JP3949196B2 - Immunosuppressant - Google Patents

Description

【０００７】
【化２】

【０００８】
また、本発明は前記化合物を有効成分とするアポトーシス誘導剤及び白血病治療剤に関する。
このような化合物としては、シクロプロジギオシンあるいはシクロプロジギオシン塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、カルボン酸塩（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩等）、ヨウ素酸塩、臭素酸塩、ピクリン酸塩、スルホン酸塩、テトラフルオロボレート塩等を例示することができる。
【０００９】
シクロプロジギオシンは、海洋細菌のアルテロモナス ルブラ、(Alteromonasrubra)(Tetrahedron Letters 24 (26),2701-2704(1983))あるいはベネッケアガゾゲネス(Benekea gazogenes) (同上誌 24(27),2797-2798(1983)) から産生される赤い色素であり、また 2- メチルシクロヘキサノンを出発物質として次の工程を経て合成する方法も知られている(Tetrahedron Letters 25,(13) 1387-1388(1984))。
【００１０】
【化３】

【００１１】
シクロプロジギオシン塩酸塩等の前記化合物は、このようにして得られたシクロプロジギオシンを塩の形に変換することによって得ることができる。塩とする手段は、通常の塩形成手段を用いることができる。
しかし、これらの海洋細菌から得られるシクロプロジギオシンは、数種のプロジギオシン類を爽雑物の形で産生しているので、抽出物のなかからシクロプロジギオシン単体を単離するには煩雑な単離操作を必要とした。
また、前記化学合成によってシクロプロジギオシンを製造する方法は多工程にわたる複雑な工程を必要としていた。
【００１２】
本発明者らは、海洋細菌の代謝産物について検討を行なっていたところ、シュードアルテロモナス デニトリフィカンス（Pseudoalteromonas denitrificans) AK-1株(FERM P-15771)がシクロプロジギオシン塩酸塩を、他のプロジギオシン類の爽雑物を含むことなく産生することを見出した。前記菌体を培養するとシクロプロジギオシン塩酸塩が菌体内及び培地中に大量に生成蓄積されるので、これを高純度で大量に作ることができる。このシクロプロジギオシン塩酸塩は、カラムクロマトグラフィー処理することによって容易に塩化水素をはずし塩酸塩のない遊離のシクロプロジギオシンを得ることができる。そして、この遊離シクロプロジギオシン (シクロプロジギオシン塩酸塩から塩化水素をはずした式(I) で示される化合物をいう) をリン酸、硫酸等の酸で処理することによって前記した塩類とすることができる。
本発明で使用するシクロプロジギオシン塩酸塩、その他の塩は、水に可溶性であり、蒸留水等に溶解して使用することができる。従って、注射剤、ドリンク剤等としても用いることができる。
【００１３】
本発明においてシクロプロジギオシンあるいはシクロプロジギオシン塩酸塩その他の塩が免疫抑制剤の有効成分となること、及びこれらの化合物がコンカナバリンＡ(ConA)刺激によるマウスリンパ球の増殖を特異的に抑制する作用があることに基づくものである。ちなみに、コンカナバリンＡはＴ細胞のマイトジェンとして知られている。
さらに、本発明者らは、シクロプロジギオシンあるいはシクロプロジギオシン塩酸塩が、急性リンパ芽球性白血病患者の末梢血に由来するヒトＴ細胞株の Jurkat 細胞でＤＮＡを分断化し、特異的にアポトーシスを誘導する作用があることを見出した。
アポトーシスは、最近注目されるようになってきた細胞死のひとつである。アポトーシスが最近注目されることになってきたのは、次の理由からと考えられる。
【００１４】
▲１▼アポトーシスが個体形成において重要な役割を演じていること、
▲２▼生体内での内的、外的要因による細胞死が多くの場合アポトーシスによること、
▲３▼エイズその他の疾病の原因となる体細胞 (リンパ細胞等) の変性にアポトーシスが深く関与していること、
▲４▼各種の抗ガン剤によるガン細胞の破壊にアポトーシスが関与していること、及び
▲５▼細胞生物学的に Programmed ｃell death(プログラムされた細胞死) との関連で、基本的興味がもたれていること。
【００１５】
従って、本発明におけるシクロプロジギオシンあるいはシクロプロジギオシン塩酸塩等のシクロプロジギオシンの塩類がアポトーシスを誘導するという知見は、これらの化合物をアポトーシスが関与する疾病の治療やそれらの基礎研究に応用することを可能にするものである。
