JP4017672B2 - ヒト・ヘモクロマトーシス遺伝子の領域における多型および新規遺伝子 - Google Patents

Description

発明の背景
遺伝性ヘモクロマトーシス（HH：血色素症）は体内に過剰な鉄が沈着する鉄代謝の遺伝性疾患である。その徴候を示す個体では、この過剰な鉄がさまざまな器官に沈着することで有害作用を及ぼして、結果的にそれらを不全に至らしめ、肝硬変、糖尿病、生殖不能、その他の重大な疾患をもたらす。この疾患で欠損している遺伝子は継続中のU.S.S.N. 08/652,265に開示されている。
HH、HFE（いくつかの刊行物ではHHまたはHFEと示される）に関与している遺伝子がマップされた領域の微細構造マッピングにより、HFE遺伝子を含む候補配列の同定が可能となり、また同時に調節・発現のための構造エレメントおよび近隣遺伝子の同定も可能となる。
微細構造マッピングには、直接ｃＤＮＡ選択、エキソン-トラッピング、およびゲノムサンプル配列決定を含めて、種々の技術が利用可能である。直接選択法（Lovettら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9628-9623（1991））はｃＤＮＡ断片のゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションを必要とする。この技術は感度が非常に高く、稀少転写産物の部分を単離することができる。エキソン-トラッピング法（Churchら，Nature Genetics 6:98-105（1994）は、in vivo発現しているゲノムＤＮＡクローンからスプライシングされたイントロンを回復させ、標的遺伝子発現のいかなる予備知識も必要とせずに候補エキソンをもたらす。また、配列データを発現配列のデータベースと比較するハイスループット・ゲノムＤＮＡ塩基配列決定法が、例えばウェルナー症候群遺伝子のポジショナルクローニング（Yuら，Science 277:258-262（1996））や第１染色体上の第二アルツハイマー病遺伝子の相同性によるクローニング（Levy-Lahadら，Science 269:973-977（1995））において使用されている。
HHは典型的には劣性形質として遺伝し、現在の知識水準からすると、当該遺伝子の２つの欠陥コピーを担持しているホモ接合体はこの疾患にかかる頻度が最も高い。さらに、HFE遺伝子のヘテロ接合体は散在性皮膚ポルフィリン症やおそらく他の疾患にも比較的かかりやすい（Robertsら，Lancet 349:321-323（1997））。白色人種の約10〜15%はHFE遺伝子の突然変異を１コピー担持しており、米国には約100万のホモ接合体が存在すると推定される。したがって、HHは白色人種において最も普通に見られる遺伝病のひとつである。最終的にHHは衰弱症状を呈するが、ホモ接合体およびヘテロ接合体の大多数は診断を下されていない。
こうした診断の必要性は、例えば、Barton, J.C.ら，Nature Medicine 2:394-395（1996）; Finch, C.A. West J Med 153:323-326（1990）; McCusick, V.Mendelian Inheritance in Man pp.1882-1887, 11th ed.,（Johns Hopkins University Press, Baltimore（1994））; Report of a Joint World Health Organization/Hemochromatosis Foundation/French Hemochromatosis Association Meeting on the Prevention and Control of Hemochromatosis（1993）; Edwards, C.Qら，New Engl J Med 328:1616-1620（1993）; Bacon, B.R.New Engl J Med 326:126-127（1992）; Balan, V.ら，Gastroenterology 107:453-459（1994）; Phatak, P.D.ら，Arch Int Med 154:769-776（1994）に述べられている。
継続中のU.S.S.N. 08/630,912において24d1と呼ばれているHFE遺伝子の単一突然変異は、当該集団中に存在する大多数の病因染色体を生じさせる。本明細書中ではこれを「共通」または「祖先」または「共通祖先」型の突然変異という。これらの用語は相互に交換して使用できる。全HH患者の約80〜90%は共通祖先型突然変異を少なくとも１コピーもっているようであり、この突然変異は祖先型HFE遺伝子欠損に近接したいくつかの遺伝的マーカーの特定の対立遺伝子と密接にリンクしている。これらのマーカーは、第一の推定として、対立遺伝子形態をしており、祖先型HFE突然変異が起こった時期にそれらはこの形態で存在していた。例えば、Simon, M.ら，Am J Hum Genet 41:89-105（1987）; Jazwinska, E.C.ら，Am J Hum Genet 53:242-257（1993）; Jazwinska, E.C.ら，Am J Hum Genet 56:428-433（1995）; Worwood, M.ら，Brit J Hematol 86:863-866（1994）; Summers, K.M.ら，Am J Hmm Genet 45:41-48（1989）を参照のこと。
HFE領域のいくつかの多型マーカーが記載されており、これらはHH疾患と関連している対立遺伝子をもつことが示された。こうしたマーカーとして、発表されたマイクロサテライトマーカーD6S258、D6S306（Gyapay, G.らNature Genetics 7:246-339（1994））、D6S265（Worwood, M.ら Brit J Hematol 86:833-846（1994））、D6S105（Jazwinska, E.C.らAm J Hum Genet 53:242-257（1993）; Jazwinska, E.C.らAm J Hum Genet 56:428-433（1995））、D6S1001（Stone, C.らHum Molec Genet 3:2043-2046（1994））、D6S1260（Raha-Chowdhuryら Hum Molec Genet 4:1869-1874（1995））、ならびに同時継続中のPCT出願WO 96/05583（その開示内容をそのまま参考としてここに組み入れる）に開示される追加のマイクロサテライトおよび単一ヌクレオチド多型マーカーが含まれる。さらに、同時継続中のU.S.S.N. 08/630,912には、追加のマーカーとして24d2および24d7が開示されている。
HHの徴候は他の症状の徴候と類似していることが多く、しかもこの疾患の重大な影響はすぐには現れない。したがって、鉄の過剰沈着と関連した過度の組織損傷の防止に間に合うように介入させるために、病気になる運命にあるヒトを確認する方法を提供することが望ましいだろう。早期診断が存在しないことの一つの理由は、どの個体が危険な状態にあるかを、特にかかる個体が徴候を示す前に、確認するための現在利用可能な診断方法が不十分であることである。
血中鉄のパラメーターはスクリーニングツールとして使用できるが、確認診断にはしばしば肝臓生検が用いられ、これは侵入的で、費用がかかり、死の危険を伴うので望ましくない。かくして、徴候を示す個体の診断を容易にし、徴候前検出を提供して器官損傷を防止するための介入を与え、さらにヘテロ接合性キャリアを同定するために、ホモ接合体およびヘテロ接合体を検出するための安価で非侵入的な診断試験を開発するという明白な必要性が存在する。
さらに、HH遺伝子座がマップされる染色体の領域の微細構造マッピング法と微細構造マップの両方の必要性が存在する。かかる必要性およびその他の必要性は本発明により解決される。
発明の概要
本発明の一態様は、図９の配列からの８以上で約100までの連続塩基を含むオリゴヌクレオチド、または前記配列の相補体であり、前記８〜約100連続塩基が表１の多型部位を少なくとも１つ含むものである。
本発明の別の態様は、表１の多型部位を増幅するための図９の配列またはその相補体から選択されるオリゴヌクレオチド対である。
本発明の別の態様は、図９の配列と実質的に同一の約100連続塩基から約235kbを含む単離された核酸分子であり、前記ＤＮＡ分子が表１の多型部位を少なくとも１つ含むものである。
本発明の別の態様は、個体における遺伝性ヘモクロマトーシス（HFE）の共通型遺伝子突然変異の有無を判定する方法であり、前記方法は、
個体からＤＮＡまたはＲＮＡを調製し、そして
前記ＤＮＡまたはＲＮＡを表１のハプロタイプの有無について評価する、ことを含んでなり、
結果的に、表１のハプロタイプの非存在はその個体のゲノムにHFE遺伝子突然変異が存在しない可能性を示し、前記ハプロタイプの存在はその個体のゲノムにHFE遺伝子突然変異が存在する可能性を示すものである。
本発明の別の態様は、個体における遺伝性ヘモクロマトーシス（HFE）の共通型遺伝子突然変異の有無を判定する方法であり、前記方法は、
個体からＤＮＡまたはＲＮＡを調製し、そして
前記ＤＮＡまたはＲＮＡを表１の多型対立遺伝子により規定される遺伝子型の有無について評価する、
ことを含んでなり、
結果的に、表１の多型対立遺伝子により規定される遺伝子型の非存在はその個体のゲノムにHFE遺伝子突然変異が存在しない可能性を示し、前記遺伝子型の存在はその個体のゲノムにHFE遺伝子突然変異が存在する可能性を示すものである。
本発明の別の態様は、ATCC CRL-12371の受託番号を有するリンパ芽球細胞の培養物である。
本発明の一態様は、BTF1と実質的に同一の核酸配列を含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、BTF2と実質的に同一の核酸配列を含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、BTF3と実質的に同一の核酸配列を含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、BTF4と実質的に同一の核酸配列を含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、BTF5と実質的に同一の核酸配列を含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、NPT3と実質的に同一の核酸配列を含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、NPT4と実質的に同一の核酸配列を含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、RoRetと実質的に同一の核酸配列を含む単離された核酸配列である。
本発明の追加の態様は、ｃＤＮＡである核酸配列、本発明の核酸によりコードされるポリペプチド、このポリペプチドに特異的に免疫反応する抗体、本発明の核酸配列を含有するベクター、および本発明の核酸により安定にトランスフェクトされた宿主細胞を包含する。
本発明の更なる態様は、BTF1の少なくとも18連続ヌクレオチドと実質的に同一の少なくとも18連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、BTF2の少なくとも18連続ヌクレオチドと実質的に同一の少なくとも18連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、BTF3の少なくとも18連続ヌクレオチドと実質的に同一の少なくとも18連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、BTF4の少なくとも18連続ヌクレオチドと実質的に同一の少なくとも18連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、BTF5の少なくとも18連続ヌクレオチドと実質的に同一の少なくとも18連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、NPT3の少なくとも18連続ヌクレオチドと実質的に同一の少なくとも18連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、NPT4の少なくとも18連続ヌクレオチドと実質的に同一の少なくとも18連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。
本発明の更なる態様は、RoRetの少なくとも18連続ヌクレオチドと実質的に同一の少なくとも18連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。
【図面の簡単な説明】
図１は、HFE遺伝子領域の遺伝子、物理、転写の組み合わせ地図を表す。第一ラインは、HFE領域を画定する選択された遺伝子マーカーの相対位置を表す。その下の太い線は、直接選択実験で使用したYACクローンを表す。エキソントラッピングおよびサンプルの配列決定で使用したバクテリアクローンの順番および位置をYACの下に示す。バクテリアクローンの下の細い線は、コンティグにマップした発現配列断片のサブセットのおよその位置を表す。太い方の線は、クローン化されたcDNAの位置を表す。２つの領域、即ち遺伝子のブチロフィリンファミリー（BTF）および完全なゲノム配列決定が行われた領域の各々を１まとめにした。
図２は、HFE遺伝子を含む250kbのゲノム配列の概略図である。全cDNA（トップ）の構造およびコーディング領域（ボトム）に対応する構造の両方、ならびに転写の方向が表されている。ヒストン遺伝子、亜鉛α-2糖タンパク質偽遺伝子およびESTの位置も表されている。
図３は、BTFタンパク質の予想アミノ酸配列の整列を表す。CLUSTAL Wを用いて対になるように配列を整列させ（Thompsonら、Nucl. Acids Res. 22:4673-4680）、最も簡単な配置推定を行った。アラインメントの下の「^*」マークは、６つのタンパク質全てに保存されたアミノ酸を表す。「.」マークは保存されたアミノ酸置換を表す。ボックスは、３つの保存モチーフ１）B-G領域、２）膜貫通領域（TM）および３）B30-2エキソン領域に対応するタンパク質内領域である。
図４のパネル（A）は、２つのBTFタンパク質（BTF1およびBTF5）のグループの代表メンバーのノーザンブロット分析を表す。BTF1はブロット上の全ての組織に、2.9kbの多量の転写産物および5.0kbの少量の転写産物としてハイブリダイズした。BTF5は、4.0から3.1kbの間の幾つかの転写産物にハイブリダイズし、その発現プロファイルはBTF1に似ていた。オートラジオグラフィーを24時間行った。β-アクチンのハイブリダイゼーションは、レーン間でポリ（A）+RNAにばらつきを示した。オートラジオグラフィーを１時間行った。パネル（B）において、RT-PCR分析は、両方の遺伝子の発現が広範囲にわたっていたことを示した。（+）レーンには、cDNA21および44が陽性コントロールとして含まれ、（-）レーンは、DNAを含まないコントロールを示す。RFP遺伝子（Isomuraら、Nucleic Acid Res. 20:5305-5310（1992））用のプライマーを用いた増幅は、cDNAの完全性（integrity）について制御した。逆転写酵素を排除して同じ実験を行うことにより、全ての第一鎖cDNAについてゲノムDNA増幅のコンタミを調べた。全てのケースにおいて、増幅は得られなかった（データは示されていない）。
図５（A）は、52kD Ro/SSA自己抗原タンパク質に対するRoRet遺伝子の予想アミノ酸配列のアラインメントを示す。アラインメントの下の「^*」マークは保存アミノ酸を表し、「.」は保存されたアミノ酸置換を表す。想定されるDNA結合システインリッチ領域およびB30-2エキソン領域をボックスで囲んである。図５（B）は、NPT1の予想アミノ酸配列に対する２つの新規な想定されるリン酸ナトリウム輸送タンパク質の予想アミノ酸配列のアラインメントを表す。
図６のパネル（A）は、RoRet遺伝子のノーザンブロット分析を表す。RoRetのcDNAは４つの異なる転写体（7.1kb〜2.2kb）にハイブリダイズした。４日間オートラジオグラフィーを行った。β-アクチンプローブを用いたブロットの再ハイブリダイゼーションは、レーン間のポリ（A）+RNAにおける変化を示した。オートラジオグラフィーを１時間行った。パネル（B）は、RoRet遺伝子のRT-PCR分析を表す。（+）レーンにはcDNA27陽性コントロールが含まれた。小腸、腎臓および肝臓において、正しいサイズの弱い増幅が観察された。他の組織は、DNAを含まないコントロールレーン（-）であったので陰性であった。RFPプライマーは、cDNAの完全性を立証した。パネル（C）は、NPT3およびNPT4のノーザンブロット分析を示す。NPT3は、心臓および筋肉において単一の7.2kb転写体として多量に発現された。他の組織ではこれより少ない量が見られた。NPT4の発現パターンはさらに制限されており、2.6〜1.7kbの転写体のしみ（smear）として肝臓および腎臓でのみ見られた。パネル（D）は、NPT3およびNPT4遺伝子のRT-PCR分析を表す。（+）レーンには、それぞれcDNA22Eおよび22B陽性コントロールが含まれた。NPT3遺伝子は、腎臓、肝臓、脾臓および精巣において適正なサイズのPCR断片として発現された。これより小さいサイズの断片が、肝臓以外の全ての細胞で検出された。DNAを含まないコントロールレーン（-）は陰性であった。NPT4は、小腸、腎臓、肝臓および精巣の中に適正なサイズの断片として発現された。脳を除く他の全ての組織において、これより大きいサイズおよび小さいサイズの断片が見られた。両方の遺伝子で、これらの異なるサイズの断片は、選択的スプライス事象の可能性を示している。DNAを含まないコントロールレーン（-）は陰性であった。RFPプライマーは、cDNAの完全性を立証した。
図７は、cDNA21（BTF1）、cDNA29（BTF3）、cDNA23（BTF4）、cDNA44（BTF5）、cDNA32（BTF2）、cDNA27（RoRet）、cDNA22B（NPT3）、cDNA22E（NPT4）の配列を示す。
図８は、罹患していない個体由来のHFEサブ領域における約235kbのヌクレオチド配列を示す。
図９は、HHにかかった個体のHFEサブ領域における約235kbのヌクレオチド配列を示す。HHにかかった個体の多型性部位を、HHにかかっていない個体由来の対応領域の配列と比較することにより決定し、表１に列挙し記載する。
発明の詳細な説明
Ａ．定義
天然に存在する20種類のアミノ酸の略号は従来の使用法にしたがう。本明細書に用いるポリペプチドの表示においては、標準的使用法および慣習にしたがって左手方向がアミノ末端方向で、右手方向はカルボキシル末端方向である。同様に、別途記載しない限り、１本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端である；２本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と言われる。生まれつつあるＲＮＡ転写物の５’から３’への付加方向は、転写方向と言われる；ＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖上にあり、かつＲＮＡ転写物の５’末端の５’側に位置する配列領域を「上流配列」と言う；ＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖上にあり、かつＲＮＡ転写物の３’末端の３’側に位置する配列領域を「下流配列」と言う。
