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JP3983985B2 - ＭｘＡタンパク質の多型遺伝子およびその使用 - Google Patents

ＭｘＡタンパク質の多型遺伝子およびその使用 Download PDF

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、MxA遺伝子プロモータ領域の多型遺伝子と、該多型遺伝子を用いてインターフェロン療法の対象となるべき個体におけるインターフェロンの有効性を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターフェロンは脊椎動物細胞が分泌するタンパク質であり、抗ウイルス性作用、免疫調節作用および細胞増殖抑制作用を有する。このため、インターフェロンはＣ型肝炎等の種々のウイルス感染症および悪性腫瘍などの治療に広く使用されている。しかし、インターフェロンに対して感受性を示さない患者の存在が知られるに至った。インターフェロン療法が効果を示さない感染者にインターフェロン療法を継続することは、患者に発熱や貧血などの副作用を引き起こすのみならず、他の治療の開始を遅らせることになる。従って、インターフェロンの有効性を予め予測して、このような非感受性の患者をインターフェロン療法から排除することが望まれている。
【０００３】
一方、インフルエンザウイルスに抵抗性を有するマウスから見出されたインターフェロン依存性タンパク質、即ち、MxAタンパク質が知られており、ヒトにもMxAタンパク質が見出されている。MxAタンパク質は、インフルエンザウイルスに対する抵抗性に関与することが知られていたが、最近、慢性C型肝炎ウイルス(以下、HCVと称する)の感染者におけるMxA mRNA及びMxAタンパク質の発現レベルが、インターフェロン療法に対する感染者の応答と関連があることが報告された。この事実は、MxA遺伝子が、インターフェロン療法の有効性を治療前に予測するための有用な指標となり得ることを示唆するものである。
【０００４】
そこで、本発明者らは、HCV感染者のインターフェロン療法に対する応答性に関与しているMxA遺伝子プロモータ領域の多型遺伝子の存在を調べた。その結果、特定の多型遺伝子を有する患者のみが、インターフェロンに対して感受性を有し、インターフェロン療法が有効であることが分かった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑み、本発明の第一の課題は、患者に対するインターフェロン療法の有効性を予測するために有用な、MxA遺伝子プロモータ領域の多型遺伝子を提供することである。
【０００６】
本発明の第二の課題は、上記のMxA遺伝子プロモータ領域の多型遺伝子を用いて、患者に対するインターフェロンの有用性を予測する方法を提供することである。
【０００７】
本発明の第三の課題は、上記MxA遺伝子プロモータ領域の多型遺伝子のうち、インターフェロン感受性の原因である多型遺伝子を用いて、インターフェロンに対して非感受性の患者をインターフェロン感受性にするための遺伝子治療、およびそのために有用なベクターを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は、以下に述べる本発明によって達成される。
【０００９】
本発明の第一の側面に従えば、下記の配列からなる群から選択される、インターフェロン療法の有効性を予測するためのポリヌクレオチドが提供される：
(at) 下記配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチド、
(bt) 前記(at)に示されるポリヌクレオチド中の455位を除く１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリヌクレオチド、
(ct) 配列番号１の441〜455位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(dt) 配列番号１の449〜459位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(et) それらの相補鎖。
【００１０】
本発明の第二の側面に従えば、下記の配列からなる群から選択される、インターフェロン療法の有効性を予測するためのポリヌクレオチドが提供される：
(ag) 下記配列表の配列番号２に示されるポリヌクレオチド、
(bg) 前記(ag)に示されるポリヌクレオチド中の455位を除く１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリヌクレオチド、
(cg) 配列番号２の441〜455位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(dg) 配列番号２の449〜459位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(eg) それらの相補鎖。
【００１１】
本発明の第三の側面に従えば、下記の配列からなる群から選択される、インターフェロン療法の有効性を予測するためのポリヌクレオチドが提供される：
(aa) 下記配列表の配列番号３に示されるポリヌクレオチド、
(ba) 前記(aa)に示されるポリヌクレオチド中の455位を除く１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリヌクレオチド、
(ca) 配列番号３の441〜455位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(da) 配列番号３の449〜459位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(ea) それらの相補鎖。
【００１２】
本発明の第四の側面に従えば、下記の配列からなる群から選択される、インターフェロン療法の有効性を予測するためのポリヌクレオチドが提供される：
(ac) 下記配列表の配列番号４に示されるポリヌクレオチド、
(bc) 前記(ac)に示されるポリヌクレオチド中の455位を除く１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリヌクレオチド、
