JP3989936B2

JP3989936B2 - 抗腫瘍剤及び新規ｄｎアーゼ

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Description

本発明は、抗腫瘍剤及び新規ＤＮアーゼに関する。

癌細胞の大きな特色として無秩序な増殖能が挙げられる。抗腫瘍剤の多くはＤＮＡを標的とし、損傷を受けたＤＮＡが特異的なアポトーシス経路を活性化することがわかっている。アポトーシスは、単なる細胞の崩壊過程であるネクローシス（壊死）とは異なり、遺伝子により制御された能動的な細胞死である（非特許文献１）。

ＤＮＡを標的とし、ＤＮＡに損傷を与える抗腫瘍剤としては、例えば、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、又はＡｒａ−Ｃ（arabinose-C）等が公知である。アルキル化剤は、ＤＮＡの塩基部分をアルキル化修飾（アダクト形成）することにより、また、トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼとＤＮＡとの中間複合体（Cleavable complex）を安定化させることにより、それぞれ、不可逆的なＤＮＡ切断を引き起こす。また、Ａｒａ−Ｃは、ＤＮＡの素材であるデオキシアデノシンと誤認されてＤＮＡに取り込まれるこにより、ＤＮＡポリメラーゼを阻害してＤＮＡ損傷を引き起こす。
これらの抗腫瘍剤によりＤＮＡに損傷が与えられると、最終的にはＤＮアーゼによりアポトーシスが引き起こされ、癌細胞が排除される。

しかしながら、ＤＮアーゼそれ自体を抗腫瘍剤として使用することは全く知られておらず、しかも、ＤＮアーゼが正常細胞には作用せず、癌細胞にのみ特異的に作用することは全く知られていなかった。また、制限酵素がＤＮＡを特定認識部位で切断することが公知であるにもかかわらず、制限酵素それ自体を抗腫瘍剤として使用することは全く知られておらず、しかも、制限酵素が正常細胞には作用せず、癌細胞にのみ特異的に作用することは全く知られていなかった。

「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（British Journal of Cancer）」，（英国），1972年，第26巻，p. 239

本発明の課題は、正常細胞には作用せず、癌にのみ特異的に作用することによって、副作用の少ない抗腫瘍剤を提供し、更に、その有効成分として有用な新規ＤＮアーゼを提供することにある。

前記課題は、本発明による、ＤＮアーゼを有効成分として含有する抗腫瘍剤により解決することができる。
本発明の抗腫瘍剤の好ましい態様によれば、ＤＮアーゼとリポソームとの複合体を有効成分として含有する。
本発明の抗腫瘍剤の別の好ましい態様によれば、前記ＤＮアーゼは、制限酵素、あるいは、後述する新規ＤＮアーゼ（例えば、ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ又はＨｅＬａＤＮアーゼ）である。

また、本発明は、下記の性質を有するＤＮアーゼ（以下、ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼと称する）：
（ａ）作用及び基質特異性：エンドヌクレアーゼ活性を有する。
（ｂ）分子量：４８〜４３ｋＤａ（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）
（ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ３．０〜４．５である。
（ｄ）熱安定性：１００℃での１０分間の加熱によっても、エンドヌクレアーゼ活性が失活しない。
（ｅ）プロテナーゼＫとの反応性：３７℃での１５分間の反応により、エンドヌクレアーゼ活性が失活する。
に関する。

更に、本発明は、下記の性質を有するＤＮアーゼ（以下、ＨｅＬａＤＮアーゼと称する）：
（ａ）作用及び基質特異性：エンドヌクレアーゼ活性を有する。
（ｂ）分子量：６３ｋＤａ（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）
（ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ３．０〜４．５である。
（ｄ）熱安定性：１００℃での１０分間の加熱により、エンドヌクレアーゼ活性が失活する。
（ｅ）プロテナーゼＫとの反応性：３７℃での１５分間の反応によっても、エンドヌクレアーゼ活性は失活しない。
に関する。

本発明の抗腫瘍剤は、各種癌培養細胞に対して細胞増殖抑制効果を示すが、正常細胞に対しては細胞増殖抑制効果を示さない。従って、本発明の抗腫瘍剤は、癌にのみ特異的に作用するため、副作用の少ない抗腫瘍剤である。
また、本発明の新規ＤＮアーゼ、あるいは、本発明の抗腫瘍剤の有効成分として用いることのできる制限酵素は、各種癌培養細胞に対して細胞増殖抑制効果を示すが、正常細胞に対しては細胞増殖抑制効果を示さない。従って、本発明の新規ＤＮアーゼ、あるいは、前記制限酵素は、本発明の抗腫瘍剤の有効成分として有用である。

［１］本発明の抗腫瘍剤
本発明の抗腫瘍剤は、その有効成分として、ＤＮアーゼを含有する。前記ＤＮアーゼとしては、腫瘍細胞に対して細胞増殖抑制作用を示し、且つ正常細胞に対して細胞増殖抑制作用を示さないＤＮアーゼである限り、特に限定されるものではない。本発明の抗腫瘍剤の有効成分として用いることのできるＤＮアーゼとしては、例えば、本発明のＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ、本発明のＨｅＬａＤＮアーゼ、ＤＮアーゼII、ＤＮアーゼＩ、ＮＵＣ１８、ＤＮアーゼＶ、ＤＮアーゼVI、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋ヒトエンドヌクレアーゼ、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋ウシエンドヌクレアーゼ、又はＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋ラットエンドヌクレアーゼ）、Ｍｇ^２＋ラットエンドヌクレアーゼ、ラット中性ＤＮアーゼ、ウシ核エンドヌクレアーゼ、ＣＨＯ酸性エンドヌクレアーゼ、ラットＤＮアーゼα、ラットＤＮアーゼβ、ラットＤＮアーゼγ、又は各種制限酵素などを挙げることができる。また、ＤＮアーゼ活性のみを有する酵素だけでなく、ＤＮアーゼ活性以外の酵素活性を一緒に有する酵素、例えば、トポイソメラーゼII（ジャイレース）、インテグラーゼ（例えば、λインテグラーゼ）などを挙げることができる。

ＤＮアーゼは、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼであることができ、エンドヌクレアーゼであることが好ましい。また、本発明の抗腫瘍剤においては、これらのＤＮアーゼの内、１種類のみを単独で用いることもできるし、あるいは、２種類以上を組合せて（例えば、エンドヌクレアーゼ同士の組合せ、エキソヌクレアーゼ同士の組合せ、又はエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの組合せ）使用することもできる。

或るＤＮアーゼが、腫瘍細胞に対して細胞増殖抑制作用を示し、且つ正常細胞に対して細胞増殖抑制作用を示さないＤＮアーゼであるか否かは、例えば、公知の抗腫瘍作用測定方法［例えば、ＭＴＴ法（J. Virol. Methods, 20, 309-321, 1988；Journal of Virological Methods, 20, 309, 1988）］を用いることにより、当業者であれば容易に決定することができる。

ＭＴＴ法を用いる場合には、例えば、後述の実施例４に記載の手順により、評価対象ＤＮアーゼが、腫瘍細胞に対して細胞増殖抑制作用を示し、且つ正常細胞に対して細胞増殖抑制作用を示さないＤＮアーゼであるか否かを決定することができる。より具体的には、評価用の細胞として、癌培養細胞（例えば、ＭＫＮ−２８細胞又はＨｅＬａ細胞）及び正常細胞（例えば、ＭＲＣ−５細胞又はＨＥＦ細胞）を用意し、各細胞の細胞浮遊液を調製しておく。マイクロプレートの各ウェルに、適当な希釈系列（例えば、２倍、４倍、８倍、１６倍、及び３２倍希釈）の評価対象ＤＮアーゼ溶液を分注し、次いで、前記細胞浮遊液を添加した後、所定期間（例えば、４日間）培養する。培養終了後、ＭＴＴ［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide；Sigma chemical Co.］溶液を各ウェルに添加し、所定期間（例えば、３７℃、４時間）インキュベートした後、培養上清を除き、ＭＴＴ溶液を加える。プレート振盪後、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍ及び６９０ｎｍの２波長測光でＯＤ値を測定し、ＩＣ_５０値を算出する。ＩＣ_５０値は、細胞対照（抗腫瘍剤を加えない）の増殖を５０％に抑制する試験液の希釈倍数又は薬剤濃度（例えば、μｇ／ｍＬ）を示す。従って、前記希釈倍数が高ければ高いほど、あるいは、前記薬剤濃度が低ければ低いほど、効果の高い薬剤（物質）であると判定することができる。

本発明の抗腫瘍剤の有効成分として用いるＤＮアーゼとしては、本発明のＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ若しくはＨｅＬａＤＮアーゼ、又は制限酵素が好ましい。
正常細胞の癌化の原因の１つとして、正常細胞に存在するプロト癌遺伝子の点突然変異が知られている。例えば、ヒト癌遺伝子である活性型ｃ−ｒａｓ（Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ）は、プロトｒａｓ遺伝子の特定のコドンに点突然変異が生じ、癌活性化したものである。

例えば、ヒト由来肺癌培養細胞Ａ５４９は、ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２の１２番目のコドンの塩基配列５’−ＧＧＴ−３’（Ｇｌｙ）が５’−ＡＧＴ−３’（Ｓｅｒ）に、すなわち、コドンの３つの塩基の内、１番目の塩基ＧがＡに変化して癌細胞へと変化したものである。前記Ａ５４９細胞では、ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２の１１及び１２番目の塩基配列は、変異前はＧＣＴＧＧＴであり、変異後はＧＣＴＡＧＴに変化する。変化後の塩基配列ＧＣＴＡＧＴ中の配列「ＣＴＡＧ」は、制限酵素ＸｓｐＩの切断認識配列「Ｃ：ＴＡＧ」（記号「：」は切断箇所を示す）であるので、本発明の抗腫瘍剤を、Ａ５４９細胞と同じ点突然変異により癌化した腫瘍に対して使用する場合には、その有効成分として、例えば、制限酵素ＸｓｐＩを選択することができる。また、同じ塩基配列を認識するアイソシゾマーも選択可能である。なお、制限酵素ＸｓｐＩは、変異前の塩基配列ＧＣＴＧＧＴを切断しないので、正常細胞に対しては影響を与えない。

このように、本発明では、治療対象である腫瘍の種類に応じて、その点突然変異の塩基配列に基づいて、適当な制限酵素を適宜選択することができる。その具体例を表１に示す。表１において、「変異前コドン」欄の括弧内の数字はコドン番号を意味する。「変異後コドン」欄において、小文字で示す塩基は変異した塩基を意味し、塩基配列中の下線は制限酵素の認識配列を意味する。

