前骨髄芽腫細胞株ＨＬ６０を用いた。
ＨＬ60細胞を遠心分離によって回収後 F- 12培地（ 4℃保存、 10 ml）に懸濁し、 RI実験室に搬入した。細胞懸濁液 200 micro l（ 1×10⁶ 細胞/ml F- 12）に、終濃度 1 nMの³H- SPN - 1 P( 15 micro Ci/1 mM) と終濃度 100 nMの非標識化合物（実施例 1化合物、実施例 2化合物、実施例３化合物）を加え、 4℃にて 30分間（時々撹拌して）結合試験を行った。 7分間 12,000 rpmにて遠心分離後、上澄を素早く（細胞ペレットを傷付けない様に）マイクロピペッターで捨て去り、細胞ペレットをレディソルブ(ベックマン) 1.5 mlで懸濁後バイアルに移し液体シンチレーションカウンター L 2100(ベックマン)で放射活性を測定した。 その結果を以下の表２に示す。
この結果より、 SPN - 1 Pと同様、実施例 1化合物、実施例 2化合物、実施例３の化合物が、 ³H - SPN - 1 Pに競合した事より、これらの物質が Edgと特異的に結合していると考えられた。
【表２】

【００４８】
（実施例７） 疑似血管モデルを用いた抗炎症試験
体内の損傷部位で、露出を受けたコラーゲン（細胞外マトリックス）が損傷シグナルとして標的になり、血小板が凝集してくるが、凝集して活性化した血小板から放出される PDGFなどの炎症性サイトカインは、炎症を進行させ、また重度の炎症は循環器の恒常性を破錠させ、動脈硬化を進行させると考えられている。ＳＰＮ−１Ｐも、PDGFと同様の作用を有すると考えられている。
そこで、ＳＰＮ−１Ｐを炎症惹起剤として用いて、疑似血管 in vitroモデルを確立し、そのモデルを用いて、本発明化合物が抗炎症作用を示すかどうか、それによって循環器の恒常性を維持し、病態を改善する方向に作用する可能性があるか否か検討した。
【００４９】
（１）疑似血管in vitro炎症モデルの確立
３μｍ孔の多孔膜により上室と下室とに区切られたトランスウェルを用い、トランスウェル上室底面の孔膜上に一層のウシ内皮細胞を培養し、トランスウェル上室に蛍光標識した好中球浮遊液を加え、下室にＳＰＮ−１Ｐを終濃度 0.1〜10 microMとなるように懸濁した。即ち、トランスウェルの上室と下室は内皮層を隔てて隔離され、上室が血管内部、下室が血管外の炎症部に対応する疑似血管 in vitro炎症モデルとなっている。
上室から内皮層を潜り抜けて下室へ透過した好中球数、及び、内皮層に粘着した好中球数を５３０ｎｍの蛍光強度より測定し、相対的好中球数を以下のように算出した。
相対的好中球数％＝[実験群での好中球（透過及び粘着）数]／[コントロールでの好中球（透過及び粘着）数]ｘ１００
（コントロールは、ＳＰＮ−１Ｐ無添加の場合である）。
その結果、ＳＰＮ−１Ｐ 10 microMにて、有意に好中球の内皮層透過、及び、粘着が促進を受けた（図３参照）。つまり、ＳＰＮ−１Ｐが炎症惹起物質として作用していると考えられた。
【００５０】
（２）炎症細胞 - 血管内皮細胞相互作用に及ぼす本発明化合物の作用
次に、上記疑似血管in vitro炎症モデルを用いて、好中球と血管内皮細胞との相互作用に、実施例２の化合物がどのように影響するか検討した。
即ち、トランスウェル下室に実施例２の化合物を 0.01〜1 microMで添加し、ＳＰＮ−１Ｐ 10 micro Mを下室に入れて炎症を惹起した。コントロールは、薬剤無添加で上記と同様に炎症を惹起したものを用いた。
内皮層に粘着した好中球数、或いは内皮層を抜け下室へ透過した好中球数を５３０ｎｍの蛍光強度より測定し、相対的好中球数を上記式より算出した。
その結果を図４に示す。図に示されるように、実施例２の化合物は、好中球透過及び粘着を抑制した。
従って、疑似血管 in vitroモデルに於て、ＳＰＮ−１Ｐを炎症惹起剤として用いた場合、実施例２の化合物は抗炎症的に作用する事より、循環器の恒常性を維持し、病態を改善する方向に作用する可能性が考えられる。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の化合物は、優れたＥｄｇ受容体拮抗作用を示し、本発明の化合物を有効成分とする医薬は循環器系疾患（例えば、動脈硬化症、心臓疾患）、がん、リウマチ、糖尿病性網膜症、呼吸器系疾患に対して優れた予防または治療効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化合物が用量依存的にＥｄｇ拮抗性を示すグラフである（スラミン：対照）。
【図２】本発明の化合物が用量依存的に血管平滑筋細胞増殖の抑制作用を示すグラフである（スラミン：対照）。
図中、白四角は、被験物質をいれない場合のデータであり、また、＊：陰性対照に対し、危険率ｐ≦５％にて有意に抑制、＊＊：陰性対照に対し、危険率ｐ≦１％にて有意に抑制を示す。
【図３】内皮細胞-好中球相互作用に及ぼすＳＰＮ−１Ｐの作用を示す。
*：薬剤無添加のコントロールと比較して危険率 5%にて有意に促進
【図４】本発明化合物が好中球の血管内皮細胞への移動に抑制的に作用していることを示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel amino alcohol phosphate compound, a production method thereof, and a utilization method thereof. Such compounds antagonize the endothelial differentiation gene endothelial differentiation gene (Edg) receptor, anti-circulatory disease (eg anti-arteriosclerotic, anti-cardiopathic (eg anti-arrhythmic, anti-myocardial infarction)), It is useful as a drug showing antirheumatic, anticancer, antidiabetic retinopathy and antirespiratory disease.
[0002]
[Prior art]
Recent research in the fields of medicine and biochemistry has revealed the importance of sphingolipids in living organisms. Glycosphingolipids are recognized for intercellular recognition, regulation of cell growth, regulation of development and differentiation, infection, and cellular regulation. It has been suggested to play an important role in malignant transformation.
[0003]
On the other hand, sphingosine-1-phosphate (SPN-1P), which is a degradation metabolite of sphingolipids
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Although its role was not yet known, in recent years, an orphan receptor endothelial differentiation gene (Edg) with SPN-1P as an endogenous ligand has been found, and its physiological action has gradually become clear.
[0004]
Edg was cloned in 1990 as an orphan receptor [Edg-1 (JBC, `90, 265, p. 9308)], but later, Edg-3 (BB RC, `96, 227, p. 608) and Edg-5 (AGR 16 / H 218) (JCB,` 96, 135, p. 1071) were obtained, but their physiological roles were unknown. However, in 1998, it was suggested that SPN-1P might be an endogenous ligand of Edg-1 (Science, `98, 279, p. 1552), and then Edg-3 and Edg-5 were also It has been shown to be a SPN-1 P specific receptor (BBRC `99, 260, p. 263, JBC` 99, 274, p. 18997).
[0005]
Edg-1 on vascular endothelial cells up-regulates adhesion proteins such as cadherin by stimulation with SPN-1P (Science, `98, 279, p. 1552), and T lymphocyte-derived cell lines become SPN-1P Stimulates vascular layer invasion in an in vitro pseudovascular model (EMBO J., `98, vol. 17, No. 14, p. 4066). In addition, Okashima et al. Conducted a simulated blood vessel migration test using CHO cells in which Edg-1 or Edg-3 was forcibly expressed. In both cases, migration was promoted in a SPN-1P concentration-dependent manner (` 1999 Annual Meeting of the Biochemical Society of Japan p. 883). On the other hand, Igarashi et al. Reported that the cancer cell line F10 was SPN-1 P 10<sup>-8</sup>~Ten<sup>-6</sup> M was shown to undergo migration inhibition up to 80% in a concentration-dependent manner, but Edg-1 or Edg-3 was hardly expressed in F10 cells, and Edg-5 was expressed (` 1999 Japanese Biochemical Society). It is pointed out that SPN-1P may have suppressed migration due to different expression variants (`99 Annual Meeting of the Chemical Society of Japan p. 675, 883).
[0006]
Vascular smooth muscle cells (Eur. J. Biochem. `98, 257, p. 403) or airway smooth muscle cells (Biochem. J.` 99, 338, p. 643), both with SPN-1P response MAP kinase activation has been observed, and it has been pointed out that SPN-1P may act in the direction of vascular smooth muscle proliferation.
[0007]
Sugiyama et al. Administered SPN-1P to rats via the caudal vein route and observed hemodynamics, and observed a significant decrease in systolic blood pressure and left ventricular pressure time differential. SPN-1P In vivo, the possibility of acting in the direction of cardiac function decline was shown (`00 Pharmacological Society Abstracts P. 127). Muscarinic receptor-oriented K in guinea pig, mouse, and human cultured coronary artery smooth muscle cells⁺It is pointed out that SPN-1P is activated via Edg-3 and stimulates the vagus nerve causing dyspnea (Mollecular Pharmacology, '00, 58, 449). In addition, in the culture of rabbit sinoatrial cells, SPN-1P extends the period of a spontaneous pacemaker, suggesting that SPN-1P may have a negative effect on the cardiac cycle. (Pfuger Arch-Eur J Physiol '99, 438, 642).
[0008]
As a result of examining the effect of SPN-1P on vascular endothelial cells using an angiogenic animal model, SPN-1P binds Edg-1 and Edg-3 to angiogenesis by growth factors such as VEGF and FGF-2. It is pointed out that Edg may act on the progression of rheumatism, solid cancer and diabetic retinopathy (Cell `99, p. 301).
[0009]
As a result of excessive inflammation caused by the binding of SPN-1P and Edg receptor and airway remodeling, pneumonia, chronic obstructive airway disease (COPD), and respiratory hypertension may progress (Pulmonary Pharmacology & Therapeutics, 2000, 13, p. 99).
[0010]
It is reported that suramin, a protozoan trypanosome eradication agent, shows Edg-3 specific antagonistic properties and blocks SPN-1P and Edg binding signals (JBC `99, 274, 27, p. 18997) . Suramin has been shown to curatively respond to arteriosclerosis models (Circulation, `99, 100, p. 861, Cardiovascular Res.,` 94, 28, p. 1166). It is possible that Edg antagonism is involved.
[0011]
In summary, when SPN-1P binds to Edg, it acts to promote arteriosclerosis such as inflammatory cell activation, vascular smooth muscle cell proliferation, and hemodynamic deterioration. In addition, it has been shown that it may promote angiogenesis and act in the direction of progression of rheumatism, solid cancer, and diabetic retinopathy. That is, a substance that antagonizes Edg exhibits anti-cardiovascular disease properties such as anti-arteriosclerotic properties and anti-cardiac disease properties, anti-rheumatic properties, anti-cancer properties, anti-diabetic retinopathy properties and anti-respiratory disease properties. There is a possibility. Therefore, synthesis of various sphingolipids and discovery of substances having Edg antagonistic activity are extremely important in creating therapeutic agents for these diseases. However, since many steps are required for the synthesis of sphingolipids, there has been little structure-activity relationship research so far.
[0012]
