JP4024282B2 - Novel polypeptide ESDN, method for producing the same, cDNA encoding ESDN, vector comprising the cDNA, host cell transformed with the vector, antibody of ESDN, and pharmaceutical composition containing ESDN or antibody - Google Patents
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Description
本発明は、新規なポリペプチドである血管内皮細胞・平滑筋細胞由来ニューロピリン様分子（Endothelial and Smooth muscle cell-Derived Neuropilin-like molecule 、以下、ＥＳＤＮと省略する。）、その製造方法、ＥＳＤＮをコードするｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、ＥＳＤＮの抗体、ＥＳＤＮまたは抗体を含有する薬学的組成物、ＥＳＤＮを測定する方法、ＥＳＤＮを測定する試薬およびＥＳＤＮを用いたスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a novel polypeptide vascular endothelial cell / smooth muscle cell-derived neuropilin-like molecule (hereinafter abbreviated as “ESDN”), its production method, and ESDN. Encoding cDNA, vector comprising the cDNA, host cell transformed with the vector, ESDN antibody, ESDN or pharmaceutical composition containing antibody, method for measuring ESDN, reagent for measuring ESDN and ESDN Related to the screening method.
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のクローニング以来、血管形成を支配する複雑な細胞外シグナル伝達ネットワークの解明が画期的になされてきた。このリガンドやＦｌｋ−１／ＶＥＧＦＲ２やＦｌｔ−１／ＶＥＧＦＲ１といったチロシンキナーゼのノックアウトマウスの研究が、血管形成、発生の第一ステップに関する最初の重要点であった。
ＶＥＧＦ受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）は、内皮細胞形成において必要であり、またこの遺伝子の欠損は、血液細胞群あるいは組織化された血管の不足を招き発生9.5日目に胎生死につながる。しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲを用いた初期マーカーの解析により初期の造血や内皮の前駆細胞が実際にＶＥＧＦＲ２非存在下において造られるという報告から、ＶＥＧＦＲ２は血球芽細胞の形成においては必要不可欠ではないが、系統のその後の増加には必要であることを示唆している。
ＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦＲ１）ノックアウトマウスもまた発生9.5日目に死ぬが、それらの内皮細胞の分化は直接影響を受けていない。その代わりに、主に間充識の血球芽細胞の移行が不足していると考えられ、過密になった内皮前駆細胞が、脈管系の重篤な組織破壊を導く。
ＶＥＧＦノックアウトマウスもまた発生9.5日目に著しい減少を伴って死ぬが、内皮細胞の分化を欠いていない。つまり、本質的にはＶＥＧＦＲ１ノックアウトマウスと同様であるが、より軽度なフェノタイプを示す。この遺伝子における目立った特長は、ヘテロ接合体の遺伝子欠失でも発生11.5日目に胎生致死になることである。このことは胎生期においてＶＥＧＦに対する著しく厳格な容量依存性が存在することを示している。
その他のレセプターチロシンキナーゼもまた、Ｔｉｅ−２やそのリガンドangiopoietin−１といったように血管内皮細胞に特異的に発現をしていて、血管形成における後期、血管新生のステップに関与している。これら遺伝子の破壊は、脈管形成には影響を及ぼさないが、血管のリモデリングに障害を与え、発生10.5日目に胎生死につながる。それらは、内皮細胞とそれを取り巻く血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）あるいは間充識細胞間の相互作用において役割を担っている。これらの脈管特有のシステムに付け加えて、ＰＤＧＦ−ＢＢあるいはＴＧＦ−βそしてそれらのレセプターもまた内皮細胞とそれを取り巻く細胞間で同様な役割を担っている。脈管システムに対するニューロピリン−１（ＮＰ−１；neuropilin-1）の関係の同定は、この分野の新局面を紹介した。ＮＰ−１は初め発達した神経系を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識される抗原としてクローニングされた。
そして、セマフォリン３Ａ（semaphorin 3A；sema 3A）のレセプターとしての同定は、軸索形成において一躍注目を浴びるようになった。またその他のＶＥＧＦレセプターの探索がＶＥＧＦＲ２のレセプターでもあるＮＰ−１の発見につながった。そしてそれは、一つのＶＥＧＦアイソフォーム（isoform）への結合の増加だけでなく、内皮細胞の遊走やおそらくマイトシス（mitosis）も同様に促進する。このことが同定される前は、ＮＰ−１を強制発現させたキメラマウスは、肥大した脈管を形成することが示された。ＮＰ−１ノックアウトマウスは、中枢神経系においては低い血管質を呈し、また大きな脈管の異形をも示した。一方sema 3Aノックアウトマウスでは血管の異常性の存在や非存在は報告されていないが、そのフェノタイプがＮＰ−１強制発現マウスにおいても観察された薄い心筋層を呈することは興味深い。
Ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎシステムは、別の例であり、初めに神経科学において有名になった。しかし、後に現在までには唯一の動脈と静脈を識別する表面マーカーとして同定されている。それらもまた内皮細胞との接点である周囲の間充識細胞に発現を示している。これらの役割を持った分子以外にも、我々は更に多くの細胞外シグナル伝達分子が血管の分野においては存在すると想定した。そしてこの事の解明が、この複雑なシステムのさらなる理解に貢献できるであろうと考えた。
Since the cloning of vascular endothelial growth factor (VEGF), elucidation of the complex extracellular signaling network that governs angiogenesis has been revolutionary. The study of knockout mice of this ligand and tyrosine kinases such as Flk-1 / VEGFR2 and Flt-1 / VEGFR1 was the first important point regarding the first step of angiogenesis and development.
VEGF receptor-2 (VEGFR2) is necessary for endothelial cell formation, and this gene deficiency leads to a lack of blood cell groups or organized blood vessels leading to embryonic death on day 9.5. However, from the report that initial hematopoiesis and endothelial progenitor cells are actually produced in the absence of VEGFR2 by analysis of initial markers using RT-PCR, VEGFR2 is not essential for the formation of hematoblasts, It suggests that it is necessary for the subsequent increase of the strain.
VEGF receptor-1 (VEGFR1) knockout mice also die at 9.5 days of development, but their endothelial cell differentiation is not directly affected. Instead, the migration of interstitial hematoblasts is thought to be lacking, and congested endothelial progenitor cells lead to severe tissue destruction of the vasculature.
VEGF knockout mice also die with a significant decrease at 9.5 days of development, but do not lack endothelial cell differentiation. That is, it is essentially the same as the VEGFR1 knockout mouse, but shows a milder phenotype. A striking feature of this gene is that even a heterozygous gene deletion results in embryonic lethality on day 11.5. This indicates that there is a remarkably stringent dose dependence on VEGF during embryonic life.
Other receptor tyrosine kinases are also specifically expressed in vascular endothelial cells such as Tie-2 and its ligand angiopoietin-1, and are involved in the later stages of angiogenesis, angiogenesis steps. While disruption of these genes does not affect angiogenesis, it disrupts vascular remodeling and leads to embryonic death at 10.5 days of development. They play a role in the interaction between endothelial cells and the vascular smooth muscle cells (VSMC) or mesenchymal cells that surround them. In addition to these vascular specific systems, PDGF-BB or TGF-β and their receptors also play a similar role between endothelial cells and the cells surrounding them. Identification of the relationship of neuropilin-1 (NP-1) to the vascular system introduced a new aspect of the field. NP-1 was cloned as an antigen recognized by a monoclonal antibody that specifically recognizes the initially developed nervous system.
The identification of semaphorin 3A (semaphorin 3A) as a receptor has attracted a great deal of attention in axon formation. The search for other VEGF receptors led to the discovery of NP-1, which is also a receptor for VEGFR2. And it not only increases binding to a single VEGF isoform, but also promotes endothelial cell migration and possibly mitosis as well. Before this was identified, it was shown that chimeric mice that forcedly expressed NP-1 formed enlarged vessels. NP-1 knockout mice exhibited low vascularity in the central nervous system and also exhibited large vascular malformations. On the other hand, the presence or absence of vascular abnormality has not been reported in sema 3A knockout mice, but it is interesting that the phenotype exhibits a thin myocardium observed in NP-1 forced expression mice.
The Eph / ephrin system is another example and first became famous in neuroscience. However, to date it has been identified as the only surface marker that distinguishes arteries and veins. They also show expression in surrounding mesenchymal cells, which are contacts with endothelial cells. In addition to molecules with these roles, we assumed that many more extracellular signaling molecules exist in the vascular field. And I thought that elucidation of this could contribute to further understanding of this complex system.
従来、ある特定のポリペプチドまたはそれをコードするｃＤＮＡを得ようとする場合、組織や細胞培養液中に目的とする生物活性を確認し、次いでポリペプチドの単離精製を経て、遺伝子をクローニングするという方法、あるいはその生物活性を指標として遺伝子を発現クローニングする方法が一般的に用いられてきた。しかし、生体内生理活性ポリペプチドは、多様な生物活性を有している場合が多いので、あるひとつの活性を指標にして遺伝子をクローニングした結果、それが既知のポリペプチドと同一であることが後になって判明するという事例が増えている。また、微量しか産生されなかったり、特別な生理条件でのみ発現する因子も多く、そのことが単離、精製および生物活性の確認を困難なものとしている。 Conventionally, when obtaining a specific polypeptide or cDNA encoding the same, the target biological activity is confirmed in tissue or cell culture medium, and then the gene is cloned through isolation and purification of the polypeptide. In general, a method of expressing and cloning a gene using its biological activity as an index has been used. However, in vivo bioactive polypeptides often have a variety of biological activities, and as a result of cloning a gene using one activity as an indicator, it may be the same as a known polypeptide. Increasing cases are found later. In addition, there are many factors that are produced only in trace amounts or expressed only under special physiological conditions, which makes isolation, purification, and confirmation of biological activity difficult.
本発明者らは、これまで造血系や免疫系で働く増殖分化因子の遺伝子のクローニングを研究してきた。そして、増殖分化因子（例えば、各種サイトカイン等）のような分泌蛋白質やそのレセプターのような膜蛋白質（以下、これらをまとめて分泌蛋白質等と呼ぶ。）の大部分がそのＮ末端にシグナルペプチドと呼ばれる配列を有していることに着目して、シグナルペプチドをコードする遺伝子を効率的かつ選択的にクローニングする方法を鋭意検討した。その結果、動物細胞を用いて、シグナルペプチドの有無を簡単に検索できる方法（シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ）法）を見出した（特許第3,229,590号参照）。さらに同じ概念のもとに、酵母を用いてさらに大量かつ簡便にシグナルペプチドをコードする遺伝子を単離する方法（酵母ＳＳＴ法）も開発された（米国特許No.5,536,637）。 The present inventors have studied the cloning of a gene for a growth / differentiation factor that works in the hematopoietic system and the immune system. And most of secreted proteins such as growth differentiation factors (for example, various cytokines) and membrane proteins such as receptors thereof (hereinafter collectively referred to as secreted proteins etc.) have a signal peptide at the N-terminus. Focusing on the fact that it has a sequence called, we have intensively studied a method for efficiently and selectively cloning a gene encoding a signal peptide. As a result, a method (signal sequence strap (SST) method) was found that can easily search for the presence or absence of a signal peptide using animal cells (see Patent No. 3,229,590). Furthermore, based on the same concept, a method (yeast SST method) for isolating a gene encoding a signal peptide more easily and easily using yeast was also developed (US Patent No. 5,536,637).
