JP4028925B2

JP4028925B2 - Monoclonal antibody

Info

Publication number: JP4028925B2
Application number: JP36388897A
Authority: JP
Inventors: 宏長崎; 隆司金子; 忠宏梶田; 陽介太田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1997-12-18
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2008-01-09
Anticipated expiration: 2017-12-18
Also published as: JPH11178580A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト前立腺特異抗原（以下、ＰＳＡと省略する）を認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を使用した免疫学的測定試薬、および該モノクローナル抗体を使用した免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査等の分野では、物質の測定を簡便に行うために、或いは高感度で特異的に測定する為にしばしば免疫学的な測定方法が利用される。免疫学的な測定方法には、抗体が必要である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマから均一な性状を備えた抗体を継続して供給できる点、１度の免疫操作で多量の抗体を得られるので抗原の使用量が少なくて済む点、そしてなによりも高度な特異性をもつ抗体を得やすい等の多くの利点を持っているので免疫学的な測定方法に於いては欠かすことのできないツールとなっている。また測定のみならず、物質の精製、生理活性や生体内に於ける挙動の研究に於いてもモノクローナル抗体は重要なツールとなっている。
【０００３】
ＰＳＡは前立腺で生産される、２３７個のアミノ酸からなる糖蛋白質で、糖を約７％含む物質である。
ＰＳＡはヒト健常男性血清中には０．１〜４ｎｇ／ｍｌ、すなわち３．５〜１４０pM存在し、前立腺癌の進行とともに、その濃度は増加する。従って、前立腺癌測定のためのマーカーとしてＰＳＡを測定することは、臨床検査上大変重要である。
ＰＳＡを認識するモノクローナル抗体については、従来チュー・ツアン・ミンらによる特公平２−５６６３４号公報、Lilja H.らによるClinical Chemistry, 37,1618-1625,1991のような報告例があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ＰＳＡ類縁物質として血中にはヒト性腺カリクレン（以下、ｈＫ２と省略する）なる物質が存在する。ｈＫ２はＰＳＡと同様に２３７個のアミノ酸からなり、ＰＳＡに対し78％のホモロジーを示し（Shedlich L. J.他、DNA, 6: 429-437, 1987）、前立腺および、前立腺癌患者血清中にも微量存在する物質である。
このｈＫ２が存在することにより、従来報告されているモノクローナル抗体を使用してＰＳＡの測定を試みても、該モノクローナル抗体がｈＫ２と反応して、ＰＳＡ量を測定する際に感度の低下を招いていた。
したがって、本発明は従来技術の上記反応性の低下を克服し、ＰＳＡ量を正確に測定することができる技術を提供しようとするものであり、詳細には、ＰＳＡ量を正確に測定するためのモノクローナル抗体、試薬および方法、並びに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する本願発明の構成は、以下の通りである。
（１）ヒト性腺カリクレンの存在下において、ヒト前立腺特異抗原を特異的に測定する免疫学的測定試薬であって、配列番号３で示されるヒト前立腺特異抗原のＣ末端アミノ酸を認識する標識されたモノクローナル抗体を含有する、ヒト前立腺特異抗原の免疫学的測定試薬。
（２）標識されたモノクローナル抗体と異なる抗原決定部位を認識する抗体が固定化された担体をさらに含有する、前記（１）の免疫学的測定試薬。
（３）標識されたモノクローナル抗体が、酵素標識されたモノクローナル抗体である、前記（１）又は（２）の免疫学的測定試薬。
（４）酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである、前記（３）の免疫学的測定試薬。
（５）モノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭＰ−１６５２６のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体である、前記（１）〜（４）のいずれかの免疫学的測定試薬。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかの免疫学的測定試薬を用いた、ヒト性腺カリクレンの存在下におけるヒト前立腺特異抗原の特異的な測定方法。
【０００７】
ＰＳＡ測定の際には、ＰＳＡに対し高い反応性を示しつつｈＫ２に交差性を示さないモノクローナル抗体を使用する点が大変重要である。しかしながら、従来このような性質を有するモノクローナル抗体は報告されていなかった。
そこで本発明は、ｈＫ２に交差性を示さず、かつＰＳＡに高い反応性を示すモノクローナル抗体を提供する点にある。また本発明は併せて、このような新規なモノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ、このような新規なモノクローナル抗体によって、優れた測定性能を持つＰＳＡの免疫学的測定試薬と、測定方法を提供するものでもある。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体において、ＰＳＡに反応するという条件は次のような方法によって確認することができる。
▲１▼高度に精製されたＰＳＡをポリスチレン等のプレートに固定化し、モノクローナル抗体を反応させ、リン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という。）等で洗浄後、標識した抗マウス抗体を反応させ、結合量を測定する。
▲２▼ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてＰＳＡを展開後、ニトロセルロース等の膜に転写し、モノクローナル抗体を反応させ、ＰＢＳ等で洗浄後、標識した抗マウス抗体を反応させ、結合量を測定する。