So far, chemical synthesis methods of D-erythro type (2S, 3R form) sphingosine corresponding to the stereoisomer of the 3-position hydroxyl group, which is the most abundant as a natural type basic skeleton, have been studied and many reports have been made. . However, it is not easy to selectively synthesize L-threo form (2S, 3S form) having a different configuration from the natural form as described below, and the phosphorylated form thereof has not been synthesized. .
[0013]
As an example of synthesis so far, a method using an asymmetric aldol-type reaction (Ito et al., Tetrahedron Lett., 1988, Vol. 29, p. 239; EJ Corey et al., Tetrahedron Lett., 2000, Vol. 41, p. 2765) and the like have been reported, but there are problems such as special reagents used in the intermediate steps or complicated operations. In addition, a method of inverting the natural erythro type 3-position hydroxyl group is known, but there is a problem that a positional isomer is likely to be formed due to the presence of a double bond at the adjacent 4-position.
[0014]
A method for producing threo-type sphingosine using amino acid L-serine as a starting material is also known (P. Herold, Helv. Chim. Acta, 1988, Vol. 71, p. 354; I. Van Overmeire et al., J. Med). Chem., 1999, Vol. 42, p. 2697), but with this method, threo-type propargyl alcohols are obtained and then the triple bond is reduced to an alkene (double bond). Absent.
[0015]
A method is known in which an alkenylating agent (alkenylating metal reagent) is allowed to act directly on an aldehyde compound to produce two stereoisomers relating to the 3-position hydroxyl group of protected sphingosine, an erythro isomer and a threo isomer. . However, the production ratio of these isomers easily changes depending on the metal species, solvent, catalyst to be added, reaction temperature, etc., so it is difficult to set conditions for selectively producing isomers. Is difficult to separate. Furthermore, although the method obtained by erythro selective is known (Japanese Patent Laid-Open No. 7-291904, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1994, p. 1257), the method obtained by threo selective Is not known. Therefore, a simple method for obtaining a threo form by a reaction with high stereoselectivity is desired.
[0016]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel aminoalcohol phosphate compound having Edg receptor antagonistic activity, a simple production method and a utilization method thereof.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the threo-type aminoalcohol compound does not have an Edg receptor antagonistic activity, but is a phosphate compound of the following general formula I ( Hereinafter, it was found that the “compound of the present invention” has an Edg receptor antagonistic activity, and that the compound can be easily produced by a synthetic route excellent in stereoselectivity, and the present invention has been completed.
[0018]
The present invention relates to the following general formula I
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(In the formula, R represents linear or branched CH which may be substituted._ThreeC_nH_(2n-2m)-(N is any integer between 2 and 19, m is an unsaturation number and any integer between 0 and 3) or an aryl group which may be substituted ), A threo-type (2S, 3S) amino alcohol-1-phosphate compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The substituent in the general formula I will be described.
“CH which may be substituted_ThreeC_nH_(2n-2m)-"Substituted CH_ThreeC_nH_(2n-2m)-Means, for example, CH substituted with one or more selected from the group consisting of a hydroxyl group, a halogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an alkoxy group and an aryl group_ThreeC_nH_(2n-2m)-.
Specific examples of the “aryl group” include a phenyl group, a 1-naphthyl group, and a 2-naphthyl group.
The substituted aryl group of the “optionally substituted aryl group” is, for example, selected from the group consisting of an alkyl or alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms which may be linear or branched, a nitro group, and a halogen atom. An aryl group substituted with one or more.
[0020]
Preferred examples of R include the following.
n is preferably 5-16, more preferably 9-12.
m is preferably 0-1 and more preferably 0.
The position of the unsaturated bond is preferably the 8-position when n is 12.
[0021]
Particularly preferred compounds of the formula I compounds according to the invention are listed below.
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[0022]
The salt of the compound of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include lower alkyl sulfonates such as methanesulfonate, trifluoromethanesulfonate, and ethanesulfonate. Aryl sulfonates such as benzene sulfonate and p-toluene sulfonate, carboxylates such as acetate, fumarate, succinate, citrate, tartrate, oxalate, maleate, Examples thereof include amino acid salts such as glycine salt, alanine salt, glutamate and aspartate, and alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt.
[0023]
The compounds of the present invention all exhibit endothelial differentiation gene (Edg) receptor antagonistic properties, antagonize binding of Edg receptor agonists such as SPN-1P to Edg, and block the intracellular signal transduction system by these. it can.
In addition, when the compounds of the present invention are used as essential ingredients of a medicine, the above-mentioned characteristics are effectively expressed even when blended with other usual ingredients of the medicine.
Therefore, this invention provides the pharmaceutical which antagonizes an endothelial differentiation gene (Edg) receptor which contains this invention compound as an active ingredient.
The present invention also relates to diseases caused by inflammatory cell activation, vascular smooth muscle proliferation, hemodynamic deterioration, and angiogenesis, such as cardiovascular diseases (eg, arteriosclerosis, heart disease (eg, myocardial infarction, arrhythmia)). ), Rheumatoid arthritis (eg, rheumatoid arthritis), cancer, diabetic retinopathy, respiratory disease (eg, pneumonia, chronic obstructive airway disease, respiratory hypertension) To do.
Here, the “circulatory system disease” refers to a disease in which a circulatory state such as blood or lymph is impaired and damages a tissue or a cell. As an example, an arteriosclerotic disease (for example, atherosclerosis (粥Condition) sclerosis), heart disease (eg, myocardial infarction, arrhythmia).
Here, “respiratory system diseases” refers to diseases in which respiratory organs such as trachea, bronchi, and lungs are impaired and related symptoms, such as asthma (immediate type, delayed type, allergic type). Asthma, etc.), bronchial asthma, allergic rhinitis, eosinophil infiltration, bronchitis (chronic bronchitis, etc.), airway inflammation, emphysema, pneumonia, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute respiratory distress syndrome, respiratory hypertension Dyspnea, pain, cough, sputum, vomiting, shortness of breath.
[0024]
In order to use the compound of the present invention as a pharmaceutical, any form of a solid composition, a liquid composition, and other compositions may be used, and the optimum one is selected as necessary. The pharmaceutical composition is prepared by adding a pharmaceutically acceptable carrier, that is, a usual excipient, a bulking agent, a binder, a disintegrant, a pH adjusting agent, a solubilizing agent, etc. to the compound of the present invention. Depending on the technology, it can be prepared into tablets, pills, capsules, granules, powders, solutions, emulsions, suspensions, injections, and the like. Examples of excipients and extenders include lactose, magnesium stearate, starch, talc, gelatin, agar, pectin, gum arabic, olive oil, sesame oil, cocoa butter, ethylene glycol, and other commonly used ones. it can.
In order to prevent oxidation of the preparation, an antioxidant (such as tocopherol) can be added, it can be included in a clathrate such as cyclodextrin, or it can be encapsulated with a film such as gelatin.
Further, the compound can be prepared as an O / W type preparation using phospholipid or nonionic surfactant as an emulsifier as described in JP-A-6-298642. The emulsifiers can be used alone or in combination of two or more, and the addition amount may be appropriate, but is 0.001 to 10% (W / V), preferably 0.01 to 5% (W / V).