本発明者らは，循環器領域におけるＰＴＣＡ後の再狭窄や動脈硬化での病的血管平滑筋で重要な役割を果たしている有益な新規因子（ポリペプチド）、特に分泌シグナルを有する分泌蛋白質および膜蛋白質に着目してそれを見出すべく、鋭意検討を行なった。
本発明者らは、血管細胞に対して新たに修正したＳＳＴスクリーニングを行ない、新規トランスメンブラン（transmembrane）タンパクのクローニングに成功した。本発明の蛋白ＥＳＤＮは、新規のＩ型transmembraneタンパク質であり、ニューロピリン（neuropilin）様の特徴的ドメインを持つものである。
The present inventors have provided a novel novel factor (polypeptide) that plays an important role in pathologic smooth muscle after restenosis and arteriosclerosis after PTCA in the cardiovascular region, in particular secreted proteins and membranes with secretory signals. In order to find out by focusing on the protein, we conducted intensive studies.
The present inventors performed newly modified SST screening on vascular cells and succeeded in cloning a novel transmembrane protein. The protein ESDN of the present invention is a novel type I transmembrane protein having a characteristic domain like neuropilin.
本発明のＥＳＤＮ蛋白は、後に詳述されるように、冠動脈細胞ならびに平滑筋細胞で発現され、またバルーン傷害した動脈の血管平滑筋や総頸動脈の中膜で発現されることから、循環器領域におけるＰＴＣＡ後の再狭窄や動脈硬化の治療に有用であると考えられる。 As will be described in detail later, the ESDN protein of the present invention is expressed in coronary artery cells and smooth muscle cells, and also expressed in the vascular smooth muscle of balloon-injured arteries and the media of the common carotid artery. It is considered useful for the treatment of restenosis after PTCA and arteriosclerosis in the region.
本発明が提供するｃＤＮＡ配列は、配列番号２で示されるヒトＥＳＤＮクローンとして同定され、冠動脈初代培養内皮細胞および平滑筋細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーより、酵母ＳＳＴ法を使用して得た情報をもとに単離された。配列番号３で示されるヒトＥＳＤＮクローンは分泌蛋白質（ここではヒトＥＳＤＮ蛋白として表される。）をコードする完全なｃＤＮＡ配列を含む全長鎖ｃＤＮＡである。 The cDNA sequence provided by the present invention is identified as a human ESDN clone represented by SEQ ID NO: 2, and information obtained using a yeast SST method from a cDNA library prepared from coronary artery primary cultured endothelial cells and smooth muscle cells is obtained. Originally isolated. The human ESDN clone shown in SEQ ID NO: 3 is a full-length cDNA containing a complete cDNA sequence encoding a secreted protein (herein expressed as a human ESDN protein).
本発明が提供するｃＤＮＡ配列は、配列番号６で示されるマウスＥＳＤＮクローンとして同定され、酵母ＳＳＴ法を使用して得た情報をもとに、マウスｃＤＮＡライブラリーより単離された。配列番号５で示されるマウスＥＳＤＮクローンは分泌蛋白質（ここではマウスＥＳＤＮ蛋白として表される）をコードする完全なｃＤＮＡ配列を含む全長鎖ｃＤＮＡである。 The cDNA sequence provided by the present invention was identified as a mouse ESDN clone represented by SEQ ID NO: 6, and was isolated from a mouse cDNA library based on information obtained using the yeast SST method. The mouse ESDN clone shown in SEQ ID NO: 5 is a full-length cDNA containing a complete cDNA sequence encoding a secreted protein (herein expressed as mouse ESDN protein).
本発明が提供する配列番号９で示されるｃＤＮＡ配列は、ラットＥＳＤＮクローンとして同定され、酵母ＳＳＴ法を使用して得た情報をもとに、ラットｃＤＮＡライブラリーより単離された。配列番号８で示されるマウスＥＳＤＮクローンは分泌蛋白質（ここではマウスＥＳＤＮ蛋白として表される）をコードする完全なｃＤＮＡ配列を含む全長鎖ｃＤＮＡである。 The cDNA sequence represented by SEQ ID NO: 9 provided by the present invention was identified as a rat ESDN clone and was isolated from a rat cDNA library based on information obtained using the yeast SST method. The mouse ESDN clone shown in SEQ ID NO: 8 is a full-length cDNA containing a complete cDNA sequence encoding a secreted protein (herein expressed as mouse ESDN protein).
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対してジンバンク（GenBank）およびＮＣＢＩを用いたＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡおよびＵＮＩＧＥＮＥなどにより、またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＰ、Ｆｌｙ Ｄａｔａｂａｓｅ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ などにより検索をした結果、本発明ポリペプチドであるラットＥＳＤＮおよびそれらをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。このことから、本発明のポリペプチドは新規な分泌蛋白質であることが判明した。 For known nucleic acid sequences registered in the nucleic acid sequence database by GenBank and BLASTN, FASTA and UNIGENE using NCBI, etc., and for amino acid sequences of known polypeptides registered in the amino acid sequence database As a result of searching with BLASTP, Fly Database, SwissProt, etc., there was no sequence that matches the rat ESDN which is the polypeptide of the present invention and the nucleic acid sequence encoding them. From this, it was found that the polypeptide of the present invention is a novel secreted protein.
本発明は、
１．実質的に純粋な形である配列番号２、５または８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのホモローグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモローグからなるポリペプチド。
２．配列番号２、５または８で示されるアミノ酸配列からなる前項１記載のポリペプチド、
３．前項１または２に記載されたポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、
４．配列番号３、６または９で示される塩基配列を有する前項３記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントからなるｃＤＮＡ。
５．前項３または４に記載のｃＤＮＡからなる複製または発現ベクター、
６．前項５記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
７．前項１または２に記載されたポリペプチドを発現させるための条件下、前項６記載の宿主細胞を培養することを特徴とするからなる前項１または２に記載のポリペプチドの製造方法、
８．前項１または２に記載されたポリペプチドのポリクローナルまたはモノクローナル抗体、
９．前項１または２に記載されたポリペプチドまたは前項８記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有することを特徴とする薬学的組成物、
１０．前項１または２に記載されたポリペプチドまたは前項８記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有することを特徴とするＰＴＣＡ後の再狭窄の治療に有効な薬学的組成物、
１１．前項１または２に記載されたポリペプチドまたは前項８記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有することを特徴とする前項１０記載の動脈硬化の治療に有効な薬学的組成物、
１２．前項１または２に記載されたポリペプチドの測定方法、
１３．前項８記載の抗体を用いることを特徴とする前項１または２に記載されたポリペプチドの免疫化学的測定方法、
１４．前項１２または１３記載の方法を用いることを特徴とする前項１または２に記載されたポリペプチドを検出する試薬、
１５．前項１２または１３記載の方法を用いることを特徴とするＰＴＣＡ後の再狭窄を検査する試薬、
１６．前項１２または１３記載の方法を用いることを特徴とする動脈硬化を検査する試薬、および
１７．前項１または２に記載されたポリペプチドを用いることを特徴とする、該ポリペプチドに対するアンタゴニストまたはアゴニストとしての活性を有する化合物をスクリーニングする方法に関する。
The present invention
1. A polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5, or 8 in a substantially pure form, or a polypeptide comprising a homologue thereof, a fragment thereof or a homologue thereof.
2. The polypeptide according to
3. CDNA encoding the polypeptide described in the preceding
4). The cDNA according to the
5). A replication or expression vector comprising the cDNA according to
6). A host cell transformed with the replication or expression vector of
7). The method for producing the polypeptide according to
8). A polyclonal or monoclonal antibody of the polypeptide described in
9. A pharmaceutical composition comprising the polypeptide according to
10. A pharmaceutical composition effective for the treatment of restenosis after PTCA, comprising the polypeptide according to
11. 10. A pharmaceutical composition effective for the treatment of arteriosclerosis according to
12 A method for measuring the polypeptide according to 1 or 2 above,
13. The method for immunochemical measurement of a polypeptide according to
14 A reagent for detecting the polypeptide according to
15. A reagent for examining restenosis after PTCA, characterized by using the method according to item 12 or 13 above,
16. 16. A reagent for examining arteriosclerosis, which comprises using the method according to item 12 or 13, and The present invention relates to a method for screening a compound having activity as an antagonist or agonist for the polypeptide, characterized by using the polypeptide described in the
本発明者らは、該ポリペプチドが血管平滑筋の収縮形質よりも合成形質において発現が亢進することを確認した。そのため、該ポリペプチドを用いて循環器領域におけるPTCA後の再狭窄や動脈硬化の治療に有用であると考えられる。
また、本発明のポリペプチドは、実験に於いて、細胞増殖抑制作用を示したこと、ＶＥＧＦと構造が類似であることから、以下の作用を有することが考えられる。
「サイトカイン活性および細胞増殖／分化活性」
本発明の蛋白は、強制発現系において細胞増殖を抑制したことから、サイトカイン活性および細胞増殖（誘導あるいは阻害）／分化活性（誘導あるいは阻害）を示す可能性、あるいはある細胞集団に他のサイトカインの産生を誘導あるいは抑制すると考えられる。
「免疫刺激／抑制活性」
本発明の蛋白は、免疫刺激活性および免疫抑制活性も示すと考えられる。例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球あるいはどちらか一方の成長および増殖を制御（刺激あるいは抑制）することや、同様にＮＫ細胞や他の集団の細胞傷害性活性に影響を与えることによって、様々な免疫不全および疾患の治療に効果を示すと考えられる。特に腫瘍血管新生によって引き起こされるリンパ行性癌転移の抑制において効果を示すと考えられる。
「虚血性血管新生抑制活性」
本発明の蛋白は、糖尿病の合併症である網膜症を抑制すると考えられる。ＶＥＧＦは虚血誘導によって強力な血管新生作用を持つことが知られている。糖尿病網膜症の血管新生も網膜無血管領域が形成された後に起こる虚血性血管新生である。本発明の蛋白は、ニューロピリン（neuropilin）との構造の類似性から新規のＶＥＧＦ受容体として血管増殖を抑制するように働いている可能性が考えられる。このことから糖尿病網膜症において効果を示すと考えられる。
The inventors of the present invention have confirmed that the expression of the polypeptide is enhanced in the synthetic trait than the contractile trait of vascular smooth muscle. Therefore, it is considered that the polypeptide is useful for treatment of restenosis after PTCA and arteriosclerosis in the circulatory region.