さらに、本発明者らは、前記 Jurkat 細胞及び M1-3b細胞 (骨髄白血病のSLマウス由来骨髄芽球細胞) を用いて、シクロプロジギオシン塩酸塩等のシクロプロジギオシン塩の細胞生育に対する影響をみたところ、これらの白血病細胞株の生育を阻害し、致死させることを見出した。
【００１６】
本発明におけるシクロプロジギオシン、シクロプロジギオシン塩酸塩あるいはその他の塩は、これをそのまま免疫抑制剤その他の薬剤として用いることができるが、通常は、賦形剤、その他の補助剤とともに適当な製剤の形にして経口あるいは非経口の形で投与される。経口剤としては、粉剤、顆粒剤、錠剤、糖衣剤、丸剤、カプセル剤、ドリンク剤等がある。また、非経口製剤には、坐剤、パップ剤、注射剤等がある。注射剤は、筋肉注射、動脈注射あるいは静脈注射の形の剤型とするとよい。
これらの賦形剤その他の補助剤としては、乳糖、しょ糖、各種のでん粉、ぶどう糖、セルロースあるいはその誘導体、ステアリン酸マグネシウム、タルク等が用いられる。また、蒸留水等の溶媒を用いることができる。これらは、製剤手段として通常知られている手段で経口あるいは非経口の製剤にすることができる。投与量は、症状、年齢、性別等によって相違するが、経口投与の場合は、シクロプロジギオシンあるいはその塩酸塩その他の塩を１日当り 0.1〜0.5mg/体重kg、非経口投与の場合は、注射剤で１日当り 0.1〜0.5mg/体重kgを投与することが望ましい。
【００１７】
これらの化合物の毒性については、シクロプロジギオシン塩酸塩をＩＣＲ雌性マウス（５週令、体重25〜29g)の腹腔内に投与したところ LD₅₀ 値は10mg以上であった。
また、シクロプロジギオシン塩酸塩をリン脂質平面膜法 (1992年７月10日（株）東京化学同人発行、（財）日本生化学会編 新生化学実験講座「生体膜と膜輸送（上）」第 181-187頁) により比抵抗を検討した。その結果を図１に示した。この図に示されるようにイオノフォアのひとつであるカルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)に比較して、イオノフォア活性を示さなかったことからみて、毒性がきわめて低いものと判断される。
【００１８】
本発明のシクロプロジギオシン塩酸塩の製造例を示す。
バクトペプトン(Difco)2.5g 、バクトイーストエクストラクト(Difco)0.5g 及びリン酸鉄(III)n水和物（和光純薬)0.1g を天然海水1L中に溶解した後、滅菌し、その 3ml中に、シュードアルテロモナス・デニトリフィカンス(Pseudoalteromonas denitrificans) AK-1株 (FERM P-15771) を、接種し、15〜20℃で１日間振盪培養を行なった。得られた培養物を上記組成の培地 600mlに移し、１日間培養を行なった。
【００１９】
このようにして培養された培地を22,000 rpmで20分間遠心分離し、菌体を回収した。菌体は５〜10g が回収された。この菌体にアセトン- ジエチルエーテル(4:1) 混液を加え200 振盪/minで色素 (シクロプロジギオシン塩酸塩) を抽出した。抽出液を12,000 rpmで10分間遠心分離して上清液を得た。この上清液に無水硫酸マグネシウムを加えて水分を吸着除去し、この硫酸マグネシウムを濾過して除去した。濾液を乾固するまで濃縮し、これを薄層クロマトグラフィーによって分析した(Kieselgel 60 F₂₅₄; 展開溶媒ベンゼン: エーテル＝1:1)。Rf 0.20 に単一のスポットが得られた。この濃縮物を塩化メチレン5ml に溶解し、この溶液から温度差を利用して再結晶した。生成した結晶をペンタンで洗浄し、吸引濾過して結晶 5mgを採取した。
この結晶は、赤色の金属光沢をもった針状結晶であって、融点はなく、約 230℃で分解した。この結晶を、元素分析し、またその Mass スペクトル、UVスペクトル、IRスペクトル、 H-NMRスペクトルを解析したところ、シクロプロジギオシン塩酸塩（化II) のそれと一致し（Tetrahedron Letters, 24 (26), 2701-2704(1983)) 、同化合物であることが同定された。
【００２０】
このようにして得られたシクロプロジギオシン塩酸塩 5mgを塩化メチレン10mlに溶解し、シリカゲルカラム (口径 1.5cm，長さ12cm, 流速1.2ml/min)を通過させ、溶媒を留去して遊離シクロプロジギオシン 4mgを得た。この物質が遊離シクロプロジギオシンであることはH-NMR 等のデータによって確認された。
【００２１】
次にシクロプロジギオシン薬理作用を実験例を示して説明する。
〔実験１〕 コンカナバリンＡ刺激によるマウスリンパ球の細胞増殖に対する抑制効果