As the phospholipid, soybean-derived phospholipid, egg yolk-derived phospholipid, lysolecithin, phosphatidylcholine (lecithin), phosphatidylserine, or the like can be used alone or in combination. Non-surfactants include polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers having a molecular weight of 500 to 15000 (for example, Pluronic F-68), polyalkylene glycols having a molecular weight of 1,000 to 10,000, and polyoxyalkylene copolymers having a molecular weight of 1,000 to 20,000. Polymer, hydrogenated castor oil polyoxyalkylene derivative, castor oil polyoxyalkylene derivative, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene castor oil, hydrogenated castor oil, polyoxyethylene alkyl ether, sucrose fatty acid An ester or the like alone or in combination is preferably used, but is not limited thereto.
The compounding amount of each compound in the present invention is about 0.0001 to about 100 mg / kg body weight / day based on pharmaceuticals, and can be administered orally or parenterally once or several times a day. This dose can be appropriately increased or decreased depending on the type of disease, the age, weight and symptoms of the patient.
[0025]
The compound of the present invention can be produced by the following production method.
The production method of the compound of formula I will be described below including preparation examples of reaction raw materials.
(1) Preparation examples of reaction raw materials
(A) Synthesis of alkenylating agent
Formula V
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(In the formula, R represents linear or branched CH which may be substituted._ThreeC_nH_(2n-2m)-(N is any integer between 2 and 19, and m is any integer between 0 and 3 and represents an unsaturated number) or an optionally substituted aryl group , Cp represents a cyclopentadienyl group), and dialkyl zinc is allowed to act on the organic zirconium compound represented by the following formula to prepare an alkenylating agent.
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The above reaction can be preferably performed using an equimolar amount of dialkylzinc with respect to the organic zirconium compound represented by the general formula V.
As the dialkyl zinc, lower dialkyl zinc (for example, dimethyl zinc or diethyl zinc) is suitable.
The organozirconium compound represented by the general formula V can be obtained by a known method (J. Schwartz et al., Org. Synth., 1992, Vol. 71, p. 83) by hydrogenated zirconocene chloride and 1-alkyne or arylacetylenes. Prepared by acting in an organic solvent.
Commercially available zirconocene hydrogenated hydride used for the production of the organic zirconium compound represented by the general formula V can be used as a commercially available method (SL Buchwald et al., Org. Synth., 1992, Vol. 71, p. 77). ) Can also be prepared from inexpensive zirconocene dichloride.
The 1-alkyne used for the production of the organic zirconium compound represented by the general formula V can be a linear or branched one having 5 to 22 carbon atoms, and contains a double bond in the molecule. Also good. Specifically, it is 1-octyne, 1-dodecin, 1-pentadecine and the like. Particularly, in the case of 1-pentadecine having 15 carbon atoms, the most C18 sphingosine is obtained in natural products.
Arylacetylenes can also be used, and the aryl may have a substituent. Specific examples include phenylacetylene, 4-chlorophenylacetylene, 1-naphthylacetylene and the like.
[0026]
(B) Synthesis of N-protected (S) -formyloxazolidine derivatives
N-protected (S) -formyloxazolidine derivatives of formula III below can be synthesized by conventional methods, for example, from (S) -serine to the method of Garner et al. (J. Org. Chem., 1987, Vol. 52). , 2361, Org. Synth., 1991, Vol. 70, p. 18), or commercially available products can be used.
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(Wherein A is a protecting group for N, B and C are alkyl groups (for example, methyl group, ethyl group, etc.), or B and C together with the carbon atom to which they are bonded are cyclic alkyl groups (for example, , Cyclopentyl group, cyclohexyl group, etc.))
Here, examples of the protecting group A for N include benzyloxycarbonyl (Z), t-butoxycarbonyl (Boc), t-amyloxycarbonyl (Aoc), isobornyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, 2 -Groups such as -chloro-benzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, and the like. Preferably, Boc is used.
[0027]
(2) Synthesis of compounds of formula I
A synthetic scheme for the compound of formula I is shown below.
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[0028]
First Step: The alkenylating agent obtained in (1) (A) above is reacted with the N-protected (S) -formyloxazolidine derivative of formula III obtained in (1) (B) above to give the formula The threo form of II is selectively obtained.
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As the reaction solvent, a halogenated hydrocarbon such as methylene chloride is suitable for selectively obtaining a threo form. The reaction temperature is preferably −30 to 30 ° C., particularly preferably −20 to 0 ° C. A reaction time of about several hours is sufficient.
As a result, a threo body II having a hydroxyl configuration different from that of the natural type is selectively obtained (threo / erythro = 9/1 or more).
[0029]
Next, with respect to the compound of formula II, corresponding to the following 2-4 steps, (1) removal of acetal type protecting group, (2) selective phosphorylation of primary hydroxyl group, (3) total protection A simple production method for obtaining a threo body by carrying out in the order of three steps of removal of a group was established by the present invention. This will be described in detail below.
It is to be noted that the threo form of compound II can be obtained by using a method similar to the method for producing an erythro compound described in JP-T 8-500816, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1992, Vol. 2, p. 973. I can be produced, but since this method requires protection of the secondary hydroxyl group, it requires 5 steps, requires purification by chromatography between each step, and the operation is extremely complicated. Convenient.
[0030]
Second Step: The oxazoline of Compound II is opened to remove the acetal type protecting group, and the general formula VI
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(Wherein R and A are as defined above) to obtain an alcohol compound in which the amino group is protected.
The reaction can be carried out in a solvent using an acid such as hydrochloric acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, or a strongly acidic ion exchange resin at -20 to 100 ° C. for several tens of minutes to several tens of hours. . However, it is important to select reaction conditions such that the amino protecting group is not removed. It is particularly preferable to carry out the heating to about 50 ° C. in about 90% aqueous acetic acid, and the reaction is completed in several hours.
[0031]
Third step: The amino group-protected alcohol compound (compound VI) obtained in the second step is converted into the following 1-phosphate analog (compound VII).
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(Wherein R and A are the same as described above, and R ′ is a lower alkyl group (for example, a methyl group or an ethyl group))
The above reaction can be carried out using a known phosphorylating agent effective for selectively reacting the primary hydroxyl group of the two hydroxyl groups of compound VI.
The simplest and preferred method is the method reported by A. Bielawska et al. (Tetrahedron Lett., 2000, Vol. 41, p. 7821), described in detail below.
A phosphoramidite method has also been proposed as a selective phosphorylation method (A. Boumendjel et al., J. Lipid. Res., 1994, Vol. 35, p. 2305), but it is necessary to prepare a phosphorus reagent. Since the oxidation step is necessary, the following method is preferable.
According to the method of A. Bielawska et al., Compound VI is reacted with trialkyl phosphite and carbon tetrabromide in an organic base (eg, pyridine).
The phosphorylating agent is preferably trimethyl phosphite or triethyl phosphite, and the amount used is 1 to 3 equivalents relative to compound VI. The amount of carbon tetrabromide used is preferably 1 to 3 equivalents relative to VI. The reaction can be performed at -20 ° C to 50 ° C, preferably 0 ° C to room temperature, for several tens of minutes to several tens of hours.