In addition, the polypeptide of the present invention exhibited a cell growth inhibitory action in the experiment, and since it has a structure similar to VEGF, it may have the following actions.
"Cytokine activity and cell proliferation / differentiation activity"
Since the protein of the present invention suppresses cell proliferation in a forced expression system, it may exhibit cytokine activity and cell proliferation (induction or inhibition) / differentiation activity (induction or inhibition), or other cytokines may be present in a cell population. It is thought to induce or suppress production.
"Immune stimulation / suppression activity"
The protein of the present invention is also considered to exhibit immunostimulatory activity and immunosuppressive activity. For example, by controlling (stimulating or suppressing) the growth and proliferation of either T lymphocytes and / or B lymphocytes, and also affecting the cytotoxic activity of NK cells and other populations. It appears to be effective in the treatment of immune deficiencies and diseases. In particular, it is considered to be effective in suppressing lymphatic cancer metastasis caused by tumor angiogenesis.
"Ischemic angiogenesis inhibitory activity"
The protein of the present invention is considered to suppress retinopathy, which is a complication of diabetes. VEGF is known to have a strong angiogenic effect upon induction of ischemia. Angiogenesis of diabetic retinopathy is also ischemic angiogenesis that occurs after the formation of a retinal avascular region. It is considered that the protein of the present invention may act as a novel VEGF receptor to suppress blood vessel growth due to the structural similarity with neuropilin. This is considered to be effective in diabetic retinopathy.
ハイブリダイズするｃＤＮＡには、上記配列の相補配列も含まれる。ハイブリダイズは、ストリンジェントな条件で行なうことが好ましい。 The hybridizing cDNA includes a complementary sequence of the above sequence. Hybridization is preferably performed under stringent conditions.
実質的に純粋な形である配列番号２、５または８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９８または９９％が配列番号２、５または８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを意味する。 A polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 5, or 8 in substantially pure form is generally 90% or more, eg, 95, 98, or 99% of the polypeptide as produced. It means a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown by 2, 5 or 8.
配列番号２、５または８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０、８０または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記載される。 The homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5 or 8 is generally a region of at least 20, preferably at least 30, for example 40, 60, 80 or 100 consecutive amino acids and at least 70 %, Preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such homologues are hereinafter described as polypeptides of the invention.
さらに、配列番号２、５または８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。 Furthermore, a fragment of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5 or 8 or a homologous fragment thereof is at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids, for example 20, 25, 30, 40, 50 Or means the 60 amino acid part.
配列番号３、６または９で示される塩基配列からなるｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするｃＤＮＡとは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０、８０または１００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなｃＤＮＡは、以後本発明のｃＤＮＡとして記載される。 The cDNA that selectively hybridizes to the cDNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, 6 or 9 is generally at least 20, preferably at least 30, for example 40, 60, 80 or 100 consecutive. The nucleotide sequence region is at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such cDNA is hereinafter described as the cDNA of the present invention.
配列番号３、６または９で示される塩基配列からなるｃＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のｃＤＮＡに含まれる。 The fragment of cDNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, 6 or 9 means a portion of at least 10 bases, preferably at least 15 bases, such as 20, 25, 30 or 40 bases. Included in the cDNA of the invention.
さらに、本発明には、本発明のｃＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ｃＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビトロ（in vitro）において、例えばｃＤＮＡに対応するＲＮＡの製造、宿主細胞の形質転換に用いることができる。 Furthermore, the present invention includes a replication or expression vector comprising the cDNA of the present invention. Examples of the vector include a plasmid, virus, or phage vector comprising an ori region and, if necessary, a promoter for expression of the cDNA, a promoter control factor, and the like. The vector may contain one or more selective marker genes, such as an ampicillin resistance gene. The vector can be used in vitro, for example, for production of RNA corresponding to cDNA and transformation of host cells.
さらに、本発明には、配列番号３、６また９で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームからなるｃＤＮＡを含む本発明のｃＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。 Furthermore, the present invention includes a host cell transformed with a vector for replicating or expressing the cDNA of the present invention comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, 6 or 9 or a cDNA comprising the open reading frame thereof. Is also included. Examples of the cell include bacteria, yeast, insect cells, and mammalian cells.
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。培養は、本発明のポリペプチドが発現し、宿主細胞より製造される条件下で行なわれることが好ましい。 Furthermore, the present invention includes a method for producing the polypeptide of the present invention, which comprises culturing the host cell of the present invention under conditions for expressing the polypeptide of the present invention. Culturing is preferably performed under conditions where the polypeptide of the present invention is expressed and produced from a host cell.
本発明のｃＤＮＡは、上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入することでアンチセンスＲＮＡを製造することもできる。このようなアンチセンスＲＮＡは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御することに用いることもできる。 Antisense RNA can also be produced by inserting the cDNA of the present invention into the antisense region of the vector as described above. Such antisense RNA can also be used to control the level of a polypeptide of the invention in a cell.
本発明は、本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体も含む。さらに本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法も含む。モノクローナル抗体は、本発明のペプチドまたは、その断片を抗原として用い、通常のハイブリドーマの技術により製造することができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に本発明のポリペプチドを接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができる。 The present invention also includes monoclonal or polyclonal antibodies of the polypeptides of the present invention. Furthermore, a method for producing a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention is also included. A monoclonal antibody can be produced by a conventional hybridoma technique using the peptide of the present invention or a fragment thereof as an antigen. Polyclonal antibodies can be produced by a conventional method in which a host animal (eg, rat, rabbit, etc.) is inoculated with the polypeptide of the present invention and immune serum is collected.
本発明には、本発明のポリペプチド、その抗体と薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有する薬学的組成物も含まれる。 The present invention also includes a pharmaceutical composition containing the polypeptide of the present invention, its antibody, and a pharmaceutically acceptable excipient and / or carrier.
本発明のポリペプチドとしては、配列番号２、５または８で示されたアミノ酸配列からなるもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、配列番号２中、生物活性の発現に必須な部分だけからなる成熟ポリペプチド等）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、および上記本発明のポリペプチドに他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。 As the polypeptide of the present invention, in addition to the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, 5 or 8, a part thereof is deleted (for example, a part essential for expression of biological activity in SEQ ID NO: 2). A mature polypeptide consisting of only amino acids), a part of which is substituted with other amino acids (for example, those substituted with amino acids having similar physical properties), and other amino acids are added or inserted into the polypeptide of the present invention. Also included.
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは１種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくｃＤＮＡの塩基配列を変えることができる。 As is well known, 1 to 6 types of codons encoding one amino acid are known (for example, 1 type for Met and 6 types for Leu). Therefore, the base sequence of cDNA can be changed without changing the amino acid sequence of the polypeptide.
本発明のｃＤＮＡには、配列番号２、５または８で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。 The cDNA of the present invention includes all nucleotide sequences encoding the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2, 5, or 8. Polypeptide productivity may be improved by changing the base sequence.
配列番号３、６または９で特定されるｃＤＮＡは、配列番号２、５または８で示されるポリペプチドをコードする塩基配列群の一態様であり、天然型配列を表わす。 The cDNA specified by SEQ ID NO: 3, 6 or 9 is one embodiment of the base sequence group encoding the polypeptide shown by SEQ ID NO: 2, 5 or 8, and represents the natural type sequence.
配列番号３、６または９で示される塩基配列からなるｃＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。 Preparation of cDNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, 6 or 9 is performed according to the following method.
はじめに酵母ＳＳＴ法（米国特許No.5,536,637に記載）の概要について説明する。
サッカロマイセス・セロヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母がショ糖またはラフィノースをエネルギー源や炭素源として利用するためにはインベルターゼを培地中に分泌しなければならない（インベルターゼはラフィノースをショ糖とメリビオースに、ショ糖をフルクトースとグルコースに分解する酵素である。）。また数多くの既知の哺乳類のシグナルペプチドは酵母のインベルターゼを分泌させうることが知られている。
First, an outline of the yeast SST method (described in US Pat. No. 5,536,637) will be described.
In order for yeasts such as Saccharomyces cerevisiae to use sucrose or raffinose as an energy or carbon source, invertase must be secreted into the medium (invertase converts raffinose into sucrose and melibiose, sucrose Is an enzyme that breaks down into fructose and glucose.) It is also known that many known mammalian signal peptides can secrete yeast invertase.
これらの知見から、酵母のインベルターゼの分泌を可能にする新規のシグナルペプチドを哺乳類のｃＤＮＡライブラリーからラフィノース培地上での酵母の生育を指標にスクリーニングする方法として本方法は開発された。 Based on these findings, the present method was developed as a method for screening a novel signal peptide that enables secretion of yeast invertase from a mammalian cDNA library using the growth of yeast on raffinose medium as an indicator.
翻訳開始点ＡＴＧを削除した非分泌型のインベルターゼ遺伝子ＳＵＣ２(GENBANK accession No.V01311) を酵母の発現ベクターに組み込んで酵母ＳＳＴ用ベクターｐＳＵＣ２を作製した。発現ベクターには、ＡＡＨ５プラスミド（Gammerer, Methods in Enzymol. 101,192-201,1983）由来の発現用プロモーター（ＡＤＨプロモーター）およびターミネーター（ＡＤＨターミネーター）が組み込まれ、酵母複製起点としては２μｏｒｉ、酵母選択マーカーにはＴＲＰ１、大腸菌複製起点としてはＣｏｌＥ１ ｏｒｉ、大腸菌薬剤耐性マーカーにはアンピシリン耐性遺伝子がそれぞれ組み込まれている。そのＳＵＣ２遺伝子の上流に哺乳類のｃＤＮＡを組み込んで、酵母ＳＳＴｃＤＮＡライブラリーを調製した。このライブラリーを分泌型インベルターゼを欠損している酵母に形質転換した。 A non-secreted invertase gene SUC2 (GENBANK accession No. V01311) from which the translation start point ATG was deleted was incorporated into a yeast expression vector to prepare a yeast SST vector pSUC2. The expression vector incorporates an expression promoter (ADH promoter) and terminator (ADH terminator) derived from the AAH5 plasmid (Gammerer, Methods in Enzymol. 101, 192-201, 1983). Is TRP1, ColE1 ori as the E. coli replication origin, and ampicillin resistance gene is incorporated into the E. coli drug resistance marker. A mammalian cDNA was incorporated upstream of the SUC2 gene to prepare a yeast SST cDNA library. This library was transformed into yeast lacking secreted invertase.