本明細書に用いる「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡを言う。「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」とは、５’末端から３’末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の１本鎖または２本鎖ポリマーを言う。それは自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマーおよび非機能性ＤＮＡまたはＲＮＡの両方を含む。本発明のいずれの核酸配列の相補体も、上記配列の定義に含まれることが理解される。
「核酸プローブ」は、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片であってよい。ＤＮＡ断片は、例えば、プラスミドＤＮＡを消化して、またはＰＣＲを用いて調製することができる。または、BeaucageおよびCarruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862（1981）に記述されているホスホルアミド法またはMatteucciら，J. Am. Chem. Soc. 103:3185（1981）のトリエステル法によって（両方とも参考として本発明に組み入れている）合成することができる。次に、所望であれば、化学的に合成した複数の１本鎖を適切な条件下でアニーリングすることによって、またはＤＮＡポリメラーゼを適切なプライマー配列と共に用いて相補鎖を合成することによって、２本鎖断片を得ることができる。核酸プローブの特定配列が与えられた場合、それに相補的な配列もまた同定され、含まれることが理解される。標的が２本鎖核酸である場合には、上記相補鎖は同じ働きをする。
「...と選択的にハイブリダイズする」という表現は、全細胞性ＤＮＡまたはＲＮＡ調製物中に標的配列が存在する場合、特定の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とのみハイブリダイズする、二重になる、または結合する核酸プローブを言う。「相補的」または「標的」核酸配列とは、核酸プローブと選択的にハイブリダイズする核酸配列を言う。適切なアニーリング条件は、例えばプローブの長さ、塩基組成、およびプローブ上のミスマッチの数およびそれらの位置、等に依存し、しばしば経験的に決定しなければならない。核酸プローブの設計およびアニーリング条件については、例えば、Sambrookら，Molecular Cloning: a Laboratory Manual（第２版）Vols. 1-3, Cold Spring Harbar Laboratory,（1989）またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubelら（編），Green Publishing and Wiley-Interscience, New York（1987）を参照されたい。
「...をコードする核酸配列」という句は、特定のタンパク質またはペプチドの発現を引き出す核酸を言う。核酸配列とは、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列およびタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。核酸配列は、全長核酸配列、および全長タンパク質から誘導される非全長配列の両方を含む。核酸配列は、天然の配列または特定の宿主細胞におけるコドン優占性（codon preference）を提供するために導入される配列の縮重コドンを含むことがさらに理解される。
「単離された」または「実質的に純粋な」という句は、宿主の核酸に普通関連している少なくとも１つのタンパク質または核酸を欠く核酸調製物を言う。
「発現カセット」という句は、そのような配列と適合性の、宿主中の構造遺伝子の発現に影響を及ぼすことのできるヌクレオチド配列を言う。このようなカセットは少なくともプロモーターを含み、さらに場合により転写終結シグナルを含む。発現を達成するために必要な、または役立つ付加的因子もまた本明細書に記述するように用いることができる。
本明細書に用いる「機能しうる形で結合した」という表現は、プロモーターがＤＮＡ配列の転写を媒介するように、該ＤＮＡ配列の上流にプロモーターが連結されていることを言う。
「ベクター」という用語は、ウイルス発現系、自律的自己複製環状ＤＮＡ（プラスミド）を言い、そして発現および非発現プラスミドの両方を含む。組換え微生物または細胞培養物が宿主として「発現ベクター」を含む、と記述されている場合、これは染色体外環状ＤＮＡおよび宿主の染色体に組み込まれたＤＮＡの両方を含む。ベクターが宿主細胞によって保持されている場合、このベクターは自律性構造物として有糸分裂の間に宿主細胞によって安定に複製されうる。または、ベクターは宿主ゲノム中に組み込まれる。
本明細書に用いる「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードする核酸配列を言うものである。この定義は、遺伝子産物の機能に影響を及ぼさない種々の配列多型、突然変異、および／または配列変形体を含む。「遺伝子」という用語は、コード配列のみでなく、プロモーター、エンハンサーおよび終結領域等の調節領域をも含むことが意図される。この用語は、全てのイントロン、およびｍＲＮＡ転写物からスプライシングされた他のＤＮＡ配列および別なスプライシング部位から生じた配列変形体をさらに含む。
「プラスミド」という用語は、細胞中で複製可能な自律性の環状ＤＮＡ分子を言い、発現タイプおよび非発現タイプの両方を含む。組換え微生物または細胞培養物が宿主として「発現ベクター」を含む、と記述されている場合、これは染色体外環状ＤＮＡ分子および宿主の染色体に組み込まれたＤＮＡの両方を含む。プラスミドが宿主細胞によって保持されている場合、このプラスミドは自律性構造物として有糸分裂の間に宿主細胞によって安定に複製されうる。または、プラスミドは宿主ゲノム中に組み込まれる。
「組換えタンパク質」または「組換えによって産生されたタンパク質」という表現は、該タンパク質を発現することのできるＤＮＡの内因性コピーを持たない非天然の細胞を用いて産生されたペプチドまたはタンパク質を言う。該細胞は適切な核酸配列の導入によって遺伝子的に変更された故に、該タンパク質を産生する。組換えタンパク質は、このタンパク質を産生する細胞に通常は結合しているタンパク質および他の細胞下成分と会合して見いだされることはない。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は本明細書では互換的に用いられる。
以下の用語、すなわち「標準配列（reference sequence）」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性百分率」および「実質的同一性」は２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列の関係を記述するために用いられる。「標準配列」とは、配列比較の基礎として用いられる規定された配列である。
「標準配列」はより大きい配列のサブセット（例えば、全長ｃＤＮＡまたは配列表に与えられた遺伝子配列のセグメント）であってもよいし、または完全なＤＮＡまたは遺伝子配列からなっていてもよい。
比較ウィンドウに合わせるために配列を最適に整列させることは、例えばSmithおよびWaterman, Adv. App. Math. 2:482（1981）の局部的相同性アルゴリズム（algorithm）によって、NeedlemanおよびWunsch J.Mol.Biol. 48:443（1970）の相同性整列アルゴリズムによって、PearsonおよびLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444（1988）の類似性検索法によって、またはこれらアルゴリズムのコンピュータ化された実行手段（例えば、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP, BESTFIT, FASTAおよびTFASTA）によって行なうことができる。
核酸配列について使われる、本明細書で用いる「実質的同一性」または「実質的配列同一性」という用語は、少なくとも20ヌクレオチドの比較ウィンドウに渡って、しばしば少なくとも25〜50ヌクレオチドのウィンドウに渡って、ポリヌクレオチドが標準配列と比較して少なくとも85%の配列同一性、好ましくは少なくとも90から95%の配列同一性、そしてより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む場合の、該ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。ここで配列同一性の百分率は、標準配列を、合計が標準配列の20%未満の欠失または付加を含んでいてもよいポリヌクレオチド配列と比較ウィンドウに渡って比較して計算される。
ポリペプチドに対して用いられる「実質的同一性」または「実質的配列同一性」という用語は、デフォルトギャップウエイト（default gap weight）を用いてプログラムGAPまたはBESTFITなどによって最適に整列させた時に、２つのペプチド配列が少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、そしてより好ましくは少なくとも95%またはそれ以上の配列同一性を共有することを意味する。「アミノ酸同一性百分率」または「アミノ酸配列同一性百分率」という用語は、最適に整列させた時に、同一アミノ酸の百分率がほぼ上記のようである２つのポリペプチドのアミノ酸の比較を言う。例えば、「95%アミノ酸同一性」とは、最適に整列させた時に、95%のアミノ酸同一性を有する２つのポリペプチドのアミノ酸の比較を言う。好ましくは、同一でない残基位置は同類アミノ酸置換によって異なっている。例えば、電荷または極性等の化学的特性が類似したアミノ酸同志の置換はタンパク質の特性に影響を及ぼす可能性が低い。このような例には、グルタミンとアスパラギンの置換、またはグルタミン酸とアスパラギン酸の置換が含まれる。
ペプチドまたはタンパク質について「実質的に精製された」または「単離された」という表現は、他の細胞成分を本質的に含まない化学組成物を意味する。それは乾性または水性の溶液であり得るが、好ましくは均一な状態にある。純度および均一性は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技法を用いて測定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質を実質的に精製する。一般に、実質的に精製された、または単離されたタンパク質は調製物中に存在する全巨大分子種の80%以上を構成する。好ましくは、タンパク質は調製物中に存在する全巨大分子種の90%以上に相当するように精製される。より好ましくは、タンパク質は95%以上まで精製される。最も好ましくは、従来の技法では他の巨大分子種が検出されない本質的均一状態になるまで、タンパク質は精製される。
あるペプチドまたはタンパク質について「抗体に特異的に結合する」または「...と特異的に免疫反応性（である）」という表現は、タンパク質および他の生物学的物質の不均一な集団の存在下において上記タンパク質の存在に限定的な結合反応を言う。したがって指定されたイムノアッセイ条件下では、特定された抗体は特定のタンパク質と結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質とは重大な量で結合することはない。そのような条件下での抗体との特異的結合は、特定のタンパク質に対する特異性によって選択された抗体を必要とするかもしれない。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、種々のイムノアッセイ様式を用いることができる。例えば、あるタンパク質と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択するためには、固相ELISAイムノアッセイが通常用いられる。イムノアッセイ様式の説明および特異的免疫反応性を測定するのに使用できる条件については、HarlowおよびLane,（1988）Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。
本明細書に用いる「ＥＳＴ」または「エクスプレスドシーケンスタグ（Expressed Sequence Tag）」という用語は、選択された細胞、細胞型、組織または組織型または生物から調製したゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから得たより長い配列の約150〜500、より好ましくは約300の連続したヌクレオチドからなる部分ＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列を言う。上記のより長い配列とは、上記ライブラリーに見いだされるｍＲＮＡまたは遺伝子に対応するものである。ＥＳＴは一般にＤＮＡである。単一の組織型から作製された１または２以上のライブラリーは典型的には少なくとも3000個の異なる（すなわち独特の）ＥＳＴ、および可能性としては考えうる全てのｃＤＮＡを表す考えうる全てのＥＳＴの完全な相補体（full complement）（例：ヒト等の動物では50,000〜100,000）を提供する。（例えば、Adamsら，Science 252:1651-1656（1991）を参照されたい）。
本明細書に用いる「ストリンジェントな」という用語は、50%ホルムアミドを用いて42℃でというハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を指す。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件も選択することができる。一般にストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定配列の熱融点（Tm）より約５℃低くなるように選択される。Tmとは（規定されたイオン強度およびｐＨにおいて）標的配列の50%が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする温度である。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７におて塩濃度が少なくとも0.02モルで、温度が少なくとも約60℃であることである。他の因子、中でも相補鎖の塩基組成および大きさ、有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチの程度はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに重大な影響を及ぼしうるので、パラメーターの組合せはいずれのパラメーターの絶対基準よりも重要である。
Ｂ．転写物地図およびＨＨ近傍の新しい遺伝子
本発明は、ＨＦＥ遺伝子の周囲１メガベース（megabase, 10⁶塩基）領域の詳細な構造地図を提供する。この地図の一部として、本発明はＤＮＡ配列の約250 kb（そのうち約235 kbは図８に示されている）および上記１メガベース領域内にある候補遺伝子に対応する８つの特に興味深い遺伝子座を提供する。これらの遺伝子座は、さらなる地図作製研究のための遺伝子マーカーおよび物理的マーカーとして有用である。さらに、これらの遺伝子座に対応する８つのｃＤＮＡ配列は、例えば、推定上の遺伝子ファミリーの他の遺伝子の単離、他の種由来の相同体の同定等のため、および診断アッセイ用のプローブとして有用である。特に、本発明のｃＤＮＡの連続したヌクレオチドと実質的に同一な少なくとも18ヌクレオチドからなる単離された核酸配列は、ＰＣＲプライマーとして有用である。典型的には、このＰＣＲプライマーはＰＣＲ反応のプライマー対の一部として用いられる。本発明のｃＤＮＡの連続したヌクレオチドと実質的に同一な好ましくは約18〜100ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも18ヌクレオチドを含む単離された核酸配列は、ＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションアッセイ用のプローブの設計に有用である。さらに、それらのｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、遺伝子発現を分析するための抗体の作製や診断アッセイ、および関連タンパク質の精製に有用である。
したがって、本発明の１つの実施態様においては、地図を作製した１メガベース領域内のFHEサブ領域の235 kb配列が提供される。この配列は上記領域における欠失、置換および挿入を遺伝子的または物理的に分析する際の標準として役立ち得る。さらに、この配列情報は上記領域の新しい遺伝子のさらなる同定のための情報源を提供する。したがって、この235 kb配列と実質的に同一な核酸配列もまた本発明の範囲内に含まれる。
本発明のさらなる実施態様においては、５個の遺伝子ＢＴＦ１〜５から成るファミリーが提供される。これらの遺伝子は配列相同性により乳タンパク質ブチロフィリン（butyrophnin）（ＢＴ）と関連している（図１、３および７）。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の予測されるアミノ酸配列を図３に示す。これらのｃＤＮＡは、ＢＴファミリーのさらなるメンバーを同定するため、およびこの遺伝子ファミリーの発現調節を研究するために有用である。これらのｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、ＢＴタンパク質のリガンドの同定および単離、ならびにＢＴ機能のアゴニストまたはアンタゴニストの作製に有用であり得る。ＢＴＦ１〜５と実質的に同一な核酸配列およびそれらによってコードされるタンパク質もまた、対立遺伝子形も含めて、本発明の範囲に含まれる。
本発明のさらに別の実施態様においては、新規遺伝子RoRetが提供される。この遺伝子は配列相同性により52 kDのRo/SSA狼瘡およびシェーグレン症候群自己抗原に関連している。この配列は、狼瘡またはシェーグレン症候群に関与している可能性のある他の遺伝子の同定に特に有用である。このｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、上記自己抗原のリガンドの同定および単離、ならびに該抗原のアゴニストまたはアンタゴニストの作製に有用であり得る。ReRotと実質的に同一な核酸配列およびそれらによってコードされるタンパク質もまた本発明の範囲に含まれる。
本発明のさらに別な実施態様においては、１型ナトリウム輸送遺伝子（type 1 sodium transport gene）と構造相同性を有する２つの遺伝子ＮＰＴ３およびＮＰＴ４が提供される。これらのｃＤＮＡおよびそれらによって発現されるタンパク質は、低リン酸血症の病因を決定するのに有用である。また、この遺伝子ファミリーの他のメンバーを同定および単離するためのプローブとしても有用である。ＮＴＰ１に類似した配列と実質的に同一な核酸配列およびそれらによってコードされるタンパク質もまた本発明の範囲に含まれる。
Ｃ．多型マーカー
本発明は、ＨＦＥ遺伝子領域における397個の新しい多型部位を提供する。これらの多型を表１に示す。以下に記述するように、これらの多型は、共通祖先型ＨＨ突然変異に同型接合である、影響をこうむった個人のＤＮＡ配列を、同時係属中のU.S.08/724,394に開示した、影響をこうむらなかった個人のＤＮＡ配列と比較することによって同定した。