マウス脾臓よりリンパ球を採取し、これを10％ FBS-RPMI1640 培養液で希釈し、 2.0×10⁶ cells/mlの細胞液とした。この細胞液 1mlに、コンカナバリンＡ１または５μg/mlとシクロプロジギオシン塩酸塩を最終濃度が図２に示される濃度になるように加え、37℃で48時間インキュベートし、トリチウムチミジン0.25μCiを添加し数時間培養後、濾過して細胞を回収した。濾紙に吸着した細胞にシンチレーター溶液 1mlを加え、これを液体シンチレーションカウンターで測定し、細胞中に取り込まれたトリチウム放射能量を測定した。その結果を図２に示す、図にみられるようにコンカナバリンＡ刺激によるマウスリンパ球の増殖を特異的に抑制した。
現在、臨床で使用されている FK 506,シクロスポリンもコンカナバリンＡ刺激によるマウスリンパ球の増殖を阻害するが、コンカナバリンＡの濃度が高いと増殖抑制効果は弱いといわれている(The Journal of Antibiotics XLIII(10),1293-1301(1990))。これに対し、本発明では、シクロプロジギオシン塩酸塩は、コンカナバリンＡの濃度依存的に増殖抑制効果を示す。またその化学構造も FK 506,シクロスポリンと相違することからみてシクロプロジギオシン塩酸塩によるリンパ球の増殖抑制機構は FK 506,シクロスポリンと相違するものと考えられる。
【００２２】
〔実験２〕 遊離シクロプロジギオシン及びシクロプロジギオシン塩酸塩のリンパ球増殖抑制効果
コンカナバリンＡ濃度を２μg/mlとし、シクロプロジギオシン塩酸塩と遊離シクロプロジギオシンとを用い実験１と同様にマウスリンパ球増殖に対する抑制効果を検討した。その結果を図３に示した。図３に示されるように、シクロプロジギオシン塩酸塩及び遊離シクロプロジギオシンは、いずれも同様にマウスリンパ球の増殖を抑制し、免疫抑制効果があることが確認された。
【００２３】
〔実験３〕 Jurkat細胞のＤＮＡ分断化作用
シクロプロジギオシン塩酸塩を10mMとなるようにDMSOに溶解し、その後さらに水で希釈した。これを最終濃度が図４に示される濃度になるように10％FBS-RMPI1640培養液に添加し、あるいはこれにコンカナバリンＡ 2μg/mlを添加し、５×10⁶cells/10cm dishの細胞密度でヒトＴ細胞株 Jurkat を接種し、37℃で18時間インキュベートした。この培地を遠心分離して細胞を回収し、細胞溶解溶液を加えて、遠心して上清を採取した。得られた上清 500μl に対して、3M酢酸ナトリウム50μl 、エタノール１mlを加えてよく攪拌し、−20℃に１時間放置し、15000 rpm で30分間遠心し、沈殿を生ぜしめた。この沈殿をTE溶液に溶解し、260nm の吸光度を測定し、この吸光度に基づいてヌクレオチド２μg/μl を含有する溶液を調製し、これにＲＮＡ分解酵素を加え、37℃で1 時間インキュベートした。得られた酵素処理液を、アガロースゲルを使用し、ゲルローディングバッファー 2μl と前記酵素処理液10μl とを混合したものを電気泳動にかけ、ＤＮＡの分断化を確認した。この結果を図４に示した。白いバンドはＤＮＡを示している。図Ａは、シクロプロジギオシン塩酸塩単独添加を、ＢはこれとコンカナバリンＡで細胞を刺激したものを示す。またマーカーとしてλ−Hind IIIを使用した。図４に示されるように、シクロプロジギオシン塩酸塩の濃度依存的に断片化されたＤＮＡ量が増加していることが分かる。これは、シクロプロジギオシン塩酸塩を単独で用いることにより特異的にアポトーシスを誘導することができることを示している。また、シクロプロジギオシン塩酸塩にコンカナバリンＡ 2μg/ml添加することによって、同じレーンにおいても図ＡよりＤＮＡ量が増加している。これは、コンカナバリンＡを添加することによってアポトーシス誘導をさらに亢進することが確認された。
なお、図Ｂのレーン２は、シクロプロジギオシン塩酸塩を添加せず、コンカナバリンＡのみで刺激したものである。このレーン２が図Ａのレーン２と同じ電気泳動のパターンを示している。図Ａのレーン２は、シクロプロジギオシン塩酸塩を添加しないものの電気泳動パターンであるから、このことからみてコンカナバリンＡ 2μg/mlのみではアポトーシスを誘導することができないことが確認される。
シクロプロジギオシン塩酸塩は、アポトーシスが関係する各種の疾病の治療及びその研究に応用することができる。
【００２４】
〔実験４〕 Jurkat細胞及び M1-3b細胞に対する生育阻害作用
前記したようなJurkat細胞及びマウス白血病細胞株 M1-3b細胞を用い、これらの細胞の生育に対するシクロプロジギオシン塩酸塩の影響を MTT法により調べた。 MTT法は、生細胞がテトラゾリウム塩である MTTを青色のホルマザン産物へ転換することを原理とし、生細胞数の指標としてよく用いられる方法である。これらの細胞を、シクロプロジギオシン塩酸塩で刺激し、24時間後に595nm の吸光度を測定し、シクロプロジギオシン塩酸塩無添加の対照の吸光度を 100とし、その比率を求めたものである。また、NRK 細胞 (ラットの腎臓由来細胞株) についても同様の方法で実験を行なった。この結果を図５に示す。
