JP4025153B2 - 唾液前処理キット及び唾液前処理方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒトの唾液中に存在する齲蝕原性細菌の一種であるミュータンス連鎖球菌を、抗原抗体反応を利用した免疫クロマトグラフィー法によって同定・定量を行うために用いる唾液前処理キット及びこの唾液前処理キットを使用する唾液前処理方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの口腔内におけるミュータンス連鎖球菌の存在と齲蝕の発生との間には密接な関係があることが知られており、ヒトの口腔内のミュータンス連鎖球菌の有無や量を簡便に検査できれば罹患リスクや現状の罹患状況の把握ができ、極めて多くの人々に恩恵をもたらすことが可能である。
【０００３】
従来から、細菌の検査には抗原抗体反応を利用した検査法が実施されてきた。例えば酵素抗体法は、酵素を用いた発色濃度で同定・定量を行う方法であるが、抗体やサンプルを扱うために特殊な洗浄器や煩雑で正確な操作を必要とし、酵素反応を行うためのインキュベーターが必要であった。また蛍光抗体法は、抗体を蛍光色素で標識し抗体と反応した抗原を特異的に染色する方法であるが、測定器として蛍光顕微鏡を必要とするために一般的ではない。
【０００４】
そのため、抗原抗体反応を簡便に利用する方法が数多く提案されてきた。例えばクロマトグラフィーを利用した測定方法がある（例えば、特許文献１，特許文献２，特許文献３，特許文献４，特許文献５，特許文献６参照。）。この方法は、採取した体液を同定・定量を目的とする抗原を含んだ試験溶液に混入して検査器具に染み込ませるだけで、抗原の有無や量を知ることができる簡便性に優れた方法である。このような方法は一般に免疫クロマトグラフィー法と呼ばれており、その同定・定量の原理も詳細に開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第５,５９１,６４５号公報
【特許文献２】
米国特許第４,８５５,２４０号公報
【特許文献３】
米国特許第４,４３５,５０４号公報
【特許文献４】
米国特許第４,９８０,２９８号公報
【特許文献５】
特開昭６１−１４５４５９号公報
【特許文献６】
特開平６−１６０３８８号公報
【非特許文献１】
Se-Hwan Paek, Seung-Hwa Lee, Joung-Hawan Cho and Young-Sang Kim, 「Development of rapid One-Step immunochromatographic assay, Ｍethods」, 22, 53-60, 2000
【０００６】
このような技術を応用すれば前述のヒトの口腔内のミュータンス連鎖球菌の同定・定量を行うことが可能であるように思われるが、現実には以下のような問題が存在するために実用化されていない。即ち、免疫クロマトグラフィー法で利用できるサンプルは原理上、多孔質膜中を毛細管現象によって通過できなければならない。しかし、ミュータンス連鎖球菌のような口腔内細菌の検査に用いられる主要なサンプルは唾液であるため、唾液中に存在するムチンと呼ばれる高粘性物質が多孔質膜の孔を塞いでしまい、またムチンは唾液中に存在する口腔粘膜面から剥がれ落ちた上皮付着細胞を凝集させる働きもするため、これらの物質により多孔質膜の孔が塞がれてミュータンス連鎖球菌の通過を阻害してしまう。
【０００７】
また、ムチン以外にも免疫クロマトグラフィー法においてミュータンス連鎖球菌の同定・定量を困難なものとする問題が存在する。即ち、測定の対象であるミュータンス連鎖球菌は単体では直径約１μｍ程度の菌であるが、連鎖球菌であるためしばしば１０〜２０個若しくはそれ以上に連鎖しており、多孔質膜中の移動を妨げる要因の一つとなり得る。しかも、ミュータンス連鎖球菌は食品中のスクロースから粘着性のグルカンを生成し、しばしば激しく凝集することもある。また、ミュータンス連鎖球菌の連鎖と凝集とは、多孔質膜中での目詰まりの原因となる以外にも連鎖球菌の表面積を減少させ、ミュータンス連鎖球菌表面に存在する抗原の数の定量に影響を与えてしまい、測定の正確性を低下させる原因となっている。
【０００８】
免疫クロマトグラフィー法においては一般的に検体を２つの抗体を用いて検出を行う。第一の抗体はサンプルが滴下される側のグラスファイバーなどから成る多孔質膜中に保持されており、その抗体は一般的にラテックス粒子や金コロイド粒子といったもので標識されている（以下、標識抗体と称することがある）。サンプル中に測定対象の検体が存在すると、この多孔質膜を通過する際に標識抗体が測定対象の検体を認識し結合する。この検体と標識抗体との複合体が毛細管現象により、第二の抗体（以下、捕捉抗体と称することがある）が例えば帯状に固定化された多孔質膜の方向へ流れる。ここで、捕捉抗体により検体と標識抗体との複合体が認識、捕捉され可視シグナルとして（この場合では帯状に）検出される。しかし唾液をサンプルとして免疫クロマトグラフィー法を用いた場合には、標識抗体とミュータンス連鎖球菌との複合体が、標識抗体を保持する膜中に捕捉されてしまい、捕捉抗体を固定化している多孔質膜の方向に効率良く毛細管現象で流れて行かず測定の正確性が低下してしまうという問題もあった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトの唾液中の齲蝕原性細菌の一種であるミュータンス連鎖球菌を抗原抗体反応を利用した免疫クロマトグラフィー法を用いて同定・定量を行う際の前記欠点を解消し、簡便な方法で唾液中のムチン及びミュータンス連鎖球菌の連鎖による凝集を取り除くことが可能で、且つ標識抗体とミュータンス連鎖球菌との複合体が標識抗体を保持する膜中から効率良く流れ出て行くことができる唾液前処理キット及び唾液前処理方法を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、特定の酸及びアルカリ溶液を用いて処理を行うことにより、
（１）唾液中のムチンやグルカンを溶解しミュータンス連鎖球菌の外膜に作用して凝集を抑えることができること、
（２）これに特定の界面活性剤を用いることによりミュータンス連鎖球菌に存在するタンパク質を可溶化させてミュータンス連鎖球菌が多孔質膜内を効率良く通り抜けることを可能にすること、