これらの多型性は、ホモ接合体またはヘテロ接合体中の変異24d1および／または24d2、好ましくは24d1の存在の可能性を検出するための診断アッセイにおいて使用する代理マーカーを提供する。これは、例えば、表１の多型対立遺伝子によって定義される遺伝子型の存在または不在について、個体のＤＮＡまたはＲＮＡを評価するものである。この場合、その結果、表１の多型対立遺伝子によって定義される遺伝子型の不在は、個体のゲノム中のHFE遺伝子変異の不在の可能性を意味し、この遺伝子型の存在は個体のゲノム中のHFE遺伝子変異の存在の可能性を意味する。
これらのマーカーは、個体中のHFE遺伝子変異の存在の可能性の診断アッセイにおいて、単独で、互いに組合せて、または別の多型性マーカー（同時出願中のWO 96/06583中に開示されたものなど）とともに使用することができる。例えば、診断アッセイにおいて、表１の多型部位によって定義されるマーカーのいずれか１つを24d1若しくは24d2と、あるいは１以上の多型HHP-1, HHP-19若しくはHHP-29、または以下のマイクロサテライト反復対立遺伝子と組合せて使用することができる；19D9:205；18B4:235；1A2:239；1E4:271；24E2:245；2B8:206；3321-1:98；4073-1:182；4440-1:180；4440-2:139；731-1:177；5091-1:148；3216-1:221；4072-2:170；950-1:142；950-2:164；950-3:165；950-4:128；950-6:151；950-8:137；63-1:151；63-2:113；63-3:169；65-1:206；65-2:159；68-1:167；241-5:108；241-29:113；373-8:151；および373-29:113、D6S258:199, D6S265:122, D6S105:124；D6S306:238；D6S464:206；およびD6S1001:180。
表２に、一般的な集団における、約100の本発明の多型部位によって定義される対立遺伝子の頻度を列記する。この表から明らかなように、これらの対立遺伝子のいくつかは一般的な集団においては稀にしか存在しない。したがって、これらの多型性は24d1または24d2などの変異HFE対立遺伝子（「遺伝子変異」）の存在についての診断アッセイにおける代理マーカーとして好ましい。好ましくは、診断アッセイにおいて使用する多型対立遺伝子の一般的集団における頻度は約50％より低く、より好ましくは約25％未満、最も好ましくは約5％未満である。こうして、表２に掲げた対立遺伝子によって定義された遺伝子型の中で、図１の塩基35983および塩基61465で発生する多型が好ましい。
当業者にとっては、これらは祖先からのHHホモ接合体中で同定されたので、表１の多型部位によって定義されるハプロタイプ（haplotype）はHFE遺伝子変異24d1の存在の可能性を予測し得ることが理解されるであろう。したがって、例えば、罹患している個体が表１によって定義される多型対立遺伝子のいずれかを２以上有する確率は非罹患個体の確率よりも高い。同様に、罹患している個体が表１によって定義される多型対立遺伝子のいずれかを３以上有する確率は非罹患個体の確率よりも高い。
こうして、例えば、個体のゲノム中のHFE遺伝子変異の存在の可能性についての診断アッセイにおいて、個体のＤＮＡまたはＲＮＡを表１のハプロタイプの存在または不在について評価する。この場合、その結果として、表１のハプロタイプの不在は個体のゲノム中のHFE遺伝子変異の不在の可能性を意味し、ハプロタイプの存在は個体のゲノム中のHFE遺伝子変異の存在の可能性を意味する。
表１の多型部位によって定義されるマーカーは、その上、特定のHFE対立遺伝子、および、例えば同時出願中のU.S.S.N.08/724,384に開示されたものを含む、図９の配列に対応する染色体領域内にあるその他の遺伝子の遺伝の遺伝子分析のためのマーカーとしても有用である。
この領域の全ヌクレオチド配列が図９に提供されているので、当業者にとって、目的とする各多型性を検出するためにプライマーまたはプローブとしてどの配列を使用すべきかは明らかであろう。こうして、本発明のいくつかの態様において、本発明のヌクレオチド配列としては、表１のある多型部位の増幅のための、図９の配列から選択される１以上のオリゴヌクレオチド対またはその相補体が含まれる。さらに、本発明のいくつかの態様において、好ましいハイブリダイズプローブは、少なくとも8から約100の連続する塩基が１以上の表１の多型部位を含む、図９の配列からの少なくとも8から約100の連続する塩基、またはその配列の相補体を含むオリゴヌクレオチドである。ある態様においては、多型部位は塩基35983または塩基61465の位置である。
本発明の核酸配列として、ＤＮＡ分子が１以上の表１の多型部位を含んでいる、図９の配列と実質的に同一の、約235 kbまでの約100の連続する塩基を含む、単離された核酸分子が含まれることも認識されるべきである。こうしたＤＮＡ配列は個体のHFE遺伝子変異の存在の可能性を検出するためのプライマー、プローブ、または診断アッセイにおけるキットの成分として有用である。
Ｄ．核酸に基づくスクリーニング
本発明の多型対立遺伝子を保有する個体を、当業界で周知の各種の技法を使用して、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質数値のいずれかによって検出することができる。診断のために使用するゲノムＤＮＡは末梢血、尿、唾液、頬、外科検体および剖検検体中に存在するものなどの体細胞から取得することができる。このＤＮＡを直接使用するか、あるいは変異分析の前に、PCR（Saikiら、Science 238:487-491（1988））、またはリガーゼ連鎖反応（LCR）（Wu and Wallace Genomics 4:560-569（1989））、鎖置換増幅（SDA）（Walerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89:392-396（1992））、自給（self-sustained）配列複製（3SR）（Fahyら、PCR Methods Appl.1:25-33（1992））などのその他のin vitro増幅方法の使用によって、in vitroで酵素により増幅することができる。変異の検出に好適な形態での核酸の調製方法論は当分野で周知である。
HFE遺伝子領域などの特定のＤＮＡ配列中の多型の検出は限定するわけではないが、以下のものを含む各種の方法によって実施することができる；対立遺伝子特異的制限エンドヌクレアーゼ切断に基づく制限断片長多型検出（Kan and Dozy Lancet ii:910-912（1978））、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション（Wallace、Nucl Acids Res 6:3543-3557（1978））、固定化オリゴヌクレオチド（Saikiら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86:6230-6234（1989））またはオリゴヌクレオチド列（arrays）（Maskos and Southern Nucl Acids Res 21:2269-2270（1993））を含むもの、対立遺伝子特異的PCR（Newtonら、Nucl Acids Res 17:2503-2516（1989））、ミスマッチ修復検出（MRD）（Faham and Cox Genome Res 5:474-482（1995））、MutSタンパク質の結合（Wagnerら、Nucl Acids Res 23:3944-3948（1995））、変性−勾配ゲル電気泳動（DGGE）（Fisher and Lermanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 80:1579-1583（1983））、一本鎖配座多型検出（Oritaら、Genomics 5:874-879（1983））、ミスマッチ塩基対位置でのＲＮＡアーゼ切断（Myersら、Science 230:1242（1985））、ヘテロ二本鎖ＤＮＡの化学的（Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85:4397-4401（1988））または酵素的（Youilら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92:87-91（1995））切断、対立遺伝子特異的プライマー伸長に基づく方法（Syvanenら、Genomics 8:684-692（1990））、遺伝ビット（bit）分析（GBA）（Nikiforovら、Nucl Acids Res 22:4167-4175（1994））、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）（Landegrenら、Science 241:1077（1988））、対立遺伝子特異的連結連鎖反応（Barrany Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:189-193（1991））、ギャップ（gap）-LCR（Abravayaら、Nucl Acids Res 23:675-682（1995））、当り業界で周知の標準的方法を使用した放射性および／または蛍光ＤＮＡ配列決定ならびにペプチド核酸（PNA）アッセイ（Orumら、Nucl. Acids Res. 21:5332-5356（1993）；Thiedeら、Nucl. Acids Res. 24:983-984（1996））。
ゲノムが24d1および／または24d2を含有する個体の同定を補助するために、同時出願中のPCT出願WO 96/35802（1996年11月14日公開）に記載したように、本発明の多型性によって定義される遺伝子型の外に、対立遺伝子19D9:205；18B4:235；1A2:239；1E4:271；24E2:245；2B8:206；3321-1:98（明細書では3321-1:197と命名）；4073-1:182；4440-1:180；4440-2:139；731-1:177；5091-1:148；3216-1:221；4072-2:170（明細書では4072-2:148と命名）；950-1:142；950-2:164；950-3:165；950-4:128；950-6:151；950-8:137；63-1:151；63-2:113；63-3:169；65-1:206；65-2:159；68-1:167；241-5:108；241-29:113；373-8:151；および373-29:113、対立遺伝子D6S258:199, D6S265:122, D6S105:124；D6S306:238；D6S464:206；およびD6S1001:180、ならびに／またはHHP-1, HHP-19若しくはHHP-29一本鎖塩基対多型と関連する対立遺伝子の存在によって特徴づけられる遺伝子型もまた使用することができる。例えば、表１の多型に隣接するオリゴヌクレオチドプライマー、および24d1および／または24d2に隣接するオリゴヌクレオチド、１以上の塩基対多型HHP-1, HHP-19およびHHP-29に隣接するオリゴヌクレオチドプライマー、１以上のマイクロサテライト反復対立遺伝子に隣接するオリゴヌクレオチドプライマー、またはこれらの多型若しくはマイクロサテライト反復対立遺伝子のいずれかの組合せのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅させることを含む操作によって、評価ステップを実施することができる。
診断アッセイに有用なオリゴヌクレオチドは典型的には８以上の長さの連続ヌクレオチドで、またこれ以上の長さ18のヌクレオチドから100以上、まはそれ以上の連続ヌクレオチドの範囲とすることができる。こうしたオリゴヌクレオチドは図８もしくは９のゲノムＤＮＡまたはこれから誘導されるＤＮＡ配列のいずれかから誘導するか、あるいは合成することができる。
その上、こうしたｃＤＮＡによってコードされるタンパク質もまた、遺伝子発現の分析のための抗体の産生、および診断アッセイ、ならびに関連するタンパク質の精製において有用である。
Ｅ．一般的な方法
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または各種の組合せのハイブリッドのいずれについても、本発明の核酸組成物は、クローン化ＤＮＡも含めて、天然の起源から単離するか、またはin vitroで合成することができる。請求の範囲の核酸は形質転換またはトランスフェクトされた全細胞、形質転換またはトランスフェクトされた細胞の溶解物、または部分的に精製された、若しくは実質的に純粋な形態で存在することが可能である。
ポリペプチドをコードする核酸配列の発現ベクター中へのサブクローン化、プローブの標識、ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの、本発明の核酸配列の核酸操作の技術は、Sambrookら、Molecular Cloning-a Laboratory Manual （2nd Ed.）, Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,（1989）に一般的に記載されており、これを参照としてここに引用する。このマニュアルを以後「Sambrookら」と称する。
本発明の核酸配列を単離する方法は各種ある。例えば、ＤＮＡは本明細書で開示される配列に相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。こうしたプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて直接使用することができる。あるいは、PCRなどの増幅技術で使用するために、プローブを設計することもできる。
ｃＤＮＡライブラリーを調製するためには、心臓または膵臓などの組織、好ましくは遺伝子または遺伝子ファミリーの発現が生じやすい組織からｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、これを組換えベクター中に連結する。このベクターを増殖、スクリーニングおよびクローニング用の組換え宿主中にトランスフェクトする。ｃＤＮＡライブラリーの作製およびスクリーニング方法は周知である。Gubler,U. and Hoffman,B.J.Gene 25:263-269（1983）およびSambrookらを参照されたい。
ゲノムライブラリーについては、例えば、ＤＮＡを組織から抽出し、機械的に剪断するかまたは酵素によって消化し、約12-20 kbの断片を生成させる。次に、この断片を勾配遠心分離によって所望しないサイズと分離し、バクテリオファージλベクター中で構築する。これらのベクターおよびファージをSambrookらの記載のようにして、in vitroでパッケージングする。Benton and Davis,Science 196:180-182（1977）の記載にしたがって、組換えファージをプラークハイブリダイゼーションによって分析する。M.Grunsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:3961-3965（1975）に一般的に記載されているようにして、コロニーハイブリダイゼーションを実施する。
例えばサザンブロット上で、核酸プローブとハイブリダイズする能力によって、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー中のいずれかにおいて、目的のＤＮＡを同定し、当業者に周知の標準的な方法によって、これらのＤＮＡ領域を単離する。Sambrookらを参照されたい。
PCR技術において、増幅すべきＤＮＡ領域の２つの3'枠に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを合成する。次に、この２つのプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を実施する。PCR Protocols:a Guide to Methods and Applications（Innis,M.,Gelfand,D.,Sninsky,J. and White,T.,eds.）,Academic Press,San Diego（1990）を参照されたい。所望に応じて、目的の全長配列をコードする全領域を増幅するか、またはより小さいＤＮＡセグメントを増幅するように、プライマーを選択することができる。
目的の配列をコードするｃＤＮＡを単離するため、各種のプロトコルでPCRを使用することができる。これらのプロトコルにおいて、ここに列記したＤＮＡ配列の分析から、目的の配列をコードするＤＮＡを増幅するのに適切なプライマーおよびプローブが作製される。こうした領域をPCR増幅した後、これを配列決定し、得られた配列からオリゴヌクレオチドプローブを調製することができる。
プライマーまたはプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、Needham-VanDevanter,D.R.ら、Nucleic Acids Res. 12:6159-6168（1984）に記載されたように、自動合成装置を使用して、Beaucage,S.L. and Carruthers,M.H.,Tetrahedron Lett. 22（20）:1859-1862（1981）に最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法にしたがって、化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、非変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはPearson,J.D.and Regnier,F.E.,J.Chrom. 255:137-149（1983）に記載された、アニオン交換HPLCのいずれかによる。Grossman,L.and Moldave,D.,eds.Academic Press,New York,Methods in Enzymology 65:499-560（1980）中のMaxam,A.M.およびGilbert,W.の化学分解法を使用して、合成オリゴヌクレオチドの配列を変更することができる。
１．発現
目的の配列をコードするＤＮＡを単離し、クローン化した後、各種の組換え操作をした細胞中で、コードされたタンパク質を発現させることができる。当業者は、目的の配列をコードするＤＮＡの発現のために利用可能な多数の発現系の知識を有するものと予想される。原核または真核生物中のタンパク質の発現について既知の各種の方法について、本明細書では詳細な記載をするつもりはない。
簡単に要約すると、目的の配列をコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、（構成性または誘導性のいずれかの）プロモーターにＤＮＡまたはｃＤＮＡを機能的に連結し、その後発現ベクターの１つに組み込むことによって達成される。ベクターは原核または真核生物のいずれかの中での複製および集積に好適なものとすることができる。典型的な発現ベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに目的のポリヌクレオチド配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。クローン化遺伝子の高レベルの発現を獲得するためには、最少でも、転写を誘導する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含有する発現プラスミドを構築することが望ましい。発現ベクターにも、１以上の独立したターミネーター配列、真核および原核生物の両方でプラスミドを複製させることができる配列、すなわちシャトルベクター、ならびに原核および真核系の両方のための選択マーカーを含有する一般的発現カセットを含ませることができる。Sambrookらを参照されたい。原核および真核系の両方でのATP-感受性カリウムチャンネルタンパク質の発現の例を以下に記載する。