《表１》
プロト変異後
腫瘍（培養細胞）癌遺伝子変異前コドンコドン制限酵素
肺癌 (A549) c-Ki-ras2 GCT GGT (11,12) GCTaGT XspI, BfaI
FspBI, MaeI
結腸腺癌 (HCT116) c-Ki-ras2 GGC GTA (13,14) GaCGTA MaeII
HpyCH4IV
膵臓腺癌 (PSN1) c-Ki-ras2 GGA GCT GGT GGAGCTcGT BanII, Eco24I
(10,11,12) EcoT38I, FriOI
Bsp1286I, BmyI
MhII
前骨髄性白血病 (HL60) N-ras CAA GAA (61,62) CtAGAA XspI, BfaI
FspBI, MaeI
急性リンパ芽球性白血病 N-ras GCA GGT (11,12) GCAtGT NlaIII, CviAII
(MOLT-4) Hsp92II, FatI
膀胱癌 (T24) c-Ha-ras1 GCC GGC GGT GCCGtCGGT Hpy99I
(11,12,13)
黒色腫 (SK2) c-Ha-ras1 CAG GAG (61,62) CtGGAG BpmI, GsuI
乳癌肉腫 (HS578T) c-Ha-ras1 GGC GGT (12,13) GaCGGT HpyCH4III
Bst4CI, TaaI
肺癌 (PR310) c-Ki-ras2 CAA GAG (61,62) CAtGAG NlaIII, CviAII
Hsp92II, FatI

本発明の抗腫瘍剤は、ＤＮアーゼをそれ単独の形で含有することもできるが、ＤＮアーゼとリポソームとの複合体の形で含有することが好ましい。
本発明において用いることのできるリポソームは、例えば、リン脂質、糖脂質、又はコレステロールなどの脂質分子及び／又は界面活性剤などにより調製させるリポソームであることができ、一枚膜リポソーム又は多重膜リポソームのいずれも有効である。

リポソームを調製することのできるリン脂質としては、一般的に、例えば、グリセロリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、又はカルジオピン）、あるいはスフィンゴリン脂質（スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、又はセラミドホスホリルグリセロール）を挙げることができる。
また、リポソームを調製することのできる糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質（ジガラクトシルジグリセリド、又はセミノリピド）、あるいはスフィンゴ糖脂質（ガラクトシルセラミド、又はラクトシルセラミド）を挙げることができる。
また、リポソームを調製することのできる界面活性剤としては、例えば、ジセチルホスフェート又はステアリルアミンを挙げることができる。

本発明の抗腫瘍剤が、ＤＮアーゼとリポソームとの複合体を含有する場合には、ＤＮアーゼとリポソームとが同時に複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の形で含有されていれば、それらの存在形態は特に限定されるものではない。前記の複合体としては、例えば、ＤＮアーゼとリポソームとの混合物、又はリポソームによるＤＮアーゼの包埋体若しくはカプセル化物等の形態を挙げることができ、包埋体が好ましい。

前記の包埋体は、例えば、本発明における有効成分であるＤＮアーゼをリポソーム内に封入した形とする方法で調製することができる。すなわち、リポソームの構成脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ジセチルホスフェイト、及びコレステロール）を適当な溶媒（例えば、クロロホルム）に溶解し、適当な容器に分注した後、窒素ガスを吹き込むことにより溶媒を除去し、別に調製しておいたＤＮアーゼ溶液をこの容器に移し、ボルテックスミキサー等にかけた後、所定温度（例えば、３７℃）にて所定時間（例えば、３０分間）インキュベートすることにより、ＤＮアーゼ封入リポソームを調製することができる。

また、本発明の抗腫瘍剤がＤＮアーゼとリポソームとの複合体を含有する場合には、前記複合体中に、熱変性免疫グロブリンＧ（Aggregated IgG）を更に含有することができる。前記熱変性ＩｇＧは、例えば、ヒトＩｇＧ（ヒトIgG Purified; Sigma Chemical Co.）１５ｍｇをリンゲル液１ｍＬに溶解した後、６０℃で１０分間加熱することにより調製することができる［Biochemistry, 15, 452, 1976］。ＤＮアーゼとリポソームとの複合体の１／１００量の上記熱変性ヒトＩｇＧを加え、最終ＩｇＧ濃度を１５０μｇ／ｍＬに調整して使用することができる。
熱変性ＩｇＧはＦｃ受容体と結合することが知られている。従って、熱変性ＩｇＧがリポソーム表面に存在すると、腫瘍細胞膜にはＦｃ受容体が存在することにより、Ｆｃ受容体と結合し、受容体介在エンドサイトーシスを引き起こすため、より高い細胞増殖抑制作用を示すものと考えている［Biochemistry, 15(2), 452-460, 1976］。

本発明の抗腫瘍剤においては、ＤＮアーゼ（好ましくは、ＤＮアーゼとリポソームとの複合体）を、それ単独で、あるいは、所望により薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。また、発明における有効成分であるＤＮアーゼ（好ましくは、ＤＮアーゼとリポソームとの複合体）は、抗腫瘍剤を製造するために使用することができる。

投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。

これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。

非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内、動脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分としての前記ＤＮアーゼ（又は前記複合体）の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の抗腫瘍剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の抗腫瘍剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。

本発明の抗腫瘍剤は、これに限定されるものではないが、ＤＮアーゼ（又は前記複合体）を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
本発明の抗腫瘍剤を用いる場合の投与量は、例えば、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
更に、形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。

本発明の抗腫瘍剤により治療及び／又は予防することのできる癌としては、以下の癌発生部位に限定されるものではないが、例えば、胃癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、口腔癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、肺癌、又は白血病等を挙げることができる。

［２］本発明のＤＮアーゼ
本発明の抗腫瘍剤の有効成分として使用することのできるＤＮアーゼの内、本発明のＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ及びＨｅＬａＤＮアーゼは、それぞれ、新規ＤＮアーゼである。

本発明のＭＫＮ−２８ＤＮアーゼは、例えば、ヒト由来胃癌培養細胞ＭＫＮ−２８（ＲＣＢ１０００，理化学研究所）から取得することができ、以下に示す性質を有する。

（ａ）作用及び基質特異性：エンドヌクレアーゼ活性を有する。
（ｂ）分子量：４８〜４３ｋＤａ（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）
（ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ３．０〜４．５である。
（ｄ）熱安定性：１００℃での１０分間の加熱によっても、エンドヌクレアーゼ活性が失活しない。
（ｅ）プロテナーゼＫとの反応性：３７℃での１５分間の反応により、エンドヌクレアーゼ活性が失活する。

（ｆ）２価陽イオン要求性：Ｃａ^２＋要求性及びＭｇ^２＋要求性はない。Ｍｎ^２＋又はＺｎ^２＋についてはやや依存性（Ｍｎ^２＋では０．０１〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｚｎ^２＋では０．０１〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）が認められる。高濃度（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、又はＺｎ^２＋による阻害作用が認められる。

（ｇ）ＤＮアーゼ阻害剤感受性：Ｇ−アクチン（Globular actin）は、ヌクレアーゼ活性を阻害しない。
オーリントリルカルボン酸（Aurintricarboxylic acid；ＡＴＡ）は、ヌクレアーゼ活性を阻害する。
クエン酸は、ヌクレアーゼ活性を阻害する。
ヨード酢酸（Iodoacetate）は、ヌクレアーゼ活性を阻害する。
硫酸イオン（ＳＯ_４ ^２−）は、ヌクレアーゼ活性を阻害する。
スペルミンは、ヌクレアーゼ活性を弱く阻害する。
Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、又はＺｎ^２＋は、高濃度下（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）ではヌクレアーゼ活性を阻害する。
β−ブチロラクトンは、ヌクレアーゼ活性を阻害しない。
１，３−ブタジエンジエポキシドは、ヌクレアーゼ活性を阻害しない。

本発明のＭＫＮ−２８ＤＮアーゼをヒト由来胃癌培養細胞ＭＫＮ−２８から取得する場合には、例えば、後述の実施例１及び実施例６（９）に記載の手順により取得することができる。すなわち、本発明のＭＫＮ−２８ＤＮアーゼは、例えば、
（１）ＭＫＮ−２８細胞破砕液に硫酸マグネシウム及びＡＴＰを添加した後、遠心し、上清を得る工程、
（２）得られた上清を７０％硫酸アンモニウムにより塩析し、遠心することにより上清を得る工程、及び
（３）得られた上清から、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量４８〜４３ｋＤａの画分を取得する工程
を含む製造方法により調製することができる。
前記工程（３）は、例えば、後述に実施例２の手順に従って、セファクリル（Sephacryl）Ｓ−３００ＨＲを用いて、ＤＮアーゼ活性を指標として目的画分を取得することができる。また、得られた画分を、例えば、実施例３の手順に従って、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ＤＮアーゼ活性を指標として、更に精製することができる。
なお、本発明のＭＫＮ−２８ＤＮアーゼを、本発明の抗腫瘍剤の有効成分として用いる場合には、精製ＤＮアーゼとして用いることもできるし、あるいは、その精製途中の粗製ＤＮアーゼ（例えば、前記工程１又は２で得られる遠心上清、あるいは、前記工程３で得られる画分）として用いることもできる。

本発明のＨｅＬａＤＮアーゼは、例えば、ヒト由来子宮頚癌培養細胞ＨｅＬａ［ＲＣＢ０００７，理化学研究所、又はＡＴＣＣＣＣＬ−２，ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）］から取得することができ、以下に示す性質を有する。

（ａ）作用及び基質特異性：エンドヌクレアーゼ活性を有する。
（ｂ）分子量：６３ｋＤａ（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）
（ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ３．０〜４．５である。
（ｄ）熱安定性：１００℃での１０分間の加熱により、エンドヌクレアーゼ活性が失活する。
（ｅ）プロテナーゼＫとの反応性：３７℃での１５分間の反応によっても、エンドヌクレアーゼ活性は失活しない。

（ｆ）２価陽イオン要求性：Ｃａ^２＋要求性、Ｍｇ^２＋要求性、Ｍｎ^２＋要求性、及びＺｎ^２＋要求性はない。高濃度（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、Ｃａ^２＋又はＭｇ^２＋による阻害作用が認められる。