(cc) 配列番号４の441〜455位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(dc) 配列番号４の449〜459位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(ec) それらの相補鎖。
【００１３】
本発明の第五の側面に従えば、インターフェロンを投与すべき個体に対して、インターフェロン療法の有効性を予測する方法であって、
１）少なくとも１つのインターフェロン応答配列を含むポリヌクレオチドを含有する試料を前記個体から採取する工程と、
２）少なくとも１つの前記インターフェロン応答配列について、3’末端から２番目に位置するヌクレオチドを決定する工程とを具備した方法が提供される。
【００１４】
この方法において、前記ヌクレオチドがチミンであれば、前記個体に対してインターフェロン療法が有効であると予測することができる。また、前記ヌクレオチドがグアニン、アデニンまたはシトシンであれば、前記個体に対してインターフェロン療法が有効でない可能性が高いと予測することができる。
【００１５】
本発明の第六の側面に従えば、インターフェロンを投与すべき個体に対してインターフェロン療法が有効であるかどうかを予測するための試験薬であって、請求項１〜４の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする試験薬が提供される。
【００１６】
本発明の第七の側面に従えば、MxA遺伝子プロモータ領域の多型遺伝子を検出するためのプローブであって、請求項１〜４の何れか１項に記載のポリヌクレオチドからなるプローブが提供される。
【００１７】
本発明の第八の側面に従えば、インターフェロンの有効性を予測するための、上記ポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００１８】
本発明の第九の側面に従えば、上記ポリヌクレオチド(at)〜(et)の何れかを含むことを特徴とする、インターフェロン非感受性の個体にインターフェロン感受性を与えるためのベクターが提供される。
【００１９】
本発明の第十の側面に従えば、インターフェロン非感受性の個体にインターフェロン感受性を与えるための方法であって、インターフェロン非感受性の個体に対して、本発明によるポリヌクレオチドを導入することを含む方法が提供される。
【００２０】
本発明の第十一の側面に従えば、インターフェロン非感受性の個体にインターフェロン感受性を与えるための医薬の製造における、上記ポリヌクレオチド(at)〜(ec)の何れかの使用が提供される。
【００２１】
本発明の第十二の側面に従えば、上記ポリヌクレオチド(at)〜(ec)の何れかが導入された非ヒトトランスジェニック動物が提供される。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４のポリヌクレオチドは、インターフェロン依存性タンパク質であるヒトＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域を包含するポリヌクレオチドであり、本発明者らによって、これらのポリヌクレオチドの４５５位に存在する一塩基多型(single nucleotide polymorphism)（以下、ＳＮＰと称する）がインターフェロン療法の効果に対する応答性に関与していることが初めて見出された。
【００２４】
各々のポリヌクレオチドの441〜456位には、インターフェロン応答配列（interferon-stimulated response element）（以下、ＩＳＲＥと称する）が存在している。
【００２５】
配列番号１の441〜456位のＩＳＲＥの塩基配列は、「GGTTTCGTTTCTG CTC」（配列番号５）であり、ＩＳＲＥの１５番目（配列番号１の455位に相当する。配列番号１における455位は、転写開始部位を+1とする通常の表記によれば、-88位に相当する）がチミンである。
【００２６】
配列番号２の441〜456位のISREの塩基配列は、「GGTTTCGTTTCTGCGC」（配列番号６）であり、ＩＳＲＥの１５番目（配列番号２の455位に相当する。配列番号２における455位は、転写開始部位を+1とする通常の表記によれば、-88位に相当する）がグアニンである。
【００２７】
また、配列番号３の441〜456位のＩＳＲＥの塩基配列は、「GGTTTCGTTTCTGCAC」（配列番号７）であり、ＩＳＲＥの１５番目（配列番号３の455位に相当する。配列番号３における455位は、転写開始部位を+1とする通常の表記によれば、-88位に相当する）はアデニンである。
【００２８】
配列番号４の３の441〜456位のＩＳＲＥの塩基配列は、「GGTTTCGTTTCTGCCC」（配列番号８）であり、ＩＳＲＥの１５番目（配列番号４の455位に相当する。配列番号４における455位は、転写開始部位を+1とする通常の表記によれば、-88位に相当する）はシトシンである。
【００２９】
以下、本明細書を通じて、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の455位をＳＮＰ部位(SNP site)と称する。
【００３０】
これらのＩＳＲＥのＳＮＰ部位以外の領域は各配列ともに共通である。これらのＩＳＲＥの１５番目のヌクレオチドがチミンであるＩＳＲＥ（配列番号５）を有するＨＣＶ感染者は、インターフェロン療法が有効であるのに対して、１５番目のヌクレオチドがチミンであるＩＳＲＥ（配列番号５）を持たないＨＣＶ感染者は、インターフェロン療法が有効でないことが本発明者らにより疫学的に実証された。
【００３１】
つまり、実施例に詳述されているように、455位のヌクレオチドがグアニンである配列番号１のポリヌクレオチドをホモ接合で有する（以下、G/Gホモと略記する） HCV感染者は、455位のヌクレオチドがチミンである配列番号１のポリヌクレオチドと、455位のヌクレオチドがグアニンである配列番号１のプロモーター領域をヘテロ接合で有する (以下、G/Tヘテロと略記する)HCV感染者、又は配列番号１のポリヌクレオチドをホモ接合で有する（以下、T/Tホモと略記する）HCV感染者と比べて、インターフェロン療法が有効でないことが実証された。