▲３▼ＰＳＡの部分ペプチドをセンサーチップに固定化し、モノクローナル抗体を反応させ、変化量を測定する（後述のBIAcoreによる）。
尚、反応性を確認するＰＳＡとしては、天然型ＰＳＡ、あるいは遺伝子技術により産生されたＰＳＡおよび部分的に人工合成されたＰＳＡ等が挙げられる。
【０００９】
また、ｈＫ２に交差性を示さないという条件は、次のような方法によって確認することができる。
▲１▼高度に精製されたｈＫ２をポリスチレン等のプレートに固定化し、モノクローナル抗体を反応させ、ＰＢＳ等で洗浄後、標識した抗マウス抗体を反応させ、結合量を測定する。
▲２▼ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてｈＫ２を分離後、ニトロセルロース等の膜に転写し、モノクローナル抗体を反応させ、ＰＢＳ等で洗浄後、標識した抗マウス抗体を反応させ、結合量を測定する。
▲３▼ｈＫ２の部分ペプチドをセンサーチップに固定化し、モノクローナル抗体を反応させ、変化量を測定する（後述のBIAcoreによる）。
尚、反応性を確認するｈＫ２としては、天然型ｈＫ２、あるいは遺伝子技術により産生されたｈＫ２および部分的に人工合成されたｈＫ２が挙げられる。
【００１０】
上記方法等により、ＰＳＡに反応性を示しｈＫ２に交差反応性を示さない抗体、詳細には、ＰＳＡのＣ末端配列（配列番号１）を認識しｈＫ２のＣ末端配列（配列番号２）を認識しない抗体の存在を確認することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、例えばケーラーとミルシュタインの方法（Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975）によって産生することができる。すなわち、ヒトＰＳＡで免疫した動物の脾細胞と骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という。）とを細胞融合させ、これにより得られたハイブリドーマからヒトＰＳＡに対して特異的な抗ヒトＰＳＡ抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマを大量培養あるいは動物の腹腔内で増殖させ、この培養液あるいは腹水から分離することにより製造することができる。
【００１１】
以下、本発明のモノクローナル抗体を得るための具体的方法について詳細に説明する。
（１）抗原と免疫工程；
抗原ヒトＰＳＡは市販品（Scripps Laboratories Co. Ltd.社製（PA0714）を購入することが可能である。
免疫される動物は、細胞融合しようとする骨髄腫細胞株との組合せを配慮して、一般には、哺乳動物が挙げられるが、好ましくはマウス、ラット等が挙げられる。
【００１２】
免疫方法は、哺乳動物の皮下、皮内、腹腔あるいは静脈等に注射等により投与することができる。具体的には、ヒトＰＳＡをＰＢＳや生理食塩水等で適当な濃度に希釈し、これに通常はアジュバントを混合し、１〜３週間毎に数回投与する。このときの投与量は、１匹当たり毎回１〜２００μｇ程度とすることが好ましい。また、最終投与は、融合に使用する３〜５日前に、アジュバントを用いない静脈注射による投与とすることが好ましい。最終免疫の数日後に脾臓細胞を取り出す。
【００１３】
（２）細胞融合工程；
この工程においては、免疫した動物の脾臓から取り出した抗体産生細胞とミエローマとを融合させ、これにより融合細胞を生じさせる。
上記の脾細胞と融合される他方のミエローマとしては、公知の細胞株、例えば、マウスでは、「NS-1/1-Ag4-1」，“European Journal of Immunology” 6，511〜519 (1976)；「SP-2/O-Ag14」，“Nature” 276, 269〜270 (1978)；「FO」,“Journal of Immunological Methods” 35, 1〜21 (1980)；「P3-X-63-Ag8-U1」, “Current Topics in Microbiology and Immunology” 81, 1〜7 (1978)；等、ラットでは、「YB 2/0」, “Methods in Enzymology” 73B, 1 (1981)；等のミエローマが使用できる。
【００１４】
細胞混合比は、脾細胞：ミエローマ＝３〜２０：１、好ましくは５〜１０：１で行うことが適している。
融合の際には、通常、融合促進剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス等が使用され、また適宜ジメチルスルホキシド等を添加することもできる。
このＰＥＧの分子量は、通常、1000〜6000位のものが好ましい。
融合時の培地としては、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等を除いた、ミエローマの増殖に使用されるＭＥＭ（Minimum Essential Medium）培地、ＲＰＭＩ−１６４０（Roswell Park Memorial Institute's Medium 1640)培地等が用いられる。
融合操作は、上記した混合比による脾細胞とミエローマとの所定量に、37℃に保温した、30〜50％（w/v）程度ＰＥＧを含有する血清無添加の培地とを混合し、数分間撹拌することにより行う。
【００１５】
（３）ハイブリドーマの選択；
上記操作で得られた細胞を、例えば数枚の９６穴マイクロプレートに分注し、ＨＡＴ培地（例えば、ＭＥＭ培地あるいはＲＰＭＩ−１６４０培地に、ヒポキサンチン100 ｍＭ、アミノプテリン 0.4ｍＭ、チミジン1600ｍＭおよびＦＣＳ約１５％（Ｖ／Ｖ）となるように含有させた培地）で培養することにより融合細胞を選択し、さらにそれらの培養上清から、ヒトＰＳＡを固相化したマイクロプレートによるＥＬＩＳＡ (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)により、ヒトＰＳＡに特異的な抗体を産生する細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることができる。
【００１６】
（４）クローニング；
前記ハイブリドーマを、限界希釈法または寒天法（例えば、９６穴マイクロプレートまたは寒天入りシャーレで希釈して培養し、陽性のものを選ぶ）等に付して、モノクローンのハイブリドーマを取得することができる。また、市販のアイソタイピングキットを用いて、これらのイムノグロブリンのタイプを決定することができる。
【００１７】
（５）モノクローナル抗体の調製；