（ｇ）ＤＮアーゼ阻害剤感受性：Ｇ−アクチンは、ヌクレアーゼ活性を阻害しない。
オーリントリルカルボン酸は、ヌクレアーゼ活性を阻害する。
クエン酸は、ヌクレアーゼ活性を阻害しない。
ヨード酢酸は、ヌクレアーゼ活性を阻害する。
硫酸イオン（ＳＯ_４ ^２−）は、ヌクレアーゼ活性を阻害する。
スペルミンは、ヌクレアーゼ活性を阻害しない。
Ｚｎ^２＋は、ヌクレアーゼ活性を阻害しない。
β−ブチロラクトンは、ヌクレアーゼ活性を阻害しない。
１，３−ブタジエンジエポキシドは、ヌクレアーゼ活性を阻害しない。

本発明のＨｅＬａＤＮアーゼをヒト由来子宮頚癌培養細胞ＨｅＬａから取得する場合には、例えば、後述の実施例１及び実施例６（９）に記載の手順により取得することができる。すなわち、本発明のＨｅＬａＤＮアーゼは、例えば、
（１）ＨｅＬａ細胞破砕液に硫酸マグネシウム及びＡＴＰを添加した後、遠心し、上清を得る工程、
（２）得られた上清を７０％硫酸アンモニウムにより塩析し、遠心することにより上清を得る工程、並びに
（３）得られた上清から、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量６３ｋＤａの画分を取得する工程
を含む製造方法により調製することができる。
前記工程（３）は、例えば、後述に実施例２の手順に従って、セファクリル（Sephacryl）Ｓ−３００ＨＲを用いて、ＤＮアーゼ活性を指標として目的画分を取得することができる。また、得られた画分を、例えば、実施例３の手順に従って、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ＤＮアーゼ活性を指標として、更に精製することができる。
なお、本発明のＨｅＬａＤＮアーゼを、本発明の抗腫瘍剤の有効成分として用いる場合には、精製ＤＮアーゼとして用いることもできるし、あるいは、その精製途中の粗製ＤＮアーゼ（例えば、前記工程１又は２で得られる遠心上清、あるいは、前記工程３で得られる画分）として用いることもできる。

本発明のＤＮアーゼは、癌培養細胞（例えば、ＭＫＮ−２８細胞又はＨｅＬａ細胞）に対して細胞増殖抑制効果を示すが、正常細胞（例えば、ヒト由来胎児肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５又はヒト由来胎児繊維芽細胞ＨＥＦ）に対しては細胞増殖抑制効果を示さない。従って、本発明のＤＮアーゼは、抗腫瘍剤の有効成分として有用である。

本発明のＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ及びＨｅＬａＤＮアーゼ、並びに公知のＤＮアーゼII及びＤＮアーゼＩの各性質を表２及び表３に示す。

《表２》
性質ＭＫＮ−２８ＨｅＬａＤＮアーゼII ＤＮアーゼＩ
ＤＮアーゼＤＮアーゼ
エンドヌクレ有り有り有り有り
アーゼ活性
分子量^ａ） 48-43kDa 63kDa ラット肝 37kDa 30kDa
ブタ脾 45kDa
至適ｐＨ 3.0-4.5 3.0-4.5 ラット肝 4.1 7.0-8.0(細胞外)
ブタ脾 − 5.5(小胞体)
熱安定性耐熱性易熱性 80℃10分間で失
(L,M緩衝液) (A緩衝液) 活
プロテナーゼ失活する失活しない
Ｋとの反応性 (M緩衝液) (A緩衝液)
２価陽イオン本文参照本文参照ブタ肝なし Ca,Mg,Mn要求性
要求性ラット脾なし有り(1種で充分)
ＤＮＡの切断 10塩基ずつ切断
切断様式 3’-P/5’-OH 3’-OH/5’-P
局在性リソソーム細胞外、小胞体
ａ）：ＤＮアーゼＩを除き、ゲル濾過クロマトグラフィーによる。ＤＮアーゼＩには、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの４分子種が知られている。

《表３》
ＤＮアーゼ阻ＭＫＮ−２８ＨｅＬａＤＮアーゼII ＤＮアーゼＩ
害剤感受性ＤＮアーゼＤＮアーゼ
Ｇ−アクチン阻害しない阻害しない阻害しない阻害する
ＡＴＡ阻害する阻害する
クエン酸阻害する阻害しない
ヨード酢酸阻害する阻害する阻害する
硫酸イオン阻害する阻害する阻害する
スペルミン弱く阻害する阻害しない
２価陽イオン Ca,Mg,Mn,Znは Znは阻害しない Znは阻害しない
10mmol/Lで阻害
β−ブチロ阻害しない阻害しない
ラクトン
1,3-ブタジエ阻害しない阻害しない
ンジエポキシド

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：各種癌培養細胞の細胞抽出液の調製》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ヒト由来胃癌培養細胞ＭＫＮ−２８（ＲＣＢ１０００，理化学研究所）及びヒト由来子宮頚癌培養細胞ＨｅＬａ（ＲＣＢ０００７，理化学研究所、又はＡＴＣＣＣＣＬ−２，ＡＴＣＣ）から、それぞれ、細胞抽出液を調製し、更に分画を行った。また、比較のために、正常細胞としてヒト由来胎児肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５（ＲＣＢ０２１１，理化学研究所、又はＡＴＣＣＣＣＬ１７１，ＡＴＣＣ）を使用し、同様の操作を実施した。

具体的には、培養液としてダルベッコ変法イーグル培地を用いて各培養細胞を培養し、単層且つ培養３日目の細胞を用いて、以下の操作を実施した。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で細胞を洗浄後、セルスクレーパーで細胞を集め、ＰＢＳを用いて遠心（１２００ｒｐｍ，５分間）で３回洗浄した。集めた各細胞をＰＢＳ５ｍＬに浮遊させ、総細胞数を８×１０^７個（ＭＫＮ−２８細胞）及び１×１０^８個（ＨｅＬａ細胞）とした。各細胞浮遊液を超音波破砕器［UH-50型；（株）MST製］で５分間（２０ｋＨｚ，５０Ｗ）氷中で処理し、細胞を破壊した。続いて、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）及びＡＴＰを、それぞれ、最終濃度２ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬの量で添加し、３７℃で一晩（２２時間）放置した。

３０００ｒｐｍ及び４℃にて３０分間遠心した後、上清を回収し、７０％硫酸アンモニウム［（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４］で塩析（磨砕硫安を１０ｍＬ当たり４．７２ｇ添加）した。４℃にて１時間塩析した後、１５００ｒｐｍ及び４℃にて１５分間遠心し、上清と沈渣物とに分けた。それぞれを、ＰＢＳを用いて、攪拌しながら４℃で１８時間透析した（ＰＢＳ交換＝４回）。透析後の各溶液をクライオチューブに分注し、−２０℃で保存した。なお、以上の操作は、可能な限り、無菌操作で行った。−２０℃で保存した各サンプルを以下の操作で使用する際には、その使用に先立って、４℃にて１００００ｒｐｍで３０分間遠心し、その上清を使用した。
以下、塩析後の遠心上清をＰＢＳに溶解した後の透析後溶液を、単に「遠心上清」と称し、塩析後の遠心沈渣物をＰＢＳに溶解した後の透析後溶液を、単に「遠心沈渣」と称する。

《実施例２：ゲルクロマトグラフィー（Sephacryl S-300 HR）による培養細胞由来遠心上清のＤＮアーゼ活性（＋）画分の分画》
実施例１で得られた、ＭＫＮ−２８細胞由来遠心上清を、以下の条件で分画した：
ゲル：セファクリル（Sephacryl）Ｓ−３００ＨＲ（球状タンパク質分画範囲＝１×１０^４〜１．５×１０^６；Amersham, 17-0599-01）を使用した。トータルゲルベッド（Total Gel Bed）を１１４．８ｍＬ［＝（０．７５ｃｍ）^２×３．１４×６５ｃｍ］とした。
カラム：１．５ｃｍ（径）×７５ｃｍ（高）のカラム（エコノカラム；Bio-Rad）を使用した。
緩衝液：ＰＢＳ（ｐＨ７．２）。
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ。
分画：２ｍＬ／チューブ。

得られた各画分について、ＤＮアーゼ活性（＋）画分を選択し、更に、その画分に関してλＤＮＡ分解能（Titer）を調べた。
具体的には、各画分の原液を使用し、どの画分にＤＮアーゼ活性があるか調べた後、活性陽性の画分に関して、λＤＮＡ分解能のタイトレーションを行った。なお、ＤＮアーゼ活性及びタイトレーションは、λＤＮＡ分解能を指標とする電気泳動法により確認した。特に、タイトレーションは、各画分を４段階希釈し、λＤＮＡ分解反応物の泳動パターン（λＤＮＡ分解の強弱）からタイターを決定した。

結果を表４に示す。ＤＮアーゼ活性のピークは、Ｎｏ．４０画分を中心に、Ｎｏ．３９〜Ｎｏ．４２画分であった。λＤＮＡ分解能のピーク画分はＮｏ．４０画分で、そのタイターは８０倍であった。従って、イオン交換クロマトグラフィーによる次の精製には、Ｎｏ．３９〜Ｎｏ．４２画分（４画分）を用いることとした。

《表４》
画分Ｎｏ． 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
タイター 20 40(80) 80(160) 40 40 40 40 20 10 5 <5

《実施例３：イオン交換クロマトグラフィーによるＭＫＮ−２８ＤＮアーゼの精製》
実施例２で得られたＤＮアーゼ活性（＋）画分を、エコノパックハイＱ（Econo-Pac High Q）カートリッジ（Stronganion, 732-0094; BIO-RAD）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより更に精製した。
具体的には、実施例２で得られたＤＮアーゼ活性（＋）画分（Ｎｏ．３９〜Ｎｏ．４２画分の混合物）は、緩衝液としてＰＢＳを使用しているため、透析によってハイＱ用緩衝液に置換した後、０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した。この操作後のサンプルにＤＮアーゼ活性があることを確認した後、エコノパックハイＱカートリッジにアプライした。溶出緩衝液には、０．０２〜０．３ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ含有５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を使用し、ＮａＣｌの濃度勾配で溶出を行った。また、流速は、１．５ｍＬ／２ｍｉｎ／画分で行った。

どの画分にＤＮアーゼ活性があるのかは、λＤＮＡ分解能を指標とする電気泳動法により確認した。ＤＮアーゼ活性測定には、画分原液（希釈せず）を使用した。各画分のλＤＮＡ分解能を調べた後、ＤＮアーゼ活性（＋）画分のタイトレーションを行い、ＤＮアーゼ活性のピークを求めた。
結果を表５に示す。ＤＮアーゼ活性のピークは、Ｎｏ．５画分（ＮａＣｌ濃度＝０．０８ｍｏｌ／Ｌ）及びＮｏ．６画分（ＮａＣｌ濃度＝０．１０ｍｏｌ／Ｌ）であった。