（３）更に塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガンという特定の金属塩を用いることにより標識抗体とミュータンス連鎖球菌との複合体が標識抗体を保持する膜中から効果的に流れ出すことが可能であること、
を究明して本発明を完成したのである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
即ち、本発明に係る唾液前処理キットの一つは、
Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液
Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液
Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤
とから構成され、Ｃ成分が、Ａ成分とＢ成分の少なくとも一方に混合されているか又はＡ成分及びＢ成分とは別に構成され、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質が前記Ａ，Ｂ，Ｃの各成分の少なくとも一つに５〜２５重量％の範囲で含有されていることを特徴とする唾液前処理キットであり、更にＤ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが、Ａ，Ｂ，Ｃの各成分の少なくとも一つに混合されていることが好ましく、
また、本発明に係る唾液前処理キットの他の一つは、
Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液
Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液
Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤
Ｄ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する水溶液
とから構成され、Ｃ成分が、Ａ成分，Ｂ成分，Ｄ成分の少なくとも一方に混合されているか又はＡ成分，Ｂ成分及びＤ成分とは別に構成され、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質がＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの各成分のうち少なくとも一つに５〜２５重量％の範囲で含有されていることを特徴とする唾液前処理キットである。
【００１２】
このような唾液前処理キットにおいて、Ｃ成分の非イオン性界面活性剤は、ポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートから成る群より選ばれる少なくとも一種又は二種以上の混合物であることが、またＣ成分の両性界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ（３−[（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−[（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート）から成る群より選ばれる一種又は二種以上の混合物であることが好ましい。
【００１３】
また、前記唾液前処理キットを使用する唾液前処理方法としては、免疫クロマトグラフィー法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量するに際し、後述するＡ，Ｂ，Ｃの各成分の少なくとも一つに、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質を５〜２５重量％の範囲で含有させておき、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤を任意の順に滴下して混合する方法（以下、第１の方法と言う）と、免疫クロマトグラフィー法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量するに際し、後述するＡ，Ｂ成分の少なくとも一つに、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質を５〜２５重量％の範囲で、及びＣ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤をそれぞれ含有させておき、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液、を任意の順に滴下して混合する方法（以下、第２の方法と言う）と、免疫クロマトグラフィー法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量するに際し、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤、Ｄ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの少なくとも一つに、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質を５〜２５重量％の範囲で含有させておき、Ａ成分とＢ成分がＤ成分の存在下で接触する順でＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ成分を滴下して混合する方法（以下、第３の方法と言う）とがある。
【００１４】
そして、第１の方法においては、更にＤ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、Ａ，Ｂ，Ｃの各成分の少なくとも一つに混合させておき、Ａ成分とＢ成分とがＤ成分の存在下で接触する順でＡ，Ｂ，Ｃ成分を滴下して混合することが、また第２の方法においては、更にＤ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、Ａ，Ｂ成分の少なくとも一方に混合させておき、Ａ成分とＢ成分とを任意の順で滴下して混合することが、第３の方法においては、少なくともＣ成分が混合されているＡ，Ｂ又はＤ成分を、Ａ成分とＢ成分がＤ成分の存在下で接触する順で滴下して混合することが更に好ましいのである。
【００１５】