[0032]
Fourth step: Each protecting group of the amino group and phosphate group of compound VII is removed.
The reaction in the fourth step can be performed by reacting an acidic substance in a solvent. The acidic substance is preferably trimethylsilane bromide, trimethylsilane iodide, or a combination of trimethylsilane chloride and sodium iodide, and the amount used is 3 to 10 equivalents, particularly 5 to 6 equivalents relative to VII. is there. The solvent is preferably a halogenated hydrocarbon such as methylene chloride. The reaction temperature is preferably room temperature to 40 ° C.
In addition, when the protecting group on the phosphate group is converted into another group (for example, trimethylsilyl (TMS) group) by the acidic substance used, the converted group is reacted after the reaction solvent is distilled off. The liquid can be removed by acidification and hydrolysis.
Finally, after concentration, the volatile acidic substance is distilled off azeotropically and recrystallized (for example, from a THF-water mixed solvent or the like) to obtain pure Compound I. If crystals are difficult to precipitate, purify by silica gel chromatography, and if necessary, recrystallize.
[0033]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to examples, but this does not limit the technical scope of the present invention.
Example 1 Threo-C15-sphingosine-1-phosphate (in Compound I, R = n-C_TenH_{twenty one})
1. Threo-C15-N-Boc-N, 1O-isopropylidene-sphingosine (in compound II, R = n-C_TenH_{twenty one}, A = Boc, B = CH_Three, C = CH_Three)
Under an argon atmosphere, 490 mg (1.8 mmol) of hydrogenated zirconocene chloride was suspended in 2 ml of methylene chloride, and 1-dodecine (R = n-C) while cooling with ice_TenH_{twenty one}) 310 mg (1.8 mmol) of methylene chloride solution (2 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour to prepare Compound V. The reaction solution was cooled to −20 ° C., and then 1.8 ml (1.8 mmol) of 1.0 M hexane solution of diethyl zinc was added and stirred for about 10 minutes. Aldehyde compound III (A = Boc, B = CH_Three, C = CH_Three) 118 mg (1.0 mmol) of methylene chloride solution (2 ml) was added, and the mixture was stirred at −20 to 0 ° C. for 3 hours. A saturated aqueous ammonium chloride solution was added, ethyl acetate was added, and the mixture was stirred for a while. The resulting precipitate was filtered and washed with ethyl acetate. The layers were separated and the organic layer was washed with saturated brine, and then the aqueous layers were combined and extracted twice with ethyl acetate. The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated to dryness, leaving 600 mg of a pale yellow oil. This was purified by silica gel chromatography (hexane / ethyl acetate = 9: 1 → 6: 1 → 4: 1) to give 350 mg (yield 88%) of the title compound as a colorless oil.
[α]_D −41.4 ° (c 1.26, CHCl_Three)
¹H-NMR (C₆D₆, 80 ° C): δ (ppm) 0.89 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.28 (16H, s), 1.40 (9H, s), 1.45 (3H, s), 1.64 (3H, s), 1.99 (2H, q, J = 6.7 Hz), 3.69 (1H, d, J = 6.3, 9.3 Hz), 3.90 (1H, dd, J = 1.8, 9.3 Hz), 3.95 (1H, dt, J = 1.5, 6.6 Hz), 4.41 (1H, t, J = 7.0 Hz), 5.53 (1H, dd, J = 7.1, 15.4 Hz), 5.71 (1H, dt, J = 6.7, 15.4 Hz),
m / z (CI): C_{twenty three}H₄₄NO_Four (M + H)⁺Calculated as, 398.3200, measured 398.3212
[0034]
2. Threo-C15-Boc-sphingosine (in compound VI R = n-C_TenH_{twenty one}, A = Boc)
95 mg (0.24 mmol) of the compound obtained in 1 was dissolved in 0.9 ml of acetic acid and 0.1 ml of water, and stirred at 50 ° C. for 5 hours. After evaporation of the solvent, 1 ml of heptane was added and concentrated to dryness to leave a pale yellow oil. This was purified by silica gel chromatography (hexane / ethyl acetate = 2: 1 → 1: 1) to give 70 mg (yield 82%) of the title compound as a colorless oil.
[α]_D −1.6 ° (c 1.78, CHCl_Three)
¹H-NMR (270 MHz, CDCl_Three): Δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.7 Hz), 1.25 (14H, s), 1.34 (2H, m), 1.43 (9H, s), 2.02 (2H, q, J = 6.7 Hz) , 2.82 (1H, broad), 3.61 (1H, m), 3.77 (2H, d-like, 3.7 Hz), 4.33 (1H, m), 5.18 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.50 (1H, dd, J = 6.3, 15.6 Hz), 5.74 (1H, dt, J = 6.7, 15.4 Hz)
¹³C-NMR (CDCl_Three14.1, 22.6, 28.3, 28.4, 29.0, 29.2, 29.3, 29.5, 29.6, 31.9, 32.3, 55.5, 64.2, 73.4, 79.7, 128.9, 134.0, 156.6
Elemental analysis value (C₂₀H₃₉NO_FourAs)
Found (%): C 67.08; H11.15; N 3.87
Calculated (%): C 67.19; H10.99; N 3.92
[0035]
3. Threo-C15-sphingosine-1-phosphate ester (in compound VII, R = n-C_TenH_{twenty one}, A = H, R ′ = CH_Three)
In a nitrogen atmosphere, 65 mg (0.18 mmol) of the compound obtained in 2 and 135 mg (0.4 mmol) of carbon tetrabromide were dissolved in 1 ml of pyridine, and 50 mg (0.4 mmol) of trimethyl phosphite was added while cooling. Stir at room temperature for 5 hours. A saturated aqueous ammonium chloride solution and ethyl acetate were added thereto and stirred for a while, and then the layers were separated. The organic layer was washed with saturated brine, and then the aqueous layers were combined and extracted twice with ethyl acetate. The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated to dryness to leave a pale yellow oil. This was purified by silica gel chromatography (hexane / ethyl acetate = 1: 1 → 1: 2) to give 59 mg (yield 70%) of the title compound as a colorless oil, which was obtained as starting material (2). 9 mg (14%) of the compound was recovered.
[α]_D −5.4 ° (c 1.4, CHCl_Three)
¹H-NMR (270 MHz, CDCl_Three): Δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.25 (14H, s), 1.33 (2H, m), 1.42 (9H, s), 2.02 (2H, q, J = 6.7 Hz) , 3.77 (3H, d, J = 11.2 Hz), 3.78 (3H, d, J = 11.2 Hz), 3.79 (1H, m), 4.09 (2H, m), 4.33 (1H, m), 5.03 (d, J = 9.0 Hz), 5.46 (1H, dd, J = 6.0, 15.4 Hz), 5.76 (1H, dt, J = 6.7, 15.4 Hz)
¹³C-NMR (CDCl_Three14.1, 22.7, 28.3, 29.1, 29.2, 29.3, 29.5, 29.57, 29.61, 29.7, 31.9, 32.3, 54.0, 54.4, 54.7, 66.1, 70.0, 79.7, 128.4, 134.0, 156.0 m / z (CI): C_{twenty two}H₄₅NO₇P (M + H)⁺Calculated as, 466.2863, measured, 466.2855
[0036]
4). Threo-C15-sphingosine-1-phosphate (in compound I, R = n-C_TenH_{twenty one})
23 mg (0.05 mmol) of the compound obtained in 3 was dissolved in 1 ml of methylene chloride, cooled, 50 microL (0.3 mmol) of trimethylsilane bromide was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After concentrating this solution, 0.5 ml of dioxane and 0.5 ml of water were added and stirred for about 2 hours. This was concentrated, 1 ml of methanol was added, and the mixture was concentrated again. The remaining 20 mg was recrystallized from THF-water (2: 1) to give 12 mg (yield 71%) of the title compound as a colorless solid.
¹H-NMR (270 MHz, CD_ThreeOD-CD_ThreeCO₂D, 3: 1): δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.7 Hz), 1.27 (14H, s), 1.39 (2H, m), 2.07 (2H, q, J = 6.6 Hz), 3.41 (1H, m), 3.92 (1H, dd, J = 7.0, 12.1 Hz), 4.06 (1H, m), 4.17 (1H, t, J = 7.8 Hz), 5.45 (1H, dd, J = 7.7, 15.3 Hz), 5.86 (1H, dt, J = 6.6, 15.1 Hz)
m / z (CI): C₁₅H₃₄NO_FiveP (M + H)⁺As calculated, 338.2026, measured, 338.2051.
[0037]
Example 2 Threo-C18-sphingosine-1-phosphate (in Compound I, R = n-C₁₃H₂₇)
1. Threo-C18-N-Boc-N, 1O-isopropylidene-sphingosine (in compound II, R = n-C₁₃H₂₇, A = Boc, B = CH_Three, C = CH_Three)
Synthesis was performed in the same manner as in Example 1. Colorless oil. Yield 86%
[α]_D −37.8 ° (c 0.84, CHCl_Three)
¹H-NMR (C₆D₆, 80 ° C): δ (ppm) 0.89 (3H, t, J = 6.7 Hz), 1.31 (22H, s), 1.40 (9H, s), 1.45 (3H, s), 1.64 (3H, s), 1.99 (2H, q, J = 6.8 Hz), 3.69 (1H, dd, J = 6.3, 9.0 Hz), 3.90 (1H, dd, J = 1.5, 9.3 Hz), 3.95 (1H, dt, J = 1.5, 6.6 Hz), 4.41 (1H, t, J = 7.0 Hz), 5.53 (1H, dd, J = 6.8, 15.3 Hz), 5.71 (1H, dt, J = 6.7, 15.4 Hz),¹³C-NMR (C₆D₆14.1, 23.0, 24.3, 27.1, 28.4, 28.5, 29.5, 29.6, 29.7, 29.9, 30.1, 32.3, 32.6, 62.5, 64.8, 74.8, 80.3, 94.6, 130.6, 134.0, 156.6 m / z (CI): C₂₆H₅₀NO_Four (M + H)⁺Calculated as: 440.3670, Actual: 440.3652
[0038]
2. Threo-C18-Boc-sphingosine (in compound VI, R = n-C₁₃H₂₇, A = Boc)
The compound was synthesized in the same manner as in Example 1. Colorless solid. Yield 80%
Melting point: 58-60 ° C
[α]_D −0.7 ° (c 1.6, CHCl_Three)