《表５》
画分Ｎｏ． 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
NaCl(mol/L) 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20
λDNA分解 − ± ＋ ++ +++ +++ +++’ − ± − −

《実施例４：各種癌培養細胞由来の各画分における細胞増殖抑制効果の検討》
本実施例では、実施例１で調製した、各種癌培養細胞及び正常細胞由来の遠心上清及び遠心沈渣の細胞増殖抑制効果をＭＴＴ法により評価した。
具体的には、評価用の培養細胞としては、癌培養細胞としてＭＫＮ−２８細胞及びＨｅＬａ細胞を使用し、正常細胞としてＭＲＣ−５細胞を使用した。評価用の各培養細胞を３日間培養した後、トリプシンで細胞を分散し、ＰＢＳを用いて遠心で細胞の洗浄を行った。８％ウシ胎児血清含有のダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地（以下、ＧＭと称する）で細胞浮遊液を調製した後、血算盤で細胞数を測定し、細胞数が５０００個／５０μＬ及び２５００個／５０μＬ（ＭＲＣ−５細胞の場合のみ、１００００個／５０μＬ及び５０００個／５０μＬ）になるようにＧＭで調整した。

９６ウェル平底プレートに、実施例１で調製した遠心上清又は遠心沈渣の希釈系列（原液、２倍、４倍、８倍、１６倍、及び３２倍希釈）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、次いで、調整済み細胞浮遊液を５０μＬ／ウェルずつ添加した後、ＣＯ_２インキュベーター中にて３７℃で培養した。培養から３日目又は４日目に、ＭＴＴ溶液を２０μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃で３時間インキュベートした。各ウェル中の培養上清を除去した後、ＭＴＴ溶出液１００μＬを各ウェルに加え、室温で５分間振盪し、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍ及び６９０ｎｍの２波長測光でＯＤ値を測定し、ＩＣ_５０値を算出した。
なお、対照として、遠心上清又は遠心沈渣の希釈系列の代わりに、ＰＢＳを用いた。また、比較のために、遠心上清又は遠心沈渣の希釈系列の代わりに、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の５倍段階希釈液（１００μｇ／ｍＬ，２０μｇ／ｍＬ，４μｇ／ｍＬ，０．８μｇ／ｍＬ，０．１６μｇ／ｍＬ，０．０３２μｇ／ｍＬ）を使用した。

評価用細胞として癌培養細胞であるＭＫＮ−２８細胞を使用し、細胞画分としてＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清又は遠心沈渣を使用した場合のＩＣ_５０値を表６に示す。また、対照としてＰＢＳを使用した場合と、比較のために５−ＦＵを使用した場合の結果も併せて示す。表６（及び後述の表７〜表１０）におけるＩＣ_５０の値は、複数回（２回〜４回）の平均値である。ＩＣ_５０値は、細胞対照（抗腫瘍剤を加えない）の増殖を５０％に抑制する試験液の希釈倍数、すなわち、相対値で示す。あるいは、薬剤濃度（５−ＦＵの場合、μｇ／ｍＬ）で示す。
表６から明らかなように、ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清及び遠心沈渣のいずれも、ＭＫＮ−２８細胞に対して細胞増殖抑制効果を示した。

《表６》
評価用細胞ＭＫＮ（３日培養）ＭＫＮ（４日培養）
細胞数／ウェル 5000 2500 5000 2500
ＭＫＮ上清２．８＜２１１．７５．３３
ＭＫＮ沈渣４．１８２．４８１０．１６．９
ＰＢＳ２．２＜２２．３３．０
５−ＦＵ５．９４．６１４．８３．７

評価用細胞として癌培養細胞であるＨｅＬａ細胞を使用し、細胞画分としてＨｅＬａ細胞由来の遠心上清又は遠心沈渣を使用した場合のＩＣ_５０値を表７に示す。表７から明らかなように、ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清及び遠心沈渣のいずれも、ＨｅＬａ細胞に対して細胞増殖抑制効果を示した。

《表７》
評価用細胞ＨｅＬａ（３日培養）ＨｅＬａ（４日培養）
細胞数／ウェル 5000 2500 5000 2500
ＨｅＬａ上清４．８２．４３．２３．８
ＨｅＬａ沈渣１１．１６．７１０．２２１．５
ＰＢＳ＜２＜２＜２＜２
５−ＦＵ７．３５．０３．６３．６

評価用細胞として正常細胞であるＭＲＣ−５細胞を使用し、細胞画分としてＭＲＣ−５細胞由来の遠心上清又は遠心沈渣を使用した場合のＩＣ_５０値を表８に示す。表８から明らかなように、ＭＲＣ−５細胞由来の遠心上清及び遠心沈渣のいずれも、ＭＲＣ−５細胞に対して細胞増殖抑制効果を示さなかった。

《表８》
評価用細胞ＭＲＣ（３日培養）ＭＲＣ（４日培養）
細胞数／ウェル 10000 5000 10000 5000
ＭＲＣ上清＜２＜２＜２＜２
ＭＲＣ沈渣２．８２．５２．８２．７
ＰＢＳ２．２２．２２．２２．３
５−ＦＵ >100 >100 >100 92.0

評価用細胞として３種類の各細胞を使用し、細胞画分として各細胞由来の遠心上清を使用した場合のＩＣ_５０値を表９（３日培養の場合）及び表１０（４日培養の場合）に示す。
表９及び表１０から明らかなとおり、いずれの細胞由来の遠心上清も、癌培養細胞であるＭＫＮ−２８細胞及びＨｅＬａ細胞に対して増殖抑制効果を示したが、正常細胞であるＭＲＣ−５細胞に対しては増殖抑制効果を示さなかった。細胞由来遠心上清に対する感受性は、ＭＫＮ−２８細胞＞ＨｅＬａ細胞＞ＭＲＣ−５細胞であった。また、後述の実施例６に示すとおり、ＭＫＮ−２８細胞及びＨｅＬａ細胞の遠心上清は、ＤＮＡを分割することより、ヌクレアーゼである。

《表９》
［３日培養］
評価用細胞ＭＫＮＨｅＬａＭＲＣ
細胞数／ウェル 5000 2500 5000 2500 10000 5000
ＭＫＮ上清２．６２．５２．９３．４＜２＜２
ＨｅＬａ上清２．６２．２４．８２．９＜２＜２
ＭＲＣ上清２．７２．２３．６３．５＜２２．１
ＰＢＳ＜２＜２＜２２．１＜２＜２
５−ＦＵ６．０４．６１２．０７．０ >100 >100

《表１０》
［４日培養］
評価用細胞ＭＫＮＨｅＬａＭＲＣ
細胞数／ウェル 5000 2500 5000 2500 10000 5000
ＭＫＮ上清１１．７６．３２．３３．３＜２＜２
ＨｅＬａ上清５．８５．０２．６３．４＜２＜２
ＭＲＣ上清５．０４．１２．５２．７＜２＜２
ＰＢＳ２．２２．４＜２＜２＜２＜２
５−ＦＵ１１．６４．７１３．０６．２ >100 92.0

《実施例５：各種癌培養細胞由来遠心上清のＭＫＮ−２８細胞増殖抑制活性の各種処理に対する耐性》
本実施例では、実施例１で調製した癌培養細胞ＭＫＮ−２８及びＨｅＬａ細胞由来の各遠心上清の性状を探るために、ＲＮアーゼ処理、ＤＮアーゼ処理、又は加熱処理した後、癌培養細胞ＭＫＮ−２８に対する細胞増殖抑制活性を検討した。なお、細胞増殖抑制活性は、実施例４に記載の方法により測定した。結果（ＩＣ_５０値）を表１１に示す。表１１における記号「−」は、測定を実施しなかったことを示す。

ＲＮアーゼ処理（表１１における記号「ＲＮ」）は、細胞抽出物１００μＬに対してＲＮアーゼ（R 5125, Type III A；SIGMA社）１０μｇを用いて、３７℃にて１時間処理することにより、実施した。
ＤＮアーゼ処理（表１１における記号「ＤＮ」）は、細胞抽出物１００μＬに対してＤＮアーゼ（Lot 18600k；Nippon Gene社）１３４ｕｎｉｔを用いて、３７℃にて１時間処理することにより、実施した。

前記ＲＮアーゼ処理及びＤＮアーゼ処理の対照として、３７℃での１時間処理（表１１における記号「37℃」）を実施した。
ＲＮアーゼ又はＤＮアーゼ自体の細胞増殖抑制活性をチェックするために、「ＲＮアーゼ＋ＰＢＳ」処理（表１１における記号「RN-Cont」）及び「ＤＮアーゼ＋ＰＢＳ」（表１１における記号「DN-Cont」）処理を実施した。

加熱処理として、５６℃で３０分間の加熱処理（表１１における記号「56℃」）を実施した。
対照として、ＰＢＳ処理（表１１における記号「PBS」）を実施した。

表１１に示すとおり、ＲＮアーゼ又はＤＮアーゼ処理では、癌培養細胞由来遠心上清の細胞増殖抑制活性は失活することはなく（具体的データは示さないが、ＲＮアーゼＨ処理でも失活しなかった）、５６℃で３０分間の加熱処理でも失活しなかった。これらの結果は、癌培養細胞由来遠心上清中の細胞増殖抑制活性を示す因子が、（１）核酸でなく、（２）加熱により失活しないことが判明した。このことは、実施例６で示すとおり、反応緩衝液が影響したことがわかった。

《表１１》
ＩＣ _５０値（倍）
ＲＮＤＮ 37℃ 未処理 RN-Cont DN-Cont 56℃ PBS
ＭＫＮ上清７.６７.６７.９７.８２.５２.３８.０２.４
ＨｅＬａ上清７.９８.０７.９８.３ − − ９.０ −

《実施例６：癌培養細胞由来遠心上清の性状の検討》
（１）λＤＮＡ及びＭＫＮ−２８細胞ゲノムＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性
本実施例では、実施例１で調製した癌培養細胞ＭＫＮ−２８及びＨｅＬａ細胞由来の各遠心上清に関して、ＤＮＡ分解能を検討した。
各遠心上清は、ＰＢＳを含んでいるため、予めＴＥ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）と置換してから使用した。分解対象ＤＮＡとしては、λＤＮＡ（４８５０２ｂｐ；Takara）と、ＭＫＮ−２８細胞より市販のキット（Genomic Prep. TM cells and Tissue DNA Isolation Kit；Amersham pharmacia biotech.）を用いて抽出したＭＫＮ−２８細胞ゲノムＤＮＡとを使用した。