組み込まれた哺乳類ｃＤＮＡがシグナルペプチドをコードしている場合、酵母で発現されたインベルターゼに対しても分泌作用を持つと考えられ、その結果ラフィノース培地上での生育が可能となる。そこで出現したコロニーから酵母を培養してプラスミドを調製し、インサートｃＤＮＡの塩基配列を決定することによって、新規シグナルペプチドの検索を迅速かつ容易にした。 When the incorporated mammalian cDNA encodes a signal peptide, it is considered to have a secretory effect on invertase expressed in yeast, and as a result, growth on a raffinose medium is possible. Thus, yeast was cultured from the colonies that emerged, plasmids were prepared, and the nucleotide sequence of the insert cDNA was determined, thereby making it possible to search for new signal peptides quickly and easily.
酵母ＳＳＴｃＤＮＡライブラリーの作製は、
（１）対象となる細胞よりｍＲＮＡを単離し、特定の制限酵素（酵素Ｉ）サイトを連結したランダムプライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、
（２）酵素Ｉとは異なる特定の制限酵素（酵素ＩＩ）サイトを含むアダプターを連結して、酵素Ｉで消化した後、適当なサイズで分画し、
（３）酵母発現ベクター内のシグナルペプチドを削除したインベルターゼ遺伝子の上流に得られたｃＤＮＡ断片を連結し、形質転換する工程よりなる。
Preparation of yeast SST cDNA library
(1) mRNA is isolated from a target cell, and a double-stranded cDNA is synthesized using a random primer linked with a specific restriction enzyme (enzyme I) site,
(2) Ligating an adapter containing a specific restriction enzyme (enzyme II) site different from enzyme I, digesting with enzyme I, fractionating at an appropriate size,
(3) A step of ligating and transforming a cDNA fragment obtained upstream of the invertase gene from which the signal peptide in the yeast expression vector has been deleted.
各工程を詳しく説明すると、工程（１）では、対象となる哺乳類の臓器や細胞株などより、必要により適当な刺激剤で刺激した後、公知の方法（以下、公知の方法は特に記載がなければMolecular Cloning（Sambrook, J., Fritsch, E. F.および Maniatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Press より1989年に発刊）またはCurrent Protocol in Molecular Biology (F.M.Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc. より発刊) に記載の方法に従って行なわれる。）に従ってｍＲＮＡの単離が行なわれる。 Each step will be described in detail. In step (1), after stimulation with an appropriate stimulant as necessary from the target mammalian organ or cell line, a known method (hereinafter, known methods are not particularly described). Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989) or Current Protocol in Molecular Biology (edited by FM Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc.) The isolation of mRNA is carried out according to the method described in the publication.
対象となる組織としては、マウス胎児心臓が挙げられる。ランダムプライマーを用いる二本鎖ｃＤＮＡの合成は公知の方法により行なわれる。 An example of a target tissue is a mouse fetal heart. Double-stranded cDNA synthesis using random primers is performed by a known method.
アダプターに連結される制限酵素（酵素Ｉ）サイトと次の工程（２）で用いられる制限酵素（酵素ＩＩ）サイトは、互いに異なるものであれば何を用いてもよい。好ましくは、酵素ＩとしてＸｈｏＩ、酵素ＩＩとしてはＥｃｏＲＩが用いられる。 The restriction enzyme (enzyme I) site connected to the adapter and the restriction enzyme (enzyme II) site used in the next step (2) may be any as long as they are different from each other. Preferably, XhoI is used as enzyme I and EcoRI is used as enzyme II.
工程（２）ではＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し、酵素ＩＩアダプターを連結した後、酵素Ｉで消化し、アガロース電気泳動（ＡＧＥ）により３００〜８００ｂｐのｃＤＮＡを分画する。酵素ＩＩは、前記したように酵素Ｉと異なるものなら何でもよい。 In step (2), the ends are blunted with T4 DNA polymerase, the enzyme II adapter is ligated, digested with enzyme I, and 300-800 bp cDNA is fractionated by agarose electrophoresis (AGE). The enzyme II may be anything as long as it is different from the enzyme I as described above.
工程（３）は、酵母発現用プラスミドベクターに連結されたシグナルペプチドを削除したインベルターゼの遺伝子の上流に（２）で得られたｃＤＮＡ断片を組み込んで大腸菌に形質転換する工程である。ここで酵母発現用プラスミドベクターとしては、種々のものが知られているが、例えば、大腸菌内でも機能するＹＥｐ２４などが用いられるが、好適には前述したプラスミドｐＳＵＣ２が用いられる。 Step (3) is a step of transforming E. coli by incorporating the cDNA fragment obtained in (2) upstream of the invertase gene from which the signal peptide linked to the yeast expression plasmid vector has been deleted. Here, various plasmid vectors for yeast expression are known. For example, YEp24 that functions also in E. coli is used, and the above-described plasmid pSUC2 is preferably used.
形質転換のための宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られており、好ましくはＤＨ１０Ｂのコンピテントセルである。また形質転換方法は公知の方法のいずれを用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法により行なわれる。形質転換体は公知の方法により培養され、酵母ＳＳＴ用のｃＤＮＡライブラリーが得られる。 Many host E. coli strains for transformation are already known, and are preferably DH10B competent cells. The transformation method may be any known method, but is preferably performed by electroporation. The transformant is cultured by a known method to obtain a cDNA library for yeast SST.
このｃＤＮＡライブラリーでは、すべてのクローンｃＤＮＡ断片が導入されているわけではないし、またすべてが未知の（新規の）シグナルペプチドをコードする遺伝子断片とは限らない。そこで、次に該ライブラリーから未知のシグナルペプチドをコードする遺伝子断片をスクリーニングする必要がある。 In this cDNA library, not all cloned cDNA fragments have been introduced, and not all gene fragments encoding unknown (new) signal peptides. Therefore, it is necessary to screen a gene fragment encoding an unknown signal peptide from the library.
遺伝子をもたない酵母、サッカロマイセス・セロヴィシエ（Saccharomycs cerevisiae）（例えば、ＹＴ４５５株など）またはインベルターゼ遺伝子を人為的に欠損させた株（公知の方法に従い作製可能）に、該ｃＤＮＡライブラリーを導入し、シグナルペプチドをコードする配列を有する断片のスクリーニングを行なう。酵母の形質転換は公知の方法、例えば酢酸リチウム法によって行なわれる。形質転換体を選択培地で生育後、ラフィノースを炭素源とする培地に移し、生育可能なコロニーを選択し、プラスミドを回収する。ラフィノースを炭素源として酵母が生育したということは、ライブラリー中に何らかの分泌蛋白質のシグナルペプチドが組み込まれていたことを示している。 Introducing the cDNA library into a yeast without a gene, Saccharomycs cerevisiae (for example, YT455 strain) or a strain in which the invertase gene is artificially deleted (can be prepared according to a known method), A fragment having a sequence encoding a signal peptide is screened. Transformation of yeast is performed by a known method such as the lithium acetate method. After growing the transformant in a selective medium, the transformant is transferred to a medium containing raffinose as a carbon source, viable colonies are selected, and the plasmid is recovered. The fact that yeast grew using raffinose as a carbon source indicates that a signal peptide of some secreted protein was incorporated into the library.
次に、単離した陽性クローンについて、塩基配列を決定し、未知の蛋白質をコードすることが明らかになったｃＤＮＡについては、それをプローブとして全長クローンを単離し、全長の塩基配列を決定することができる。これらの操作は、当業者にとってすべて公知の方法で行なわれる。 Next, the nucleotide sequence of the isolated positive clone is determined, and for cDNA that has been revealed to encode an unknown protein, a full-length clone is isolated using it as a probe, and the full-length nucleotide sequence is determined. Can do. These operations are all performed by methods known to those skilled in the art.
配列番号３、６または９で示される塩基配列が、一部、好ましくは全てが確定されると哺乳類に存在する本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡもしくは本発明蛋白質のホモローグおよびサブセットをコードするｃＤＮＡを得ることができる。適当な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それを用いて哺乳類由来のｃＤＮＡライブラリーあるいはｍＲＮＡからＰＣＲ法により、あるいは適当な塩基配列の断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、他の哺乳類ｃＤＮＡライブラリーあるいは該ゲノムライブラリーから、他の哺乳類型の当該蛋白質をコードするｃＤＮＡを得ることができる。 A cDNA encoding the protein of the present invention present in a mammal or a cDNA encoding a homologue and a subset of the protein of the present invention when part, preferably all, of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, 6 or 9 is determined Obtainable. By synthesizing an oligonucleotide having an appropriate base sequence and using it to PCR from a cDNA library or mRNA derived from a mammal, or by hybridizing with a fragment of an appropriate base sequence as a probe, other mammalian cDNA live From the library or the genomic library, cDNAs encoding the other mammalian proteins can be obtained.
このようにして得られたｃＤＮＡが、ＳＳＴで得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列（またはその相同配列）を含んでいるならばシグナルペプチドをコードしていることになるので、該ｃＤＮＡが全長、またはほぼ全長であることは明らかである（シグナルペプチドは例外なく蛋白質のＮ末端に存在することから、ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの5'末端にコードされている。）。
さらに公知の方法に従い、該ｃＤＮＡをプローブとしてノザン(Northern)解析によって全長の確認をしてもよい。ハイブリダイズしたバンドから得られるｍＲＮＡのサイズと該ｃＤＮＡのサイズを比較し、ほぼ同じであれば該ｃＤＮＡはほぼ全長であると考えられる。
If the cDNA thus obtained contains the nucleotide sequence of the cDNA fragment obtained by SST (or a homologous sequence thereof), it means that the signal peptide is encoded. It is clear that it is almost full length (the signal peptide is encoded at the 5 ′ end of the open reading frame of the cDNA because it exists at the N-terminus of the protein without exception).
Furthermore, according to a known method, the full length may be confirmed by Northern analysis using the cDNA as a probe. The size of the mRNA obtained from the hybridized band is compared with the size of the cDNA. If the size is almost the same, the cDNA is considered to be almost full length.