このような本発明に係る唾液前処理キット及び唾液前処理方法に使用されるＡ成分である「０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液」は、唾液中のムチンやミュータンス連鎖球菌の外膜に存在するグルカンに作用してミュータンス連鎖球菌の凝集を抑え、抗原であるミュータンス連鎖球菌の多孔質膜中の移動を容易とする作用を成すもので、このアルカリ溶液として水酸化ナトリウムを使用することが必要であり、炭酸ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム等は適しておらず、水酸化ナトリウム以外のアルカリ溶液以外ではミュータンス連鎖球菌の検査を行うことはできない。これは水酸化ナトリウム以外のアルカリ処理では、ミュータンス連鎖球菌の抗原の構造に障害を与えている可能性があると推測される。水酸化ナトリウムの濃度は水溶液中に０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌであることが必要があり、０.０１ｍｏｌ／ｌ未満ではその効果が十分に得られず、１０ｍｏｌ／ｌを超えるとミュータンス連鎖球菌の抗原を破壊してしまい検出精度が低下する。
【００１６】
また、本発明に係る唾液前処理キット及び唾液前処理方法に使用されるＢ成分である「０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液」は、ミュータンス連鎖球菌の連鎖を抑えることにより抗原であるミュータンス連鎖球菌の多孔質膜中の移動を容易とする作用を成すもので、酸として酒石酸及び／又はクエン酸を使用することが必要である。その他の酸、例えば塩酸，硫酸，硝酸，酢酸，乳酸，マレイン酸等は適しておらず、水酸化ナトリウムと組み合わせて用いても目的とする検査の感度を得ることができない。これは酒石酸及びクエン酸以外では、ミュータンス連鎖球菌の抗原の構造に障害を与えている可能性があると推測される。酒石酸及び／又はクエン酸の濃度は水溶液中に０.０１〜３ｍｏｌ／ｌである必要があり、０.０１ｍｏｌ／ｌ未満ではその効果が十分に得られず、３ｍｏｌ／ｌを超えると酒石酸及び／又はクエン酸の溶解濃度が限界に達し沈殿を生じてしまうため適さない。
【００１７】
また、本発明に係る唾液前処理キット及び唾液前処理方法に使用されるＣ成分である「非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤」は、ミュータンス連鎖球菌表面のタンパク質を可溶化して、ミュータンス連鎖球菌が多孔質膜中を効率良く通り抜けることを可能とする作用を成すものである。従来から免疫クロマトグラフィー法ではサンプル液や抗原液が検査器具内をスムーズに移動できるようにイオン性界面活性剤を使用することがよくある。しかし、本発明に係るミュータンス連鎖球菌抗原の同定・定量を行うための唾液前処理キット及び唾液前処理方法に使用される界面活性剤は、実験の結果から非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤である必要があり、ラウリル硫酸ナトリウムやドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤では、抗体による抗原の検出を行うことができない。
【００１８】
このような本発明で使用する界面活性剤は、非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤であれば特に限定されず、一般に膜タンパク質の可溶化剤として使用されるものがいずれも使用できる。しかし、用いる非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤の種類によってミュータンス連鎖球菌抗原の検出感度に差があり、中でも非イオン性界面活性剤としては、ポリエチレングリコールモノオクチフェニルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドが、また両性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ（３−[（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−[（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート）から成る群より選ばれる一種又は二種以上の混合物であることが、検出感度の点で好ましい。
【００１９】
本発明に係る唾液前処理キット及び唾液前処理方法において、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤は、唾液の処理後に０.０５〜９０重量％の濃度となるように使用することが好ましく、０.０５重量％未満では抗原抗体反応による検出感度が低くなる傾向があり、９０重量％を超えても抗原抗体反応による検出感度が低下し易いので好ましくない。
【００２０】
本発明に係る唾液前処理キット及び唾液前処理方法において、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤は、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液及びＢ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液と別に提供されてもよく、その場合は水溶液の形態でもよい。またＡ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムを含有する水溶液とＢ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸を含有する水溶液との一方又は両方に混合されて提供されてもよいが、その場合には酸やアルカリによる分解性に注意を払わなければならない。
【００２１】
本発明に係る唾液前処理キット及び唾液前処理方法においては、標識抗体とミュータンス連鎖球菌との複合体が標識抗体を保持する膜中から効率良く流れ出るように、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質をＡ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤の少なくとも一つに５〜２５重量％の範囲で含有させておく。これら塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質は、唾液中に存在する各種タンパク質を塩析により凝集させ、また標識抗体とそれを保持する膜間の相互作用を打ち消す効果があり、その作用により標識抗体とミュータンス連鎖球菌との複合体が標識抗体を保持する膜中から効率良く流れ出す効果を得る。