上記のようにして得られた抗体産生ハイブリドーマを動物の腹腔内に接種し、約１０〜１５日後に腹水を採取し、その上清から、あるいはこのハイブリドーマを適当な培地で培養し、その培養上清から、本発明のモノクローナル抗体を調製することができる。この際、必要に応じて、モノクローナル抗体を塩析、アフィニティカラム、ゲルろ過等により精製してもよい。
【００１８】
このようにして、ヒトＰＳＡに反応しｈＫ２に反応しないモノクローナル抗体、ＰＳＡのＣ末端配列（配列番号１、好ましくは配列番号３）を認識し、かつｈＫ２のＣ末端配列（配列番号２、好ましくは配列番号４）を認識しないモノクローナル抗体が見出される。
このような性質を有するモノクローナル抗体として、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１６５２６で寄託されたハイブリドーマから産生されるＰＡ−３１３が挙げられる。このモノクローナル抗体ＰＡ−３１３は、後述の実施例に示すごとく、ヒトｈＫ２に交差することなく、ＰＳＡを認識することができる。
【００１９】
更に本発明は、次の反応性で特徴付けられる、ＰＳＡを認識するモノクローナル抗体を含むＰＳＡの免疫学的測定試薬を提供する。
(1) ＰＳＡに反応する
(2) ｈＫ２に交差性を示さない
免疫学的測定には、蛍光反応を利用した方法又は凝集反応を利用した方法等が挙げられ、好ましくはＥＬＩＳＡ法が挙げられる。
【００２０】
本発明の免疫学的測定試薬に於いては、モノクローナル抗体が遊離の状態で用いられても良いし、或いは担体或いは不溶性担体に結合していても良い。担体としては、合成樹脂金属が挙げられ、好ましくはポリスチレン、ポリエチレンが挙げられる。
また、不溶性担体としてはラテックスが挙げられる。
本発明の免疫学的測定試薬には、この他に公知の成分を組み合わせることができる。即ち、免疫反応に必要なpHを与える緩衝剤、免疫反応を促進する反応増強剤、非特異反応を抑制する反応安定剤やブロッカー、試薬の保存性を高める防腐剤等を組み合わせても良い。
【００２１】
緩衝剤としては以下のものが挙げられる。
（蛍光、凝集法の場合）
ＰＢＳ、Tris-HCl、HepesなどGood緩衝試薬
反応安定剤やブロッカーとしては、以下のものが挙げられる。
（蛍光、凝集法の場合）
ＦＣＳ、ウシ血清アルブミン、フェノール等である。
防腐剤としては以下のものが挙げられる。
チメロサール、NaN₃、パラ安息香酸等である。
また、蛍光法により測定する場合は、蛍光標識として以下のものが使用できる。
アクリジニウム塩、ユーロピウム等である。
【００２２】
これらの各種成分を含む本発明によるＰＳＡの測定試薬は、溶液状態で、或いは乾燥状態で供給することができる。溶液状態で流通させるには、更に各種の界面活性剤、糖、ゼラチンを加えても良い。これらの安定化剤は、試薬を乾燥するときも安定化剤として有効である。
測定対象であるＰＳＡとしては、例えば天然型ＰＳＡ、あるいは遺伝子技術により産生されたＰＳＡおよび部分的に人工合成されたＰＳＡ等が挙げられる。
本発明によるＰＳＡの免疫学的測定は、先に述べたＰＳＡの免疫学的測定により実現する。試薬がＥＬＩＳＡによるものであれば、免疫反応の進行を光学的に測定することによって行うことができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１（モノクローナル抗体の産生）
（１）抗原ＰＳＡの入手
Scripps Laboratories Co., Ltd.(P0724) より＞95％純度のＰＳＡを購入した。
（２）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
上記（１）で得たヒトＰＳＡ２５〜５０μｇとフロイント完全アジュバントの等容量との混合物を、マウス（BALB/c）１匹、１回当たりの投与量とし、これを２週間毎に計４回腹腔及び背部に皮下注射し、更に１週間毎に３回腹腔内に注射した。
【００２４】
抗体価の上昇を、抗原を固相化したプレートを用いて、免疫マウス血清のＥＬＩＳＡにより確認した。
腹腔内免疫終了後、最終免疫として、ＰＢＳに溶解したＰＳＡ５０μｇを尾静脈に投与し、免疫感作脾細胞を作製した。３日後に脾臓を取り出し、20％（v/v）ＦＣＳ入りＤＭＥＭ培地にほぐして懸濁し、洗浄した。
一方、細胞融合に供するミエローマとしてマウスミエローマP3-X-63-Ag8-U1を使用し、これを20％（v/v）ＦＣＳ入りＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。
【００２５】
得られた２種類の細胞を次の要領で融合した。すなわち、５０％（w/v）ポリエチレングリコール（分子量４０００）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地 0.5ｍｌ中で、遠心分離で集めた上記脾細胞２．２×１０⁸個と、遠心分離で集めた対数増殖期にある上記骨髄腫細胞４．４×１０⁷個とを混合して細胞融合を行った。細胞融合の温度は37℃近傍で時間は４分であった。
融合された細胞から融合用培地を除去後、９６穴マイクロプレート８枚に分注して、ハイブリドーマの選択培養を行った。すなわち、融合細胞をＨＡＴ培地（１×１０^-4Ｍのヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ社）、４×１０^-7Ｍのアミノプテリン（ＩＣＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社）および１．６×１０^-5Ｍのチミジン（Ｓｉｇｍａ社））を添加した１０％（v/v）ＦＣＳ入りＲＰＭＩ−１６４０培地にて培養した。１〜３日間隔で培地交換を行い、２週間でハイブリドーマのコロニーの形成を認めた。
【００２６】
培養上清を、ヒトＰＳＡ 1.0μｇ／ｍｌ濃度で固相したプレートにおけるＥＬＩＳＡ（第二抗体として（ペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗体（TAGO社製））を使用）によって検査し、ヒトＰＳＡに強い反応性を示すコロニー６個を選択した。
こうして得られたコロニーを拡大培養した後、９６穴プレートのウェル１穴当たり細胞が１個となるようＨＴ培地（上記ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）で限界希釈を行った。
２週間後、コロニーの形成を確認し、再びＥＬＩＳＡにより、培養上清に産生された抗体のヒトＰＳＡに対する反応性を確認した。
さらに、ハイブリドーマの限界希釈によるクローニングを行い、単一のハイブリドーマ株であることを確認し、また産生した抗体のアイソタイピングを行った。その結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】