【００３２】
あるいは、455位のヌクレオチドがチミンでないMxA遺伝子のプロモーター領域をホモ接合で有するHCV感染者(以下、non-T/non-Tホモと略記する)は、T/non-Tヘテロ又はT/TホモのHCV感染者と比べて、インターフェロン療法が有効でないことが示された。non-T/non-Tホモの組み合わせとしては、G/G、G/A、G/C、A/A、A/C、C/Cがある。T/non-Tの組み合わせとしては、T/G、T/A、T/Cがある。
【００３３】
従って、インターフェロン療法の実施に先立って、例えばHCV感染者が有するヒトMxA遺伝子のプロモーター領域を包含するポリヌクレオチドのＩＳＲＥにおけるＳＮＰ部位のヌクレオチドを決定することによって、該HCV感染者に対して、インターフェロン療法の有効性を検知することができる。
【００３４】
上記の発見に基づき、本発明によればインターフェロン療法の有効性を予測するためのポリヌクレオチドが提供される。また、インターフェロンを投与すべき個体に対して、インターフェロン療法が有効であるかどうかを予測する方法が提供される。また、被験者が上記何れのSNPを有しているかを検出するための、本発明によるポリヌクレオチドのプローブとしての使用が提供される。
【００３５】
また、インターフェロン非感受性の個体にインターフェロン感受性を与えるための遺伝子療法が提供される。
【００３６】
更に、実験動物として有用な、上記ヌクレオチドを含む非ヒトトランスジェニック動物が提供される。
【００３７】
以下、本発明の夫々の側面について個別的に説明する。
【００３８】
＜インターフェロン療法の有効性を予測するためのポリヌクレオチド＞
本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは、２以上のヌクレオシドがリン酸エステル結合で結合されてなる物質を意味する。「ヌクレオシド」には、デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。また、さらに本発明において「ポリヌクレオチド」とは、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ-オリゴ核酸などの人工合成核酸も指称するものとする。
【００３９】
なお、本明細書において、「プロモーター領域」とは、TATAボックス等の転写開始反応に直接関与する領域のみを指すのではなく、該領域の近傍又は遠隔に存在して転写開始反応の効率に影響を与える調節配列を含む配列も指称するものとする。従って、「プロモーター領域」なる語には、転写開始反応に関与する配列のみ、調節配列のみ、及びその両者が連結された配列が含まれることに留意しなければならない。
【００４０】
また、「ISRE」とは、インターフェロンα、β、γ、またはωの刺激によって誘導される遺伝子の転写調節領域に存在する約12〜15のヌクレオチドからなる塩基配列を意味する。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドには、以下の（ａ）〜（ｅ）が含まれる。
【００４２】
（ａ）配列番号１、２、３、４のいずれかに示されるポリヌクレオチド。
【００４３】
（ｂ）前記（ａ）に示されるポリヌクレオチドにおいて、455位を除く１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリヌクレオチド。
【００４４】
欠失の例としては、128位、133位、152位、508位、及び543位の欠失、置換の例としては330位の置換（G→T）、542位の置換(C→G)、付加の例としては501位への付加（C）を挙げることができる。
【００４５】
付加による修飾ポリヌクレオチドの他の例としては、前記配列番号１、２、３、４のポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドの断片に、プロモーター、エンハンサー、上流活性化配列、サイレンサー、上流抑制配列、アテニュエーター、ポリAテール、核移行シグナル、Kozak配列、ISRE、薬物耐性因子、シグナルペプチドの遺伝子、膜貫通領域の遺伝子、ルシフェリン、緑色蛍光タンパク質、フィコシアニン、西洋ワサビペルオキシダーゼを含むマーカータンパク質の遺伝子、インターフェロン応答性タンパク質の遺伝子、非インターフェロン応答性タンパク質の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドが連結されてなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４６】
また、配列番号１、２、３、４に示される前記ポリヌクレオチドの塩基配列のうち、インターフェロン療法の有効性に関与しているのは455位に位置するＳＮＰ部位に存在する１個のヌクレオチドなので、本発明のポリヌクレオチドは、前記455位のSNP部位を含むポリヌクレオチドの断片であってよい。このポリヌクレオチドは、１１ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下であることが望ましい。ポリヌクレオチド断片の長さが過度に長いと、１個のヌクレオチドの相違を識別することが困難になる。一方、基体にポリヌクレオチドの長さが過度に短いと試料中に含まれるポリヌクレオチドの塩基配列の決定が困難になる。
【００４７】
特に好適なポリヌクレオチドとしては、下記の（ｃ）〜（ｅ）が挙げられる。
【００４８】
（ｃ）前記455位のSNP部位を含む配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のポリヌクレオチドの断片であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の４４１〜４５６位に相当する配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８で示される配列を有するポリヌクレオチド（すなわち前記ISRE）を含む断片。
【００４９】