反応緩衝液としては、Ｌ（Ｌｏｗ）緩衝液（ＮａＣｌ無添加）、Ｍ（Ｍｅｄｉｕｍ）緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ）、及びＨ（Ｈｉｇｈ）緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ）を使用した。なお、各緩衝液は、基本となる組成［１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ_２，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ（Dithiothreitol）］に、前記所定量のＮａＣｌを加えたものである。
反応は３７℃で１時間実施し、反応終了後、電気泳動法によりＤＮＡ分解の程度を観察した。

ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清は、Ｌ又はＭ緩衝液ではいずれのＤＮＡ（すなわち、λＤＮＡ及びＭＫＮ−２８細胞ゲノムＤＮＡ）も分解したが、Ｈ緩衝液ではいずれのＤＮＡも分解しなかった。
ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清は、Ｌ、Ｍ、又はＨ緩衝液の全ての緩衝液において、いずれのＤＮＡ（すなわち、λＤＮＡ及びＭＫＮ−２８細胞ゲノムＤＮＡ）も分解しなかった。

（２）至適緩衝液
前記（１）で使用した反応緩衝液以外の緩衝液として、Ａ緩衝液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｍｅｓバッファー（ｐＨ５．８），１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ_２，３ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ_２］及びＢ緩衝液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｍｏｐｓバッファー（ｐＨ７．０），１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ_２，３ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ_２］を用いて、前記（１）の操作を繰り返した。
ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清は、Ａ緩衝液ではいずれのＤＮＡ（すなわち、λＤＮＡ及びＭＫＮ−２８細胞ゲノムＤＮＡ）も分解したが、Ｂ緩衝液ではいずれのＤＮＡも分解しなかった。
ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清におけるヌクレアーゼ活性は、Ａ緩衝液で顕著であり、Ｂ緩衝液でもλＤＮＡは少し分解された。

（３）加熱処理に対する耐性
各遠心上清を、１００℃で１０分間加熱処理した後、ヌクレアーゼ活性を検討した。
ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清は、加熱処理した後であっても、Ｌ又はＭ緩衝液下にて、λＤＮＡ又はＭＫＮ−２８細胞ゲノムＤＮＡのいずれのＤＮＡも分解した。すなわち、加熱処理により失活しなかった。
ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清は、Ａ緩衝液下にて、加熱未処理の場合にはλＤＮＡを分解するのに対して、加熱処理した場合には、λＤＮＡを分解しなかった。すなわち、加熱処理により失活した。

（４）プロテナーゼＫ処理に対する耐性
各遠心上清を、プロテナーゼＫ処理（３７℃で１５分間）した後、ヌクレアーゼ活性を検討した。
ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清は、Ｍ緩衝液下にて、プロテナーゼＫ未処理の場合にはλＤＮＡを分解するのに対して、プロテナーゼＫ処理した場合には、λＤＮＡを分解しなかった。すなわち、プロテナーゼＫ処理により失活した。
ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清は、プロテナーゼＫ処理した後であっても、Ａ緩衝液下にてλＤＮＡを分解した。すなわち、プロテナーゼＫ処理により失活しなかった。
表１２に、（１）〜（４）のこれまでの結果を示す。

《表１２》
遠心上清 λＤＮＡ MKN-28 DNA 加熱処理プロテナーゼＫ処理至適緩衝液
ＭＫＮ分解する分解する失活しない失活するＡ緩衝液
（耐熱性）（Ｌ，Ｍ緩衝液）
ＨｅＬａ分解する分解する失活する失活しないＡ緩衝液
（易熱性）

（５）至適ｐＨ
各遠心上清のヌクレアーゼ活性の至適ｐＨを、λＤＮＡの分解能を指標として検討した。
λＤＮＡ分解反応を、１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴを添加した５０ｍｍｏｌ／Ｌ各緩衝液［Acetate-HCl (pH 1.0-5.5), MOPS-NaOH (pH 6.0-7.0), Tris-HCl (pH 7.5-8.5)；ｐＨ１．０〜８．５まで０．５刻み］反応液中で、３７℃にて３０分間実施した後、電気泳動法により確認した。
いずれの遠心上清（すなわち、ＭＫＮ−２８細胞由来遠心上清及びＨｅＬａ細胞由来遠心上清）は、ｐＨ４．５以下でλＤＮＡをほとんど完全に分解した。なお、遠心上清を加えずに、同様の操作を実施したところ、ｐＨ２．５以下でλＤＮＡが分解されることが判明した。従って、各遠心上清の至適ｐＨは、３．０〜４．５であることが判明した。

（６）２価陽イオン要求性
各遠心上清の２価陽イオン（Ｃａ^２＋，Ｍｇ^２＋，Ｍｎ^２＋，Ｚｎ^２＋）要求性を、λＤＮＡの分解能を指標として検討した。
各遠心上清は、予めＰＢＳ（Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋フリー）で透析した後、力価を測定し、至適希釈濃度を決定した。ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清は５倍希釈し、ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清は３倍希釈して用いた。
Ｃａ^２＋要求性は３ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ_２を添加した酢酸−ＨＣｌ緩衝液を用いて、Ｍｇ^２＋要求性は３ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ_２を添加した酢酸−ＨＣｌ緩衝液を用いて、Ｍｎ^２＋又はＺｎ^２＋要求性は酢酸−ＨＣｌ緩衝液（Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋フリー）を用いて、それぞれ検討した。なお、各緩衝液のｐＨは、ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清の場合にはｐＨ４．５とし、ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清の場合には、ｐＨ４．０とした。

ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清に関する結果を表１３に示し、ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清に関する結果を表１４に示す。表１３における記号「＋」は、数が多いほど、λＤＮＡの分解の程度が高いことを意味し、記号「（−）」は検討を実施していないことを示す。また、表には示していないが、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋不在下では「+++」であり、緩衝液のみでは「−」（分解されず）であった。

表１３に示すように、ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清（５倍希釈）では、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、又はＺｎ^２＋のいずれの２価陽イオンについても要求（依存）性はなく、高濃度（１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上）では、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋又はＺｎ^２＋による阻害作用が認められた。
なお、ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清の２価陽イオン要求性を高感度で検出するため、４０倍希釈したもの（λＤＮＡ分解検出限界濃度）を用いて同様の実験を行ったところ、Ｃａ^２＋又はＭｇ^２＋については要求（依存）性はなかったが、Ｍｎ^２＋ではやや依存性（０．０１〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）が認められ、Ｚｎ^２＋でもやや依存性（０．０１〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）が認められ、高濃度（１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上）では、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、又はＺｎ^２＋による阻害作用が認められた。

表１４に示すように、ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清（３倍希釈）では、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、又はＺｎ^２＋のいずれの２価陽イオンについても要求（依存）性はなく、高濃度（１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上）では、Ｃａ^２＋又はＭｇ^２＋による阻害作用が認められた。
なお、ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清として２０倍希釈したもの（λＤＮＡ分解検出限界濃度）を用いて同様の実験を行ったところ、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、又はＺｎ^２＋のいずれの２価陽イオンについても要求（依存）性はなく、高濃度（１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上）では、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、又はＺｎ^２＋による阻害作用が認められた。

《表１３》
２価イオン濃度
（mmol/L）０ 0.01 0.03 0.1 0.3 1.0 3.0 10 30
Ｃａ^２＋ +++ (−) +++ (−) +++ (−) +++ + ±
Ｍｇ^２＋ +++ (−) +++ (−) +++ (−) +++ + ±
Ｍｎ^２＋ +++ +++ (−) +++ (−) +++ (−) +++ (−)
Ｚｎ ^２＋ +++ +++ (−) +++ (−) +++ (−) + (−)

《表１４》
２価イオン濃度
（mmol/L）０ 0.01 0.03 0.1 0.3 1.0 3.0 10 30
Ｃａ^２＋ +++ (−) +++ (−) +++ (−) +++ ++ ±
Ｍｇ^２＋ +++ (−) +++ (−) +++ (−) +++ ++ ±
Ｍｎ^２＋ +++ +++ (−) +++ (−) +++ (−) +++ (−)
Ｚｎ ^２＋ +++ +++ (−) +++ (−) +++ (−) +++ (−)

（７）阻害剤感受性
各種阻害剤に対する各遠心上清の感受性を、λＤＮＡの分解能を指標として検討した。
ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清については、５倍希釈したものを使用し、各阻害剤存在下にて、ｐＨ４．５及び３７℃で３０分間インキュベートした後、電気泳動により判定した。また、ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清については、３倍希釈したものを使用し、各阻害剤存在下にて、ｐＨ４．０及び３７℃で３０分間インキュベートした後、電気泳動により判定した。

各阻害剤がλＤＮＡの分解を阻害したか否かを、表１５及び表１６に示す。
表１５において、
記号（Ｇ）は、Ｇ−アクチン（Globular actin，ウシ筋肉由来；Sigma）を意味し、その下の数値（１，１０，１００）はＧ−アクチン濃度（μｇ／ｍＬ）を意味し、
記号（Ａ）は、ＡＴＡ（Aurintricarboxylic acid；Wako）を意味し、その下の数値（１，１０，１００）はＡＴＡ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を意味し、
記号（ｃ）は、クエン酸（クエン酸ナトリウム；Wako）を意味し、
記号（Ｉ）は、ヨード酢酸（Iodoacetate；Nakarai）を意味し、
記号（SO）は、ＳＯ_４ ^２−（ＭｇＳＯ_４；Wako）を意味し、
記号（Zn）は、Ｚｎ^２＋（ＺｎＣｌ_２；Wako）を意味し、
記号（Ｓ）は、スペルミン（Wako）を意味する。
表１６において、
記号（Ｂ）は、β−ブチロラクトン（東京化成工業）を意味し、その下の数値（０．１，１．０，１０）はβ−ブチロラクトン濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）を意味し、
記号（BD）は、１，３−ブタジエンジエポキシド（東京化成工業）を意味し、その下の数値（０．１，１．０，１０）は１，３−ブタジエンジエポキシド濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）を意味する。
また、記号「＋」は、数が多いほど、λＤＮＡの分解を阻害する活性が高いことを意味し、記号「−」は、λＤＮＡ分解の阻害活性がないことを意味し、記号「±」は、弱く阻害することを意味する。

《表１５》
（Ｇ）（Ａ）（Ｃ）（Ｉ）（SO）（Zn）（S）
１ 10 100 １ 10 100
ＭＫＮ − − − ± ++ +++ ++ +++ ++ ++ ＋
ＨｅＬａ − − − − − ++ − ++ ＋ ± −