a.原核生物における発現
本発明のタンパク質を発現するために、様々な原核生物発現系を使うことができる。例としては、大腸菌（E.coli）、バシラス属（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）などが挙げられる。
少なくとも、転写を指令する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写／翻訳ターミネーターを含有する発現プラスミドを構築することが好ましい。大腸菌におけるこの目的に適した制御領域の例は、Yanofsk, C., J. Bacteriol. 158:1018-1024（1984）に記載の大腸菌トリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター領域並びにHerskowitz, I.及びHagen, D., Ann. Rev. Genet. 14:399-445（1980）に記載のファージλ（Ｐλ）の左側プロモーターである。大腸菌を形質転換させるＤＮＡベクター中へ選択マーカーを導入することもまた有用である。このようなマーカーの例としては、アンピシリン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコールに耐性を示す遺伝子が挙げられる。E.Coliで使用する選択マーカーの詳細は、Sambrookらの文献を参照されたい。
大腸菌からの精製時に発現組換えタンパク質の適切なフォールディングを増強するために、発現タンパク質を最初に変性し、その後、再生することができる。これは、細菌により産生したタンパク質をグアニジンHClのようなカオトロピック剤中に溶解し、全てのシステイン残基をβ−メルカプトエタノールのような還元剤で還元することにより実施される。該タンパク質はその後、ゆっくりと透析することにより、またはゲル濾過により再生される。米国特許第4,511,503号を参照のこと。
発現された抗原の検出は、ラジオイムノアッセイ、またはウエスタンブロット技術、または免疫沈降のような当業界で公知の方法により達成される。大腸菌からの精製は米国特許第4,511,503号に記載されたような方法により行うことができる。
b.真核生物における発現
酵母、昆虫細胞系、鳥、魚、及び哺乳動物細胞のような様々な真核生物発現系が当業者に公知である。以下に概略を説明するように、目的とする配列はこれらの真核生物系で発現させることができる。
酵母における異種タンパク質の合成は公知である。Methods in Yeast Genetics, Sherman, Fら，Cold Spring Harbor Laboratory,（1982）は、酵母中でタンパク質を産生するために利用可能な様々な方法を記述し、よく認められた著作である。
適切なベクターは通常、所望により、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含むプロモーター、及び複製起点、終結配列等の発現制御配列を有する。例えば、適切なベクターは文献（Bosteinら，Gene 8:17-24（1979）; Broachら，Gene 8:121-133（1979））に記載されている。
二つの方法が酵母細胞の形質転換に使用される。一つのケースでは、酵母細胞を最初にザイモリアーゼ（zymolyase）、リチカーゼ（lyticase）またはグルスラーゼ（glusulase）を用いてプロトプラストに変換し、続いてＤＮＡとポリエチレングリコール（PEG）を添加する。PEGで処理したプロトプラストは、その後3％寒天培地にて選択条件下で再生される。この処理の詳細は、J. D. Beggs, Nature（London）275:104-109（1978）;及びHinnen, a.ら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:1929-1933（1978）に記載されている。第二の方法は細胞壁の除去を必要としないものである。その代わりに、細胞は塩化リチウムまたは酢酸リチウム及びPEGで処理され、選択プレート上に置かれる（Ito, Hら，J. Bact. 153:163-168（1983））。
本発明のタンパク質は、一度発現すれば、細胞を溶解し、標準的なタンパク質単離技術を溶解物に応用することによって、酵母から単離することができる。精製プロセスのモニタリングは、ウエスタンブロット技術またはラジオイムノアッセイまたは他の標準的なイムノアッセイ技術を用いることにより行うことができる。
本発明のタンパク質をコードする配列は、また、例えば、哺乳動物、昆虫、鳥または魚を起源とする細胞培養物を形質転換するのに使用される様々な発現ベクターへ連結させることもできる。ポリペプチドの産生に有用な細胞培養物の例は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、哺乳動物細胞懸濁物を使用することもできるが、細胞の単層の形態であることが多い。無傷のタンパク質を発現する能力のあるいくつかの適切な宿主細胞系が当業界で開発されており、HEK293、BHK21、及びCHO細胞系、及びCOS細胞系、HeLa細胞、ミエローマ細胞系、Jurkat細胞のような様々なヒト細胞などが含まれる。これら細胞用の発現ベクターは、複製起点、プロモーター（例えば、CMVプロモーター、HSVtkプロモーターまたはpgk（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター）、エンハンサー（Queenら，Immunol. Rev. 89:49（1986））のような発現制御配列、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、SV40ラージT抗原ポリA付加部位）のような必要なプロセシング情報部位、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。ATP−感受性カリウムチャネルタンパク質の産生に有用な他の動物細胞は、例えば、the American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas（第7版,（1992））から入手可能である。
昆虫細胞における本発明のタンパク質を発現するための適切なベクターは、通常、SF9バキュロウイルスから誘導される。適切な昆虫細胞系は蚊幼生、カイコ、ヨトウムシ（armyorum）、ガ（moth）及びシュナイダー（Schneider）細胞系（Schneider J. Embryol. Exp. Morphol.27:353-365（1987）を参照されたい）のようなショウジョウバエ（Drosophila）細胞系が挙げられる。
上述したように、宿主細胞を形質転換するために使われるベクター（例えば、プラスミド）は、好ましくは転写を開始するＤＮＡ配列及びタンパク質の翻訳を制御する配列を含有する。これらの配列を発現制御配列と呼ぶ。
酵母の場合と同様に、高等動物宿主細胞を用いる際には、ポリアデニル化または公知の哺乳動物遺伝子由来の転写ターミネーター配列をベクターへ組み込む必要がある。ターミネーター配列の一例はウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列もまた含まれ得る。スプライシング配列の一例は、SV40由来のVP1イントロンである（Sprague, J.ら，J. Virol. 45:773-781（1983））。
更に、宿主細胞において複製を制御する遺伝子配列を、ウシ乳頭腫ウイルス型のベクターに見出されるようなベクターに結合することができる。Saveria-Campo, M., 1985, "Bovine Papilloma virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector" in DNA Cloning Vol. II a Practical Approach Ed. D. M. Glover, IRL Press, Arlington, Virginia pp.213-238。
該宿主細胞は様々な手法による形質転換に対しコンピテントであるかまたはコンピテントになる。動物細胞にＤＮＡを導入するいくつかの公知の方法がある。これらは、燐酸カルシウム沈降、受容細胞と該ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとの融合、該ＤＮＡを含有するリポソームによる受容細胞の処理、DEAE−デキストラン法、エレクトロポーレーション及びＤＮＡを直接細胞へ導入するマイクロインジェクションなどである。
形質転換細胞は当業で公知の手法により培養する（Biochemical Method In Cell Culture and Virology, Kuchler, R.J., Dowden, Hutchinson and Ross, Inc.,（1977））。発現したポリペプチドは、増殖した細胞から懸濁液としてまたは単層として単離する。後者は公知の機械的、化学的または酵素的手法により回収する。
2.精製
組換えＤＮＡ技術により産生されたタンパク質は、当業者に公知の標準技術により精製することができる。組換え技術によって産生したタンパク質は直接発現するか、融合タンパク質として発現することができる。その後、タンパク質を細胞溶解（例えば超音波処理）とアフィニティクロマトグラフィーを組み合わせて精製する。融合産物については、次に適切なタンパク質分解酵素により融合タンパク質を消化して、所望のポリペプチドを得る。
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムのような物質との選択的沈降、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法、その他を含む当業界で公知の標準技術によりかなりの純度に精製することができる。例えば、本明細書に参考として組み込まれるR. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: New York（1982）を参照されたい。例えば、一つの実施様態では、本明細書に記載された本発明のタンパク質に対して抗体を産生させることができる。組換えタンパク質を発現する細胞系から細胞膜を単離し、該タンパク質を膜から抽出し、免疫沈降する。その後、該タンパク質を上述の標準タンパク質化学技術により更に精製することができる。
3.抗体
上述したごとく、抗体もまた、本発明の多型性核酸によりコードされたポリペプチド産物のスクリーニングに使うことができる。更に、抗体は、本発明に従って、様々な他の意味においても有用である。かかる抗体はHHの診断及び、特定の用途では、感染組織のターゲッティングに用いることができる。
このように、本発明の他の様態に従えば、本発明の多型性核酸によりコードされたポリペプチド産物と特異的に結合する抗体を、抗体の遺伝子産物への結合を検出する試薬と組合わせて使用するイムノアッセイによって、本発明の多型性核酸によりコードされたポリペプチド産物の有無をスクリーニング及びアッセイするのに適したキットが提供される。
ハイブリドーマ細胞系が調製されれば、モノクローナル抗体は、プリスタンでマウスを初回免疫し、このマウスにハイブリッド細胞を腹腔内注射して腹水からモノクローナル抗体を回収する通常の技術により作製することができる。
合成及び半合成抗体については、かかる用語は抗体フラグメント、イソ型スイッチ抗体、ヒト化抗体（マウス−ヒト、ヒト−マウスなど）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、完全合成抗体様分子などを包含することを意図する。
本発明はまた、本明細書及び例示材料に記載された核酸プローブを含む組織サンプルまたは血液サンプル中に表1の多型性を含むＤＮＡまたはＲＮＡを検出する診断キットを包含する。該キットはまた、二重鎖（duplexed）核酸の同定のための、本明細書に記載した標識化合物のような追加成分を含有することができる。
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、発明の範囲を限定するものではない。当業者には本発明の他の変形が容易にわかるであろうが、これらは請求項に包含される。
F.実施例
1.メガベース転写物マップ
これらの研究では、直接選択、エキソン−トラッピング、及びゲノムサンプル配列決定を用い、HFEの近傍のHLA-Aに対しほぼ8.5メガベーステロメアの1メガベース領域の転写物マップを作製した。この領域6p21.3は遺伝子マーカーD6S2242とD6S2241に隣接していた。これらの実験の出発物質は1メガベースYAC標識y899g1及びこの領域の細菌クローンコンティグとした（Federら，Nature Genetics 13:399-408（1995））。これらの技術と本研究に使用した他の方法を以下に概説する。
a.直接選択（DS）
ヒト胎児の脳、肝臓及び小腸由来のポリＡ⁺ＲＮＡ（Clontech, Palo Alto, CA）を、ランダムプライマーとSuperscritptｃＤＮＡ合成キット（Life Technologies, Gaithersburg, MD）を用いてｃＤＮＡに変換した。該ｃＤＮＡをMboIで消化し、ｃＤＮＡ MboIリンカー−アダプターに連結した。未連結リンカー−アダプターはｃＤＮＡスパンカラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）中を通過させることによって除去した。連結したｃＤＮＡの各5ngをｃＤＮＡ MboI-Sプライマー（5'-CCTGATGCTCGAGTGAATTC-3'）を使って増幅した。増幅産物をS-400スピンカラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）で精製し、エタノール沈降し、TE中に1mg/mlで再懸濁した。ゲル精製したyac899g1（Centre d'Etude du Polymorphisme Humain）をMorganら，Nucl. Acids Res. 20:5173-5179（1992）に記載のとおりに処理した。ｃＤＮＡを全3mgに対して等モルで混合し、4mg Cot-1 ＤＮＡ（Life Technologies, Gaithersburg, MD）及びSau 3Aで消化したリボソームＤＮＡと5つの異なるヒストンＤＮＡのカクテルの混合物でブロックした。ブロックしたｃＤＮＡをビオチン化yac899g1ＤＮＡとハイブリダイズし、Morganら（先に同じ）に記載のとおりにストレプトアビジン捕捉を行った。二回目の選択の後、ウラシル−ＤＮＡグリコリアーゼクローニング（UDG, Life Technologies, Gaithersburg, MD）と併用するために構築されたpSP72（Promega, Madison, WI）のバージョンへのクローニングを容易にするために、5'末端に（CUA）4繰返しを含むｃＤＮＡ MboI-Sプライマーを使って溶出ｃＤＮＡを増幅した。組換え体をDH5α中で形質転換し、1000個のクローンを96ウエルフォーマット中にとり、AGTCボイリング96ウエルミニプレップシステム（Advance Genetic Technologies, Gaithersburg, MD）を用いてクローンをＤＮＡ配列決定用に調製した。
465個のクローンを配列決定し、得られたデータをBLAST（Altschulら，J. Mol. Biol. 215: 403-410（1990））により検索した。反復配列、細菌配列、酵母配列、ミトコンドリア配列及びヒストン配列に該当するこれらのクローンは、以後を考慮して除去した。その後、残った配列を、オーバーラップについて検索し、集合体化させて108のユニークDSコンティグとした。１つのDSコンティグ当たりのクローン数は1〜22の間で変動し、それぞれのコンティグの長さは250bp〜850bpの範囲にあった。小規模の配列標識部位PCRアッセイを、それぞれのDSコンティグに対して行い、２つの実験を同時に行った：すなわち、該領域の細菌クローンコンティグに遡って各DSコンティグをマッピングし、ｃＤＮＡライブラリー中の各DSコンティグの有無について試験した。全体でDSコンティグの86％または80％を該領域に遡ってマッピングし、ｃＤＮＡライブラリー中にあることを見出した。エキソン−インストロン境界を横切るPCRアッセイは失敗するか大きなサイズの産物を与えることでネガティブになると思われていたため、該領域への80％マッピングの数は、おそらく、直接選択の適合度を過小評価したものである。
b.エキソン−トラッピング
CsCl−精製ゲノムP1（Genome Systems）、BAC（Research Gehetics）及びPAC（Genome Systems）ＤＮＡを、BamH I、BgI II、Pst I Sac 1及びXho Iで消化し、それぞれの消化物の125ngを500ng pSPL3（Churchら，Nature Genetics 6:98-105（1994））（Life Technologies, Gaithersburg, MD）に連結し、適切な制限酵素により消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（USB, Cleveland, OH）で加水分解した。連結体（ligation）の10分の1を用いて、XL1-Blue MRF'細胞（Stratagene, La Jolia, CA）をエレクトロポーレーションにより形質転換した。エレクトロポーレーション物の10分の9を用いて、10mlのLBとカルベニシリン100μg/mlに接種し、一夜増殖させた後、ＤＮＡをQiagen Q-20tips（Qiagen GmbH, Hilden Germany）を用いて調製した。残りの10分の1をLBと100μg/mlカルベニシリンのプレート上に広げ、クローニング効率を評価し、個々のクローンを単一インサートの有無について試験した。COS-7細胞を一夜、6ウエルディッシュ中に1.4×10⁵／ウエルの密度でまいた。ＤＮＡの1μgを6mlのLipofect-Aceを用いてトランスフェクトした。細胞質ＲＮＡをトランスフェクション48時間後に単離した。RT-PCRをChurchら（先に同じ）に記載のとおりに、市販試薬（Life Technologies, Gaithersburg, MD）を用いて実施した。各制限酵素で消化した細菌クローンに対して得られたCUA−テールを有するPCR断片をプールし、UDGをpSP72-U（pSP72の誘導体）にクローニングした。該ＤＮＡをDH5αで形質転換し、細胞をナイロン膜に広げた。一夜増殖させた後、複製を作製し、該ＤＮＡを、pSPL3ベクターに関連する様々なバックグラウンド産物を検出するために設計した³²P末端標識オリゴ（oligos）へハイブリダイズさせた。膜の１セットを以下のゲル精製オリゴと、6×SSCハイブリダイゼーション水溶液中、42℃でハイブリダイズさせた：