（ｄ）前記４５５位のSNP部位を含む配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のポリヌクレオチドの断片であって、配列番号１乃至配列番号４の449〜459位に相当する配列番号９、１０、１１、１２のポリヌクレオチドを含む断片。特に（ｄ）は前記SNPをほぼ中心とし、前後同等の長さの塩基配列を含むものであるため、高精度で塩基配列の決定が行われる。更に精度の高い検出を行うためには、望ましくは配列番号１ないし配列番号４の447〜461位に相当するポリヌクレオチドを含む断片が好ましい。
【００５０】
さらに、本発明の好適なポリヌクレオチドとしては
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）に示されるポリヌクレオチドの相補鎖であってもよい。
【００５１】
前記配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８で示される配列（すなわち前記ISRE）の相補鎖は、配列番号１３，１４、１５、１６で表される配列である。
【００５２】
前記配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２で示される配列の相補鎖は、それぞれ配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０で示される配列である。
【００５３】
＜インターフェロン療法が有効であるかどうかを予測する方法＞
本発明によれば、インターフェロン療法の実施に先立って、あるHCV感染者の前記SNPのヌクレオチドを決定することによって、該HCV感染者に対して、インターフェロン療法が有効であるかどうかを予測することができる。これまでは、ある個体に対してインターフェロン療法が有効であるかどうかを事前に判断することはできなかったので、かかる予測が可能になった意義は極めて大きい。
【００５４】
それ故、本発明は、インターフェロンを投与すべきHCVに感染した個体に対して、インターフェロン療法が有効であるかどうかを予測する方法であって、
１）配列番号１のポリヌクレオチド、又は441〜456位の塩基配列を有する該ポリヌクレオチドの断片を含有する試料を前記個体から採取する工程と、
２）上流側に位置する前記ISREについて、3’末端から２番目に位置するヌクレオチドを決定する工程と、
３）前記ヌクレオチドがチミンであれば、前記個体に対してインターフェロン療法が有効であると予測する工程とを備えた方法を提供する。
【００５５】
また、本発明は、該方法の工程３）に代えて、前記ヌクレオチドがグアニン、アデニンまたはシトシンであれば、前記個体に対してインターフェロン療法が有効でない可能性が高いと予測する工程を具備する方法を提供する。
【００５６】
さらに、インターフェロン療法の適応症はＣ型肝炎に限られないので、本発明は、インターフェロンを投与すべき個体に対して、インターフェロン療法が有効であるかどうかを予測する方法であって、
１）少なくとも１つのインターフェロン応答配列を含むポリヌクレオチドを含有する試料を前記個体から採取する工程と、
２）少なくとも１つの前記インターフェロン応答配列について、3’末端から２番目に位置するヌクレオチドを決定する工程と、
３）前記ポリヌクレオチドがチミンであれば、前記個体に対してインターフェロン療法が有効であると予測する工程とを備えた方法を提供する。
【００５７】
また、本発明は、該方法の工程３）に代えて、前記ヌクレオチドがグアニン、アデニンまたはシトシンであれば、前記個体に対してインターフェロン療法が有効でない可能性が高いと予測する工程を具備する方法を提供する。
【００５８】
本方法を適用すべき個体は、インターフェロン療法が有効である疾患、好ましくはインターフェロンα、βまたはωが有効である疾患に罹患した患者であり得る。また、前記個体は、健康な者であってもよい。インターフェロンα、βまたはωが有効である疾患には、Ｃ型肝炎の他に、膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、皮膚悪性黒色腫、Ｂ型肝炎、腎癌、多発性骨髄腫、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、亜急性硬化性全脳炎、ウイルス性脳炎、免疫抑制患者の全身性帯状疱疹及び水痘、上咽頭未分化癌、聴力低下を伴うウイルス性内耳感染症、ヘルペス性角膜炎、偏平コンジローマ、尖圭コンジローマ、アデノウイルス及びヘルペスウイルス感染による結膜炎、性器ヘルペス、口唇ヘルペス、子宮頸癌、癌性胸水症、角化棘細胞腫、基底細胞癌、δ型慢性活動性肝炎が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明の方法を実施するためには、まず、本方法を適用すべき個体から、インターフェロン応答配列を含むポリヌクレオチドを含有する試料を採取する。本発明の方法の対象となる「個体」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む任意の哺乳動物であり得るが、ヒトが最も好適な個体である。
【００６０】
「インターフェロン応答配列を含むポリヌクレオチド」は、インターフェロン応答性タンパク質をコードする遺伝子の上流に存在する制御配列（プロモーター領域など）を含むポリヌクレオチドであり得るが、これに限定されない。最も好ましくは、「インターフェロン応答配列を含むポリヌクレオチド」は、配列番号１〜４のポリヌクレオチド、又はそれらの441〜456位のポリヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチドの断片である。
【００６１】
ポリヌクレオチドは体内に広く含まれているので、個体から採取した任意の試料が、「インターフェロン応答配列を含むポリヌクレオチドを含有する試料」となり得る。好ましい試料は、血液である。
【００６２】
個体から試料を採取した後、通常は、該試料からポリヌクレオチドを抽出する操作を行う。生体成分からポリヌクレオチドを抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈澱の他、任意の抽出方法を使用し得る。mRNAを抽出する場合には、オリゴdTカラムにかけてもよい。
【００６３】