図５に示すように、NRK 細胞では、シクロプロジギオシン塩酸塩(PdG) の濃度が高くなっても細胞生育阻害は生じていないのに対し、Jurkat細胞、M1-3b 細胞では、シクロプロジギオシン塩酸塩の濃度に依存して生育阻害がおこり、細胞を死滅させている。両者ともほぼ 5μg/mlの濃度で生育がほとんど阻害されている。
このようにシクロプロジギオシン塩酸塩は、白血病細胞株に対して特異的に致死効果をもたらし、白血病の治療薬として有効である。
【００２５】
次に実施例として製剤例を示す。
【実施例１】
シクロプロジギオシン塩酸塩 0.5g
乳糖 400 g
ヒドロキシプロピルセルロース 50 g
澱粉 50 g
上記の成分を混合し、常法により顆粒剤を製造した。
【００２６】
【実施例２】
シクロプロジギオシン塩酸塩 20 mg
Tween 80 0.4 g
蒸留水 200 ml
シクロプロジギオシン塩酸塩20mgをTween 80 0.4g とともに蒸留水 200mlに溶解し、20mlのアンプルに充填し、加熱殺菌して静脈注射剤を調製した。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、シクロプロジギオシンあるいはその塩酸塩等のシクロプロジギオシン塩のリンパ球、Jurkat細胞生育抑制効果を利用してこれらの化合物を臓器移植のさいの免疫抑制剤又はアポトーシス誘導剤あるいは白血病治療剤として有効に用いることができる。そして得られた剤は、経口または非経口で投与することによりこれらの疾病の治療効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】シクロプロジギオシン塩酸塩のリン脂質平面膜の比抵抗を示す。
【図２】実験１のコンカナバリンＡ刺激によるリンパ球の増殖活性におけるシクロプロジギオシン塩酸塩の影響を示す。
【図３】実験２の遊離シクロプロジギオシン及びシクロプロジギオシン塩酸塩の免疫抑制効果を示す。
【図４】実験３のシクロプロジギオシン塩酸塩のヒトＴ細胞株のＤＮＡ分断化を示す電気泳動図を示す。（Ａは、シクロプロジギオシン塩酸塩の単独使用を、Ｂは、これとコンカナバリンＡで細胞を刺激したものの電気泳動図を示す。）
レーン１はマーカー、レーン２〜８は順にシクロプロジギオシン塩酸塩を最終濃度が 0,1,4,11,36,107,357 ng/mlになるように添加したものを示す。
【図５】実験４のシクロプロジギオシン塩酸塩(PdG) の白血病細胞株に対する生育阻害効果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel immunosuppressive agent, apoptosis inducer and leukemia therapeutic agent.
[0002]
[Prior art]
During organ transplantation, rejection may occur in the living organism (recipient). Conventionally, immunosuppressive agents have been used to suppress this rejection reaction. As such an immunosuppressant, tacrolimus (FK506), cyclosporine, and the like are used. However, administration of these drugs may cause serious side effects, particularly kidney damage. The details of the mechanism were unknown until recently, but this mechanism has recently been suggested to be the action of these drugs through the immunosuppressive mechanism, calcineurin (J. Exp. Med. , 176 , 751-760 (1992)). For this reason, it is expected to develop an immunosuppressive agent by a mechanism different from such an immunosuppressive mechanism, enhance the immunosuppressive effect, reduce the induction of serious side effects, and succeed in organ transplantation.