【００２２】
これら塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質は、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤の少なくとも一つに５〜２５重量％の範囲で配合する必要があり、５重量％未満ではその効果が十分に得られず標識抗体とミュータンス連鎖球菌との複合体が標識抗体を保持する膜中から効率良く流れない。一方、２５重量％を超えると逆に検出精度が低下してしまう。
【００２３】
本発明に係る唾液前処理キット及び唾液前処理方法においては、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液とＢ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液との間に中和反応が起こるため、緩衝剤を利用することが好ましく、この中和反応において緩衝作用を効果的に得るためにはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを緩衝剤として使用することが好ましい。しかしこのとき、その他の緩衝剤、例えば炭酸水素ナトリウムと炭酸ナトリウムや、クエン酸とクエン酸ナトリウムのような組み合わせでは十分な緩衝作用は得られないことを確認している。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンはＡ，Ｂ，Ｃの各成分の少なくとも一方に配合してもよいし、別に提供されてもよく、その場合は水溶液の形態が好ましい。なお、本発明に係る唾液前処理キットにおいては、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液と、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液は、中和作用があるため必ず別になっていることが必要である。
【００２４】
本発明に係る唾液前処理方法における第１の方法では、免疫クロマトグラフィー法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量するに際し、Ａ，Ｂ，Ｃの各成分の少なくとも一つに、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質を５〜２５重量％の範囲で含有させておき、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤を任意の順に滴下して混合する。また、この処理を簡便にするために本発明に係る唾液前処理方法における第２の方法では、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤をＡ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液の少なくとも一方に予め混合させておき、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液を任意の順に滴下して混合する。
【００２５】
本発明に係る唾液前処理方法においては、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液と、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液との間に中和反応が起こるため緩衝剤を利用することが好ましく、この中和反応において緩衝作用を効果的に得るためには、Ｄ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを使用する。このとき、本発明に使用するＡ，Ｂ，Ｃの各成分はそれぞれ独立した機能を持つため、任意の順で処理を行うことが可能であるが、唾液前処理用キットにＤ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む場合には、Ａ成分とＢ成分の中和反応において緩衝作用を得るためにＡ成分とＢ成分とが接触する際にはＤ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの存在下であることが必要である。
【００２６】
また前記第１及び第２の方法以外に、本発明に係る唾液前処理方法における第３の方法では、免疫クロマトグラフィー法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量するに際し、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤、Ｄ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの少なくとも一つに、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質を５〜２５重量％の範囲で含有させておき、Ａ成分とＢ成分がＤ成分の存在下で接触する順でＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ成分を滴下して混合するのである。この場合、少なくともＣ成分が混合されているＡ，Ｂ又はＤ成分を、Ａ成分とＢ成分がＤ成分の存在下で接触する順で滴下して混合することが好ましい。
【００２７】
このような本発明に係る唾液前処理方法においては、処理後の唾液のｐＨが５〜９の範囲内となるように処理を行うことが好ましい。これは抗原抗体反応がこのｐＨの範囲内で行われるため、用いる抗体によって異なるが、ｐＨがこの範囲外であると抗体が抗原と離れてしまったり、非特異的な親和性を持ってしまうため測定結果の信頼性が低下する傾向がある。
【００２８】