ポリヌクレオチドの量が少ないときには、必要に応じてポリヌクレオチドを増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、逆転写ポリメラーゼ反応(RT-PCR)を含むポリメラーゼ連鎖反応（以下PCRと略記する）によって行い得る。
【００６４】
必要に応じて、抽出操作及び／又は増幅操作を行った後には、少なくとも１つのインターフェロン応答配列の3’末端から２番目のヌクレオチドの種類を決定する。
【００６５】
ヌクレオチドの種類を決定するには、最も一般的には、決定すべきヌクレオチドを含むインターフェロン応答配列を挟むプライマー対を用いて、インターフェロン応答配列を増幅した後、又は増幅せずに、該インターフェロン応答配列の塩基配列を決定すればよい。
【００６６】
決定すべきヌクレオチドが、制限酵素の認識部位の中に存在している場合には、制限酵素断片長多型法を用いてもよい。例えば、上記MxA遺伝子のプロモーター領域の多型を決定する場合、455位のヌクレオチドがグアニンである配列番号３のISREは、塩基配列GCGCを特異的に認識して切断し得る制限酵素HhaIによって切断されるのに対して、455位のヌクレオチドがグアニンでない場合は、HhaIによって切断されない。従って、配列番号１の455位のヌクレオチドを同定する場合には、HhaIを用いたRFLP法を使用し得る。
【００６７】
その他、多型を決定する方法としては、PCR-SSP(PCR-specific sequence primers)法、ドットプロット法とPCRを組み合わせたPCR-SSO（PCR-sequence specific oligonucleotide）法、及びPCR-SSCP法等の周知の方法を使用することもできるが、これらに限定されない。
【００６８】
なお、ドットブロット法とは、配列が既知のプローブ核酸鎖を用いて、試料中に含まれる特定の配列をもった核酸鎖を検出する一つの方法である。この方法では、例えば基板上の有機薄膜に一本鎖核酸の試料を固定化し、次に蛍光物質等で標識した一本鎖のプローブ核酸鎖の溶液をこの薄膜上の試料に接触させる。試料がプローブ核酸鎖と相補的な配列を有していれば、プローブ核酸鎖とハイブリダイズして二本鎖を形成するので、基板上に固定される。したがって、洗浄により未反応の核酸鎖を除去した後、プローブに付された標識を検出することにより、プローブに対して相補的な配列を有する試料核酸鎖を検出することができる。従って、本発明は、MxAタンパク質の多型遺伝子の検出における、本発明によるポリヌクレオチドのプローブとしての使用をも含むものである。また、請求項１〜４の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、インターフェロンを投与すべき個体に対してインターフェロン療法が有効であるかどうかを予測するための試験薬もまた、本発明に含まれる。
【００６９】
上記のような方法によって、インターフェロン応答配列の3’末端から２番目のヌクレオチドの種類を決定し、該ヌクレオチドがチミンであれば、インターフェロン療法が有効であると予測できる。あるいは、このような方法によって、該ヌクレオチドがグアニン、アデニンまたはシトシンであれば、前記個体に対してインターフェロン療法が有効でない可能性が高いと予測できる。
【００７０】
＜遺伝子治療＞
上記のように、個体に対してインターフェロン療法が有効であるためには、その個体が、下記の配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドを有する必要がある。
【００７１】
(at) 下記配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチド、
(bt) 前記(at)に示されるポリヌクレオチド中の455位を除く１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリヌクレオチド、
(ct) 配列番号１の441〜455位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(dt) 配列番号１の449〜459位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(et) それらの相補鎖
従って、上記ヌクレオチド(at)〜(et)は、インターフェロン療法が有効でない個体に対して、これらポリヌクレオチドを導入することにより、該個体をインターフェロン感受性にし、インターフェロン療法を有効にするための遺伝子治療に使用することができる。
【００７２】
即ち、本発明には、インターフェロン非感受性の個体にインターフェロン感受性を与えるための方法であって、インターフェロン非感受性の個体に対して、上記ポリヌクレオチド(at)〜(et)の何れかを導入することを含む方法が含まれる。また、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、インターフェロン非感受性の個体にインターフェロン感受性を与えるためのベクターが含まれる。更に、インターフェロン非感受性の個体にインターフェロン感受性を与えるための医薬の製造における、請求項１に記載のポリヌクレオチドの使用が含まれる。
【００７３】
更に、上記本発明のベクターは、これを適切な宿主に形質転換して発現させることにより、インターフェロン感受性を与えるタンパク質を製造するためにも使用することができる。
【００７４】
＜トランスジェニック動物＞
本発明のポリヌクレオチドを使用すれば、常法により、非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。この非ヒトトランスジェニック動物は、インターフェロンの機能を研究にするための実験動物として有用である。
【００７５】
【実施例】
以下、実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。
【００７６】
実施例１
本実施例では、MxA遺伝子のプロモーター領域の-88位（配列番号１の塩基配列では、455位に相当する）のヌクレオチドがチミンである遺伝子(以下MxA(T)と表記する)をヘテロ又はホモ接合で有するHCV感染者は、該ヌクレオチドがグアニンである遺伝子(以下MxA(G)と表記する)をホモ接合で有するHCV感染者に比べて、インターフェロン療法に対する応答性がよいことを実証した。