《表１６》
（Ｂ）（BD）
0.1 1.0 10 0.1 1.0 10
ＭＫＮ − − − − − −
ＨｅＬａ − − − − − −

（８）環状二重鎖ＤＮＡの切断
各遠心上清について、環状二重鎖ＤＮＡ（プラスミドｐＡＣＹＣ１８４；ニッポンジーン，13-0220）の切断の有無を指標として、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼのいずれであるかを検討した。
ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清及びＨｅＬａ細胞由来の遠心上清のいずれも、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４を分解し、エンドヌクレアーゼであると考えられる。

（９）分子量（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）
各遠心上清をゲル濾過クロマトグラフィーにより分画し、本発明のＤＮアーゼを精製すると共に、その分子量を決定した。条件は以下のとおりとした：
カラム：１．５ｃｍ（径）×７５ｃｍ（高）のカラム（エコノカラム；Bio-Rad）を使用した。
ゲル：セファクリル（Sephacryl）Ｓ−３００ＨＲ（球状タンパク質分画範囲＝１×１０^４〜１．５×１０^６；Amersham）を使用した。トータルゲルベッド（Total Gel Bed）を１１４．８ｍＬ［＝（０．７５ｃｍ）^２×３．１４×６５ｃｍ］とした。
緩衝液：ＰＢＳ（ｐＨ７．２）
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
画分：２ｍＬ／チューブ
分子量算出：市販のキット（Gel Filtration Calibration Kits；Amersham Bioscience）を使用した。分子量マーカーとしては、アルブミン（分子量６７０００）、オブアルブミン（分子量４３０００）、及びキモトリプシノーゲンＡ（分子量２５０００）を用いた。

分画終了後、各画分のλＤＮＡ分解能を指標として各画分の力価を測定して、本発明のＤＮアーゼが含まれるピーク画分を決定した。
ＭＫＮ−２８細胞由来の遠心上清を用いた場合には、Ｎｏ．２５及びＮｏ．２６画分がピーク画分であり、その分子量は４８〜４３ｋＤａであった。
ＨｅＬａ細胞由来の遠心上清を用いた場合には、Ｎｏ．２５画分がピーク画分であり、その分子量は６３ｋＤａであった。

《実施例７：ＭＫＮ−２８細胞由来遠心上清含有リポソーム製剤のＭＫＮ−２８細胞増殖抑制効果、リポソームの細胞毒、反応緩衝液、及びそのｐＨに関する評価》
実施例６に示したとおり、ＭＫＮ−２８細胞由来遠心上清はＤＮアーゼである。λＤＮＡ分解を指標とした電気泳動法で調べたＭＫＮ−２８細胞由来遠心上清（ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ）の至適ｐＨは酸性（ｐＨ３．０〜４．５）であった（前述）。培養細胞の増殖に影響を及ぼさない許容範囲内の酸性緩衝液を用いてＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソーム製剤を作製し、細胞増殖抑制効果を調べた。

リポソームは、ホスファチジルコリン（L-α-phosphatidylcholine，卵黄由来；Nakarai）、ジセチルホスフェイト（dicetyl phosphate；sigma）、及びコレステロール（cholesterol；ICN Biochemical Inc.）を７：２：１（モル比）の割合で混合したクロロホルムを蒸散させることにより作製した。
具体的には、まず、ホスファチジルコリン７０μｍｏｌ、ジセチルホスフェイト２０μｍｏｌ、及びコレステロール１０μｍｏｌをクロロホルム１ｍＬに溶解した（７：２：１。１００μｍｏｌ／ｍＬ）。これをクロロホルムで１６倍希釈（６．２５μｍｏｌ／ｍＬ）した後、サンプル瓶に５０μＬずつ分注した（０．３１２５μｍｏｌ／瓶）。次いで、サンプル瓶を回転させながら窒素ガスを注入し、クロロホルムを蒸散させた後、減圧下で更にクロロホルムを蒸散させることにより、リポソーム薄層を調製した。このサンプル瓶に、ＤＮアーゼを溶解した緩衝液（あるいは緩衝液のみ）５００μＬを加えた（０．３１２５μｍｏｌ／５００μＬ＝０．６２５μｍｏｌ／ｍＬ）。

リポソームにＤＮアーゼと共に封入する反応緩衝液として、等張性と組成成分を考慮して、ＰＢＳを使用した。ＰＢＳ中のＫＨ_２ＰＯ_４とＮａ_２ＨＰＯ_４の混合比率を変えることにより、ｐＨ６．０とｐＨ７．２の各緩衝液は容易に調製することができる。反応緩衝液としてＰＢＳが適当であるか、また、ＰＢＳのｐＨの差によって細胞増殖抑制効果にどのような影響が生じるかを比較検討した。

濃縮用メンブレンフィルター（Amicon製）を用いて、ＭＫＮ−２８細胞由来遠心上清（ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ）を濃縮し、ｐＨ６．０及び７．２の各ＰＢＳに置換した。先に調製したリポソーム薄層サンプル瓶に、ＰＢＳ（ｐＨ６．０又は７．２）、あるいは、ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有ＰＢＳ（ｐＨ６．０又は７．２）５００μＬを加え、渦（vortex）撹拌した後、熱変性ヒトＩｇＧ（最終濃度＝１５０μｇ／ｍＬ）を加え、３７℃にて３０分間インキュベートすることにより、熱変性ＩｇＧコート（Agg-IgG coated）ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソーム製剤（ｐＨ６．０及び７．２）を調製した。なお、熱変性ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ（ヒトIgG Purified; Sigma Chemical Co.）１５ｍｇをリンゲル液１ｍＬに溶解した後、６０℃で１０分間加熱することにより調製した。

熱変性ＩｇＧコート（Agg-IgG coated）ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソーム製剤（ｐＨ６．０）及び同製剤（ｐＨ７．２）のＭＫＮ−２８細胞及び正常細胞としてのヒト胎児繊維芽細胞ＨＥＦ（J. Infect. Dis., 163, 270-275, 1991）に対する増殖抑制効果をＭＴＴ法により評価した。
まず、９６ウェルマイクロプレートに、ＧＭで作製した熱変性ＩｇＧコートＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソーム製剤の希釈系列（原液、２倍、４倍、８倍、１６倍、及び３２倍希釈）を５０μＬ／ウェルずつ分注した。次いで、５０００細胞／５０μＬに調整したＭＫＮ−２８細胞浮遊液又はＨＥＦ細胞浮遊液を、各ウェルに５０μＬずつ添加し、培養液を換えることなく、３７℃のＣＯ_２インキュベーターでそのまま培養し、培養４日後にＭＴＴ法によりＩＣ_５０値を算出した。
なお、対照として、熱変性ＩｇＧコートＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソーム製剤の２倍希釈系列の代わりに、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼなし）の２倍希釈系列、ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼのみ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）の２倍希釈系列、及び緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ６．０又は７．２）を用いて同じ操作を行った。

結果を表１７及び表１８に示す。表１７及び表１８において、記号「LP-DN」、「LP(DNなし)」、「DN(LPなし)」、及び「PBSのみ」は、それぞれ、熱変性ＩｇＧコートＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソーム、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼなし）、ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼのみ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）、及びＰＢＳ（緩衝液）のみを意味する。表１７及び表１８に示すＩＣ_５０値は、２〜４回の実験の平均値である。表１７は、癌培養細胞ＭＫＮ−２８に対する増殖抑制効果を示し、表１８は、正常細胞としてのヒト胎児繊維芽細胞ＨＥＦに対する増殖抑制効果を示す。

《表１７》
［MKN-28］ LP-DN LP(DNなし) DN(LPなし) PBSのみ
ｐＨ 6.0 7.2 6.0 7.2 6.0 7.2 6.0 7.2
ＩＣ_５０値 24.5 26.0 4.3 3.5 15.0 15.0 2.7 2.5

《表１８》
［HEF］ LP-DN LP(DNなし) DN(LPなし) PBSのみ
ｐＨ 6.0 7.2 6.0 7.2 6.0 7.2 6.0 7.2
ＩＣ_５０値 4.0 3.8 3.5 3.2 <2.0 <2.0 <2.0 <2.0

ＭＫＮ−２８細胞に対するＩＣ_５０値は、ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で作製した熱変性ＩｇＧコートＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソーム「LP-DN」が２４．５であるのに対して、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼなし）「LP(DNなし)」では４．３であり、ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼのみ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）「DN(LPなし)」では１５．０であり、ＰＢＳ（緩衝液）のみ「PBSのみ」では２．７であった。
また、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で作製した熱変性ＩｇＧコートＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームが２６．０であるのに対して、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼなし）では３．５であり、ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼのみ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）では１５．０であり、ＰＢＳ（緩衝液）のみでは２．５であった。

一方、ＨＥＦ細胞に対するＩＣ_５０値は、ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で作製した熱変性ＩｇＧコートＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームでは４．０であり、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼなし）では３．５であり、ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼのみ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）では＜２．０であり、ＰＢＳ（緩衝液）のみでは＜２．０であった。
また、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で作製した熱変性ＩｇＧコートＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームでは３．８であり、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼなし）では３．２であり、ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼのみ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）では＜２．０であり、ＰＢＳ（緩衝液）のみでは＜２．０であった。

反応緩衝液としてＰＢＳを使用した場合、ＭＫＮ−２８細胞に対して、ｐＨ６．０でＩＣ_５０値は２．７、ｐＨ７．２でＩＣ_５０値は２．５であり、ＨＥＦ細胞に対して、ｐＨ６．０でＩＣ_５０値は＜２．０、ｐＨ７．２でＩＣ_５０値は＜２．０であった。この結果は、ＰＢＳは細胞に対する毒性がなく、反応緩衝液として優れており、また、ＰＨ６．０及び７．２で、ＩＣ_５０値にほとんど差がないことを示している。
また、リポソーム（ＤＮアーゼなし）では、ＭＫＮ−２８細胞に対して、ｐＨ６．０でＩＣ_５０値は４．３、ｐＨ７．２でＩＣ_５０値は３．５であり、ＨＥＦ細胞に対して、ｐＨ６．０でＩＣ_５０値は３．５、ｐＨ７．２でＩＣ_５０値は３．２であった。リポソーム濃度は、０．５μｍｏｌ／Ｌ以下であり、従って、リポソーム濃度が０．５μｍｏｌ／Ｌ以下なら細胞毒性は認められなかった。