膜を2回、6×SSC、10mMピロ燐酸ナトリウム（NaPPi）中で60℃で30分間洗浄した。
一晩オートラジオグラフィーを行った後、非ハイブリダイズクローンを拾い、96ウエルミニラックチューブ内で、250μlのLBとカルベニシリン100μg/ml中で増殖させた。キット（Life Technologies, Gaithersburg, MD）に含まれている二次PCRプライマーを用いてサンプルをPCRにより分析し、200bpより大きなインサートを有するクローンを配列決定のために選択した。
細菌クローン１つ当たり96のエキソントラップを全部で768の反応に対して配列決定し、得られたデータをBLASTで解析した。更に、各潜在エキソンを86DSコンティグのデータベースに対して検索して重複配列を消去した。PCRアッセイを潜在エキソンのそれぞれに対して行い、該エキソンをｃＤＮＡライブラリー中の有無について試験した。これらのスクリーニング工程後に全部で48の潜在エキソンが残った。
c．試料のシークエンシング
Qiagen Maxi-Prepシステムを用いて、y899g1をカバーするように選択された細菌クローンの最小セットをプレ・プレップし、CsClで精製した。各細菌クローンからのDNA１０μｇをHeat Systems Sonicator XLで超音波処理した後、クレノー（USB）およびT4 DNAポリメラーゼ（USB）により末端修復を行った。せん断したフラグメントは、0.7％アガロースゲル上で３〜４ｋｂの間でサイズ選択し、次いでBstXIリンカー（Invitrogen）にライゲートした。ライゲーション産物は、0.7％アガロースゲルにてゲル精製を行い、pSP72由来のプラスミドベクターにクローニングした。得られたプラスミドをエレクトロコンピーテントなDH5α細胞に形質転換し、LB-カルベニシリンプレートに播いた。15倍のクローン・カバレージ（coverage）となるように十分量のコロニーを釣り上げた。単一倍配列カバレージ（single-fold sequence coverage）となるよう、次式に従い適当なコロニー数を計算した:
コロニー数＝細菌クローンのサイズ（kb）/平均配列読み長さ（0.4 kb）
これらのコロニーを96穴AGCT系にプレップし、標準ABI Dye Terminatorプロトコルを用いて、オリゴMAP1で末端シークエンシングを行った。MAP1はCGTTAGAACGCGGCTACAATであった。全ての利用可能な公共のデータベースに対するBLASTアルゴリズムを使って局所的にMAP1配列のスクリーニングを行った。全ての同定配列は一覧表にし、DSおよびエクソン・トラップ・データベースと相互参照した。
全部で3794回の末端配列反応を行うと理論上1Xのカバレージになる。これら配列のうち85％は細菌でもベクターでもない挿入物を含んでいた。配列のカバレージを増やし、選択領域へのコンティグ形成に備えるため、クローニングベクターの反対側からさらに1060回の末端配列反応を行った。全ての利用可能な公共のデータベースに対するBLAST検索により12個のヒストン遺伝子と74個のユニークな発現配列フラグメント（ESF）を同定した。ESFはESTと、ゲノムDNAの実質的な部分以上の配列同一性により選択された他の発現配列フラグメントの集合を表す。ESFは、DSおよびエクソン・トラップ・データベースと相互参照することによって遺伝子重複を除いた。58個のユニークESFが残り、これは39個の異なるクローンを示す。これらのESFにはヒストン遺伝子に相同な５個の配列が含まれる。