¹H-NMR (270 MHz, CDCl_Three): Δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.7 Hz), 1.25 (20H, s), 1.34 (2H, m), 1.44 (9H, s), 2.03 (2H, q, J = 6.8 Hz) , 2.60 (1H, broad), 3.61 (1H, m), 3.78 (2H, d-like, 3.7 Hz), 4.34 (1H, dd, J = 2.9, 6.1 Hz), 5.18 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.50 (1H, dd, J = 6.5, 15.5 Hz), 5.74 (1H, dt, J = 6.8, 15.4 Hz)
¹³C-NMR (CDCl_Three14.1, 22.7, 28.3, 28.4, 29.0, 29.2, 29.3, 29.5, 29.58, 29.63, 29.7, 31.9, 32.3, 55.5, 64.3, 73.4, 79.7, 128.9, 134.0, 156.6
Elemental analysis value (C_{twenty three}H₄₅NO_FourAs)
Found (%): C 69.22; H11.45; N 3.47
Calculated (%): C 69.13; H11.35; N 3.51
[0039]
3. Threo-C18-sphingosine-1-phosphate ester (in compound VII, R = n-C₁₃H₂₇, A = H, R ′ = CH_Three)
Synthesis was performed in the same manner as in Example 1. Colorless oil. Yield 65%
[α]_D −3.5 ° (c 1.0, CHCl_Three)
¹H-NMR (270 MHz, CDCl_Three): Δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.25 (22H, s), 1.42 (9H, s), 2.02 (2H, q, J = 6.7 Hz), 3.77 (3H, d, J = 11.2 Hz), 3.78 (3H, d, J = 11.2 Hz), 3.79 (1H, m), 4.09 (2H, m), 4.33 (1H, m), 5.03 (d, J = 9.0 Hz), 5.46 (1H, dd, J = 6.0, 15.4 Hz), 5.76 (1H, dt, J = 6.7, 15.4 Hz)
¹³C-NMR (CDCl_Three14.1, 22.7, 28.3, 29.1, 29.2, 29.3, 29.4, 29.5, 29.58, 29.63, 29.7, 31.9, 32.3, 54.3, 54.5, 54.6, 66.2, 70.1, 79.7, 128.4, 134.0, 156.0 m / z (CI) : C_{twenty five}H₅₁NO₇P (M + H)⁺As calculated, 508.3333, measured, 508.3335
[0040]
4). Threo-C18-sphingosine-1-phosphate (in compound I, R = n-C₁₃H₂₇)
The compound was synthesized in the same manner as in Example 1. Colorless solid. Yield 62%
¹H-NMR (270 MHz, CD_ThreeOD-CD_ThreeCO₂D, 3: 1): δ (ppm) 0.87 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.26 (20H, s), 1.38 (2H, m), 2.06 (2H, q, J = 6.6 Hz), 3.37 (1H, m), 3.95 (1H, dd, J = 7.0, 12.1 Hz), 4.07 (1H, m), 4.19 (1H, t, J = 7.8 Hz), 5.44 (1H, dd, J = 7.7, 15.3 Hz), 5.86 (1H, dt, J = 6.6, 15.2 Hz)
Elemental analysis value (C₁₈H₃₈NO_FiveAs P)
Found (%): C 56.82; H11.35; N 3.57
Calculated (%): C 56.97; H10.09; N 3.69
[0041]
Example 3 Threo-2-amino-3-cinnamyl-1,3-diol-1-phosphate (In Compound I, R = C₆H_Five)
1. Threo-cinnamyl alcohol derivative (in compound II, R = C₆H_Five, A = Boc, B = CH_Three, C = CH_Three)
Phenylacetylene 103 mg (1.0 mmol), hydrogenated zirconocene 265 mg (1.0 mmol), diethylzinc 1.0 M in hexane solution 0.9 ml (0.9 mmol), aldehyde compound III (A = Boc, B = CH_Three, C = CH_Three) Using 135 mg (0.6 mmol) in the same manner as 1 in Example 1, 180 mg (yield 92%) of the title compound was obtained as a colorless oil.
[α]_D −89.1 ° (c 1.48, CHCl_Three)
¹H-NMR (C₆D₆, 80 ° C): δ (ppm) 1.39 (9H, s), 1.42 (3H, s), 1.59 (3H, s), 3.67 (1H, dd, J = 6.3, 9.3 Hz), 3.94 (1H, dd, J = 2.0, 9.3 Hz), 4.02 (1H, dt, J = 2.0, 6.4 Hz), 4.60 (1H, t, J = 6.7 Hz), 6.22 (1H, dd, J = 7.1, 15.9 Hz), 6.62 ( 1H, d, J = 15.9 Hz), 7.00-7.15 (3H, m), 7.26 (2H, m)¹³C-NMR (C₆D₆24.3, 27.1, 28.5, 62.5, 64.5, 74.4, 80.4, 94.6, 127.0, 127.1, 128.8, 128.9, 129.9, 132.7, 156.6
m / z (CI): C₁₉H₂₈NO_Four (M + H)⁺Calculated as: 334.1948, Actual: 334.1962
[0042]
2. Cinnamyl-type threo-Boc amino alcohol derivative (in compound VI, R = C₆H_Five, A = Boc)
The compound was synthesized in the same manner as in Example 1. Compound II (R = C₆H_Five84 mg (0.25 mmol) gave 66 mg (89% yield) of the title compound as a colorless solid.
Melting point: 78-80 ° C
[α]_D + 11.3 ° (c 1.32, CHCl_Three)
¹H-NMR (270 MHz, CDCl_Three): Δ (ppm) 1.43 (9H, s), 2.03 (2H, q, J = 6.8 Hz), 3.75 (1H, broad), 3.79 (1H, m), 3.85 (2H,), 4.64 (1H, m ), 5.37 (1H, d, J = 8.3 Hz), 6.27 (1H, dd, J = 5.9, 15.9 Hz), 6.69 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.22-7.42 (5H, m)
¹³C-NMR (CDCl_Three) 28.2, 55.6, 63.5, 72.6, 79.9, 126.5 (2C), 127.7, 128.5 (2C), 128.8, 131.4, 136.5, 156.6
Elemental analysis value (C₁₆H_{twenty three}NO_FourAs)
Found (%): C 65.24; H 8.03; N 4.67
Calculated (%): C 65.51; H 7.90; N 4.77
[0043]
3. Cinnamyl-type threo-Boc aminoalcohol phosphate ester (in compound VII, R = C₆H_Five, A = H, R ′ = CH_Three)
Synthesis was performed in the same manner as in Example 1. Colorless oil. Yield 65%
[α]_D + 0.9 ° (c 0.9, CHCl_Three)
¹H-NMR (270 MHz, CDCl_Three): Δ (ppm) 1.37 (9H, s), 3.76 (3H, d, J = 11.2 Hz), 3.78 (3H, d, J = 11.1 Hz), 3.93 (1H, m), 4.15 (2H, m) , 4.58 (1H, m), 5.12 (d, J = 8.3 Hz), 6.20 (1H, dd, J = 5.4, 16.0 Hz), 6.70 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.18-7.40 (5H, m)
¹³C-NMR (CDCl_Three) 28.2, 54.3, 54.5, 54.6, 66.0, 66.9, 79.8, 126.5 (2C), 127.6, 128.3, 128.5 (2C), 131.6, 136.6, 156.0
m / z (CI): C₁₈H₂₉NO₇P (M + H)⁺Calculated value as: 402.11611, actual value: 402.1632
[0044]
4). Threo-2-amino-3-cinnamyl-1,3-diol-1-phosphate (in Compound I, R = C₆H_Five)
The compound was synthesized in the same manner as in Example 1. Since it could not be crystallized from the concentrate after the reaction, it was purified by silica gel chromatography (developing solvent: n-butanol / acetic acid / water = 6: 1: 1). Colorless solid. Yield 41%
¹H-NMR (270 MHz, CD_ThreeOD-CD_ThreeCO₂D, 4: 1): δ (ppm) 3.65 (1H, m), 4.03 (1H, m), 4.14 (2H, m), 6.22 (1H, dd, J = 6.0, 16.0 Hz), 6.80 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.22-7.40 (5H, m)
[0045]
(Example 4) Edg receptor responsiveness test
HL 60 cells were obtained from the cell bank and subcultured for about 50 passages using RPMI -1640 medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum according to the method described in BBRC `98, 263, p. 253. Promyeloblastoma cell line HL60 expressing the receptor on the cell surface was prepared. Using HL60 expressing this Edg receptor on the cell surface, the cell responsiveness of the test substance was examined. Intracellular Ca as an indicator of cellular response<sup>2+</sup>The increase in concentration was measured. The Edg receptor on the HL60 cell surface phosphorylates G protein when bound to SPN-1P, and IP<sub>Three</sub>Intracellular Ca after activating kinase<sup>2+</sup>It has been reported that the concentration increases (FEBS Letter `96, 379, p. 260, BBRC` 98, 253, p. 253).²⁺Concentration is an indicator of Edg receptor responsiveness.
Ca²⁺The chelating reagent Fura-2 AM was incorporated into HL 60 cells.
A cell made of quartz is filled with 1.2 ml of cell suspension and attached to a fluorimeter LS-50B (Perkin Elmer, for cell measurement), with an excitation wavelength of 340 nm (Ca) every 0.5 seconds.²⁺Were alternately switched to 380 nm (excited unreacted Fura-2), and the fluorescence intensity at 510 nm was measured.
After adding the test substance (compound of Example 1, 2 or 3) at a final concentration of 30 microM using a microsyringe, the fluorescence intensity is traced and Ca is added.²⁺Was examined to increase. In addition, when adding 1 microM SPN-1P after adding the test substance,²⁺Was confirmed, and the SPN-1P antagonistic properties of each substance were examined.
After adding the compound of Example 1 or 2, intracellular Ca by addition of SPN-1P²⁺The fact that the increase in concentration was blocked suggested that these substances may be Edg antagonistic.
Next, intracellular Ca by the compound of Example 1, 2, or 3 suggested the possibility of antagonism.²⁺The dose dependency of the increase inhibitory effect was examined. As a control, suramin whose antagonism has already been confirmed was used. The experimental procedure was the same as described above except that SPN-1P (1 microM) was added after the addition of the test substance at each concentration. Ca²⁺Concentration increase is due to Ca in the negative control group (no drug added)²⁺As a relative value to the increasing concentration, Ca²⁺Evaluation was based on increasing concentration%.
As a result, the compound of Example 1 at a concentration of 0.003 to 0.03 microM, the compound of Example 2 and the compound of Example 3 at a concentration of 0.01 to 0.1 microM in a dose-dependent manner by Ca of SPN-1P.²⁺Concentration increase was suppressed. The result is shown in FIG.
In addition, intracellular Ca²⁺Increased 50% inhibitory concentration (ED₅₀The value) was 0.015 ± 0.007 microM for the compound of Example 1, 0.030 ± 0.002 microM for the compound of Example 2, and 0.037 ± 0.014 microM for the compound of Example 3. Edg antagonisticity has already been reported. Suramin ED₅₀Compared with the value 1.8 ± 0.1 microM, the action strength of the compound of Example 1 was about 100 times, and the action strength of the compound of Example 2 was about 60 times stronger. The results are shown in Table 1.
[Table 1]