【００７７】
＜被験者＞
組織学的に慢性C型肝炎であると証明され、インターフェロン療法を行っている115人の患者と、抗HCV陰性の健康な者42人が本研究に参加した。これらの者は、全員日本人であり、互いに血縁関係はない。
【００７８】
115人の患者のうち、52人の患者は、インターフェロン療法終了後の少なくとも６月の追跡期間中、血清アラニンアミノトランスフェラーゼのレベルが正常な範囲にあり、且つHCVのRNAが常に陰性である持続的応答者(以下、SRと表記する)であり、63人の患者は、ALTレベルに関わらず、追跡期間中に、HCVのRNAが陽性のままであり、又はC型肝炎を再発した非応答者(以下、NRと表記する)であった。全ての患者には、総用量300万ユニットを超えるインターフェロンα及び／又はβを投与した。
【００７９】
＜MxA遺伝子分析＞
患者と健康な対照から採取したPBMCから核酸を抽出した。該核酸をPCRに供し、MxA遺伝子のプロモーター領域を包含する599ヌクレオチドのDNAを増幅した。
【００８０】
PCRの概略は、以下のとおりである。
【００８１】
0.05μgの核酸をTaq-Gold(パーキンエルマー)、配列番号５のオリゴヌクレオチドプライマー＃MXAF01(フォワードプライマー、-569〜-540位)、及び配列番号６のオリゴヌクレオチドプライマー#MXAF02(リバースプライマー、+30〜+1位)と混合した後(-569〜-540位は、配列番号１の塩基配列の47〜76位に相当する)、［95℃10分］、［95℃10秒、68℃60秒］×55、［72℃7分］のサイクル条件で、反応させた。PCR産物を直接解読することによって、157の試料のうち12個を配列決定した。
【００８２】
配列決定により、増幅した領域中のSNP部位を同定した後、対立遺伝子のヌクレオチドを識別可能に検出するためのRFLPシステムを構築した。全患者の599ヌクレオチドのPCR産物をHhaI(GCG↓C)で消化し、アガロースゲル中で電気泳動して、482ヌクレオチドのバンド及び533ヌクレオチドバンドの何れか又は両者が生成するか否かを調べた。
【００８３】
＜統計分析＞
イエーツの補正を行って、又は行わずに、フィッシャーの正確な確率テストによってグループデータを比較した。p<0.05を統計学的に有意と見做した。
【００８４】
＜結果＞
12のサンプルの配列決定を行うことによって、MxA遺伝子のプロモーター領域中に、多型部位が同定された。該プロモーター領域の-88位には、SNPが存在し(GとT)、該SNPは、図１に示されているISREに類似する領域中に含まれていた。
【００８５】
続くHhaIによるRFLPでは、全157サンプルについて、MxA遺伝子の遺伝子型を決定した。該アッセイでは、多型部位にグアニンを有する試料は、電気泳動ゲルに482ヌクレオチドのバントを示した。これに対して、グアニンがチミンに置換されると、HhaIが認識する制限部位が消失するので、533ヌクレオチドのバンドを示した。多型部位がグアニンであるプロモーター領域と多型部位がチミンであるプロモーター領域をヘテロ接合で有する場合には、482ヌクレオチドのバンドと533ヌクレオチドのバンドが共に検出される（図２参照）。
【００８６】
表１に示されているように、NR群では、患者の62%が、前記多型部位がグアニンであるプロモーター領域をホモ接合で有していたが(G・Gホモ)、SR群では、患者の31%がG・Gホモであった(p=0.0009；SR vs NR)。反対に、NR群では、患者の35%が、前記多型部位がグアニンであるプロモーター領域と前記多型部位がチミンであるプロモーター領域をヘテロ接合で有していたが(G・Tヘテロ)、SR群では、患者の60%が、G・Tヘテロであった(p=0.0082；SR vs.NR)。T・Tホモの患者は、それぞれ、NR群で3.2%、SR群で10%であった(p=0.2956；SR vs NR)。
【００８７】
前記多型部位がグアニンであるプロモーター領域を有する対立遺伝子の頻度は、SR群では0.606であったのに対して、NR群では0.794であった(p=0.0018；SR vs
NR)。
【００８８】
【表１】
Figure 0003983985
【００８９】
さらに、NR群に比べてSR群ではG・Gホモの個体が有意に少ないという上記の結果は、患者が感染したHCVの遺伝子型に依存しないことも明らかとなった。
【００９０】
【表２】
Figure 0003983985
【００９１】
表２から明らかなように、遺伝子型が1bであるHCVに感染した患者群（HCV 1b群）と遺伝子型が2a又は2bであるHCVに感染した患者群（HCV 2a/2b群）では、共にNR群は62%がG・Gホモの個体であるのに対して、SR群は、それぞれ28%及び32%がG・Gホモの個体であった。表２に示した結果から、患者が感染したHCVの遺伝子型にかかわらず、SR群ではG・Gホモの個体が有意に少ないことが明らかとなった（HCV 1b群；p=0.0321、HCV 2a/2b群；p=0.0318）。
【００９２】
以上、本実施例によって、前記多型部位がチミンであるMxAプロモーター領域をヘテロ接合又はホモ接合で有しているHCV感染者は、感染したHCVの遺伝子型によらず、インターフェロン療法に高い応答性を示すことが実証された。
【００９３】
また、本実施例は、前記多型部位がグアニンでないMxAプロモーター領域をヘテロ接合又はホモ接合で有しているHCV感染者は、インターフェロン療法に高い応答性を示すことも示唆している。
【００９４】
さらに、前記多型部位はISRE中に存在するので、これらのことは、C型肝炎以外の疾患についても当てはまるといえる。
【００９５】
実施例２：
実施例１で明らかになったように、MxAプロモーターのSNPがT型であるHCV感染者はインターフェロン投与による肝炎の治療効果が高い。一方、そのSNPがG型である場合には治療効果が低い。この理由として、ISREの機能を果たすための塩基配列であるT型はインターフェロンの刺激に正しく応答するが、G型はその配列と１塩基だけ異なるために、インターフェロンの刺激に応答せずMxA蛋白質の生成量が低いためと解釈される。
【００９６】
このような状況から考えるとMxAプロモーターのSNPがC型並びにA型のHCV肝炎の患者も、G型と同様にインターフェロンにMxAプロモーターは応答せず、その治療効果は低いと推定される。