また、ＤＮアーゼ（リポソームなし）では、ＭＫＮ−２８細胞に対して、ｐＨ６．０でＩＣ_５０値は１５．０、ｐＨ７．２でＩＣ_５０値は１５．０であり、ＨＥＦ細胞に対して、ｐＨ６．０でＩＣ_５０値は＜２．０、ｐＨ７．２でＩＣ_５０値は＜２．０であった。ＤＮアーゼのみでも、ＭＫＮ−２８細胞増殖抑制効果を示すが、正常細胞としてのＨＥＦ細胞に対しては、全くＨＥＦ細胞増殖抑制効果を示さなかった。
リポソーム−ＤＮアーゼでは、ＭＫＮ−２８細胞に対して、ｐＨ６．０でＩＣ_５０値は２４．５、ｐＨ７．２でＩＣ_５０値は２６．０であり、ＨＥＦ細胞に対して、ｐＨ６．０でＩＣ_５０値は４．０、ｐＨ７．２でＩＣ_５０値は３．８であった。すなわち、リポソーム−ＤＮアーゼは、ＭＫＮ−２８細胞に対して非常にＩＣ_５０値を高いが、正常細胞であるＨＥＦ細胞に対しては、毒性がほとんど認められなかった。
また、ＩＣ_５０値は、リポソーム−ＤＮアーゼ＞ＤＮアーゼ（リポソームなし）であり、ＤＮアーゼをリポソームに封入することが効果的であった。
以上のとおり、本発明の有効成分の１つである前記遠心上清は、抗腫瘍剤の用途に適用することができる。また、リポソームとの複合体として抗腫瘍剤の用途に供することは、非常に効果的である。

《実施例８：細胞分裂と細胞増殖抑制効果との関係》
ＤＮアーゼが癌細胞のＤＮＡに作用するためには、ＤＮアーゼと癌細胞のＤＮＡとが直接接触することが必要である。細胞質内のＤＮアーゼがＤＮＡに接触するためには、核膜の存在が両者の接触を阻害している。核膜がなくなるのは、細胞分裂期（Ｍ期）のみである。効率の高いＤＮアーゼの細胞増殖抑制活性効果を調べるため、各種培養細胞からＭ期の細胞を作製し、Ｍ期の細胞に対するＤＮアーゼ含有リポソームの抑制効果を調べた。
Ｍ期の細胞作製には、合成コルヒチンであるコルセミド（J. Radiat. Res., 14, 258-270, 1971）を用いることとし、Ｍ期の生細胞収集のための至適条件、及びＭＴＴ法による細胞増殖抑制効果評価のための条件を検討した。

具体的には、２５ｃｍ^２培養フラスコ（Falcon, 3014, 50mL）で細胞を培養し、培養３日目の細胞（モノレイヤー完成）を、洗浄後、０．０２５μｇ／ｍＬコルセミド（ナカライ，09356-74）含有増殖培地へ交換し、３７℃で６時間インキュベートした。細胞を軽く洗浄した後、培養フラスコをゆるやかに振盪（gentle shaking）し、脱落細胞を集めた。集めた細胞を培地（ＧＭ）で遠心洗浄して、コルセミドを除去した後、増殖培地に懸濁して、培養を開始した。

顕微鏡観察による分裂期細胞（mitotic cell）の経時的出現について、表１９に示す。なお、分裂期細胞の出現は、球状細胞（round cell）の出現を指標とした。すなわち、培養細胞の多くは、ガラス面に接着して薄く広がっているが、分裂期に入ると、球形化してガラス面から浮きやすくなる性質があるため、丸まってモノレイヤーから脱落しそうな細胞の出現を指標にした。
表１９に示す記号「−」は、球状細胞の出現が全細胞の０％であることを意味し、「±」は、球状細胞の出現が５％未満であることを意味し、「＋」は、球状細胞の出現が５％以上３０％未満であることを意味する。また、「球状細胞数／フラスコ」欄の括弧内の数字は、トレパンブルー染色陽性細胞数である。

《表１９》
球状細胞の出現球状細胞数／フラスコ
細胞 1hr 2hr 3hr 4hr 5hr
MKN-28 − ± ＋＋＋９．３万（０）
MRC-5 − ± ＋＋＋１５．３万（０）

コルセミド処理細胞の回収率（処理後回収細胞数／処理前細胞数）は、ＭＫＮ−２８細胞で１．４％（９．３万／６３０万）であり、ＭＲＣ−５細胞で２９％（１５．３万／５２万）であった。

次に、分裂期細胞の増殖能を、０．０２５μｇ／ｍＬコルセミド、３７℃、６時間処理により得られた細胞を９６ウェルプレートに播くことにより調べた。具体的には、ＭＫＮ−２８細胞については、１ウェル当たりの細胞数が、９３００、４６５０、２３２５、及び１１６２個となるように播き、３７℃にて５日間培養して観察したところ、９３００細胞／ウェル又はそれよりやや多い細胞数が、ＭＴＴアッセイには好ましいことが判明した（増殖能が幾分低下していた）。また、ＭＲＣ−５細胞では、１５３００、７６５０、３８２５、及び１９１２細胞／ウェルで実施したところ、繊維芽細胞特有のモノレイヤーを形成しなかった（細胞は増殖するが、乱れが見られる）が、７６５０又は３８２５細胞／ウェルでＭＴＴアッセイが成立すると思われる。

これまでの結果をまとめると、今までのＭＴＴアッセイは、主に、５０００細胞／ウェル、３７℃、４日培養の条件で実施していたが、コルセミド処理して得られる分裂期細胞の場合には、ＭＫＮ―２８細胞では１００００細胞／ウェルで、ＭＲＣ−５細胞では８０００細胞／ウェルでＭＴＴアッセイを実施することが好ましいと考えられる。なお、ＭＫＮ―２８細胞では、通常の培養細胞（すなわち、コルセミド非処理）の増殖能と比較すると、増殖能が低下しており、培養３〜４日目では死細胞も認められた。また、ＭＲＣ−５細胞では、増殖能が低下しているだけでなく、細胞増殖性に乱れがあり、完全なモノレイヤーを形成しなかった。以下の実験では、前記条件でＭＴＴアッセイを実施した。

《実施例９：ＭＫＮ−２８細胞由来精製ＤＮアーゼを含有するリポソーム製剤の各種細胞に対する増殖抑制効果の評価》
本実施例では、実施例１で調製した各種癌培養細胞及び正常細胞由来の遠心上清を、実施例２で示す手順でセファクリルＳ−３００ＨＲにより精製し、更に、実施例３で示す手順でイオン交換クロマトグラフィーにより精製して得られたＭＫＮ−２８細胞由来精製ＤＮアーゼを用いて、リポソーム製剤を調製し、そのＭＫＮ−２８細胞増殖抑制効果を評価した。
具体的には、ＭＫＮ−２８細胞由来精製ＤＮアーゼとして、実施例３で得られたＤＮアーゼ活性のピーク画分、すなわち、Ｎｏ．５画分［５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋０．０８ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ］及びＮｏ．６画分［５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋０．１０ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ］を使用した。リポソームは、実施例７に記載の手順に従って調製した。但し、実施例７では、ＤＮアーゼとして実施例１で得られた遠心上清を使用したが、本実施例では、実施例３で得られた精製ＤＮアーゼを使用した。また、実施例７では、反応緩衝液としてＰＢＳを使用したが、本実施例では、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋０．０８ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌを使用した。ＭＴＴ法も実施例７と同様に行った。

得られた熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソーム製剤（懸濁液）中に含まれる精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ量は、１７ユニット／１００μＬであった。なお、１ユニットは、１μｇのλＤＮＡを３７℃で１時間処理することにより完全に分解することのできるＤＮアーゼ量である。リポソーム製剤中のＤＮアーゼ量は、リポソーム製剤１００μＬを遠心操作によりその上清を除去した後、０．２％トリトン（Triton）Ｘ−１００含有ＰＢＳ溶液１００μＬを添加することによりリポソームを溶解し、その状態でλＤＮＡ分解能を評価することにより決定した。なお、トリトンＸ−１００がＤＮアーゼ活性に影響を与えないことは予め確認した。

本実施例では、精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼのＭＫＮ−２８細胞及びＭＲＣ−５細胞に対する増殖抑制活性を、セルサスペンジョン（cell-suspension）法及びモノレイヤー法により評価した。

セルサスペンジョン法では、まず、ＧＭで作製した熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームの希釈系列（原液、２倍、４倍、８倍、１６倍、及び３２倍希釈）を５０μＬ／ウェルずつ分注した。次いで、５０００細胞／５０μＬに調整したＭＫＮ−２８細胞浮遊液又はＭＲＣ−５細胞浮遊液を、各ウェルに５０μＬずつ添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで培養し、培養４日後にＭＴＴ法によりＩＣ_５０値を算出した。
また、対照として、熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームの２倍希釈系列の代わりに、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼなし）の２倍希釈系列、精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）の２倍希釈系列、又は反応緩衝液を用いて、同じ操作を繰り返した。

モノレイヤー法では、９６ウェルマイクロプレートに、５０００細胞／１００μＬに調整したＭＫＮ−２８細胞又はＭＲＣ−５細胞を、１ウェル当たり１００μＬずつ分注し、３７℃で培養した。培養２０時間後、培養液を除去したウェルに、ＧＭで作製した熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームの２倍希釈系列（２倍、４倍、８倍、１６倍、及び３２倍希釈）を１００μＬずつ添加し、３７℃で培養した。培養４日後に、ＭＴＴ法によりＩＣ_５０値を算出した。
また、対照として、熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームの２倍希釈系列の代わりに、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼなし）の２倍希釈系列、精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）の２倍希釈系列、又は反応緩衝液（０．８ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ含有０．５ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を用いて、同じ操作を繰り返した。
結果を表２０に示す。

《表２０》
細胞 LP-DN LP(DNなし) DN(LPなし) 緩衝液
MKN-28 サスペンジョン法 5.3 2.7 2.7 2.8
モノレイヤー法 <2.0 2.6 2.0 2.4
MRC-5 サスペンジョン法 <2.0 <2.0 <2.0 <2.0
モノレイヤー法 <2.0 <2.0 <2.0 <2.0

表２０に示すとおり、ＭＫＮ−２８細胞に関して、セルサスペンジョン法では、熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソーム［LP-DN］のＩＣ_５０値は５．３であり、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼなし）［LP(DNなし)］のＩＣ_５０値は２．７であり、精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）［DN(LPなし)］のＩＣ_５０値は２．７であり、反応緩衝液のみではＩＣ_５０値は２．８であった。明らかに、熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームは、ＭＫＮ−２８細胞に対して増殖抑制効果があった。一方、モノレイヤー法では、細胞増殖効果は認められなかった。それに対して、正常細胞としてのＭＲＣ−５細胞では、セルサスペンジョン法及びモノレイヤー法のいずれにおいても、ＩＣ_５０値は＜２．０であり、増殖抑制効果は認められなかった。
リポソーム濃度は、０．５μｍｏｌ／Ｌ以下で、先述したとおり、０．５μｍｏｌ／Ｌ以下ではほとんどリポソームは細胞毒性が認められないことより、リポソーム濃度と関係ないと思われた。