d．cDNAライブラリースクリーニング
Superscript plasmid cDNAライブラリー、脳、肝臓、睾丸はLife technologies, Galthersburg, MDから購入した。標準的な手法を用いてコロニーはHybond Nフィルター（アマーシャム）に播いた。DSからのインサートプローブ、エクソンおよびEST（I.M.A.G.E.クローン、Genome Systems）はすべてPCRにより分離し、次いで低融点アガロースゲル（Seakem）で精製した。Prime-it IIIIキット（Stratagene, La Jola, CA）を用い、DNAをゲル中で標識した。小さエクソンプローブは、ランダムプライマーの代わりにそれぞれのSTS PCRプライマーを用いて標識した。5個までの異なるプローブをハイブリッド形成によりプールした。標準的な手法を用いて、フィルターをハイブリッド複製した。プローブのSTSを用い、PCRによって推定ポジティブをスクリーニングし、クローンを同定した。ポジティブ・クローンから得られたインサートはpSP72にサブクローニングし、シークエンシングを行った。
e．ノーザン・ブロッティングとRT-PCR分析
マルチ組織ノーザン・ブロットはClontechから購入し、メーカーの指示通りにハイブリダイズさせた。AmpliTaq Gold（Perkm-Elmer）を用いてポリA+RNA（Clontech）から作ったランダム・プライムされた一本鎖cDNAに対してRT-PCRを行った。逆転写酵素の不存在下、ゲノムDNA混入を制御するためにプロセスしたRNA試料について対照反応を行った。
f．ゲノムのシークエンシング
細菌クローンb132a2、222k22および75L14から得られたMAP1配列をStadenパッケージ（Roger Staden, MRCより入手可）を用いてコンティグに再構築した。プラスミド・ベクターの反対側にあるオリゴ標識MAP2でシークエンシングするため、3 kbクローンの最小セットを選択した。MAP2の配列は、GCCGATTCATTAATGCAGGTであった。MAP2配列を、MAP1配列と結合させてStadenデータベースに入れ、その領域を横切る3 kbクローンのタイリング（tiling）経路を形成した。これらの配列もまたBLASTアルゴリズムによりスクリーニングした。配列同定したものはすべて新規であった。同時に96穴フォーマットでプラスミド3 kbのライブラリーをpox38UR（C. Martin, Lawrence Berkeley Laboratoriesより入手可）に形質転換した。次いで96穴フォーマットにより形質転換体をJGM（Strathman et al., P.N.A.S. 88:1247-1250（1991））と接合させた。タイリング経路内の3 kbクローン接合はすべて、LB-カルベニシリン-カナマイシン・プレート上の画線培養により行った。3 kbクローン当たりコロニー12個のランダム選択をAGCT系でプレプレップした。オリゴ21：CTGTAAAACGACGGCCAGTCおよびREV：GCAGGAAACAGCTATGACCを用いてトランスポゾンの両末端からシークエンシングを行った。3 kbクローンをそれぞれ全細菌クローンから得られた末端配列情報と結合させて再構築してその領域に対する完全配列を得た。このゲノム配列をBLAST塩基とタンパク質相同アルゴリズムおよびGRAIL 1.2ソフトウェアによって分析し、遺伝子発見用の新規なオープン・リーディング・フレーム（ORF）を同定した。
g．考察
ESF174個を編集して、全長cDNA単離物に対するフレームワークとして利用できる領域の発現配列マップを構築した（図1）。（マップは実際にマッピングされたESFのサブセットを示す。）cDNAのコード領域由来と思われる82個の最良ESF用プローブを開発して、適当なcDNAライブラリーをスクリーニングした。これにより、19個のcDNAが単離され、そのうちの17個は新規な配列であった。174個のESFのうち70個は単離されたcDNAに含まれていた（40％）。複数のライブラリーについてスクリーニングを繰り返した後でも、36個のプローブはまったくクローンを作ることができなかった。クローン化したcDNAにおいて解明されなかった51個のESFはどのスクリーニングにも使用しなかった。従ってこの1メガベース領域内のいくつかの付加的な遺伝子は検出されていない可能性がある。
クローン化したこれらcDNAおよびこれらを得るために使用した方法の比較に関するリストを表4に示す。実験に使用したYACの範囲内に含まれる18個のcDNAから14個が直接選択により見出された。エクソン・トラッピングでは、ラージ・インサート細菌クローンのコンティグ領域内に含まれる19個のcDNAから15個が見つかった。試料のシークエンシングにより、公共のデータベースの対応ESTをもつ11個の遺伝子が同定された。