【００２８】
実施例２（ウェスタンブロット）；
ＰＳＡ（タンパク量４０ｎｇ、１８０ｎｇ）、Dube等（Deperthes他Biochemia et Biophysica Acta, 1245, 1995）により精製されたｈＫ２（タンパク量 180ｎｇ）および人工的に大腸菌にて発現させたｈＫ２（タンパク量１μｇ、２μｇ）を還元処理（処理液：終濃度で、1 ％（w/v）SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、10ｍＭトリス緩衝液（pH 6.8）、20％（ｖ/ｖ）グリセリン、1 ％（ｖ/ｖ） 2−メルカプトエタノール）後、１０％（ｗ/ｖ）ゲル濃度のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（MILLIPORE社製）に、電気的に200 mA、２時間ブロッティングした。
【００２９】
このPVDF膜を、5 ％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングし、５０ｎｇ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化抗体ＰＡ−３１３を室温で２時間反応させ、0.05％（ｖ/ｖ）Triton X-100を含むＴＢＳで３回洗浄した。洗浄後、パーオキシダーゼ基質溶液で発色させた。この結果を、発色バンドの位置として図１のＡに示すが、モノクローナル抗体ＰＡ−３１３は、ＰＳＡに対して特異的に反応し、ｈＫ２には反応しないことが証明された。
【００３０】
また、ｈＫ２の特異的なＣ末端配列（配列番号４）を認識する抗体９Ｄ５（Dube等により精製）を用いてウェスタンブロットを行った。
ＰＳＡ（タンパク量５μｇ、１μｇ）およびDube等により精製されたｈＫ２（タンパク量１ｎｇ、５ｎｇ、２５ｎｇ）を前記と同様に還元処理、電気泳動展開、PVDF膜へのブロッキングを行った。１μｇ／ｍｌの１次抗体９Ｄ５を、室温で２時間反応させ、0.05％（ｖ／ｖ）Triton X-100を含むＴＢＳで３回洗浄し、２次抗体として、0.05％（ｖ/ｖ）Triton X-100 、5 ％（ｗ/ｖ）ＢＳＡを含むＴＢＳで2000倍希釈した（１μｇ／ｍｌとした）ペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗体（Jackson社製）を添加し、室温で１時間反応させ、同様に洗浄した。洗浄後、パーオキシダーゼ基質溶液で発色させた。この結果を、発色バンドの位置として図１のＢに示すが、抗体９Ｄ５は、ｈＫ２に対して特異的に反応し、ＰＳＡには反応しないことが証明された。
【００３１】
実施例３（合成ペプチドとＰＡ−３１３との相互作用）；
Pharmacia社より提供されているBIAcoreは蛋白−蛋白間等の相互作用を放射線等の標識をせずに、直接測定することが可能な装置である（実験医学，第３巻，第５号，１９９７年）。
合成ペプチド（ＰＳＡ：配列番号５（Ｃ末端配列）、ｈＫ２：配列番号６（Ｃ末端配列））をそれぞれセンサーチップに固定化し（なお、ふたつの合成ペプチドのＮ末端のシステイン残基はセンサーチップに固定化する際に利用するために本来のシークエンス以外に導入したものである）、モノクローナル抗体ＰＡ−３１３との相互作用を検討した。
その結果を図２に示す。ＰＳＡとＰＡ−３１３との間では相互作用が大きく、ｈＫ２との間では小さいことが分かった。
【００３２】
実施例４（免疫学的測定試薬の調製）
西洋ワサビペリオキシダーゼを結合させたモノクローナル抗体溶液を10％ＦＣＳを含むＰＢＳ、Tris-HCl、Hepes-HCl (pH 7.0)等により調製した。
実施例５（免疫学的測定）
モノクローナル抗体ＰＡ−３１３が認識するＰＳＡの抗原決定部位とは異なる抗原決定部位を認識する抗体を固定化する。ＰＳＡ標準溶液を添加し、インキュベートする。ＰＢＳ等により洗浄後、実施例４にて調製した免疫学的測定試薬を用いて結合量を測定し、検量線の作成と最低検出感度の検討を行った。
図３に示すように、ＰＳＡ濃度０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲の間で、ほぼ比例関数的になる検量線を得ることができた。
また、最低検出感度の検討はＰＳＡ濃度０〜１．００ｎｇ／ｍｌの範囲の間で行ったが、図４に示すように、０点における測定値（平均値）＋２ＳＤ（標準偏差）と、０．１ｎｇ／ｍｌにおける測定値（平均値）−２ＳＤとは有意差があるので、最低検出感度は０．１ｎｇ／ｍｌ以下である。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＰＳＡのＣ末端配列（配列番号１）を認識しｈＫ２のＣ末端配列（配列番号２）を認識しないことにより、ＰＳＡ量を正確に測定することができ、臨床検査上大変有用であり、特に前立腺癌の診断等に応用が期待される。
また、本発明のモノクローナル抗体に対して酵素標識等を行い、かつ、適当な媒質分と混合することにより、容易に、溶液状または乾燥状の免疫学的測定試薬に調製することができる。
さらに、本発明のモノクローナル抗体や、この抗体から調製した免疫学的測定試薬を用いることにより、正確かつ簡易な免疫学的測定を行うことができる。
また本発明のモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭＰ−１６５２６のハイブリドーマにより容易に産生することができる。
【００３４】
【配列表】