[0046]
(Example 5) Effect on vascular smooth muscle
The test substance was examined for its effect on vascular smooth muscle proliferation.
As arteriosclerosis progresses, vascular smooth muscle cells are transformed from contraction type to synthetic type, and vascular smooth muscle cells proliferate and secrete inflammatory cytokines. hypothesis). It has been reported that Edg receptor is expressed on the surface of vascular smooth muscle cells (The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics' 00, Vol. 58, p. 449). It has been reported that vascular smooth muscle cells proliferate in response to sphingosylphosphorylcholine acting on the receptor (The American Physiological Society 98, C 1255).
Therefore, the effect of the compound of Example 1 on vascular smooth muscle proliferation was examined this time. As a positive control, suramin confirmed to be an Edg receptor antagonist was used.
Rat carotid intima was scraped by ballooning, and after 2 weeks, vascular smooth muscle cells prepared by Explant culture were cultured in DMEM medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum, and subcultured several times. 5 × 10 after stabilization^ThreeCell / cm²The cell density was used for the experiment.
The compound of Example 1 or suramin in combination with the growth factor sphingosylphosphorylcholine (10 microM) is added to the above cells, and 24 hours later, the cell density is determined by BrdU assay (Science '82, 218, p.474). It was measured. As a result, the compound of Example 1 inhibited vascular smooth muscle cell proliferation in a dose-dependent manner at a concentration of 0.3 to 3 microM. For suramin used as a positive control, vascular smooth muscle cell proliferation was suppressed at 30 and 100 microM concentrations. The result is shown in FIG.
[0047]
(Example 6)^ThreeCompetition experiments using H-SPN-1P
A promyeloblastoma cell line HL60 expressing the same Edg receptor as in Example 4 on the cell surface was used.
HL60 cells were collected by centrifugation, suspended in F-12 medium (stored at 4 ° C., 10 ml), and carried into the RI laboratory. Cell suspension 200 micro l (1 × 10⁶ Cells / ml F-12) to a final concentration of 1 nM^ThreeH-SPN-1P (15 micro Ci / 1 mM) and a final concentration of 100 nM unlabeled compound (Example 1 compound, Example 2 compound, Example 3 compound) were added, and 30 minutes at 4 ° C (sometimes The binding test was performed (with stirring). After centrifuging at 12,000 rpm for 7 minutes, the supernatant is quickly discarded with a micropipettor (so as not to damage the cell pellet). The cell pellet is suspended in 1.5 ml of Readysolv (Beckman) and transferred to a vial. Radioactivity was measured with Beckman. The results are shown in Table 2 below.
From this result, the compound of Example 1 compound, Example 2 compound, and Example 3 are similar to SPN-1P.^ThreeFrom the competition with H-SPN-1P, these substances were considered to bind specifically to Edg.
[Table 2]