本発明に係る唾液前処理キット及び唾液前処理方法によって処理を行った唾液試料は、従来の免疫クロマトグラフィー法を用いた抗原抗体反応により、ミュータンス連鎖球菌の同定・定量することが可能である。抗体は、通常用いられる方法によって得ることができ、例えば、KohlerとMilstein (Kohler G, C. Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256:495-497, 1975) による細胞融合によるハイブリドーマの樹立法によってもよいし、単に抗原を動物に免疫してその血清から精製したものでも構わない。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例のみに制限されるものではない。尚、特に記述がない限り、温度は室温で操作し、ｐＨは２０〜２５℃におけるｐＨを示す。
【００３０】
（１）試薬、試験器具の調製
１．抗体の作製
ミュータンス連鎖球菌としてストレプトコッカス・ミュータンス菌（ＡＴＣＣ２５１７５菌株）、ストレプトコッカス・ソブリヌス菌（ＡＴＣＣ３３４７８菌株）をそれぞれＢＨＩ培地（Brain Heart Infusion培地，ＤＩＦＣＯ社製）を用いて３７℃で一晩培養を行い、培養液から遠心分離によって菌体を回収した後、ＰＢＳ（１０ｍｍｏｌリン酸緩衝化生理食塩水）にて２回洗浄後、ホルムアルデヒド水溶液により生育を停止させた。この菌の分散液をそのままマウスに免疫し、KohlerとMilsteinによる細胞融合を用いたハイブリドーマの樹立法によって以下に示す精製抗体を各二種類ずつ得た。
【００３１】
「ＳＭ１抗体」…ストレプトコッカス・ミュータンス菌に対する抗体
「ＳＭ２抗体」…ストレプトコッカス・ミュータンス菌に対する抗体
「ＳＳ１抗体」…ストレプトコッカス・ソブリヌス菌に対する抗体
「ＳＳ２抗体」…ストレプトコッカス・ソブリヌス菌に対する抗体
【００３２】
２．抗体への金コロイド標識
粒径４０ｎｍの金コロイドをＳＭ２抗体及びＳＳ２抗体に標識した。金コロイドは市販品（商品名：British Biocell，International社製）を使用し、ウシ血清アルブミン（商品名：ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社製）１％、非イオン性界面活性剤（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０，ＳＩＧＭＡ社製）１％を添加したＰＢＳで抗体濃度０.１μｇ／ｍｌとなるように希釈した。金コロイドで標識した抗体液をそれぞれＳＭ２標識抗体、ＳＳ２標識抗体と称する。
【００３３】
３．抗体固定化多孔質膜ストリップの作製
多孔質膜としてプラスティックフィルムで裏打ちをしたニトロセルロースメンブレン（商品名：ＳＸＨＦ、日本ミリポア社製）を用いた。この膜を５ｍｍ×４０ｍｍの長方形に切り出し、ＳＭ１抗体又はＳＳ１抗体を１％ウシ血清アルブミン含有５０ｍｍｏｌリン酸緩衝液に１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように希釈し、この抗体希釈液を切り出したニトロセルロースメンブレンの中央部に長手方向と直角にマイクロピペットで凡そ１μｌ／ｃｍとなるように塗布した。尚、固定された抗体はそれぞれＳＭ１捕捉抗体、ＳＳ１捕捉抗体と称することがある。この膜の一方の端に１５ｍｍ四方の濾紙を密着するようにクリップで固定し吸水体とした。また、吸水体と反対側の端に標識抗体の保持体（以下、標識抗体保持体と称する）として５ｍｍ×２０ｍｍのポリプロピレン製マトリクス（商品名：クイックリリース コンジュゲートパッド，日本ミリポア社製）をクリップで固定し、そこにＳＭ２標識抗体液又はＳＳ２標識抗体液を３０μｌ滴下した。この器具を３７℃で２時間乾燥し、使用直前までデシケーター中に保管した。
【００３４】
以上の試薬、器具を用いた免疫クロマトグラフィー法による唾液中のミュータンス連鎖球菌の定量と、従来のコロニー数から算出する唾液中のミュータンス連鎖球菌とを比較した。
【００３５】
１．免疫クロマトグラフィー法による試験方法
ミュータンス連鎖球菌と抗体固定化多孔質膜ストリップ上に固定化された抗体との反応性は以下の原理で検出される。唾液が抗体固定化多孔質膜ストリップの標識抗体保持体を通過する際、唾液中のミュータンス連鎖球菌に標識抗体が結合し赤色に発色する。更にミュータンス連鎖球菌と標識抗体との複合体は抗体固定化多孔質膜ストリップ中を移動して行き、抗体固定化多孔質膜ストリップに例えば帯状に固定化された抗体（捕捉抗体）に捕捉され帯状の染みが確認される。
【００３６】
２．従来のコロニー数からのミュータンス連鎖球菌数
ＭＳＢ培地上に、ストレプトコッカス・ミュータンス菌、ストレプトコッカス・ソブリヌス菌の両菌及び夾雑菌がコロニーを形成する。そこでこれらのコロニー数を正確に計測するために、ＭＳＢ培地上に形成されたコロニー数を計測した後、それぞれのコロニーの一部分を回収し菌体を破砕した後に、ストレプトコッカス・ミュータンス菌又はストレプトコッカス・ソブリヌス菌に特異的な配列を持つ合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、増幅された遺伝子断片をアガロースゲルで電気泳動を行うことにより、菌株の確認も行った。
【００３７】
実施例１
抗体固定化多孔質膜ストリップとして、中央部にＳＭ１抗体を固定化し、一方の端の標識抗体保持体にはＳＭ２標識抗体を含んだものを用い、以下のように試験を行った。
【００３８】
被験者に唾液採取用ガムを５分間咀嚼させ唾液を試験管に採取した。採取した唾液の一部をＰＢＳにて希釈しＭＳＢ培地に塗布する。２〜３日間、３７℃で嫌気培養を行った後、コロニー数を計測する。計測後、それぞれのコロニーの一部分を回収し菌体を破砕した後にストレプトコッカス・ミュータンス菌又はストレプトコッカス・ソブリヌス菌に特異的な配列を持つ合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、増幅された遺伝子断片をアガロースゲルで電気泳動を行うことにより両菌株の判別を行った。判別の結果、ストレプトコッカス・ミュータンス菌のコロニーであると確認されたものの数値から細菌数（ＣＦＵ／ｍｌ値）を算出した。
【００３９】
１.０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム（Ａ成分）を含有している１.０ｍｏｌ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｄ成分）に２３.３重量％となるように塩化ナトリウムを添加した液（ＡＤ液）と、０.５ｍｏｌ／ｌのクエン酸（Ｂ成分）を含有している１.０ｍｏｌ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｄ成分）に非イオン性界面活性剤（Ｃ成分）としてポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル（和光純薬社製）を５重量％添加した液（ＢＣＤ液）とを準備した。