[0003]
The present inventors paid attention to the development of such an immunosuppressive agent and examined the immunosuppressive effect using various compounds. As a result, Pseudoalteromonas s. denitrificans ) The red substance cycloprodigiosin hydrochloride produced by the AK-1 strain (FERM P-15771) was found to specifically inhibit the proliferation of mouse lymphocytes induced by concanavalin A. And it investigated about using this compound as an active ingredient of an immunosuppressant.
Furthermore, when the pharmacological action of cycloprodigiosin hydrochloride was examined, it was found that it induces apoptosis and inhibits the growth of various leukemia cell lines.
Then, hydrogen chloride was removed from this compound, and it was found that the same effect was obtained with free cycloprodigiosin having no hydrochloride.
Conventionally, cycloprodigiosin is known to have antibacterial activity and antifungal activity (Tetrahedron Letters 30 (13) 1725 (1989)), but pharmacological action of cycloprodigiosin and its hydrochloride as described above. Is not known at all.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above, an object of the present invention is to provide a novel immunosuppressive agent, apoptosis inducer, and leukemia therapeutic agent.
Furthermore, the subject of this invention is providing the novel use of cycloprodigiosin and its salt.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and comprises an immunosuppressive agent containing cycloprodigiosin (Chemical Formula I) or cycloprodigiosin hydrochloride (Chemical Formula II) or another salt as an active ingredient About.
[0006]
[Chemical 1]

[0007]
[Chemical 2]

[0008]
The present invention also relates to an apoptosis inducer and leukemia therapeutic agent comprising the compound as an active ingredient.
Such compounds include cycloprodigiosin or cycloprodigiosin hydrochloride, phosphate, sulfate, perchlorate, carboxylate (eg, acetate, citrate, oxalate, etc.), Examples thereof include iodate, bromate, picrate, sulfonate, tetrafluoroborate salt and the like.
[0009]
Cycloprodigiosin is derived from the marine bacterium Alteromonas rubra (Alteromonasrubra) (Tetrahedron Letters 24 (26), 2701-2704 (1983)) or Benekea gazogenes (ibid. 24 (27), 2797-2798. (1983)) is also a red pigment produced from 2-methylcyclohexanone as a starting material, and a method of synthesis through the following steps is also known (Tetrahedron Letters 25 , (13) 1387-1388 (1984)) .
[0010]
[Chemical 3]

[0011]
Said compounds such as cycloprodigiosin hydrochloride can be obtained by converting the cycloprodigiosin thus obtained into a salt form. As a means for forming a salt, a usual salt forming means can be used.
However, cycloprodigiosin obtained from these marine bacteria produces several kinds of prodigiosins in the form of a refreshing product, so it is cumbersome to isolate cycloprodigiosin alone from the extract. Necessitated an isolated operation.
In addition, the method for producing cycloprodigiosin by the chemical synthesis requires complicated steps over many steps.
[0012]
The present inventors have examined the metabolite of a marine bacterium. Pseudoalteromonas s denitrificans AK-1 strain (FERM P-15771) obtained cycloprodigiosin hydrochloride. It was found that the product was produced without containing other prodigiosins. When the cells are cultured, cycloprodigiosin hydrochloride is produced and accumulated in large quantities in the cells and in the medium, and can be produced in large quantities with high purity. This cycloprodigiosin hydrochloride can easily remove hydrogen chloride by column chromatography to obtain free cycloprodigiosin without hydrochloride. Then, this free cycloprodigiosin (referred to as a compound represented by the formula (I) in which hydrogen chloride is removed from cycloprodigiosin hydrochloride) is treated with an acid such as phosphoric acid or sulfuric acid to obtain the aforementioned salts. be able to.
Cycloprodigiosin hydrochloride and other salts used in the present invention are soluble in water and can be used by dissolving in distilled water or the like. Therefore, it can be used as an injection, a drink and the like.
[0013]
In the present invention, cycloprodigiosin or cycloprodigiosin hydrochloride and other salts are active ingredients of immunosuppressants, and these compounds specifically inhibit mouse lymphocyte proliferation induced by concanavalin A (ConA). This is based on the effect of Incidentally, concanavalin A is known as a mitogen for T cells.
Furthermore, the present inventors have shown that cycloprodigiosin or cycloprodigiosin hydrochloride cleaves DNA in Jurkat cells, a human T cell line derived from the peripheral blood of patients with acute lymphoblastic leukemia, specifically It was found that it has an effect of inducing apoptosis.