本発明は、開示されたタンパクの全長型並びに成熟型の両方を提供する。それらのタンパクの全長型は、配列番号２、５または８で示される塩基配列の翻訳されるアミノ酸配列で同定される。それらの成熟タンパクは、適当な哺乳類の細胞あるいはその他の宿主細胞で開示された配列番号３、６または９で示される全長ＤＮＡを適当な哺乳類の細胞あるいはその他の宿主細胞で発現させることによって得られる。成熟型のタンパクの配列は、全長型のアミノ酸配列より予測可能である（図１参照）。 The present invention provides both full-length as well as mature forms of the disclosed proteins. The full-length forms of these proteins are identified by the translated amino acid sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5 or 8. These mature proteins can be obtained by expressing the full-length DNA represented by SEQ ID NO: 3, 6 or 9 disclosed in an appropriate mammalian cell or other host cell in an appropriate mammalian cell or other host cell. . The sequence of the mature protein can be predicted from the full-length amino acid sequence (see FIG. 1).
配列番号３、６または９で示される塩基配列が一旦確定されると、その後は、化学合成によって、あるいは該塩基配列の断片を化学合成し、これをプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のｃＤＮＡを得ることができる。さらに、本ｃＤＮＡを含有するベクターｃＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とするｃＤＮＡを必要量得ることができる。 Once the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, 6 or 9 is determined, thereafter, by chemical synthesis, or by chemically synthesizing a fragment of the base sequence and hybridizing it with a probe, cDNA can be obtained. Furthermore, a necessary amount of the target cDNA can be obtained by introducing a vector cDNA containing this cDNA into an appropriate host and propagating it.
本発明のポリペプチドを取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
As a method for obtaining the polypeptide of the present invention,
(1) A method for purification and isolation from living organisms or cultured cells,
(2) a method of peptide synthesis, or (3) a method of production using genetic recombination technology,
Industrially, the method described in (3) is preferable.
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。 Examples of the expression system (host-vector system) for producing a polypeptide using a gene recombination technique include bacterial, yeast, insect cell and mammalian cell expression systems.
例えば、大腸菌で発現させる場合には、成熟蛋白部分をコードするｃＤＮＡの５´末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたｃＤＮＡを、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。 For example, when expressed in E. coli, an initiation codon (ATG) is added to the 5 ′ end of the cDNA encoding the mature protein portion, and the resulting cDNA is converted into an appropriate promoter (eg, trp promoter, lac promoter, λPL An expression vector is prepared by connecting downstream of a promoter, T7 promoter, etc.) and inserting into a vector that functions in E. coli (eg, pBR322, pUC18, pUC19, etc.).
次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E. Coli ＤＨ１、E. Coli ＪＭ１０９、E. Coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・プロテイン（fusion protein）を生産することもできる。 Next, E. coli transformed with this expression vector (for example, E. Coli DH1, E. Coli JM109, E. Coli HB101 strain, etc.) is cultured in an appropriate medium, and the desired polypeptide is obtained from the cells. Obtainable. In addition, if a bacterial signal peptide (for example, a pelB signal peptide) is used, the target polypeptide can be secreted into the periplasm. In addition, fusion proteins with other polypeptides can be produced.
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号３、６または９で示される塩基配列を適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば，サルＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、分泌蛋白である本発明の蛋白は、その細胞上清中に目的とするポリペプチドとして発現される。さらに、その他のポリペプチド、例えば抗体の定常領域(Fc portion）をコードするｃＤＮＡ断片と連結することによって、フュージョン・プロテイン（fusion protein）を生産することもできる。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。 In addition, when expressed in mammalian cells, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, 6 or 9 is used as an appropriate vector (for example, retrovirus vector, papilloma virus vector, vaccinia virus vector, SV40 vector, etc.) An expression vector is prepared by inserting it downstream of an appropriate promoter (for example, SV40 promoter, LTR promoter, metallothionein promoter, etc.). Next, an appropriate mammalian cell (for example, monkey COS-1 cell, COS-7 cell, Chinese hamster CHO cell, mouse L cell, etc.) is transformed with the obtained expression vector, and the transformant is transformed into an appropriate medium. The protein of the present invention, which is a secreted protein, is expressed as a desired polypeptide in the cell supernatant. Furthermore, a fusion protein can also be produced by ligation with a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of another polypeptide, such as an antibody. The polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method.
本発明の蛋白に関して記述される効果あるいは生物活性は、その蛋白の投与あるいは使用により、あるいは、その蛋白をコードするｃＤＮＡの投与あるいは使用（例えば、遺伝子療法（再生医療を含む。）やｃＤＮＡ導入に適したベクター）により、提供される。 The effects or biological activities described for the protein of the present invention can be attributed to administration or use of the protein, or administration or use of cDNA encoding the protein (eg, gene therapy (including regenerative medicine) and cDNA introduction). A suitable vector).
また、該ポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて公知の方法により作製することができる。 In addition, the polypeptide can be quantified in a living body using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody of the polypeptide, and can be used for studying the relationship between the polypeptide and a disease or for diagnosing a disease. Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies can be prepared by known methods using the polypeptide or a fragment thereof as an antigen.
また該ポリペプチドを用いることにより、例えばアフィニティーカラムを作製して、本ポリペプチドと結合する既知または未知の蛋白（リガンド）の同定、精製あるいはその遺伝子クローニングを行なうことができる。 Further, by using the polypeptide, for example, an affinity column can be prepared, and a known or unknown protein (ligand) that binds to the polypeptide can be identified and purified, or gene cloning thereof can be performed.
また該ポリペプチドを用いて、例えばウエスト−ウエスタン法により、または該ｃＤＮＡ（好ましくは該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ）を用いて、例えば酵母２−ハイブリッド法により該ポリペプチドと相互作用する分子の同定、遺伝子クローニングを行なうこともできる。 Identification of a molecule that interacts with the polypeptide using the polypeptide, for example, by the West-Western method, or using the cDNA (preferably cDNA encoding the polypeptide), for example, by the yeast two-hybrid method. Gene cloning can also be performed.
さらに本ポリペプチドを用いることによって、本ポリペプチドレセプターアゴニスト、アンタゴニストおよび受容体−シグナル伝達分子間の阻害剤等のスクリーニングを行なうこともできる。 Furthermore, by using the present polypeptide, it is possible to screen for the present polypeptide receptor agonists, antagonists, inhibitors between receptor and signaling molecules, and the like.
スクリーニングは、例えば、以下の方法により行なうことが出来る。すなわち、ａ）本発明のポリペプチド、スクリーニングすべき化合物、及び細胞を含む反応混合物を、細胞が該ペプチドにより正常に刺激される条件下に一緒にし（該反応混合物は細胞が増殖するに従い細胞中に導入される標識および該ペプチドの機能を効果的に観察させるための該ペプチド以外のペプチドを含む）；ついで
ｂ）細胞の増殖の程度を測定して、該化合物が有効なアンタゴニストまたはアゴニストであるかどうかを決定する。
Screening can be performed, for example, by the following method. That is, a) a reaction mixture comprising a polypeptide of the present invention, a compound to be screened, and cells under conditions in which the cells are normally stimulated by the peptide (the reaction mixture in the cells as the cells proliferate) And a peptide other than the peptide for effectively observing the function of the peptide); then b) measuring the degree of cell proliferation and the compound is an effective antagonist or agonist Decide whether or not.
本発明のｃＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺伝子欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮＡ）によって、ポリペプチドの発現を停止させることによる治療等）に利用できる。
また、本発明のｃＤＮＡをプローブとしてゲノミック（genomic）ＤＮＡを分離できる。
The cDNA of the present invention is not only an important and indispensable template for producing the polypeptide of the present invention, which is expected to be very useful, but also diagnosis and treatment of genetic diseases (treatment of gene deficiency or antisense). DNA (RNA) can be used for treatment by stopping the expression of a polypeptide.
Further, genomic DNA can be separated using the cDNA of the present invention as a probe.
［医薬品への適用］
前記の疾患に適応するために、本発明のポリペプチド、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体は通常、全身的又は局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与される。好ましくは、経口投与、静脈内投与および脳室内投与である。
[Application to pharmaceutical products]
In order to adapt to the above-mentioned diseases, the polypeptide of the present invention or the antibody against the polypeptide of the present invention is usually administered systemically or locally, generally in an oral or parenteral form. Oral administration, intravenous administration, and intracerebroventricular administration are preferable.
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一人あたり、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与される。 The dose varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but it is usually administered orally once to several times a day in the range of 100 μg to 100 mg per adult. Alternatively, it is administered parenterally once or several times a day in the range of 10 μg to 100 mg per adult per person.
もちろん前記したように、投与量は、種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。 Of course, as described above, the dose varies depending on various conditions, so that a dose smaller than the above dose may be sufficient or may be necessary beyond the range.
本発明化合物を投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。 When the compound of the present invention is administered, it is used as a solid composition, liquid composition and other compositions for oral administration, injections for parenteral administration, external preparations, suppositories and the like.
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれる。 Solid compositions for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like. Capsules include soft capsules and hard capsules.
このような固体組成物においては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、安定化剤（ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（アルギニン、アスパラギン酸等）を含有していてもよい。 In such solid compositions, one or more active substances are present in at least one inert diluent (eg lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone, Acid magnesium aluminate etc.). The composition is prepared in accordance with conventional methods, and additives other than inert diluents, such as lubricants (magnesium stearate, etc.), disintegrants (calcium fibrin glycolate, etc.), stabilizers (human serum albumin, lactose, etc.) ), A solubilizing agent (arginine, aspartic acid, etc.) may be contained.
錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、また２以上の層で被膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。 Tablets or pills may be coated with a gastric or enteric film such as sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc., if necessary, or may be coated with two or more layers. Also included are capsules of absorbable substances such as gelatin.
経口投与のための液体組成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤（例えば、精製水、エタノール等）を含んでいてもよい。この様な組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。 Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs, etc., and commonly used inert diluents (eg, purified water, Ethanol etc.) may be included. Such a composition may contain an auxiliary agent such as a wetting agent and a suspending agent, a sweetening agent, a flavoring agent, a fragrance and a preservative in addition to the inert diluent.
経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第2,868,691号および同第3,095,355号明細書に詳しく記載されている。 Other compositions for oral administration include sprays containing one or more active substances and formulated by methods known per se. In addition to the inert diluent, this composition contains a stabilizer that provides isotonicity with a stabilizer such as sodium bisulfite, and an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citric acid. May be. The production method of the spray is described in detail in, for example, US Pat. Nos. 2,868,691 and 3,095,355.
本発明による非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等が挙げられる。 The injection for parenteral administration according to the present invention includes sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. As an aqueous or non-aqueous solution or suspension, one or more active substances are mixed with at least one inert diluent. Examples of the aqueous diluent include distilled water for injection and physiological saline. Examples of the non-aqueous diluent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80 (registered trademark), and the like.
このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギニン、アスパラギン酸等）のような補助剤を含んでいてもよい。 Such a composition further includes adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers (eg, human serum albumin, lactose, etc.), and solubilizing agents (eg, arginine, aspartic acid, etc.). May be included.
以下に本発明のクローンＥＳＤＮに関する実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to examples of the clone ESDN of the present invention, but these do not limit the scope of the present invention.
実施例１：ＳＳＴによるスクリーニング
ヒト冠動脈初代培養内皮細胞（ｈＣＡＥＣ）および平滑筋細胞（ｈＣＡＳＭＣ）(Clontech)、そしてそれらの共培養（同じ細胞数のｈＣＡＥＣとｈＣＡＳＭＣを混ぜ、ＥＧＭ−２−ＭＶ（商品名、BioWhittakerより購入）を用いて２日間培養）をソースとしてｃＤＮＡライブラリーを構築した（特願平10-119731号参照）。次に酵母ＳＳＴ法（米国特許No.5,536,637を参照）によりスクリーニングを行なった結果、共培養をソースとしたｃＤＮＡライブラリーからＣＵＢドメインを有するＥＳＤＮを得た。
Example 1: Screening by SST Human coronary artery primary cultured endothelial cells (hCAEC) and smooth muscle cells (hCASMC) (Clontech), and their co-culture (mixed hCAEC and hCASMC of the same number of cells, EGM-2-MV (commodity) Name), purchased from BioWhittaker) for 2 days) and a cDNA library was constructed (see Japanese Patent Application No. 10-119731). Next, as a result of screening by the yeast SST method (see US Pat. No. 5,536,637), an ESDN having a CUB domain was obtained from a cDNA library using co-culture as a source.
実施例２：ヒト、マウス、ラットの全長ｃＤＮＡクローニング
全長ｃＤＮＡを得るためにマラソン・ｃＤＮＡ・アンプリフィケーション・キット（Marathon cDNA amplification kit）（商品名、CLONTECH社より購入）による５’−、３’−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA End）法を用いて５’−、３’−末端ｃＤＮＡのクローニングを行なった。同時にヒトの塩基配列情報に基づきプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲによりラット、マウスのＥＳＤＮの単離も行なった。
マウスプライマー
５’−ＣＴＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１０）
５’−ＣＴＧＣＴＴＣＡＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１１）
ラットプライマー
５’−ＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＣＴＣ−３’（配列番号１２）
５’−ＴＧＴＧＣＴＴＴＡＡＡＡＣＧＡＴＧＣＴＴＴＧ−３’（配列番号１３）
その結果、ＥＳＤＮは、ヒト、マウス、ラット間において高い相同性を有していることが明らかとなったが、何れの種においても翻訳開始点ＡＴＧを含む５’末端配列を見出すことができなかった。この原因としてＥＳＤＮの５’末端領域の高いＧＣ含量が考えられる。そこでマウスphage genomic ライブラリー（Lambda FIXII library( 商品名、Strategene社より購入) ）を用いたスクリーニングを行なった。その結果、翻訳開始点（Ｍｅｔ）を含む２個の陽性クローンを得た。そこでこのＭｅｔを含む５’−側のプライマーを作成し、下流のエクソンを含む(genomic cloneには含まれていない）アンチセンスプライマー
Sense primer :５’−ＧＣＡＣＴＡＴＧＣＧＧＧＣＧＧＡＴＴＧＣ−３’（配列番号１４）
antisense primer :５’−ＧＧＡＴＧＴＡＡＧＧＧＴＴＣＣＡＣＴＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１５）
と共にＲＴ−ＰＣＲを行なったところ、ヒト、ラットのカウンターパートを得た。得られたアミノ酸シークエンスよりヒトとげっ歯類は８４〜５％の相同性、マウスとラットでは９２％の相同性を表した。ヒト、ラットおよびマウスのＥＳＤＮのアライメントを図１に示す。
モチーフ検索の結果から、ＥＳＤＮは、細胞外に１個のＣＵＢドメインと１個のファクター（factor）V/VIII相同ドメインを有するタイプ（type）Ｉ膜貫通型タンパク質であることが判明した。また、この構造上の特徴からneuropilin（２個のＣＵＢ、２個のFV/VIIIドメイン、１個のＭＡＭドメインを有する）との構造の類似性を指摘することができる。またその他の領域では、カブトガニのファクター（Factor）Ｃ、及びヒトにおける難聴の原因遺伝子の一つであるＣｏｃｈと４個のシステインが保存された相同性の高い領域がある。この領域はＣｏｃｈにおいては、ＤＦＮＡ９という遺伝性難聴においてこれまで発見されている４つの変異全てが局在している部分で、カブトガニのような進化系統樹で離れた生物にも見出されることから新しいドメイン構造と考えられる。図２および図３に示す。
Example 2: Full-length cDNA cloning of human, mouse and rat 5'-3 'using a Marathon cDNA amplification kit (trade name, purchased from CLONTECH) to obtain full-length cDNA -5'-, 3'-terminal cDNA was cloned using RACE (Rapid Amplification of cDNA End) method. At the same time, primers were designed based on human base sequence information, and rat and mouse ESDNs were also isolated by RT-PCR.
Mouse primer 5'-CTGCCTCACTACTCTCCTCTCTC-3 '(SEQ ID NO: 10)
5′-CTGCTTTATTCCTTTCCACCAACCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
Rat primer 5'-TGGCTGGTCATGGTCTCACTACTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 12)
5′-TGTGCTTTAAAACGATGCTTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 13)
As a result, it was revealed that ESDN has high homology among human, mouse, and rat, but no 5 ′ terminal sequence including the translation start point ATG can be found in any species. It was. This may be due to the high GC content of the 5 ′ end region of ESDN. Therefore, screening was performed using a mouse phage genomic library (Lambda FIXII library (trade name, purchased from Strategene)). As a result, two positive clones containing the translation start point (Met) were obtained. Therefore, a 5'-side primer containing this Met was prepared, and an antisense primer containing a downstream exon (not included in the genomic clone)
Sense primer: 5′-GCACTATGCGGGCGGATTGC-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
antisense primer: 5′-GAGATGTAAGGGTTCCACTCTCAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
As a result of RT-PCR, human and rat counterparts were obtained. From the obtained amino acid sequence, human and rodent showed 84 to 5% homology, and mouse and rat showed 92% homology. The alignment of human, rat and mouse ESDN is shown in FIG.
From the results of the motif search, it was found that ESDN is a type I transmembrane protein having one CUB domain and one factor V / VIII homology domain outside the cell. Moreover, the structural similarity with neuropilin (having two CUBs, two FV / VIII domains, and one MAM domain) can be pointed out from this structural feature. In other regions, there is a highly homologous region in which horseshoe crab Factor C, and Coch, which is one of the genes responsible for hearing loss in humans, are conserved. This region is new in Coch because it is a part where all four mutations discovered so far in DFNA9 hereditary deafness are localized, and it is also found in living organisms such as horseshoe crabs. It is considered a domain structure. It is shown in FIG. 2 and FIG.
実施例３：哺乳動物細胞を用いたヒトＥＳＤＮ蛋白の発現と抗ペプチド抗体による同定
ヒト全長ｃＤＮＡを哺乳動物細胞用発現ベクターのオリジナルＶ５エピトープをファッグ・タグ（FLAG tag）に交換し、ｐＥＦ６Ｖ５−Ｈｉｓ（商品名、Invitrogen社より購入）にサブクローニングした。これらの発現ベクターは、２９３Ｔ細胞やＣＯＳ７細胞にセルフェクト（Cellphect）（商品名、Amersham Life Science社より購入）やリポフェクトアミン（Lipofectamine）（商品名、Life Technologies、社より購入）により細胞に導入した。なお目的の発現蛋白質の確認は、細胞のライセイト（lysate）を作成した後、各種抗体によるウエスタンブロッティングにより検出した。
anti-FLAG M2 monoclonal antibody( 商品名、Sigma社より購入)
ＧｌｙＧｌｕＡｒｇＩｌｅＡｒｇＩｌｅＬｙｓＰｈｅＧｌｙＡｓｐＧｌｙＡｓｐＩｌｅＧｌｕＡｓｐＳｅｒＡｓｐ（配列番号１６）を用いて作成したウサギ抗ＣＵＢポリクローナル抗体
ＧｌｎＡｓｐＬｙｓＩｌｅＰｈｅＧｌｎＧｌｙＡｓｎＬｙｓＡｓｐＴｙｒＨｉｓＬｙｓＡｓｐＶａｌＡｒｇＡｓｎＡｓｎ（配列番号１７）を用いて作成した抗FV/VIII ポリクローナル抗体
は、それぞれＫＬＨに連結させたポリペプチドをウサギに免疫することによって得た(Sawady Technology) 。
ウエスタンブロッティングは、ＥＣＬ（商品名、Amersham Life Science社より購入）ルネッサンス（Renaissance）(NEN Life Science)のプロトコールに従った。その結果、発現ベクターのみを導入した細胞ライセイト（lysate）には認められないバンドが、１２７、１０６、９３ｋＤａ付近に検出された（図６に示す。）。
Example 3: Expression of human ESDN protein using mammalian cells and identification with anti-peptide antibody The original V5 epitope of the expression vector for mammalian cells was replaced with a FLAG tag, and pEF6V5-His was obtained. The product was subcloned into (trade name, purchased from Invitrogen). These expression vectors were introduced into cells by Cellphect (trade name, purchased from Amersham Life Science) or Lipofectamine (trade name, purchased from Life Technologies, Inc.) into 293T cells and COS7 cells. . The target expressed protein was confirmed by preparing a cell lysate and then Western blotting with various antibodies.
anti-FLAG M2 monoclonal antibody (trade name, purchased from Sigma)
GlyGluArgIleArgIleLysPheGlyAspGlyAspIleGluAspSerAsp (SEQ ID NO: 16) was used as a rabbit anti-CUB polyclonal antibody GlnAspLysIlePheGlnGlyAsnLysAspLysAgV Obtained (Sawady Technology).
Western blotting followed the protocol of ECL (trade name, purchased from Amersham Life Science) Renaissance (NEN Life Science). As a result, bands that were not observed in the cell lysate into which only the expression vector was introduced were detected at around 127, 106, and 93 kDa (shown in FIG. 6).