【００４０】
唾液２５０μｌに対し、先ずＡＤ液を５０μｌ添加して攪拌し、次にＢＣＤ液を１００μｌ添加して攪拌する処理を行い、処理後の唾液のうち１００μｌをストリップの標識抗体保持体側に滴下した。処理後の液のｐＨは７.２であった。尚、この液中のＣ成分の濃度は１.２５重量％となる。滴下１５分後に捕捉抗体との反応を確認し、また標識抗体保持体に残存するＳＭ２標識抗体とストレプトコッカス・ミュータンス菌との複合体の量を目視により観察した。
【００４１】
前記試験をａ〜ｅの５人の被験者に対して実施した結果を以下の表１に示す。抗体との反応性の評価は、＋＋：明確に赤色の帯が確認できる、＋：赤色の帯が確認できる、±：僅かに赤色の帯が確認できる、−：帯は確認できない、の４段階で評価した。また標識抗体保持体に残存するＳＭ２標識抗体とストレプトコッカス・ミュータンス菌との複合体の量（以下、単に残存抗体量と称す）を目視にて確認し、＋：標識抗体保持体に赤色として残存抗体が多く確認される、±：僅かに確認される、−：なし、の３段階で評価した。尚、表中で単位として用いているＣＦＵ／ｍｌは唾液１ｍｌ当りの細菌のコロニー数を示すものである。
【００４２】
【表１】

【００４３】
実施例２
実施例１と同様の抗体固定化多孔質膜ストリップにおいて、ＳＭ１捕捉抗体に代えてＳＳ１捕捉抗体を、ＳＭ２標識抗体に代えてＳＳ２標識抗体を使用し、以下の試験を行った。
【００４４】
１.０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム（Ａ成分）を含有している水溶液に２５.０重量％となるように塩化ナトリウムを添加した液（Ａ液）と、０.５ｍｏｌ／ｌのクエン酸（Ｂ成分）を含有している１.０ｍｏｌ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｄ成分）から成る液（ＢＤ液）と、非イオン性界面活性剤（Ｃ成分）であるポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル（和光純薬社製）５重量％水溶液（Ｃ液）とを準備した。
【００４５】
唾液２５０μｌに対し、先ずＢＤ液を８０μｌ添加して攪拌し、次にＣ液を５０μｌ添加して攪拌し、更にＡ液を４０μｌ添加して撹拌する処理を行い、処理後の唾液のうち１００μｌをストリップの標識抗体保持体側に滴下した。処理後の液のｐＨは６.６であった。尚、この液中のＣ成分の濃度は０.６０重量％となる。滴下１５分後に捕捉抗体との反応を確認し、また標識抗体保持体に残存するＳＳ２標識抗体とストレプトコッカス・ソブリヌス菌との複合体の量を目視により観察した。
【００４６】
前記の試験をａ〜ｅの５人の被験者に対して実施した結果を実施例１と同様の評価を行った。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】

【００４８】
実施例３
実施例１と同様に抗体固定化多孔質膜ストリップに、ＳＭ１捕捉抗体，ＳＭ２標識抗体を使用し、以下の試験を行った。
【００４９】
１.０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム（Ａ成分）を含有している非イオン性界面活性剤（Ｃ成分）であるポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル（和光純薬社製）５重量％の水溶液（ＡＣ液）と、０.５ｍｏｌ／ｌのクエン酸（Ｂ成分）を含有する１.０ｍｏｌ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｄ成分）に１２.０重量％となるように塩化ナトリウムを添加した液（ＢＤ液）とを準備した。
【００５０】
唾液２５０μｌに対し、先ずＡＣ液を７５μｌ添加して攪拌し、次にＢＤ液を７５μｌ添加して攪拌する処理を行い、処理後の唾液のうち１００μｌをストリップの標識抗体保持体側に滴下した。処理後の液のｐＨは７.５であった。尚、この液中のＣ成分の濃度は０.９４重量％となる。滴下１５分後に捕捉抗体との反応を確認し、また標識抗体保持体に残存するＳＭ２標識抗体とストレプトコッカス・ミュータンス菌との複合体の量を目視により観察した。
【００５１】
前記の試験をａ，ｂ，ｃの３人の被験者に対して実施した結果を実施例１と同様の評価を行った。結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】

【００５３】
実施例４
実施例２と同様に抗体固定化多孔質膜ストリップに、ＳＳ１捕捉抗体，ＳＳ２標識抗体を使用し以下の試験を行った。
【００５４】
４.０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム（Ａ成分）の水溶液（Ａ液）と、１.０ｍｏｌ／ｌの酒石酸（Ｂ成分）の水溶液（Ｂ液）と、非イオン性界面活性剤（Ｃ成分）であるポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル（和光純薬社製）５重量％の水溶液（Ｃ液）と、１.０ｍｏｌ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｄ成分）に１２.０重量％となるように塩化ナトリウムを添加した液（Ｄ液）とを準備した。
【００５５】
唾液２５０μｌに対し、先ずＣ液を４０μｌ添加して攪拌し、次にＢ液を４０μｌ添加して攪拌し、次にＤ液を４０μｌ添加して攪拌し、最後にＡ液を４０μｌ添加して攪拌する処理を行い、処理後の唾液のうち１００μｌをストリップの標識抗体保持体側に滴下した。処理後の液のｐＨは８.０であった。尚、この液中のＣ成分の濃度は０.４９重量％となる。滴下１５分後に捕捉抗体との反応を確認し、また標識抗体保持体に残存するＳＳ２標識抗体とストレプトコッカス・ソブリヌス菌との複合体の量を目視により観察した。
【００５６】
前記の試験をａ，ｂ，ｃの３人の被験者に対して実施した結果を実施例１と同様の評価を行った。結果を表４に示す。
【００５７】
【表４】

【００５８】
実施例５