【００３５】

【００３６】

【００３７】

【００３８】

【００３９】

【図面の簡単な説明】
【図１】ウエスタンブロッティング法による、ヒトＰＳＡおよびｈＫ２に対するモノクローナル抗体ＰＡ−３１３の反応性を示す写真である。
【図２】 BIAcoreによる、ヒトＰＳＡおよびｈＫ２とモノクローナル抗体ＰＡ−３１３との相互作用を示すグラフである。
【図３】実施例４の免疫学的測定試薬を用いて作成した、ＰＳＡ濃度測定のための検量線である。
【図４】実施例４の免疫学的測定試薬を用いた、最低検出感度（0.1 ｎｇ／ｍｌ以下）の検討結果を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes human prostate specific antigen (hereinafter abbreviated as PSA), a hybridoma that produces the monoclonal antibody, an immunoassay reagent that uses the monoclonal antibody, and an immunity that uses the monoclonal antibody The present invention relates to a measurement method.
[0002]
[Prior art]
In the field of clinical examination and the like, an immunological measurement method is often used for simple measurement of a substance or for specific measurement with high sensitivity. An immunological assay requires an antibody. Monoclonal antibodies can continuously supply antibodies with uniform properties from hybridomas, can produce large amounts of antibodies in a single immunization, and can use less antigens. Since it has many advantages such as easy to obtain antibodies with specificity, it has become an indispensable tool in immunological measurement methods. In addition to measurement, monoclonal antibodies have become an important tool not only in the purification of substances, but also in the study of physiological activity and behavior in vivo.
[0003]
PSA is a glycoprotein consisting of 237 amino acids produced in the prostate and is a substance containing about 7% sugar.
PSA is present in human healthy male serum at 0.1 to 4 ng / ml, that is, 3.5 to 140 pM, and its concentration increases with the progression of prostate cancer. Therefore, measuring PSA as a marker for prostate cancer measurement is very important for clinical examination.
Regarding monoclonal antibodies recognizing PSA, there have heretofore been reported examples such as Japanese Patent Publication No. 2-56634 by Chu Tu Min Min et al. And Clinical Chemistry, 37, 1618-1625, 1991 by Lilja H. et al.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, a substance called human gonadal kallikrene (hereinafter abbreviated as hK2) exists in blood as a PSA-related substance. hK2 is composed of 237 amino acids like PSA, and shows 78% homology to PSA (Shedlich LJ et al., DNA, 6: 429-437, 1987), and is also present in a small amount in prostate and prostate cancer patient sera It is a substance.
Due to the presence of hK2, even when attempting to measure PSA using a conventionally reported monoclonal antibody, the monoclonal antibody reacts with hK2 to cause a decrease in sensitivity when measuring the amount of PSA. It was.
Therefore, the present invention aims to provide a technique capable of accurately measuring the PSA amount by overcoming the above-described decrease in reactivity of the prior art, and more specifically, for accurately measuring the PSA amount. The present invention seeks to provide monoclonal antibodies, reagents and methods, and hybridomas that produce the monoclonal antibodies.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The configuration of the present invention for solving the above-described problems is as follows.
(1) An immunoassay reagent for specifically measuring human prostate-specific antigen in the presence of human gonadal calicrene, which is labeled to recognize the C-terminal amino acid of human prostate-specific antigen represented by SEQ ID NO: 3 A reagent for immunoassay of human prostate specific antigen, which contains a monoclonal antibody.
(2) The immunoassay reagent according to (1), further comprising a carrier on which an antibody that recognizes an antigen determining site different from the labeled monoclonal antibody is immobilized.
(3) The immunoassay reagent according to (1) or (2) above, wherein the labeled monoclonal antibody is an enzyme-labeled monoclonal antibody.
(4) The immunoassay reagent according to (3), wherein the enzyme is horseradish peroxidase.
(5) The immunoassay reagent according to any one of (1) to (4), wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced from a hybridoma having the accession number FERM P-16526.
(6) A specific method for measuring a human prostate specific antigen in the presence of human gonadal calicrene, using the immunological measurement reagent according to any one of (1) to (5).
[0007]
In the PSA measurement, it is very important to use a monoclonal antibody that shows high reactivity to PSA but does not show cross-reactivity to hK2. However, no monoclonal antibody having such properties has been reported so far.
Therefore, the present invention is to provide a monoclonal antibody that does not exhibit cross-reactivity with hK2 and exhibits high reactivity with PSA. The present invention also provides a hybridoma capable of producing such a novel monoclonal antibody, an immunoassay reagent for PSA having excellent measurement performance, and a measurement method using such a novel monoclonal antibody. It is also what you do.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The condition of reacting with PSA in the monoclonal antibody of the present invention can be confirmed by the following method.
(1) Highly purified PSA is immobilized on a plate such as polystyrene, reacted with a monoclonal antibody, washed with a phosphate buffer (hereinafter referred to as “PBS”), etc., and reacted with a labeled anti-mouse antibody. Measure the binding amount.
(2) After developing PSA by polyacrylamide gel electrophoresis, transfer to a membrane such as nitrocellulose, react with monoclonal antibody, wash with PBS etc., react with labeled anti-mouse antibody and measure the amount of binding .
(3) A partial peptide of PSA is immobilized on a sensor chip, reacted with a monoclonal antibody, and the amount of change is measured (by BIAcore described later).
Examples of PSA for confirming reactivity include natural PSA, PSA produced by genetic techniques, and partially artificially synthesized PSA.
[0009]
Further, the condition that hK2 does not exhibit crossing property can be confirmed by the following method.
(1) Highly purified hK2 is immobilized on a plate such as polystyrene, reacted with a monoclonal antibody, washed with PBS or the like, reacted with a labeled anti-mouse antibody, and the binding amount is measured.
(2) After separation of hK2 by polyacrylamide gel electrophoresis, transfer to a membrane such as nitrocellulose, react with monoclonal antibody, wash with PBS etc., react with labeled anti-mouse antibody, and measure the amount of binding .
(3) A partial peptide of hK2 is immobilized on a sensor chip, reacted with a monoclonal antibody, and the amount of change is measured (by BIAcore described later).
Examples of hK2 for confirming reactivity include natural hK2, hK2 produced by genetic techniques, and partially artificially synthesized hK2.
[0010]
By the above method, an antibody that is reactive to PSA but not cross-reactive to hK2, specifically, recognizes the C-terminal sequence of PSA (SEQ ID NO: 1) and recognizes the C-terminal sequence of hK2 (SEQ ID NO: 2) The presence of non-antibodies can be confirmed.
The monoclonal antibody of the present invention can be produced, for example, by the method of Kohler and Milstein (Nature 256, 495-497, 1975). That is, spleen cells and myeloma cells (hereinafter referred to as “myeloma”) of an animal immunized with human PSA are cell-fused, and an anti-human PSA antibody specific for human PSA is obtained from the resulting hybridoma. The hybridoma to be produced can be selected, and the hybridoma can be produced by mass-culturing or growing it in the peritoneal cavity of an animal and separating it from the culture solution or ascites.
[0011]
Hereinafter, a specific method for obtaining the monoclonal antibody of the present invention will be described in detail.
(1) antigen and immunization process;
Antigen human PSA can be purchased commercially (Scripps Laboratories Co. Ltd. (PA0714)).
The animal to be immunized is generally a mammal in consideration of the combination with the myeloma cell line to be cell-fused, and preferably a mouse, a rat and the like.
[0012]
The immunization method can be administered by injection or the like into the subcutaneous, intradermal, abdominal or vein of a mammal. Specifically, human PSA is diluted to an appropriate concentration with PBS, physiological saline or the like, and is usually mixed with an adjuvant and administered several times every 1 to 3 weeks. The dosage at this time is preferably about 1 to 200 μg per animal. The final administration is preferably 3 to 5 days before use for fusion by intravenous injection without an adjuvant. Spleen cells are removed several days after the final immunization.
[0013]
(2) cell fusion step;