《実施例１０：熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームのＭ期細胞に対する増殖抑制効果》
細胞増殖抑制効果を高めるために、核膜が消失する細胞分裂期、いわゆるＭ期に細胞をすることによってＤＮＡとＤＮアーゼがより容易に接触することができるようにすることにした。すなわち、実施例８で示したとおり、合成コルヒチンであるコルセミド処理することにした。
具体的には、培養３日目のＭＫＮ−２８細胞又はＭＲＣ−５細胞を０．０２５μｇ／ｍＬコルセミド含有の増殖培地へ交換し、３７℃にて６時間インキュベートした。緩やかに振盪することにより脱落した細胞を集め、コルセミドを含まない通常の増殖培地で洗浄した後、９６ウェルマイクロプレートに、ＧＭで作製した熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームの２倍希釈系列（原液、２倍、４倍、８倍、１６倍、及び３２倍希釈）を５０μＬ／ウェルずつ分注した。次いで、１００００細胞／５０μＬに調整したＭＫＮ−２８（Ｍ期）細胞浮遊液、あるいは、８０００細胞／５０μＬに調整したＭＲＣ−５（Ｍ期）細胞浮遊液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、３７℃にてＣＯ_２インキュベーターで培養した。培養４日後、ＭＴＴ法によりＩＣ_５０値を算出した。
また、対照として、熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソームの２倍希釈系列の代わりに、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼなし）の２倍希釈系列、精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）の２倍希釈系列、又は反応緩衝液を用いて、同じ操作を繰り返した。

結果を表２１に示す。
表２１に示すとおり、コルセミド処理したＭＫＮ−２８細胞に関して、熱変性ＩｇＧコート精製ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼ含有リポソーム［LP-DN］のＩＣ_５０値は９．３であり、細胞増殖抑制効果が認められた。それに対して、正常細胞としてのＭＲＣ−５細胞では、ＩＣ_５０値は＜２．０であり、増殖抑制効果は認められなかった。
以上のとおり、本発明のＤＮアーゼは、抗腫瘍剤の用途に適用することができる。また、リポソームとの複合体として抗腫瘍剤の用途に供することが効果的である。更に、コルセミドと併用することも効果的である。

《表２１》
細胞 LP-DN LP(DNなし) DN(LPなし) 緩衝液
MKN-28 サスペンジョン法 9.3 5.0 4.5 2.8
MRC-5 サスペンジョン法 <2.0 <2.0 <2.0 <2.0

《実施例１１：熱変性ＩｇＧコート制限酵素ＸｓｐＩ含有リポソームの増殖抑制効果の評価》
本実施例では、ＭＫＮ−２８ＤＮアーゼの代わりに制限酵素ＸｓｐＩを使用し、実施例７に記載の手順に準拠して、制限酵素ＸｓｐＩ含有リポソーム製剤を調製し、その細胞増殖抑制効果をＭＴＴ法（セルサスペンジョン法又はモノレイヤー法）を用いて評価した。評価細胞としては、ヒト由来肺癌培養細胞Ａ５４９（ＲＣＢ００９８，理化学研究所、又はＡＴＣＣＣＣＬ１８５，ＡＴＣＣ）、ヒト由来胃癌培養細胞ＭＫＮ−２８、及び正常細胞としてのヒト由来胎児肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５を使用した。
なお、プロト癌遺伝子Ｎ−ｒａｓ、Ｈａ−ｒａｓ、及びＫｉ−ｒａｓは、いずれも、１１番目及び１２番目のコドンがＧＣＴ（Ａｌａ）及びＧＧＴ（Ｇｌｙ）であり、Ａ５４９細胞では、ＧＣＴ（Ａｌａ）及びＡＧＴ（Ｓｅｒ）と変化している。Ａ５４９細胞における前記塩基配列ＧＣＴＡＧＴ中の配列「ＣＴＡＧ」は、制限酵素ＸｓｐＩの切断認識配列「Ｃ：ＴＡＧ」（記号「：」は切断箇所を示す）である。また、ＭＫＮ−２８細胞の原因変異は同定されていない。

結果（ＩＣ_５０値）を表２２及び表２３に示す。表２２は、希釈倍数によるＩＣ_５０値を示し、表２３は、単位：ＸｓｐＩユニット／ウェル／１００μＬによるＩＣ_５０値を示す。表２２及び表２３において、記号「LP-Xsp」、「LP(Xspなし)」、「Xsp(LPなし)」、及び「RBのみ」は、それぞれ、熱変性ＩｇＧコート制限酵素ＸｓｐＩ含有リポソーム、熱変性ＩｇＧコートリポソーム（制限酵素ＸｓｐＩなし）、制限酵素ＸｓｐＩのみ（熱変性ＩｇＧコートリポソームなし）、及び反応緩衝液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ_２，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ］のみを意味する。

《表２２》
ＩＣ _５０値（希釈倍数）
細胞 LP-Xsp LP(Xspなし) Xsp(LPなし) RB
A549 サスペンジョン法 12.0 6.2 11.5 5.0
モノレイヤー法 4.7 3.5 4.3 3.4
MKN-28 サスペンジョン法 7.3 <2.0 7.2 <2.0
モノレイヤー法 15.0 2.9 19.0 5.2
MRC-5 サスペンジョン法 3.0 <2.0 2.2 2.0
モノレイヤー法 2.6 <2.0 2.4 2.4

《表２３》
ＩＣ _５０値（XspI units/well/100μL）
細胞 LP-Xsp LP(Xspなし) Xsp(LPなし) RB
A549 サスペンジョン法 0.68 1.35 0.68 1.6
モノレイヤー法 1.7 2.3 1.9 2.3
MKN-28 サスペンジョン法 1.25 >4.0 1.27 >4.0
モノレイヤー法 0.6 2.6 0.4 1.5
MRC-5 サスペンジョン法 2.95 >4.0 3.5 4.0
モノレイヤー法 3.0 >4.0 3.2 3.2

表２２に示すとおり、ヒト由来肺癌培養細胞Ａ５４９に対して、セルサスペンジョン法では、熱変性ＩｇＧコート制限酵素ＸｓｐＩ含有リポソームのＩＣ_５０値は１２．０であり、制限酵素ＸｓｐＩのみのＩＣ_５０値は１１．５であり、いずれも細胞増殖抑制効果を示した。
また、ヒト由来胃癌培養細胞ＭＫＮ−２８に対して、セルサスペンジョン法では、熱変性ＩｇＧコート制限酵素ＸｓｐＩ含有リポソームのＩＣ_５０値は７．３であり、制限酵素ＸｓｐＩのみのＩＣ_５０値は７．２であり、また、モノレイヤー法では、熱変性ＩｇＧコート制限酵素ＸｓｐＩ含有リポソームのＩＣ_５０値は１５．０であり、制限酵素ＸｓｐＩのみのＩＣ_５０値は１９．０であり、いずれも細胞増殖抑制効果を示した。
一方、正常細胞であるＭＲＣ−５細胞に対しては、熱変性ＩｇＧコート制限酵素ＸｓｐＩ含有リポソームの場合も、制限酵素ＸｓｐＩのみの場合も、ほとんど細胞増殖抑制活性は認められず、本発明の抗腫瘍剤は、正常細胞に作用しないことが判明した。

《実施例１２：熱変性ＩｇＧコート制限酵素ＸｓｐＩ含有リポソームのＭ期細胞に対する増殖抑制効果》
実施例１０に記載の方法に準拠して、熱変性ＩｇＧコート制限酵素ＸｓｐＩ含有リポソームのＭ期細胞に対する増殖抑制効果を評価した。結果を表２４及び表２５に示す。
表２４及び表２５に示すとおり、本発明の抗腫瘍剤は、ヒト由来肺癌培養細胞Ａ５４９及びヒト由来胃癌培養細胞ＭＫＮ−２８に対して細胞増殖抑制効果を示す一方、正常細胞に作用しないことが判明した。

《表２４》
ＩＣ _５０値（希釈倍数）
細胞 LP-Xsp LP(Xspなし) Xsp(LPなし) RB
A549 サスペンジョン法 8.3 3.7 6.0 3.4
MKN-28 サスペンジョン法 12.0 4.6 7.9 3.0
MRC-5 サスペンジョン法 2.5 <2.0 2.7 2.0

《表２５》
ＩＣ _５０値（XspI units/well/100μL）
細胞 LP-Xsp LP(Xspなし) Xsp(LPなし) RB
A549 サスペンジョン法 0.94 2.3 1.3 2.2
MKN-28 サスペンジョン法 0.65 1.65 1.2 2.6
MRC-5 サスペンジョン法 3.0 >4.0 2.9 4.0

本発明のＤＮアーゼは、抗腫瘍剤の用途に適用することができる。

Claims

下記の性質を有する、ヒト由来胃癌培養細胞ＭＫＮ−２８由来のＤＮアーゼ。
（ａ）作用及び基質特異性：エンドヌクレアーゼ活性を有する。
（ｂ）分子量：４８〜４３ｋＤａ（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）
（ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ３．０〜４．５である。
（ｄ）熱安定性：１００℃での１０分間の加熱によっても、エンドヌクレアーゼ活性が失活しない。
（ｅ）プロテナーゼＫとの反応性：３７℃での１５分間の反応により、エンドヌクレアーゼ活性が失活する。
下記の性質を有する、ヒト由来子宮頚癌培養細胞ＨｅＬａ由来のＤＮアーゼ。
（ａ）作用及び基質特異性：エンドヌクレアーゼ活性を有する。
（ｂ）分子量：６３ｋＤａ（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）
（ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ３．０〜４．５である。
（ｄ）熱安定性：１００℃での１０分間の加熱により、エンドヌクレアーゼ活性が失活する。
（ｅ）プロテナーゼＫとの反応性：３７℃での１５分間の反応によっても、エンドヌクレアーゼ活性は失活しない。
請求項１又は２に記載のＤＮアーゼを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
前記ＤＮアーゼをリポソームとの複合体として含有する、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
熱変性免疫グロブリンＧを更に含有する、請求項４に記載の抗腫瘍剤。