実施例１と同様に抗体固定化多孔質膜ストリップに、ＳＭ１捕捉抗体，ＳＭ２標識抗体を使用し以下の試験を行った。
【００５９】
１.０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム（Ａ成分）を含有している非イオン性界面活性剤（Ｃ成分）であるポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル（和光純薬社製）５重量％の水溶液に１２.０重量％となるように塩塩化ナトリウムを添加した液（ＡＣ液）と、０.５ｍｏｌ／ｌの酒石酸（Ｂ成分）の水溶液（Ｂ液）と、１.０ｍｏｌ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｄ成分）に１２.０重量％となるように塩化ナトリウムを添加した液（Ｄ液）とを準備した。
【００６０】
唾液２５０μｌに対し、先ずＡＣ液を７５μｌ添加して攪拌し、次にＢ液を７５μｌ添加して攪拌し、次にＤ液を５０μｌ添加して攪拌する処理を行い、処理後の唾液のうち１００μｌをストリップの標識抗体保持体側に滴下した。処理後の液のｐＨは７.２であった。尚、この液中のＣ成分の濃度は０.８３重量％となる。滴下１５分後に捕捉抗体との反応を確認し、また標識抗体保持体に残存するＳＭ２標識抗体とストレプトコッカス・ミュータンス菌との複合体の量を目視により観察した。
【００６１】
前記の試験をａ，ｂ，ｃの３人の被験者に対して実施した結果を実施例１と同様の評価を行った。結果を表５に示す。
【００６２】
【表５】

【００６３】
実施例６
実施例１と同様に抗体固定化多孔質膜ストリップに、ＳＭ１捕捉抗体，ＳＭ２標識抗体を使用し以下の試験を行った。
【００６４】
１２.０重量％となるように塩化ナトリウムを添加した３.０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム（Ａ成分）を含有している１.０ｍｏｌ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｄ成分）から成る液（ＡＤ液）と、１.０ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び０.５ｍｏｌ／ｌのクエン酸（Ｂ成分）を含有する１.０ｍｏｌ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｄ成分）から成る液（ＢＤ液）と、非イオン性界面活性剤（Ｃ成分）であるポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル（和光純薬社製）５重量％の水溶液に２ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを添加した液（Ｃ液）とを準備した。
【００６５】
唾液２５０μｌに対し、先ずＢＤ液を４０μｌ添加して攪拌し、次にＡ液を４０μｌ添加して攪拌し、次にＣ液を４０μｌ添加して攪拌する処理を行い、処理後の唾液のうち１００μｌをストリップの標識抗体保持体側に滴下した。処理後の液のｐＨは６.９であった。尚、この液中のＣ成分の濃度は０.５４重量％となる。滴下１５分後に捕捉抗体との反応を確認し、また標識抗体保持体に残存するＳＭ２標識抗体とストレプトコッカス・ミュータンス菌との複合体の量を目視により観察した。
【００６６】
前記の試験をａ，ｂ，ｃの３人の被験者に対して実施した結果を実施例１と同様の評価を行った。結果を表６に示す。
【００６７】
【表６】

【００６８】
実施例７
実施例１と同様に抗体固定化多孔質膜ストリップに、ＳＭ１捕捉抗体，ＳＭ２標識抗体を使用し以下の試験を行った。
【００６９】
１.０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム（Ａ成分）を含有している水溶液に２５.０重量％となるように塩化ナトリウムを添加した液（Ａ液）と、０.５ｍｏｌ／ｌのクエン酸（Ｂ成分）を含有している水溶液に非イオン性界面活性剤（Ｃ成分）であるポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル（和光純薬社製）を５重量％となるように添加した液（ＢＣ液）と、２ｍｏｌ／ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｄ成分）から成る緩衝液（Ｄ液）とを準備した。
【００７０】
唾液２５０μｌに対し、先ずＤ液を４０μｌ添加して攪拌し、次にＡ液を４０μｌ添加して攪拌し、次にＢＣ液を７０μｌ添加して攪拌する処理を行い、処理後の唾液のうち１００μｌをストリップの標識抗体保持体側に滴下した。処理後の液のｐＨは６.９であった。尚、この液中のＣ成分の濃度は０.８８重量％となる。滴下１５分後に捕捉抗体との反応を確認し、また標識抗体保持体に残存するＳＭ２標識抗体とストレプトコッカス・ミュータンス菌との複合体の量を目視により観察した。
【００７１】
前記の試験をａ〜ｅの５人の被験者に対して実施した結果を実施例１と同様の評価を行った。結果を表７に示す。
【００７２】
【表７】

【００７３】
比較例１
塩化ナトリウムの入っていないＡＤ液を用いた以外は実施例１と同様にして、試験をａ〜ｅの５人の被験者に対して実施した結果を実施例１と同様の評価を行った。結果を表８に示す。
【００７４】
【表８】

【００７５】
比較例２
塩化ナトリウムの入っていないＤ液を用いた以外は実施例４と同様にして、試験をａ，ｂ，ｃの３人の被験者に対して実施した結果を実施例１と同様の評価を行った。結果を表９に示す。
【００７６】
【表９】

【００７７】
以上の結果から本発明に係る唾液前処理キットを使用した唾液前処理方法は、唾液中のムチン及びミュータンス連鎖球菌の連鎖による凝集を取り除くことが可能であり、且つ標識抗体保持体に残存する標識抗体とミュータンス連鎖球菌との複合体の量が少ないことから、標識抗体とミュータンス連鎖球菌との複合体が標識抗体を保持する膜中に留まってしまう現象を防ぐ効果が確認できた。
【００７８】
【発明の効果】
以上に詳述した如く、本発明に係る唾液前処理キット及び唾液の前処理方法は、ヒトの唾液中の齲蝕原性細菌の一種であるミュータンス連鎖球菌を抗原抗体反応を利用した免疫クロマトグラフィー法を用いて同定・定量を行う際に、簡便な方法で唾液中のムチン及びミュータンス連鎖球菌の連鎖による凝集を取り除くことが可能で、且つ標識抗体とミュータンス連鎖球菌との複合体が標識抗体を保持する膜中から効率良く流すことにより精度の高い同定・定量を行うことを可能とするものであり、その歯科医療に貢献する価値の非常に大なるものである。