[0048]
(Example 7) Anti-inflammatory test using pseudo blood vessel model
The exposed collagen (extracellular matrix) is targeted as a damage signal at the site of damage in the body, and platelets aggregate. However, inflammatory cytokines such as PDGF released from aggregated and activated platelets Inflammation is promoted, and severe inflammation is thought to break cardiovascular homeostasis and advance arteriosclerosis. SPN-1P is also considered to have the same action as PDGF.
Thus, a pseudovascular in vitro model was established using SPN-1P as an inflammation-inducing agent, and whether or not the compound of the present invention exhibits an anti-inflammatory action by using the model, thereby maintaining cardiovascular homeostasis. We examined whether there is a possibility of acting in the direction of improving the disease state.
[0049]
(1) Establishment of pseudovascular in vitro inflammation model
Using a transwell divided into an upper chamber and a lower chamber by a 3 μm pore porous membrane, a layer of bovine endothelial cells was cultured on the pore membrane at the bottom of the upper chamber of the transwell, and the transwell upper chamber was fluorescently labeled A sphere suspension was added, and SPN-1P was suspended in the lower chamber to a final concentration of 0.1 to 10 microM. That is, the upper chamber and the lower chamber of the transwell are separated with an endothelial layer therebetween, and the upper chamber is a pseudovascular in vitro inflammation model corresponding to the inside of the blood vessel and the lower chamber corresponds to the inflamed part outside the blood vessel.
The number of neutrophils that penetrated from the upper chamber through the endothelial layer and permeated into the lower chamber and the number of neutrophils adhered to the endothelial layer were measured from the fluorescence intensity at 530 nm, and the relative neutrophil count was as follows: Calculated.
Relative neutrophil number% = [number of neutrophils (permeation and adhesion) in experimental group] / [number of neutrophils (permeation and adhesion) in control] × 100
(Control is when SPN-1P is not added).
As a result, SPN-1P 10 microM significantly promoted neutrophil permeation of the endothelial layer and adhesion (see FIG. 3). That is, it was considered that SPN-1P acts as an inflammation-inducing substance.
[0050]
(2) Action of the compound of the present invention on inflammatory cell-vascular endothelial cell interaction
Next, how the compound of Example 2 affects the interaction between neutrophils and vascular endothelial cells was examined using the pseudo-vascular in vitro inflammation model.
That is, 0.01 to 1 microM of the compound of Example 2 was added to the transwell lower chamber, and SPN-1P 10 microM was placed in the lower chamber to induce inflammation. As a control, a substance that caused inflammation in the same manner as described above without using any drug was used.
The number of neutrophils adhered to the endothelial layer or the number of neutrophils that passed through the endothelial layer and permeated into the lower chamber was measured from the fluorescence intensity at 530 nm, and the relative neutrophil count was calculated from the above formula.
The result is shown in FIG. As shown in the figure, the compound of Example 2 suppressed neutrophil permeation and adhesion.
Therefore, in the simulated blood vessel in vitro model, when SPN-1P is used as an inflammation-inducing agent, the compound of Example 2 acts anti-inflammatory, thereby maintaining cardiovascular homeostasis and improving the disease state The possibility of acting in the direction to be considered.
[0051]
【The invention's effect】
The compound of the present invention exhibits excellent Edg receptor antagonism, and a medicament containing the compound of the present invention as an active ingredient is a cardiovascular disease (eg, arteriosclerosis, heart disease), cancer, rheumatism, diabetic retina. Excellent preventive or therapeutic effect on diseases and respiratory diseases.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing Edg antagonism of a compound of the present invention in a dose-dependent manner (suramin: control).
FIG. 2 is a graph showing an inhibitory effect on proliferation of vascular smooth muscle cells by a compound of the present invention in a dose-dependent manner (suramin: control).
In the figure, white squares are data when no test substance is added. *: Significantly suppressed at a risk rate p ≦ 5% with respect to the negative control. **: Risk rate p with respect to the negative control. Significant suppression is shown at ≦ 1%.
FIG. 3 shows the effect of SPN-1P on endothelial cell-neutrophil interaction.
*: Significantly promoted at a risk rate of 5% compared to the control with no drug added
FIG. 4 is a graph showing that the compound of the present invention has an inhibitory effect on the migration of neutrophils to vascular endothelial cells.