Apoptosis is one of the cell deaths that has recently attracted attention. Apoptosis has recently attracted attention for the following reasons.
[0014]
(1) Apoptosis plays an important role in individual formation,
(2) Cell death in vivo due to internal and external factors is often due to apoptosis,
(3) Apoptosis is deeply involved in the degeneration of somatic cells (lymphocytes, etc.) that cause AIDS and other diseases.
(4) Basic interest is related to the involvement of apoptosis in the destruction of cancer cells by various anti-cancer agents, and (5) cell biologically, programmed cell death. Leaning.
[0015]
Therefore, the finding that cycloprodigiosin salts such as cycloprodigiosin or cycloprodigiosin hydrochloride in the present invention induce apoptosis is useful for the treatment of diseases related to apoptosis and their basic research. It is possible to apply.
Furthermore, the present inventors have used the Jurkat cells and M1-3b cells (myeloblasts derived from myelogenous leukemia SL mice) to influence the cell growth of cycloprodigiosin salts such as cycloprodigiosin hydrochloride. As a result, it was found that the growth of these leukemia cell lines was inhibited and lethal.
[0016]
The cycloprodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride or other salt in the present invention can be used as it is as an immunosuppressant or other drug, but is usually suitable together with excipients and other adjuvants. It is administered in oral or parenteral form in the form of a preparation. Oral agents include powders, granules, tablets, dragees, pills, capsules, drinks and the like. Parenteral preparations include suppositories, cataplasms, injections and the like. The injection may be in the form of intramuscular injection, arterial injection or intravenous injection.
As these excipients and other auxiliary agents, lactose, sucrose, various starches, glucose, cellulose or derivatives thereof, magnesium stearate, talc and the like are used. A solvent such as distilled water can be used. These can be made into oral or parenteral preparations by means commonly known as preparation means. The dosage varies depending on symptoms, age, sex, etc., but in the case of oral administration, 0.1 to 0.5 mg / kg body weight of cycloprodigiosin or its hydrochloride or other salt per day, in the case of parenteral administration, It is desirable to administer 0.1 to 0.5 mg / kg body weight per day by injection.
[0017]
Regarding the toxicity of these compounds, when cycloprodigiosin hydrochloride was administered intraperitoneally to ICR female mice (5 weeks old, body weight 25-29 g), the LD ₅₀ value was 10 mg or more.
Cycloprodigiosin hydrochloride is converted into a phospholipid planar membrane method (published on July 10, 1992 by Tokyo Kagaku Doujin, Japan Biochemical Society, New Biochemistry Experiment Course "Biological membranes and membrane transport (up)". 181-187)), the specific resistance was examined. The results are shown in FIG. As shown in this figure, compared to carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), which is one of the ionophores, it is judged that the toxicity is extremely low because it does not show ionophore activity. .
[0018]
The manufacture example of the cycloprodigiosin hydrochloride of this invention is shown.
Dissolve 2.5 g of bactopeptone (Difco), 0.5 g of bacto yeast extract (Difco) and 0.1 g of iron (III) phosphate hydrate (Wako Pure Chemical Industries) in 1 liter of natural seawater, sterilize, 3 ml Inside, Pseudoalteromonas denitrificans AK-1 strain (FERM P-15771) was inoculated and cultured at 15 to 20 ° C. for 1 day. The obtained culture was transferred to 600 ml of the medium having the above composition and cultured for 1 day.
[0019]
The culture medium cultured in this manner was centrifuged at 22,000 rpm for 20 minutes, and the cells were collected. 5-10 g of cells were recovered. A mixture of acetone-diethyl ether (4: 1) was added to the cells, and the dye (cycloprodigiosin hydrochloride) was extracted at 200 shaking / min. The extract was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant. Anhydrous magnesium sulfate was added to the supernatant to adsorb and remove moisture, and the magnesium sulfate was removed by filtration. The filtrate was concentrated to dryness and analyzed by thin layer chromatography (Kieselgel 60 F ₂₅₄ ; developing solvent benzene: ether = 1: 1). A single spot was obtained at Rf 0.20. This concentrate was dissolved in 5 ml of methylene chloride and recrystallized from this solution using the temperature difference. The produced crystals were washed with pentane and suction filtered to collect 5 mg of crystals.
This crystal was a needle-like crystal having a red metallic luster, had no melting point, and decomposed at about 230 ° C. Elemental analysis of this crystal and analysis of its mass spectrum, UV spectrum, IR spectrum and 1 H-NMR spectrum revealed that it was consistent with that of cycloprodigiosin hydrochloride (Chemical II) (Tetrahedron Letters, 24 (26) , 2701-2704 (1983)), and was identified as the same compound.