実施例４：シグナル配列の解析
得られたアミノ酸配列の疎水性プロット（図４に示す。）から、ＥＳＤＮのシグナル配列は、通常の配列よりも長く異型性であることが判明した。そこでヒト全長ｃＤＮＡを導入したＣＯＳ７細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固定した後、一次抗体により３０分間室温で反応させた。次に３０分間二次抗体、テキサス・レッド・アンチマウスＩｇＧ（Texas red anti-mouse IgG）（商品名、Vector Laboratories社より購入）やＦＩＴＣアンチラビットＩｇＧ（FITC-anti-rabbit IgG）（商品名、Jackson Laboratories社より購入）で反応させた後、バイオ・ラッド・コンフォーカル・レーザー・スキャニング・マイクロスコープ（Bio-Rad confocal laser scanning microscope）（商品名、model MRC-1024）により解析した。その結果、同タンパク質は、細胞表面上に発現していることが判った（図７に示す。）。
次にシグナル配列の切断部位の確認を試みた。
マウスＥＳＤＮの細胞外領域のＣ端にＨｉｓ−ｔａｇを付けたｍＥＳＤＮ−Ｅｘ（Ｅｄｎｓ）やヒトＣＤ５のシグナル配列：ＭｅｔＰｒｏＭｅｔＧｌｙＳｅｒＬｅｕＧｌｎＰｒｏＬｅｕＡｌａＴｈｒＬｅｕＴｙｒＬｅｕＬｅｕＧｌｙＭｅｔＬｅｕＶａｌＡｌａＳｅｒＶａｌＬｅｕＡｌａ（配列番号１８）に置換したｍＥＳＤＮ−Ｅｘ（ＣＤ５）をｐＣＡＧＧＳ(Ｓcience 261, 600-603 (1993)）にサブクローニングした。２９３Ｔ細胞に導入後、培養上清に分泌された目的タンパク質を「His-probe H-15 polyclonal antibody」（商品名、Santa Cruz社より購入）によるウエスタンブロッティングにより検出した。その結果、ｍＥＳＤＮ−Ｅｘ（Ｅｄｎｓ）とｍＥＳＤＮ−Ｅｘ（ＣＤ５）の両コンストラクト（図５に示す。）より同じサイズのタンパク質が確認された。ヒトＣＤ５とマウスＥＳＤＮのシグナル配列は、３９アミノ酸（約４ｋＤａ）ヒトＣＤ５の方が小さいが、得られたタンパク質のサイズが同じことから、同じ切断部位であることが予想された（図８に示す。）。
Example 4: Analysis of signal sequence From the hydrophobicity plot (shown in Fig. 4) of the obtained amino acid sequence, it was found that the signal sequence of ESDN was atypical longer than the normal sequence. Therefore, COS7 cells introduced with human full-length cDNA were fixed with 4% paraformaldehyde, and then reacted with a primary antibody for 30 minutes at room temperature. Next, the secondary antibody, Texas red anti-mouse IgG (trade name, purchased from Vector Laboratories) or FITC anti-rabbit IgG (FITC-anti-rabbit IgG) (trade name, The reaction was carried out using a Bio-Rad confocal laser scanning microscope (trade name, model MRC-1024). As a result, it was found that the protein was expressed on the cell surface (shown in FIG. 7).
Next, an attempt was made to confirm the cleavage site of the signal sequence.
MESDN-Ex (Edns) with His-tag added to the C-terminus of the extracellular region of mouse ESDN and human CD5 signal sequence: MetProMetGlySerLeuGlnProLeuThlaLeuTyrLeuLeuGlyMetLeuGalLuS 600-603 (1993)). After introduction into 293T cells, the target protein secreted into the culture supernatant was detected by Western blotting using “His-probe H-15 polyclonal antibody” (trade name, purchased from Santa Cruz). As a result, proteins of the same size were confirmed from both constructs of mESDN-Ex (Edns) and mESDN-Ex (CD5) (shown in FIG. 5). The signal sequences of human CD5 and mouse ESDN are smaller for 39 amino acids (about 4 kDa) human CD5, but the size of the obtained protein is the same, so that the same cleavage site was predicted (shown in FIG. 8). .)
実施例５：ＥＳＤＮ蛋白のサザーン・ズーブロット（southern zooblot）解析
［32Ｐ］ｄＣＴＰ−ラベルしたヒトＥＳＤＮをプローブとして、哺乳類（マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒト）、アフリカツメガエル（Xenopus）、ハエ（fly）、酵母（yeast）の種におけるサザーン・ズーブロット（southern zooblot）解析を行なった（３７℃、１×ＳＳＣにより洗浄）。その結果、哺乳類においては強いバンドが確認され、ＥＳＤＮが、哺乳類において高度に保存されていることが明らかとなった。一方、アフリカツメガエル（Xenopus）では弱いバンドが確認された。なお、ショウジョウバエ（fly）、酵母（yeast）においては、バンドは確認されなかった（図９Ａに示す。）。
Example 5: Southern zooblot analysis of ESDN protein Using [ 32 P] dCTP-labeled human ESDN as a probe, mammals (mouse, rat, rabbit, cow, human), Xenopus, fly ( Fly, Southern zooblot analysis in yeast seeds was performed (washed at 37 ° C., 1 × SSC). As a result, a strong band was confirmed in mammals, and it was revealed that ESDN was highly conserved in mammals. On the other hand, a weak band was confirmed in Xenopus. In Drosophila (fly) and yeast (yeast), no band was confirmed (shown in FIG. 9A).
実施例６：ヒトＥＳＤＮの遺伝子座
ヒトにおいては、２個(stSG29921、sts-D29024) の独立したＳＴＳ（sequence-tagged site）の情報からラジエーション・ハイブリッド・マップ（radiation hybrid map）のD3S1603-D3S1271、D3S1552-D3S1603近傍（cytogenetic mapではchromosome 3q11.2に相当すると思われる部位）に遺伝子座があることが明らかとなった。このデータベースにより得られた結果を確認するために、マウスライン（Cell line）であるＡ９（Ｎｅｏ３）、Ａ９（Ｎｅｏ１２）（JCRB Cell Bank）を用いてゲノミック・サザン（genomic southern）ハイブリダイゼーションを行なった。その結果、ヒトＥＳＤＮプローブは、マウスＥＳＤＮも認識できるためＡ９（Ｎｅｏ３）、Ａ９（Ｎｅｏ１２）の両方においてマウスＥＳＤＮが確認された。一方、ヒトＥＳＤＮは、Ａ９（Ｎｅｏ３）のみにおいて検出された。このことからヒトＥＳＤＮは、クロモソーム（chromosome）3q11.2 に相当すると思われる部位に遺伝子座があることが明らかとなった（図９Ｂに示す。）。
Example 6: Gene locus of human ESDN In humans, radiation hybrid map D3S1603-D3S1271, from information of two (stSG29921, sts-D29024) independent sequence-tagged sites (STS), It became clear that there is a locus in the vicinity of D3S1552-D3S1603 (site that seems to correspond to chromosome 3q11.2 in cytogenetic map). In order to confirm the results obtained from this database, genomic southern hybridization was performed using the mouse lines A9 (Neo3) and A9 (Neo12) (JCRB Cell Bank). . As a result, the mouse ESDN was confirmed in both A9 (Neo3) and A9 (Neo12) because the human ESDN probe can also recognize mouse ESDN. On the other hand, human ESDN was detected only in A9 (Neo3). From this, it became clear that human ESDN has a locus at a site which seems to correspond to chromosome 3q11.2 (shown in FIG. 9B).
実施例７：ＥＳＤＮ ｍＲＮＡの発現部位の解析
培養ヒト細胞のノザン（Northern）解析は、ｈＣＡＥＣ、ｈＣＡＳＭＣそしてそれらの共培養からトータル（total）ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（商品名、Life Technologies社より購入）により抽出した。ラット組織・細胞のノザン（Northern）解析は、トータル（total）ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ ＬＳ（全血に対して）、ＴＲＩｚｏｌ（その他の組織や培養細胞に対して）により抽出した。次にｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡは、「OligotexTM-dT30 Super」（商品名、Roche Molecular Biochemicals社より購入）により精製した。次に［32Ｐ］ｄＣＴＰ−ラベルしたヒト、ラットＥＳＤＮやＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡをプローブとして用い、ノザン・ブロット（Northern blot）解析（６５℃、0.2 ×ＳＳＣにより洗浄）を行なった。その結果、ｈＣＡＳＭＣ細胞において強い発現が認められた（6.4 、３ｋｂ）。一方ｈＣＡＥＣ細胞においては、ｈＣＡＳＭＣに比べて弱い発現が認められた。なお、共培養することによる、ＥＳＤＮ ｍＲＮＡの発現の変化は認められなかった（図１０Ａに示す。）。
ラット組織・細胞のノザン（Northern）解析の結果、全血細胞からＥＳＤＮ ｍＲＮＡは確認されず、肝臓においても発現がかなり低いことが判った（図１０Ｂに示す。）。
Example 7: Analysis of the expression site of ESDN mRNA Northern analysis of cultured human cells was performed by extracting total RNA from hCAEC, hCASMC and their co-cultures with TRIzol (trade name, purchased from Life Technologies). did. For Northern analysis of rat tissues / cells, total RNA was extracted with TRIzol LS (for whole blood) and TRIzol (for other tissues and cultured cells). Next, poly (A) RNA was purified by “Oligotex ™ -dT30 Super” (trade name, purchased from Roche Molecular Biochemicals). Next, [ 32 P] dCTP-labeled human, rat ESDN or GAPDH cDNA was used as a probe for Northern blot analysis (washed at 65 ° C., 0.2 × SSC). As a result, strong expression was observed in hCASMC cells (6.4, 3 kb). On the other hand, hCAEC cells showed weaker expression than hCASMC. In addition, the change of the expression of ESDN mRNA by co-culture was not recognized (shown in FIG. 10A).
As a result of Northern analysis of rat tissues / cells, it was found that ESDN mRNA was not confirmed from whole blood cells and its expression was considerably low in the liver (shown in FIG. 10B).