【００９７】
これらの事を証明するために、MxAプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドを構築し、これをヒト細胞（HeLa細胞、並びに卵巣癌細胞）にトランスフェクションした。そして、４種類のSNP（T型、G型、A型、C型）を有するMxAプロモーターの夫々について、これらがインターフェロンに応答した結果として産生されるルシフェラーゼ活性を調べた。
【００９８】
その結果を図３〜図６に示す。図３は、インターフェロンαを用いてHela細胞内で誘導した例、図４は、インターフェロンαを用いて卵巣癌細胞内で誘導した例、図５は、インターフェロンβを用いてHela細胞内で誘導した例、図６は、インターフェロンβを用いて卵巣癌細胞内で誘導した例である。また、これらの図において、＋はインターフェロンを添加した場合のルシフェラーゼ活性を示し、−はインターフェロンを添加しないときのルシフェラーゼ活性を示している。これらの結果は何れも３回の実験の平均値であり、その標準偏差をバーで表示した。
【００９９】
図から明らかなように、何れの場合もT型のMxAプロモーターが最も高い値を示し、A型とC型のSNPを有するHCV肝炎の患者はG型の場合と同様に、インターフェロンa並びにインターフェロンbに対する応答が低い。従って、インターフェロンによる治療効果が低い事が予測される。
【０１００】
実施例３
本実施例では、MxA遺伝子を導入した胚性幹細胞(以下、ES細胞と表記する)によるMxAタンパク質の生成について説明する。
【０１０１】
MxA遺伝子のプロモーター領域の-88の塩基がTの遺伝子(MxA(T))およびGの遺伝子(MxA(G))を含む領域をプライマー#MXAF01（配列番号５）、#MXAR02（配列番号６）を使ってPCR法によって増幅した。
【０１０２】
次に増幅産物をリン酸カルシウム法でそれぞれES細胞にトランスフェクトした。反応条件は全て既報の条件に従った。これらの細胞にIFN-αを作用させMxAタンパク質の産生量をノーザンブロットで比較した。
【０１０３】
その結果、MxA(G)遺伝子を導入した細胞では、遺伝子を導入していない細胞と比較して約1.2倍量のMxAタンパク質の生成が確認できた。一方MxA(T)遺伝子を導入した細胞では、コントロール細胞の約2.5倍、MxA(G)遺伝子を導入した細胞と比較して約2倍のMxAタンパク質量を示すことが分った。
【０１０４】
本実施例によって、ES細胞中にMxA(T)遺伝子を導入することにより、MxAタンパク質を多量に生成し得ることが明らかとなった。
【０１０５】
本実施例の結果から、MxA(T)遺伝子を導入したES細胞を用いることにより、インターフェロンが有効な疾病に対する遺伝子治療の可能性が示唆された。
【０１０６】
また、MxA遺伝子を導入したES細胞を利用すればキメラ動物を作成し得る。さらに、キメラ動物を交配すればトランスジェニック動物を得ることもできる。
【０１０７】
実施例４： ES細胞への遺伝子導入
ES細胞はES/LIF培地で培養した後、エレクトロポレーションで遺伝子の導入を行った。エレクトロポレーションの条件を以下に示した。
【０１０８】
＜液組成＞：20mmol/L-HEPES(pH7.3)、137mmol/L-NaCl、5mmol/L-KCl、0.7mmol/L-Na2HPO4、6mmol/L-グルコース、0.1mmol/L-2-メルカプトエタノール
＜条件＞：450v、250μF、10min、室温、4mmキュベット
エレクトロポレーションの後、細胞をES/LIF培地に移し、既報に従い200μg/Lのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(G418)と2μmol/Lのガンシクロビル(GANC)を用いて、遺伝子が導入された細胞を選択した。得られた細胞からDNAの抽出を行いサザンハイブリダイゼーションで目的断片が導入されていることを確認した。
【０１０９】
本実施例により、エレクトロポレーションを用いて、ES細胞に遺伝子を導入し得ることが明らかとなった。
【０１１０】
実施例５
本実施例では、ベクターへのMxA遺伝子の導入について説明する。
【０１１１】
MxA遺伝子のプロモーター領域の-88の塩基がチミンである遺伝子(MxA(T))およびグアニンである遺伝子(MxA(G))を含む領域をプライマー#MXAF01(配列番号５)、#MXAR02（配列番号６）を使ってPCR法によって増幅した。次に増幅産物をpNTKベクターに従い導入した（図７）。反応条件は全て既報の条件に従った。ベクターは制限酵素で直鎖に切断した後、細胞への導入に用いた。
【０１１２】
MxA遺伝子が導入されたベクターを用いれば、標的細胞にMxA遺伝子を導入して、インターフェロンに対する応答性を改善せしめることができる。
【０１１３】
実施例６
本実施例では、MxA遺伝子を導入したES細胞でのMxAタンパク質生成を説明する。
【０１１４】
MxA(T)あるいはMxA(G)遺伝子を導入したこれらの細胞にIFN-αを作用させMxAタンパク質の産生量を比較した。ノーザンブロッティングで比較を行った結果、MxA(G)遺伝子を導入した細胞では、何も作用させていない細胞と比較して約1.5倍のMxAタンパク質生成が確認できた。一方MxA(T)遺伝子を導入した細胞では、コントロール細胞の約4.5倍、MxA(G)遺伝子を導入した細胞と比較して約3倍の値を示すことが分った。
【０１１５】
以上の結果から、MxA(T)遺伝子を導入したES細胞を用いることで、インターフェロンが有効な疾病に対する遺伝子治療を実施し得る可能性が示唆された。
【０１１６】
【発明の効果】
本発明のポリヌクレオチドを用いれば、ある個体に対して、インターフェロン療法が有効であるか否かを予測することができる。
【０１１７】
【配列表】
Figure 0003983985
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、MxA遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を示す図である。
【図２】図２は、HhaIを用いたRFLPの電気泳動写真である。