[0020]
5 mg of the cycloprodigiosin hydrochloride thus obtained is dissolved in 10 ml of methylene chloride, passed through a silica gel column (diameter 1.5 cm, length 12 cm, flow rate 1.2 ml / min), and the solvent is distilled off to release. 4 mg of cycloprodigiosin was obtained. It was confirmed by data such as H-NMR that this substance was free cycloprodigiosin.
[0021]
Next, the pharmacological action of cycloprodigiosin will be described with reference to experimental examples.
[Experiment 1] Inhibitory effect on cell proliferation of mouse lymphocytes by stimulation with concanavalin A Lymphocytes were collected from the mouse spleen and diluted with 10% FBS-RPMI1640 culture solution to obtain 2.0 × 10 ⁶ cells / ml cell solution. did. To 1 ml of this cell solution, add concanavalin A1 or 5 μg / ml and cycloprodigiosin hydrochloride so that the final concentration is as shown in FIG. 2, and incubate at 37 ° C. for 48 hours, and then add tritiated thymidine 0.25 μCi. After culturing for several hours, the cells were collected by filtration. 1 ml of scintillator solution was added to the cells adsorbed on the filter paper, and this was measured with a liquid scintillation counter to measure the amount of tritium radioactivity incorporated into the cells. The results are shown in FIG. 2, and the proliferation of mouse lymphocytes by concanavalin A stimulation was specifically suppressed as seen in the figure.
FK 506 and cyclosporin currently used clinically also inhibit the growth of mouse lymphocytes by concanavalin A stimulation, but it is said that the growth inhibitory effect is weak when the concentration of concanavalin A is high (The Journal of Antibiotics XLIII ( 10), 1293-1301 (1990)). In contrast, in the present invention, cycloprodigiosin hydrochloride exhibits a growth inhibitory effect in a concanavalin A concentration-dependent manner. The chemical structure is also different from that of FK 506 and cyclosporine. Therefore, the mechanism of inhibition of lymphocyte proliferation by cycloprodigiosin hydrochloride is considered to be different from that of FK 506 and cyclosporin.
[0022]
[Experiment 2] Lymphocyte growth inhibitory effect of free cycloprodigiosin and cycloprodigiosin hydrochloride Concanavalin A concentration was set to 2 μg / ml, and the same as experiment 1 using cycloprodigiosin hydrochloride and free cycloprodigiosin In addition, the inhibitory effect on mouse lymphocyte proliferation was examined. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 3, it was confirmed that both cycloprodigiosin hydrochloride and free cycloprodigiosin similarly suppressed the proliferation of mouse lymphocytes and had an immunosuppressive effect.
[0023]
[Experiment 3] DNA fragmentation of Jurkat cells Cycloprodigiosin hydrochloride was dissolved in DMSO to a concentration of 10 mM, and then further diluted with water. Add this to the 10% FBS-RMPI1640 culture solution so that the final concentration is as shown in FIG. 4, or add 2 μg / ml of concanavalin A to this to a cell density of 5 × 10 ⁶ cells / 10 cm dish. Human T cell line Jurkat was inoculated and incubated at 37 ° C. for 18 hours. The medium was centrifuged to recover the cells, a cell lysis solution was added, and the supernatant was collected by centrifugation. To 500 μl of the obtained supernatant, 50 μl of 3M sodium acetate and 1 ml of ethanol were added and stirred well, left at −20 ° C. for 1 hour, and centrifuged at 15000 rpm for 30 minutes to form a precipitate. This precipitate was dissolved in a TE solution, and the absorbance at 260 nm was measured. Based on this absorbance, a solution containing 2 μg / μl of nucleotide was prepared, RNase was added thereto, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. The obtained enzyme-treated solution was subjected to electrophoresis using an agarose gel, and a mixture of 2 μl of gel loading buffer and 10 μl of the enzyme-treated solution was subjected to electrophoresis to confirm DNA fragmentation. The results are shown in FIG. A white band indicates DNA. Fig. A shows addition of cycloprodigiosin hydrochloride alone, and B shows stimulation of cells with this and concanavalin A. In addition, λ-Hind III was used as a marker. As shown in FIG. 4, it can be seen that the amount of fragmented DNA in cycloprodigiosin hydrochloride is dependent on the concentration. This indicates that apoptosis can be specifically induced by using cycloprodigiosin hydrochloride alone. Further, by adding 2 μg / ml concanavalin A to cycloprodigiosin hydrochloride, the amount of DNA in FIG. This was confirmed to further enhance apoptosis induction by adding concanavalin A.