In this step, antibody-producing cells taken from the spleen of the immunized animal are fused with myeloma, thereby producing fused cells.
As the other myeloma to be fused with the above spleen cells, in known cell lines such as mice, “NS-1 / 1-Ag4-1”, “European Journal of Immunology” 6, 511 to 519 (1976) "SP-2 / O-Ag14", "Nature" 276, 269-270 (1978); "FO", "Journal of Immunological Methods" 35, 1-21 (1980); "P3-X-63-Ag8 -U1 ”,“ Current Topics in Microbiology and Immunology ”81, 1-7 (1978); etc. In rats, myeloma such as“ YB 2/0 ”,“ Methods in Enzymology ”73B, 1 (1981); it can.
[0014]
The cell mixing ratio is suitably spleen cells: myeloma = 3-20: 1, preferably 5-10: 1.
In the fusion, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus or the like is usually used as a fusion accelerator, and dimethyl sulfoxide or the like can be added as appropriate.
The molecular weight of this PEG is usually preferably about 1000 to 6000.
As the medium for fusion, MEM (Minimum Essential Medium) medium, RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute's Medium 1640) medium, etc. used for the growth of myeloma, excluding fetal calf serum (FCS) and the like are used.
The fusion operation is performed by mixing a predetermined amount of spleen cells and myeloma with the above-mentioned mixing ratio with a serum-free medium containing about 30 to 50% (w / v) PEG, which is kept at 37 ° C. Stir for a minute.
[0015]
(3) Selection of hybridomas;
The cells obtained by the above operation are dispensed into, for example, several 96-well microplates, and HAT medium (for example, MEM medium or RPMI-1640 medium, hypoxanthine 100 mM, aminopterin 0.4 mM, thymidine 1600 mM, and FCS). The fused cells are selected by culturing in a medium containing about 15% (V / V)), and from the culture supernatant, ELISA (Enzyme Linked) using a microplate on which human PSA is immobilized is selected. Immunosorbent Assay) enables screening of cells (hybridomas) that produce antibodies specific for human PSA.
[0016]
(4) Cloning;
Monoclonal hybridomas can be obtained by subjecting the hybridoma to a limiting dilution method or an agar method (for example, dilute and culture in a 96-well microplate or petri dish containing agar and select positive ones). . In addition, these immunoglobulin types can be determined using a commercially available isotyping kit.
[0017]
(5) Preparation of monoclonal antibody;
The antibody-producing hybridoma obtained as described above is inoculated into the abdominal cavity of the animal, and ascites is collected about 10 to 15 days later. From the supernatant or the hybridoma is cultured in an appropriate medium, From the serum, the monoclonal antibody of the present invention can be prepared. At this time, the monoclonal antibody may be purified by salting out, affinity column, gel filtration or the like, if necessary.
[0018]
Thus, a monoclonal antibody that reacts with human PSA but does not react with hK2, a C-terminal sequence of PSA (SEQ ID NO: 1, preferably SEQ ID NO: 3) is recognized, and a C-terminal sequence of hK2 (SEQ ID NO: 2, preferably Monoclonal antibodies that do not recognize SEQ ID NO: 4) are found.
As a monoclonal antibody having such properties, PA-313 produced from a hybridoma deposited at the Biotechnology Institute of Industrial Science and Technology under the accession number FERM P-16526 can be mentioned. This monoclonal antibody PA-313 can recognize PSA without crossing human hK2, as shown in the Examples described later.
[0019]
Furthermore, the present invention provides an immunoassay reagent for PSA comprising a monoclonal antibody that recognizes PSA, characterized by the following reactivity.
(1) Reacts to PSA
(2) Examples of immunological measurements that do not exhibit cross-reactivity to hK2 include a method using a fluorescent reaction or a method using an agglutination reaction, and preferably an ELISA method.
[0020]
In the immunological measurement reagent of the present invention, the monoclonal antibody may be used in a free state, or may be bound to a carrier or an insoluble carrier. Examples of the carrier include synthetic resin metals, preferably polystyrene and polyethylene.
An example of the insoluble carrier is latex.
In addition to the above, known components can be combined with the immunological measurement reagent of the present invention. That is, a buffer that gives the pH necessary for the immune reaction, a reaction enhancer that promotes the immune reaction, a reaction stabilizer or blocker that suppresses the non-specific reaction, a preservative that enhances the storage stability of the reagent, and the like may be combined.
[0021]
Examples of the buffer include the following.
(For fluorescence and aggregation methods)
Examples of Good buffer reagent reaction stabilizers and blockers such as PBS, Tris-HCl, and Hepes include the following.
(For fluorescence and aggregation methods)
FCS, bovine serum albumin, phenol and the like.
Examples of the preservative include the following.
Thimerosal, NaN ₃ , parabenzoic acid and the like.
Moreover, when measuring by the fluorescence method, the following can be used as a fluorescent label.
Acridinium salts, europium and the like.
[0022]
The reagent for measuring PSA according to the present invention containing these various components can be supplied in a solution state or in a dry state. In order to distribute in a solution state, various surfactants, sugars, and gelatins may be added. These stabilizers are also effective as stabilizers when the reagent is dried.
Examples of PSA to be measured include natural PSA, PSA produced by genetic techniques, and partially artificially synthesized PSA.
The immunoassay of PSA according to the present invention is realized by the immunoassay of PSA described above. If the reagent is based on ELISA, the progress of the immune reaction can be measured optically.
[0023]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited by these Examples.
Example 1 (Production of monoclonal antibodies)
(1) Obtaining antigen PSA
PSA with> 95% purity was purchased from Scripps Laboratories Co., Ltd. (P0724).
(2) Preparation of monoclonal antibody-producing hybridoma A mixture of human PSA (25-50 μg) obtained in (1) above and an equal volume of Freund's complete adjuvant was used as a dose per mouse (BALB / c). Was injected subcutaneously into the abdominal cavity and back for a total of 4 times every 2 weeks, and further injected 3 times a week.
[0024]
The increase in antibody titer was confirmed by ELISA of immunized mouse serum using a plate on which an antigen was immobilized.
After the intraperitoneal immunization, as final immunization, 50 μg of PSA dissolved in PBS was administered to the tail vein to prepare immunized spleen cells. Three days later, the spleen was taken out, suspended in DMEM medium containing 20% (v / v) FCS, suspended, and washed.
On the other hand, mouse myeloma P3-X-63-Ag8-U1 was used as myeloma for cell fusion, and this was grown in RPMI-1640 medium containing 20% (v / v) FCS.
[0025]
The obtained two types of cells were fused in the following manner. That is, 2.2 × 10 ⁸ spleen cells collected by centrifugation in 0.5 ml of RPMI-1640 medium containing 50% (w / v) polyethylene glycol (molecular weight 4000) and logarithm collected by centrifugation Cell fusion was performed by mixing 4.4 × 10 ^{7 of the} myeloma cells in the growth phase. The temperature for cell fusion was around 37 ° C. and the time was 4 minutes.
After removing the fusion medium from the fused cells, the cells were dispensed into eight 96-well microplates to perform selective culture of hybridomas. That is, the fused cells were treated with HAT medium (1 × 10 ⁻⁴ M hypoxanthine (Sigma), 4 × 10 ⁻⁷ M aminopterin (ICN Pharmaceutical) and 1.6 × 10 ⁻⁵ M thymidine (Sigma). )) Was added to the RPMI-1640 medium containing 10% (v / v) FCS. The medium was changed every 1 to 3 days, and formation of hybridoma colonies was observed in 2 weeks.
[0026]
The culture supernatant was examined by ELISA (using a peroxidase-labeled goat anti-mouse antibody (TAGO)) as a second antibody on a plate solid-phased at a concentration of human PSA of 1.0 μg / ml, and strongly reacted to human PSA. Six colonies showing sex were selected.
The colonies thus obtained were expanded and cultured, and then limiting dilution was performed with an HT medium (a medium obtained by removing aminopterin from the HAT medium) so that there was one cell per well of a 96-well plate.
Two weeks later, formation of colonies was confirmed, and the reactivity of the antibody produced in the culture supernatant to human PSA was confirmed by ELISA again.
Furthermore, the hybridoma was cloned by limiting dilution to confirm that it was a single hybridoma strain, and the produced antibody was isotyped. The results are shown in Table 1.
[0027]
[Table 1]