Claims (13)

Formula I

(In the formula, R is an optionally substituted linear or branched CH ₃ C _n H _(2n-2m) — (n is any integer between 2 and 19, and m is A threo-type (2S, 3S) aminoalcohol-1-phosphate represented by: an unsaturated number, which is any integer between 0 and 3) or an aryl group which may be substituted A compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof. General formula I is represented by the following formula:

The compound of Claim 1 represented by these, or its pharmaceutically acceptable salt. General formula I is represented by the following formula:

The compound of Claim 1 represented by these, or its pharmaceutically acceptable salt. General formula I is represented by the following formula:

The compound of Claim 1 represented by these, or its pharmaceutically acceptable salt. (1) General formula V

(In the formula, R is an optionally substituted linear or branched CH ₃ C _n H _(2n-2m) — (n is any integer between 2 and 19, and m is Represents an unsaturated number and is an integer of 0 to 3) or an aryl group which may be substituted, and Cp represents a cyclopentadienyl group) An alkenylating agent prepared by the action of dialkylzinc,
N-protected (S) -formyloxazolidine compounds of general formula III:

(Wherein A is a protecting group for N, and B and C are alkyl groups)
To selectively obtain a threo form (2S, 3S) of the general formula II,

(Wherein R, A, B and C are as defined above)
(2) Opening the oxazoline of compound II to remove the acetal-type protecting group to obtain an alcohol compound of the general formula VI in which the amino group is protected:

(Wherein R and A are as defined above)
(3) Conversion from a compound of general formula VI to a 1-phosphate analog compound of general formula VII:

(Wherein R and A are as defined above, and R ′ is a lower alkyl group)
(4) removing each protecting group of the amino group and phosphate group of the compound of general formula VII,
A process for producing the compound of claim 1. A medicament for antagonizing an endothelial differentiation gene (Edg) receptor, comprising the compound according to any one of claims 1 to 4 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. The medicament according to claim 6 for treating or preventing cardiovascular disease. The medicament according to claim 7, wherein the cardiovascular disease is arteriosclerosis. The medicament according to claim 6 for treating or preventing cancer. The medicament according to claim 6 for treating or preventing rheumatism. The medicament according to claim 6 for treating or preventing diabetic retinopathy. The medicament according to claim 6, for treating or preventing a respiratory disease. The medicament according to claim 7, wherein the cardiovascular disease is a heart disease.

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