Claims (11)

1. Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液
   Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液
   Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤
   とから構成され、Ｃ成分が、Ａ成分とＢ成分の少なくとも一方に混合されているか又はＡ成分及びＢ成分とは別に構成され、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質が前記Ａ，Ｂ，Ｃの各成分の少なくとも一つに５〜２５重量％の範囲で含有されていることを特徴とする唾液前処理キット。
2. 更にＤ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが、Ａ，Ｂ，Ｃの各成分の少なくとも一つに混合されている請求項１に記載の唾液前処理キット。
3. Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液
   Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液
   Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤
   Ｄ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する水溶液
   とから構成され、Ｃ成分が、Ａ成分，Ｂ成分，Ｄ成分の少なくとも一方に混合されているか又はＡ成分，Ｂ成分及びＤ成分とは別に構成され、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質がＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの各成分のうち少なくとも一つに５〜２５重量％の範囲で含有されていることを特徴とする唾液前処理キット。
4. Ｃ成分の非イオン性界面活性剤が、ポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートから成る群より選ばれる少なくとも一種又は二種以上の混合物である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の唾液前処理キット。
5. Ｃ成分の両性界面活性剤が、ＣＨＡＰＳ（３−[（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−[（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート）から成る群より選ばれる一種又は二種以上の混合物である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の唾液前処理キット。
6. 免疫クロマトグラフィー法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量するに際し、後述するＡ，Ｂ，Ｃの各成分の少なくとも一つに、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質を５〜２５重量％の範囲で含有させておき、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤を任意の順に滴下して混合することを特徴とする唾液前処理方法。
7. 更にＤ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、Ａ，Ｂ，Ｃの各成分の少なくとも一つに混合させておき、Ａ成分とＢ成分とがＤ成分の存在下で接触する順でＡ，Ｂ，Ｃ成分を滴下して混合する請求項６に記載の唾液前処理方法。
8. 免疫クロマトグラフィー法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量するに際し、後述するＡ，Ｂ成分の少なくとも一つに、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質を５〜２５重量％の範囲で、及びＣ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤をそれぞれ含有させておき、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液、を任意の順に滴下して混合することを特徴とする唾液前処理方法。
9. 更にＤ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、Ａ，Ｂ成分の少なくとも一方に混合させておき、Ａ成分とＢ成分とを任意の順で滴下して混合する請求項８に記載の唾液前処理方法。
10. 免疫クロマトグラフィー法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量するに際し、Ａ）０.０１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ）０.０１〜３ｍｏｌ／ｌの酒石酸及び／又はクエン酸水溶液、Ｃ）非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤、Ｄ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの少なくとも一つに、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，硫酸マンガンから成る群より選ばれる少なくとも一種の物質を５〜２５重量％の範囲で含有させておき、Ａ成分とＢ成分がＤ成分の存在下で接触する順でＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ成分を滴下して混合することを特徴とする唾液前処理方法。
11. 少なくともＣ成分が混合されているＡ，Ｂ又はＤ成分を、Ａ成分とＢ成分がＤ成分の存在下で接触する順で滴下して混合する請求項１０に記載の唾液前処理方法。