【図３】図３は、４種類のSNP（T型、G型、A型、C型）を有するMxAプロモーターの夫々について、Hela細胞内におけるインターフェロンαに対する応答性を、該プロモータの支配下にあるルシフェラーゼ活性を指標として比較した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、４種類のSNP（T型、G型、A型、C型）を有するMxAプロモーターの夫々について、卵巣癌細胞内におけるインターフェロンαに対する応答性を、該プロモータの支配下にあるルシフェラーゼ活性を指標として比較した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、４種類のSNP（T型、G型、A型、C型）を有するMxAプロモーターの夫々について、Hela細胞内におけるインターフェロンβに対する応答性を、該プロモータの支配下にあるルシフェラーゼ活性を指標として比較した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、４種類のSNP（T型、G型、A型、C型）を有するMxAプロモーターの夫々について、卵巣癌細胞内におけるインターフェロンβに対する応答性を、該プロモータの支配下にあるルシフェラーゼ活性を指標として比較した結果を示すグラフである。
【図７】図７は、遺伝子を導入したPtnkベクターの構造を模式的に示した図。
【符号の説明】
１：TK遺伝子、2：pTNKベクター、3：M+又はM-遺伝子、4：neo遺伝子、5：制限サイト

Claims (9)

  1. Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体に対してインターフェロン療法が有効であるか否かを予測するためのデータを収集する方法であって、
    前記固体から採取された、インターフェロン応答配列を含むポリヌクレオチドの配列が、配列番号５と一致する部分を含むかどうかを決定する工程を含んでなることを特徴とする方法。
  2. Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体に対してインターフェロン療法が有効であるか否かを予測するためのデータを収集する方法であって、
    前記固体から採取された、インターフェロン応答配列を含むポリヌクレオチドの配列が、配列番号６と一致する部分を含むかどうかを決定する工程を含んでなることを特徴とする方法。
  3. Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体に対してインターフェロン療法が有効であるか否かを予測するためのデータを収集する方法であって、
    前記固体から採取された、インターフェロン応答配列を含むポリヌクレオチドの配列が、配列番号７と一致する部分を含むかどうかを決定する工程を含んでなることを特徴とする方法。
  4. Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体に対してインターフェロン療法が有効であるか否かを予測するためのデータを収集する方法であって、
    前記固体から採取された、インターフェロン応答配列を含むポリヌクレオチドの配列が、配列番号８と一致する部分を含むかどうかを決定する工程を含んでなることを特徴とする方法。
  5. 請求項１に記載の方法を実施するために用いるためのポリヌクレオチドプローブであって、下記の配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドプローブ：
    ・下記配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチド、
    ・配列番号１に示されるポリヌクレオチドの断片であって、配列番号１の441〜456位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
    ・上記ポリヌクレオチドの相補鎖。
  6. 請求項２に記載の方法を実施するために用いるためのポリヌクレオチドプローブであって、下記の配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドプローブ：
    ・下記配列表の配列番号２に示されるポリヌクレオチド、
    ・配列番号２に示されるポリヌクレオチドの断片であって、配列番号２の441〜456位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
    ・上記ポリヌクレオチドの相補鎖。
  7. 請求項３に記載の方法を実施するために用いるためのポリヌクレオチドプローブであって、下記の配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドプローブ：
    ・下記配列表の配列番号３に示されるポリヌクレオチド、
    ・配列番号３に示されるポリヌクレオチド断片であって、配列番号３の441〜456位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
    ・上記ポリヌクレオチドの相補鎖。
  8. 請求項４に記載の方法を実施するために用いるためのポリヌクレオチドプローブであって、下記の配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドプローブ：
    ・下記配列表の配列番号４に示されるポリヌクレオチド、
    ・配列番号４に示されるポリヌクレオチド断片であって、配列番号４の441〜456位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
    ・上記ポリヌクレオチドの相補鎖。
  9. Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体に対して、インターフェロン療法が有効であるかどうかを予測するための試験薬であって、請求項５〜８の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする試験薬。
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