実施例８：ヒト冠動脈平滑筋細胞を用いたESDN蛋白の発現
ｈＣＡＳＭＣを血清（serum）飢餓の状態のＤＭＥＭ／２ｍＭグルタミン（glutamine）で４８時間培養した。次に指定濃度のＰＤＧＦ−ＢＢ、ＡＴ−ＩＩ、ＦＣＳ（商品名、Sigma 、Life Technologies社より購入）を含む培地に置換し、刺激を行なった。トータル（total）ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（商品名、Life Technologies社より購入）により調製し、ｃＤＮＡ合成はスーパースクリプト・プレアンプリケーション・システム（SuperScript Preamplification System）（商品名、First Strand cDNA Synthesis ：Life Technologies 社より購入）を用いて行なった。なおｍＲＮＡは、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（real-time quantitative RT-PCR;PE Applied Biosystems Prism Model 7700 Sequence Detection System）により測定した。フォワード（Forward）リバース（Reverse）プライマーの配列は以下の通りである。
ESDN forward: ５’−ＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧＧＡＴＧ−３’（配列番号１９）
ESDN reverse: ５’−ＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＡＧ−３’（配列番号２０）
ESDN probe: ５’−（６−ＦＡＭ）−ＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＧＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＴＣＣＡＴＡＡＡＣ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２１）
これらの配列はヒトを基準にしているが、げっ歯動物にも適応できることを確認した。
ヒトＧＡＰＤＨのシークエンスは以下の通りである。
human GAPDH forward: ５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号２２）
human GAPDH reverse: ５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号２３）
human GAPDH probe: ５’−（ＶＩＣ）−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２４）
「TaqMan Rodent GAPDH Control Reagents」(PE biosystems)をラット（rat）ＧＡＰＤＨの定量に用いた。ＥＳＤＮとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルはコピー数を意味している。そこで先方の発現レベルをＧＡＰＤＨにより標準化した。このことは、スタンダードの連続希釈から作成した標準曲線によって成し遂げられた。なおスタンダードにはＥＳＤＮあるいはＧＡＰＤＨをpBlueScript ＳＫ（−）（商品名、Stratagene社より購入）にサブクローニングした既知量のプラスミドを準備した。
結果、ＥＳＤＮはＰＤＧＦ−ＢＢ刺激において濃度依存的に発現が増加するが、ＡＴ−ＩＩ刺激においては発現の増加が認められなかった。またＦＣＳ刺激においてもＥＳＤＮの発現増加が濃度依存的に認められたが、ＰＤＧＦ−ＢＢ刺激に比べてより少ない量であった（図１１に示す。）。
Example 8: Expression of ESDN protein using human coronary artery smooth muscle cells hCASMC was cultured in serum-starved DMEM / 2mM glutamine for 48 hours. Next, the medium was replaced with a medium containing PDGF-BB, AT-II, and FCS (trade name, Sigma, purchased from Life Technologies) at designated concentrations, and stimulation was performed. Total RNA was prepared by Trizol (trade name, purchased from Life Technologies), and cDNA synthesis was performed by SuperScript Preamplification System (trade name, First Strand cDNA Synthesis: Life Technologies). Purchased). MRNA was measured by real-time quantitative RT-PCR (PE Applied Biosystems Prism Model 7700 Sequence Detection System). The sequences of the forward and reverse primers are as follows.
ESDN forward: 5′-CCCACGCAAGGTGATGGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 19)
ESDN reverse: 5′-CAAGAATCAGAATCTTCAATGTCAAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 20)
ESDN probe: 5 '-(6-FAM) -CCTGGAGATGGAACCCTTACATCCATAAAC- (TAMRA) -3' (SEQ ID NO: 21)
Although these sequences are based on humans, they were confirmed to be applicable to rodents.
The sequence of human GAPDH is as follows.
human GAPDH forward: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGATC-3 ′ (SEQ ID NO: 22)
human GAPDH reverse: 5′-GAAGATGGTGATGGGGATTC-3 ′ (SEQ ID NO: 23)
human GAPDH probe: 5 '-(VIC) -CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC- (TAMRA) -3' (SEQ ID NO: 24)
“TaqMan Rodent GAPDH Control Reagents” (PE biosystems) was used for the quantification of rat GAPDH. The mRNA levels of ESDN and GAPDH mean copy number. Therefore, the previous expression level was normalized by GAPDH. This was accomplished by a standard curve generated from serial dilutions of the standard. As a standard, a known amount of plasmid obtained by subcloning ESDN or GAPDH into pBlueScript SK (-) (trade name, purchased from Stratagene) was prepared.
As a result, the expression of ESDN increased in a concentration-dependent manner upon stimulation with PDGF-BB, but no increase in expression was observed upon stimulation with AT-II. In addition, the increase in expression of ESDN was also observed in the FCS stimulation in a concentration-dependent manner, but the amount was smaller than that in the PDGF-BB stimulation (shown in FIG. 11).
実施例９：ラットの総頸動脈におけるＥＳＤＮ蛋白の発現
バルーン障害後（ｎ＝５，day ０，５，ｎ＝４，day １４）、０、５、１４日後に頸動脈を採取した。トータル（total）ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（商品名、Life Technologies 社より購入）により調製し、ｃＤＮＡ合成は「SuperScript Preamplification System 」（商品名、First Strand cDNA Synthesis ：Life Technologies 社より購入）を用いて行なった。ラットＥＳＤＮやＧＡＰＤＨのｍＲＮＡは「real-time quantitative RT-PCR 」（PE Applied Biosystems Prism Model 7700 Sequence Detection System）により測定した。その結果、５日目にＥＳＤＮの増加の傾向が認められ、１４日目には３０％もの有意な増加が認められた。次に、このＥＳＤＮの発現を免疫組織学的に解析した（図１２に示す。）
処置あるいは未処置ラットを麻酔下にして、予め４℃に冷やした生理食塩水で組織を灌流した。そして局所灌流部分を４％パラホルムアルデヒドにより固定した。頸動脈を丁寧に採取し、ドライアイス−エタノール・バス上に置いた「Tissue-Tek O.C.T. Compound」（商品名、Sakura Finetechnical社より購入）により包埋した。組織を４μｍの厚さにスライスし、「avidin-biotin-alkaline phosphatase complex」（商品名、Vector Laboratories 社より購入) 法により免疫組織解析を行なった。アルカリンホスファターゼ（Alkaline phosphatase）は「Vector Red」（商品名、Vector Laboratories 社より購入）により発色させた。切片はメチルグリーンにより対比染色を行なった。ウサギ抗ペプチドポリクローナル抗体（一次抗体）は、５〜１０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。ネガティブコントロールには、正常ウサギＩｇＧ（ＤＡＫＯ）を同濃度で用いた。その結果、血管平滑筋の存在する大動脈や総頸動脈の中膜が染まるものの、むしろ脳・脊髄といった中枢神経系の一部（矢印）や迷走神経（アローヘッド）などの末梢神経が強く染色された（図１３に示す。）。Ａ、Ｂ、ＥおよびＦは抗ＣＵＢ抗体で染色した。Ｃ、Ｄ、ＧおよびＨは、同じ濃度のウサギの抗ＩｇＧ抗体を一次抗体として染色した（コントロール）。ＥおよびＦ中のＭおよびＮは、それぞれ血管中膜および血管内膜を示す。
Example 9: Expression of ESDN protein in rat common carotid artery The carotid artery was collected 0, 5, and 14 days after balloon injury (n = 5,
Treated or untreated rats were anesthetized and the tissues were perfused with physiological saline previously cooled to 4 ° C. And the local perfusion part was fixed with 4% paraformaldehyde. The carotid artery was carefully collected and embedded with “Tissue-Tek OCT Compound” (trade name, purchased from Sakura Finetechnical) placed on a dry ice-ethanol bath. The tissue was sliced to a thickness of 4 μm, and immunohistochemical analysis was performed by the “avidin-biotin-alkaline phosphatase complex” (trade name, purchased from Vector Laboratories) method. Alkaline phosphatase was developed with “Vector Red” (trade name, purchased from Vector Laboratories). Sections were counterstained with methyl green. Rabbit anti-peptide polyclonal antibody (primary antibody) was used at a concentration of 5 to 10 μg / ml. As a negative control, normal rabbit IgG (DAKO) was used at the same concentration. As a result, although the media of the aorta and common carotid artery where vascular smooth muscle exists are stained, the central nervous system such as the brain and spinal cord (arrows) and peripheral nerves such as the vagus nerve (arrowhead) are strongly stained (Shown in FIG. 13). A, B, E and F were stained with anti-CUB antibody. C, D, G and H were stained with the same concentration of rabbit anti-IgG antibody as the primary antibody (control). M and N in E and F indicate the vascular media and intima, respectively.
実施例１０：２９３Ｔ細胞を用いたＢｒｄＵの取りこみ測定
全長ＥＳＤＮ、およびそのディレーション・ミュータント（deletion mutants）（ｈＥＳＤＮ−ΔＥＣ、ｈＥＳＤＮ−ΔＣｙ）を発現ベクター「QIAfilter Plasmid Midi Kit」（商品名、QIAGEN社より購入）により調整した。そしてさらに精製するためフェノール（phenol）／ＣＩＡＡにより２回抽出し、ＣＩＡＡ抽出を１回行なった。セルフェクト（CellPhect）（商品名、Amersham Life Science 社より購入）を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。１２時間後、メディウムを新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに交換し、２時間インキュベーションした。次にトリプシンにより細胞を一旦回収した後、９６穴プレート２枚に播き直した。一方のプレートは、２時間のＢｒｄＵの取り込みを２４時間の培養後に行なった。ＢｒｄＵの取り込みは、「Cell Proliferation ELISA、BrdU」(colorimetric)（商品名、Roche Diagnostics社より購入）により測定した。もう一方のプレートは、播きこみ後2 時間細胞数を「Premix WST-1 assay kit」（商品名、TaKaRa Biomedicals社より購入）により測定した。その結果、全長ＥＳＤＮを発現させた細胞において、ＢｒｄＵの取りこみが有意に抑制されることが明らかとなった。一方細胞外ドメインを欠いたものでは、この効果が弱められた。また細胞内ドメインを欠いたものでは全くこの効果が無くなることが確認された（図１４に示す。）。
Example 10: Measurement of BrdU incorporation using 293T cells Full-length ESDN and its deletion mutants (hESDN-ΔEC, hESDN-ΔCy) were expressed using the expression vector “QIAfilter Plasmid Midi Kit” (trade name, QIAGEN) (Purchased more). Then, for further purification, extraction was performed twice with phenol / CIAA, and CIAA extraction was performed once. 293T cells were transfected using CellPhect (trade name, purchased from Amersham Life Science). After 12 hours, the medium was replaced with fresh DMEM / 10% FCS and incubated for 2 hours. Next, the cells were once collected with trypsin, and then replated on two 96-well plates. One plate was uptaked after 2 hours of BrdU incorporation for 24 hours. BrdU incorporation was measured by “Cell Proliferation ELISA, BrdU” (colorimetric) (trade name, purchased from Roche Diagnostics). On the other plate, the number of cells for 2 hours after seeding was measured by “Premix WST-1 assay kit” (trade name, purchased from TaKaRa Biomedicals). As a result, it was revealed that BrdU incorporation was significantly suppressed in cells in which full-length ESDN was expressed. On the other hand, those lacking the extracellular domain attenuated this effect. Moreover, it was confirmed that this effect was completely lost in the case of lacking the intracellular domain (shown in FIG. 14).
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