[0028]
Example 2 (Western blot);
HK2 (protein amount 180 ng) purified by PSA (protein amount 40 ng, 180 ng), Dube et al. (Deperthes et al. Biochemia et Biophysica Acta, 1245, 1995) and hK2 artificially expressed in E. coli (protein amount 1 μg, 2 μg) ) Reduction treatment (treatment solution: final concentration, 1% (w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate), 10 mM Tris buffer (pH 6.8), 20% (v / v) glycerin, 1% (v / v ) 2-mercaptoethanol) and then developed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis with a gel concentration of 10% (w / v), electrically applied to polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (MILLIPORE) with 200 mA, 2 Time blotted.
[0029]
The PVDF membrane was blocked with TBS containing 5% (w / v) BSA for 1 hour at room temperature, and 50 ng / ml horseradish peroxidase (HRP) -labeled antibody PA-313 was reacted at room temperature for 2 hours. Washed 3 times with TBS containing 0.05% (v / v) Triton X-100. After washing, color was developed with a peroxidase substrate solution. This result is shown in FIG. 1A as the position of the color development band, and it was proved that the monoclonal antibody PA-313 specifically reacts with PSA and does not react with hK2.
[0030]
Further, Western blotting was performed using an antibody 9D5 (purified by Dube or the like) that recognizes a specific C-terminal sequence of hK2 (SEQ ID NO: 4).
PSA (protein amount 5 μg, 1 μg) and hK2 (protein amount 1 ng, 5 ng, 25 ng) purified by Dube and the like were subjected to reduction treatment, electrophoresis development, and blocking to a PVDF membrane in the same manner as described above. 1 μg / ml of the primary antibody 9D5 was reacted at room temperature for 2 hours, washed 3 times with TBS containing 0.05% (v / v) Triton X-100, and 0.05% (v / v) Triton was obtained as the secondary antibody. X-100, a peroxidase-labeled goat anti-mouse antibody (Jackson) diluted 2000-fold with TBS containing 5% (w / v) BSA (1 μg / ml) was added and reacted at room temperature for 1 hour. Washed in the same way. After washing, color was developed with a peroxidase substrate solution. This result is shown in FIG. 1B as the position of the color development band, and it was proved that the antibody 9D5 reacts specifically with hK2 and does not react with PSA.
[0031]
Example 3 (interaction of synthetic peptide with PA-313);
BIAcore provided by Pharmacia is a device that can directly measure protein-protein interactions without labeling such as radiation (Experimental Medicine, Vol. 3, No. 5, 1997). Year).
Synthetic peptides (PSA: SEQ ID NO: 5 (C-terminal sequence), hK2: SEQ ID NO: 6 (C-terminal sequence)) were each immobilized on the sensor chip (note that the N-terminal cysteine residues of the two synthetic peptides were attached to the sensor chip. (It was introduced in addition to the original sequence for use in immobilization), and the interaction with the monoclonal antibody PA-313 was examined.
The result is shown in FIG. It was found that the interaction was large between PSA and PA-313 and small between hK2.
[0032]
Example 4 (Preparation of immunological measurement reagent)
A monoclonal antibody solution conjugated with horseradish peroxidase was prepared with PBS containing 10% FCS, Tris-HCl, Hepes-HCl (pH 7.0) or the like.
Example 5 (immunological measurement)
An antibody that recognizes an antigen determining site different from the antigen determining site of PSA recognized by the monoclonal antibody PA-313 is immobilized. Add PSA standard solution and incubate. After washing with PBS or the like, the binding amount was measured using the immunological measurement reagent prepared in Example 4, and a calibration curve was prepared and the minimum detection sensitivity was examined.
As shown in FIG. 3, a calibration curve having a substantially proportional function was obtained in a PSA concentration range of 0 to 100 ng / ml.
The minimum detection sensitivity was examined in the range of PSA concentration of 0 to 1.00 ng / ml. As shown in FIG. 4, the measured value (average value) at 2 points + 2SD (standard deviation) and 0 Since the measured value (average value) at 1 ng / ml is significantly different from -2SD, the minimum detection sensitivity is 0.1 ng / ml or less.
[0033]
【The invention's effect】
The monoclonal antibody of the present invention can accurately measure the amount of PSA by recognizing the C-terminal sequence of human PSA (SEQ ID NO: 1) but not the hK2 C-terminal sequence (SEQ ID NO: 2). It is very useful, and is expected to be applied especially to the diagnosis of prostate cancer.
In addition, by subjecting the monoclonal antibody of the present invention to enzyme labeling and mixing with an appropriate medium, it can be easily prepared into a solution or dry immunoassay reagent.
Furthermore, accurate and simple immunological measurement can be performed by using the monoclonal antibody of the present invention or an immunological measurement reagent prepared from this antibody.
In addition, the monoclonal antibody of the present invention can be easily produced by the hybridoma having the accession number FERM P-16526.
[0034]
[Sequence Listing]