最後のアプローチとして、試料配列データベースから得られたオーバーラップ末端配列をもつタイリング経路を作った。両末端シークエンシング用プラッタフォームとして転座可能な（transposable）エレメントを用い、この経路内の3 kbクローンそれぞれについてショットガン・シークエンシングを行った。これら個々のクローンは、その領域にある全細菌クローンから末端配列と結合させて再構築された。BLAST相同検索およびGrail 1.2プログラムにより、得られた配列（図2）を系統的に分析し新規なオープン・リーディング・フレーム（ORF）とその他の遺伝子様構造を同定した。BLAST相同検索では、すでに試料シークエンシングによって同定されていないプローブは得られなかった。Grailは、その領域内の遺伝子すべてに対するエクソンを予想したが、単にヒストン類を代表的なフォームへ再構築することができただけであった。BLAST相同検索によるタンパク質データベースの詳細な分析によって、HFEの約25 kb上流に亜鉛アルファ2糖蛋白に対する誘導的相同が同定されたが、実質的なORFが欠如していることと停止コドンが存在することは、それが偽遺伝子であることを示唆している。図2はその位置、エクソンおよびイントロンの構造、この領域内における新規な遺伝子転写の相対的オリエンテーションを示す。さらにヒストン遺伝子の位置および転写のオリエンテーションも示す。本研究により合計12個のヒストン遺伝子が同定された。
250 kb領域において特性化された遺伝子と関連しないESTを説明すべく、推定3'末端付近のゲノム配列をポリアデニル化シグナルについて調べ、特定のEST配列が、EST生成に用いる正常化cDNAライブラリーにおけるゲノムDNA汚染から生じたものであるかどうかを判断した。この領域内にある14個のESTの位置を図2に掲げて、クローン化したcDNAと関連するもの、および明らかなコードポテンシャルをもつゲノムDNAと関連しないものを示す。4個のESTは、この領域からクローニングされた4個のcDNAのうちの３個に対応する（表2）。ESTの一つはヒストンH2B.1遺伝子をコードし、もう一方は反復エレメントであった。後の8個のうち、6個のESTクローンをネガティブな結果が出たcDNAライブラリーのプローブとして使用した。cDNAの推定3'末端を表すこれらの配列を、ポリ（A）+追加シグナルが存在するかどうかについて検索した。3'末端配列をもつ13個のESTのうち５個はATAAAまたはATTAAをもっていた。ポリ（A）+追加シグナルをもたない残りの8個のうち５個のESTは、EST配列の末端近くにポリ（A）のゲノムコード化ストレッチをもっており、従って、ゲノムDNAが混入するオリゴd（T）プライミングによって生じた可能性がある。この分析を拡張して、確実な3'末端をもつラージ・インサート細菌コンティグに全ESTを含めた。残り26個のうち15個は3'末端配列をもっており、8個はポリ（A）+追加シグナルをもっていた。この8個のうち5個のESTはクローニングしたcDNAと関連していた。ポリ（A）+追加信号をもたない残りの7個のうち4個はポリ（A）のゲノムコード化ストレッチをもっていた。
i．ブチロフィリン遺伝子ファミリー
ウシ・ブチロフィリン遺伝子（BT）のヒト相同体をクローニングし、HFEにセントロメアな約480 kbのマッピングを行った（図1）。BTは未知の機能をもつ膜輸送タンパク質であり、ウシ乳の脂肪小球と関連する総タンパク質の40％を占める（Jack et al., J. Biol. Chem. 265:14481-14486（1990））。最近になってTayloerらによりBTのヒト相同体がクローニングされた（Biochem. Biophys. Acta 1306:1-4（1996））。この研究結果によれば、BTはこの領域にあるファミリーの少なくともさらに5メンバーをもつ遺伝子ファミリーの1メンバーであることが分かった（図1）。これらタンパク質の比較を図3に示す。このタンパク質は、関連性の遠い順番に基づいて配列のギャップを最小とするように整列していた。5個のタンパク質それぞれはBTに対する相同性の程度を変えて示している。BTF1（cDNA 21）、BTF2（cDNA 32）、BTF5（cDNA 44）およびBTF3（cDNA 29）はそれぞれ45％、48％、46％および49％がBTと同一であったのに対し、BTF3（cDNA 29）にもつと類似するBTF4（cDNA 23）は26％が同一であるに過ぎなかった。BTとの低い同一性は、主にタンパク質のカルボキシル末端における切断（truncation）によるものである。BTFファミリーは二つのグループに分けられる。BTF1と2はBTあるいはその他のBTFメンバーよりもっと相互に関連しており、BTF5、3および4は共通の発生源をもっているように思われる。染色体にあるこれら遺伝子の順番は、BT遺伝子が二回重複してBTF1とBTF5を生じたのではないかと考えられる。次いでこれら二個の遺伝子がさらに重複を繰り返してこれらグループの他のメンバーを生じるようである。
BTの主要な三成分である、B-Gイムノグロブリンのスーパーファミリー・ドメイン（Vコンセンサス配列を含む）（Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:4377-4381（1991））、トランスメンブラン領域およびB30-2エクソンはこれらタンパク質のすべてに見出される（BTF4（cDNA 23）は例外で、カルボキシル末端の切断によりB30-2エクソンを欠如する）。エクソンB30-2は、HLA-A遺伝子にセントロメアな約200 kbのMHCクラス1領域について先に観察された特徴である（Vemet et al., J. Mol. Evol. 37:600-612（1993））。さらにこのエクソンはHLA-Aにテロメアな多様性機能をもつ複数の遺伝子、すなわち、MOG（約200 kb）およびRFP（約1メガベース）（Amadou et al., Genomics 26:9-20（1995））にも見出される。
BTF mRNAのレベルを、ノーザン・ブロット分析により分析した（図4A）。BTF遺伝子の発現は二つのパターンに分かれる。BTF1とBTF2は単一の2.9 kb主転写物および1個の5.O kb副転写物として発現した。これらの遺伝子は試験した組織すべてにおいて高レベルで発現した。例外は腎臓で、その発現レベルは低かった。2個の遺伝子はDNA配列レベルと90％同一であり、従ってノーザンで観察したシグナルは交差ハイブリッド形成の結果であり、二遺伝子の一方だけを実際に発現させることが可能である。この可能性について、組織依存性であると思われる発現を検出するため、異なる組織のパネルにつきRT-PCR実験を行った。組織依存性であれば両方の遺伝子が発現すると思われる。BTF1、BTF2両方の増幅により、同一の従って両義的な結果が得られた（図4B）。
第二の遺伝子グループ、BTF3-5は4.0〜3.3 kbの3個（BTF5）の転写物（図4A）および2個（BTF3および4）の転写物として発現される。BTF5は、発現レベルが小さい腎臓を除いて、試験したすべての組織で中程度のレベルで発現する。RT-PCR実験により、試験された組織すべて（腎臓を含む）にBTF5遺伝子から得られたmRNAを見出せることが分かった（図4B）。このグループの他の遺伝子からのプライマーでも同一の結果が得られた（データ示さず）。これらの遺伝子もまたDNA配列レベルにおいて互いに90％同一である（しかしBTF1および2との同一性は58％に止まる）従ってBTF1やBTF2のように、交差ハイブリッド形成はノーザン・ブロットおよびRT-PCRのサイズおよびパターンにおける類似性の原因を説明することができた。これはB30-2エクソンのないBTF4については特に真実であるが、BTF5やBTF3のように大きいサイズの転写物に対してはなおハイブリダイズする。
ii．52 kDのRo/SSA自己抗原に類似する遺伝子
約120 kbに在るHFE遺伝子にテロメアな遺伝子RoRetは、全身性紅斑やセーレンセン症候群の患者がもつ抗体によってしばしば認識される、機能未知の自己抗原である52 kD Ro/SSAタンパク質に対して58％アミノ酸類似性をもっている（Anderson et al., Lancet 2:456-560（1961）; Clark et al., J. Immunol. 102:117-122（1969））（図1、2）。このcDNAの予想アミノ酸配列を52 kDのRo/SSAのそれと整列させると52 kDのRo/SSAタンパク質に関連する二つの特徴が示された。N末端にある推定DNA結合システインに富むモチーフ（C-X-（I,V）-C-X（11-30）-C-X-H-X-（F,1,L）-C-X（2）-C-（1,L,M）-X（10-18）-C-P-X-C）［Freemont et al. Cell 64:483-484（1991）］およびカルボキシル末端近くにあるB30-2エクソンは共にRoRetに保存されている（図5）。ノーザン・ブロッティング分析によれば、RoRet遺伝子は、β-アクチンプローブ法により測定したRNAカバレージを反映する濃度をもつブロット上の組織すべてにおいて、2.8および2.2 kbの二つの主転写物および7.1、4.4 kbの二つの副転写物として発現することが分かった（図6A）。RT-PCRを用いて、小腸、腎臓、肝臓および脾臓でも発現を検出することができる（図6B）。
iii．リン酸ナトリウム・トランスポーターと相同な二個の遺伝子
リン酸ナトリウム・トランスポーター・タンパク質（NPT1）のcDNAを予めクローニングしておき、体細胞ハイブリッドパネルを用いて6pZ1,3にマッピングした（Chong et al., Genomics 18:355-359（1993））。NPT1はHFE遺伝子にテロメアな320 kbマッピングを行う（図1、2）。NPT1に対して相同性を示すさらに二個のcDNAをクローニングした（図5）。これらの遺伝子、NPT3とNPT4は、NPT1遺伝子に対してセントロメアな1.5メガベースおよび1.3メガベースをマッピングした（図1）。NPT1と同様に、NPT3とNPT4の遺伝子生成物は極めて疎水性であり、これはメンブランの位置を反映している。両タンパク質とも本研究ではNPT1と区別できない疎水性のプロフィルを与えた（データ図示せず）。ノーザン・ブロッティング分析によって、二個の遺伝子が異なる発現パターンをもっていることが分かった（図6C）。NPT3は、筋肉および心臓で優勢な7.2 kb転写物として高レベルの発現を示した。少量のmRNAも脳、胎盤、肺、肝臓および膵臓に見つかった。RT-PCR分析により、NPT3の適切なサイズのPCRフラグメントは、胎児脳、脊髄および小腸では発現しないことが明らかになった（図6D）。小さいサイズのフラグメントは、肝臓を除く全組織で検出可能であった。これは代替スプライシングの証拠を示しているのかもしれない。ノーザン・ブロッティング分析では腎臓での発現は明らかに観察できなかったが、RT-PCRによって検出することができた。乳腺、脾臓および睾丸でも発現が示された。一方NPT4は約2.6-1.7 kb転写物のスミアとして肝臓および腎臓だけで発現した（図6C）。これらの結果はRT-PCRにより確認された。ただし適当なサイズのPCRフラグメントの少量が小腸と睾丸にも見出された（図6D）。他の組織は増幅を示したが、そのフラグメントはcDNA２２Eポジティブコントロールによってできたものよりサイズが大きいものと小さいものであった。従って、リン酸ナトリウム・トランスポーターの構造的な特徴をもつことが明らかなこれら二個の遺伝子は、異なる制御メカニズムの支配下にあるようであり、そのメカニズムは区別的な発現パターンの結果として表れている。
2．ホモ接合祖先（に影響された）個体からの235 kbのシークエンシング
これらの研究において、フランキング・マーカーD6S2238およびD6S2241間にHFE遺伝子を取り囲む235,033 bp領域に相当する領域について、HHの影響を受けた個体から全ゲノム配列を決定した。その配列は、祖先のHH突然変異および領域に対してホモ接合性であるヒトのリンパ芽球細胞株HC14由来であった。祖先の染色体（図9）から得られた配列を、係属中の米国特許出願08/724,394に開示されている、影響を受けていない個体（図8）の領域配列と対比して、多型部位の同定を行った。そのようにして特定した多型の対立遺伝子サブセットをさらに検討してランダム個体集合における頻度を測定した。
HC14細胞株は1997年6月25日ATCCに寄託し、ATCC CRL-12371と称する。
a．コスミド・ライブラリーのスクリーニング
影響を受けた個体のゲノムDNAをシークエンシングするストラテジーと方法論は本質的には係属中の米国特許出願08/724,394に記載された通りであり、その全文を引用により本明細書に取り込むものとする。基本的に、コスミド・ライブラリーは高分子量のDNAを用いてHC14細胞から構築した。ライブラリーはスーパーcosベクター（Strategene, La Jolia, CA）で構築した。標準手法に従って、コロニーをBiotransナイロンフィルター（ICN）に複製した。米国特許出願08/724,394に開示された影響を受けていない配列の配列生成に使用したゲノムサブクローンをゲル電気泳動およびエレクトロポレーションにより分離した。235 kb領域全体に約20 kbの間隔をおいてサブクローンを選択した。ランダム・プライマー標識アプローチにより32P dCTPを入れて、そのDNAを標識した。ポジティブにハイブリッド化するクローンを二次スクリーニング段階の純度まで分離した。コスミド・インサート末端をシークエンシングして完全なカバレージが得られたかどうか、どのクローンが235 kb領域を通る最小コスミド経路を形成したのかを決定した。
b．試料のシークエンシング
235 kb領域をカバーするように選択された最小セットのコスミド・クローンをQiagen Maxi-Prepシステムにより準備した。各コスミド標品から得られた10μgのDNAをHeat Systems Sonicator XLで超音波処理し、クレノー（USB）およびT4 DNAポリメラーゼ（USB）により末端修復を行った。せん断したフラグメントは、0.7％アガロースゲル上でサイズを選択し、次いでBStXIリンカー（Invitrogen）にライゲーションした。ライゲーションしたものは0.7％アガロースゲルにてゲル精製を行い、pSP72由来のプラスミド・ベクターにクローニングした。得られたプラスミドをエレクトロコンピーテントなDH5α細胞に形質転換し、LB-カルベニシリンプレートで平板培養した。十分量のコロニーを釣り上げて15倍のクローン・カバレージとした。一本鎖配列（single-fold sequence）カバレージとなるよう、次式に従い適当なコロニー数を計算した。
コロニー数＝細菌クローンのサイズ（kb）/平均配列読み長さ（0.4 kb）
これらのコロニーを96穴Qiagen REAL、そして5'から3'へのDNA Prep Kitに調製し、標準ABI Dye Terminatorプロトコールを用いて、オリゴMAP1でAGCTの末端シークエンシングを行った。MAP1はCGTTAGAACGCGCTACAATであった。
c．ゲノムのシークエンシング
コスミド・クローンHC182、HC187、HC189、HC195、HC199、HC200、HC201、HC206、HC207およびHC212から得られたMAP1配列をStadenパッケージ（Roger Staden, MRCより入手可）でコンティグに再構築した。プラスミド・ベクターの反対側に在るオリゴ標識MAP2でのシークエンシング用に3 kbクローンの最小セットを選択した。MAP2の配列はGCCGATTCATTAATGCAGGTであった。MAP2配列を、MAP1配列と共にStadenデータベースに入れてその領域にわたる3 kbクローンのタイリング経路を作った。96穴フォーマットでプラスミド3 kbライブラリーを同時に（pox38URC. Martin, Lawrence Berkeley Laboratoriesより入手可）へ形質転換した。次に96穴フォーマットで形質転換体をJGM（Strathman et al,, P.N.A.S. 88:1247-1250（1991））と接合した。タイリング経路内の3 kbクローン接合はすべて、LB-カルベニシリン-カナマイシン平板上の画線培養により行った。3 kbクローン当たりコロニー12個のランダム選択を予めAGCT系で行った。オリゴ21：CTGTAAAACGACGGCCAGTCおよびREV：GCAGGAAACAGCTATGACCを用いてトランスポゾンの両末端からシークエンシングを行った。その領域の全コスミド・クローンから得られた末端配列情報と共に3 kbクローンをそれぞれ再構築した。
いくつかの領域では、コスミドによるゲノム配列のカバレージが不完全であった。配列中のギャップは標準PCR法を用いて埋め、これら領域のゲノムDNAを増幅し、標準ABI染料ターミネーター化学により増幅生成物のシークエンシングを行った。
d．多型部位の同定
FASTAアルゴリズムを用いて、PCRで増幅したゲノムDNAに関連するコスミド・クローンの再構築配列を、影響を受けていない個体のゲノム配列と比較した。配列領域に1から235,303の数値を与えた。塩基1はD6S2238のCAリピートにおける最初のCを指し、塩基235,303は影響を受けていない配列のD6S2241のGTリピートにおける最後のTを指す（図8）。表1に、この比較された二配列の差を示す。先に開示された（Feder et al., Nature Genetics, 13:399-408（1996））多型の部位である、D6S2238（塩基1）、D6S2241（塩基235,032）、24d1（塩基41316）およびD6S2239（塩基84841）は祖先配列中に観察されたが、これらは新しい多型のリストには含まれていない。これらの多型部位は表の脚注に引用するに止める。表中、C-Tのごとき単一塩基の変更とは、影響を受けた配列の対応位置にTとして表れる、指示塩基位置の影響を受けない配列におけるCを意味する。同様に、影響を受けた配列におけるTTTのような、一またはそれ以上の塩基の挿入は、影響を受けていない配列の指定塩基の間に「TTT INS」として表示する。影響を受けた配列に生じる一またはそれ以上の塩基の削除は、AAA DELのように、影響を受けていない配列の指定塩基の削除として表示する。
e．稀少多型の特性化
本研究では、表1のうち約100の多型を任意に選択してさらに特性化を行った。ランダムDNA集団を用いて、全集団における対立遺伝子頻度をOLA分析により算定した（the "CEPH" collection, J. Dausset et al., Genomics, 6（3）:575-577（1990））。結果を表2に示す。
塩基35983に生じC182.1G7T/Cと呼ぶ単一塩基対の差（反対側鎖におけるAからGへの変化）は、祖先の染色体に在りランダムDNA中ではまれであった。この変化は、24d1（Cys282Tyr）突然変異から約5.3 kbのエクソン7近辺にあるヘモクロマトーシス遺伝子の非コード領域で生じた。OLAを用いて、C182.1G7T/C塩基対変化についてヘモクロマトーシス患者90名の遺伝子型を調べた。ランダムDNAでは5％であるのに対し、患者中この位置に発生するCの頻度は79.4％であった。測定した患者90名のうち85名が、同一の24d1およびC182.1G7T/C遺伝子型を持っていた。残り5名のうち4名の患者は24d1においてホモ接合性、C182.1G7T/Cでヘテロ接合性であった。1名は24d1においてヘテロ接合性、C182.1G7T/Cにおいてホモ接合性であった。この分析に使用したプライマーを以下に挙げる。
検出用PCRプライマー:

検出アッセイ用、使用したビオチン化プライマーは以下の通りであった。

使用したリン酸化ジゴキシゲニン標識プライマー:

さらにまれな単一塩基対変化が61,465 bpで検出された。この多型、C195.1H5C/T（反対鎖でのGからAへの変化）の遺伝パターンは24d1のそれと同一である。患者76名のグループで観察されたその位置（C195.1HT）でおこるTの頻度は78.5％であったのに対し、ランダムな個人では5％であった。
検出用PCRプライマー:

検出アッセイ用、使用したビオチン化プライマーは以下の通りであった。

使用したリン酸化ジゴキシゲニン標識プライマー：

従って、これらの微量対立遺伝子は24d1の好ましい代理マーカーであり、24d1および/または24d2が存在する可能性がある場合のスクリーニング・アッセイには特に有用である。
本明細書中に引用した刊行物、特許および特許出願はすべて引用によりその全体をここに取り込むものである。

Claims (11)

1. 配列番号２１に表わされる配列からの少なくとも18〜100の連続塩基からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補体であって、配列番号２１の多型部位C182.1G7である塩基35935もしくはその相補体を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補体。
2. 配列番号２１に表わされる配列からの少なくとも18〜100の連続塩基からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補体であって、配列番号２１の多型部位C195.1H5である塩基61408もしくはその相補体を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補体。
3. 配列番号２１由来またはその相補体の核酸配列を増幅するための、多型部位C182.1G7を含む、配列番号４０および配列番号４１からなるオリゴヌクレオチド対。
4. 配列番号２１由来またはその相補体の核酸配列を増幅するための、多型部位C195.1H5を含む、配列番号４５および配列番号４６からなるオリゴヌクレオチド対。
5. 個体由来のDNAまたはRNAサンプル中の共通の祖先型遺伝性ヘモクロマトーシス（HFE）遺伝子の突然変異の有無を請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを用いて判定する方法であって、
   DNAまたはRNAを配列番号２１の多型部位C182.1G7である塩基35935の多型部位におけるG遺伝子型または配列番号２１の相補体の相補部位におけるC遺伝子型の有無について評価することを含んでなり、多型部位C182.1G7におけるG遺伝子型の不存在または相補部位におけるC遺伝子型の不存在がサンプルを採取した個体のゲノムにHFE遺伝子突然変異が存在しない可能性を示し、多型部位C182.1G7におけるG遺伝子型の存在または相補部位におけるC遺伝子型の存在がサンプルを採取した個体のゲノムにHFE遺伝子突然変異が存在する可能性を示すものである、前記方法。
6. 個体由来のDNAまたはRNAサンプル中の共通の祖先型遺伝性ヘモクロマトーシス（HFE）遺伝子の突然変異の有無を請求項２記載のオリゴヌクレオチドを用いて判定する方法であって、
   DNAまたはRNAを配列番号２１の多型部位C195.1H5である塩基61408の多型部位におけるA遺伝子型または配列番号２１の相補体の相補部位におけるT遺伝子型の有無について評価することを含んでなり、多型部位C195.1H5におけるA遺伝子型の不存在または相補部位におけるT遺伝子型の不存在がサンプルを採取した個体のゲノムにHFE遺伝子突然変異が存在しない可能性を示し、多型部位C195.1H5におけるA遺伝子型の存在または相補部位におけるT遺伝子型の存在がサンプルを採取した個体のゲノムにHFE遺伝子突然変異が存在する可能性を示すのである、前記方法。
7. ＤＮＡまたはＲＮＡ遺伝子型を、次の多型24d1、HHP-1、HHP-19もしくはHHP-29；または次のマイクロサテライト反復対立遺伝子19D9:205、18B4:235、1A2:239、1E4:271、24E2:245、2B8:206、3321-1:98、4073-1:182、4440-1:180、4440-2:139、73-1:177、509-1:148、3216-1:221、4072-2:170、950-1:142、950-2:164、950-3:165、950-4:128、950-6:151、950-8:137、63-1:151、63-2:113、63-3:169、65-1:206、65-2:159、68-1:167、241-29:113、373-8:151、373-29:113、D6S258:199、D6S105:124、D6S306:238、D6S464:206またはD6S1001:180のうちの少なくとも１つの存在について評価することをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
8. DNAまたはRNA遺伝子型を、サンプル中の、配列番号２１の位置232673、217062、209662、202259、196737、162207、130937、126209、101657、61408、40383もしくは38478、または配列番号２１に相補的なストランド中の位置232673、217062、209662、202259、196737、162207、130937、126209、101657、61408、40383もしくは38478に相補的な位置における少なくとも１つの多型部位の存在について評価することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
9. DNAまたはRNA遺伝子型を、サンプル中の、配列番号２１の位置232673、217062、209662、202259、196737、162207、130937、126209、101657、40383もしくは38478、または配列番号２１に相補的なストランド中の位置232673、217062、209662、202259、196737、162207、130937、126209、101657、40383、38478もしくは35935に相補的な位置における少なくとも１つの多型部位の存在について評価することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
10. 請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドまたはその相補体を１以上含んでなるキット。
11. 請求項３または４に記載のオリゴヌクレオチド対を少なくとも１つ含んでなるキット。

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