In FIG. B, lane 2 was stimulated with only concanavalin A without adding cycloprodigiosin hydrochloride. This lane 2 shows the same electrophoresis pattern as lane 2 in FIG. Lane 2 in FIG. A shows an electrophoresis pattern with no addition of cycloprodigiosin hydrochloride. From this, it is confirmed that apoptosis cannot be induced only with 2 μg / ml of concanavalin A.
Cycloprodigiosin hydrochloride can be applied to the treatment and research of various diseases related to apoptosis.
[0024]
[Experiment 4] Growth inhibitory action on Jurkat cells and M1-3b cells Using the Jurkat cells and mouse leukemia cell line M1-3b cells as described above, the effect of cycloprodigiosin hydrochloride on the growth of these cells was determined by the MTT method. We investigated by. The MTT method is a method often used as an indicator of the number of living cells based on the principle that living cells convert MTT, which is a tetrazolium salt, into a blue formazan product. These cells were stimulated with cycloprodigiosin hydrochloride, the absorbance at 595 nm was measured 24 hours later, the absorbance of a control without cycloprodigiosin hydrochloride was taken as 100, and the ratio was determined. NRK cells (rat kidney-derived cell lines) were also tested in the same manner. The result is shown in FIG.
As shown in FIG. 5, in NRK cells, cell growth inhibition did not occur even when the concentration of cycloprodigiosin hydrochloride (PdG) was increased, whereas in Jurkat cells and M1-3b cells, cycloprodigios. Depending on the concentration of cin hydrochloride, growth inhibition occurs and cells are killed. In both cases, growth is almost inhibited at a concentration of approximately 5 μg / ml.
Thus, cycloprodigiosin hydrochloride has a specific lethal effect on leukemia cell lines and is effective as a therapeutic agent for leukemia.
[0025]
Next, formulation examples are shown as examples.
[Example 1]
Cycloprodigiosin hydrochloride 0.5g
Lactose 400 g
Hydroxypropylcellulose 50 g
Starch 50 g
The above ingredients were mixed and a granule was produced by a conventional method.
[0026]
[Example 2]
Cycloprodigiosin hydrochloride 20 mg
Tween 80 0.4 g
Distilled water 200 ml
Cycloprodigiosin hydrochloride (20 mg) was dissolved in distilled water (200 ml) together with Tween 80 (0.4 g), filled into a 20 ml ampule, and heat-sterilized to prepare an intravenous injection.
[0027]
【The invention's effect】
According to the present invention, these compounds are used as an immunosuppressant or apoptosis inducer during organ transplantation by utilizing the effect of inhibiting the growth of lymphocytes and Jurkat cells of cycloprodigiosin salts such as cycloprodigiosin or its hydrochloride. Alternatively, it can be used effectively as a therapeutic agent for leukemia. The obtained agent can be expected to be effective for treating these diseases by oral or parenteral administration.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the specific resistance of a phospholipid planar membrane of cycloprodigiosin hydrochloride.
FIG. 2 shows the influence of cycloprodigiosin hydrochloride on the proliferation activity of lymphocytes stimulated by concanavalin A in Experiment 1.
FIG. 3 shows the immunosuppressive effect of free cycloprodigiosin and cycloprodigiosin hydrochloride of Experiment 2.
FIG. 4 shows an electrophoretogram showing DNA fragmentation of cycloprodigiosin hydrochloride human T cell line in Experiment 3. (A shows the electropherogram of the single use of cycloprodigiosin hydrochloride, and B shows the electropherogram of the cells stimulated with this and concanavalin A.)
Lane 1 shows a marker, and lanes 2-8 show cycloprodigiosin hydrochloride added in order so that the final concentration becomes 0,1,4,11,36,107,357 ng / ml.
FIG. 5 shows the growth inhibitory effect of cycloprodigiosin hydrochloride (PdG) in Experiment 4 on leukemia cell lines.

Claims (6)

  An immunosuppressant comprising cycloprodigiosin or a salt thereof as an active ingredient.   The immunosuppressive agent according to claim 1, wherein the active ingredient is cycloprodigiosin.   The immunosuppressive agent according to claim 1, wherein the active ingredient is cycloprodigiosin hydrochloride. The immunosuppressive agent according to claim 3, which uses cycloprodigiosin hydrochloride produced by Pseudoalteromonas denitrificans AK-1 strain (FERM P-15771).   An apoptosis inducer containing cycloprodigiosin or a salt thereof as an active ingredient.   A therapeutic agent for leukemia comprising cycloprodigiosin or a salt thereof as an active ingredient.

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