[0035]

[0036]

[0037]

[0038]

[0039]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph showing the reactivity of monoclonal antibody PA-313 to human PSA and hK2 by Western blotting.
FIG. 2 is a graph showing the interaction between human PSA and hK2 and monoclonal antibody PA-313 by BIAcore.
FIG. 3 is a calibration curve for measuring PSA concentration, prepared using the immunoassay reagent of Example 4.
4 is a graph showing the examination results of the lowest detection sensitivity (0.1 ng / ml or less) using the immunological measurement reagent of Example 4. FIG.

Claims

An immunological measurement reagent that specifically measures human prostate specific antigen in the presence of human gonadal calicrene, comprising a labeled monoclonal antibody that recognizes the C-terminal amino acid of human prostate specific antigen represented by SEQ ID NO: 3 A reagent for immunological measurement of human prostate specific antigen.

The immunoassay reagent according to claim 1, further comprising a carrier on which an antibody recognizing an antigen determining site different from the labeled monoclonal antibody is immobilized.

The immunoassay reagent according to claim 1 or 2, wherein the labeled monoclonal antibody is an enzyme-labeled monoclonal antibody.

The immunoassay reagent according to claim 3, wherein the enzyme is horseradish peroxidase.

The immunoassay reagent according to any one of claims 1 to 4, wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced from a hybridoma having the accession number FERM P-16526.

The specific measuring method of a human prostate specific antigen in presence of human gonadal calicrene using the immunoassay reagent of any one of Claims 1-5.